MXPA04012812A - Microorganismos y proceso para la produccion aumentada de pantotenato. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos mejorados para la produccion aumentada de pantoato y pantotenato utilizando microorganismos que tengan modificadas las actividades de las enzimas biosinteticas de pantotenato, y que tengan modificadas las actividades de las enzimas biosinteticas del metilentetrahidrofolato (MTF). En particular, la invencion muestra los metodos para aumentar la produccion de los productos deseados incrementando los niveles de un intermediario clave, cetopantoato, aumentando las enzimas o sustratos que contribuyen directa o indirectamente a su sintesis. Los microorganismos recombinantes y condiciones para cultivarlos tambien estan descritos. Tambien se mencionan las composiciones producidas por estos microorganismos.

Description

MICROORGANISMOS Y PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN AUMENTADA DE PANTOTENATO Solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama prioridad ante la solicitud de patente provisional US No. 60/393,826, presentada el 3 de julio de 2002, titulado "Microorganismos y procesos para la producción aumentada de pantotenato". Esta solicitud se relaciona con la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US02/00925, titulada "Microorganismos y procesos para la producción aumentada de pantotenato", presentada el 18 de enero de 2002 (pendiente) , que, a su vez, reclama el beneficio ante la Solicitud de Patente provisional antes presentada serie No. 50/347,638, titulada "Microorganismos y procesos para la producción aumentada de pantotenato", presentada el 11 de enero de 2002, (pendiente) , ante la Solicitud de Patente provisional antes presentada Serie No. 60/263,053, presentada el 19 de enero de 2002 (vencida), y ante la Solicitud de Patente provisional antes presentada Serie No. 60/262,995, presentada el 19 de enero de 2001 (vencida) . La presente invención también se relaciona con la Solicitud de Patente US Serie No. 09/667,569, presentada el 21 de septiembre de 2000, (pendiente) que es una continuación en parte de la Solicitud de Patente US serie No. 09/400,494, presentada el 21 de septiembre de 1999 (abandonada) . La Solicitud de Patente US Serie No. 09/667,569 también reclama el beneficio de la Solicitud de Patente provisional antes presentada Serie No. 60/210,072, presentada el 7 de junio de 2000 (vencida) , la Solicitud de Patente provisional Serie No. 60/221, 836, presentada el 28 de julio de 2000 (vencida) y la Solicitud de Patente provisional Serie No. 60/227,860, presentada el 24 de agosto de 2000 (vencida). Todo el contenido de cada una de las solicitudes antes mencionadas se incorpora en la presente por esta referencia.

Antecedente de la invención El pantotenato, también conocido como ácido pantoténico o vitamina B5, es un miembro del complejo B de vitaminas y es un requisito nutricional para los mamíferos, incluido el ganado y los humanos (por ejemplo de fuentes alimenticias como un suplemento vitamínico soluble en agua o como aditivo alimenticio) . En las células el pantotenato se utiliza principalmente para la biosíntesis de la coenzima A (CoA) y la proteína portadora de acilos (ACP) . Estas coenzimas funcionan en el metabolismo de las porciones acilo que forman tioésteres con el grupo sulf idrilo de la porción A' -fosfopantoteina de estas moléculas. Estas coenzimas son esenciales en todas las células, participando en más o menos 100 reacciones intermedias diferentes en el metabolismo celular.

Los medios tradicionales de la síntesis de pantotenato (en particular, el isómero bioactivo D) es una vía por síntesis química de sustancias químicas a granel, un proceso que es impedido por el excesivo costo de sustrato así como el requisito para la resolución óptica de los intermediarios racémicos. Por consiguiente, los investigadores han buscado recientemente sistemas bacterianos o microbianos que produzcan enzimas útiles en los procesos de biosíntesis del pantotenato (en vista de que las propias bacterias pueden sintetizar pantotenato) . En particular, se han evaluado procesos de bioconversión como un medio para favorecer la producción del isómero preferido del ácido pantoténico. Además, en fechas recientes se han examinado métodos de síntesis microbiana directa como medios para facilitar la producción de D-pantotenato .

