CN106676120A - 一种提高产溶剂梭菌发酵性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高产溶剂梭菌发酵性能的方法。具体而言，本发明首先提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有编码SEQ ID NO:1、2、3和4所示氨基酸序列或分别在SEQ ID NO:1、2、3和4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且分别保留SEQ ID NO:1、2、3和4的生物学活性的分别由SEQ ID NO:1、2、3和4衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；和任选的与前述多核苷酸序列或其互补序列创造性连接的启动子序列。本发明还提供一种产溶剂梭菌、利用该产溶剂梭菌发酵的方法以及提高产溶剂梭菌的生长能力和/或产溶剂能力的方法。
Description
技术领域
本发明属于两种重要产溶剂梭菌发酵领域，具体涉及提高产溶剂梭菌发酵性能的方法。
背景技术
生物素，又称维生素H、辅酶R，是一种水溶性含硫B类维生素。生物素是许多微生物生长所必需的重要微量元素，它可以作为菌体内羧化酶的辅酶广泛参与到菌株的各项生理活动，例如氨基酸代谢，脂肪酸代谢，糖异生以及毒素的合成等。因此，生物素在许多微生物培养基中被添加使用。
产溶剂梭菌，可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、阿拉伯糖以及含碳气体(一氧化碳和二氧化碳)等多种碳源发酵生产丙酮、乙醇以及丁醇。其中，产溶剂梭菌的模式菌—丙酮丁醇梭菌被用来生产有机溶剂的历史可以追溯到上个世纪早期。鉴于生物素对于维持微生物正常生长的重要性，目前用于产溶剂梭菌培养的合成培养基以及企业采用的工业培养基中都或多或少地含有生物素或包含生物素成分的天然物质。
然而，在培养基中使用生物素或含生物素成分的天然物质不可避免地增加了发酵成本。是否可以通过在产溶剂梭菌中过表达生物素合成相关基因，强化其自身的生物素合成能力，从而消除产溶剂梭菌在生长和代谢过程中对外源生物素或含生物素成分物质的依赖呢？此外，如果产溶剂梭菌自身的生物素合成能力得到提高，实现了体内生物素的持续、充足供应，是否能够进一步提升菌株的发酵性能，获得比外源添加生物素更优的发酵结果呢？这些问题尚未被探究。如果上述猜想得到证实，将有可能全面提升产溶剂梭菌的发酵性能，且可能显著降低发酵成本，提高发酵效率和经济性。
发明内容
本发明第一方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有：
(1)编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:1的生物学活性的由SEQ IDNO:1衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；
(2)编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:2的生物学活性的由SEQ IDNO:2衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；
(3)编码SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:3的生物学活性的由SEQ IDNO:3衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；和
(4)编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:4的生物学活性的由SEQ IDNO:4衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列。
在一个具体实施例中，所述核酸构建物还含有与编码SEQ ID NO:1、2、3和4所示氨基酸序列的多核苷酸序列操作性连接的启动子序列，用于表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示氨基酸序列。
在一个具体实施例中，所述核酸构建物中，编码SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的多核苷酸序列从5’-3’依次连接，与thl启动子或其RBS区至少含有该区5’端的AGGAGG的变体或其RBS区3’端截短1－14个核苷酸或延长1－6个核苷酸的变体操作性连接。
在一个具体实施例中，所述thl启动子或其变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:12－16中任一条所示。
在一个具体实施例中，表达SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸序列与ptb启动子操作性连接。
在一个具体实施例中，所述核酸构建物用于表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示的氨基酸序列。
在一个具体实施例中，所述核酸构建物的骨架载体来自pIMP1载体。
在一个具体实施例中，所述核酸构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明第二方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列或来自其它梭菌属的与上述各基因相对应的基因序列。
在一个具体实施例中，所述cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列分别如SEQ ID NO:11中第173～712位碱基、第712～1434位碱基、第1457～2800位碱基、和第2933～3919位碱基所示。
