发明内容
本发明整体提供了,尤其是,用于通过对底物的微生物发酵而产生一种或多种产物的方法,用于此类方法的经遗传修饰的微生物,适于制备经遗传修饰的微生物的核酸,以及用于在混合的微生物群中选择某些微生物或防止不合需要的微生物生长的方法。
在第一方面,本发明提供了重组微生物,所述重组微生物包含被改造为适于表达一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶的至少一种外源核酸,以使得所述重组微生物可产生所述一种或多种维生素,其中所述重组微生物是厌氧菌。
在一个实施方案中,所述至少一种外源核酸编码一种或多种基因,所述一种或多种基因编码所述一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶。
在一个实施方案中,所述一种或多种维生素是微生物生长所需要的。在一个实施方案中,所述一种或多种维生素是微生物生长所必需的。
在一个实施方案中,所述至少一种外源核酸包含衍生出所述重组微生物的亲代微生物中所缺乏的一种或多种基因。
在一个实施方案中,本发明提供了重组微生物,所述重组微生物能够产生一种或多种维生素生物合成途径的一种或多种酶,所述微生物包含编码所述一种或多种酶的一种或多种外源核酸,其中所述重组微生物衍生自缺乏编码所述一种或多种酶的一种或多种核酸的亲代微生物。
在一个实施方案中,所述一种或多种维生素选自硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和氰钴胺素。在一个具体的实施方案中,所述维生素是硫胺素(B1)和/或泛酸盐(B5)。
在一个实施方案中,所述一种或多种酶选自下文描述的组。在一个具体的实施方案中,所述一种或多种酶选自硫胺素生物合成蛋白ThiC(EC4.1.99.17)、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶PanB(EC 2.1.2.11)、泛酸-β-丙氨酸连接酶PanC(EC 6.3.2.1)以及天冬氨酸1-脱羧酶Pan D(EC 4.1.1.11)。在一个实施方案中,所述酶是ThiC。在另一个实施方案中,所述一种或多种酶是PanB、PanC和PanD的组合。
在一个实施方案中,所述微生物选自包含在一个具体的实施方案中,所述微生物选自以下:梭菌属(Clostridium)、真细菌属(Eubacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、放线菌属(Actinomyces)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、拟杆菌属(Bacteriodes)、梭杆菌属(Fusobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或韦永氏球菌属(Veillonella)。
在一个实施方案中,微生物是一氧化碳营养型产乙酸菌。
在一个具体的实施方案中,微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在一个实施方案中,所述微生物为自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体的实施方案中,所述微生物为自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体的实施方案中,所述微生物为杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个具体的实施方案中,所述微生物选自自产乙醇梭菌或杨氏梭菌,并且所述酶是ThiC。在另一个具体的实施方案中,所述微生物是自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌或伍氏醋酸杆菌,并且所述酶是PanB、PanC和PanD。
在一个实施方案中,本发明包括不需要补充任何维生素的重组细菌。
在第二方面,本发明提供了核酸,所述核酸编码产生一种或多种维生素的一种或多种生物合成途径中的一种或多种酶。
在一个实施方案中,所述核酸编码两种或更多种酶。在一个实施方案中,本发明的核酸编码3、4、5或6种此类酶。
在一个实施方案中,所述一种或多种维生素选自硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和氰钴胺素。在一个具体的实施方案中,所述维生素是硫胺素(B1)或泛酸盐(B5)。
在一个实施方案中,所述一种或多种酶如后文所述。
在第三方面,本发明提供了包含第二方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。
在一个具体的实施方案中,所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个具体的实施方案中,所述表达构建体或载体是质粒。
在第四方面,本发明提供了包含任一种或多种第二方面的核酸或第三方面的载体或构建体的宿主生物体。
在第五方面,本发明提供了组合物,其包含如本发明的第三方面提及的表达构建体或载体,和甲基化构建体或载体。
优选地,所述组合物能够产生根据本发明的第一方面的重组微生物。
在一个具体的实施方案中,所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
在第六方面,本发明提供了通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法,所述微生物发酵包括使用本发明第一方面的重组微生物发酵底物。
在一个实施方案中,所述底物选自包括CO、二氧化碳和氢气、甘油、脂肪酸、淀粉、糖蜜、戊糖和己糖、生物质的底物。
在一个具体的实施方案中,所述底物是包含CO的底物。在所述实施方案中,本发明的方法可用于减少工业过程的总大气碳排放。
优选地,所述发酵包括在生物反应器中使用本发明的重组微生物发酵底物从而产生一种或多种产物的步骤。
在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(a)向包含本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器提供底物;以及
(b)通过所述生物反应器中的培养物的厌氧发酵而产生一种或多种产物。
在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(a)在由工业过程产生的含CO的气体被释放到大气中之前,将所述气体捕获;
(b)通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生所述一种或多种产物,所述培养物包含一种或多种本发明第一方面的微生物。
在所述方法方面的具体的实施方案中,将所述微生物维持在含水培养基中。
在所述方法方面的具体的实施方案中,所述底物的发酵在生物反应器中进行。
在具体的实施方案中,所述含CO的底物是含CO的气态底物。在一个实施方案中,所述底物包含工业废气。在某些实施方案中,所述气体是钢厂废气或合成气。
在一个实施方案中,所述底物通常会包含大比例的CO,例如至少约20体积%到约100体积%、20体积%到70体积%、30体积%到60体积%以及40体积%到55体积%的CO。在具体的实施方案中,所述底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%或约50体积%的CO,或约55体积%或约60体积%的CO。
在某些实施方案中,所述方法还包括从发酵液中回收所述一种或多种产物中的一种或多种的步骤。
在某些实施方案中,所述一种或多种产物包括乙醇、乙酸、丁醇、异丙醇、一种或多种维生素、丙酮和2,3-丁二醇。
在一个具体的实施方案中,所述一种或多种产物是一种或多种维生素。
在一个实施方案中,将所述一种或多种产物(在一个实施方案中是维生素)从发酵中回收,并传送到一个或多个其他生物反应器以支持一种或多种第二微生物的生长,或支持一种或多种第二微生物对底物的发酵。
在一个实施方案中,所述一种或多种第二微生物是不能产生或不能以足够的水平产生所述一种或多种产物(在一种实施方案中是维生素)的微生物,并需要向其生长或发酵培养基补充所述一种或多种产物(在一个实施方案中是维生素)以确保或维持生长或发酵,或提高生长或发酵效率。
在一个实施方案中,本发明的方法还可包含由所述一种或多种第二微生物对底物的发酵以产生一种或多种产物。在一个实施方案中,然后可从发酵液中回收所述一种或多种产物。
在第七方面,本发明提供了通过第六方面的方法产生的一种或多种产物。在某些实施方案中,所述一种或多种产物包括乙醇、乙酸、丁醇、异丙醇、一种或多种维生素、丙酮、2,3-丁二醇。
在第八方面,本发明提供了用于产生本发明第一方面的微生物的方法,所述方法包括用一种或多种外源核酸转化亲代微生物,所述外源核酸被改造为适于表达在产生一种或多种维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶。
在某些实施方案中,所述一种或多种维生素和酶如后文所述。
在第九方面,本发明提供了用于在混合的微生物群中选择微生物A的方法,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述外源核酸被改造为适于表达在产生一种或多种所述微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得所述微生物A可产生所述一种或多种维生素,所述方法包括使混合的微生物群经受包括缺乏所述一种或多种维生素的培养基的生长条件。
在一个实施方案中,所述一种或多种维生素是微生物生长所必需的。
在一个实施方案中,所述至少一种外源核酸编码一种或多种基因,所述一种或多种基因编码在一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶。
在一个实施方案中,所述一种或多种维生素如前文所述。
在一个实施方案中,所述一种或多种酶如后文所述。
在一个实施方案中,所述培养基选自适于培养一种或多种微生物的任何合适的培养基。
在一个实施方案中,在产生重组微生物的过程中,进行所述方法以区分重组与非重组微生物。
在另一个实施方案中,在微生物A的生长和/或对底物发酵的过程中,进行所述方法以负选择(select against)污染性微生物。
在第十方面,本发明提供了防止一种或多种不合需要的微生物在微生物培养物或发酵液中生长的方法,其中所述微生物培养物或发酵液包含微生物A和营养培养基,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述外源核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物A和不合需要的微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,其中所述培养基缺乏所述微生物生长所需的所述一种或多种维生素。
在第十一方面,本发明提供了用于微生物A的选择性生长或培养的方法,并且其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,并且其中所述生长或培养培养基缺乏所述一种或多种维生素。
在一个实施方案中,所述条件负选择一种或多种不合需要的微生物的生长。
在第十二方面,本发明提供了用于通过微生物A对底物进行的微生物发酵而产生一种或多种产物的方法,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,,所述核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,并且其中发酵在缺乏所述一种或多种维生素的生长培养基之中或之上进行。
在一个实施方案中,所述条件正选择(select for)微生物A的生长并且负选择一种或多种不合需要的微生物的生长。
本发明的第九、十、十一和十二方面的微生物可选自任何目的微生物,并且不限于厌氧菌。但是,在一个实施方案中,它们选自厌氧微生物。在一个实施方案中,它们选自一氧化碳营养型产乙酸菌。
微生物及其生长
想到了分离的、经遗传工程改造的、一氧化碳营养型产乙酸菌。这些细菌可借助维生素生物合成途径中的外源生物合成基因而成为对硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和/或氰钴胺素原养型的。例如,可用外源thiC基因和/或外源panBCD基因簇将营养缺陷型转化为原养型。在多个实施方案中,细菌可以是自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌或凯伍热厌氧菌。在某些实施方案中,它们是梭菌属细菌,如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和食一氧化碳梭菌。任选地,在不存在所述外源thiC基因的情况下,所述细菌不能将1-(5'-磷酸核糖)-5-氨基咪唑核糖核苷酸(AIR)转化成4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶。想到了来自拉氏梭菌的外源thiC基因,并在下文示例性示出。所述外源thiC基因可以在质粒上,以使得所述细菌在质粒消除时为硫胺素营养缺陷型的。或者,想到了所述细菌在质粒消除时为泛酸盐营养缺陷型的。在某些实施方案中,想到了分离的、经遗传工程改造的一氧化碳营养型细菌。在某些实施方案中,所述细菌可以是拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、发酵植物多糖梭菌(C.phytofermentans)、热纤梭菌(C.thermocellum)、噬纤维梭菌(C.cellulovorans)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)。