Sin embargo, existe todavía una gran necesidad de procesos de producción de pantotenato mejorados, en particular, de procesos microbianos optimizados para producir mayores rendimientos del producto deseado.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a los procesos mejorados (por ejemplo las síntesis microbianas) para la producción de pantotenato. Los procesos de producción de pantotenato se han descrito en solicitudes relacionadas que caracterizan, por ejemplo, microbios manipulados para sobreexpresar las enzimas clave de la vía biosintética del pantotenato y la vía biosintética de isoleucina-valina (véase por ejemplo la Figura 1) . Se han manipulado cepas que pueden producir >50 g/L de pantotenato en procesos de fermentación normalizados (véase por ejemplo la Patente Internacional No. WO 01/21772 y la Solicitud de Patente US No. 60/262, 995). En particular, el aumento de la expresión de los genes panB, panC, panD y panEl y el aumento de la expresión de los genes ilvBNC e ilvD da origen a cepas que convierten glucosa (piruvato) en cantidades convenientes desde el punto de vista comercial del pantotenato.

Para favorecer los niveles de producción de, por ejemplo, pantotenato, ahora se han desarrollado diversos mejoramientos en los métodos antes descritos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente US Serie No. 09/667,569 describe cepas de producción que tienen enzimas pantotenato cinasa modificadas (por ejemplo, con actividad delecionada o disminuida) . En estas cepas, los niveles de pantotenato se aumentan efectivamente al disminuir la utilización de pantotenato para la síntesis de la coenzima A ("CoA") . La Solicitud de Patente US Serie No. 60/262,995 además describe cepas aumentadas para la producción de pantotenato que se han manipulado para llevar al mínimo la utilización de las diferentes enzimas biosintéticas del pantotenato y/o las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina y/o sus sustratos respectivos para producir un producto alternativo identificado como ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") .

La presente invención se refiere a los métodos para mejorar más la producción de pantotenato modulando una ruta biosintética que suministra un sustrato para la vía biosintética de pantotenato, a saber, la vía biosintética de metilentetrahidrofolato ("MTF") . En particular, se ha descubierto que al aumentar la concentraciones de MTF por modificación de la vía biosintética del MTF se obtienen mejores concentraciones del intermediario clave de la vía biosintética del pantotenato, cetopantoato . Los niveles mejorados de cetopantoato, a su vez, conducen a concentraciones muy aumentadas de la producción de pantotenato en cepas adecuadamente manipuladas . En esencia, los inventores presentes han identificado un paso limitante en la producción de los panto-compuestos (por ejemplo pantotenato) mediante cepas manipuladas para sobre expresar, por ejemplo, los genes panBr panC, panD, panEl, ilvBNC e ilvD, y describen en la presente otro medio para superar esta limitación mediante la modificación de la via biosintética de MTF.

En la presente se describen al menos tres medios efectivos para modificar la via biosintética del MTF. En un aspecto, se ha demostrado que al aumentar la concentración de serina en el medio de cultivo de los microorganismos productores de pantotenato se obtiene una producción aumentada de los panto-compuestos . También se ha demostrado que al aumentar la síntesis o actividad de la 3-fosfoglicerato de deshidrogenasa (el producto del gen serA) , o la síntesis o la actividad de la serina hidroximetil transferasa (el producto del gen glyA) , mejorando con ello la biosíntesis de serina y metilentetrahidrofolato en microorganismos adecuadamente manipulados, se incrementa la producción de los pantocompuestos . La síntesis aumentada de la 3-fosfoglicerato des idrogenasa (el producto del gen serA) se logra, por ejemplo, mediante la sobreexpresión de serA a partir de un cásete de expresión adecuadamente manipulado. La síntesis aumentada de serina hidroximetil transferasa (el producto del gen glyA) se lograr por ejemplo, mediante la sobre expresión de glyA a partir de un cásete de expresión adecuadamente manipulado. De otro modo, se incrementan las concentraciones de serina hidroximetil transferasa (el producto del gen glyA) alterando la regulación del gen glyA. Por ejemplo, la mutación o deleción del gen que codifica un regulador negativo (es decir, represor) de la expresión de glyA, el gen purR, aumenta efectivamente la expresión de glyA. Otros métodos convenientes para aumentar las concentraciones de MTF en los microorganismos productores de los pantocompuestos consiste en desregular las enzimas responsables de convertir glicina a MTF (por ejemplo las enzimas de la disociación o clivaje de glicina) .

Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a los procesos para la producción aumentada de pantoato y pantotenato que incluyen cultivar microorganismos que tengan aumentadas las actividades de la enzima biosintética del pantotenato y que tengan modificadas las actividades de la enzima biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) en condiciones tales que se aumente la producción de pantotenato. En otro aspecto, la invención se refiere a los procesos para la producción aumentada de pantoato y pantotenato que consisten en cultivar microorganismos que tengan modificadas las actividades de la enzima biosintética del pantotenato, que tengan modificadas las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (iiv) y que tengan modificadas las actividades de la enzima biosintética del metilentetrahidrofolato (MTF) en condiciones tales que se aumente la producción de pantotenato. En particular, la invención se refiere a los métodos para mejorar la producción de los productos deseados (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) aumentando las concentraciones de un intermediario clave, el cetopantoato, mediante enzimas que contribuyan a su síntesis. Los métodos preferidos dan origen a la producción de pantotenato en concentraciones mayores de 50, 60, 70 ó más g/L después de 36 horas de cultivar los microorganismos, o tales que se produzcan al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 ó más g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar los microorganismos. También se mencionan los microorganismos recombinantes y las condiciones para cultivarlos. También se refiere a las composiciones producidas por estos microorganismos.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es una representación esquemática de las vías biosintéticas de pantotenato e isoleucina-valina (ilv) . Las enzimas biosintéticas de pantotenato se representan en negritas y sus genes correspondientes se indican en itálicas. Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) están representadas en negritas itálicas y sus genes correspondientes están indicados en itálicas .

La Figura 2 es una representación esquemática de la vías biosintética de metilentetrahidrofolato ("MTF") en E. coli (y tal vez en B. subtilis) .

La Figura 3 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pAN665 La Figura 4 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pi¾N670.

La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido p¾N004.

La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido pAN396.

La Figura 7 es una representación esquemática del plásmido pAN393.

La Figura 8 es una representación esquemática de la estructura de pAN835F, un clon del gen purR de B. subtilis.

La Figura 9 es una representación esquemática de la estructura de pAN838F, un plásmido diseñado para instalar una disrupción del gen purR de B. subtilis.

La Figura 10 es una representación esquemática de la estructura de pAN821, un plásmido diseñado para delecionar una parte del gen serA, seleccionando para resistencia a canamicina.

La Figura 11 es una representación esquemática de la estructura de pAN824, un plásmido diseñado para integrar un cásete ??ß serA que no puede ser amplificado en el locus serA, seleccionando para Ser+.

La Figura 12 es una representación esquemática de la estructura de pAN395, un plásmido con un número de copias mediano diseñado para integrar y amplifica un c sete de expresión P26 serA en el locus serA. Descripción detallada de la invención La presente invención se dirige a los métodos mejorados para producir panto-compuestos (por ejemplo quetopantoato, pantoato y/o pantotenato) y las cepas manipuladas para utilizarlas en estos métodos mejorados. Las cepas que pueden producir >50 g/L de pantotenato pueden construirse como se enseña en la Solicitud de Patente Internacional Serie No. O 02/21772 y en la Solicitud de Patente US Serie No. 60/252,995. Al aumentar la expresión de los genes panB, panCf panD y panEl y al aumentar la expresión de los genes ilvBNC e ilvD, es posible diseñar cepas (por ejemplo cepas de Bacillus) que conviertan la glucosa (piruvato) en cantidades de pantotenato atractivas desde el punto de vista comercial.