本发明第三方面提供一种产溶剂梭菌，所述产溶剂梭菌为经遗传工程操作的工程菌，与获得该工程菌的亲本菌株相比，该工程菌的生物素表达水平提高。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌为丙酮丁醇梭菌。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌中cac1360、cac1361、cac1362和cac0210或其对应基因过表达，或SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白过表达。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌中经遗传工程操作而转入了本发明的核酸构建物。
本发明第四方面提供一种产溶剂梭菌发酵方法，所述方法包括使用本发明的产溶剂梭菌进行发酵，其中，发酵培养基含有与该产溶剂梭菌的标准发酵培养基相比降低的生物素浓度。
本发明第五方面提供一种提高产溶剂梭菌生长能力和/或产溶剂能力的方法，所述方法包括对所述产溶剂梭菌实施遗传工程操作，使其过表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌是丙酮丁醇梭菌。
在一个具体实施例中，所述实施遗传工程操作包括将本发明的核酸构建物转入所述产溶剂梭菌中。
附图说明
图1显示向丙酮丁醇梭菌发酵培养基中(P2)添加生物素后可以提升菌株生长以及产溶剂的能力。
图2显示在BioYADB菌株中生物素合成量多于EP菌株。
图3显示丙酮丁醇梭菌中生物素转运以及合成相关基因的分析鉴定及其强化过表达。
图4显示优化生物素合成途径后可以进一步提升丙酮丁醇梭菌的发酵性能。
图5显示强化生物素合成途径后可以进一步提升824glcG-TBA菌株的发酵性能。
具体实施方式
本发明通过在产溶剂梭菌中过表达生物素合成相关基因，强化其自身的生物素合成能力而全面提升菌株的发酵性能，且可能消除该梭菌在生长和代谢过程中对外源生物素或含生物素成分物质的依赖，降低发酵培养基的成本，提高发酵过程的效率和经济性。
生物素合成相关蛋白及其编码序列
本发明涉及的生物素合成相关蛋白为来自丙酮丁醇梭菌的BioY、BioD、BioA和BioB，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1－4所示。
本发明也包括SEQ ID NO:1－4任一序列的突变体。这些突变体包括：与SEQ IDNO:1－4具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留SEQ ID NO:1－4各自的生物学活性的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在SEQ ID NO:1－4所示的序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留SEQ ID NO:1－4各自的生物学活性的氨基酸序列，及其编码序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
应理解，丙酮丁醇梭菌的BioY、BioD、BioA和BioB的突变体也包括来自不同梭菌或不同的丙酮丁醇梭菌菌株、具有不同的氨基酸组成、但生物学活性相同的BioY、BioD、BioA和BioB蛋白。这类蛋白往往由处于相同或相应的基因组位置上的同一种或视为同一种的基因表达。在本文中，这类蛋白被认为是“同源的”。
本发明包括BioY、BioD、BioA和BioB蛋白及其各自的突变体的编码序列。更具体而言，本发明包括SEQ ID NO:1－4的编码序列。作为示例性的例子，这些蛋白分别由cac1360、cac1361、cac1362和cac0210编码。除cac1360、cac1361、cac1362和cac0210外，本发明当然也包括SEQ ID NO:1－4的其它编码序列，即“简并序列”。应理解，“简并序列”在本发明中是指编码本发明的氨基酸序列，但与如cac1360、cac1361、cac1362和cac0210等所示的序列有差别的核酸序列。
生物素合成相关基因
本发明涉及丙酮丁醇梭菌的如下基因：cac1360、cac1361、cac1362和cac0210〔KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)中的编号〕。本发明也涉及来自梭菌属其它菌株的分别与cac1360、cac1361、cac1362和cac0210相对应的基因。“相对应的基因”在本文中指在梭菌的基因组中处于或视为处于相同的位置并表达具有相同或视为相同的生物学功能的蛋白的基因。应理解，所述“视为”应指本领域技术人员根据本领域的公知技术能合理作出的判断。
基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列分别如SEQ ID NO:11中第173～712位碱基、第712～1434位碱基、第1457～2800位碱基、和第2933～3919位碱基所示。
本发明也包括与基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性的核苷酸序列。优选的是，这些核苷酸序列所编码的蛋白质仍然具有本文所需的生物学活性。可采用例如NCBI中的nucleotide blast比对两条核苷酸序列，计算其序列相同性。另一方面，本发明也包括与基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的同源性、且其编码的蛋白质仍然具有本文所述生物学活性的核苷酸序列。可采用已知的技术手段进行同源性比对，例如Clustal-W等。
核酸构建物
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的生物素合成相关基因或生物素合成相关蛋白的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的生物素合成相关基因或生物素合成相关蛋白的编码序列可以多种方式被操作以保证所述蛋白的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