一种可以使用的特定外源panBCD基因簇来自拜氏梭菌(C.beijerenckei)。
通过在含有气态碳源的培养基中生长,可培养所述分离的、经遗传工程改造的一氧化碳营养型产乙酸菌;碳源可以包含CO。类似地,所述细菌可在含有包含CO的能源的培养基中培养。想到了所述培养可以是严格厌氧的。还想到了如果细菌包含外源thiC基因,则所述培养基可以不含硫胺素。在一些实施方案中,细菌将包含外源panBCD基因簇并且所述培养基将不含泛酸盐。在其它实施方案中,所述细菌将包含生物合成途径中的一种或多种外源基因,并且所述培养基将不含相应生物合成途径的产物。在一些实施方案中,碳源可包括工业废气流,如来自铁金属产品制备的废气(如钢厂废气)、来自有色金属产品制备的废气、来自石油精炼过程的废气、来自煤的气化的废气、来自电力生产的废气、来自炭黑生产的废气、来自氨生产的废气、来自甲醇生产的废气、来自焦炭制备的废气以及合成气。汽车废气也可用作碳源。
CO转化过程
想到的一个实施方案是将含CO的底物中的CO转化成较高分子量的产物的方法。所述方法包括:将含CO的底物传送到包含在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸菌培养物的生物反应器,以使得所述细菌将CO转化成较高分子量的产物;以及从所述生物反应器中回收所述较高分子量的产物。将一氧化碳营养型产乙酸菌进行遗传工程改造以表达不存于培养基中的营养素的生物合成途径中的酶。可向培养基提供任选外加的营养素,以用于一氧化碳营养型产乙酸菌的存活和/或生长。当对一氧化碳营养型产乙酸菌进行遗传工程改造以表达营养素的生物合成途径中的酶时,所述营养素不存在于外加的营养素中。任选地,从所述营养素的营养缺陷型亲代细菌进行遗传工程改造得到一氧化碳营养型产乙酸菌。在一种替代形式中,所述较高分子量的产物选自醇、酸、二醇、酯、酮及其混合物。在另一种替代形式中,所述较高分子量的产物选自乙醇、丙酮、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、甲乙酮(MEK)、3-羟丙酸、脂肪酸、萜、1,3-丁二烯、3-羟基丁酸酯、2-羟基异丁酸、醋酸及其混合物。任选地,将选择剂加入培养基,如所需的细菌能耐受的抗生素。所述抗生素可用于抑制非期望的污染性微生物或已经丧失了所需的生物合成酶或酶途径的细菌的生长。要注意的是,抗生素可以不是必需的,并且在一些实施方案中,外来抗生素不存在于所述培养基中。赋予原养型的生物合成酶可发挥充分的选择压力以维持所需的微生物的培养物。在成本节约、环境保护以及特别是人类健康方面,这可能是有益的。通常,所述培养基是含有溶解的或未溶解的气体的含水混合物。通常,将培养条件维持在温度为约30℃与约37℃之间,并且pH为约4至小于7。在一个实施方案中,对含CO的底物进行预处理以除去非CO的气体组分。在一些实施方案中,可以产生超过培养物中的细菌所需量的营养素。在此类实施方案中,可收集过量的营养素作为发酵产物。
在一个实施方案中,将含CO的气态底物中的CO转化为较高分子量的产物。将含CO的气态底物传送到包含在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸菌培养物的生物反应器中,以使得所述细菌将CO转化成较高分子量的产物。从所述生物反应器中回收所述较高分子量的产物。将一氧化碳营养型产乙酸菌进行遗传工程改造以表达不存于培养基中的营养素的生物合成途径中的酶。此外,一氧化碳营养型产乙酸菌借助外源thiC基因和/或外源panBCD基因簇而成为对硫胺素和/或泛酸盐原养型的。所述营养素选自硫胺素和泛酸盐。
在CO转化过程中使用的组合物
另一实施方案是用于将含CO的底物中的CO转化成较高分子量的产物的组合物。所述组合物可包含在pH为约4至小于7的水性培养基中所含的一氧化碳营养型产乙酸菌,以及一种或多种用于所述一氧化碳营养型产乙酸菌的存活或生长的营养素。所述一氧化碳营养型产乙酸菌经遗传工程改造以表达不存在于培养基中的营养素(如硫胺素或泛酸盐)的生物合成途径中的酶。所述组合物可处于容器中,如生物反应器中,并通常将含有含CO的气态碳源。
其它方法
想到的另一实施方案是提供用于减少工业过程的温室气体排放物的微生物。分析了所述微生物的基因组序列,以确定编码必需营养素的生物合成途径中所必需的酶的基因是缺乏还是有缺陷的。如果发现缺失或缺陷的酶,则通过基因转移技术将外源(或异源)型基因提供给所述微生物,以使得所述微生物成为对必需营养素原养型的。所述异源基因可来自不同的种、不同的属、不同的门、或甚至不同的界。遗传缺陷或缺失的互补将使得微生物成为原养型的。
想到的又一个实施方案是用于将外源核酸转移到硫胺素和/或泛酸盐营养缺陷型的一氧化碳营养型产乙酸菌群中的方法。采用含有可操作地连接到启动子的外源thiC基因或外源panBCD基因簇的第一核酸转化所述细菌。
从转化的细菌群中选择硫胺素原养型和/或泛酸盐原养型。任选地,可用包含当在细菌中表达时赋予所需性质的外源或内源基因的第二核酸共转化所述细菌。所述所需的性质不必为选择性的。所述第一和第二核酸可以在单独的分子上或在同一分子中。任选地,可使用另外的步骤来针对第一核酸的存在情况筛选原养型、转化的细菌。在某些情况下,可能有必要和/或需要在共转化步骤之前处理第一和第二核酸以形成甲基化的第一和第二核酸。
又一个实施方案在不存在任何其它选择剂(如抗生素)的情况下使用原养型自身作为转化体的可选择标记。所述原养型可以是针对维生素(如下所示)或任何其它必需营养素。在不存在抗生素的情况下的干净选择(cleanslection)出人意料。无论是在需氧还是厌氧生长条件下,这种类型的选择均可用于本文所述的任何梭菌,以及其它革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。
广义上说,本发明还可单独或综合地包括本申请说明书中提及或指出的部分、要素和特征,包括两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合,并且当本文提及的具体整数在本发明所涉及的领域具有已知的等价物时,所述已知的等价物被认为如同单独被提出一样纳入本文。
具体实施方式
下面是在广义上给出的对本发明(包括其优选的实施方案)的说明。下文在标题“实施例”下给出的公开内容进一步解释本发明,其提供了支持本发明的实验数据、本发明多个方面的具体实例以及实施本发明的方法。
本发明人惊讶地发现,在微生物存活所必需的维生素的生物合成途径中的一种或多种基因可用作有效的选择标记以筛选用外源核酸转化的细胞,其中所述微生物天然不含有或表达所述一种或多种基因。
这具有多个优点,包括无需使用昂贵的、具有局限性并且可能对一些所需的细胞有毒性的标准选择性标记和选择剂(如抗生素)。因为可省去通常需要加到生长和发酵培养基中的维生素,其还具有进一步降低重组微生物的生长和发酵成本的有益效果。另外,维生素自身是有价值的产物,因此除了充当选择性标记之外,可将产生的维生素回收并销售或用于其它目的。
本文中提到的“发酵液”是包含至少一种营养培养基和细菌细胞的培养基。
本文中提到的“穿梭微生物”是其中表达甲基转移酶的微生物,并且其不同于目标微生物。
本文中提到的“目标微生物”是其中表达包括在表达构建体/载体上的基因的微生物,并且其不同于所述穿梭微生物。
术语“主要发酵产物”旨在意指以最高浓度和/或产率产生的那种发酵产物。
当用于发酵过程时,术语“提高效率”、“提高的效率”等包括但不限于提高如下中的一个或多个:催化所述发酵的微生物的生长速率、在提高的产物浓度下的生长和/或产物产生速率、产生的所需产物的体积/消耗的底物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、以及产生的所需产物与所述发酵的其它副产物相比的相对比例。
短语“含一氧化碳的底物”及类似术语应被理解为包括任意底物,其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株用于例如生长和/或发酵。
短语“含一氧化碳的气态底物”及类似短语和术语包括含有某一水平一氧化碳的任意气体。在某些实施方案中,所述底物含有至少约20体积%至约100体积%的CO、20体积%至70体积%的CO、30体积%至60体积%的CO、40体积%至55体积%的CO。在具体的实施方案中,底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%或约50体积%的CO,或约55体积%或约60体积%的CO。
虽然所述底物不必需含有任何氢气,但是存在H2应该不会对本发明方法的产物形成不利。在具体的实施方案中,存在氢气可获得提高的醇生产的总体效率。例如,在具体的实施方案中,所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的H2:CO。在一个实施方案中,所述底物包含约30体积%或更少的H2、20体积%或更少的H2、约15体积%或更少的H2或约10体积%或更少的H2。在其它实施方案中,所述底物流包含低浓度的H2,例如低于5%、或低于4%、或低于3%、或低于2%、或低于1%,或基本上不含氢气。所述底物还可包含一些CO2,例如,约1体积%至约80体积%的CO2、或1体积%至约30体积%的CO2。在一个实施方案中,所述底物包含低于或等于约20体积%的CO2。在具体的实施方案中,所述底物包含低于或等于约15体积%的CO2、低于或等于约10体积%的CO2、低于或等于约5体积%的CO2,或基本上不含CO2。
在以下的说明书中,从递送和发酵“含CO的气态底物”的方面描述本发明的实施方案。但是,应理解,所述气态底物可以其他形式提供。例如,所述含CO的气态底物可以溶解于液体中的形式提供。实质上,将液体用含一氧化碳的气体饱和,然后将所述液体加入生物反应器中。这可使用标准的方法学完成。例如,可使用微泡分散发生器(Hensirisak et al.Scale-up ofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermentation;Applied Biochemistryand Biotechnology第101卷,第3期/2002年10月)。又例如,可将所述含CO的气态底物吸附到固相载体上。术语“含CO的底物”等的使用涵盖了此类替代方法。
在本发明的具体的实施方案中,所述含CO的气态底物是工业排气或废气。“工业废气或工业排气”应被广义地认为包括工业过程产生的任何含CO的气体,并且包括铁金属产品制备、有色金属产品制备、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产和焦炭制备所产生的气体。本文其它部分可提供另外的实例。
除非另有说明,否则本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等旨在涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如本文将进一步描述,在一些实施方案中,所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此,向发酵反应中加入金属或组合物应被理解为包括加入到这些反应器之一或两个中。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排布组成的发酵装置,其包括连续搅拌槽式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器,或适于气液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中,所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此,当提到将底物加入到所述生物反应器或发酵反应中时,如果合适,应理解为加入到这些反应器中之一或两个中。
“外源核酸”是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何合适的来源,包括但不限于与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种,或者它们可通过人工或重组方法形成。所述外源核酸代表了非天然存在于待引入其的微生物内的核酸序列,并且使得能够表达非天然存在于所述微生物内的产物。所述外源核酸可被改造为适于整合到待引入其的微生物的基因组中或保持染色体外状态。通常,所述外源核酸是异源的,来自与受体不同的种、不同的属、或不同的门或界。
应理解,可使用其序列与本文具体示例的序列不同的核酸来实施本发明,只要它们执行基本上相同的功能。对于编码蛋白或肽的核酸序列来说,这意味着所编码的蛋白或肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列来说,所述变体序列将具有促进一种或多种基因表达的能力。此类核酸在本文可称为“功能等价变体”。举例来说,核酸的功能等价变体包括等位基因变体、基因片段、包含突变(缺失、插入、核苷酸置换等)的基因和/或多态性等。来自其它微生物的同源基因也可被视为本文具体示例的序列的功能等价变体的实例。这些包括在如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、拜氏梭菌的种之中的同源基因,它们的详细情况可从如Genbank或NCBI的网站公开获得。所述短语“功能等价变体”也应被视为包括由特定生物体的密码子优化而导致的序列变化的核酸。本文的核酸的“功能等价变体”将优选地具有与已鉴定的核酸至少约70%、优选约80%、更优选约85%、优选约90%、优选约95%或更高的核酸序列同一性。