No obstante, se ha descubierto que en las cepas manipuladas para expresar elevadas concentraciones del producto del gen panBr quetopantoato hidroximetiltransferasa (por ejemplo PA824, descritas en la Solicitud de Patente Serie No. 09/667,569 y PA668-24, descritas en la Solicitud de Patente US Serie No. 60/262,995) un paso limitante para aumentar más la producción de pantotenato todavía es la conversión de a-cetoisovalerato (oc-KIV) a cetopantoato . Los métodos para aumentar la síntesis de oc-KIV fueron descritos antes en la Solicitud de Patente Internacional Serie No. WO 01/21772 y la Solicitud de Patente US Serie No. 60/262,995. En este caso describimos que es posible obtener aún más aumentos en la producción de pantotenato manipulando microorganismos productores de los panto-compuestos de modo que se mejore o aumente la concentración de MTF, o la velocidad de síntesis de MTF.

Por consiguiente, la presente invención caracteriza los métodos para mejorar la producción de panto-compuestos que consiste en modular la vía biosintética de metilentetrahidrofolato ("MTF") . En particular, el aumento de las concentraciones de MTF en los microbios productores de panto-compuestos es un medio efectivo para mejorar la producción de cetopantoato, y a su vez da origen a la mejor producción de pantoato y/o pantotenato en los microorganismos recombinantes adecuadamente manipulados .

La cetopantoato hidroximetilentransferasa cataliza la producción de cetopantoato a partir de cc-cetoisovalerato C" -KIV") y MTF (véase por ejemplo la Figura 1) . En particular, la enzima cataliza la transferencia del grupo hidroximetilo desde MTF hasta a-KIV para producir cetopantoato. El oc-KIV y el MTF son sustratos para esta reacción, y sus síntesis pueden aumentarse para mejorar la producción de cetopantoato. La via para la biosíntesis de MTF en E. coli (y también en Bacillus subtilis) se muestra en la Figura 2. El MTF se sintetiza a partir de tetrahidrofolato y serina en una reacción catalizada por el gen glyA que codifica serina hidroximetiltransferasa . Para la síntesis aumentada de MTF las células necesitan cantidades aumentadas de ambos sustratos y el producto del gen glyA.

En una modalidad, la invención caracteriza procesos para la producción aumentada de pantotenato que consisten en cultivar un microorganismo que tenga: (i) una vía biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo que tenga una, dos, tres o cuatro enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas) y (ii) una vía biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada (por ejemplo, que tenga al menos una o dos enzimas biosintéticas del MTF desregulada) , en condiciones tales que se aumente la producción de pantotenato. Las enzimas biosintéticas de pantotenato ejemplares incluyen cetopantoato hidroximetiltransferasa, cetopantoato reductasa, pantotenato sintetasa y aspartato- -descarboxilasa . Las enzimas biosintéticas de MTF ejemplares incluyen el producto del gen serA y el producto del gen glyA.

En otra modalidad, la invención caracteriza procesos para la producción aumentada de pantotenato que consisten en cultivar un microorganismo que tenga: (i) una vía biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo que tenga una, dos, tres o cuatro enzimas biosintéticas de pantotenato desreguladas) , (ii) una via biosintética de isoleucina-valina {ilv)) desregulada (por ejemplo, que tenga una o dos enzimas biosintéticas de ilv desregulada) , (iii) una via biosintética de MTF desregulada (por ejemplo que tenga al menos una o dos enzimas biosintéticas de MTF desregulada) , en las condiciones tales que se aumente la producción de pantotenato. Las enzimas biosintéticas de ilv ejemplares incluyen acetohidroxiácido sintetasa, aceto idroxiácido isomeroreductasa y dihidroxiácido des idratasa .

En otra modalidad, la invención muestra los procesos para la producción de pantotenato que incluye cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada, una via biosintética de ilv desregulada y una via biosintética de MTF desregulada, de modo que al menos se produzcan 50 g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar el microorganismo, de preferencia de modo que se produzca al menos 60 g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar el microorganismo, con mayor preferencia de modo que al menos 70 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo, y con mayor preferencia de modo que al menos 80 g/L de pantotenato, al menos 90 g/L de pantotenato, al menos 100 g/L de pantotenato, al menos de 110 g/L de pantotenato o al menos 120 g/L de pantotenato (o más) se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo.