本发明中，启动子可以是thl启动子或ptb启动子。在某些实施例中，启动子还包括thl启动子的突变体，具体为thl启动子RBS区至少含有该区5’端的AGGAGG的变体或其RBS区3’端截短1-14个核苷酸或延长1－6个核苷酸的突变体。Thl启动子的序列如SEQ ID NO:12所示，其变体的例子可参见SEQ ID NO:13－16中任一条所示。Ptb启动子的序列可如SEQ ID NO:11第2811～2935位碱基所示。
在一个具体实施例中，本发明的核酸构建物中，BioY、BioD和BioA的编码序列从5’到3’顺次连接，并与thl启动子或其变体操作性连接。BioB的编码序列与ptb启动子操作性连接，并处于BioY、BioD和BioA的编码序列的下游。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
例如，用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。
在某些实施例中，本发明的核酸构建物是表达载体，用于在产溶剂梭菌，尤其是丙酮丁醇梭菌中表达生物素合成相关蛋白，尤其是本文所述的BioY、BioD、BioA和BioB及其保留了所需生物学功能的突变体。
表达载体
本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。各种核酸和调控序列可被连接在一起，以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。
重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。
载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。
本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
一个以上拷贝的本发明的与生物素合成相关的基因或多核苷酸序列可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。
本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
本发明优选使用能在产溶剂梭菌，尤其是丙酮丁醇梭菌中表达的载体。
产溶剂梭菌
本发明提供一种产溶剂梭菌，该产溶剂梭菌为经遗传工程操作的工程菌，与获得该工程菌的亲本菌株相比，该工程菌的生物素表达水平提高。
本文中，“遗传工程操作”通常指将本发明的核酸构建物或表达载体转入该产溶剂梭菌的操作。具体的操作为本领域常规技术。具体而言，可采用本领域常规的转染方法将本发明的核酸构建物或表达载体转入该产溶剂梭菌中。
转染通常分为瞬时转染和稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染中，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。转染的技术手段包括化学转染和物理转染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法，后者如显微注射、电穿孔和基因枪等。
优选的是，所述产溶剂梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(ClostridiumSaccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)。
优选的是，所述产溶剂梭菌中cac1360、cac1361、cac1362和cac0210或其对应基因过表达。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌中经遗传工程操作而转入了本发明的核酸构建物或表达载体，并稳定表达本文所述的生物素合成相关蛋白。
方法
本发明还提供一种产溶剂梭菌发酵方法，所述方法包括使用本发明的产溶剂梭菌进行发酵，其中，发酵培养基含有与该产溶剂梭菌的标准发酵培养基相比降低的生物素浓度。
用于发酵的培养基通常为本领域常规的用于产溶剂梭菌的发酵的培养基，所不同的是该发酵培养基中生物素的含量或浓度与标准发酵培养基相比降低。
通常的产溶剂梭菌发酵培养基(P2)含有碳源以及K2HPO4(0.3～0.8g/l，如0.5g/l)，KH2PO4(0.3～0.8g/l，如0.5g/l)，CH3COONH4(1.8～2.6g/l，如2.2g/l)，MgSO4·7H20(150～250mg/l，如200mg/l)，MnSO4·H2O(7～13mg/l，如10mg/l)，NaCl(7～13mg/l，如10mg/l)，FeSO4·7H20(7～13mg/l，如10mg/l)，对氨基苯甲酸(0.7～1.3mg/l，如1mg/l)，硫胺(0.7～1.3mg/l，如1mg/l)以及生物素(8～20μg/l，如10μg/l)。
本发明还提供一种提高产溶剂梭菌生长能力和/或产溶剂能力的方法，所述方法包括对所述产溶剂所述实施遗传工程操作，使其过表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白。
在一个具体实施例中，所述产溶剂梭菌是丙酮丁醇梭菌、扬氏梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌或糖乙酸多丁醇梭菌。在一个具体实施例中，所述实施遗传工程操作包括将本发明的核酸构建物转入所述产溶剂梭菌中。
实施例1：添加生物素可以强化丙酮丁醇梭菌的发酵性能
实验方法：
利用添加有不同浓度生物素的P2培养基对野生型丙酮丁醇梭菌进行发酵测试，确定生物素对丙酮丁醇梭菌发酵的影响。
实验步骤：
1)向丙酮丁醇梭菌发酵培养基(不含生物素的P2培养基)中添加不同浓度的生物素(生物素浓度：10，15，20，25以及30μg/L)，构建含有不同浓度生物素的发酵培养基；
2)向1)中准备的培养基内按5％(v/v)的比例接种野生型丙酮丁醇梭菌，在厌氧箱中进行37℃静置发酵；具体发酵条件如下：P2培养基(30ml)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接种量(v/v)，生物素添加浓度：10，15，20，25和30μg/L。
3)在发酵的不同阶段进行发酵取样，利用气相色谱仪(890A，Agilent，Wilmington，DE，US)以及高效液相色谱仪(model 1200，Agilent)测定发酵液中的有机溶剂含量以及糖利用量。