还应理解,可使用其序列与本文具体示例的氨基酸序列不同的多肽来实施本发明。这些变体在本文可称为“功能等价变体”。蛋白或肽的功能等价变体包括与已鉴定的蛋白或肽共有至少40%、优选50%、优选60%、优选70%、优选75%、优选80%、优选85%、优选90%、优选95%或更高的氨基酸同一性并与所述目的肽或蛋白具有基本上相同的功能的那些蛋白或肽。此类变体在其范围内包括这样的蛋白或肽片段,其中所述片段包括多肽的截短形式,其中缺失可以为1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸,并且可在多肽的任一末端延伸1至25个残基,并且其中缺失可以为所述区域内的任何长度,或可以在内部位置。本文特定多肽的功能等价变体也应视为包括例如如在之前段落中所示例的,在其它细菌种中由同源基因表达的多肽。
本文使用的“基本上相同的功能”旨在意指所述核酸或多肽能够执行作为变体来源的核酸或多肽的功能。例如,本发明的酶的变体将能够催化与该酶所催化的反应相同的反应。但是,不应认为意指所述变体与作为所述变体来源的核酸或多肽具有相同水平的活性。
可使用任意数量的已知方法来评估功能等价变体是否与作为所述变体来源的核酸或多肽具有基本上相同的功能。但是,举例来说,Zhang等(1997,J.Bacteriol.,179:3030-5)、Lawhorn等(2004,Organic&BiomolecularChemistry,2:2538-46)中所概述的方法可用于评估关于ThiC的功能;Powers&Snell(1976,Biol.Chem.251,3786-3793)可用于评估关于PanB的功能;Cronan等(1982,J.Bacteriol.149:916-922)可用于评估关于PanC的功能;或者Williamson(1985,Methods Enzymol.113:589-595)可用于评估关于PanD的功能;或者可以使用关于硫胺素基因的Lawhorn等(2004,J.Soc.Biol.Chem.,279:43555-9)所概述的遗传筛选。
“亲代微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。所述亲代微生物可以是天然存在的微生物(即,野生型微生物),或之前曾被修饰但不表达微生物生长所需的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶的微生物。因此,对本发明的重组微生物进行了修饰以表达在亲代微生物中不表达的所述一种或多种酶。
术语核酸“构建体”或“载体”及类似术语应被广义地认为包括适合用作载体将遗传物质转移到细胞中的任意核酸(包括DNA和RNA)。所述术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包含一种或多种调控元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在具体的实施方案中,所述构建体或载体被改造为适于使得由所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸核酸,以及用一种或多种可帮助向细胞递送的试剂(例如,脂质体缀合的核酸、其中包含所述核酸的有机体(organism))配制的核酸。
本发明适用于通过微生物发酵产生“一种或多种产物”。提到“一种或多种产物”应被广义地认为包括可通过微生物发酵产生的任何产物。但是,举例来说,其包括乙醇、乙酸、丁醇、异丙醇、一种或多种维生素、丙酮、2,3-丁二醇。
“污染性微生物”或“不合需要的微生物”应被广义地认为意指无论由于何种原因而不合需要的任何微生物。
当在本发明方法的上下文中使用时,“防止生长”及类似术语应被广义地认为包括对一种或多种微生物生长水平的任何程度的防止或降低。所述术语不应被解释为意指微生物的生长受到完全阻止、抑制或中止。但是,在一个优选的实施方案中,所述微生物的生长基本上被阻止。
“生长所需的”被视为意指所述维生素是达到所需生长水平所需要的,以使得在微生物将在其中或其上生长的培养基中不存在所述维生素足以正选择重组微生物(能够形成维生素)或负选择不合需要的或污染性的微生物。在一个实施方案中,维生素是微生物的“生长必需的”。在这种情况下,没有所述维生素,微生物基本上不会生长或可能死亡。
“厌氧菌”或“厌氧微生物”或类似术语应被广义地认为包括专性和兼性厌氧菌。
重组微生物
如前文所讨论的,本发明提供了重组微生物。所述重组微生物包含至少一种外源核酸,所述核酸编码在产生微生物的生长需要的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种基因。因此所述重组微生物能够产生所述一种或多种维生素。所述重组微生物是厌氧菌。
所述重组微生物由亲代微生物产生。
所述亲代微生物可选自缺乏所述一种或多种维生素生物合成途径中的所述一种或多种基因的任何微生物。
在一个实施方案中,所述维生素选自硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和氰钴胺素。在一个具体的实施方案中,所述维生素是硫胺素(B1)或泛酸盐(B5)。
所述一种或多种酶可以是参与维生素生物合成途径的任意一种。但是,举例来说,所述一种或多种酶可选自下表1至表8中列出的那些。
表1:硫胺素(B1)生物合成:
半胱氨酸脱硫酶[EC:2.8.1.7]
甘氨酸氧化酶[EC:1.4.3.19]
羟乙基噻唑激酶[EC:2.7.1.50]
羟甲基嘧啶[EC:2.7.4.7]
核苷三磷酸酶[EC:3.6.1.15]
磷酸甲基嘧啶激酶[EC:2.7.1.49]
硒代半胱氨酸裂解酶[EC:4.4.1.16]
硫载体蛋白ThiS腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.73]
硫胺素酶[EC:3.5.99.2]
硫胺素生物合成蛋白ThiC[EC 4.1.99.17]
硫胺素生物合成蛋白ThiG
硫胺素生物合成蛋白ThiH
硫胺素生物合成蛋白ThiI
硫胺素激酶[EC:2.7.1.89]
硫胺素吡啶基酶[EC:2.5.1.2]
硫胺素焦磷酸激酶[EC:2.7.6.2]
硫胺素单磷酸激酶[EC:2.7.4.16]
磷酸硫胺素焦磷酸化酶[EC:2.5.1.3]
硫胺素三磷酸酶[EC:3.6.1.28]
表2:核黄素(B2)生物合成:
GTP环化水解酶II[EC:3.5.4.25]
2,5-二氨基-6-(核糖基氨基)-4(3H)-嘧啶酮5'-磷酸还原酶[EC:1.1.1.302]
2-氨基-5-甲酰基氨基-6-核糖基氨基嘧啶-4(3H)-酮5'-单磷酸去甲酰酶[EC:3.5.1.102]
3,4-二羟基2-丁酮4-磷酸合酶[EC:4.1.99.12]
4-肌醇六磷酸酶/酸性磷酸酶[EC:3.1.3.2/3.1.3.26]
5,6-二甲基苯并咪唑合酶[EC:1.14.99.40]
5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶[EC:1.1.1.193]
6,7-二甲基-8-核糖醇基二氧四氢蝶啶合酶[EC:2.5.1.78]
酸性磷酸酶(A类)[EC:3.1.3.2]
酸性磷酸酶(B类)[EC:3.1.3.2]
酸性磷酸酶[EC:3.1.3.2]
水钴胺素还原酶/NAD(P)H-黄素还原酶[EC:1.5.1.41/1.16.1.3]
胆绿素还原酶/黄素还原酶[EC:1.5.1.30/1.3.1.24]
二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶/5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶[EC:1.1.1.193/3.5.4.26]
二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶[EC:3.5.4.26]
核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1/3[EC:3.6.1.9/3.1.4.1]
FAD合成酶[EC:2.7.7.2]
FMN还原酶[EC:1.5.1.38]
GTP环化水解酶II[EC:3.5.4.25]
GTP环化水解酶IIa[EC:3.5.4.29]
低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶[EC:3.1.3.48/3.1.3.2]
6型溶血磷脂酸磷酸酶[EC:3.1.3.2]
FMN腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.2]
核黄素激酶[EC:2.7.1.26/EC:2.7.1.161]
核黄素合酶[EC:2.5.1.9]
5型抗酒石酸酸性磷酸酶[EC:3.1.3.2]
tRNA假尿苷合酶8/2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖醇氨基)-嘧啶-4(3H)-酮脱氨酶[EC:5.4.99.-]
酪氨酸酶[EC:1.14.18.1]
表3:烟酸(B3)生物合成:
5'-核苷酸酶[EC:3.1.3.5]
6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶[EC:3.7.1.-]
6-羟基烟酸3-单氧合酶[EC:1.14.13.114]
醛氧化酶[EC:1.2.3.1]
天冬氨酸脱氢酶[EC:1.4.1.21]
双官能NMN腺苷酰转移酶/nudix水解酶[EC:3.6.1.-2.7.7.1]
核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1/3[EC:3.6.1.93.1.4.1]
enamidase[EC:3.5.2.18]
L-天冬氨酸氧化酶[EC:1.4.3.16]
马来酰胺酸酰胺水解酶[EC:3.5.1.107]
马来酸异构酶[EC:5.2.1.1]
NAD(P)转氢酶[EC:1.6.1.1]
NAD(P)转氢酶α亚基[EC:1.6.1.2]
NAD(P)转氢酶β亚基[EC:1.6.1.2]
NAD+二磷酸酶[EC:3.6.1.22]
NAD+激酶[EC:2.7.1.23]
NAD+核苷酶[EC:3.2.2.5]
NAD+合酶(谷氨酰胺水解)[EC:6.3.5.1]
NAD+合酶[EC:6.3.1.5]
N-甲酰基马来酰胺酸去甲酰酶[EC:3.5.1.106]
烟酰胺酶[EC:3.5.1.19]
烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.182.7.7.1]
烟酰胺N-甲基转移酶[EC:2.1.1.1]
烟酰胺磷酸核糖基转移酶[EC:2.4.2.12]
烟酰胺核糖苷激酶[EC:2.7.1.22]
烟酰胺-核苷酸腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.1]
烟酸磷酸核糖基转移酶[EC:2.4.2.11]
烟酸-核苷酸腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.18]
烟酸-核苷酸焦磷酸化酶(羧化)[EC:2.4.2.19]
嘌呤核苷酶[EC:3.2.2.1]
嘌呤-核苷磷酸化酶[EC:2.4.2.1]
吡嗪酰胺酶[EC:3.5.1.-]
喹啉酸合酶[EC:2.5.1.72]
UDP-糖二磷酸酶[EC:3.6.1.45]
表4:泛酸盐(B5)生物合成:
2-脱氢泛酸2-还原酶[EC:1.1.1.169]
3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶PanB[EC:2.1.2.11]
4'-磷酸泛硫乙胺基转移酶[EC:2.7.8.-]
4-磷酸泛酸-β-丙氨酸连接酶[EC:6.3.2.36]
乙酰乳酸合酶I/II/III大亚基EC:2.2.1.6]
乙酰乳酸合酶I/III小亚基[EC:2.2.1.6]
乙酰乳酸合酶II小亚基[EC:2.2.1.6]
酰基载体蛋白磷酸二酯酶[EC:3.1.4.14]
天冬氨酸1-脱羧酶PanD[EC:4.1.1.11]
β-脲酰丙酸酶[EC:3.5.1.6]
生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]连接酶[EC:6.3.4.15]
支链氨基酸转氨酶[EC:2.6.1.42]
脱磷酸-CoA激酶[EC:2.7.1.24]
二氢嘧啶酶[EC:3.5.2.2]
二氢嘧啶脱氢酶(NADP+)[EC:1.3.1.2]
二羟酸脱水酶[EC:4.2.1.9]
核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1/3[EC:3.6.1.93.1.4.1]
全-[酰基载体蛋白]合酶[EC:2.7.8.7]
酮醇酸还原异构酶[EC:1.1.1.86]