En otra modalidad, la invención muestra los procesos para la producción de pantotenato que incluyen cultivar un microorganismo que tenga una vía biosintética de pantotenato desregulada, una via biosintética de ilv desregulada y una via biosintética de MTF desregulada, desreguladas de modo que se produzca al menos 70 g/L de pantotenato después de 48 horas de cultivar el microorganismo, de preferencia de modo que al menos 80 g/L de pantotenato se produzcan después de 48 horas de cultivar el microorganismo, y más preferentemente de modo que al menos 90 g/L de pantotenato se produzcan después de 48 horas de cultivar el microorganismo.

En una modalidad ejemplar, la desregulación de la via biosintética de MTF se logra desregulando el producto del gen serA en una cepa productora de panto-compuestos, por ejemplo expresando el gen serA constitutivamente o introduciendo un alelo resistente a la realimentación de serA. En otra modalidad ejemplar, la desregulación de la via biosintética del MTF se logra desregulando el producto del gen glyA en una cepa productora de pantocompuestos, por ejemplo sobreexpresando el gen glyA o modulando la represión del gen glyA mutando o rompiendo el producto del gen purR. En otras modalidades ejemplares, la biosintesis de MTF se modula aumentando serina en el medio de cultivo o desregulando las enzimas para el clivaje de glicina.

La invención además presenta los métodos como ya se describió, en donde la producción de pantotenato se mejora más regulando la actividad de la pantotenato cinasa (por ejemplo en donde se disminuye la actividad de la pantotenato cinasa) . En una modalidad se realiza la deleción de CoaA y se efectúa regulación descendente de CoaX. En otra modalidad, se realiza la deleción de CoaX y se realiza la regulación descendente de CoaA. En todavía otra modalidad, se realiza la regulación descendente de CoaX y de CoaA. La invención además presenta los métodos como ya se describió, en donde los microorganismos se cultivan en condiciones de exceso de serina. La invención presenta además los métodos como ya se describió, en donde los microorganismos tienen desregulada la vía biosintética del pantotenato de modo que la producción de pantotenato sea independiente de la alimentación de ß-alanina .

También se presentan los productos sintetizados de acuerdo con los procesos de la invención, al igual que las composiciones que contienen el pantotenato producido de acuerdo con los procesados. También se mencionan los microorganismos recombinantes que se utilizan en los procesos de la invención. En una modalidad, la invención presenta un microorganismo recombinante para la producción aumentada de pantotenato el cual tiene una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de MTF desregulada. En otra modalidad, la invención presenta un microorganismo recombinante para la producción aumentada de pantotenato, el cual tiene la via biosintética de pantotenato desregulada, una vía biosintética de MTF desregulada y una vía de ilv desregulada. Los microorganismos además pueden tener reducida la actividad de la pantotenato cinasa. Los microorganismos preferidos pertenecen al género Bacíllusr por ejemplo Bacíllus subtilis .

Como ya se mencionó, algunos aspectos de la invención presentan los procesos para la producción aumentada de los pantocompuestos (pantoato y/o pantotenato) que consisten en cultivar microorganismos que tengan al menos una via biosintética de pantotenato desregulada. El término "via biosintética de pantotenato" incluye la via biosintética con las enzimas biosintéticas de pantotenato (por ejemplo los polipéptidos codificados por los genes que codifican la enzima biosintética) , los compuestos (por ejemplo los sustratos, intermediarios o productos), los cofactores y similares que se utilizan en la formación o síntesis de pantotenato. El término " ía biosintética de pantotenato" incluye la vía biosintética que da origen a la síntesis de pantotenato en los microorganismos (por ejemplo in vivo) así como la vía biosintética que da origen a la síntesis de pantotenato in vitro.

