CN101528918B - 生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶 - Google Patents

生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生物学活性增加的新的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶的核酸和蛋白序列。还提供了含有这些酶的细胞，以及它们的使用方法，例如生产丙二酰半醛及其下游产物，例如3-羟基丙酸及其衍生物。

Description

生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶
与相关申请的交叉参考
本申请要求2006年8月30日提交的美国临时申请no.60/824,031的权益，在此引为参考。
发明领域
本公开涉及改良的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)的核酸和氨基酸序列，具有改良的BAAT活性的细胞，所述细胞能够用于将β-丙氨酸转化为丙二酰半醛，丙二酰半醛又能通过3-HP脱氢酶转化为3-羟基丙酸(3-HP)，以及使用该细胞生产3-HP及其衍生物的方法。
对政府支持的确认
本发明是在能源部授予的合同GO 13144下由美国政府支持完成的。美国政府在本发明中具有确定的权利。
发明背景
有机化学物例如有机酸、酯和多元醇可用于合成塑料和其它产品。为了满足对有机化学物的增长的需求，正在开发利用基于碳水化合物而不是碳氢化合物的原料的更为有效和成本合算的生产方法。例如，某些细菌已经被用于生产大量的乳酸，用于聚乳酸的生产。
3-羟基丙酸(3-HP)是一种有机酸。已经描述了几种生产3-HP的化学合成路线，生物催化路线也已经被公开(Suthers等的WO01/16346)。3-HP可用于专业合成，并可通过化学工业中的现有技术被转化成商业重要的中间体，例如脱水成为丙烯酸、氧化成为丙二酸、与醇发生酯化反应成为酯、以及还原成为1，3-丙二醇。
发明概述
化合物3-羟基丙酸(3-HP)可以从葡萄糖通过β-丙氨酸中间体经生物催化来生产(图1)。β-丙氨酸可以使用β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)和3-HP脱氢酶经丙二酰半醛转化为3-HP(图1)。但是，该途径效率不高。
本文公开了新的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)，它们具有增强的将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。这种BAAT酶活性的增强导致了丙二酰半醛和下游产物例如3-HP生产的相应增加。
分离的BAAT分子的具体例子包括在SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18中显示的核酸序列，以及在SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19中显示的它们的相应氨基酸序列，以及这些序列保留了将β-丙氨酸与丙二酰半醛的互变能力的变异体、片段、融合物和多态性。所公开的核酸分子可以与启动子可操作连接，并可以成为载体的一部分。
所公开的BAAT序列可用于转化细胞，以便被转化的细胞具有BAAT活性，从而使得细胞从β-丙氨酸生产丙二酰半醛。在某些例子中，这种转化的细胞生产3-HP或其衍生物。与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19中任何一个特异性结合的结合剂也包涵在本公开中。这种结合剂的一个例子是抗体，例如多克隆或单克隆抗体。
提供了分离的细胞，它们表达外源BAAT核酸分子，因此具有BAAT活性，使得细胞可以将β-丙氨酸转化为丙二酰半醛。这样的细胞可以是真核或原核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或细菌细胞(例如乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳酸球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)或大肠杆菌(Escherichia)细胞)。还提供了含有这样的细胞的转基因植物和生物体。在一个实施例中，将细胞用编码BAAT的核酸分子(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18中的任何一个或其保留了BAAT活性的片段、融合物或变异体)转化，从而赋予了被转化的细胞BAAT活性。该公开的细胞可用于生产核酸分子、肽和有机化合物，例如丙二酰半醛和3-HP或其衍生物(例如聚合化的3-HP、3-HP酯或1，3-丙二醇)。3-HP在生物学上和商业上都是重要的。例如，营养品业可以使用3-HP作为食品、饲料添加剂或防腐剂，同时上面提到的衍生物可以从3-HP生产。这里描述的细胞可以用于培养系统中，用来生产大量的3-HP以及其它有机化合物，例如上面列出的那些。肽可用于催化有机化合物的形成，或者可用作抗原以产生特异性结合剂。
在某些实施例中，所公开的细胞，除了BAAT活性之外，还可以包括其它的酶活性，例如3-HP脱氢酶活性(例如编码与SEQ ID NO：21、23、27或31具有至少95％序列同一性的蛋白的核酸分子)，其中所述细胞产生3-HP。具有BAAT和3-HP脱氢酶活性的细胞还可以包括其它酶活性，例如用于生产3-HP的衍生物。在一个实施例中，这样的细胞还具有脂肪酶或酯酶活性，并产生3-HP的酯。在另一个实施例中，这样的细胞还具有酯酶活性，并产生聚合的3-HP。在另一个实施例中，这样的细胞还具有醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)和醛脱氢酶活性(例如来自1.2.1-类的酶)活性，并产生1，3-丙二醇。其他的酶活性可以是细胞内源的或外源的(例如由编码酶的外源核酸分子提供)。
在某些实施例中，所公开的细胞，除了BAAT活性之外，还包括其它的酶活性，例如生产β-丙氨酸所需的活性。这样的活性可以是细胞内源的，或者可以由一种或多种外源核酸分子提供。这样的酶的例子包括PEP羧化酶(例如在从PEP生产草酰乙酸时)、丙酮酸羧化酶(例如在从丙酮酸生产草酰乙酸时)、天冬氨酸氨基转移酶以及天冬氨酸脱羧酶(例如与SEQ ID NO：39或具有至少95％序列同一性的蛋白)。在具体的实施例中，至少一种编码这些酶的外源核酸分子包含非天然的启动子，以增加酶的表达，例如提高至少20％。
在具体的实施例中，所公开的细胞含有增加可用的丙酮酸以制造β-丙氨酸的突变。这样的突变的例子包括但不限于：ΔpoxB突变(例如使细胞的乙酸形成减少至少20％的突变)，ΔadhE或ΔatpFH突变(或二者)(例如与不存在ΔadhE或ΔatpFH相比，突变导致细胞产生至少多20％的3-HP)，或表达与SEQ ID NO：52具有至少95％序列同一性的外源核酸分子。
公开了使用所公开的具有BAAT活性的细胞从β-丙氨酸生产丙二酰半醛的方法。在一个实施例中，将细胞转染β-丙氨酸转化成丙二酰半醛所必需的一种或多种酶。在另一个实施例中，该方法包括从细胞纯化β-丙氨酸，然后将β-丙氨酸与β-丙氨酸转化成丙二酰半醛所必需的多肽相接触。
本公开还提供了制造3-HP或其衍生物的方法。在一个实施例中，将所公开的细胞在允许3-HP或其衍生物形成的条件下培养。在另一个实施例中，首先从所公开的细胞中纯化生产3-HP所需的酶，例如3-HP脱氢酶，然后将其与丙二酰半醛在允许3-HP形成的条件下温育。在另一个实施例中，将3-HP从所公开的细胞中纯化，然后将其与醇脱氢酶或醛脱氢酶在允许1，3-丙二醇形成的条件下温育，或者与酯酶在允许聚合的3-HP形成的条件下温育，或与脂肪酶或酯酶在允许3-HP酯形成的条件下温育。
在某些实施例中，所公开的产物在体外(细胞外部)生产。在其它实施例中，产物使用体外和体内(细胞内部)方法的组合来生产。在其它实施例中，产物在体内生产。对于涉及体内步骤的方法来说，细胞可以是分离的培养细胞或完整的生物体例如转基因植物，或单细胞生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌和大肠杆菌细胞)。这些细胞生产的产物可以是有机产物例如β-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP，以及它们的衍生物例如有机酸、多元醇(例如1，3-丙二醇)，以及本文描述的BAAT酶。
从下面参考附图进行的详细描述，本公开的上述以及其它的特点将变得更加明显。
附图简述
图1是经β-丙氨酸中间体产生3-HP及其衍生物的途径的图解。
图2A-B显示了改良的β-丙氨酸氨基转移酶(BAAT)(SEQ ID NO：6、10、12、14、17和19)与原有BAAT序列(SEQ ID NO：4)的比较。粗体中的残基是相对于原有BAAT序列所做的改变。
序列表
在所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码来显示。每个核酸序列只显示一条链，但是应该理解，对显示的链的任何引用均包含了互补链。
SEQ ID NO：1和2是用于PCR扩增阿维链霉菌(S.avermitilis)BAAT基因的PCR引物。
SEQ ID NO：3和4分别显示了天然阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：5和6分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT1。该蛋白与天然序列相比包含S24T突变。
SEQ ID NO：7和8分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT1b。该蛋白与天然序列相比包含T83A、S314T和E348G突变。
SEQ ID NO：9和10分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT2。该蛋白与天然序列相比包含S24T和F113L突变。
SEQ ID NO：11和12分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT3。该蛋白与天然序列相比包含了S24T、F113L和A133T突变。
SEQ ID NO：13和14分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAATP3H。该蛋白与天然序列相比包含P3H突变。
SEQ ID NO：15显示了用于将P3H突变导入到BAAT2和BAAT3突变体中的引物。
SEQ ID NO：16和17分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT3ML。该蛋白与天然序列相比包含P3H、S24T、F113L和A133T突变。
SEQ ID NO：18和19分别显示了突变的阿维链霉菌的BAATcDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT5-9。该蛋白与天然序列相比包含P3H、S24T、D110N、F113L和A133T突变。该核酸序列还包含沉默突变c207t、c381g和t471c。
SEQ ID NO：20和21分别显示了铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的3-HP脱氢酶的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：22和23分别显示了粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)M3A的3-HP脱氢酶cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：24和25显示了用于克隆恶臭假单胞菌(P.putida)的3-HP脱氢酶的扩增引物。
SEQ ID NO：26和27分别显示了恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：28显示了用于将突变导入SEQ ID NO：26显示的恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶中的引物。
SEQ ID NO：29是突变的恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶cDNA序列，它没有改变SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30和31分别显示了大肠杆菌(E.coli)的ydfG cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：32和33是用于将SEQ ID NO：30克隆到pET28b载体中的引物。
SEQ ID NO：34和35分别为用于克隆丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的天冬氨酸脱羧酶的正向和反向引物。
SEQ ID NO：36和37分别为用于克隆阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧酶的正向和反向引物。
SEQ ID NO：38和39分别显示了丙酮丁醇梭菌的天冬氨酸脱羧酶的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：40和41分别显示了阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧酶的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO：42和43分别为正向和反向引物，用于扩增质粒pKD4的旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记以供poxB基因在大肠杆菌中的插入性缺失。
SEQ ID NO：44和45分别是用于证实旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记插入到poxB基因中的正向和反向引物。
SEQ ID NO：46和47分别是正向和反向引物，用于扩增pKDprom上的旁侧带有FRT的氯霉素抗性标记和Plac/ara启动子以插入到大肠杆菌中ppc基因的上游。
SEQ ID NO：48和49是用于扩增pKDprom上旁侧带有FRT的氯霉素抗性标记和Plac/ara启动子以插入到大肠杆菌aspC基因上游的引物。
SEQ ID NO：50和51分别为正向和反向引物，用于扩增pKD3上旁侧带有FRT的氯霉素抗性标记以插入到大肠杆菌gltA基因的上游中以降低柠檬酸合成酶的表达。
SEQ ID NO：52是在转化的弱化菌株中获得的修饰的gltA基因座(KDgltA)和核苷酸序列。改变的核苷酸序列位于57-138位，翻译在138bp处开始。
SEQ ID NO：53-55是用于测试修饰的gltA位点的完整性的引物。
SEQ ID NO：56和57分别是正向和反向引物，用于从质粒pKD4扩增旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记，以供atpFH基因在大肠杆菌中的插入性缺失。
SEQ ID NO：58和59是用于证实旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记插入到atpFH基因中的引物。
详细描述
缩写和术语
为了更好地描述本公开并在本公开的实践中对本技术领域的普通技术人员进行指导，提供了下面的对术语和方法的解释。本文中使用的“包含”意味着“包括”，单数形式“a”或“an”或“the”包括复数的指称，除非上下文另有明确指示。例如指称“包含细胞”包括了一种或多种这样的细胞，指称“包含BAAT酶(comprising the BAATenzyme)”包括指称一种或多种BAAT酶及其本技术领域的专业人员已知的等价物，等等。术语“或者”是指所陈述的可选要素中的单个要素或两个或多个要素的组合，除非上下文另有明确指示。例如，词组“醇脱氢酶活性或醛脱氢酶活性”是指醇脱氢酶活性、醛脱氢酶、或醇脱氢酶活性和醛脱氢酶活性的组合。
除非有另外的解释，本文中使用的所有技术和科学术语的意义都与本公开所属的技术领域中的普通专业人员通常理解的相同。尽管与本文描述的相似或等价的方法和材料可用于本公开的实践或检验中，但适合的方法和材料描述在下面。所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不意味着限制。从下面的详细描述和权利要求书中，本公开的其它特点和优点将变得显见。
3-HP：3-羟基丙酸
BAAT：β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶
adhE：编码醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的基因。也包括使用NAD+作为电子受体催化伯或仲醇向醛的可逆氧化的蛋白醇脱氢酶。adhE的核酸和蛋白序列可以公开获得。例如，GenBank登记号No：M33504、AF093749、AB008676和CP000255公开了adhE的核酸序列，GenBank登记号No：AAA2342、AAC78120、BAA77747和ABD21317公开了adhE的蛋白序列。
atpFH：编码偶联F0F1-ATP合成酶的F1和F0组分的两个蛋白的基因(atpF和atpH)。也包括该基因所编码的蛋白。atpFH的核酸和蛋白序列可以公开获得。例如，GenBank登记号No：AB206839、AF522463、NC000913、AE009952和CR931997公开了atpFH的核酸序列。
抗体：含有与抗原(例如BAAT酶或其片段)特异性结合(发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。例子包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体，或其免疫有效的部分。包括免疫球蛋白分子及其免疫活性部分。
针对本文公开的任何多肽的单克隆抗体可以从鼠类杂交瘤按照Kohler&Milstein的经典方法(Nature 256：495，1975)或其衍生方法来制备。
所含有的抗体针对本文公开的任何多肽的异源表位的多克隆抗血清，可以通过用多肽(或其片段、融合物或变异体)免疫适当的动物来制备，这些多肽可以是未修饰的或被修饰以增强免疫原性。对兔子的有效免疫方案可以在Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33：988-91，1971)中找到。
抗体片段可用于代替完整抗体，并且可以容易地在原核宿主细胞中表达。制造和使用单克隆抗体的免疫有效部分、也称为“抗体片段”的方法是众所周知的，包括在Better&Horowitz(Methods Enzymol.178：476-96，1989)、Glockshuber等(Biochemistry 29：1362-7，1990)、美国专利No.5,648,237(功能性抗体片段的表达，“Expression of FunctionalAntibody Fragments”)、美国专利No.4,946,778(单多肽链结合分子，“Single Polypeptide Chain Binding Molecules”)、美国专利No.5,455,030(使用单链多肽结合分子的免疫疗法，“Immunotherapy Using SingleChain Polypeptide Binding Molecules”)、以及其中引用的参考文献中描述的方法。
可以生产针对BAAT肽(例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19或其免疫性片段)的抗体。适合用作免疫原的基本上纯的多肽可以从转染细胞、转化细胞或野生型细胞获得。最佳情况下，针对肽抗原上的一个或多个表位产生的抗体将特异性检测该肽。也就是说，针对一种特定多肽产生的抗体将识别和结合该特定多肽，而基本上不识别或结合其它多肽。抗体与特定多肽特异性结合的测定可以通过许多标准免疫分析方法中的任何一种来进行；例如Western印迹法。
“特异性结合”是指特定剂(“特异性结合剂”)与特定分析物发生特异性反应的能力，例如与抗体发生特异性免疫反应，或与特定肽序列发生特异性结合。结合是例如抗体分子和抗原决定簇之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性通常是由抗体与特异性抗原和无关抗原的差异结合能力的参照点来确定，从而区别两种不同的抗原，特别是当这两种抗原具有独特的表位时。与特定表位特异性结合的抗体被称为“特异性抗体”。
β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)：能够在例如细胞中将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的酶。包括来自任何生物体例如原核生物的任何BAAT基因、cDNA、RNA或蛋白。在具体的例子中，BAAT核酸序列包括SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18显示的核酸序列、以及其保留了编码具有BAAT活性蛋白的能力的片段、变异体或融合物，或由以上所述组成。在另一个例子中，BAAT蛋白包括SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、17或19中显示的氨基酸序列、以及其保留了BAAT活性的片段、融合物或变异体，或由以上所述组成。该描述包括BAAT等位基因变异体，以及保留了将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力的任何变异体、片段或融合序列。
BAAT的氨基酸序列包括全长序列，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19，以及保留了将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力的较短的序列或变异体。能够对BAAT氨基酸序列做出并保留了所需生物活性的具体取代的例子包括但不限于SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19中的V53L、R104K、L200I、T312S、A400S、W411Y或其组合。示例性片段包括SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19中的1-150、1-140、1-200、1-250、1-300、1-350或1-400位氨基酸。
BAAT活性：BAAT酶将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。在一个实施例中，这样的活性出现在细胞中。在另一个实施例中，这样的活性出现在体外。这种活性可以使用本技术领域任何已知的分析方法来测量。例如，BAAT活性可以通过将酶与β-丙氨酸和α-酮戊二酸进行温育，并通过高效液相色谱(例如使用Abe等J.Chromatography B，712：43-9，1998中的方法)测定反应产物(例如丙二酰半醛和谷氨酸)来鉴定。在具体的实施例中，BAAT活性可以通过在BAAT的存在下，使用
Figure G2007800324494D00121
分析(参见实施例1)测量β-丙氨酸产生的丙二酰半醛来测定。在具体的实施例中，BAAT活性可以通过在BAAT和3-HP脱氢酶的存在下，使用LC/MS(参见实施例8)测量从β-丙氨酸和丙二酰半醛中间体产生的3-HP来测定。
在具体的实施例中，如果酶对β-丙氨酸的比活为至少0.3U/mg(其中的U是1μmol/min)(例如使用在实施例4中描述的方法)、例如至少1.5U/mg、至少2U/mg、至少2.5U/mg或至少3U/mg，该酶被称为具有BAAT活性。
cDNA(互补性DNA)：一段缺少内部非编码区段(内含子)和决定转录的调控序列的DNA。cDNA可以通过逆转录从细胞提取的信使RNA来合成。
保守取代：一个或多个氨基酸取代(例如1、2、5、10或15个氨基酸残基)具有相似生化性质的氨基酸残基。通常，保守取代对所得肽的活性影响很小或没有。例如，在BAAT肽中的保守取代基本上不影响该肽将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。在具体的实施例中，保守取代是BAAT肽中的氨基酸取代，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19中的保守取代，它们没有明显降低(例如降低不超过20％、例如不超过10％)蛋白将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛或其它下游产物例如3-HP的能力。
丙氨酸扫描可用于鉴定肽中可以耐受取代的氨基酸残基。在一个实施例中，当丙氨酸或其它保守氨基酸(例如上面列出的那些)取代了一个或多个天然氨基酸时，活性的变化不超过25％，例如不超过20％、例如不超过10％。
在具体的实施例中，如果天然BAAT(例如SEQ ID NO：4)的情况下产生的丙二酰半醛的量相比，所产生的丙二酰半醛的量比起含有一个或多个保守氨基酸取代的BAAT的情况下所产生的丙二酰半醛的量而言，减少不超过大约25％、例如不超过大约10％，则BAAT活性基本上没有改变。
可以通过使用例如标准的方法例如位点定向诱变或PCR来操作编码肽的核苷酸序列，来产生含有一个或多个保守取代的肽。或者，也可以使用标准的肽合成方法来产生含有一个或多个保守取代的肽。