泛硫乙胺水解酶[EC:3.5.1.92]
泛硫乙胺-磷酸腺苷酰转移酶[EC:2.7.7.3]
泛酸激酶[EC:2.7.1.169]
泛酸连接酶/胞苷酸激酶[EC:2.7.4.14/6.3.2.1]
泛酸-β-丙氨酸连接酶PanC[EC:6.3.2.1]
磷酸泛硫乙胺腺苷酰转移酶/脱磷酸-CoA激酶[EC:2.7.1.242.7.7.3]
磷酸泛酸-半胱氨酸连接酶[EC:6.3.2.5]
磷酸泛酸-半胱氨酸连接酶[EC:6.3.2.5]
磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶[EC:4.1.1.36]
I型泛酸激酶[EC:2.7.1.33]
II型泛酸激酶[EC:2.7.1.33]
III型泛酸激酶[EC:2.7.1.33]
表5:吡哆醇(B6)生物合成:
4-羟基苏氨酸-4-磷酸脱氢酶[EC:1.1.1.262]
醛氧化酶[EC:1.2.3.1]
D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶[EC:1.2.1.72]
赤糖酸-4-磷酸脱氢酶[EC:1.1.1.290]
谷氨酰胺酰胺转移酶[EC:2.6.-.-]
磷酸丝氨酸转氨酶[EC:2.6.1.52]
吡哆醛磷酸酶[EC:3.1.3.74]
磷酸吡哆醛磷酸酶EC:3.1.3.74]
5'-磷酸吡哆胺氧化酶[EC:1.4.3.5]
吡哆醇4-脱氢酶[EC:1.1.1.65]
5-磷酸吡哆醇合酶[EC:2.6.99.2]
吡哆醇生物合成蛋白[EC:4.-.-.-]
吡哆醇激酶[EC:2.7.1.35]
苏氨酸合酶[EC:4.2.3.1]
表6:生物素(B7)生物合成:
6-羧基己酸-CoA连接酶[EC:6.2.1.14]
8-氨基-7-氧代壬酸合酶[EC:2.3.1.47]
腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基转移酶[EC:2.6.1.62]
生物素合成酶[EC:2.8.1.6]
生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]连接酶[EC:6.3.4.15]
生物素酶[EC:3.5.1.12]
生物素-蛋白连接酶[EC:6.3.4.156.3.4.116.3.4.106.3.4.9]
脱硫生物素合成酶[EC:6.3.3.3]
III型泛酸激酶[EC:2.7.1.33]
表7:叶酸(B9)/对氨基苯甲酸(B10)生物合成:
2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶二磷酸激酶[EC:2.7.6.3]
4-氨基-4-去氧分支酸裂解酶[EC:2.6.1.85/EC:4.1.3.38]
6-丙酮酰四氢生物蝶呤合酶[EC:4.2.3.12]
6-丙酮酰四氢蝶呤2'-还原酶[EC:1.1.1.220]
碱性磷酸酶[EC:3.1.3.1]
二氢叶酸还原酶[EC:1.5.1.3]
二氢叶酸合酶/叶酰多聚谷氨酸合酶[EC:6.3.2.17/6.3.2.12]
二氢新蝶呤还原酶(dihydromonapterin reductase)[EC:1.5.1.-]
二氢新蝶呤醛缩酶/2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶
二磷酸激酶[EC:2.7.6.3/4.1.2.25]
二氢新蝶呤醛缩酶[EC:4.1.2.25]
二氢蝶啶还原酶[EC:1.5.1.34]
二氢蝶酸合酶[EC:2.5.1.15]
叶酰多聚谷氨酸合酶[EC:6.3.2.17]
γ-谷氨酰水解酶[EC:3.4.19.9]
GTP环化水解酶I[EC:3.5.4.16]
钼辅因子生物合成蛋白
钼蝶呤合酶催化亚基[EC:2.-.-.-]
钼蝶呤合酶硫载体亚基
对氨基苯甲酸合成酶[EC:2.6.1.85]
对氨基苯甲酸合成酶组分I[EC:2.6.1.85]
对氨基苯甲酸合成酶组分II[EC:2.6.1.85]
墨蝶呤还原酶[EC:1.1.1.153]
胸苷酸合酶[EC:2.1.1.45]
表8:钴胺素(B12)生物合成
5-氨基乙酰丙酸合酶[EC:2.3.1.37]
5-氨基乙酰丙酸:丙酮酸转氨酶[EC 2.6.1.43]
腺苷钴啉醇酰胺激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶[EC:2.7.1.156/2.7.7.62]
腺苷钴啉醇酰胺-GDP核唑转移酶[EC:2.7.8.26]
腺苷钴啉醇酰胺-磷酸合酶[EC:6.3.1.10]
腺苷钴啉胺酸合酶[EC:6.3.5.10]
α-核唑磷酸酶[EC:3.1.3.73]
钴胺素(I)腺苷转移酶[EC:2.5.1.17]
钴(II)啉酸a,c-二酰胺还原酶[EC:1.16.8.1]
钴-前咕啉5A水解酶[EC:3.7.1.12]
钴-前咕啉-5B(C1)-甲基转移酶[EC:2.1.1.195]
钴-前咕啉-7(C15)-甲基转移酶[EC:2.1.1.196]
钴螯合酶CobN[EC:6.6.1.2]
钴啉酸a,c-二酰胺合酶[EC:6.3.5.9/6.3.5.11]
铁蛋白[EC:1.16.3.1]
谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶[EC:5.4.3.8]
谷氨酰-tRNA还原酶[EC:1.2.1.70]
谷氨酰-tRNA合成酶[EC:6.1.1.17]
羟甲基胆色烷合酶[EC:2.5.1.61]
烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶[EC:2.4.2.21]
氧非依赖性粪卟啉原III氧化酶[EC:1.3.99.22]
胆色素原合酶[EC:4.2.1.24]
前咕啉-2脱氢酶/赛罗氢绿素(sirohydrochlorin)亚铁螯合酶[EC:1.3.1.76/4.99.1.4]
前咕啉-2/钴因子-2C20-甲基转移酶[EC:2.1.1.130/2.1.1.151]
前咕啉-3B合酶[EC:1.14.13.83]
前咕啉-3B C17-甲基转移酶[EC:2.1.1.131]
前咕啉-4C11-甲基转移酶[EC:2.1.1.133]
前咕啉-6X还原酶[EC:1.3.1.54]
前咕啉-6Y C5,15-甲基转移酶[EC:2.1.1.132]
前咕啉-8W脱羧酶[EC:1.-.-.-]
前咕啉-8X甲基变位酶[EC:5.4.1.2]
赛罗氢绿素钴螯合酶[EC:4.99.1.3]
苏氨酸-磷酸脱羧酶[EC:4.1.1.81]
尿卟啉原脱羧酶[EC:4.1.1.37]
尿卟啉原III甲基转移酶/合酶[EC:2.1.1.1074.2.1.75]
在一个具体的实施方案中,所述亲代微生物缺乏编码以下酶的一种或多种基因:硫胺素生物合成蛋白ThiC(EC 4.1.99.17)、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶PanB(EC 2.1.2.11)、泛酸-β-丙氨酸连接酶PanC(EC 6.3.2.1)和天冬氨酸1-脱羧酶Pan D(EC 4.1.1.11)。在一个实施方案中,所述亲代微生物缺乏编码酶ThiC的基因。在另一个实施方案中,所述亲代微生物缺乏编码PanB、PanC和PanD中的一种或多种或全部的一种或多种酶。
虽然本文以某些维生素生物合成途径举例说明了本发明,但是应理解,可使用其它生物合成途径。通过本发明的知识,可使用数据库比如KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes KEGG(http://www.genome.jp/kegg/;Kanehisa et al.,2012,Nucleic Acids Res.40,D109-D114;Kanehisa和Goto,2000,Nucleic Acids Res.28,27-30)或BioCyc(http://biocyc.org/;Caspi et al.,,2010,Nucleic Acids Res.38:D473-479)对任何测序的生物体进行分析,以鉴定存在于特定生物合成途径或从特定生物合成途径缺失的基因。
所述亲代微生物可选自任何厌氧微生物,在一个实施方案中,选自厌氧细菌。
在一个实施方案中,微生物选自以下属:梭菌属、真细菌属、消化链球菌属、消化球菌属、放线菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸杆菌属、拟杆菌属、梭杆菌属、弯曲杆菌属或韦永氏球菌属。
在一个具体的实施方案中,所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸菌。在某些实施方案中,所述微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在一个具体的实施方案中,所述亲代微生物选自产乙醇、产乙酸梭菌属的簇,包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌种以及相关分离株。这些包括但不限于以下菌株:自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium thatproduces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351]、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,RoweMJ,Warner IL:Novel bacteria and methods thereof.国际专利2009,WO/2009/064200]、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC 55383)[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridiumljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology GroupI.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236]、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)[Gaddy JL:Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases.美国专利1997,5,593,886]、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solventfor its extraction from the fermentation broth.美国专利2002,6,368,819]、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial processfor the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from thefermentation broth.美国专利2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11T(ATCCBAA-622)[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization ofnovel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055],相关分离株如“科斯卡塔梭菌(C.coskatii)”[Zahn et al-Novel ethanologenic speciesClostridium coskatii(美国专利申请号US20110229947)]和“梭菌属种”(Clostridium sp.)(Tyurin et al.,2012,J.Biotech Res.4:1-12),或突变菌株如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from SynthesisGas Using Clostridium ljungdahlii.PhD thesis,North Carolina State University,2010)。这些菌株形成梭菌rRNA簇I内的亚簇,并且它们的16S rRNA基因有99%以上是相同的,而具有约30%的相似的低GC含量。但是,DNA-DNA重新组合和DNA指纹实验显示,这些菌株属于不同的种[Huhnke RL,LewisRS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。