Cuando se utiliza en la presente, un microorganismo "que tiene una vía biosintética de pantotenato "desregulada" incluye un microorganismo que tiene al menos una enzima biosintética de pantotenato desregulanda (por ejemplo sobreexpresada) (ambos términos como se definen en la presente) de modo que se aumente la producción de pantotenato (por ejemplo en comparación con la producción de pantotenato en el microorganismo antes de la desregulación de la enzima biosintética o en comparación con un microorganismo tipo nativo) . El término "pantotenato" incluye la forma ácida libre de pantotenato, también conocida como "ácido pantoténico", asi como cualquier sal de este (por ejemplo obtenida sustituyendo el hidrógeno ácido de pantotenato o ácido pantoténico con un catión, por ejemplo calcio, sodio, potasio, amonio, magnesio) , también conocida como "sal pantotenato". El término "pantotenato" también incluye los derivados alcohol de pantotenato. Las sales pantotenato preferidas son pantotenato de calcio o pantotenato de sodio. Un derivado alcohol preferido es pantotenol. Las sales y/o alcoholes de pantotenato de la presente invención incluyen las sales y/o alcoholes que se preparan por los métodos tradicionales a partir de los ácidos libres descritos en la presente. En otra modalidad, una sal de pantotenato se sintetiza directamente por un microorganismo de la presente invención. La sal de pantotenato de la presente invención del mismo modo puede convertirse en una forma ácida libre de pantotenato o ácido pantoténico por los métodos tradicionales. El término "pantotenato" también se abrevia como "pan" en la presente.

De preferencia, un microorganismo "que tenga una vía biosintética de pantotenato desregulada" incluye un microorganismo que tenga al menos una enzima biosintética del pantotenato desregulada (por ejemplo sobreexpresada) de modo que la producción de pantotenato sea de 1 g/L o mayor. Con mayor preferencia, un microorganismo "que tanga una via biosintética de pantotenato desregulada" incluye un microorganismo que tenga al menos una enzima biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo sobreexpresada) de modo que la producción de pantotenato sea 2 g/L o mayor. Incluso más preferentemente, un microorganismo "que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada" incluye un microorganismo que tenga al menos una enzima biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo sobre expresada) de modo que la producción de pantotenato sea 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L o mayor.

El término "enzima biosintética del pantotenato" incluye cualquier enzima que se utilice en la formación de un compuesto (por ejemplo intermediario o producto) de la via biosintética del pantotenato. Por ejemplo, la síntesis de pantoato a partir de cc-cetoisovalerato (oc-KIV) procede a través del intermediario cetopantoato . La formación de cetopantoatos cataliza por la enzima biosintética de pantotenato panB o cetopantoato hidroximetiltransferasa (el producto del panB) . La formación de pantoato se cataliza por la enzima biosintética del pantotenato panEl o cetopantoato reductasa (el producto del panEl) . La síntesis de ß-alanina a partir de aspartato se cataliza por la enzima biosintética del pantotenato PanD o la aspartato-a-descarboxilasa (el producto del gen panD) . La formación de pantotenato a partir de pantoato y ß-alanina (por ejemplo la condensación) se cataliza por la enzima biosintética del pantotenato panC o la pantotenato cintetasa (el producto del gen panC) . Las enzimas biosintéticas del pantotenato también realizan otra función como enzimas en al vía biosintética de HMBPA descrita en la presente.

Por consiguiente, en una modalidades, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluye cultivar un microorganismo que tenga al menos una enzima biosintética de pantotenato desregulada (por ejemplo desregulada de modo que se aumente la producción de pantotenato) , siendo la enzima seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en panB (o cetopantoato hidroximetiltransferasa) , panC (o pantotenato sintetasa) , panD (o aspartato-a-descarboxilasa, panEl (o cetopantoato reductasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluyen cultivar un microorganismo que tenga al menos dos enzimas biosintéticas del pantotenato desregulada, las enzimas siendo seleccionadas por, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en panB (o cetopantoato hidroximetiltransferasa) , panC (o pantotenato sintetasa) , panD (o aspartato-a-descarboxilasa, panEl (o cetopantoato reductasa. En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluyen cultivar un microorganismo que tenga al menos tres enzimas biosintéticas del pantotenato desreguladas, las enzimas siendo seleccionadas, por ejemplo, del grupo que consiste en panB (o cetopantoato hidroximetiltransferasa) , panC (o pantotenato sintetasa) , panD (o aspartato-a-descarboxilasa, panEl (o cetopantoato reductasa. En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluyen cultivar un microorganismo que tenga al menos cuatro enzimas biosintéticas del pantotenato desreguladas, por ejemplo, un microorganismo que tenga desregulada panB (o cetopantoato hidroximetiltransferasa) , panC (o pantotenato sintetasa) , panD (o aspartato-a-descarboxilasa, panEl (o cetopantoato reductasa .