实验结果：
实验结果如图1所示。图中显示为2次生物学重复的结果。具体而言，图A显示添加生物素后菌株的生长曲线，横坐标为发酵时间，纵坐标为OD600；图B显示添加不同浓度生物素后丙酮丁醇梭菌在48h的发酵产物分析，横坐标为生物素添加浓度，纵坐标为溶剂产量；图C显示添加不同浓度生物素后丙酮丁醇梭菌在72h的发酵产物分析，横坐标为生物素添加浓度，纵坐标为溶剂产量。
结果显示，随着培养基中生物素浓度的增加，菌株的生长以及产溶剂能力提升。当发酵培养基内生物素浓度为25μg/L时菌株的生长及产溶剂能力提升最明显，其中最高菌体浓度(optical density)提升55％，最终总溶剂提升14％。
实施例2：丙酮丁醇梭菌中生物素合成相关基因分析鉴定及其表达水平的强化
实验方法：
利用生物信息学、比较基因组学和蛋白质氨基酸序列同源比对的方法来分析鉴定丙酮丁醇梭菌中的生物素合成基因，进一步通过过表达生物素合成相关基因提升丙酮丁醇梭菌的发酵性能。
实验步骤：
1)根据KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)中基因组注释，分析丙酮丁醇梭菌中生物素合成相关基因；
2)以枯草芽孢杆菌中生物素合成相关蛋白的氨基酸序列为模板，利用氨基酸序列同源比对的方法(protein blast)，检索找寻丙酮丁醇梭菌中潜在的生物素合成相关蛋白；
3)在丙酮丁醇梭菌中强化过表达生物素合成相关基因以及发酵验证；
4)分别利用Pthl以及Pptb过表达来源于丙酮丁醇梭菌的生物素合成相关基因构建获得生物素过表达质粒pIMP1-Biotin(pIMP1Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，具体构建过程如下：
A：生物素基因簇bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)的获取：
首先以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，利用CAC1360-for/CAC1362-rev引物(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得目的片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)。
B：Pptb-bioB片段的获取：
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，利用Pptb-for/Pptb-rev引物(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得启动子片段Pptb，利用CAC0210-for/CAC0210-rev引物(分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得片段bioB(cac0210)。最后利用Pptb-for/CAC0210-rev作为引物(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)，以片段Pptb与bioB(cac0210)的混合物为模板进行重叠PCR(overlap-PCR)，经琼脂糖电泳以及胶回收过程获得目的片段Pptb-bioB。
C：pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒的构建：
在37℃水浴中，利用限制性内切酶SalI/KpnI对空质粒pIMP1-Pthl(美国特拉华大学的Eleftherios Terry Papoutsakis教授赠予)及片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)进行双酶切，酶切3h后利用胶回收试剂盒纯化回收酶切过的载体骨架以及bioY-bioD-bioA片段，之后利用solution I连接酶将酶切过的载体骨架以及bioY-bioD-bioA片段进行重组连接。16℃连接4h后，将连接产物转化Top10感受态，涂布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固体平板。第二天挑取平板上长出的菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落转接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液体培养基中，培养过夜。第二天，利用质粒提取试剂盒抽取质粒，经SalI/KpnI酶切验证正确后，将该质粒送测序公司测序，测序结果正确即获得pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒。
D：质粒Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB的获取
将C中测序正确的pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒以及B中获得的Pptb-bioB片段经过KpnI单酶切处理，分别回收酶切过的载体骨架以及Pptb-bioB片段，利用solution I连接酶将酶切过的载体骨架以及Pptb-bioB片段进行重组连接。16℃连接4h后，将连接产物转化Top10感受态，涂布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固体平板。第二天挑取平板上长出的菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落转接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液体培养基中，培养过夜。第二天，利用质粒提取试剂盒抽取质粒，经KpnI酶切验证正确后，将该质粒送测序公司测序，测序结果正确即获得Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB质粒。