取代变异体是氨基酸序列中至少一个残基已经被移除、并在其位置中插入了不同的残基的变异体。可以取代蛋白中的原始氨基酸并被当作保守取代的氨基酸的例子包括：Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Ser取代Cys；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；以及Ile或Leu取代Val。
关于保守取代的进一步特别是信息可以在Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169：751-7，1987)、O′Regan等，(Gene 77：237-51，1989)、Sahin-Toth等，(Protein Sci.3：240-7，1994)、Hochuli等，(Bio/Technology 6：1321-5，1988)、WO 00/67796(Curd等)以及遗传学和分子生物学的标准教科书中发现。
缺失：从核酸分子中除去一个或多个核苷酸，或从蛋白中除去一个或多个氨基酸，将两边的区域连接到一起。
可检测的：能够确定存在或出现。例如，如果从丙二酰半醛或3-HP分别产生的信号强得足以被测量，那么从β-丙氨酸生产的丙二酰半醛或从β-丙氨酸生产的3-HP是可检测的。
DNA：脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，包含大多数活生物体的遗传物质(某些病毒的基因包含核糖核酸RNA)。DNA聚合物中的重复单位是四种不同的核苷酸，每种含有四种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，碱基与连有磷酸基团的脱氧核糖相连。DNA分子中被称为密码子的核苷酸三联体编码肽中的氨基酸。术语密码子也用于DNA序列转录成的mRNA中三个核苷酸的相应(和互补的)序列。
增强或增加：改善某种事物的质量、数量或强度。
在一个实施例中，突变的BAAT酶、例如SEQ ID NO：4的变异体，如果该酶的活性相对于天然BAAT酶(例如SEQ ID NO：4)的活性增加，则增强了BAAT酶的活性。在具体的实施例中，突变的BAAT酶(例如SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、17或19)具有的将β-丙氨酸转化为丙二酰半醛的能力增加，例如增加了至少10％、至少20％、至少50％、至少100％或甚至至少200％。例如，外源突变体BAAT酶(例如SEQ ID NO：5、6、8、10、12、14、17或19)在细胞中的表达，可以增加下游产物例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物的生产(如果细胞表达其它适合的酶)。这种增强可以使用本文公开的方法来测量，例如使用在下面的实施例(例如实施例1和8)中公开的方法，在突变体BAAT酶的存在下测定产生的丙二酰半醛或3-HP的量。
外源的：当在本文中用于指称核酸分子和特定细胞时，是指任何不源自于在自然界中发现的该特定细胞的核酸分子。因此，非天然存在的核酸分子一旦被导入到细胞中，就被认为对于细胞来说是外源的。天然存在的核酸分子对于特定的细胞来说也可能是外源的。例如，从细胞X分离的完整编码序列，一旦该编码序列被导入到细胞Y中，则对于细胞Y来说就是外源核酸，即使X和Y是同样的细胞类型。
表达：通过其将基因的编码信息转变成细胞的结构和功能、例如蛋白、转运RNA或核糖体RNA的过程。被表达的基因包括被转录成mRNA然后翻译成蛋白的基因，以及被转录成RNA但是没有被翻译成蛋白(例如转运和核糖体RNA)的基因。
功能性缺失：对基因序列进行的突变、部分或完全缺失、插入或其它变异，降低或抑制了基因产物的产生，或使得基因产物没有功能。例如，大肠杆菌中poxB的功能性缺失减少了由poxB基因编码的丙酮酸氧化酶产生的乙酸。在另一个实施例中，大肠杆菌中atpFH的功能性缺失减少了通过F0F1复合体的质子传递产生的ATP。
功能上等价的：具有相似的功能，例如序列变异体、片段或融合物具有与天然序列相似功能的能力。在某些实施例中，功能等价物甚至具有比天然序列更高的生物学活性。例如，BAAT的功能等价分子包括了那些保留了BAAT的功能、即将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力的分子。例如，功能等价物可以通过在BAAT中进行序列变更来提供，其中具有一个或多个序列变更的肽(例如SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17、19)保留了未改变的肽(例如SEQ ID NO：4)的功能，使得它保留了其将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。
序列变更的例子包括但不限于保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个实施例中，给定的肽与抗体结合，而功能等价物是与同样的抗体结合的肽。因此，功能等价物包括与肽具有同样的结合特异性、并且能够用作代替肽的试剂(例如在丙二酰半醛、3-HP及其衍生物的生产中)的肽。在一个实施例中，功能等价物包括其中结合序列是不连续的、其中抗体结合线性表位的肽。因此，如果肽序列是MTPQPNPQVG(SEQ ID NO：4的1-10位氨基酸)，功能等价物包括不连续的表位，它可以表现如下(**＝任何数量的居间氨基酸)：NH2-**-M**T**P**Q**P**N**P**Q**V**G-COOH。在该例子中，如果肽的三维结构使得它能够结合与SEQ ID NO：4的1-10位氨基酸结合的单克隆抗体，那么该肽与SEQ ID NO：4的1-10位氨基酸在功能上等价。
杂交：互补的单链DNA或RNA形成双链体分子的能力。在某些例子中，杂交被用于确定两个或多个核苷酸序列之间的互补性。核酸杂交技术可在本公开范围内用于获得分离的核酸。简单来说，任何与BAAT核酸分子具有一定同源性的核酸分子(例如与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18或其变异体或片段同源)都可以用作探针，用于在中度到高度严紧的条件下通过杂交鉴定相似的核酸分子。一旦鉴定后，可以将核酸纯化、测序并分析，以确定它是否是具有BAAT活性的BAAT。
杂交可以通过Southern或Northern分析来进行，以分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。探针可以用例如生物素、荧光团、洋地黄毒甙、酶或放射性同位素例如32P进行标记。待分析的DNA或RNA可以在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转移到硝酸纤维素、尼龙或其它适合的膜上，并使用本技术领域众所周知的标准技术与探针杂交，这些技术例如在Sambrook等(1989)的《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY.)的7.39-7.52节中描述。通常，探针的长度为至少大约20个核苷酸。例如，含有BAAT核酸序列的20个连续核苷酸(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的20个连续核苷酸)的探针，可用于鉴定相同的或类似的核酸。此外，长于或短于20个核苷酸的探针也可以使用。
本公开还提供了分离的核酸序列，其长度为至少大约12个核苷酸(例如长度为至少大约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1400、2000、3000、4000或5000个核苷酸)，并且在中度或高度严紧杂交条件下与BAAT核酸序列、例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的正义或反义链杂交。
中度严紧杂交条件是在大约42℃下、在含有25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart’s溶液、50μg/mL变性和超声过的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(大约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约50℃下、用含有2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的清洗溶液进行清洗。
高度严紧杂交条件是在大约42℃下、在含有25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart’s溶液、50μg/mL变性和超声过的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(大约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约65℃下、用含有0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的清洗溶液进行清洗。
分离的：“分离的”生物成分(例如核酸分子、蛋白或细胞)已经与该成分所天然存在中的其它生物成分，例如其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白，基本上分开或纯化出来。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语也包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。
在一个例子中，分离的是指天然存在的核酸分子，其没有与在它所源自的生物体的天然存在的基因组中与它直接邻接的两个序列(一个在5’末端，另一个在3’末端)直接毗邻。例如而非限制性的，分离的核酸分子可以是任何长度的重组DNA分子，只要在天然存在的基因组中通常发现的直接在该重组DNA分子旁侧的核酸序列之一被移除了或不存在即可。因此，分离的核酸分子包括但不限于独立于其它序列作为分离的分子存在的重组DNA(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及被掺入到载体、自主复制的质粒、病毒(例如反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可以包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。
在一个实施例中，术语“分离的”当用于指称核酸分子时，也包括任何非天然存在的核酸分子，因为非天然存在的核酸序列在自然界中没有发现，并且不具有天然存在的基因组中直接邻接的序列。例如，非天然存在的核酸分子例如工程化的核酸分子被认为是分离的核酸分子。工程化的核酸分子可以使用常用的分子克隆或化学核酸合成技术来制造。分离的非天然存在的核酸分子可以独立于其它序列，或掺入到载体、自主复制的质粒、病毒(例如反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核或真核生物的基因组DNA中。此外，非天然存在的核酸分子可以包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
核酸分子：包含RNA和DNA二者，包括但不限于cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如化学合成或重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链的或单链的。当是单链的时，核酸分子可以是正义链或反义链。此外，核酸分子可以是环形的或线性的。
可操作连接：当第一个核酸序列放置得与第二个核酸序列功能相关时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列(例如BAAT编码序列)的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。一般来说，可操作连接的DNA序列是相连的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，处于相同的阅读框中。以串联的方式作为单个信使RNA转录的分离基因的构型被命名为操纵子。因此，将基因紧密相邻放置在例如质粒载体中，置于单一启动子的转录调控之下，构成了合成操纵子。
ORF(开放阅读框)：不含有任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以翻译成肽。
肽修饰：本公开提供了新的肽(例如新的BAAT、天冬氨酸脱羧酶和3-HP脱氢酶)以及合成实施方案。此外，具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(从所公开的肽序列起始获得的化学功能化的肽分子)以及变异体(同源物)也可以用于本文公开的方法。本文公开的肽包含的氨基酸列，可以是L-或D-氨基酸，天然存在和其它。
肽可以通过各种化学技术进行修饰，以产生与未修饰的肽具有基本上相同的活性、并任选具有其它所需性质的衍生物。例如，蛋白的羧酸基团，不论是羧基末端或侧链，都可以提供成可药用的阳离子盐的形式，或酯化形成C1-C16酯，或转化成具有式NR1R2的酰胺、其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或合并形成杂环、例如5或6员环。肽的氨基基团，不论是氨基末端或侧链，都可以是可药用的酸加成盐的形式，例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机酸盐，或者可以被修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基，或进一步转化成酰胺。
肽侧链的羟基基团可以使用公认的技术转化成C1-C16烷氧基或转化成C1-C16酯。肽侧链的苯基和苯酚环可以被一个或多个卤素原子例如F、Cl、Br或I、或被C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯、或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基基团可以被延伸成同源的C2-C4亚烷基。巯醇可以用许多公认的保护基团中的任何一种、例如乙酰胺基团来保护。本技术领域的专业人员也将认识到将环状结构导入本公开的肽的方法，以选择和提供对结构的构象限制，产生增强的稳定性。例如，可以给肽加上C-或N-末端半胱氨酸，以便当氧化时肽将含有二硫键，产生环形的肽。其它的肽环化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端的酰胺和酯。
肽模拟和有机模拟实施方案也在本公开的范围内，藉此这些肽模拟物和有机模拟物的化学组成成分的三维排列模拟了肽骨架和组分氨基酸侧链的三维排列，导致本发明的蛋白的这些肽模拟物和有机模拟物具有可检测的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。对于计算机模拟应用来说，药效团是生物活性的结构要求的理想化的三维定义。肽模拟物和有机模拟物可以被设计成用当前的计算机模拟软件拟合每个药效团(使用计算机辅助药物设计或CADD)。对于在CADD中所使用的技术的描述，参见在Klegerman&Groves主编的《药物生物技术》165-174页中Walters的“药物的计算机辅助模拟”(″Computer-AssistedModeling of Drugs″，in Klegerman&Groves，eds.，1993，PharmaceuticalBiotechnology，Interpharm Press：Buffalo Grove，IL，pp.165-174)以及Munson主编的《药理原理》第102章(Principles of PharmacologyMunson(ed.)1995，Ch.102)。
poxB：编码丙酮酸氧化酶的基因。也包括将丙酮酸代谢成乙酸和CO2的丙酮酸氧化酶蛋白。poxB主要表达在应激培养下或在好氧条件下的稳定期表达。poxB核酸和蛋白序列可公开获得。例如，GenBank登记号No：AE009952、AX537387、M28208和CR931997公开了poxB的核酸序列，GenBank登记号No：AAM86372、CAD57486、AAB59101和CAI36877公开了poxB的蛋白序列。
启动子：一系列指导核酸分子的转录的核酸控制序列。启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列，例如在聚合酶II类型启动子情况下的TATA元件。启动子也任选包含远处的增强子或阻遏子元件，它们可以位于距转录起始位点多达几千碱基对的位置。
该术语包括内源启动子序列以及外源启动子序列(例如导入到染色体中以启动基因例如BAAT表达的启动子)。可以用于实践本文公开的方法的具体启动子类型包括但不限于组成型启动子和诱导型启动子(例如响应或不响应特定刺激的启动子，例如光、氧、或化学浓度例如乳糖、IPTG、阿拉伯糖或四环素诱导的启动子)
纯化的：术语纯化的不要求绝对纯度；相反，它准备用作相对术语。因此，例如，纯化的肽制备物(例如BAAT肽制备物)是其中的肽比肽在其细胞内的环境中更加富集、使得肽与可能伴随它的细胞成分(核酸、脂类、碳水化合物和其它肽)基本上分离开的制备物。在另一个实施例中，纯化的肽制备物是其中的肽基本上不含污染物，例如在肽的化学合成后可能存在的那些污染物的制备物。
在一个实施例中，当样品重量的至少大约50％由肽构成时，例如当样品的至少大约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多由肽构成时，肽是纯化的。可用于纯化肽的方法的例子包括但不限于在Sambrook等公开的方法(《分子克隆：实验室手册》第17章(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork，1989，Ch.17)。蛋白纯度的测定可以通过例如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳、然后在对聚丙烯酰胺凝胶染色后观察单一的肽条带；高压液相色谱；测序或其它常规方法。
重组：重组核酸分子或蛋白是具有不是天然存在的序列、具有通过将两个原本分开的序列片段进行人工组合而制造的序列、或这二者。该人工组合可以通过例如化学合成、或通过对核酸分子或蛋白的分离片段进行人工操作、例如遗传工程技术来实现。重组也用于描述已经被人工操作过、但含有与从中分离到核酸的生物体中发现的相同调控序列和编码区的核酸分子。
序列同一性/相似性：两个或多个核酸序列、或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/相似性，根据序列之间的同一性或相似性来表示。序列同一性可以根据百分同一性来度量；百分率越高，序列越一致。序列相似性可以根据百分相似性来度量(其中考虑了保守氨基酸取代)；百分率越高，序列越相似。核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物当使用标准方法进行比对时，具有相对高度的序列同一性/相似性。
对序列比对以进行比较的方法在本技术领域是众所周知的。各种不同的程序和比对算法描述于：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins&Sharp，Gene，73：237-44，1988；Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等，Nuc.Acids Res.16：10881-90，1988；Huang等.Computer Appls.in theBiosciences 8，155-65，1992；以及Pearson等，Meth.Mol.Bio.24：307-31，1994。Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990，提出了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI的基本本地比对搜索工具(NCBI Basic Local AlignmentSearch Tool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)可以从几个来源获得，包括国立生物信息中心(NCBI，National Libraryof Medicine，Building 38A，Room 8N805，Bethesda，MD 20894)以及在因特网上，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。其它的信息可以在NCBI网点上发现。
BLASTN被用于比较核酸序列，而BLASTP被用于比较氨基酸序列。对于两个核酸序列的比较，选项可以设置如下：-i被设置为含有要比较的第一个核酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j被设置为含有要比较的第二个核酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p被设置为blastn；-o被设置为任何所需文件名(例如C:\output.txt)；-q被设置为-1；-r被设置为2；所有其它选项保留在它们的缺省设置。例如，下面的命令可用于产生含有两个序列间对比的输出文件：C:\B12seq-i c:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r 2。
对于两个氨基酸序列的比较，B12seq的选项可以设置如下：-i被设置为含有要比较的第一个氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j被设置为含有要比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p被设置为blastp；-o被设置为任何所需文件名(例如C:\output.txt)；所有其它选项保留在它们的缺省设置。例如，下面的命令可用于产生含有两个氨基酸序列间对比的输出文件：C:\B12seq-i c:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果两个被比较的序列具有同源性，那么指定的输出文件将会将那些同源的区域显示为比对序列。如果两个被比较的序列不具有同源性，那么指定的输出文件将不显示比对的序列。
比对后，通过对两个序列中出现同样的核苷酸或氨基酸残基的位置数量进行计数，来确定匹配的数量。用匹配的数量除以被鉴定的序列显示的序列长度、或除以分节的长度(例如来自被鉴定的序列显示的序列中的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以100，就确定了百分序列同一性。例如，一个核酸序列，当与具有1554个核苷酸的测试序列比对时有1166个匹配，则与测试序列有75.0百分同一性(1166÷1554*100＝75.0)。序列的百分同一性值被四舍五入到小数点后一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14被四舍五入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19被四舍五入到75.2。长度值总是整数。在另一个实施例中，靶序列含有20个核苷酸的区域，该区域与来自下面被鉴定序列的20个连续核苷酸进行比对，则该靶序列含有与被鉴定的序列具有75百分同一性的区域(即15÷20*100＝75)。
        1                          20
靶序列：                   ATGACCCATCAGCCGAATCC
       | || ||| |||| |||| |
被鉴定的序列：               ACGAGCCAACAGCGGAATGC
对于大于大约30个氨基酸的氨基酸序列的比较来说，利用Blast 2序列功能，使用缺省BLOSUM62矩阵设置为缺省参数(间隙存在价值为11，每个残基间隙价值为1)。同源物的典型特征为，使用NCBI BasicBlast 2.0、带数据库例如nr或swissprot数据库的间隙blastp，在与氨基酸序列的全长比对范围内计算，具有至少大约70％的序列同一性。用blastn程序搜索的查询使用DUST(Hancock和Armstrong，1994，Comput.Appl.Biosci.10：67-70)进行过滤。其它程序使用SEG。此外，可以进行手动比对。当通过该方法评估时，具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19中任何一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
当对短肽(少于大约30个氨基酸)进行比对时，应该使用Blast 2序列功能进行比对，使用设置为缺省参数的PAM30矩阵(开口间隙罚分为9，延伸间隙罚分为1)。当使用该方法评估时，与参比序列具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性。当比较小于完整序列的序列同一性时，同源物典型地在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少75％的序列同一性，并根据它们与参比序列的同一性，可以具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。在这样的短窗口中确定序列同一性的方法在NCBI网点上有描述。