该簇的所有菌种具有相似的形态和大小(对数生长细胞为0.5-0.7×3-5μm),是嗜温的(最适生长温度为30-37℃),并且是严格厌氧菌[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species inClostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236;Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,ananaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.ArchMicrobiol 1994,4:345-351;Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation andCharacterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。此外,它们均共有相同的主要系统发育特征,如相同的pH范围(pH4-7.5,最适的初始pH为5.5-6),基于含CO的气体以相似的生长速率进行强的自养生长,以及类似的代谢谱——以乙醇与乙酸作为主要发酵终产物并且在某些条件下形成的少量2,3-丁二醇与乳酸[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236;Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium thatproduces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351;Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolationand Characterization of novelClostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。所有的三个种观察到了吲哚产生。但是,这些种在对不同糖(例如鼠李糖,阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用上是不同的。此外,发现一些种是某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型而其它种则不是。
该簇的菌株由共有的特征定义,它们有着类似的基因型和表型,并且它们均具有相同的保存能量和发酵代谢模式。该簇的菌株缺少细胞色素并通过Rnf复合体保存能量。
该簇的所有菌株的基因组大小为约4.2MBp的基因组大小(et al.,2010)和GC组成为约32%mol(Abrini et al.,1994;et al.,2010;Tanner etal.,1993)(WO 2008/028055;美国专利2011/0229947),并且具有保守的必要关键基因操纵子,所述操纵子编码Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、乙醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(et al.,2010,2011)。已发现所述负责气体摄取的Wood-Ljungdahl途径基因的结构和数目在所有种中都是一样的,尽管在核酸和氨基酸序列方面不同(et al.,2011)。
在一系列这些生物体中,已证实了羧酸还原成其相应的醇(Perez,Richter,Loftus,&Angenent,2012)。
因此,所述特征不是一种生物(如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌)所特有的,而是一氧化碳营养型的且能够合成乙醇的梭菌属的一般特征。因此,可预期本发明可用于这些菌株,尽管表现上可能会有不同。
可使用任意数量的本领域已知的用于产生重组微生物的技术由亲代一氧化碳营养型产乙酸微生物和一种或多种外源核酸制备本发明的重组一氧化碳营养型产乙酸微生物。仅举例来说,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、电融合、超声、聚乙二醇介导的转化、接合或化学感受态和天然感受态来实现。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989。
电穿孔已被描述用于若干一氧化碳营养型产乙酸菌,如杨氏梭菌(et al.,2010;Leang,Ueki,Nevin,&Lovley,2012)(PCT/NZ2011/000203;WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203;WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(Sauer,Kuhn,&Dürre,1994)或热醋穆尔氏菌(Kita et al.,2012),并且是用于很多梭菌如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein,Welker,Bennett,&Papoutsakis,1992)、解纤维梭菌(Jennert,Tardif,Young,&Young,2000)或热纤梭菌(MV Tyurin,Desai,&Lynd,2004)的标准方法。
电融合已被描述用于产乙酸梭菌菌属种(Clostridium sp.)MT351(Tyurin和Kiriukhin,2012)。
原噬菌体诱导已被描述用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及粪味梭菌(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,Development of a Genetic ModificationSystem in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants,Masters Project Western Kentucky University)。
接合已被描述为产乙酸菌艰难梭菌(Clostridium difficile)(Herbert,O’Keeffe,Purdy,Elmore,&Minton,2003)和包括丙酮丁醇梭菌(Williams,Young,&Young,1990)的许多其它梭菌的可选方法。在一个实施方案中,所述亲代菌株使用CO作为其唯一碳源和能源。
在一个实施方案中,所述亲代微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体的实施方案中,所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体的实施方案中,所述微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个具体的实施方案中,所述亲代微生物是自产乙醇梭菌,所述生物合成途径是硫胺素或泛酸盐生物合成途径,而所述亲代微生物缺乏基因thiC或者panB、panC和panD中的一种或多种。
在一个具体的实施方案中,所述重组微生物被改造为适于表达在产生维生素的维生素生物合成途径中的一种或多种酶,所述维生素是微生物生长所需的并且不是天然存在于所述亲代微生物中。
所述微生物可被改造为适于通过任意数量的重组方法表达一种或多种酶,所述方法包括,例如,引入编码不是天然存在于亲代微生物中的酶并被改造为适于表达所述酶的外源核酸。
在本文他处定义了用于本发明的重组微生物的维生素和酶。
在一个实施方案中,所述微生物包含一种或多种外源核酸,所述核酸编码在本文其它地方提及的一种或多种酶并被改造为适于表达所述酶。在一个实施方案中,所述微生物包含编码至少所述两种酶并被改造为适于表达所述酶的一种或多种外源核酸。在其它实施方案中,所述微生物包含编码3、4、5或6种所述酶并被改造为适于表达所述酶的一种或多种外源核酸。
所述微生物可包含一种或多种外源核酸。当需要用两种或多种遗传元件(如)转化亲代微生物时,它们可被包含在一种或多种外源核酸上。
在一个实施方案中,所述一种或多种外源核酸是核酸构建体或载体,在一个具体的实施方案中是质粒,其编码本文提及的一种或多种酶的任何组合。
在转化亲代微生物时,所述外源核酸可保持在染色体外或可优选地整合到所述亲代微生物的基因组中。因此,它们可以包含另外的核苷酸序列,所述另外的核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如,可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或帮助染色体外构建体的表达和复制(例如复制起点、启动子和其它调控元件或序列)。
在一个实施方案中,如前文提到的编码一种或多种酶的外源核酸还将包含启动子,其被改造为适于促进由所述外源核酸编码的一种或多种酶的表达。在一个实施方案中,所述启动子是组成型启动子,其优选地在合适的发酵条件下具有高活性。还可使用诱导型启动子。在优选的实施方案中,所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员应了解,可指导表达(优选在合适的发酵条件下高水平表达)的其它启动子可有效地作为所示例的实施方案的替代方案。
在一个实施方案中,所述外源核酸是表达质粒。
核酸
本发明还提供了用于产生本发明的重组微生物的核酸和核酸构建体。
所述核酸包含编码一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶的序列,这些序列当在微生物中表达时使得所述微生物能够产生微生物生长所需的维生素。在一个具体的实施方案中,本发明提供了编码两种或更多种酶的核酸。在一个实施方案中,本发明的核酸编码3、4、5或6种此类酶。
本发明的核酸编码维生素生物合成途径中的一种或多种酶。在一个具体的实施方案中,本发明的核酸编码硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和氰钴胺素中的一种或多种的生物合成途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中,本发明的核酸编码前文表3至10中列出的一种或多种酶。
在一个具体的实施方案中,本发明的核酸编码硫胺素生物合成途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中,所述核酸编码ThiC。
在另一个实施方案中,本发明的核酸编码泛酸盐途径中的一种或多种酶。在一个具体的实施方案中,所述核酸编码panB、panC或panD中的一种或多种或全部。
考虑到本文、GenBank和其它数据库中所含的信息以及遗传密码,技术人员会很容易地了解编码可用于本发明的酶或其功能等价变体的核酸序列。但是,仅举例来说,编码与本发明相关的酶的示例性氨基酸序列和核酸序列可从数据库如例如NCBI、KEGG和BRENDA数据库中获得。
仅举例来说,在一个实施方案中,ThiC具有SEQ ID No.3的序列,或为其功能等价变体。进一步举例来说,在一个实施方案中,panB具有YP_001309722.1(GenBank)的序列,或为其功能等价变体,panC具有YP_001309721.1(GenBank)的序列或为其功能等价变体,并且panD具有YP_001309720.1(GenBank)的序列或为其功能等价变体。
同样地,仅举例来说,在一个实施方案中,编码ThiC的核酸具有SEQ IDNo.2的序列或为其功能等价变体。进一步举例来说,在一个实施方案中,编码panB的核酸具有Cbei_2610;Gene ID:5293811的序列或为其功能等价变体,编码panC的核酸具有Cbei_2609;Gene ID:5293810的序列或为其功能等价变体,并且编码panD的核酸具有Cbei_2608;Gene ID:5293809的序列或为其功能等价变体。
在一个实施方案中,本发明的核酸还会包含启动子。在一个实施方案中,所述启动子允许在其控制下基因的组成型表达。但是,也可以采用诱导型启动子。本领域的技术人员将容易地了解本发明中使用的启动子。优选地,所述启动子可指导在适当的发酵条件下的高水平表达。在一个具体的实施方案中,使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中,使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中,使用丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个具体的实施方案中,所述启动子来自自产乙醇梭菌。
在转化亲代微生物时,本发明的核酸可保持在染色体外或者可优选地被改造为适于整合到所述微生物的基因组中。因此,本发明的核酸可以包含另外的核苷酸序列,所述另外的核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如,可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或帮助染色体外构建体的稳定表达和复制(例如复制起点、启动子和其它调控序列)。
在一个实施方案中,所述核酸是核酸构建体或载体。在一个具体的实施方案中,所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体,但是,本发明涵盖其它构建体或载体(如用于克隆的那些)。在一个具体的实施方案中,所述表达构建体或载体是质粒。
应理解,除了启动子以外,本发明的表达构建体/载体还可包含任何多种调控元件,以及需要时,可包含适于表达其它蛋白的另外基因。在一个实施方案中,所述表达构建体/载体包含一个启动子。在另一个实施方案中,所述表达构建体/载体包含两个或更多个启动子。在一个具体的实施方案中,所述表达构建体/载体包含用于每个待表达的基因的一个启动子。在一个实施方案中,所述表达构建体/载体包含一个或多个核糖体结合位点,优选用于每个待表达的基因的一个核糖体结合位点。