5)将Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB质粒(pIMP1-Biotin)以及相应的对照质粒pIMP1-thl(只含有Pthl的空质粒)分别电转至野生型丙酮丁醇梭菌中得到BioYADB(生物素基因簇过表达菌株)以及EP(对照菌株)菌株；
6)将EP以及BioYADB分别接种至P2培养基(添加生物素以及不添加生物素两种培养基)中，在厌氧箱中进行37℃静置发酵；
发酵条件：添加生物素的P2培养基：发酵体积30ml，7％葡萄糖(w/v)，5％的接种量(v/v)，生物素添加浓度10μg/L，红霉素10μg/ml。
不添加生物素的P2培养基：发酵体积140ml，7％葡萄糖(w/v)，5％的接种量(v/v)，红霉素10μg/ml。
7)在不同时间点进行发酵取样，利用气相色谱仪(890A,Agilent,Wilmington,DE,US)以及高效液相色谱仪(model 1200,Agilent)测定发酵液中的有机溶剂含量以及糖利用量。
实验结果：
图3显示了实验结果。图中显示为3次生物学重复的结果。图A显示枯草芽孢杆菌中生物素成途径，其中BioI：细胞色素P450蛋白；BioW：庚二酰-CoA合成酶；BioF：KAPA合成酶；BioA：DAPA合成酶；BioD：脱硫生物素合成酶；BioB：生物素合成酶。图B显示为丙酮丁醇梭菌中的生物素转运以及合成相关基因在基因组上的分布。丙酮丁醇梭菌中生物素合成相关基因包括：CAC0210/CAC1631/CAC3343(BioB)，CAC1361(BioD)以及CAC1362(BioA)；丙酮丁醇梭菌中生物素转运相关基因CAC1360/CAC0211/CAC3456(BioY)。图C显示为丙酮丁醇梭菌中生物素转运以及合成相关基因的过表达模式。图D(i)显示为在添加有生物素的P2培养基中，丙酮丁醇梭菌中过表达生物素转运以及合成相关基因后菌株的生长以及糖利用情况。图D(ii)显示为在添加有生物素的P2培养基中，丙酮丁醇梭菌中过表达生物素转运以及合成相关基因后菌株的产溶剂情况。图D(iii)显示为在不添加有生物素的P2培养基中，丙酮丁醇梭菌中过表达生物素转运以及合成相关基因后菌株的生长以及糖利用情况。图D(iv)显示为在不添加有生物素的P2培养基中，丙酮丁醇梭菌中过表达生物素转运以及合成相关基因后菌株的产溶剂情况。
具体而言，根据KEGG中基因功能注释，在丙酮丁醇梭菌中鉴定得到一系列生物素合成相关蛋白：BioA(CAC1362)蛋白，BioD(CAC1361)蛋白以及BioB(CAC0210，CAC1631以及CAC3343)蛋白；分别以枯草芽孢杆菌中的生物素合成相关蛋白(BioW，BioA，BioF，BioD，BioB以及BioI)的氨基酸序列为模板，利用Clustal W2进行氨基酸序列同源比对的方法在丙酮丁醇梭菌中鉴定得到三个与枯草芽孢杆菌中生物素合成相关蛋白氨基酸序列同源性较高的蛋白：BioA(CAC1362，与枯草芽孢杆菌中BioA的氨基酸序列一致性达到42.12％)，BioD(CAC1361，与枯草芽孢杆菌中BioD的氨基酸序列一致性达到31.88％)以及BioB(CAC0210，与枯草芽孢杆菌中BioB的氨基酸序列一致性达到41.12％)，其中丙酮丁醇梭菌中另外两个BioB蛋白的氨基酸序列与枯草中BioB的氨基酸序列一致性较低(CAC1631以及CAC3343与枯草芽孢杆菌中BioB蛋白的氨基酸序列一致性分别为21.04％和17.22％)。另外，丙酮丁醇梭菌中存在三个预测的生物素转运相关的BioY(CAC0211，CAC1360以及CAC3456)蛋白，分别将这三个BioY蛋白的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌基因组中预测的BioY(BSU10370)进行氨基酸序列同源比对，结果发现：CAC1360与枯草中两个BioY氨基酸序列的同源性最高。
在添加有生物素的P2培养基中，BioYADB菌株与EP菌株相比，其生长速率显著加快，BioYADB较EP提前19h到达最高菌体浓度(optical density)，底物利用能力增加(BioYADB较EP多利用8.29g葡萄糖)，进而合成了更多的产物(丙酮5.95g/l，丁醇14.72g/l，乙醇2.72g/l，EP菌株的产物浓度为丙酮5.79g/l，丁醇13.22g/l，乙醇1.95g/l)。而在不添加生物素的P2培养基中(7％D-葡萄糖)进行发酵时，BioYADB的发酵性能较EP优势更明显，其底物利用能力增加(BioYADB较824-P多利用15.45g葡萄糖)，最终发酵产物产量明显提升(丙酮5.15g/l，丁醇11.78g/l，乙醇2.67g/l，而EP菌株的产物浓度为丙酮4.06g/l，丁醇8.51g/l，乙醇1.20g/l)。
实施例3：BioYADB以及EP菌株内生物素含量测定
实验方法：
利用生物素营养缺陷型的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum E4)来检测丙酮丁醇梭菌合成的生物素含量。
实验步骤：
1)将EP以及BioYADB在不添加有生物素的P2培养基中进行厌氧发酵，分别在24h，31h，41h，49h以及54h进行取样(4ml)；
发酵条件：P2培养基(400ml，不添加生物素)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接种量(v/v)，红霉素最终浓度10μg/ml；
2)将1)中获取的培养液进行离心收菌，收集上清，用于测定胞外生物素含量；
3)将2)中获得的菌体经过0.9％NaCl(w/v)清洗三次后，利用3M H2SO4悬浮菌体，经过121℃灭菌1h，充分降解菌体，释放体内生物素，离心后收集上清，用于测定胞内生物素含量；
4)利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum E4)来进行生物素含量测定：植物乳杆菌为生物素营养缺陷型菌株，在添加不同浓度生物素的条件下其生长与生物素浓度呈线性关系，利用此原理对3)中胞内与胞外的生物素含量进行测定；
5)利用植物乳杆菌构建生物素测定的标准曲线，分别测定胞外和胞内的生物素含量，最终得到总的生物素含量。
实验结果：