两种核酸分子密切相关的一个指示是这两种分子在严紧条件下彼此杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同环境参数下不同。通常，在严紧条件下与BAAT基因序列杂交的核酸分子，在上述的条件下分别与基于完整BAAT基因或该基因的选定部分的探针杂交。
由于遗传密码的简并性，没有显示出高度同一性的核酸序列仍然可以编码一致的或相似的(保守的)氨基酸序列。使用这种简并性可以对核酸序列进行改变，以产生都编码基本上相同蛋白的多种核酸分子。通过这种方法测定，这样的同源核酸序列可以具有例如与SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、16或18中任何一个至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
本技术领域的专业人员将会认识到，这些序列同一性的范围仅仅被提供作为指导；有可能获得在提供的范围之外的非常显著的同源物。
两种核酸序列基本上一致的备选(不一定是累积性)指示是第一种核酸编码的肽与第二种核酸编码的肽发生交叉免疫反应。
特异性结合剂：基本上只与确定的靶例如肽靶结合的剂。例如，BAAT结合试剂包括抗BAAT抗体以及其它基本上只与BAAT蛋白结合的剂(例如肽或药物)。针对BAAT蛋白(或其片段)的抗体可用于纯化或鉴定该蛋白。
转化细胞：其中已经通过例如分子生物学技术导入了核酸分子、例如BAAT核酸分子的细胞。转化包涵可以将核酸分子导入这样的细胞的所有技术，包括但不限于用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化、以及通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速导入裸露的DNA。
在足以…的条件下：用于描述任何允许所需活性的任何环境的词组。
在一个例子中，包括将细胞(例如细菌细胞)在足以允许所需活性的生长培养基和温度下培养。在具体的实施例中，所需活性是细胞生产β-丙氨酸(或其下游产物，例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物)。
变异体、片段或融合物：所公开的蛋白和核酸序列(例如BAAT、天冬氨酸脱羧酶和3-HP脱氢酶)包括其保留所需生物活性的变异体、片段和融合物。例如，编码BAAT蛋白(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18)、融合的BAAT蛋白、或BAAT蛋白的片段或变异体的DNA序列，其可以被工程化以允许蛋白在真核细胞、细菌、昆虫或植物中表达。为了获得表达，DNA序列可以被改变并与其它调控序列可操作连接。含有调控序列和蛋白的最终产物被称为载体。该载体可以被导入到真核、细菌、昆虫或植物细胞中。一旦进入细胞，载体允许蛋白生产。
在一个实施例中，融合蛋白包含BAAT氨基酸序列(或其变异体或片段)，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19，它们与其它不显著降低BAAT活性例如将β-丙氨酸转化为丙二酰半醛的能力的氨基酸序列相连。在一个实施例中，其它氨基酸序列的长度不超过大约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸，例如5-50个氨基酸。此外，在BAAT序列和其它氨基酸序列之间可以放置间隔区序列。这种间隔区可以为至少4个、至少6个或至少10个氨基酸，例如4-12个氨基酸。
本技术领域的专业人员将会认识到，DNA序列可以以多种方式被改变，而不影响所编码的蛋白的生物学活性。例如，可以使用PCR在编码BAAT的DNA序列中产生变异。这样的变异体可以是对用于表达蛋白的宿主细胞中的密码子偏好性进行最适化、或其它促进表达的序列改变的变异体。
载体：导入到细胞中时的核酸分子，进而产生转化细胞。载体可以包含允许它在细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体也可以包含本技术领域已知的一种或多种选择性标记基因或其它遗传元件。
β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶序列
本公开提供了新的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)蛋白和编码这些蛋白的核酸序列。
蛋白
本文公开了具有β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)活性的肽。使用几轮突变然后筛选丙二酰半醛的生产，在BAAT氨基酸序列中鉴定到了几个突变能增加天然BAAT序列(SEQ ID NO：4)的生物学活性。这些取代包括：P3H、S24T、D110N、F113L和A133T，以及它们的组合(取代的编号基于SEQ ID NO：4)。
在例如表达外源BAAT的细胞中，BAAT肽具有将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。在具体的实施例中，BAAT的生物学活性通过测量酶的比活来确定(例如通过测量β-丙氨酸和α-酮戊二酸产生的L-谷氨酸，参见实施例4)。在另一个实施例中，BAAT的生物学活性通过测量酶对β-丙氨酸的Km来确定(参见实施例4)。在具体的实施例中，生物学活性增加的BAAT酶(例如变异体BAAT酶)是比活相对于天然酶(例如SEQ ID NO：4)增加了至少2倍的BAAT酶，例如增加了至少3倍、至少5倍甚或至少10倍。在具体的实施例中，生物学活性增加的BAAT酶(例如变异体BAAT酶)是比活为至少1.5U/mg(其中U是1μmol/分钟)的BAAT酶，例如比活为至少2U/mg、甚或比活力为至少3U/mg。
所公开的BAAT肽可以与例如3-HP脱氢酶(例如SEQ ID NO：21、23、27和31)组合用于生产3-HP(参见图1)。BAAT肽的具体例子显示在SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19。SEQ ID NO：4是天然的BAAT序列，而SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17和19是BAAT生物学活性增加的变异体序列。
本公开还包涵SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19的保留了BAAT生物学活性、甚或增加的BAAT活性的变异体、融合物和片段。变异的BAAT肽序列可以通过使用标准的方法例如位点定向诱变或PCR操控编码BAAT肽的核苷酸序列来产生。在具体的实施例中，SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19的变异体、融合物和片段具有SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19的至少90％的BAAT活性，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19的至少95％、至少98％、至少100％甚或至少150％的BAAT活性。
在某些实施例中，BAAT肽包含与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19至少80％的序列同一性(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)，并包含P3H、S24T、D110N、F113L或A133T取代，或其组合，并保留了BAAT活性。例如，这样的序列可以包含P3H、S24T、D110N、F113L或A133T取代，S24T和F113L两种取代，S24T、F113L和A133T取代，P3H、S24T、F113L和A133T取代，或S24T、F113L和A133T取代，P3H、S24T、D110N、F113L和A133T取代。本技术领域的专业人员将会认识到提供BAAT活性的其它组合也是可能的。本公开也提供了编码这些蛋白的核酸分子。
变异体包含一个或多个氨基酸的取代，例如一个或多个保守氨基酸取代、一个或多个非保守氨基酸取代、或其组合。变异体也包含一个或多个氨基酸的缺失或插入(或其组合，例如单个缺失加上多个插入)，例如不超过50个氨基酸、不超过20个氨基酸、不超过10个氨基酸、不超过5个氨基酸、不超过2个氨基酸的添加或缺失，例如1-5个氨基酸、1-10个氨基酸或2-20个氨基酸的添加或缺失。在具体的实施例中，变异体BAAT序列包括与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19中的任何一个至少80％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，只要氨基酸序列编码的肽保留BAAT活性即可。
非保守取代是其中氨基酸具有更显著差异的取代，例如它们对维持下列的影响：(a)取代的区域中多肽骨架的结构，例如是片层还是螺旋构象；(b)靶位点处多肽的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。一般情况下预期将在多肽的功能上产生最大变化的取代是下述取代，其中：(a)亲水性残基例如丝氨酸或苏氨酸，取代疏水性残基(或被疏水性残基取代)，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基(或被任何其它残基取代)；(c)具有正电侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，取代负电残基(或被负电残基取代)，例如谷氨酸或天冬氨酸；或(d)具有庞大侧链的残基例如苯丙氨酸，取代不具有侧链的残基(或被不具有侧链的残基取代)，例如甘氨酸。可以通过使用本文公开的分析方法分析肽催化β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力，来评估这些氨基酸取代(或其它缺失或添加)对具有BAAT活性的肽的影响。理想情况下，非保守氨基酸取代基本上不减少BAAT的生物学活性，甚至可以增加BAAT的生物学活性(正如SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17和19所证实的那样)。
相反，保守取代是其中氨基酸具有相似的生物化学性质的取代。在一个实施例中，BAAT序列在SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17和19任何一个中包含至少一个保守氨基酸取代，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个保守氨基酸取代，例如1-5、1-10或1-20个保守氨基酸取代。可以做出、同时仍保留BAAT活性的保守取代的具体例子包括但不限于：A205S、L250V、Y52W、R50K或S144T(氨基酸号码参考SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19的任何一个)。
提供了可以在本公开的细胞中表达、以例如在体内生产3-HP的BAAT片段。本公开还提供了含有SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19的至少15个连续的氨基酸、并保留了BAAT活性的BAAT肽。BAAT肽也可以包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少425个连续氨基酸残基，只要这些片段保留了将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力即可。
使用公开的BAAT序列可以产生融合蛋白(以及相应的核酸序列)。融合序列可以包含与第二个氨基酸序列相连的全长BAAT蛋白序列(例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17或19)或其具有BAAT活性的变异体或片段。在某些实施例中，第二个氨基酸序列包括至少5个氨基酸，例如至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、甚或至少200个氨基酸，例如5-500个氨基酸。在具体的实施例中，BAAT序列和第二个氨基酸序列通过间隔区序列相连。间隔区的具体例子包括一个或多个丙氨酸或甘氨酸残基，或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸。在某些实施例中，间隔区不超过50个氨基酸，例如不超过20个氨基酸、不超过10个氨基酸、不超过5个氨基酸，例如5-50个氨基酸。
核酸分子
还公开了编码具有BAAT活性的肽的分离核酸分子，例如包括SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的序列。但是，本公开还包涵SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的变异体、融合物和片段，它们保留了编码具有BAAT活性、甚或增加的BAAT活性的蛋白的能力。在一个实施例中，编码具有BAAT活性的肽的分离核酸分子与启动子序列可操作连接，并可以作为载体的一部分。在具体的实施例中，启动子是增强BAAT表达的启动子，例如增加至少25％。核酸可以是重组核酸，其可以用于转化细胞和制造转化细胞或转基因植物。
公开了含有至少一个外源核酸分子的转化细胞，该核酸分子编码具有BAAT活性的肽(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18，或其保留了BAAT活性的片段、融合物或变异体)。在一个实施例中，这样的转化细胞从β-丙氨酸产生丙二酰半醛。在另一个实施例中，细胞产生3-HP(或其衍生物例如3-HP的酯或聚合的3-HP)或有机化合物例如1，3-丙二醇。被转化的细胞可以是真核或原核状态的，例如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或酵母细胞。转基因细胞的具体例子包括乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌或大肠杆菌细胞。还提供了含有所公开的BAAT核酸分子的植物或表达这些BAAT核酸分子的转基因细胞。
编码BAAT的核酸序列可以包含编码酶的完整核酸序列，以及其保留了所需酶活性的部分。例如，BAAT核酸分子可以含有BAAT核酸序列(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18)的至少15个连续核苷酸。应该认识到，本公开也提供了含有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的至少18个、至少21个、至少27个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个或至少1200个连续核苷酸的分离核酸分子。在某些实施例中，SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18的片段(或互补链)不编码具有BAAT活性的蛋白，而是可以用作探针或引物的较短片段。
本文公开了变异的BAAT核酸序列。变异体可以含有单个插入、单个缺失、单个取代、多个插入、多个缺失、多个取代或其任何组合(例如单个缺失加上多个插入)，只要由其编码的肽保留了BAAT活性(或可以作为探针或引物)即可。这种分离的核酸分子可以与BAAT序列(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18)共有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，只要核酸编码的肽保留了BAAT活性即可。
例如，可以对SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16或18进行一种或多种下列改变：24位的“g”可以用“a”取代；96位或144位的“c”可以用“t”取代；339位或1110位的“c”可以用“t”取代；816位的“a”可以用“c”、“t”或“g”取代；1200位或1296位的“c”可以用“a”、“t”或“g”取代；1152位的“g”可用“a”、“t”或“c”取代；1344位的“g”可用“a”取代；1353位的“t”可用“g”、“a”或“c ”取代。
BAAT序列的编码区可以通过利用遗传密码的简并性来改变编码区序列来改变，这种方式使得尽管核酸序列明显改变，但它编码的肽仍具有与天然氨基酸序列一致或基本上相似的氨基酸序列。例如，可以使用具体物种的密码子偏好性和密码子使用表，来工程化利用该特定物种的密码子使用偏好性的分离核酸分子。由于遗传密码的简并性，丙氨酸由四种核苷酸密码子三联体编码：GCT、GCA、GCC和GCG。因此，在丙氨酸位置上开放阅读框架的核酸序列可以被改变成任何这些密码子，而不影响所编码的多肽的氨基酸序列或肽的性质。基于遗传密码的简并性，可以通过使用本文描述的标准DNA诱变技术从核酸序列、或通过核酸序列的合成得到核酸变异体。因此，本公开也包涵编码同样的多肽、但是由于遗传密码的简并性在核酸序列上不同的核酸分子。因此，本文公开的BAAT核酸序列可以被设计成具有被目的特定生物体偏好使用的密码子(例如在下面的实施例中描述的)。
本公开包涵编码BAAT序列的变异体、融合物或片段的核酸(例如上面描述的那些)。本公开还提供了编码BAAT的分离核酸序列，其中该序列长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1000个或至少1200个核苷酸)，并且在杂交条件下与编码酶的核酸分子的正义链或反义链杂交。杂交条件可以是中度或高度严紧的杂交条件。
BAAT肽和编码这些肽的核酸分子可以通过标准DNA诱变技术例如M13引物诱变来产生。这些技术的详细情况提供在Sambrook等主编的《分子克隆：实验室手册》(第二版)的15章中(Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring，Harbor，N.Y.，1989，Ch.15)。核酸分子可以含有编码区的变化，以配合要导入分子的具体生物体的密码子使用偏好。
具有BAAT活性的细胞
公开了例如由于存在外源BAAT核酸或蛋白而具有BAAT活性的细胞。这样的细胞可以从β-丙氨酸产生丙二酰半醛，在某些实施例中，如果细胞中也存在3-HP脱氢酶活性，也可以从丙二酰半醛产生3-HP(或其衍生物)。
本文公开的细胞表达的酶活性，可以通过表达编码具有所需活性的酶的核酸、或通过直接供应该酶来提供。将外源核酸序列(例如载体中的序列)导入细胞的方法是常规的。
在一个实施例中，由于表达外源BAAT核酸分子、例如增加BAAT活性(例如与天然BAAT序列、例如SEQ ID NO：3和4相比)的变异体分子，使细胞具有BAAT活性。这样的变异体分子的例子在本文中提供(例如与SEQ ID NO：5、7、9、11、13、16或18具有至少90％或至少95％序列同一性的核酸序列)。在某些实施例中，增加的BAAT活性导致细胞从β-丙氨酸生产丙二酰半醛增加，并且如果细胞也具有3-HP脱氢酶活性，还导致从丙二酰半醛生产3-HP(或其衍生物)的增加。在具体的实施例中，丙二酰半醛或下游产物例如3-HP(或其衍生物)的生产或产量增加了至少20％、例如至少50％、至少75％、至少100％或至少150％。丙二酰半醛或3-HP的生产增加可以是相对于表达天然BAAT序列(不论是否是外源的，例如SEQ ID NO：3和4)的同样类型细胞。测量这种生产的方法在本技术领域中是已知的，在本文中提供了具体的非限制性例子。
含有BAAT活性的细胞可以是真核或原核的。这样的细胞的例子包括但不限于细菌细胞(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、地芽孢杆菌(Geobacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)或梭菌(Clostridium))、真菌细胞(例如曲霉(Aspergillus)或根霉(Rhizopus)细胞)、植物细胞(例如玉米、小麦、水稻或大豆细胞)以及酵母细胞。在一个实施例中，细胞是微生物。术语“微生物”是指任何显微生物体，包括但不限于细菌、藻类、真菌和原生动物。因此，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluveromyces lactis)、Candida blankii、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)都是微生物并且可以使用。在另一个实施例中，细胞是较大的生物体例如植物如转基因植物的一部分。可用于从β-丙氨酸制造3-HP或其它有机化合物的植物的例子包括但不限于遗传工程的植物作物，例如玉米、水稻、小麦和大豆。
在一个实施例中，具有BAAT活性的细胞是转化的细胞。这样的细胞可以含有至少一种编码BAAT的外源核酸分子，例如含有SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、16或18或其保留了编码具有BAAT活性蛋白的能力的变异体、片段或融合物的序列(参见上面BAAT核酸分子的讨论)。在某些实施例中，表达了至少两种不同的外源BAAT分子，例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18中的两种或多种。
在一个实施例中，外源核酸分子是突变的BAAT，其中突变的BAAT(例如SEQ ID NO：5、7、9、11、13、16或18)增加了细胞中BAAT活性，并可以增加从β-丙氨酸生产丙二酰半醛。例如，在某些实施例中，相对于天然BAAT(例如SEQ ID NO：3和4)存在下从β-丙氨酸生产的丙二酰半醛的量，突变的BAAT可以将细胞中从β-丙氨酸生产丙二酰半醛增加至少3倍，例如增加至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍或甚至至少10倍。
公开了含有BAAT活性以及其它酶活性的细胞。这样的细胞可用于生产β-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP、多元醇例如1，3-丙二醇、聚合的3-HP、3-HP和3-HP酯的共聚物。其它的酶活性对于细胞来说可以是天然的，或可以由于导入了编码所需酶的核酸分子而是外源的。在具体的实施例中，编码两种或多种所需酶、例如三种或多种所需酶的操纵子被导入到细胞中。例如，含有编码BAAT、3-HP脱氢酶和天冬氨酸脱羧酶中的两种或多种的核酸分子的操纵子，可以被细胞表达。
本文提供了具有外源BAAT活性(例如由于表达本文公开的至少一种BAAT分子)以及允许产生丙二酰半醛的下游产物、例如3-HP及其衍生物的一种或多种内源或外源核酸分子的细胞。3-HP的存在可以使用常规方法来确定，例如在Sullivan和Clarke(J.Assoc.Offic.Agr.Chemists，38：514-8，1955)中描述的方法。例如，具有BAAT和3-HP脱氢酶活性(3-羟基丙酸脱氢酶活性，EC 1.1.1.59)(例如由于表达了所编码的蛋白与SEQ ID NO：21、23、27或31具有至少95％序列同一性的核酸序列，例如SEQ ID NO：20、22、26、29或30)的细胞。这样的细胞能够从β-丙氨酸和丙二酰半醛中间体生产3-HP。类似地，具有天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性(例如由于表达了所编码的的蛋白与SEQ ID NO：39或41具有至少95％序列同一性的核酸序列，例如SEQ ID NO：38或40)、PEP羧化酶活性、外源BAAT活性(例如由于表达至少一种本文公开的BAAT分子)和3-HP脱氢酶活性(例如由于表达SEQ ID NO：20、22、26或29)的细胞，能够从葡萄糖或丙酮酸生产3-HP。在这些实施例中，细胞可用于生产3-HP。
生产3-HP的上述细胞还可以含有脂肪酶或酯酶活性，例如由于表达编码脂肪酶或酯酶(EC 3.1.1.-)的外源核酸分子的。这样的细胞可用于生产3-HP的酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯、或3-羟基丙酸2-乙基己酯。生产3-HP的上述细胞可以进一步含有酯酶活性，例如由于表达编码酯酶的外源核酸分子。这样的细胞可用于生产聚合的3-HP。生产3-HP的上述细胞还可以含有醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)、醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)或这二者，例如由于表达编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或二者的外源核酸分子。这样的细胞可用于生产1，3-丙二醇。
在具体的实施例中，细胞中编码所需酶活性的外源核酸分子包括增强所需酶表达的非天然启动子。这种所需前体的表达增加可以导致下游产物、例如β-丙氨酸、丙酮酸、草酰乙酸、丙二酰半醛以及3-HP及其衍生物的生产增加。在具体的实施例中，一种或多种这些下游产物的表达与例如使用天然启动子表达的量相比，增加了至少20％、至少50％或甚至至少100％。
例如，使用常规的分子生物学方法，可以用启动子例如可以用乳糖或IPTG诱导的lac启动子、可以用阿拉伯糖诱导的ara启动子、或可以用四环素诱导的tet启动子或组成型启动子取代酶的天然启动子。这样的非天然或合成的启动子与酶的编码序列可操作连接。在具体的实施例中，这样的非天然启动子与酶的天然启动子相比，可以将酶的表达增加至少20％，例如至少50％。酶的表达增加(在核酸或蛋白水平上)可以使用常规的方法来检测，例如Southern印迹、northern印迹、RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、western印迹或流式细胞术。在一个实施例中，本公开的含有外源BAAT活性的细胞，也含有编码PEP羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、BAAT或3-HP脱氢酶的一种或多种外源核酸分子(例如这些酶中的2、3、4、5或6种)，其中这些酶中的一种或多种从非天然启动子表达。