本领域技术人员应理解,本文描述的核酸序列和构建体/载体序列可包含标准接头核苷酸,如核糖体结合位点和/或限制性位点所需要的那些。此类接头序列不应被解释为是必需的,也不应限制所定义的序列。
本发明的核酸和核酸构建体(包括表达构建体/载体)可使用任意数量的本领域的标准技术构建。例如,可使用化学合成或重组技术。此类技术记载于例如Sambrook等(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。其他示例性技术记载于下文的“实施例”部分。实质上,所述个体基因和调控元件将被可操作地相互连接以使得可表达所述基因来形成所需的蛋白。本领域普通技术人员会了解可用于本发明的合适的载体。但是,举例来说,下述载体可能是合适的:pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750以及下文“实施例”部分所中示例的质粒。
应理解本发明的核酸可以是任何合适的形式,包括RNA、DNA或cDNA。
本发明还提供了包含任何一种或多种本文所述核酸的宿主生物,特别是微生物,包括病毒、细菌和酵母。
可将所述一种或多种外源核酸以裸核酸形式递送到亲代微生物或可将其用一种或多种可促进转化过程的试剂(例如,脂质体缀合的核酸、其中包含所述核酸的有机体)配制。合适时,所述一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。限制性抑制剂可用于某些实施方案;参见,例如Murray,N.E.et al.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412)。
可使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的技术由亲代微生物和一种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅举例来说,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声、聚乙二醇介导的转化、化学感受态或天然感受态或接合来实现。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring HarbourLabrotary Press,Cold Spring Harbour,1989。
在某些实施方案中,由于在待转化的微生物中存在具有活性的限制性系统,需要将待引入所述微生物的核酸甲基化。这可使用多种技术进行,所述技术包括下文描述的那些,其在下文“实施例”部分进一步示例说明。
举例来说,在一个实施方案中,通过包括如下步骤的方法产生本发明的重组微生物:
a.将(i)本文所述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体导入穿梭微生物;表达所述甲基转移酶基因;
b.从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体;和,
c.将所述一种或多种构建体/载体导入目标微生物。
在一个实施方案中,步骤B的甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方案中,步骤B的甲基转移酶基因的表达是诱导的。
所述穿梭微生物是可促进对构成所述表达构建体/载体的核酸序列甲基化的微生物,优选限制性酶阴性的微生物。在一个具体的实施方案中,所述穿梭微生物是限制性阴性的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
一旦所述表达构建体/载体和甲基化构建体/载体被导入所述穿梭微生物,存在于所述甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因就被诱导。可通过任何合适的启动子系统进行诱导,但在本发明的一个具体的实施方案中,所述甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子,并通过加入乳糖或其类似物,更优选异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中,所述甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
在一个具体的实施方案中,所述甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物类型特异性的复制起点,以使存在于所述甲基化构建体/载体上的任何基因均可在所述穿梭微生物中表达。优选地,所述表达构建体/载体具有对所述目标微生物类型特异性的复制起点,以使存在于所述表达构建体/载体上的任何基因均可在所述目标微生物中表达。
所述甲基转移酶的表达可导致存在于所述表达构建体/载体上的基因的甲基化。然后,可根据多种已知方法中的任一种将所述表达构建体/载体从所述穿梭微生物中分离。仅举例来说,可使用下文实施例部分描述的方法分离所述表达构建体/载体。
在一个具体的实施方案中,两种构建体/载体被同时分离。
可使用任意数量的已知方法,将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物。但是,举例来说,可使用下文实施例部分所述的方法。由于所述表达构建体/载体是甲基化的,存在于所述表达构建体/载体上的核酸序列可被纳入所述目标微生物并成功表达。
可以想到,可将甲基转移酶基因导入穿梭微生物并过表达。因此,在一个实施方案中,可使用已知方法收集所产生的甲基转移酶并在体外用于甲基化表达质粒。然后,可将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物用于表达。在另一个实施方案中,将甲基转移酶基因导入所述穿梭微生物的基因组,然后将所述表达构建体/载体导入所述穿梭微生物,从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体,然后将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物。
可以想到,可将如上文所定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体结合以提供一种目标组合物(a composition of matter)。这样的组合物在绕过限制性屏障机制以产生本发明的重组微生物方面特别有用。
在一个具体的实施方案中,所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
本领域普通技术人员会了了解可用于产生本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。但是,可使用例如枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和具有SEQ ID 14的序列的甲基转移酶或其功能等价变体。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码,应容易地了解编码合适的甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中,编码甲基转移酶的核酸为SEQ ID 15的核酸,或为其功能等价变体。
可以使用任意数量的被改造为适于表达甲基转移酶基因的构建体/载体,来产生所述甲基化构建体/载体。但是,举例来说,可使用下文实施例部分描述的质粒。
产生方法
本发明提供了通过用本发明的重组微生物对底物进行微生物发酵而产生一种或多种所需产物的方法。
适于厌氧发酵的任何底物均可用于发酵,包括例如碳水化合物、糖、含CO的底物、含二氧化碳和氢气的底物、甘油、脂肪酸、淀粉、糖蜜、戊糖和己糖、生物质。在一个实施方案中,所述底物是含CO的底物。在所述实施方案中,本发明的方法可用于减少来自工业过程的总的大气碳排放。
优选地,所述发酵包括使用本发明的重组微生物在生物反应器中发酵底物从而产生所述一种或多种产物的步骤。
在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(a)将底物提供至包含本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器;和
(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生所述一种或多种产物。
在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(a)在由工业过程产生的含CO的气体释放到大气中之前,将所述气体捕获;
(b)通过包含一种或多种本发明微生物的培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生所述一种或多种产物。
在本发明的一个实施方案中,被所述微生物发酵的气态底物是含CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程副产物获得的或从某些其它来源(如汽车废气)获得的含CO的废气。在某些实施方案中,所述工业过程选自铁金属产品制备(如钢厂)、有色金属产品制备、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制备。在这些实施方案中,可在所述含CO的气体被排放到大气中之前使用任意方便的方法从所述工业过程中将其捕获。所述CO可以是合成气(含一氧化碳和氢气的气体)的组分。从工业过程产生的CO通常被燃烧掉以产生CO2,因此本发明在减少CO2温室气体排放并产生用作生物燃料的丁醇方面尤其有用。根据所述含CO的气态底物的组成,还可能需要对其进行处理,以在将其导入所述发酵之前除去任何不合需要的杂质如尘粒。例如,可使用已知的方法过滤或洗涤所述气态底物。
应理解,为使所述细菌生长并发生底物到所述一种或多种产物的转化,除所述底物之外,需要将合适的液体营养培养基进料至所述生物反应器。所述底物和培养基可以连续、分批或分批补料方式进料至所述生物反应器。如本领域中已知的,营养培养基会包含多种足以允许所使用的微生物存活和/或生长的化合物。合适的厌氧和有氧发酵培养基是本领域中已知的。例如,Biebel(2001)记载了合适的培养基。但是,由于重组微生物能够产生维生素,因此本发明具有不必在培养基中包含一种或多种维生素的优势。因此,可使用基本培养基,从而降低成本。此外,重组微生物的生长和发酵通常涉及向培养基中加入选择化合物,通常为一种或多种抗生素,以使得正选择重组微生物,并且任何污染性微生物不存活。抗生素的使用增加了发酵成本,并且可能存在其它缺点如毒性。本发明避免了对抗生素的需要。在本发明的一个实施方案中,所述培养基如后文实施例部分中所述。
合乎需要地,所述发酵应在用于发生从所述底物到所述一种或多种产物的发酵的合适条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器的话)、接种物水平、确保底物不成为限制的最大底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。
如果使用含CO的底物,通常需要提高底物流中的CO浓度(或气态底物中的CO分压),并因此提高CO作为底物时发酵反应的效率。在增加的压力下操作可显著增加CO从气相转移到液相的速率,在液相中CO可被所述微生物作为碳源摄取用于产生所述一种或多种产物。这继而意味着,当生物反应器保持在升高的压力而非大气压力下时,可减少保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分地取决于本发明所使用的具体微生物。但是,一般来讲,优选所述发酵在高于环境压力的压力下进行。并且,因为给定的CO到所述一种或多种产物的转化率部分地是所述底物保留时间的函数,并且实现所需保留时间进而限定了生物反应器的所需体积,因此使用增压系统可大大地减小所需的生物反应器体积,从而降低所述发酵设备的资本成本。根据美国专利no.5,593,886中给出的实例,反应器体积的减小可与反应器操作压力的升高成线性比例,即,在10个大气压下操作的生物反应器只需要在1个大气压下操作的那些生物反应器体积的1/10。
举例来说,已经描述了在升高的压力下进行气体到乙醇的发酵的有益效果。例如,WO 02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行的气体到乙醇的发酵,得到的乙醇产率分别为150g/l/天和369g/l/天。但是,发现在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵产生1/20到1/10的乙醇/升/天。
还需要的是,含CO的气态底物的导入速率是这样的,即确保液相中的CO浓度不会成为限制。这是因为CO受限的条件的结果可能是产物被所述培养物消耗。
用于进料给发酵反应的气流的组成可对所述反应的效率和/或成本有显著影响。例如,O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中,对不需要的或不必要的气体的处理可增加这些阶段的负担(例如,当在气体流进入生物反应器之前将气体流压缩时,则可能使用不必要的能量来压缩发酵中不需要的气体)。因此,可能需要处理底物流(特别是来自工业来源的底物流)以除去不需要的组分并提高所需组分的浓度。