结果显示在图2中，图中显示为2次生物学重复的结果。图A显示为利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum E4)构建的生物素测定标准曲线。图B显示为EP菌株以及BioYADB菌株在五个时间点(24h，31h，41h，49h以及54h)的生物素含量测定。
结果表明：BioYADB菌株在五个时间点(24h，31h，41h，49h以及54h)的生物素含量均高于EP菌株(生物素总量在24h，31h，41h，49h以及54h分别提升39.6％，43.9％以及60.0％，24.2％以及18.4％)。该结果表明BioYADB较EP合成了更多的生物素。
实施例4：优化生物素合成途径进一步提升菌株的发酵性能
实验方法：
利用启动子优化的方法进一步强化丙酮丁醇梭菌的生物素合成途径，提升菌株性能。
实验步骤：
1)改变thl内RBS区与下游基因起始密码子ATG间的距离，构建得到一系列thlvar(thl来源的改造启动子：thl-7，thl-15，thl-23以及thl-27，序列分别见SEQ ID NO:13、14、15和16)；
2)利用1)中得到thlvar分别过表达生物素合成相关基因簇bioY-bioD-bioA，得到不同的生物素基因过表达质粒：pIMP1-thl7-Biotin，pIMP1-thl15-Biotin，pIMP1-thl23-Biotin以及pIMP1-thl27-Biotin；
3)将2)中质粒电转至野生型丙酮丁醇梭菌中得到一些列生物素基因过表达菌株：Bio7，Bio15，Bio23以及Bio27；
4)将3)中得到的菌株与EP以及BioYADB菌株在不添加有生物素的P2培养基中进行发酵，在不同时间点进行取样，最终分析样品中有机溶剂的含量以及残糖量；
发酵条件：P2培养基(30ml，不添加生物素)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接种量(v/v)，红霉素最终浓度10μg/ml。
实验结果：
结果显示在图4中，图中显示为3组生物学重复的结果。图A显示为thl启动子的优化，通过改变thl内RBS区与下游基因起始密码子ATG间的距离，构建得到一系列thlvar。图B显示利用lacZ报告系统对图5A中得到的一系列thlvar进行体内酶活测定，鉴定启动子强度。图C显示利用优化的thl启动子过表达bioY-bioD-bioA后菌株的最高菌体浓度(optical density)分析。图D显示利用优化的thl启动子过表达bioY-bioD-bioA后菌株的总溶剂分析。
结果表明：利用thl-7过表达bioY-bioD-bioA时，菌株的生长及产溶剂性能有明显提升。发酵至72h，Bio7菌株较BioYADB菌株总溶剂提升1.21g(5.85％)。
实施例5：强化生物素合成途径进一步提升工程菌824glcG-TBA的发酵性能
实验方法：
在工程菌株824glcG-TBA菌株中过表达生物素合成途径(Pthl-7-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，验证能否进一步提升菌株的发酵性能。
实验步骤：
分别向824glcG菌株中电转导入生物素合成途径(pIMP1-thl7-Biotin)以及木糖代谢相关基因(pITC-xylTthl-xylBAthl)，之后在含有葡萄糖、木糖以及阿拉伯糖三种混糖(37.63g/l的D-葡萄糖，14.47g/l的D-木糖以及2.89g/l的L-阿拉伯糖)的模拟水解液培养基中进行发酵，验证菌株的发酵表型。
发酵条件：P2培养基(30ml，不添加生物素)，混糖(37.63g/l的D-葡萄糖，14.47g/l的D-木糖以及2.89g/l的L-阿拉伯糖，w/v)，5％的接种量(v/v)，红霉素最终浓度10μg/ml，甲砜氯霉素最终浓度8μg/ml。
实验结果：
结果显示在图5中，图中显示为2组生物学重复的结果。图A显示为824glcG-TBA菌株与824glcG-TBA-Bio菌株的生长曲线。图B显示为824glcG-TBA菌株与824glcG-TBA-Bio菌株的糖利用曲线。图C显示为824glcG-TBA菌株与824glcG-TBA-Bio菌株的产溶剂曲线。
具体而言，在824glcG-TBA菌株中通过过表达丙酮丁醇梭菌来源的生物素合成途径(824glcG-TBA-Bio)可以进一步提升该菌株的发酵性能、菌株的生长和糖利用能力，其中824glcG-TBA-Bio菌株较824glcG-TBA菌株提前13h到达最高菌体浓度(opticaldensity)，底物利用能力增加(824glcG-TBA-Bio较824glcG-TBA利用葡萄糖以及木糖的能力增强，最终多利用4.07g木糖)，最终发酵产物产量明显提升(824glcG-TBA-Bio产物浓度为丙酮4.48g/l，丁醇10.31g/l，乙醇1.79g/l，824glcG-TBA菌株的产物浓度为丙酮3.97g/l，丁醇9.13g/l，乙醇1.35g/l)。
实施例6：添加生物素可以强化扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的发酵性能
实验方法：
利用添加有不同浓度生物素的P2培养基对野生型扬氏梭菌进行发酵测试，确定生物素对扬氏梭菌发酵的影响。
实验步骤：
1)向扬氏梭菌发酵培养基(不含生物素的P2培养基)中添加不同浓度的生物素(生物素浓度：10，15，20，25以及30μg/l)，构建含有不同浓度生物素的发酵培养基；
2)向1)中准备的培养基内按5％(v/v)的比例接种野生型扬氏梭菌，在厌氧箱中进行37℃静置发酵；具体发酵条件如下：采用美国模式培养物集存库(American type culturecollection)网站(http://www.atcc.org/)提供的ATCC 1754培养基(30ml)，5％的接种量(v/v)，生物素添加浓度：10，15，20，25和30μg/l。
3)在发酵的不同阶段进行发酵取样，利用气相色谱仪(890A，Agilent，Wilmington，DE，US)以及高效液相色谱仪(model 1200，Agilent)测定发酵液中的有机溶剂含量以及糖利用量。
实施例7：扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)中生物素合成水平的强化
实验方法：