所公开的具有外源BAAT活性的细胞(例如生产3-HP的细胞)也可以含有增加可用的丙酮酸来用作下游产物例如β-丙氨酸和3-HP的前体的突变(例如一种或多种基因的功能性缺失)。丙酮酸的可用性增加可以增加所需的下游产物例如3-HP及其衍生物的生产，例如增加至少20％或至少50％。例如，poxB基因(ΔpoxB)的功能性缺失减少了细胞的乙酸形成(例如减少至少20％或至少50％)，并可以增加细胞中的丙酮酸。在另一个实施例中，adhE或ΔatpFH基因(ΔadhE或ΔatpFH)的功能性突变可以增加细胞中的丙酮酸，从而将β-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP(或其组合)的生产增加至少20％或至少50％(例如与存在有功能的adhE或ΔatpFH基因相比)。对基因进行功能性缺失的方法在本技术领域中是常规的。
所公开的具有外源BAAT活性的细胞(例如生产3-HP的细胞)也可以含有柠檬酸合成酶基因的突变(例如这样的基因的功能性缺失)，这显著降低柠檬酸合成酶的生物学活性。这样的突变可以增加可用作天冬氨酸氨基转移酶反应的底物的草酰乙酸的量(图1)，从而增加下游产物例如β-丙氨酸和3-HP的生产。增加草酰乙酸的量可以增加所需的下游产物例如3-HP及其衍生物的生产，例如增加至少20％或至少50％。例如，SEQ ID NO：52(突变的gltA)的表达可以增加3-HP的生产。
本技术领域的专业人员将会认识到，所公开的分离细胞可以含有所需元件的多种组合，例如与一种或多种所需酶可操作连接的非天然启动子(其中该启动子相对于天然启动子增加了酶的表达)、增加可用的丙酮酸的突变、以及减少柠檬酸合成酶表达的突变。
在某些实施例中，所需产物(例如β-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP或其衍生)从细胞分泌出来，减少或消除破坏细胞膜以回收所需化合物的需要。在一个实施例中，细胞产生的所需产物的浓度为每升至少1mg/L(例如至少1mg/L、至少5mg/L、至少10mg/L、至少50mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L或至少10g/L)。当测定具体细胞的产物例如3-HP或其衍生物的产量时，可以使用任何方法。参见例如Applied EnvironmentalMicrobiology 59(12)：4261-5(1993)。在本公开范围内的细胞可以利用各种不同的碳源。在另一个实施例中，radical SAM的酶产物(或其下游有机化合物)不从细胞中分泌。在这样的实施例中，可以使用本技术领域已知的方法破坏细胞膜，以回收有机化合物。
生产丙二酰半醛、3-HP及其衍生物的方法
公开了通过所公开的BAAT序列和所公开的具有BAAT活性的细胞从β-丙氨酸生产丙二酰半醛所涉及的方法和材料。此外，还公开了从丙二酰半醛生产3-HP、以及有机化合物例如1，3-丙二醇、聚合的3-HP、3-HP和其它化合物例如丁酸、戊酸和其它化合物的共聚物、以及3-HP的酯所涉及的方法和材料.具体来说，本公开提供了BAAT核酸分子(例如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18)、肽(例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19)、宿主细胞、以及从β-丙氨酸生产丙二酰半醛的方法和材料，它们可用于更有效地制造丙二酰半醛和3-HP及其衍生物例如1，3-丙二醇、聚合的3-HP和3-HP的酯。尽管提供了生产β-丙氨酸和下游化学物质的具体方法和酶，本技术领域的专业人员将会认识到，类似的方法和变异的酶也可以使用。
几条代谢途径可用于从β-丙氨酸产生的丙二酰半醛生产有机化合物(图1)。3-HP可以通过使用从β-丙氨酸产生丙二酰半醛的具有BAAT活性的肽，从β-丙氨酸制造。丙二酰半醛可以用具有3-HP脱氢酶活性(EC 1.1.1.59或.31)的肽转化成3-HP。所获得的3-HP可以用具有酯酶活性的肽转化成聚合的3-HP。3-HP可以用具有醛脱氢酶(EC1.2.1.-)活性和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的肽转化成1，3-丙二醇。所获得的3-HP可以用具有脂肪酶或酯酶活性(EC 3.1.1.-)的多肽转化成3-HP的酯。
本公开还提供了增加β-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP(及其衍生物)的生产的方法。在具体的实施例中，使用本文提供的BAAT活性增加的变异体BAAT序列，与例如使用非天然启动子来表达酶和增加可用的丙酮酸相结合，可以增加β-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP的生产，例如增加至少20％、至少40％或甚至至少50％或至少100％。增加所需产物的生产可以是相对于不表达改进的BAAT、不从非天然启动子表达一种或多种酶、或不包含能增加可用丙酮酸的突变的同样类型细胞。例如，增加可以是相对于当天然BAAT(例如SEQ ID NO：3)表达时预计的产物参比值。在另一个实施例中，增加可以是相对于含有天然BAAT的实验样品。测量所需产物生产的方法在本技术领域中是已知的，本文中公开了具体的非限制性例子。
所公开方法的执行可以在体内、体外，或其组合。例如，本文提供的细胞或微生物可用于执行一个或多个图1中提供的步骤，或者含有具有指定酶活性的肽的提取物可用于执行一个或多个图1中提供的步骤。在一个实施例中，该方法可以包括在足以使细胞制造所需产物(例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物)的条件下，对具有BAAT和其它所需酶活性的公开细胞进行培养。对于涉及体内步骤的方法来说，细胞可以是分离的培养细胞或完整生物体例如转基因植物，或单细胞生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌和大肠杆菌细胞)。这样的细胞可以被称为生产细胞。由这些生产细胞生产的产物可以是有机产物，例如β-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP(或其衍生物)。
在另一个实施例中，使用了体外方法(或体内和体外方法的组合)。例如，可以使用具有本文公开的BAAT活性的细胞生产丙二酰半醛，将其纯化，然后与3-HP脱氢酶在体外允许3-HP形成的条件下温育。本技术领域的专业人员将会认识到，体外合成步骤可以经过化学反应或酶反应。例如，化学处理可用于执行图1中提供的转化。在一个实施例中，3-HP可以通过转酯作用转化成3-HP酯，或通过加氢作用转化成1，3-丙二醇。对有机酸例如3-HP进行的加氢可以使用任何方法例如用于琥珀酸或乳酸加氢的方法来进行。例如，3-HP可以使用金属催化剂来加氢。在另一个实施例中，3-HP可以脱水形成丙烯酸。任何方法都可用于执行脱水反应。例如，3-HP可以在催化剂(例如金属或无机酸催化剂)存在下加热以形成丙烯酸。
体内生产丙二酰半醛和3-HP及其衍生物
提供了体内生产丙二酰半醛和下游产品例如3-HP(及其衍生物)有关的方法和材料。例如，丙二酰半醛和3-HP可以在细胞、例如本文提供的细胞中生产。细胞可以是分离的培养细胞或完整生物体例如转基因植物，或单细胞生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌和大肠杆菌细胞)。在具体的实施例中，该方法包括在足以生产所需产物的条件下培养细胞。例如，细胞可以用表达适合的产生所需产物的酶的一种或多种核酸分子进行转染，然后在足以制造所需产物的条件下进行培养。所需产物可以从细胞提取，或者如果产物被细胞分泌，则可以从细胞外培养基中回收。本技术领域的专业人员将会认识到，编码适合的酶的外源核酸分子可以是一种或多种载体的一部分，并可以包含其它核酸序列。
提供了与在体内从β-丙氨酸生产丙二酰半醛有关的方法和材料。在一个实施例中，该方法包括在允许细胞从β-丙氨酸制造丙二酰半醛的条件下培养具有BAAT活性的公开细胞。在具体的实施例中，BAAT活性是由于编码BAAT酶(例如与SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17或19具有至少95％序列同一性的酶)的外源核酸分子的存在。在某些实施例中，细胞还包含编码其它酶活性的外源核酸分子，例如从PEP、丙酮酸或二者生产β-丙氨酸所需的酶活性。这样的酶的例子包括但不限于：PEP羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、和丙酮酸羧化酶、天冬氨酸脱羧酶。在一个实施例中，细胞包含编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子(例如编码与SEQ ID NO：38或40具有至少95％序列同一性的天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子)。细胞也可以包含增加可用的丙酮酸的突变。这样的突变的例子包括但不限于：ΔpoxB突变(例如将细胞的乙酸形成减少至少20％的突变)，ΔadhE或ΔatpFH突变(例如与不存在ΔadhE或ΔatpFH相比，将丙二酰半醛的生产增加至少20％的突变)，或减少柠檬酸合成酶产生的突变(例如表达与SEQ ID NO：52具有至少95％序列同一性的外源核酸分子)。
公开了在体内从丙二酸半醛生产3-HP有关的方法和材料。3-HP可以在营养品工业中用作食品、饲料添加剂或防腐剂。此外，3-HP可用于生产其衍生物，例如1，3-丙二醇、3-HP的酯、丙烯酸酯或丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、聚合的3-HP、3-HP和其它化合物例如丁酸、戊酸的共聚物。在一个实施例中，该方法包括在允许细胞从丙二酰半醛制造3-HP的条件下对具有BAAT活性(例如上述的那些)和3-HP脱氢酶活性(EC 1.1.1.59)的公开细胞进行培养。在具体的实施例中，3-HP脱氢酶活性是由于编码3-HP脱氢酶(例如与SEQ ID NO：21、23、27或31具有至少95％序列同一性的酶)的外源核酸分子的存在。
3-HP的衍生物可以按照上面的描述在体内从丙二酰半醛产生的3-HP来制造。3-HP的衍生物，例如3-HP的酯、聚合的3-HP或1，3-丙二醇，可以通过使用表达适当的酶的细胞在体内从3-HP来产生(参见图1)。在一个实施例中，这些酶通过用能够表达具有必需酶活性的蛋白的一种或多种核酸分子转染细胞来提供给细胞。例如，进一步含有脂肪酶或酯酶活性(EC 3.1.1.-)的细胞可用于将3-HP转化成3-HP的酯(例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯、或3-羟基丙酸2-乙基己酯)。进一步含有醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的细胞可用于将3-HP转化成1，3-丙二醇。进一步具有酯酶活性(EC 3.1.1.-)的细胞可用于将3-HP转化成聚合的3-HP。
使用体内和体外方法生产3-HP及其衍生物
在具体的实施例中，生产产物例如3-HP或其衍生物的方法使用体内和体外方法的组合来进行。例如，为了从丙二酰半醛产生3-HP，丙二酰半醛可以在细胞中体内产生(在某些实施例中它从细胞或培养基中被后续分离或纯化)，和将丙二酰半醛与其它酶或化学物质在体外相接触，以产生3-HP或其衍生物。尽管提供了具体的酶和方法，但本公开不限于这样的酶或方法。
例如，丙二酰半醛可以在BAAT活性增加的细胞(例如由于表达生物学活性增加的BAAT)体内产生，随后使用本技术领域已知的标准方法进行纯化。然后将丙二酰半醛与适合的酶相接触或温育，以在体外产生所需的下游有机化学物质。例如，为了从丙二酰半醛产生3-HP，可以将丙二酰半醛与具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的肽相接触，以制造3-HP。
3-HP的衍生物，例如3-HP的酯、聚合的3-HP或1，3-丙二醇，可以在体外从3-HP来产生。例如，3-HP可以按照上面的描述在体外生产生产，或在体内并然后分离。获得的3-HP可以在适当的酶(参见图1和本公开)的存在下进行温育。在一个实施例中，将所有这些酶与丙二酰半醛温育，并允许反应在体外进行。在另一个实施例中，将纯化的3-HP用化学物质处理以产生所需的衍生物。例如，3-HP可以通过转酯作用转化成3-HP的酯，通过氢化作用转化成1，3-丙二醇，或脱水形成丙烯酸。
在体外生产丙二酰半醛和3-HP及其衍生物
具有所需酶活性的纯化的肽可用于生产丙二酰半醛或3-HP(或其衍生物例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP)。例如，含有基本上纯的具有BAAT活性的肽的制备物可用于催化从β-丙氨酸形成丙二酰半醛。
此外，含有具有所需酶活性的肽的无细胞提取物可以单独或与纯化的肽或细胞组合使用以生产3-HP或其衍生物。例如，含有具有BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的肽的无细胞提取物，可用于从β-丙氨酸形成3-HP。任何方法都可用于生产无细胞提取物。例如，渗透冲击、超声、或反复的冻融循环然后进行过滤或离心，可用于从完整细胞生产无细胞提取物。
纯化的肽或无细胞提取物可用于生产3-HP，3-HP又被化学处理以产生另一种化合物。例如，化学方法可用于将3-HP修饰成衍生物例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。
细胞发酵以生产有机酸
提供了包含体内方法(例如单独地或与体外方法相组合)的生产丙二酰半醛和3-HP(及其衍生物)的方法。体内方法可以包括在培养基中培养具有适当酶活性的细胞(例如微生物)，以便产生所需的产物。一般来说，培养基或培养条件可以使得细胞生长到足够的密度并有效地产生产物。对于大规模生产工艺来说，可以使用任何方法，例如在别处描述的那些(Demain和Davies主编的《工业微生物学和生物技术手册》(第二版)(Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology，2nd Edition，Editors：Demain and Davies，ASM Press)；以及Stanbury和Whitaker的《发酵技术原理》(Principles of FermentationTechnology，Stanbury and Whitaker，Pergamon))。
简单来说，在含有具有例如葡萄糖碳源的适合培养基的罐(例如1加仑、5加仑、10加仑、50加仑、100加仑、200加仑、500加仑或更大的罐)中接种一种或多种所公开的细胞(例如微生物)。接种后，将细胞温育以允许生物质产生。一旦达到所需的生物质后，可以将含有细胞的肉汤转移到第二个罐中。该第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以比第一个罐大、小、或同样大小。通常，第二个罐比第一个罐大，使得可以在第一个罐的肉汤中再加入培养基。此外，该第二个罐中的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。例如，第一个罐可以含有具有木糖的培养基，而第二个罐含有具有葡萄糖的培养基。
一旦转移后，可以将细胞温育，以允许β-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP或3-HP衍生物的生产。一旦产生后，就可以用任何方法分离所形成的产物。例如，普通的分离技术可用于从肉汤中除去生物质，普通的分离方法(例如提取、蒸馏和离子交换方法)可用于从无细胞肉汤中获得所需产物。或者，产物可以在其产生的同时被分离，或者它可以在产物生产阶段已经结束后从肉汤中分离。在某些实施例中，细胞被分离，并从细胞中提取所需产物。
酶
所公开的细胞可以包含下列酶中的一种或多种。这些酶可以是内源的、外源的或其组合。术语“具有酶活性的肽”是指任何催化其它物质的化学反应而在反应完成后其自身不被破坏或改变的肽。通常，具有酶活性的肽催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。这样的肽可以具有任何类型的酶活性，包括但不限于与酶例如PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶有关的酶活性。
具有PEP羧化酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、Thermosynechococcus vulcanus和大肠杆菌。PEP羧化酶活性是指将PEP转化为草酰乙酸的能力。例如，PEP羧化酶核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AB057454、AF177946或X05903(核酸)和BAB64533、AAD53311或CAA29332(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了PEP羧化酶活性即可。
具有丙酮酸羧化酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于艾特利根瘤菌(Rhizobium etli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)以及大肠杆菌。丙酮酸羧化酶活性是指将丙酮酸转化为草酰乙酸的能力。例如，丙酮酸羧化酶的核酸和蛋白公开在GenBank登记号No：U51439、AF038548或D83706(核酸)和AAC44388、AAB92588或BAA12072(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了丙酮酸羧化酶活性即可。
具有天冬氨酸氨基转移酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)和大肠杆菌。天冬氨酸氨基转移酶活性是指将草酰乙酸转化成天冬氨酸的能力。例如，天冬氨酸氨基转移酶的核酸和蛋白公开在GenBank登记号No：L05064、D38459或X03629(核酸)和AAA26245、BAA07487或CAA27279(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了天冬氨酸氨基转移酶活性即可。
具有天冬氨酸脱羧酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于谷氨酸棒杆菌、百脉根慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、丙酮丁醇梭菌、阿维链霉菌和大肠杆菌。天冬氨酸脱羧酶活性是指将天冬氨酸转化成β-丙氨酸的能力。例如，天冬氨酸脱羧酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AF116114、AF311738、L17086以及SEQ ID NO：38和40(核酸)，以及GenBank登记号No：AAD28430、AAG47796、AAA24271以及SEQ ID NO：39和41(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了天冬氨酸脱羧酶活性即可。
具有BAAT活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)和大肠杆菌。BAAT活性是指将β-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。例如，BAAT的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AE004091或AE015451以及SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、16和18(核酸)，以及GenBank登记号No：AAG08698或P28269以及SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、17和19(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了BAAT活性即可。
具有3-HP脱氢酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和大肠杆菌。3-HP脱氢酶活性是指将丙二酰半醛转化成3-HP的能力。例如，3-HP脱氢酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AF316325、M84911、NC002516、AE015451和SEQ ID NO：20、22、26、29和30(核酸)，以及GenBank登记号No：AAL26884、AAA25892、NP 252259、AAN70239以及SEQ ID NO：21、23、27和31(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了3-HP脱氢酶活性即可。例如，编码具有3-HP脱氢酶活性的肽的核酸可以从铜绿假单胞菌的3-羟基异丁酸脱氢酶(mmsB)基因获得，并可以具有GenBank登记号M84911中显示的序列(相应的蛋白序列显示在GenBank登记号AAA25892.1中)。
具有脂肪酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于皱褶假丝酵母、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和白色念珠菌(Candida albicans)。脂肪酶活性是指特别是在3-HP和醇之间催化酯键的水解或形成的能力。例如，脂肪酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：A81171、Z30945、AF188894(核酸)和Z30945和AF188894(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了脂肪酶活性即可。
具有酯酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于皱褶假丝酵母、热带假丝酵母和白色念珠菌。酯酶活性是指在两分子3-HP之间或一分子3-HP和3-HP的聚合物之间、或两种3-HP的聚合物之间催化酯键的水解或形成、特别是酯键的形成的能力。例如，酯酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：Z30945和AF188894(核酸)以及CAA83122和AAF35171(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了酯酶活性即可。
具有醛脱氢酶(EC 1.2.1.-)活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于恶臭假单胞菌、大肠杆菌和酿酒酵母。醛脱氢酶活性是指使用NADH或NADPH作为还原剂将羧酸基团还原成醛基的能力。例如，醛脱氢酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AB100375、L40742和Z17314(核酸)以及BAD07372、AAC36938和CAA78962(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了醛脱氢酶活性即可。
具有醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于恶臭假单胞菌、运动发酵单胞菌(Z.mobilis)和酿酒酵母。醇脱氢酶活性是指使用NADH或NADPH作为还原剂将醛基还原成醇基的能力。例如，醇脱氢酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No：AB100375、M32100和M38457(核酸)以及BAD07371、AAA27682和AAA34411(蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了醇脱氢酶活性即可。
尽管公开了可以使用的酶的具体的例子，但本技术领域的专业人员将会认识到，可以使用本技术领域已知的方法鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核酸分子。例如，具有所需酶活性的肽的编码核酸分子可以使用常用的分子克隆或化学核酸合成方法和技术，包括PCR，来鉴定和获得。此外，标准的核酸测序技术和基于遗传密码将核酸序列翻译成氨基酸序列的软件程序，可用于确定特定的核酸是否与已知的具有酶活性的肽具有任何序列同源性。序列比对软件例如MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)可用于比较各种不同的序列。此外，核酸和氨基酸数据库(例如GenBank和EMBL)可用于鉴定具有所需酶活性的肽的编码核酸序列。简单来说，任何与具有所需酶活性(例如PEP羧化酶)的肽具有至少80％同源性的氨基酸序列，或任何与具有所需酶活性的肽的编码序列具有至少50％同源性的核酸序列，都可用作查询序列以搜索GenBank。然后可以对鉴定到的肽进行分析，以确定它们是否展现所需的酶活性。