在某些实施方案中,将本发明的细菌培养物维持在水性培养基(依据本发明,其不含一种或多种维生素)中。优选地,所述水性培养基是基本微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的,并且被记载于例如美国专利no.5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438中,并且如下文实施例部分所述。
可通过本领域已知的方法如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提和萃取发酵(包括例如液-液萃取)从发酵液中回收所述一种或多种产物。
在本发明的某些优选实施方案中,可通过以下方式从所述发酵液中回收所述一种或多种产物:从所述生物反应器中连续移出部分发酵液,从所述发酵液中分离微生物细胞(方便地通过过滤),并从所述发酵液中回收一种或多种产物。醇可通过例如蒸馏方便地回收。丙酮可通过例如蒸馏回收。所产生的任何酸可通过例如吸附在活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞返回到所述发酵生物反应器中。优选地将已移除任何醇和酸之后剩余的无细胞渗透物返回至所述发酵生物反应器。
维生素可使用任何适当的方法回收。但是,举例来说,可通过浓缩并干燥细胞(例如离心或喷雾干燥)随后提取(例如在醇中使用色谱法或只是通过差速离心来纯化和过滤)并结晶来回收维生素(Survase et al.,2006,FoodTechnol.Biotechnol.44:381-96)。
在一个实施方案中,所述一种或多种产物(在一个具体的实施方案中是一种或多种维生素)是从所述发酵中回收,并传送到一个或多个其他生物反应器中以支持一种或多种第二微生物的生长,或支持一种或多种第二微生物对底物的发酵。
在一个实施方案中,所述一种或多种第二微生物是这样的微生物,即不能产生或不能以足够的水平产生所述一种或多种维生素,并需要向其生长或发酵培养基补充所述一种或多种维生素以确保或维持生长或发酵,或提高生长或发酵效率。
可使用任何合适的导管将从第一发酵中回收的所述一种或多种产物传送到一个或多个其他生物反应器。
在一个实施方案中,本发明的方法还可以包括由所述一种或多种第二微生物对底物发酵以产生一种或多种产物。在一个实施方案中,然后可从所述发酵液中回收所述一种或多种产物。
选择方法
本发明还提供了在混合的微生物群中选择微生物A的方法,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述外源核酸被改造为适于表达在产生所述混合的微生物群生长所需的一种或多种维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶。
所述方法包括使混合的微生物群经受包括缺乏微生物生长所需的所述一种或多种维生素的培养基的培养条件。不能产生所述一种或多种维生素的那些微生物将不会生长或将被负选择。
在其它实施方案中,所述一种或多种酶如前文所述。所述一种或多种维生素如前文所述。在一个具体的实施方案中,所述一种或多种维生素选自硫胺素、泛酸盐、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸和/或氰钴胺素。
“培养条件”可以是实现至少维持微生物A的培养物的任何合适的条件,并包括适于生长和/或发酵的条件。考虑到微生物的性质和本文包含的信息,技术人员将认识到合适的条件。但是,举例来说,生长条件包括合适的环境条件,包括pH、存在或不存在氧以及其它气体、盐度、温度等。
可以使用任何合适的培养基,只要其如前文所述不含微生物生长所需的所述一种或多种维生素(其可由微生物A产生)。技术人员将容易地认识到多种适当的培养基。但是,在一个实施方案中,所述培养基是基本培养基。
虽然本发明克服了对使用替代选择方法或将培养基补充如抗生素的成分的需要,但是如果需要的话,这些方法可与本发明相结合。
本发明该方面的方法可用于在产生重组微生物的过程中区分重组与非重组微生物,例如在转化过程中区分成功转化的细菌。
所述方法还可用于在实验室或商业规模的微生物培养和/或发酵反应期间负选择污染性微生物的目的。没有选择措施时,不合需要的微生物可生长至危害所需的微生物,或以其它方式影响培养或发酵反应的效率。
因此,本发明还提供了防止一种或多种不合需要的微生物在微生物培养物或发酵液中生长的方法,其中所述微生物培养物或发酵液包含微生物A和营养培养基,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物A和不合需要的微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,其中所述培养基缺乏所述一种或多种维生素。
本发明还提供了用于微生物A的选择性生长或培养的方法,并且其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,并且其中生长或培养培养基缺乏所述一种或多种维生素。
在一个实施方案中,所述条件负选择一种或多种不合需要的微生物的生长。
在另一方面,本发明提供了通过微生物A对底物进行微生物发酵而产生一种或多种产物的方法,其中微生物A是包含至少一种外源核酸的重组微生物,所述核酸被改造为适于表达在产生一种或多种微生物生长所需的维生素的一种或多种维生素生物合成途径中的一种或多种酶,以使得微生物A可产生所述一种或多种维生素,并且其中发酵在缺乏所述一种或多种维生素的生长培养基之中或之上进行。
在一个实施方案中,所述条件正选择微生物A的生长并且负选择一种或多种不合需要的微生物的生长。
应理解,本发明该方面的微生物(包括重组微生物A)可选自任何目的微生物,并且不限于厌氧菌。但是,在一个实施方案中,它们选自厌氧微生物。在一个实施方案中,它们选自一氧化碳营养型产乙酸菌。
可容易地采用前文描述的产生本发明其它方面的厌氧重组微生物的方法以及本领域中已知的方法来产生将在本发明该方面中选择的重组微生物,在必要时进行调整以适应具体的微生物。例如,如果所述微生物不是厌氧菌,则可使用有氧条件。所述亲代微生物可选自任何类的微生物,并且不限于厌氧菌。但是,在一个实施方案中,它们可选自厌氧微生物,并在一个具体的实施方案中,选自一氧化碳营养型产乙酸菌。
相似地,根据目的微生物的类型的需要,采用所调整的条件(例如,取代厌氧和有氧条件),可将本发明其它方面所述的生长和发酵方法用于本发明的该方面。
本发明还提供了根据前文所述的方法培养或生长的微生物,以及通过如前文所述的方法产生的产物。
实施例
现将参照以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
方法
杨氏梭菌、自产乙醇梭菌和拉氏梭菌的维生素生物合成途径的分析
本发明人分析了一氧化碳营养型产乙酸菌杨氏梭菌(NC_014328.1;et al.,2010,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,107:13087-13092)、自产乙醇梭菌和拉氏梭菌的基因组。据发现,由于缺乏参与由1-(5'-磷酸核糖)-5-氨基咪唑核糖核苷酸(AIR)合成4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶的硫胺素生物合成蛋白ThiC,杨氏梭菌以及自产乙醇梭菌两者都不能合成硫胺素。ThiC是已经鉴定用于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和枯草芽孢杆菌中嘧啶生物合成的唯一需要的基因产物(Begeley et al,1999,Arch Microbiol,171:293-300)。另一方面,ThiC和整个硫胺素生物合成途径也存在于拉氏梭菌和其它生物体中。在血清瓶和发酵实验中证明了杨氏梭菌和自产乙醇梭菌的硫胺素营养缺陷型,从而确认了需要将硫胺素加入发酵培养基中(见下文)。
据发现,在所有三种生物体:杨氏梭菌、自产乙醇梭菌和拉氏梭菌中,由于缺乏生物合成基因panBCD,泛酸盐/CoA生物合成途径是不完整的,所述生物合成基因编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(EC:2.1.2.11;催化5,10-亚甲基四氢叶酸和3-甲基-2-氧代丁酸转化成四氢叶酸和2-脱氢泛酸)、泛酸-β-丙氨酸连接酶(EC:6.3.2.1;催化(R)-泛酸+β-丙氨酸反应为二磷酸+泛酸)以及天冬氨酸1-脱羧酶(EC:4.1.1.11;催化L-天冬氨酸转化成β-丙氨酸)。
这个概念可扩展到梭菌属的其它种,包括不产乙酸的梭菌属种或其它产乙酸的菌种。可从公共资源如NCBI(/genome/browse/)或KEGG(genome.jp/kegg-bin/get_htext)获得基因组,然后分析编码表1-8所列的维生素生物合成蛋白的基因的存在。例如,据发现,在最近测序的另一种一氧化碳营养型产乙酸菌伍氏醋酸杆菌中,基因panCD也缺失(Poehlein et al.,2012),或者在另一梭菌属种如发酵植物多糖梭菌(C.phytofermentans)中panBCD基因缺失,而泛酸盐途径的所有其它基因均存在。
使用杨氏梭菌、自产乙醇梭菌和拉氏梭菌在不含硫胺素的培养基中的生长实验
使用得自DSMZ(德国微生物菌种保藏中心,德国布伦瑞克,Inhoffenstraβe 7 B,38124(The German Collection of Microorganisms and CellCultures,Inhoffenstraβe 7 B,38124 Braunschweig,Germany))的自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生株)以及杨氏梭菌进行实验。拉氏梭菌ATCC BAA-622来源自ATCC(美国,VA 20108,马纳萨斯的美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA 20108,USA))。
使用严格厌氧条件和技术(Hungate,1969,Methods in Microbiology,第3B卷.Academic Press,New York:117-132;Wolfe,1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)在37℃下在化学上确定成分的不含酵母提取物的PETC培养基(表9)中培养所有菌株。30psi的含一氧化碳的钢厂废气(收集自NewZealand Steel site in Glenbrook,NZ;组成:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2)作为唯一碳源和能源。
表.9:PETC培养基
减除硫胺素的沃尔夫维生素溶液 |
每升母液 |
生物素 |
2mg |
叶酸 |
2mg |
盐酸吡多辛 |
10mg |
核黄素 |
5mg |
烟酸 |
5mg |
D-(+)-泛酸钙 |
5mg |
维生素B12 |
0.1mg |
对氨基苯甲酸 |
5mg |
硫辛酸 |
5mg |
然后在从沃尔夫维生素溶液省去了硫胺素(或泛酸盐)的PETC培养基中进行生长实验。虽然拉氏梭菌能够在不存在硫胺素的情况下经多次传代培养生长,但是自产乙醇梭菌和杨氏梭菌在不存在硫胺素的情况下不能生长超过2个传代培养步骤(或者如果在接种前洗涤细胞以除去残留的硫胺素,则不能在传代培养步骤后生长),从而确认了基因组分析的结果:那些菌株是硫胺素营养缺陷型的。
对于自产乙醇梭菌DSM23693,也进行了生物反应器实验,使用了每升含有MgCl、CaCl2(0.5mM)、KCl(2mM)、H3PO4(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)的确定成分培养基,并制备所述培养基用于培养物生长。将所述培养基转移到生物反应器中并在121℃下高压灭菌45分钟。高压灭菌后,向所述培养基补加沃尔夫B族维生素溶液(见上文),并用3mM盐酸半胱氨酸(Cysteine-HCl)还原。为实现厌氧状态,通过0.2μm滤器用氮气吹扫反应器容器。含一氧化碳的钢厂废气的气流最初设定为80ml/分钟,在指数生长期中期增加到120ml/分钟,同时搅拌从250rpm增加到350rpm。将Na2S按0.25ml/小时定量加入到所述生物反应器。一旦OD600达到0.4时,将生物反应器切换到速率为1.0ml/分钟的连续模式(稀释速率0.96d-1)。使用注射泵单独地将硫胺素定量加入反应器。在第二十天与第二十六天之间,将硫胺素泵关闭六天。在此期间,停止硫胺素给料,培养物死亡,生物质和气体摄取大幅下降。重新启动硫胺素给料,恢复生长并且生物质和气体摄取恢复到与之前相同的水平(图1),证明了如血清瓶实验和基因组分析所预期的,自产乙醇梭菌是硫胺素营养缺陷型的。
硫胺素生物合成基因thiC的克隆
将拉氏梭菌的thiC基因克隆到合适的表达载体中。本发明使用了标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook et al,Molecular Cloning:A laboratoryManual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989;Ausubel等,Current protocols in molecular biology,John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。