通过在扬氏梭菌中过表达上述4个来源于丙酮丁醇梭菌的生物素合成相关基因提升扬氏梭菌的发酵性能。
实验步骤：
1)在扬氏梭菌中强化过表达上述4个来源于丙酮丁醇梭菌的生物素合成相关基因以及发酵验证；
4)分别利用Pthl以及Pptb过表达来源于丙酮丁醇梭菌的生物素合成相关基因构建获得生物素过表达质粒pIMP1-Biotin(pIMP1Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，具体构建过程如下：
A：生物素基因簇bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)的获取：
首先以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，利用CAC1360-for/CAC1362-rev引物(分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得目的片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)。
B：Pptb-bioB片段的获取：
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，利用Pptb-for/Pptb-rev引物(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得启动子片段Pptb，利用CAC0210-for/CAC0210-rev引物(分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳以及胶回收过程获得片段bioB(cac0210)。最后利用Pptb-for/CAC0210-rev作为引物(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)，以片段Pptb与bioB(cac0210)的混合物为模板进行重叠PCR(overlap-PCR)，经琼脂糖电泳以及胶回收过程获得目的片段Pptb-bioB。
C：pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒的构建：
在37℃水浴中，利用限制性内切酶SalI/KpnI对空质粒pIMP1-Pthl(美国特拉华大学的Eleftherios Terry Papoutsakis教授赠予)及片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)进行双酶切，酶切3h后利用胶回收试剂盒纯化回收酶切过的载体骨架以及bioY-bioD-bioA片段，之后利用solution I连接酶将酶切过的载体骨架以及bioY-bioD-bioA片段进行重组连接。16℃连接4h后，将连接产物转化Top10感受态，涂布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固体平板。第二天挑取平板上长出的菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落转接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液体培养基中，培养过夜。第二天，利用质粒提取试剂盒抽取质粒，经SalI/KpnI酶切验证正确后，将该质粒送测序公司测序，测序结果正确即获得pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒。
D：质粒Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB的获取
将C中测序正确的pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA质粒以及B中获得的Pptb-bioB片段经过KpnI单酶切处理，分别回收酶切过的载体骨架以及Pptb-bioB片段，利用solution I连接酶将酶切过的载体骨架以及Pptb-bioB片段进行重组连接。16℃连接4h后，将连接产物转化Top10感受态，涂布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固体平板。第二天挑取平板上长出的菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落转接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液体培养基中，培养过夜。第二天，利用质粒提取试剂盒抽取质粒，经KpnI酶切验证正确后，将该质粒送测序公司测序，测序结果正确即获得Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB质粒。
5)将Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB质粒(即pIMP1-Biotin)以及相应的对照质粒pIMP1-thl(只含有Pthl的空质粒)分别电转至野生型扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)中得到Clj-Bio(生物素基因簇过表达菌株)以及EP(对照菌株)菌株；
6)将EP以及Clj-Bio分别接种至ATCC 1754培养基(添加生物素以及不添加生物素两种培养基)中，在厌氧箱中进行37℃静置发酵；
发酵条件：添加生物素的ATCC 1754培养基：发酵体积30ml，5％的接种量(v/v)，生物素添加浓度10μg/l，甲砜氯霉素5μg/ml。
不添加生物素的ATCC 1754培养基：发酵体积140ml，5％的接种量(v/v)，红霉素10μg/ml。
7)在不同时间点进行发酵取样，利用气相色谱仪(890A,Agilent,Wilmington,DE,US)以及高效液相色谱仪(model 1200,Agilent)测定发酵液中的有机溶剂含量以及糖利用量。
Claims (10)
1.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有：