核酸杂交技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核酸分子。简单来说，已知酶活性的肽的编码核酸分子或其片段，可用作探针，在中度到高度严紧条件下通过杂交鉴定相似的核酸分子。然后可以将这种相似的核酸分子分离、测序和分析，以确定所编码的肽是否具有所需的酶活性。
表达克隆技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核酸分子。例如，已知与特定的酶相互作用的底物可用于筛选含有该酶的噬菌体展示文库。噬菌体展示文库可以按照描述产生(Burritt等，Anal.Biochem.238：1-13，1990)，或者可以从商业化供应商例如Novagen(Madison，WI)获得。
肽测序技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核酸分子。例如，可以将纯化的肽通过凝胶电泳进行分离，并通过例如氨基酸微量测序技术测定其氨基酸序列。一旦测定后，可以使用该氨基酸序列设计简并的寡核苷酸引物。简并的寡核苷酸引物可用于通过PCR获得编码多肽的核酸。一旦获得后，可以对核酸进行测序，将其克隆到适合的表达载体中，并导入微生物。
蛋白的重组表达
本文描述的酶(例如图1中列出的酶)可以在细胞中单独或组合生产。生产重组蛋白的方法在本技术领域中是众所周知的，因此，本公开的范围包括任何本文公开的酶的重组表达。例如，重组核酸分子可用于产生细胞并实践本文公开的方法。在具体的实施例中，本公开的细胞(或使用这样的细胞的方法)包含至少一种外源核酸分子。
对于所公开的和公共可用的酶的核酸和氨基酸酶序列、例如PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶(及其保留可所需酶活性的变异体、片段和融合物)来说，能够通过标准的实验室技术来表达或纯化这些蛋白。本技术领域的专业人员将会理解，肽可以在任何目标细胞或生物体中重组生产，并在使用前、例如在生产3-HP或其衍生物之前纯化。
具有特定酶活性的肽可以是天然存在的或非天然存在的肽。天然存在的肽是任何具有在自然界中发现的氨基酸序列的肽，包括野生型和多态性的肽。天然存在的肽可以从任何物种获得，包括但不限于酵母、植物、真菌和细菌物种。非天然存在的肽是任何具有没有在自然界中发现的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：5-14和16-19)的肽。因此，非天然存在的肽可以是天然存在的肽的突变版本，或工程化的肽。例如，BAAT活性增加的非天然存在的肽可以是天然存在的BAAT肽的突变版本。肽可以使用本技术领域已知的方法，通过例如序列添加、缺失、取代或其组合来进行突变。
转化的细胞可用于执行本文描述的途径中的步骤的一个或多个步骤，或者转化的细胞可用于生产本公开的肽供随后在体外应用。例如，单个微生物可以含有执行图1中描述的步骤所需的每个肽的外源编码核酸，所述肽例如生产β-丙氨酸、丙二酰半醛或3-HP(或其衍生物)所需的酶。这样的细胞可以含有任何数量的外源核酸分子。例如，特定的细胞可以含有至少一种、至少两种、至少三种或至少四种不同的外源核酸分子，每一种都编码如图1所示将PEP或丙酮酸转化成β-丙氨酸(或后面的产物例如丙二酰半醛或3-HP)所必需的肽，或者特定的细胞可以内源性产生将丙酮酸转化成β-丙氨酸的肽，同时含有将β-丙氨酸转化成3-HP的肽的外源编码核酸分子。
编码本文描述的酶的核酸分子可以使用标准的分子生物学方法导入到细胞中。单个核酸分子可以编码超过一种酶或其它所需分子。例如，可以使用含有两种以上核酸序列例如二、三、四、五、六或甚至七种序列的操纵子。例如，每种核酸序列可以编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-羟基丙酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶或醇脱氢酶。在具体的实施例中，重组核酸序列包含PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-羟基丙酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶中的一种或多种的编码序列。
重组核酸序列可以包含促进编码酶的核酸序列表达的调控元件。通常，调控元件是在转录水平上调控其它DNA序列表达的DNA序列。因此，调控元件包括但不限于启动子、增强子等。例如，一种或多种启动子序列可以通过将启动子放置在cDNA序列的上游来促进编码序列的表达。在一个实施例中，使用了与天然启动子相比增强编码序列表达的非天然启动子。启动子的例子包括但不限于组成型启动子，以及响应或不响应特定刺激(例如光、氧、化学物质浓度)的启动子。本公开的核酸分子可以合并到载体中，载体可用于转化细胞，或者合并到细胞的基因组中，或这二者中。例如，编码所需酶的cDNA被连接到表达载体中，例如细菌表达载体。其它的克隆载体，例如其它质粒、噬菌体、粘粒、动物病毒和酵母人工染色体，也可以使用。这些载体可以被导入到各种不同的宿主中，包括简单和复杂的生物体，例如细菌、真菌或植物，它们通过导入异源cDNA成为转基因生物。
单个外源核酸分子可以编码一种或超过一种的肽。例如，单个外源核酸分子可以含有编码两种、三种或甚至四种不同肽的序列，例如下列的至少两种：PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶。此外，本文描述的细胞可以含有单拷贝或多拷贝(例如至少5个、至少10个、至少20个、至少35个、至少50个、至少75个、至少100个或至少150个拷贝)的特定外源核酸分子。本文描述的细胞可以含有超过一种特定外源核酸。例如，特定的细胞可以含有大约15拷贝的外源核酸分子X，以及大约25个拷贝的外源核酸分子Y。
任何方法都可用于将外源核酸分子导入细胞。将DNA转移到真核细胞中是常规的技术。将核酸分子导入细胞的非限制性的示例方法包括热冲击、脂质转染、电穿孔、接合、原生质体融合、用磷酸钙或磷酸锶沉淀、DEAE葡聚糖、微注射和生物弹射投送(例如参见Ito等，J.Bacterol.153：163-8，1983；Durrens等，Curr.Genet.18：7-12，1990；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》第二版(Molecular cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，USA，second edition，1989)；以及Becker和Guarente，Methods inEnzymology 194：182-7，1991)。在一个实施例中，可以通过用病毒载体感染来导入cDNA，例如反转录病毒(Bernstein等，1985，Gen.Engrg.7：235)，例如腺病毒(Ahmad等，1986，J.Virol.57：267)或疱疹病毒(Spaete等，1982，Cell 30：295)。
在本公开的特定细胞中包含的外源核酸分子可以以任何形式维持在该细胞中。例如，外源核酸分子可以被整合到细胞的基因组中或维持在游离体状态。即细胞可以是稳定的或暂时的转化体。
实施例1
β-丙氨酸氨基转移酶的纯化和克隆
本实施例描述了用于从灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中克隆天然β-丙氨酸氨基转移酶(BAAT)的方法。本技术领域的专业人员将会认识到，类似的方法可用于从任何所需的生物体克隆BAAT。
灰色链霉菌(ATCC21897；美国典型培养物保藏中心，AmericanType Culture Collection，Manassas，VA)在含有1％葡萄糖、0.1％K2HPO4、0.1％蛋白胨、0.05％酵母提取物、0.01％MgSO4·7H2O和0.2％β-丙氨酸的培养基中生长。在26℃和250rpm的摇动下，培养物生长在2.8L瓶的1L体积中。过夜生长后，通过离心收获细胞，用0.2倍体积的0.85％NaCl清洗，将细胞团(2L培养基的大约10g细胞)储存在-80℃直到使用。
将细胞团在冰上融化。将细胞糊转移到研钵中，与大约2g海沙一起碾磨。将细胞/沙混合物重新悬浮在大约30ml缓冲液A中(20mM pH7.2的磷酸钾，20μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇)，转移到玻璃管中，超声裂解细胞。通过离心(30,000xg离心30分钟)除去细胞碎片和沙。将上清液加到已经用缓冲液A平衡的DEAE琼脂糖柱，用缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)以分步梯度(0％，30％，50％，100％)洗脱蛋白。β-丙氨酸氨基转移酶活性在50％的步骤中洗脱下来。
收集具有活性的级份，浓缩，并加到用缓冲液A+150mM NaCl平衡的Superdex75柱。将具有β-丙氨酸氨基转移酶活性的级份合并，使用PD-10柱，用1mM pH 7.2的磷酸钾，20μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇作为缓冲液进行脱盐，然后将脱盐的级份加到用缓冲液HA(20μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇)和1％缓冲液HB(100mM磷酸钾，20μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇)平衡的羟基磷灰石柱。用缓冲液HB的逐步梯度(1％，10％，20％，100％)洗脱蛋白。β-丙氨酸氨基转移酶活性在100％的步骤中洗脱下来。将蛋白浓缩并保存在-80℃。
将纯化的蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶上跑动，切下大约48,000道尔顿的条带并测序。因为灰色链霉菌的基因组核苷酸序列不能公开获得，使用BLAST软件将得到的肽片段用于搜索已经发表的阿维链霉菌基因组序列，并用于鉴定同源的基因。设计引物用于从阿维链霉菌基因组DNA(ATCC#31267D)扩增预测的开放阅读框架：CGGGATCCCTAAACCGTGTACTCGTCC(SEQ ID NO：1)和GGAATTCCATATGACCCCTCAGCCGAATC(SEQ ID NO：2)。
使用富含GC的PCR系统(Roche)进行PCR，将得到的PCR片段用NdeI和BamHI消化，并使用快速连接试剂盒(Quick Ligation Kit，Roche)连接到已经用NdeI和BamHI消化的pET28b中，构建pET28b/SaBAAT。
天然的阿维链霉菌BAAT cDNA和蛋白序列分别显示在SEQ IDNO：3和4中。
实施例2
筛选生物学活性增加的BAAT
本实施例描述了用于分离对β-丙氨酸活性增加的BAAT蛋白(以及编码它们的核苷酸)的方法。类似的方法可用于鉴定其它的BAAT分子。
简单来说，筛选方法包括将含有BAAT的诱变文库的细胞生长在以β-丙氨酸作为唯一氮源的培养基上。在这些条件下，只有能够将β-丙氨酸转变成中间代谢物的细胞才能生长。例如，BAAT可以将β-丙氨酸和α-酮戊二酸分别转变成丙二酰半醛和谷氨酸，谷氨酸进入中间代谢并支持细胞生长。
诱变PCR基于Cadwell和Joyce的方案(PCR Methods Appl.2：28-33，1992)进行。该方法使用了各种稀释度的诱变缓冲液，该缓冲液含有21.2mM MgCl2、2.0mM MnCl2、3.2mM dTTP和3.2mM dCTP。将6.3％和9.4％(v/v)的诱变缓冲液加入到不同的PCR反应中(每个终体积为100μL)，另外还有含有1.5mM MgCl2的1X Taq PCR缓冲液、0.25μM正向和反向载体引物、200μM每种dNTP、5ng pET28b/SaBAAT DNA作为模板、5％DMSO、以及10单位Taq DNA聚合酶(Roche)。PCR程序的组成为：在94℃起始变性2分钟；94℃30秒、54℃45秒和72℃2.25分钟共30个循环；以及在72℃最终延伸7分钟。
将PCR产物用限制性酶BamHI和NdeI消化，连接到类似消化的载体pPRONde中，并转化到大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。pPRONde质粒是pPROLar.A122(ClontechLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的衍生物，其中使用来自Stratagene的QuikChange位点定向诱变试剂盒，通过寡核苷酸定向的诱变在起始ATG密码子处构建了NdeI位点。从随机选取的单菌落分离质粒DNA并测序，以获得对突变率的估计(每1000个核苷酸3个变化)。将多次转化体铺于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基上，获得了大约90,000个菌落。从平板刮下菌落，使用MiniSpin质粒方法(Qiagen，Valencia，CA)制备质粒DNA。将合并的质粒DNA通过乙醇沉淀进行浓缩。
将诱变的阿维链霉菌BAAT质粒文库转化到大肠杆菌BW25113的ΔgabT菌株(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-5，2000)的电感受态细胞中。gabT基因缺失被用于防止该基因编码的宿主的4-氨基丁酸氨基转移酶对β-丙氨酸的任何可能的活性。转化体在SOC培养基中生长1.5小时，离心，用0.85％NaCl清洗，并重新悬浮在0.75mL NaCl中，以除去痕量的氮源。取200μL用于接种25mL不含NH4Cl的M9基本培养基，其中添加了0.5％甘油、50μM吡哆醇-HCl、100μM IPTG、100mM MOPS pH 7.0、40μg/mL卡那霉素和5mM β-丙氨酸。好氧生长5天后，取1mL培养物用于接种25mL新鲜培养基。生长6天后，12,000个菌落在丰富培养基上铺板，从合并的菌落分离质粒DNA。
将大约700ng DNA转化到大肠杆菌ΔgabT的幼稚细胞中。将转化体在SOC培养基中回收1小时，离心，用0.85％NaCl清洗，并用于接种25mL上述培养基。3天后，将培养物在新鲜培养基中传代培养。两天后，在含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基上进行铺板，获得20,000个菌落。从这些合并的菌落分离质粒DNA，并用乙酸铵和乙醇沉淀。该文库被用于实施例3中的筛选。传代培养物也被稀释并铺板于含有5mM β-丙氨酸的基本培养基上，以获得个体菌落。将最大的个体菌落挑到新鲜培养基中，将显示出最好生长的菌落挑到含有5mM β-丙氨酸、50μg/mL水溶性对硝基苯胺和250μg/mL NaHSO4的基本培养基上。
从在染料培养基上显示出良好显色的三个菌落分离质粒DNA，转化到大肠杆菌ΔgabT菌株的幼稚感受态细胞中。在液体生长测试中，将重新转化的菌落在添加有5mM β-丙氨酸或5mM谷氨酸的上面给出的M9基本培养基中进行试验。通过这种筛选方法分离到的改进的克隆被测序，多个克隆显示出带有突变，导致24位的丝氨酸变成苏氨酸(S24T)。这种变异被称为BAAT1(SEQ ID NO：5和6)。其它的改进克隆组，尽管活性比S24T突变体低，但带有突变T83A、S314T和E348G(BAAT1b；SEQ ID NO：7和8)。
Figure G2007800324494D00551
分析
也使用
Figure G2007800324494D00552
(Aldrich)醛捕获染料直接测试克隆的丙二酰半醛生产。反应混合物包含50mM硼酸钠缓冲液，pH 8.0，0.035％β-巯基乙醇，10mM α-酮戊二酸，0.5mM磷酸吡哆醛，50mM β-丙氨酸，以及50-500μg细胞提取物或大约20μg纯化的蛋白。或者，100mM pH8的磷酸钾缓冲液可用于代替硼酸缓冲液和β-巯基乙醇。
反应在37℃温育30分钟，然后通过加入等体积的含有10mg/mL
Figure G2007800324494D00553
的1N NaOH终止。一旦紫色开始显现，在535nm处使用分光光度法读取反应物的吸光度。
第二轮诱变
使用两种不同的第一轮突变体(SEQ ID NO：5和7)和野生型阿维链霉菌的β-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：4)作为模板，制备了诱变文库。文库按照上面的描述构建，不同之处是3.9％和5.5％的诱变缓冲液，以及模板被克隆到pPRONde载体中。PCR程序包括在94℃起始变性2分钟；94℃30秒、55℃45秒和72℃2分钟共30个循环；以及在72℃最终延伸5分钟。将PCR产物凝胶纯化并按照上面的描述克隆，加入DpnI消化步骤以消除任何残留的模板。
连接利用来自三种模板的等量DNA。将连接的多次转化物放入BW25113ΔgabT菌株中。转化物在SOC培养基中回收2小时，合并，清洗，并重新悬浮在1mL 0.85％NaCl中。使用300μL重新悬浮物接种到含有25mL上述筛选培养基的瓶中，培养基含有1mM、5mM或20mM β-丙氨酸。培养物在37℃生长到OD6000.5-1.8后，将每种培养物的大约6,000个菌落铺板于两块含有25μg/mL卡那霉素的LB平板上。对于每种浓度的β-丙氨酸，分别从平板刮取菌落，使用MiniSpin质粒方法制备质粒DNA。将质粒DNA沉淀，获得350-372ng/uL的浓度。将每种亚文库2μL重新转化到BW25113ΔgabT菌株中，以减少宿主突变对培养物在β-丙氨酸上生长的作用。
转化物在SOC培养基中回收1小时，清洗，重新悬浮在0.85％NaCl中。重新悬浮物被用于接种含有1mM、5mM或20mM β-丙氨酸的液体筛选培养基，并分布的菌落铺板在相同筛选培养基的平板上。在分布铺板中生长良好的几个菌落被划线纯化，并进一步在液体生长试验中测试。这些液体生长试验在玻璃培养管中进行，使用了3mL筛选培养基。使用大约等量的接种物接种培养物，从有前景的培养物分离质粒DNA，并重新转化到幼稚BW25113ΔgabT中，将重新转化体在液体生长试验中重新试验。将看起来有前景的重新转化体生长在丰富培养基中，用1mM IPTG在30℃诱导4小时。使用BugBuster提取试剂(Novagen，Madison，WI)获得细胞提取物，使用以前描述的试剂进行分析。
从5mM β-丙氨酸筛选中分离的最高效突变体，除了第一轮诱变和筛选的S24T突变之外，还带有F113L突变；该变异体被称为BAAT2(SEQ ID NO：9和10)，被克隆到pET28b中以允许蛋白纯化和纯化蛋白的动力学分析。
第三轮诱变
BAAT2(SEQ ID NO：9)被用作第三轮诱变的模板。诱变按照上面的描述进行，使用3.9％和5.5％的诱变缓冲液。将突变的PCR产物克隆到pPRONde载体中，将连接反应物转化到BW25113ΔgabT菌株中，在含有2和5mM β-丙氨酸的筛选培养基中进行生长。每两天在新鲜筛选培养基中传代培养。将第三次传代培养物铺板于筛选培养基上，每个平板获得大约250个菌落。将最大的菌落挑到新鲜的筛选平板上，在液体生长试验中使用筛选培养基测试生长最快的菌落。从生长最快的菌落分离质粒DNA，并重新转化到筛选宿主中。按照上面的描述，将重新转化的克隆在液体生长试验中重新测试，并进行分析。
从第三轮诱变获得的最好变异体(BAAT3，SEQ ID NO：11和12)另外含有A133T突变，来自5mM β-丙氨酸筛选。该突变体被克隆到pET28b中以允许蛋白纯化和纯化蛋白的动力学分析。
将P3H突变体定向诱变为BAAT2和BAAT3突变体
在实施例3中描述了基于用
Figure G2007800324494D00572
试剂测量的活性增加，对改进的β-丙氨酸氨基转移酶进行高通量筛选。该筛选导致分离到了具有附加的P3H变化(SEQ ID NO：13和14，分别为核酸和蛋白序列)的变异体，并使用
Figure G2007800324494D00573
多位点定向诱变试剂盒(MultiSite-Directed Mutagenesis Kit，Stratagene)将该突变转移到BAAT2(SEQ ID NO：9)和BAAT3(SEQ ID NO：11)变异体中。用于诱变的引物具有如下序列：5’Phos-AAGGTACATATGACCCATCAGCCGAATCCC-3’(SEQ ID NO：15)。
DpnI处理过的反应物被直接转化到BW25113ΔgabT菌株中。通过PCR鉴定含有所需突变的菌落，并通过测序证实。使用50mM底物，用Purpald试剂对来自诱导细胞的提取物进行的分析，证实了由于P3H突变，醛的生产增加了大约2.5倍。带有来自第三轮诱变和筛选的突变以及P3H变化的变异体被命名为BAAT3ML(SEQ ID NO：16和17)。
第五轮诱变
BAAT3ML(SEQ ID NO：16)被用作第五轮诱变的模板。诱变按照前面的描述进行，使用3.9％和5.5％的诱变缓冲液。将突变的PCR产物克隆到载体pCEK/Pgaam8-1/PpmmsB/Spaat中，其中Pgaam8-1是编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的基因，PpmmsB是编码恶臭假单胞菌甲基-丙二酰半醛脱氢酶的基因(参见实施例5)，Spaat是编码粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因。清洁过的连接反应物被转化到大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞中，通过从大约78,000个菌落的合并物制备质粒DNA来构建文库。将2.3ug文库转化到BW25113ΔgabT或在ydfG基因前整合有启动子的BW25113菌株中(BW25113ΔgabT/Plac-araydfG)。后一种菌株被用于减少丙二酰半醛生产的可能毒性效应，因为ydfG基因产物可以将丙二酰半醛还原成3-羟基丙酸(实施例5)。
回收后，将转化物在筛选培养基中生长(不含NH4Cl的M9基本培养基，添加有1mM β-丙氨酸、1％葡萄糖、50μM吡哆醇-HCL、500μM IPTG、100mM MOPS pH 7.0、40μg/mL卡那霉素)。在新鲜筛选培养基中2-3次传代培养后，将菌落铺板于筛选培养基上，每个平板上获得了大约400个菌落。将最大的菌落挑到新鲜筛选平板上，在液体生长试验中使用筛选培养基测试生长最快的菌落。
从生长最快的克隆分离质粒DNA，并重新转化到BW25113ΔgabT/Plac-araydfG宿主中。将重新转化的克隆在液体生长试验中重新测试，从重新转化体分离质粒以证实质粒稳定性。将最好的突变体克隆到pET28b中，以允许蛋白纯化和纯化蛋白的动力学分析。
来自于第五轮诱变的最好变异体被命名为BAAT5-9(SEQ ID NO：18和19，分别为核酸和蛋白序列)，它含有额外的编码突变D110N和沉默突变c207t、c381g和t471c。
图2A-B显示了改进的β-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：6、10、12、14、17和19)与天然序列(SEQ ID NO：4)比较的氨基酸序列比对。
实施例3
筛选改进的β-丙氨酸氨基转移酶
本实施例描述了用于鉴定能够增加BAAT生物学活性的氨基酸变化的高通量筛选。
各带有来自实施例2的第一轮PCR诱变文库的克隆的单个菌落生长在具有透明底的384孔微量滴定板的单个孔中，以允许读取光密度。培养基是含有卡那霉素(50μg/ml)和IPTG(1mM)的LB培养基。将带有接种菌落的板盖上盖子，在旋转装置上放在37℃培养箱中24小时。使用了机械操作系统(Beckman-Coulter Biomeck，带有ORCA臂，使用内部开发的软件运行，装备有界面分光光度计)来鉴定OD600超过固定阈值的菌落，将45μl这样的培养物转移到96孔板中。
在每个孔中加入5μl(Novagen)溶液(100μl
Figure G2007800324494D00592
10μl rLyso(1/750稀释)和2μl benzonase)，混合两次。温育30分钟后，加入100μl底物混合物(0.13mM磷酸吡哆醛，66.5mM磷酸钾，13.3mM α-酮戊二酸，26.6mM β-丙氨酸)。然后将板从机械传送带上取出，用自粘性铝膜密封，在37℃下以200rpm混合。
两小时后，除去铝封，将板放回到机械传送带上，加入140μl
Figure G2007800324494D00601
(Aldrich)溶液(10mg
Figure G2007800324494D00602
在1ml 2M NaOH中)以检测醛。将板在室温温育45分钟以显色。通过加入10μl 95％乙醇来除去在
Figure G2007800324494D00603
温育期间可能产生的气泡。自动化比色测试读数在540nm处进行。
将被鉴定为产生的醛量增加的克隆回收，纯化其质粒，对β-丙氨酸氨基转移酶基因进行测序。这些克隆带有突变，导致3位的脯氨酸另外变成组氨酸(P3H)(SEQ ID NOS：13和14，分别为核酸和蛋白序列)。
实施例4
β-丙氨酸氨基转移酶活性的分析
本实施例描述了用于测量BAAT生物学活性的体外方法。这种分析方法可用于确定具体的BAAT变异体、融合物或片段是否保留了所需的BAAT生物学活性。
使用金属亲和层析，按照制造商(Novagen)的描述对克隆到pET28b中的β-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：3、5、9、11、16和18)进行纯化。通过跟踪β-丙氨酸和α-酮戊二酸产生L-谷氨酸来测量纯化的酶的酶活性。反应混合物含有50mM HEPPS，pH 8.0，10mM α-酮戊二酸，0.2mM 5-磷酸吡哆醛，以及不同量的β-丙氨酸和酶。温育在25℃下进行，以30秒的时间间隔取出0.05mL的等份样，加入到0.15mL反应淬灭缓冲液中(50％甲酸/50％50mM HEPPS pH 8)。通过在使用来自Pickering的pH 3.28和pH 7.48缓冲液作为流动相建立的AMINOSep-511柱(Transgenomic)上进行高压离子交换层析，然后用邻苯二甲醛进行柱后衍生以及荧光计检测，来测定L-谷氨酸。