关于拉氏梭菌和自产乙醇梭菌的基因组DNA提取,收集了100ml指数期生长的培养物(4000x g,15分钟,4℃),用磷酸钾缓冲液洗涤(10mM,pH7.5),然后重悬于1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,1mM EDTA,200mM蔗糖)中。将细胞用300μL溶菌酶(100000U)在37℃下孵育30分钟。裂解步骤之后用10%(w/v)的SDS孵育10分钟。在室温下通过加入240μL的0.5M EDTA(pH 8.0)、20μL的1M Tris-HCl(pH 7.5)和100μL的RNaseA将RNA消化。然后,加入100μl蛋白酶K(0.5U)并在37℃下进行3h的蛋白水解。最后,加入600μl高氯酸钠(5M),接着用苯酚-氯仿萃取并用异丙醇沉淀。
用从Life Technologies订购的寡核苷酸ThiC-ApaI-F(SEQ ID NO:8:GCAGGGCCCAATACGATTATCTCCTTTC)和ThiC+PurF-Rev-SbfI(SEQ IDNO:9:GCATCCTGCAGGTAAATTTTGTTCTTCATT)测定了包含thiC基因(SEQ ID NO:2)的拉氏梭菌基因组的区域(SEQ ID NO:1)以及编码酰胺磷酸核糖基转移酶(SEQ ID NO:5和7)的相邻purF基因(SEQ ID NO:4和6)和包含调控thi盒元件的启动子区域(图2)。由于自产乙醇梭菌和杨氏梭菌都包含purF基因,因此可能不需要包含PurF。
使用iProof HF DNA聚合酶(Bio-Rad)和FailSafe 2X PCR premix E缓冲液(Epicentre),在Applied Biosystems GeneAmp PCR系统9700上进行了扩增。使用以下程序扩增所述基因:98°起始变性两分钟,接着三十二个循环:变性(95℃,30s),退火(53℃,30s),以及延伸(68℃,3分钟)。在72℃下的最后五分钟延伸步骤完成了3063bp片段的扩增。
用ApaI和SbfI(New England Biolabs)将得到的PCR片段克隆到穿梭载体pMTL85246(SEQ ID NO:10)中,以产生质粒pMTL85246-thiC-purF(SEQID NO:11;图3)。载体pMTL85246是带有通过NotI和NdeI克隆进的自产乙醇梭菌磷酸转乙酰酶-乙酸激酶pta-ack操纵子启动子区域(SEQ ID NO:12)的pMTL85240的衍生物。
将DNA片段与ApaI和BSA在25℃下孵育三小时,接着加入SbfI并在37℃下再孵育三小时。在37C进行NotI和NdeI的双消化。通过在65℃下孵育二十分钟而使所有酶失活。用虾碱性磷酸酶(Fermentas)在37℃下将载体pMTL85240和pMTL85246去磷酸化一小时。所得纯化的DNA片段用T4DNA连接酶(New England Biolabs)连接。使反应物在16℃下孵育过夜,然后在65℃下孵育十分钟使酶失活。
将5μL连接混合物转化到从Coli Genetic Stock Centre(CGSC)获得的大肠杆菌JW3958-1的thiC阴性菌株的电感受态细胞中[thiC765(del)::kan(Babaet al,2006,Mol.Syst.Biol.,2:1-11)]。在LB培养基中再生30分钟后,将细胞洗涤两次,并用thiC基因作为选择标记在不含硫胺素的M9培养基(表10)中进行选择。菌落形成需要2-3天,并且所有筛选的克隆均为阳性,无任何背景生长。这在用作选择标记时是重要的,并且令人惊讶的是可通过对细胞进行特殊处理(如在再生后洗涤细胞)来实现。在大肠杆菌中使用抗生素选择标记表达植物thiC基因时,观察到显著的背景生长(Kong et al.,2008,CellResearch 18:566-576)。
使用菌落PCR(Intron iTaq PCR premix)确认了所述质粒的存在。所述PCR条件是:94℃三分钟,接下来三十二个循环:变性(94℃,30s)、退火(53℃,30s)和延伸(72℃,3分钟)。在72℃下的最后七分钟延伸步骤完成了3063bp片段的扩增。用NdeI(NEB)限制性消化,产生了两个条带(4269bp和2325bp),也由此确认了所述插入片段和质粒的存在。对所述质粒的插入片段进行了完全测序以确认序列同一性。
表10:M9基本培养基
培养基组分 |
每1.0L培养基的浓度 |
M9盐(见下文) |
200ml |
1M MgSO4 |
2ml |
20%葡萄糖 |
20ml |
1M CaCl2 |
100μl |
蒸馏水 |
补足1L |
M9盐 |
每升母液 |
Na2HPO4 |
64g |
KH2PO4 |
15g |
NaCl |
2.5g |
NH4Cl |
5g |
蒸馏水 |
补足1L |
用thiC作为自产乙醇梭菌中的选择标记
在转化到自产乙醇梭菌中之前,使用大肠杆菌菌株XL1Blue MRF’和甲基化质粒pGS20(SEQ ID NO:13)在体内将质粒DNA甲基化,所述甲基化质粒携带如WO 2012/053905中所述的诱导型lac启动子(SEQ ID NO:15)控制下的设计的甲基转移酶(SEQ ID NO:14)。用PureLinkTM HiPure质粒纯化试剂盒(Life Technologies)纯化甲基化的质粒DNA。使细胞在PET培养基(表9)中生长,其中以硫胺素加1g/L酵母提取物和5g/L果糖加钢厂气体作为碳源和能源。将50mL自产乙醇梭菌DSM23693培养物在新鲜培养基上传代培养,持续培养3天。使用这些细胞以0.05的OD600nm接种含40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基。当所述培养物的OD600nm达到0.4时,将所述细胞转移到厌氧培养室中,并在4℃下以4,700x g收集。用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠,pH7.4)将所得培养物洗涤两次,最后悬浮于600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将所得混合物转移到预冷的电穿孔杯(电极间隙为0.4em,含有1μg甲基化的质粒混合物)中,并立即用具有以下设置的Gene pulser Xcell电穿孔系统(Bio-Rad)进行冲击:2.5kV、600Ω和25μF。时间常数为3.7-4.0ms。在具有10g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)作为缓冲液的5mL PETC培养基中进行再生。
然后将细胞铺板在具有硫胺素和酵母提取物以及作为选择剂的5μg/mL克拉霉素的PETC-MES固体培养基(1.2%Bacto琼脂)上,或洗涤两次后铺板在不含酵母提取物且不含硫胺素的PETC-MES固体培养基上。在这两种情况下,在使用克拉霉素作为选择剂并用ermC作为选择标记3天后以及在不含酵母提取物和硫胺素的板上用thiC作为选择标记6天后,每个板得到了超过50个携带所述质粒的阳性菌落。
在不存在硫胺素的情况下用thiC工程改造的自产乙醇梭菌的生长
挑取单个菌落,进行生长实验以使用自产乙醇梭菌DSM23693野生型和携带质粒pMTL85246-thiC-purF的菌株比较在不含硫胺素和酵母提取物并用钢厂气体作为唯一能源和碳源的PETC培养基中的生长。虽然野生型的生长在两个传代培养步骤后(或者如果在接种前洗涤所述细胞,则在一个传代培养步骤内)停止,但携带质粒pMTL85246-thiC-purF的菌株能够持续生长多个传代培养步骤(不管细胞是否经过洗涤)(图5)。用血清瓶和50mL的体积进行三次重复实验。通过PCR检查质粒的存在。
这证明了所述生物体能够自身合成硫胺素并且thiC可在一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌中用作选择标记。
用panBCD作为选择标记
本发明人已经鉴定了自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌具有缺乏生物合成基因panBCD的不完整泛酸盐途径,所述基因编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(EC:2.1.2.11;催化5,10-亚甲基四氢叶酸和3-甲基-2-氧代丁酸转化成四氢叶酸和2-脱氢泛酸)、泛酸-β-丙氨酸连接酶(EC:6.3.2.1;催化(R)-泛酸+β-丙氨酸反应为二磷酸+泛酸)以及天冬氨酸1-脱羧酶(EC:4.1.1.11;催化L-天冬氨酸转化成β-丙氨酸)。在其它产乙酸菌如伍氏醋酸杆菌中,也发现了其基因组中不存在(Poehlein et al,2012,PLoS One 7:e33439)、基因panB和panC,而存在所述泛酸盐生物合成途径的其余部分。
与作为选择标记和选择剂的thiC和硫胺素同样的原理可适于这些生物体中的panBCD和泛酸盐。虽然就thiC而言,只需要一个基因,这里缺失了三个基因。但是,已发现在例如拜氏梭菌中所有三个基因组织成一簇(图4)。可通过PCR从拜氏梭菌的基因组DNA扩增出包含启动子区域以及基因panB(Cbei_2610;Gene ID:5293811;YP_001309722.1)、panC(Cbei_2609;Gene ID:5293810;YP_001309721.1)和panD(Cbei_2608;Gene ID:5293809;YP_001309720.1)的所述簇(NC_009617.1,3038300-3034200),并按照针对来自拉氏梭菌的thiC基因的描述将其克隆进表达载体中。然后可将所述构建体按针对thiC构建体所述的相似方式使用,其通过省去泛酸盐而不是硫胺素以在缺乏任何这些基因的生物体中表达,所述微生物为如一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、伍氏醋酸杆菌和拉氏梭菌或大肠杆菌的panBCD阴性菌株,比如大肠杆菌JW0129-1(panC750(del)::kan)、JW0130-1(panB751(del)::kan)和JW0127-2(panD748(del)::kan)(Baba et al,2006,Mol.Syst.Biol.,2:1-11),它们可从大肠杆菌遗传库存中心(Coli Genetic StockCentre(CGSC))中获得。
panBCD的克隆
使用GeneArt Seamless Cloning and Assembly试剂盒(Life Technologies)将panBCD基因克隆到表达载体中。设计了包含与所需载体同源的20bp突出端(overhang)的长PCR引物。
使用iProof高保真DNA聚合酶从拜氏梭菌PCR扩增所述panBCD序列。扩增2813bp片段的方案是:起始30s、变性10s、退火30s、延伸2分钟以及最后7分钟的延伸步骤。
使用DNA Clean and Concentrator-5(Zymo Research)纯化所得DNA。用NdeI和BamHI(Fermentas)消化携带catP抗生素抗性标记以及Ppta启动子的pMTL载体83155,并用DNA Clean and Concentrator-5(Zymo Research)纯化。将100ng消化后的载体与插入片段以2∶1的摩尔比混和,以及与5X反应缓冲液和10X酶混合物混合。将所得混合物在室温下孵育30分钟,然后立即转化到One Shot TOP10大肠杆菌感受态细胞中。取50μL转化后的大肠杆菌涂布到含有5μg/ml氯霉素的LB琼脂板上。使用iNtron Maxime PCR PreMixi-MAX II(Tech Dragon Limited)从过夜培养物中筛选出四个菌落。
引物 |
序列 |
M13F |
TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:18) |
M13R |
CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO:19) |
扩增3404bp片段的方案是:起始30s、变性10s、退火30s、延伸2分钟以及最后7分钟的延伸步骤。
通过使用NotI和EcoRV(fermentas)限制性消化以进一步检查这四个质粒。消化后的预期大小为2343bp和5383bp,未消化的质粒为7726bp。
本文已参照某些优选实施方案描述了本发明文,以使得读者无需过多实验及即可实施本发明。但是,本领域的普通技术人员应容易地认识到,可将许多组分和参数作一定程度的变化或修改或替换为已知的等价物,而不偏离本发明的范围。应理解,这样的修改和等价物如同单独提出一样被纳入本文。提供名称、标题等的目的是增强读者对本文的理解,而不应被解释为是对本发明范围的限制。
如果有的话,上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容均以引用的方式纳入本文。但是,本说明书中对任何申请、专利和出版物的引用不是也不应被理解为,承认或以任何形式暗示它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或形成公知常识的一部分。
在本说明书通篇中以及以下的任何权利要求中,除非上下文另有说明,词语“包含(comprise)”、“包括(comprising)”等应以与排除意义相反的包括意义来解释,也就是说“包含但不限于”的意思。