(1)编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:1的生物学活性的由SEQ ID NO:1衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；
(2)编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:2的生物学活性的由SEQ ID NO:2衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；
(3)编码SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:3的生物学活性的由SEQ ID NO:3衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；和
(4)编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO:4的生物学活性的由SEQ ID NO:4衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补序列；和
任选的，与前述(1)－(4)所述多核苷酸序列或其互补序列创造性连接的启动子序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物具有以下一个或多个特征：
所述核酸构建物中，(1)－(3)项所述的多核苷酸序列或其互补序列从5’-3’顺次连接，与thl启动子或其RBS区至少含有该区5’端的AGGAGG的变体或其RBS区3’端截短1－14个核苷酸或延长1－6个核苷酸的变体操作性连接；(4)项所述的多核苷酸序列或其互补序列与ptb启动子操作性连接，并位于(1)－(3)项所述的多核苷酸序列或其互补序列的下游；
所述核酸构建物用于表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示的氨基酸序列；
核酸构建物含有丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列或来自其它梭菌属的与上述各基因相对应的基因序列；和
所述多核苷酸构建物是表达载体。
3.如权利要求2所述的多核苷酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物具有以下一个或多个特征：
所述thl启动子或其变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:12－16中任一条所示；
所述核酸构建物的骨架载体来自pIMP1载体；
所述核酸构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；和
所述cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列分别如SEQ ID NO:11中第173～712位碱基、第712～1434位碱基、第1457～2800位碱基、和第2933～3919位碱基所示。
4.一种产溶剂梭菌，其特征在于，所述产溶剂梭菌为经遗传工程操作的工程菌，与获得该工程菌的亲本菌株相比，该工程菌的生物素表达水平提高。
5.如权利要求4所述的产溶剂梭菌，其特征在于，所述产溶剂梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(ClostridiumSaccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)。
6.如权利要求4或5所述的产溶剂梭菌，其特征在于，所述产溶剂梭菌中SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白过表达；或所述产溶剂梭菌中经遗传工程操作而转入了权利要求1－3中任一项所述的核酸构建物。
7.如权利要求4所述的产溶剂梭菌，其特征在于，所述产溶剂梭菌是丙酮丁醇梭菌或扬氏梭菌，所述产溶剂梭菌经遗传工程操作而转入了核酸序列如SEQ ID NO:11所示的核酸构建物。
8.一种产溶剂梭菌发酵方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求4－7中任一项所述的产溶剂梭菌进行发酵，其中，发酵培养基含有与该产溶剂梭菌的标准发酵培养基相比降低的生物素浓度。
9.一种提高产溶剂梭菌生长能力和/或产溶剂能力的方法，其特征在于，所述方法包括对所述产溶剂梭菌实施遗传工程操作，使其过表达SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，
所述产溶剂梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium Saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)；和
所述产溶剂梭菌中经遗传工程操作而转入了权利要求1－3中任一项所述的核酸构建物。
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Effective date of registration: 20200609 Address after: 200032 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai Applicant after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences Address before: 200031, 319 Yueyang Road, Shanghai, Shanghai, Xuhui District Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
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Application publication date: 20170517 |
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