改进的BAATs的比活和它们对β-丙氨酸的Km显示在表1中。
表1：改进的β-丙氨酸氨基转移酶的性质
Figure G2007800324494D00611
a1U＝1μmol/min
b对于β-丙氨酸来说
c未测定
实施例5
3-HP脱氢酶的克隆
本实施例描述了在例如细胞中克隆可用于将丙二酰半醛转变成3-HP的3-HP脱氢酶的方法。
按照Gokarn等US 2004/0076982中的描述，从铜绿假单胞菌分离了具有3-HP脱氢酶活性的蛋白(PammsB)的编码基因(SEQ ID NO：20)。纯化的酶(SEQ ID NO：21)的比活为70U/mg，对丙二酰半醛的Km为4.5mM；NADH是优选的还原剂。
按照Liao等的PCT WO 03/062173 A2中的描述，从粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)M3A分离了具有3-HP脱氢酶活性的蛋白(SEQID NO：23)的另一个编码基因(SEQ ID NO：22)。
通过从恶臭假单胞菌KT2440菌株的基因组DNA(ATCC 47054D)扩增mmsB基因，克隆了具有3-HP脱氢酶活性活性的蛋白的又一个编码基因。扩增引物允许克隆(PpmmsB)，并在含有BAAT3ML β-丙氨酸氨基转移酶的pPRONde载体的NotI和XbaI位点中提供了导入的核糖体结合位点。
5’-TACTGCGGCCGCAAGAAGGAGATATAGATATGCGTATTGCATTCATTGGC-3’(SEQ ID NO：24)和5’-CCTAGTCTAGATCAATCCTTCTTGCGATACCCCT-3’(SEQ IDNO：25)
SEQ ID NO：26和27分别为恶臭假单胞菌3-HP脱氢酶基因的核苷酸和蛋白序列。与铜绿假单胞菌3-HP脱氢酶(SEQ ID NO：21)相比，该酶显示出较高的生产，并且在带有BAAT3ML的大肠杆菌BW25113ΔydfG宿主中以β-丙氨酸作为唯一氮源上允许更好地生长。
为了增加蛋白的生产，将通过Proteoexpert程序设计的含有密码子2-7各种组合的文库，构建到pET28b/BAAT5-9载体中。使用的引物含有简并的核苷酸，其中掺入了由Proteoexpert软件建议的变化(48种组合)。
5’-GGAGGTATTTATATGCGTATYGCWTTYATYGGHCTGGGCAACATGGGCGCGCC-3’(SEQ ID NO：28)。
引物在简并区的任一端还包含20个碱基的序列。紧靠简并区的上游和下游但不包含简并区的基因片段被分别扩增。用于制造这些片段的模板含有BAAT5-9基因，并且PpmmsB基因被克隆在其下游的BamHI和NheI限制性位点中。上游片段包括BAAT5-9基因的一部分，以简并区上游的20个核苷酸终止。下游片段从简并区下游的20个碱基开始，并含有PpmmsB的3’末端。然后使用与片段的5’和3’末端同源的引物，将简并引物用于在第二次DNA扩增中将这两个片段桥接起来。从第二轮产物中用BamHI和NheI切下含有3-7位氨基酸残基的简并密码子文库的PpmmsB基因，克隆到pET28B/BAAT5-9载体的BamHI和NotI位点中。
在转化到菌株BW25113 ΔpanD(DE3)中后，将随机菌落转移到含有100μM IPTG的LB中进行诱导。生长良好的菌落被转移到含有5mM β-丙氨酸的筛选培养基和含有β-丙氨酸和醛捕获染料(副蔷薇苯胺氯化物，Sigma P-3750)的筛选培养基中。筛选培养基包含不含NH4Cl的M9盐、100mM MOPS pH 8.0、100μM吡哆醇-HCl、1％葡萄糖、5mM β-丙氨酸、40μg/mL卡那霉素、500μM IPTG，以及微量元素。有少数菌落在筛选培养基上生长得比平均情况好。其中，31号菌落的颜色比其它的更深。两个菌落，包括31号菌落，在染料培养基上颜色较浅，这是如果丙二酰半醛被快速转化成3-HP所预计的。
测试了几个克隆将β-丙氨酸生物转化为3-HP。将克隆在含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃生长过夜，以1∶24传代培养到12mL含有25μg/mL卡那霉素和10μM泛酸盐的2YT培养基中。培养物在37℃生长，在OD 0.4-0.6时用100μM IPTG在34℃诱导5小时。总OD为7200的培养物体积被旋转下来，重新悬浮在1.7mL生物转化培养基中。将1.5mL重新悬浮物转移到2mL的玻璃HPLC管中，置于34℃下以225rpm摇动。生物转化培养基含有不含NH4Cl的M9盐、100mM MOPS pH 8.0、100μM吡哆醇-HCl、1％葡萄糖、5mM β-丙氨酸和20μM泛酸钙。将17小时后收集的样品通过加入5％体积的90％甲酸进行酸化，并通过LC/MS测试3-HP的浓度。31号菌落给出了最高百分率的β-丙氨酸到3-HP的转化(35mg/L 3HP对野生型PpmmsB对照的2mg/L)，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶中条带密度来判断，也显示出最高的PpmmsB蛋白的表达。
SEQ ID NO：29是PpmmsB31的核苷酸序列；蛋白序列与SEQ IDNO：27一致。使用标准的克隆、DNA扩增或定向诱变技术将BAAT5-9/PpmmsB31序列结合到几种不同的操纵子中，以生产3-HP。
在另一个实施例中，使用基因组文库筛选来鉴定通过除去潜在有害的丙二酰半醛来增加BAAT表达的蛋白。这通过将基因组文库克隆到含有活性BAAT的载体中、并在含有β-丙氨酸作为唯一氮源的基本培养基上筛选来进行。含有编码增强BAAT活性的蛋白的插入片段的细胞将生长得更加有效，因此当生长于筛选培养基上时尺寸更大。BAAT活性可以通过例如增加β-丙氨酸的摄入、降低β-丙氨酸的分泌、增加辅因子利用、或增加丙二酰半醛的加工来增加。
将大肠杆菌ΔgabT的基因组DNA用限制性内切酶Sau3AI消化，使用来自Qiagen(Valencia，CA)的试剂盒将大小为1到3Kb的片段凝胶纯化。将纯化的DNA连接到含有改进的β-丙氨酸氨基转移酶(BAAT2，SEQ ID NO：9)的pPRONde载体中，转化到大肠杆菌ΔgabT细胞中。将转化反应物在1mL SOC培养基中回收1小时，离心，用0.85％NaCl清洗，重新悬浮在1mL 0.85％NaCl中。将20μL重新悬浮物铺于含有25μg/ml卡那霉素的LB培养基上，以获得菌落计数。将剩余的转化反应物铺于M9基本培养基上，每个板获得大约600个菌落。该M9培养基是基于标准的M9培养基，只是不含NH4Cl，并添加有0.5％甘油、50μM吡哆醇-HCL、100μM IPTG、100mM MOPS pH 7.0、40μg/mL卡那霉素、以及2mM β-丙氨酸。
生长两天后，看到8个大菌落(从总共大约7,000个中)比平板上的其它菌落大几倍。将这些菌落进行菌落纯化，分离它们的质粒，通过限制性酶消化比较插入片段。在8个菌落中，有6个带有独特大小的插入片段。对这些克隆的插入DNA片段进行测序，使用BLAST软件将序列结果与大肠杆菌基因组数据库进行比较。所有的6个克隆都与大肠杆菌基因组的同样区域同源。其中包含所有插入片段中的基因之一是ydfG基因(SEQ ID NO：30和31)，它被注解为可能的脱氢酶。因此，由于该基因在多拷贝质粒中的存在而增加表达的生长增强效应，可能是由于它将丙二酰半醛转变成3-HP的能力，因此或者减轻了丙二酰半醛的潜在毒性，或者通过除去了改进的β-丙氨酸氨基转移酶催化的反应产物之一，而增加将氮从β-丙氨酸插入到L-谷氨酸中的速度。
根据这些结果，ydfG编码的蛋白可以与BAAT组合使用以增加3-HP的生产。例如，表达ydfG的核酸分子可以与BAAT一起在细胞中表达，以增加细胞的3-HP生产。
将ydfG基因克隆到pET28b载体中(Novagen，Madison，WI)，以允许纯化和对纯化蛋白的动力学研究。用于该克隆的引物具有加入的限制性位点，以允许克隆到NdeI和BamHI位点中。GGTAGACATATGATCGTTTTAGTAACTGGAGCAAC(SEQ ID NO：32)和GTTCTCGGATCCTTACTGACGGTGGACATTCAGTC(SEQ IDNO：33)。片段的扩增使用Pfu DNA聚合酶来进行，以最小化扩增错误，使用的退火温度为58℃。将大约750bp的PCR产物条带进行凝胶纯化，用NdeI和BamHI消化，并使用NEB快速连接方法(New EnglandBioLabs，Waverly MA)连接到已经用同样酶消化的pET28B载体中。将连接反应物转化到大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞中，铺于含有25μg/ml卡那霉素的LB培养基上。将来自显示出正确插入大小的菌落的质粒DNA进行测序，显示出与来自大肠杆菌MG1655的ydfG序列一致。纯化的酶对丙二酰半醛的比活为48.5U/mg，Km为3.7mM；NADPH是该酶使用的唯一辅因子，使用NADH没有获得活性。
脱氢酶的辅因子偏好性被扩展或改变的例子在本技术领域中是已知的，这些方法可用于开发利用NADH的变异体ydfG蛋白。在BAAT和诱变的ydfG基因的存在下，在本身的ydfG功能被缺失的宿主中(例如ΔydfG大肠杆菌菌株)，在含有β-丙氨酸作为唯一氮源的基本培养基上进行生长筛选，是鉴定利用NADH的脱氢酶的一种方法。
实施例6
含有BAAT和3-HP脱氢酶的合成操纵子
本实施例描述了包含BAAT和3-HP脱氢酶的操纵子。这些操纵子可以被转化到细胞中，以允许在细胞中生产3-HP或其衍生物，例如通过将操纵子整合到细胞的染色体中。尽管描述了具体的BAAT和3-HP脱氢酶，但本技术领域的专业人员将会认识到，类似的方法可用于其它的BAATs(例如SEQ ID NO：5、7、9、13、16或19)和3-HP脱氢酶(例如SEQ ID NO：20、22或30)。
含有BAAT(SEQ ID NO：11)和3-HP脱氢酶(SEQ ID NO：27)的合成操纵子的整合使用Purvis等(Appl.Environ.Microbiol.71：3761-9，2005)描述的基于Tn5的系统来实现。将质粒pCEK-BAAT3ML-PpmmsB用限制性内切酶XhoI和AvrII消化，将带有Plac/ara启动子和BAAT3ML-PpmmsB基因的DNA片段连接到用XhoI和SpeI消化的质粒pLOI3472中。然后将获得的构建物pLOI-Bm3用PacI消化，将带有Plac/ara启动子、BAAT3ML-PpmmsB基因和旁侧带有FRT位点的卡那霉素抗性标记连接到用同样的内切酶消化的pLOI3469中，以便来自pLOI-Bm3的整个片段的旁侧为pLOI3469上存在的Tn5转座酶的外端(OE)和内端(IE)识别位点。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株BW25141中(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-5，2000；BW25141是pir+菌株，支持带有源自R6K的复制原点的质粒例如pLOI3469的复制)。得到的质粒pInt-Bm3可以通过转化或接合导入到非pir+的靶菌株中，转座酶的作用使得来自pLOI-Bm3的片段插入到靶菌株染色体的随机位点中，而pLOI-Bm3本身不能在该宿主中复制。
在一个实施例中，将pINT-Bm3转化到大肠杆菌11303ΔldhAΔpan(C-D)KIfld中(其中遗传标记KIfld表示在fldA基因前方插入了合成的Plac/ara启动子)。筛选对卡那霉素具有抗性但对氨苄青霉素敏感(表明失去了pLOI-Bm3质粒)的转化体，获得了其中BAAT3ML-PpmmsB构建物被整合到染色体中的菌株；带有整合基因的菌株被命名为INT(BAAT3ML/PpmmsB)。这些基因的存在，通过如同实施例2中描述的在β-丙氨酸作为唯一氮源上生长、通过在β-丙氨酸存在下生产3-HP、通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上观察到BAAT3ML和PpmmsB蛋白条带的存在、或者通过提取物的酶法分析，得到了证实。
按照上面的描述还产生并整合了带有改进的变异体BAAT5-9(SEQ ID NO：18)和PpmmsB31(SEQ ID NO：29)的类似构建物。
通过基于P1的转导，使用卡那霉素抗性标记监测基因在受体染色体中的整合，将整合的BAAT-mmsB基因导入了其它大肠杆菌菌株。
实施例7
克隆天冬氨酸脱羧酶基因
本实施例描述了用于从丙酮丁醇梭菌和阿维链霉菌克隆天冬氨酸脱羧酶的方法。天冬氨酸脱羧酶可用于将天冬氨酸转化成β-丙氨酸(参见图1)，例如在其中表达外源天冬氨酸脱羧酶的细胞中。本技术领域的专业人员将会认识到，类似的方法可用于从其它所需物种克隆天冬氨酸脱羧酶，例如其中需要3-HP生产的细胞物种中。
按照下述从丙酮丁醇梭菌和阿维链霉菌克隆编码天冬氨酸脱羧酶(由panD基因编码)的基因。将丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)细胞在5ml强化的梭菌培养基(Oxoid CM149)中厌氧生长，使用基因组“Puregene”DNA分离试剂盒(Gentra Systems；Minneapolis，MN)分离基因组DNA。阿维链霉菌基因组DNA从ATCC获得(ATCC31267D)。这两种基因组DNAs被用作模板扩增相应的panD基因。
对于丙酮丁醇梭菌的panD设计了下列引物：5’-GGAATTCCATATGCATTTAAATATGTTAAAATC-3’(CapanNdeF；SEQ ID NO：34)和5’-ACCCAAGCTTTAGCCAATTGTCCCGTGCTTTTC-3’(CapanHdR；SEQ ID NO：35)。丙酮丁醇梭菌在有100ng基因组DNA、CapanNdeF、CapanHdR引物和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)的100μlPCR中扩增。PCR条件是：94℃2分钟；94℃30秒，48℃30秒和72℃45秒共10个循环；94℃30秒，50℃30秒和72℃45秒共15个循环，结束时72℃最终延伸7分钟。
阿维链霉菌panD的引物是：5’-GGAATTCCATATGCTGCGTACCATGTTCAAGTC-3’(SapanNdeF；SEQ ID NO：36)和5’-ACACAAGCTTTAGGCGGTGACGGCCTGC-3’(SapanHdR；SEQ ID NO：37)。阿维链霉菌DNA在有100ng基因组DNA、SapanNdeF、SapanHdR引物以及2ul rTth聚合酶(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和0.5ul Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)的混合物的100μl PCR中扩增。PCR条件是：94℃2分钟；94℃30秒，52℃30秒和70℃45秒共10个循环；94℃30秒，56℃30秒和70℃45秒共15个循环，结束时70℃7分钟。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，按照制造商的说明书纯化获得的PCR产物。将纯化的PCR产物和pPRONde载体用NdeI和HindIII限制性酶在37℃消化过夜。然后将pPRONde载体用牛肠碱性磷酸酶(New England BioLabs，Ipswich，MA)按照制造商的说明书处理1小时，并使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化。将NdeI和HindIII消化的PCR产物在75℃加热30分钟，使限制性酶失活，直接用于与凝胶纯化的载体进行快速连接反应(New EnglandBiolabs)。在5分钟的连接后，使用Qiagen PCR纯化试剂盒对反应混合物进行缓冲液交换，并使用1μl连接反应物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞。将转化的细胞铺于添加了25μg/ml卡那霉素的LB平板上，对得到的菌落测试panD基因的存在。
对阳性克隆进行测序，以证实准确性，并重新转化到大肠杆菌E.coli 11303ΔldhA ΔpanC-D Kifld中。得到的克隆被用于生物转化和天冬氨酸脱羧酶分析。SEQ ID NO：38和39分别描述了丙酮丁醇梭菌的天冬氨酸脱羧酶基因(CapanD)的核苷酸和蛋白序列。SEQ ID NO：40和41分别描述了阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧酶基因(SapanD)的核苷酸和蛋白序列。
对于生物转化来说，将带有pPROCapanD和pPROSapanD质粒的细胞生长在添加有25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中直到OD600～0.6-0.8，并用1mM IPTG诱导6小时。诱导后，将细胞沉淀，在添加有10g/L葡萄糖、100mM MOPS pH 8.0、100μM吡哆醇-HCL和10μM泛酸盐的M9培养基中，或在添加有0.4g/L葡萄糖、20mM天冬氨酸、100mM MOPS和10μM泛酸盐的不含氮源的M9培养基中，重新悬浮到OD600为大约4。生物转化在含有1ml培养基的14ml Falcon管(目录号2059)中，在37℃和225rpm下进行20小时。在生物转化结束时，将细胞沉淀，在上清液中加入甲酸到5％使其酸化，过滤，按照实施例4中的描述通过HPLC分析从只有葡萄糖或从葡萄糖和天冬氨酸产生的β-丙氨酸。
图表2所示，从只有葡萄糖产生的β-丙氨酸为大约2mM。在生物转化培养基中加入天冬氨酸使β-丙氨酸的生产增加了2-3倍。
表2：通过天冬氨酸脱羧酶生产的β-丙氨酸
通过测量天冬氨酸到β-丙氨酸的转化，分析了粗提取物中的天冬氨酸脱羧酶活性。将带有质粒pPROEcpanD、pPROCapanD和pPROSapanD的细胞在2YT培养基中生长到OD600～0.4-0.6，并用1mMIPTG和0.2％阿拉伯糖诱导6小时。诱导后，将细胞沉淀，重新悬浮在50mM HEPPS(pH＝8.0)缓冲液中。使用French压力器将细胞破碎。标准反应混合物含有1.2mM天冬氨酸、50mM HEPPS(pH＝8.0)和0.4mg粗酶液，终体积为1mL。在37℃温育后，在定期的间隔取出50μl反应混合物，用150μl终止溶液(10％甲酸)淬灭。沉淀的蛋白通过离心除去，按照描述对每个样品中的β-丙氨酸进行定量。
粗提取物中天冬氨酸脱羧酶活性的比活显示在表3中。
表3：粗提取物中天冬氨酸脱羧酶的活性
Figure G2007800324494D00701
a1U＝1μmol/min
通过用每个细胞平均拷贝数为30～50的来自ColE1的复制原点代替每个细胞平均拷贝数为15的质粒pPROSapanD的p15a复制原点，细胞提取物中天冬氨酸脱羧酶的比活增加到0.54U/mg。
实施例8
用表达panD、BAAT和3-HP脱氢酶的细胞生产3-HP
本实施例描述了用于在体内通过在细胞中表达外源天冬氨酸脱羧酶、β-丙氨酸氨基转移酶和3-HP脱氢酶生产3-HP的方法。尽管使用了具体的酶序列，但本技术领域的专业人员将会认识到，本技术领域已知的或本文公开的其它这样的序列也可以使用。
表达整合到染色体中或者存在于一种或多种质粒中的外源panD基因(SEQ ID NO：40)、外源BAAT5-9基因(SEQ ID NO：18)和外源PpmmsB31基因(SEQ ID NO：29)的细胞，能够从葡萄糖生产3-HP(图1)。在这样的细胞的一个实施例中，将在染色体中整合了BAAT5-9-PpmmsB31基因的宿主用质粒pCECSapanD转化。宿主源自大肠杆菌菌株ATCC 11303(B菌株)，并还带有遗传标记Δpan(C-D)ΔldhA KIfld ΔpoxB。
将转化体生长在添加了氯霉素以维持质粒的LB培养基中，在30℃生长6小时，然后稀释100倍到过夜表达培养基(Novagen/EMDBiosciences，Madison WI)中，按照制造商的描述，只是碳源(过夜表达试剂盒中的溶液1)用0.1％(w/v)葡萄糖和2％L-阿拉伯糖代替，并另外含有30μg/ml氯霉素、20μM泛酸钙和1mM IPTG。将细胞在30℃生长大约18小时，然后将0.25-ml的部分用0.75ml生物转化培养基(M9盐，0.1M MOPS，pH 8.0，133μM吡哆醇，2.67％葡萄糖，13.3mM NaHCO3)稀释，在30℃继续温育23小时。通过离心回收培养上清液，用0.05体积的90％甲酸(终浓度大约1M)酸化。
按照WO 2005/118719 A2中的描述，通过LC/MS对上清液中的3-HP进行定量。简单来说，层析在Waters 2690液相色谱系统中进行，使用2.1mm×250mm Phenomenex Aqua C18反向色谱柱，在45℃下使用含有0.1％(v/v)甲酸的1％甲醇∶水作为流动相，以0.18ml/min的流速进行等度洗脱。在电喷雾负离子状态(-ESI)下操作的MicromassZQ四极质谱仪的参数被设置如下：毛细管：2.0kV；锥体：25V；提取器：4V；RF透镜：1V；源温度：120℃；去溶剂化温度：380℃；去溶剂化气体：600L/h；锥体气体：关闭；低质量分辨率：15.0；高质量分辨率：15.0；离子能量：0.2；放大器：650。建立起选定的监测MS参数的离子，以允许选择m/z 89，对应于3-HP的去质子分子离子[M-H]-。
带有pCECSapanD上的天冬氨酸脱羧酶基因、以及整合在染色体中置于合成的Plac/ara启动子的表达控制之下的BAAT和3-HP脱氢酶基因的细胞，积累2.7g/L 3-HP。
实施例9
乙酸和丙酮酸对β-丙氨酸氨基转移酶的影响
本实施例描述了用于确定乙酸和丙酮酸对β-丙氨酸氨基转移酶的生物学活性的影响的方法，这种影响通过3-HP的生产测定。乙酸和丙酮酸是大肠杆菌代谢的天然产物，在某些实施例中希望减少或消除它们，因为它们可以在3-HP途径中消耗前体并抑制酶。
乙酸在厌氧和好氧条件下都降低BAAT的体内生物学活性。将带有载体pCEC/SapanD的大肠杆菌11303Δpta ΔadhEΔfrdABCD ΔldhAΔpan(C-D)ΔpoxB INT(BAAT5-9/PpmmsB31)的培养物，在30℃下生长在含有氯霉素的LB培养基中。该培养物被用于接种在125mL瓶中的20mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD600为0.05。对培养基的修改包括用浓度为0.1％的葡萄糖和2％的阿拉伯糖代替溶液1，以及添加20uM泛酸钙、25ug/mL氯霉素、100uM吡哆醇-HCl和1mM IPTG。在诱导培养基中生长17小时后，OD600为8.4。将总共32,500OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在7.313mL葡萄糖或β-丙氨酸生物转化培养基中。葡萄糖生物转化培养基由M9盐、100mMMOPS pH 8、1％葡萄糖、500uM IPTG和50uM吡哆醇-HCl组成。β-丙氨酸生物转化培养基除了葡萄糖生物转化培养基的成分之外，还含有16mM β-丙氨酸。
对于好氧生物转化来说，分取900uL重悬浮培养物到14mLFalcon管中，用水和/或乙酸钠(pH 7)将体积调整到1mL。对于厌氧生物转化来说，分取1.35mL重悬浮培养物到1.8mL玻璃小瓶中，用水和/或乙酸钠(pH 7)将体积调整到1.5mL。加入的乙酸钠的终浓度是0、20mM和100mM，生物转化温育在30℃下，以225rpm摇动。来自β-丙氨酸的好氧培养物在生物转化后3小时获得样品，来自β-丙氨酸的厌氧培养物和来自葡萄糖的好氧培养物在6.5小时后获得样品，来自葡萄糖的厌氧培养物在28小时后获得样品。培养物上清液用0.05体积的90％甲酸酸化，离心，过滤，按照实施例8中的描述分析3-HP的产生。
在好氧条件下，20mM乙酸导致来自β-丙氨酸的3-HP减少22％，来自葡萄糖的3-HP减少28％。在同样条件下100mM乙酸导致来自β-丙氨酸的3-HP减少47％，来自葡萄糖的3-HP减少52％(表3)。在厌氧条件下观察到的3-HP的减少在8-29％的范围内，并且由于在所有培养物包括没有添加乙酸的对照中都存在乙酸作为天然发酵产物而可能更低。尽管该生物转化在poxB和pta基因都缺失的菌株中进行，但在某些培养条件下，仍然可以观察到乙酸的产生。
表4：乙酸对3-HP生产的影响
Figure G2007800324494D00731
还使用偶联分析测量了乙酸对细胞提取物中BAAT酶的体外生物学活性的影响，其中BAAT催化的反应的丙二酰半醛产物被3-HP脱氢酶还原。通过将离心收集的细胞用Bugbuster(EMD/Novagen，MadisonWI)按照制造商的描述重新悬浮，制备了带有整合的BAAT5-9/PpmmsB31的细胞提取物。在Costar 3635透紫外线的96孔平底板(Corning Incorporated，Corning NY)的孔中形成了终体积为200μl的反应混合物，其中含有50mM pH 8.0的磷酸钾、100μM磷酸吡哆醛、7.5mM α-酮戊二酸、20mM β-丙氨酸、1mM NADH、0.4mg细胞提取物蛋白。反应的进行监测为由于NADH的氧化而导致的A340的降低。乙酸或丙酮酸的影响通过加入最多20mM的任一种化合物(作为中性的Na+盐)而测定。
使用这种体外分析，在10mM乙酸或丙酮酸的存在下，BAAT-3-HP脱氢酶系统的活性被减少了大约50％。
基于这些观察，当在体内通过表达BAAT的细胞生产3-HP时，减少乙酸或丙酮酸的存在增加3-HP的生产。
实施例10
通过减少乙酸生产增加3-HP生产的宿主突变
本实施例描述了在例如表达外源BAAT的细胞中减少乙酸的生产，从而增加3-HP生产的方法。
在实施例9中获得的结果表明，当乙酸生产减少或不存在时，3-HP的生产增加。这可以通过例如在Vemuri等(Appl.Environ.Microbiol.72：3653-61，2006)中描述的发酵工艺控制、或通过使用由于不存在编码催化乙酸产生的酶活性的基因而导致乙酸的生产减少的菌株、或这两种方法的组合来实现。
任何减少乙酸产生的方法，不论是通过遗传操作还是通过控制培养基和/或生长条件或是这二者，都可以从任何利用β-丙氨酸氨基转移酶的途径增加3-HP的生产。通过大肠杆菌菌株减少乙酸生产的一种方法是缺失poxB基因，该基因编码丙酮酸氧化酶。丙酮酸氧化酶将丙酮酸代谢为乙酸和CO2，主要在应激下的培养物中或在好氧条件下的稳定期中表达。产生乙酸的另一个重要途径是从乙酰CoA的ack-pta途径，主要在厌氧条件下有活性。
下面的实施例说明了可破坏大肠杆菌中的基因、例如poxB基因的方法。使用下面的引物从质粒pKD4(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-5，2000)扩增了旁侧带有FRT的卡那霉素标记：5’-TAAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCATGAAACAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(poxBkoF；SEQ ID NO：42)和5’-TCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTTTACCTTAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’(poxBkoR；SEQ IDNO：43)。
扩增使用rTth DNA聚合酶XL(Applied Biosystems)按照制造商的说明书进行，使用了退火温度为52℃的8个循环和退火温度为60℃的22个循环，以及在68℃延伸2分钟。将扩增产物凝胶纯化(Qiagen)，用限制性内切酶DpnI消化3小时，使用Qiagen PCR纯化柱净化。将纯化的DNA(100ng)转化到带有诱导的Red辅助质粒pKD046(Datsenko和Wanner，2000)的BW25115感受态细胞中，将转化的细胞铺于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基上。
将获得的菌落重新划线进行纯化，，使用了被置换区域上游(poxBupF)和下游(poxBdnR)的引物检测单个菌落中所需的整合：5’-GGGATTTGGTTCTCGCATAATC-3’(poxBupF；SEQ ID NO：44)和5’-GTAGGGTCGTCTCCGTAAAC-3’(poxBdnR；SEQ ID NO：45)。
从BW25113Δ poxB::kan菌株制备P1噬菌体裂解物，用于将突变转移到带有Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)的大肠杆菌ATCC11303中。按照Datsenko和Wanner(2000)中勾画出的方法消除卡那霉素标记，不同之处在于pCP20转化体在30℃下含有羧苄青霉素的液体培养基中筛选，并在42℃非选择性纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试ΔpoxB缺失的影响。带有载体pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31的没有和具有ΔpoxB的菌株的每一种的两个复制在含有卡那霉素的LB培养基中生长。这些培养物被用于接种在125mL瓶中的15mL 2YT培养基，培养基中含有25μg/mL卡那霉素和10uM泛酸钙。在OD600为0.53时用1mM IPTG和0.2％阿拉伯糖将细胞诱导6小时。对于每个培养物将总共有4,000OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在1mL生物转化培养基中，培养基由M9盐、100mM pH 8的MOPS、1％葡萄糖、500uM IPTG和100uM吡哆醇-HCl组成。诱导和生物转化的培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。22.5小时后取出上清液样品，用0.05体积的90％甲酸酸化，离心，过滤，并按照实施例8中的描述对3-HP进行分析。将未酸化的上清液在BioRad Aminex HPX 87H离子交换柱(Bio-Rad目录号125-0140)上分析有机酸，分析在60℃进行，0.01N硫酸作为系统流动相，流速为0.6ml/min。根据折射率检测乙酸，并根据已知浓度的标准品进行定量。
带有ΔpoxB的菌株与不带有ΔpoxB的对照相比，显示出每OD的3-HP增加了25％，，与对照产生的0.64g/L乙酸相比，没有产生可检测的乙酸。因此，减少乙酸的代谢生产或存在，将导致通过涉及BAAT的途径增加3-HP的生产，例如增加至少20％，或至少25％。
可选的遗传方法可用于减少乙酸的生产，例如通过pta和/或ack基因的缺失。
实施例11
通过增加前体或减少竞争性途径来增加3-HP生产的宿主突变
本实施例描述了其它的或可选的方法，通过该方法可以在例如表达外源BAAT的细胞中增加3-HP的生产。可以通过增加途径中前体的可用性或减少中间体消耗成其它代谢产物，来增加3-HP的生产。
ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
可以通过例如选择启动子来增加前体的可用性。例如，可以构建其中催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2形成草酰乙酸的PEP羧化酶的活性增加的菌株，这种增加是通过将合成的启动子放置在编码该功能的染色体编码的基因ppc的前方。使用了将PCR产生的片段插入到大肠杆菌基因组特定位点中的修改方法(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Soc.USA 97：6640-5，2000)。通过将pPRONde的Plac/ara启动子区插入到Datsenko和Wanner的质粒pKD3中，构建了新的质粒pKDprom。
质粒pKDprom在紧邻Plac/ara启动子的两个FRT区之间带有氯霉素抗性标记(允许通过FLP蛋白切除标记)。使用下面带有紧接ppc基因上游的区域同源的5’延伸区的引物，扩增了该含有pKDprom上的标记和启动子的区段：5′-AGGATACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：46)和5′-GAGCATACTGACATTACTACGCAATGCGGAATATTGTTCGTTCATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA(SEQ ID NO：47)。按照Datsenko和Wanner(2000)的描述，通过λ噬菌体的Red重组酶功能将PCR产物重组到大肠杆菌BW 25113基因组的ppc位点中。插入后筛选氯霉素抗性，并通过PCR证实。
在ppc基因前方带有人工启动子和氯霉素抗性盒的菌株被命名为KIppc::cam，在ppc基因前带有人工启动子、从这里切除氯霉素抗性标记的菌株被命名为Kippc。通过P1噬菌体转导将KIppc::cam转移到带有Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D) ΔpoxB2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)的大肠杆菌ATCC 11303中，该菌株含有整合在基因组中的两个拷贝的改进的β-丙氨酸氨基转移酶(SEQ IDNO：18)和恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶(SEQ ID NO：29)。将抗性标记从Kippc菌株中分解出来，用载体pCEC/SapanD转化该菌株。在测量葡萄糖生产3-HP的生物转化中，对该菌株和没有Kippc标记的对照菌株进行了比较。
在含有氯霉素的LB培养基中生长的培养物被用于接种125mL瓶中的9mL修改过的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD为0.05-0.07。对培养基的修改包括用浓度为0.1％的葡萄糖和2％的L-阿拉伯糖代替溶液1，以及添加20μM泛酸钙、25μg/mL氯霉素、5μM吡哆醇-HCl和10mM NaHCO3。在生长2小时后，加入IPTG到浓度为1mM。在诱导培养基中生长19小时后，OD600在8.3(KIppc菌株)到13.8(对照)的范围内。将总共32,000OD单位的每种菌株离心，重新悬浮在8mL生物转化培养基中。生物转化培养基由M9盐、100mMMOPS pH 8、1％葡萄糖、500uM IPTG、5uM吡哆醇-HCl和10mMNaHCO3组成。诱导和生物转化培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。在诱导后和生物转化7.5和23小时后取样，用0.05体积的90％甲酸进行酸化，离心，过滤，并按照实施例8和4中的描述对3-HP、β-丙氨酸和天冬氨酸进行分析。
经过23小时的生物转化后，所有的葡萄糖都已经被利用，只留下了痕量的β-丙氨酸，带有Kippc的菌株每OD产生的3-HP是对照的2.4倍(表5)。因此，PEP羧化酶活性的增加为3-HP生产途径提供了增加的前体草酰乙酸。增加草酰乙酸形成的可选实施方案包括在质粒上克隆和表达PEP羧化酶，或克隆和表达丙酮酸羧化酶，该酶将丙酮酸加CO2/HCO3 -转化成草酰乙酸，同时消耗ATP。
表5：ppc表达增加对3-HP生产的影响
Figure G2007800324494D00781
a大肠杆菌ATCC 11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D) ΔpoxB2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)/pCECSapanD
bONEX＝离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的3-HP和β-丙氨酸。
aspC，天冬氨酸氨基转移酶
可用于增加前体可用性的另一个例子的遗传构建物，是其中催化从草酰乙酸和谷氨酸形成天冬氨酸(图1)的天冬氨酸氨基转移酶的活性被增加的菌株，这种增加是将合成的启动子放置在编码该功能的染色体编码的基因aspC的前方。使用下面带有紧挨aspC基因上游的区域同源的5’延伸区的引物，扩增了含有pKDprom上氯霉素抗性标记和启动子的区段：5′-CCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：48)和5′-GCCCAGAATCGGGTCGGCAGGAGCGGCGGTAATGTTCTCAAACATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA(SEQ ID NO：49)。
按照Datsenko和Wanner(2000)的描述，通过λ噬菌体的Red重组酶功能将PCR产物重组到大肠杆菌BW 25113基因组的aspC位点中。插入后筛选氯霉素抗性，并通过PCR证实。在aspC基因前方带有人工启动子和氯霉素抗性盒的菌株被命名为KIaspC::cam，在aspC基因前带有人工启动子、并且从这里氯霉素抗性标记被切除的菌株被命名为KIaspC。通过P1噬菌体转导将KIaspC::cam转移到带有ΔldhAΔpan(C-D)KIppc 2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)的大肠杆菌ATCC 11303中，该菌株含有整合在基因组中的两个拷贝的改进的β-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：18)和恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶(SEQ ID NO：29)。将抗性标记从KIaspC菌株中分解出来，用载体pCEC/SapanD转化该菌株。在测量葡萄糖生产3-HP的生物转化中，对该菌株和没有KIaspC标记的对照菌株进行了比较。
在含有氯霉素的LB培养基中生长的培养物被用于接种7mL修改过的过夜表达培养基(Novagen)。对培养基的修改包括用浓度为0.1％的葡萄糖和2％的L-阿拉伯糖代替溶液1，以及添加10μM泛酸钙、30μg/mL氯霉素和5μM吡哆醇-HCl。在生长3小时后，加入IPTG到浓度为1mM。在诱导培养基中生长19小时后，将每种培养物2.5ml用7.5ml有M9盐、100mM MOPS pH 8、1％葡萄糖、100uM吡哆醇-HCl组成的生物转化培养基稀释。诱导和生物转化培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。在生物转化21小时后取样，用0.05体积的90％甲酸进行酸化，离心，过滤，并按照实施例8中的描述对3-HP进行分析。
带有KiaspC的菌株产生441mg/L.OD，与对照菌株产生的175mg/L.OD的量相比增加了2.5倍。因此，天冬氨酸氨基转移酶活性的增加为3-HP生产途径提供了增加的前体天冬氨酸。可用于增加天冬氨酸生产的可选实施方案包括表达天冬氨酸氨基转移酶(例如在质粒上)。
gltA，柠檬酸合成酶
调节柠檬酸合成酶的表达以提高可用作天冬氨酸氨基转移酶反应的底物的草酰乙酸以及用作丙酮酸羧化酶和/或PEP羧化酶的正激活剂的乙酰CoA的水平，和减少在柠檬酸循环中变成二氧化碳而丢失的碳量。对于大肠杆菌来说，通过将ATG翻译起始密码子改变成GTG、以及将核糖体结合位点改变成不是非常理想的序列，来减少柠檬酸合成酶的产生，但是也可以使用对这些区域的其它突变、在启动子和编码区的突变、掺入稀有密码子或二级结构、或RNA干扰技术来进行。在下面用下划线显示的本实施例中使用的突变，结合到Wanner基因敲除技术(Datsenko和Wanner，2000)使用的下游引物中。上游引物(gltAKDF)设计为一旦抗性标记被分解出来，留下的“疤痕”将代替上游区域中同样数量的核苷酸。该区域不包含任何其它已知的基因，并位于预测的gltA启动子的下游。5’-CTGTACCCAGGTTTTCCCCTCTTTCACAGAGCGGCGAGCCAAATAAAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(gltAKDF；SEQ ID NO：50)和5’-TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCACATGAATATCCGCCTTAGTTC-3’(gltAKDR；SEQ ID NO：51)。
SEQ ID NO：52是分离的弱化菌株中修饰的gltA位点(KdgltA)的所得序列。
使用gltAKDF和gltAKDR引物从质粒pKD4(Datsenko和Wanner，2000)扩增旁侧带有FRT的卡那霉素标记。扩增使用rTth DNA聚合酶XL(Applied Biosystems)按照制造商的说明书进行，使用退火温度为52℃的8个循环和退火温度为60℃的22个循环，以及在68℃延伸2.25分钟。将扩增产物凝胶纯化(Qiagen)，用限制性内切酶DpnI消化2小时，使用Qiagen PCR纯化柱净化。将纯化的DNA(100ng)转化到带有诱导的Red辅助质粒pKD046的BW25115感受态细胞中，将转化的细胞铺于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基上。
将获得的菌落重新划线进行纯化，检测单个菌落的所需整合，所述检测使用被置换区域上游的引物(gltAupF；5’-GATTCGCCATTTATTCGTCATC-3’；SEQ ID NO：53)和下游的引物(gltAdwnR；5’-CTGGGTCAAAGGTGAACAC-3’；SEQ ID NO：54)，或者使用上游引物和特异针对改变的核苷酸的引物(gltAtestR；5’-GTTTTGCTTTTGTATCAGCCACA-3’；SEQ ID NO：55)。使用59.5℃的退火温度，gltAupF/gltAtestR引物使用野生型gltA模板时不能产生PCR产物，但是使用纯化的转化体时产生了具有预期大小的产物。
然后从gltA已调节的菌株制备P1噬菌体裂解物，用于将突变转移到带有Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔpoxB和整合了一个拷贝BAAT5-9/PpmmsB31的大肠杆菌ATCC11303中。按照Datsenko和Wanner(2000)中勾画的方法将卡那霉素标记分离，不同之处在于pCP20转化体在30℃下在含有羧苄青霉素的液体培养基中筛选，并在42℃非选择性纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试gltA调节(KdgltA)的影响。将带有Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔpoxB INT的菌株11303和带有Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔpoxB INT KDgltA的菌株11303的培养物，它们都带有载体pCEC/SapanD，生长在含有氯霉素的LB培养基中。这些培养物被用于接种125mL瓶中的10mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD达到0.05-0.10。对培养基的修改包括用浓度为0.1％的葡萄糖和2％的L-阿拉伯糖代替溶液1，以及添加20μM泛酸钙、25μg/mL氯霉素、50μM吡哆醇-HCl和10mM NaHCO3。在生长1.25小时后，加入IPTG到浓度为1mM。在诱导培养基中生长18小时后，OD600在4.5(KDgltA)到11.2(对照)的范围内。将总共32,000OD单位(OD/ml乘以ml)离心，重新悬浮在8mL生物转化培养基中。生物转化培养基由M9盐、100mM MOPS pH 8、1％葡萄糖、500μM IPTG、50μM吡哆醇-HCl和10mM NaHCO3组成。诱导和生物转化培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。在诱导后以及生物转化6和24小时后取样，并按照实施例8和4中的描述对3-HP和β-丙氨酸进行分析。
带有已调节的KdgltA的菌株与对照相比，显示出每OD的3-HP增加了2.5到3.7倍(表6)，表明减少通过柠檬酸合成酶步骤的代谢流对3-HP的生产有利。
表6：调节柠檬酸合成酶生产的影响
Figure G2007800324494D00821
a大肠杆菌ATCC 11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔpoxBINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)/pCECSapanD
bONEX＝离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的3-HP和β-丙氨酸。
atpFH，F 0 F 1 -ATP合成酶的F 1 和F 0 组分
atpFH基因编码偶联F0F1-ATP合成酶的F1和F0组分的两种蛋白。缺失了这两个基因的菌株不能通过将质子迁移通过复合物来合成ATP，而是具有胞质F1-ATPase。ATP突变体依赖底物水平的磷酸化，从ADP再生ATP。流量的增加是通过糖酵解途径经磷酸转乙酰酶(产生乙酸)产生ATP和通过TCA循环借助琥珀酰CoA合成酶产生ATP。通过这些途径增加的流量导致NADH产生增加。胞质ATPase活性为糖酵解提供ADP，突变体生长速度的降低减少了用于细胞生长的丙酮酸利用。Causey等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(8)：2235-40，2004)显示，atpFH基因(ΔatpFH)的缺失导致了丙酮酸积聚，因为糖酵解流量的增加大于乙酸途径的容量。
在3-HP的天冬氨酸途径中，ΔatpFH突变与丙酮酸或PEP羧化酶过表达的组合将增加从丙酮酸到草酰乙酸的碳流，NADH可以被3-HP脱氢酶用于驱动该途径。其它增加可用的丙酮酸库的突变是ΔldhA、Δack-pta、ΔfrdABCD、ΔpoxB和ΔadhE。atpFH缺失可以与柠檬酸合成酶弱化组合使用，以减少通过TCA循环的流量，尽管NADH本身是柠檬酸合成酶的变构抑制剂。
使用了下面的引物来构建atpFH基因的缺失：5’-GAGCAATATCAGAACGTTAACTAAATAGAGGCATTGTGCTGTGAATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(atpFHkoF；SEQ ID NO：56)和5’-CGCTGATTTCGGTGGAATTCAGTTGCATGCTCCAGTCCCCTTAAGACTGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’(atpFHkoR；SEQ ID NO：57)。这些引物被用于从质粒pKD4扩增旁侧带有FRT的卡那霉素标记(Datsenko和Wanner，2000)。扩增使用rTth DNA聚合酶XL(AppliedBiosystems)按照制造商的说明书进行，使用退火温度为52℃的8个循环和退火温度为60℃的22个循环，以及在68℃延伸2分钟。将扩增产物凝胶纯化(Qiagen)，用限制性内切酶DpnI消化3小时，使用Qiagen PCR纯化柱净化。将纯化的DNA(100ng)转化到带有诱导的λRed辅助质粒pKD046的BW25115感受态细胞中，将转化的细胞铺于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基上。将获得的菌落重新划线进行纯化，使用被置换区域上游的引物(atpFHupF；5’-CTCTGCTGCGTACTCAGTTC-3’；SEQ ID NO：58)和下游的引物(atpFHdnR；5’-GATCATTTCACCCTGCATACAATC-3’；SEQ ID NO：59)，检测单菌落的所需整合。然后从BW25113ΔatpFH菌株制备P1噬菌体裂解物，用于将突变转移到大肠杆菌ATCC 11303 Δpta ΔadhEΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)中。按照Datsenko和Wanner(2000)中勾画的方法将卡那霉素标记分离，不同之处在于pCP20转化体在30℃下在含有氨苄青霉素的液体和固体培养基中相继筛选，并在42℃非选择性地纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试atpFH敲除的影响。将均带有载体pPRONde/SapanD/BAAT5-9/PpmmsB31和pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31的菌株11303 Δpta ΔadhEΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)(对照)和11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCDΔldhA Δpan(C-D)ΔatpFH的培养物，生长在含有卡那霉素的LB培养基中，允许生长较缓慢的ΔatpFH菌株生长较长的时间。培养物被用于接种125mL瓶中的20mL含有25μg/mL卡那霉素和10μM泛酸钙的2YT培养基。细胞在OD600为0.29(ΔatpFH)或0.65(对照)时用1mMIPTG和0.2％阿拉伯糖都诱导6小时和22.5小时。将4,000OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在1mL生物转化培养基中。生物转化培养基由M9盐、100mM MOPS pH 8、1％葡萄糖、500μM IPTG和50μM吡哆醇-HCl组成。诱导和生物转化培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。在大约23小时后取样，并按照实施例8中的描述对3-HP进行分析。
带有ΔatpFH的菌株与对照相比显示出每OD的3-HP增加了2到3.4倍(表7)。
表7：ΔatpFH对3-HP生产的影响
a大肠杆菌ATCC 11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)/pPRONde/SapanD/BAAT5-9/PpmmsB31或pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31
也进行了生物转化以测量带有质粒pCEC/SapanD的大肠杆菌11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)和11303 Δpta ΔadhEΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔatpFH菌株从葡萄糖生产的β-丙氨酸。将生长在含有氯霉素的LB培养基中的培养物用于接种125mL瓶中的10mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD达到0.05-0.15。对培养基的修改包括用终浓度为0.1％的葡萄糖和2％的阿拉伯糖代替溶液1，添加20μM泛酸钙、25μg/mL氯霉素、50μM吡哆醇-HCl和10mM NaHCO3。在生长1.25小时后，加入IPTG到浓度为1mM。在诱导培养基中生长20小时后，ODs在1.8(ΔatpFH)到13.2(对照)的范围内。将10,000OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在2.5mL生物转化培养基中。使用1和1.5mL重悬浮培养物在14mLFalcon管中进行生物转化。生物转化培养基由M9盐、100mM MOPS pH8、1％葡萄糖、500μM IPTG、50μM吡哆醇-HCl和10mM NaHCO3组成。诱导和生物转化培养物都生长在30℃下，以225rpm摇动。在诱导后和生物转化24小时后取样，并按照实施例4中的描述对β-丙氨酸进行分析。
菌株11303Δpta  ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)ΔatpFH/pCECSapanD与对照相比，显示出每OD的β-丙氨酸增加了1.4到2.2倍(表8)。因此，atpFH基因的缺失在从β-丙氨酸形成3-HP的代谢途径的存在下，导致β-丙氨酸和3-HP形成的增加。
表8：ΔatpFH对β-丙氨酸生产的影响
Figure G2007800324494D00851
a大肠杆菌ATCC 11303 Δpta ΔadhE ΔfrdABCD ΔldhA Δpan(C-D)/pCECSapanD
bONEX＝离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的β-丙氨酸。
尽管被命名为Kippc、KiaspC、KdgltA和ΔatpFH的突变的影响被分别确定，并且每种都显示出导致具有天冬氨酸脱羧酶、改进的BAAT和3-HP脱氢酶活性的细胞增加3-HP生产，但这些突变中的两种或多种的组合预计将进一步增加这些细胞的3-HP生产量。
实施例12
β-丙氨酸的生产
本实施例描述了生产β-丙氨酸的方法以及能够生产β-丙氨酸的细胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但是例如根据需要产生β-丙氨酸的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及所公开的酶的变异体)也可以使用。
β-丙氨酸可以在例如天冬氨酸脱羧酶的存在下(图1)，在体外、体内(例如在细胞中)或其组合从天冬氨酸产生。例如，通过例如使用重组技术在细胞中表达具有天冬氨酸脱羧酶活性的酶的编码核酸分子，可以将产生天冬氨酸的细胞(例如微生物)工程化以制造β-丙氨酸。示例的天冬氨酸脱羧酶核酸分子包括在SEQ ID NO：38和40中显示的，及其保留了编码可以将天冬氨酸转化成β-丙氨酸的酶的能力的变异体(例如编码SEQ ID NO：39或41的核酸)。细胞也可以具有PEP羧化酶活性或丙酮酸羧化酶活性(或二者)，以及天冬氨酸氨基转移酶活性，以允许从PEP或丙酮酸(或二者)生产天冬氨酸。这样的活性对于细胞来说可以是内源的或外源的(例如由编码肽的外源核酸分子提供)。
在具体的实施例中，细胞包含编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的一种或多种外源核酸，其中表达这些核酸分子的至少一种受到增加核酸分子表达的非天然启动子的控制。在具体的实施例中，这种表达增加提高了细胞产生的β-丙氨酸量，例如增加至少20％。这样的细胞也可以包含增加可用的丙酮酸库的突变，例如poxB、adhE、atpFH的功能性缺失或它们的组合。在某些实施例中，细胞还包含降低柠檬酸合成酶生产的突变或核酸分子(例如SEQ ID NO：52的表达)。
因此，在体内生产β-丙氨酸的方法包括将所公开的细胞在足以从天冬氨酸生产β-丙氨酸的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造β-丙氨酸的方法包括用编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的一种或多种外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造β-丙氨酸。产生的β-丙氨酸可以从细胞培养基中分离，或从细胞中提取。
还提供了体外从天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法。例如，可以通过将天冬氨酸与具有天冬氨酸脱羧酶活性的酶相接触，来实现从天冬氨酸到β-丙氨酸的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来进行。
在体内或体外发酵过程中形成的β-丙氨酸可以使用HPLC(参见实施例4)或其它方法(参见实施例7)来分析。
实施例13
丙二酰半醛的生产
本实施例描述了生产丙二酰半醛的方法以及生产丙二酰半醛的细胞。在具体的实施例中，这样的方法和细胞可以用作制造3-HP的起点。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但是例如根据需要产生丙二酰半醛的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
丙二酰半醛可以从β-丙氨酸经BAAT(图1)在体外、体内(例如细胞中)或其组合生产。例如，通过例如使用重组技术在细胞中表达具有BAAT活性的酶的一种或多种编码核酸分子，可以将产生β-丙氨酸的细胞(例如微生物)(参见实施例12)工程化以制造丙二酰半醛。示例的BAAT核酸分子包括在SEQ ID NO：5、7、9、11、13、16和18中显示的及其保留了编码能够将天冬氨酸转化成β-丙氨酸的酶的能力的变异体(例如编码SEQ ID NO：6、8、10、12、14、17或19的核酸)。
因此，在体内生产β-丙氨酸的方法可以包括将所公开的细胞在足以从β-丙氨酸生产丙二酰半醛的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造丙二酰半醛的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶和BAAT的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造丙二酰半醛。产生的丙二酰半醛可以用作制造其它产物例如3-HP的前体。在具体的实施例中，丙二酰半醛可以从细胞培养基中分离，或从细胞中提取以备使用。
还提供了在体外从β-丙氨酸生产丙二酰半醛的方法。例如，可以通过将β-丙氨酸与具有BAAT活性的酶相接触，来实现β-丙氨酸到丙二酰半醛的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来进行。
在体内或体外发酵过程中形成的丙二酰半醛可以使用HPLC或
Figure G2007800324494D00881
醛捕获染料(参见实施例1)来分析。
实施例14
从β-丙氨酸生产3-HP
本实施例描述了生产3-HP的方法以及生产3-HP的细胞。在具体的实施例中，这样的方法和细胞可以用作制造3-HP的衍生物、例如3-HP的酯、1，3-丙二醇和聚合的3-HP(分别参见实施例14-16)的起点。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根据需要产生3-HP的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
3-HP可以从β-丙氨酸经丙二酰半醛(图1)在体外、体内(例如细胞中)或其组合生产。例如，通过例如使用重组技术在细胞中表达具有3-HP脱氢酶活性的酶的一种或多种编码核酸分子，可以将产生丙二酰半醛的细胞(例如微生物)(参见实施例13)工程化以制造3-HP。示例的3-HP脱氢酶核酸分子包括在SEQ ID NO：20、22、26和29中显示的及其保留了编码能够将天冬氨酸转化成β-丙氨酸的酶的能力的变异体(例如编码SEQ ID NO：21、23、27或31的核酸)。
因此，在体内生产3-HP的方法可以包括将所公开的细胞在足以从β-丙氨酸和丙二酰半醛生产3-HP的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造3-HP的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT和3-HP脱氢酶的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造3-HP。产生的3-HP可以用作制造其它产物例如3-HP的酯、聚合的3-HP和1，3-丙二醇的前体。在具体的实施例中，3-HP从细胞培养基中分离或从细胞中提取以供使用。
还提供了在体外从丙二酰半醛生产3-HP的方法。例如，可以通过将丙二酰半醛与具有3-HP脱氢酶活性的酶相接触，来实现从丙二酰半醛到3-HP的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来进行。
在体内或体外发酵过程中形成的3-HP可以使用US20040076982A1中公开的方法(这些些方法在此引为参考)来分析。
实施例15
3-HP的酯的生产
本实施例描述了生产3-HP的酯的方法以及能够生产3-HP的酯的细胞。3-HP酯的具体例子包括但不限于：3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或3-羟基丙酸2-乙基己酯。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根据需要产生3-HP酯的宿主细胞，来自其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
3-HP的酯可以从3-HP产生。例如，通过表达编码具有脂肪酶或酯酶活性(EC 3.1.1.-)的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞或微生物(例如在实施例14中描述的)工程化以制造3-HP的酯。
例如，通过表达编码具有脂肪酶或酯酶活性的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)工程化以制造3-HP的酯。在具体的实施例中，产生3-HP的酯的转化细胞可以包含具有脂肪酶或酯酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产3-HP的酯的方法可以包括将所公开的细胞在足以从3-HP生产3-HP的酯的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造3-HP的酯的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶以及脂肪酶或酯酶的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造3-HP的酯。产生的3-HP酯可以从细胞培养基中分离或从细胞中提取以供使用。
还提供了在体外从3-HP生产3-HP的酯的方法。通过将3-HP与具有脂肪酶或酯酶活性的酶相接触以形成3-HP的酯，来实现从3-HP到3-HP的酯的转化。这些转化也可以用体内和体外方法的组合来进行。
在体内发酵或体外分析过程中形成的3-HP的酯可以使用在US20040076982A1中描述的方法来分析。
实施例16
1，3-丙二醇的生产
本实施例描述了生产1，3-丙二醇的方法以及能够生产1，3-丙二醇的细胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根据需要产生1，3-丙二醇的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
1，3-丙二醇可以从3-HP产生(图1)。例如，通过表达具有醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)活性的酶的编码核酸分子，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)(例如在实施例14中公开的)工程化以制造1，3-丙二醇。
例如，通过表达编码具有醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)工程化以制造1，3-丙二醇。在具体的实施例中，产生3-HP的转化细胞可以包含具有醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产1，3-丙二醇的方法可以包括将所公开的细胞在足以从3-HP生产1，3-丙二醇的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造1，3-丙二醇的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶、醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造1，3-丙二醇。产生的1，3-丙二醇可以从细胞培养基中分离或从细胞中提取以供使用。
还提供了在体外从3-HP生产1，3-丙二醇的方法。可以通过将3-HP与具有醛脱氢酶活性(EC 1.2.1.-)和醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的酶相接触，将3-HP转化为1，3-丙二醇。或者，可以使用在体外从3-HP生产1，3-丙二醇的化学方法，例如在Meng、Tsobanakis和Abraham在US 2005/0283029中公开的方法。
在发酵期间或体外加工中形成的1，3-丙二醇可以使用在高效液相色谱(HPLC)来分析。色谱分离可以使用Bio-Rad 87H离子交换柱来实现。0.01N硫酸的流动相以0.6ml/min的流速流过，将柱子维持在45-65℃的温度下。样品中1，3-丙二醇的存在可以使用折射率检测器来检测(Skraly等，Appl.Environ.Microbiol.64：98-105，1998)。
实施例17
聚合的3-HP的生产
本实施例描述了生产聚合的3-HP的方法以及能够生产聚合的3-HP的细胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根据需要产生聚合的3-HP的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
聚合的3-HP可以从3-HP产生(图1)。例如，通过表达编码具有酯酶活性的酶的核酸分子，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)(例如在实施例14中描述的)工程化以制造聚合的3-HP。
例如，通过表达编码具有酯酶活性的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞(例如在实施例14中描述的)工程化以制造聚合的3-HP。在具体的实施例中，产生聚合的3-HP的转化细胞可以包含具有酯酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产聚合的3-HP的方法可以包括将所公开的细胞在足以从3-HP生产聚合的3-HP的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造聚合的3-HP的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-HP脱氢酶和酯酶活性的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造聚合的3-HP。产生的聚合的3-HP可以从细胞培养基中分离或从细胞中提取以备使用。
还提供了在体外从3-HP生产聚合的3-HP的方法。可以通过将3-HP与具有酯酶活性的酶相接触以形成聚合的3-HP，来实现从3-HP到聚合的3-HP的转化。这些转化也可以使用体内和体外方法的组合来进行。
在体内发酵过程或体外分析中形成的聚合的3-HP可以使用体积排阻HPLC来分析。
实施例18
肽的合成和纯化
本文公开的酶，例如PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、3-羟基丙酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶(及其保留了所需酶活性的变异体)，可以通过本技术领域已知的多种手动或自动合成方法中的任何一种来化学合成。这样的合成肽可以在体外反应中用于生产所需的终产物。
例如，固相肽合成(SPPS)在0.25毫摩尔(mmol)的规模上使用Applied Biosystems Model 431A肽合成仪进行，并使用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基末端保护，与二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羟基苯并三唑(HBTU/HOBT)偶联，并对羧基末端的酸使用对羟甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)或Sasrin树脂，或对羧基末端的酰胺使用Rink酰胺树脂。
按照Atherton等(Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press：Oxford，1989)的描述，通过将适当的前体氨基酸在三氟乙酸中的三苯基甲醇中进行三苯甲基化，然后进行Fmoc衍生，制备Fmoc衍生的氨基酸。
使用1％TFA的二氯甲烷溶液，将Sasrin树脂结合的肽裂解以产生被保护的肽。适合的话，在氨基酸侧链受到保护的新生肽中，使用二甲基磷酸基叠氮化物通过氨基末端游离胺和羧基末端游离酸的反应，在氨基和羧基末端之间将受保护的肽前体环化。
将HMP或Rink酰胺树脂结合的产物常规裂解，使用含有三氟乙酸(TFA)的溶液将含有受保护侧链的环化肽去保护，该溶液中任选还包含水、茴香硫醚和乙二硫醇，比率为100∶5∶5∶2.5，去保护在室温进行0.5-3小时。
通过制备型高压液相色谱(HPLC)纯化粗肽，例如使用WatersDelta-Pak C18柱，用乙腈调制的含有0.1％TFA的水进行梯度洗脱。在柱洗脱后，将乙腈从洗脱的级份中蒸发，然后将其冷冻干燥。这样生产和纯化的每种产物的身份可以通过快速原子轰击质谱(FABMS)或电喷雾质谱(ESMS)来证实。
鉴于本公开的发明的原理可用于许多可能的实施方案，因此应该认识到，所说明的实施方案仅仅是本发明的例子，不应该被当作对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附的权利要求书限定。因此，我们将所有位于这些权利要求的范围和精神内者要求为我们的发明。

Claims (50)

1.分离蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：4、6、10、12、14、17或19，并且其中所述蛋白具有β-丙氨酸氨基转移酶(BAAT)活性。
2.权利要求1的分离蛋白，其中所述蛋白包含P3H取代、S24T取代、D110N取代、F113L取代、A133T取代或其组合。
3.权利要求1的分离蛋白，其中所述蛋白具有SEQ ID NO：4、6、10、12、14、17或19中显示的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸，并且其中所述蛋白具有BAAT活性。
4.分离核酸分子，其中所述核酸分子编码权利要求1的分离蛋白。
5.权利要求4的分离核酸分子，其与启动子序列可操作连接。
6.权利要求4的分离核酸分子，其中所述核酸序列显示为SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、16或18。
7.载体，其含有权利要求4的分离核酸分子。
8.重组核酸分子，其含有权利要求4的分离核酸分子。
9.分离细胞，其用权利要求8的重组核酸分子转化。
10.权利要求9的分离细胞，其中所述细胞是原核细胞。
11.权利要求9的分离细胞，其中分离的核酸序列显示为SEQ IDNO：5、7、9、11、13、16或18，以及其中所述细胞从β-丙氨酸生产的丙二酰半醛比存在天然BAAT核酸序列时多至少50％。
12.权利要求11的分离细胞，其中所述细胞还含有编码3-HP脱氢酶的外源或内源核酸分子，其中所述细胞产生3-羟基丙酸(3-HP)。
13.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码脂肪酶或酯酶的外源核酸分子，并产生3-HP的酯。
14.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码酯酶的外源核酸分子，并产生聚合的3-HP。
15.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或二者的外源或内源核酸分子，并且其中所述细胞产生1，3-丙二醇。
16.权利要求12的分离细胞，其中编码3-HP脱氢酶的核酸分子编码SEQ ID NO：21、23、27或31所示的蛋白。
17.权利要求12的分离细胞，其中编码3-HP脱氢酶的核酸分子显示为SEQ ID NO：20、22、26、29或30。
18.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子。
19.权利要求18的分离细胞，其中编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子含有编码SEQ ID NO：39或41所示的蛋白的核酸序列。
20.权利要求18的分离细胞，其中编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子显示为SEQ ID NO：38或40。
21.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码PEP羧化酶的外源或内源核酸分子以及编码天冬氨酸氨基转移酶的外源或内源核酸分子。
22.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞还含有编码丙酮酸羧化酶的外源核酸分子。
23.权利要求21的分离细胞，其中编码PEP羧化酶的核酸分子包含与PEP羧化酶可操作连接的合成启动子。
24.权利要求21的分离细胞，其中编码天冬氨酸氨基转移酶的核酸分子包含与天冬氨酸氨基转移酶可操作连接的合成启动子。
25.权利要求12的分离细胞，其中所述细胞含有SEQ ID NO：52所示的外源核酸分子。
26.分离细胞，其含有编码SEQ ID NO：6、12、17或19的外源核酸分子。
27.转化细胞，其含有编码权利要求1的蛋白的外源核酸分子。
28.权利要求27的转化细胞，其中所述细胞从β-丙氨酸生产丙二酰半醛。
29.权利要求28的转化细胞，其中所述细胞产生3-HP、3-HP酯、聚合的3-HP、1，3-丙二醇或其组合。
30.从β-丙氨酸制造丙二酰半醛的方法，包括：
将权利要求9的细胞在允许细胞从β-丙氨酸制造丙二酰半醛的条件下进行培养。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞还含有编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子。
32.权利要求31的方法，其中所述外源核酸分子编码SEQ ID NO：38或40所示序列的天冬氨酸脱羧酶。
33.权利要求32的方法，其中所述外源核酸分子具有SEQ ID NO：39或41所示的序列。
34.权利要求31的方法，其中所述细胞还含有编码PEP羧化酶的外源或内源核酸分子以及编码天冬氨酸氨基转移酶的外源或内源核酸分子。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞还含有编码丙酮酸羧化酶的外源核酸分子。
36.权利要求34的方法，其中编码PEP羧化酶的核酸分子包含与PEP羧化酶可操作连接的合成启动子。
37.权利要求34的方法，其中编码天冬氨酸氨基转移酶的核酸分子包含与天冬氨酸氨基转移酶可操作连接的合成启动子。
38.权利要求34的方法，其中所述细胞包含SEQ ID NO：52所示的外源核酸分子。
39.制造3-HP的方法，包括：
将权利要求12的分离细胞在允许细胞从丙二酰半醛生产3-HP的条件下进行培养。
40.制造3-HP的酯的方法，包括：
将权利要求13的细胞在允许细胞从3-HP生产3-HP的酯的条件下进行培养。
41.制造聚合的3-HP的方法，包括：
将权利要求14的细胞在允许细胞从3-HP生产聚合的3-HP的条件下进行培养。
42.制造1，3-丙二醇的方法，包括：
将权利要求15的细胞在允许细胞从3-HP生产1，3-丙二醇的条件下进行培养。
43.制造3-HP的方法，包括：
从权利要求9的细胞中纯化丙二酰半醛；以及
将丙二酰半醛与具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的肽相接触以形成3-HP。
44.制造3-HP的方法，包括：
用编码具有3-HP脱氢酶活性的肽的核酸分子转染权利要求9的细胞；以及
培养转染的细胞以允许转染的细胞制造3-HP。
45.权利要求44的方法，其中编码具有3-HP脱氢酶活性的肽的核酸分子显示为SEQ ID NO：20、22、26、29或30。
46.从3-HP制造1，3-丙二醇的方法，包括：
使用权利要求43的方法分离产生的3-HP；以及
将3-HP与具有醇脱氢酶活性的肽和具有醛脱氢酶活性的多肽相接触，从而产生1，3-丙二醇。
47.制造聚合的3-HP的方法，包括：
使用权利要求43的方法分离产生的3-HP；以及
将3-HP与具有酯酶活性的肽相接触，从而产生聚合的3-HP。
48.制造3-HP酯的方法，包括：
使用权利要求43的方法分离产生的3-HP；以及
将3-HP与具有脂肪酶或酯酶活性的肽相接触，从而产生3-HP酯。
49.权利要求30的方法，其中所述细胞是原核细胞。
50.特异性结合剂，其与权利要求1的蛋白特异性结合。
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