En otro aspecto, la invención presenta los procesos para la producción aumentada de pantotenato que incluyen cultivar microorganismos que tengan una vía biosintética de isoleucina-valina desregulada. El término "vía biosintética de isoleucina-valina" incluye la vía biosintética que involucra las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (por ejemplo los polipéptidos codificados por los genes que codifican la enzima biosintética) , los compuestos (por ejemplo, sustratos, intermediarios o productos), cofactores o similares que se utilicen en la formación o síntesis de la conversión del piruvato a valina o isoleucina. El término "vía biosintética isoleucina-valina" incluyen la vía biosintética que da origen a la síntesis de valina o isoleucina en los microorganismos (por ejemplo in vivo) así como la vía biosintética que da origen a la síntesis de valina o isoleucina in vitro.

Cuando se utiliza en la presente, un microorganismo "que tiene una vía isoleucina-valina (ilv) desregulada" incluye un microorganismo que tiene al menos una enzima biosintética de isoleucina-valina ( lv) desregulada (por ejemplo sobreexpresada) (ambos términos como se define en la presente) de modo que se aumente la producción de isoleucina y/o valina y/o el precursor de valina, el oc-cetoisovalerato (cc-KIV) (por ejemplo en comparación con la producción de isoleucina y/o valina y/o -KIV en el microorganismo antes de la desregulación de la enzima biosintética o en comparación con un microorganismo tipo nativo) . La figura 1 incluye una representación esquemática de la via biosintética de isoleucina-valina . Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina están representadas en negritas itálicas y sus genes correspondientes están indicados en itálicas. El término "enzima biosintética de isoleucina-valina" incluye cualquier enzima que se utilice en la formación de un compuesto (intermediario o producto) de la via biosintética de isoleucina-valina. De acuerdo con la figura 1, la síntesis de valina a partir de piruvato procede a través de los intermediarios acetolactato [sic], a, ß-dihidroxiisovalerato (a,ß-DHIV) y a-cetoisovalerato (a-KIV) . La formación de acetolacetato [sic] a partir de piruvato se cataliza por la enzima biosintética de isoleucina-valina acetohidroxiácidos sintetasa (los productos del gen ilvBN, o de otro modo, el producto del gen alsS) . La formación de a, ß-DHIV a partir de acetolactato [sic] se cataliza por la enzima biosintética de isoleucina-valina acetohidroxiácido isómero reductasa (el producto del gen ilvC) . La síntesis de ot-KIV a partir de a,ß-THIV se cataliza por la enzima biosintética de isoleucina-valina la dihidroxiácido deshidratasa (el producto del gen ilvD) . Además, la valina e isoleucina pueden ser interconvertidas en sus compuestos -ceto respectivos por aminoácido transaminasas de cadena ramificada. Las enzimas biosintéticas de isoleucina-valina también pueden realizar una función alternativa como enzimas en la vía biosintética de HMBPA descrita en la presente.

Por consiguiente, en una modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluye cultivar un microorganismo que tenga al menos una enzima biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada (por ejemplo desregulada de modo que se aumente la producción de valina y/o isoleucina y/o ot-KIV) , siendo la enzima seleccionada, por ejemplo, del grupo que en IlvBN, AlsS (o acetohidroxiácido sintetasa) , IlvC, (o acetohidroxiácido isómero reductasa) y I1VD (o dihidroxiácido deshidratasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluye cultivar un microorganismo que tanga al menos dos enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas, siendo la enzima seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en IlvBN, AlsS (o acetohidroxiácido sintetasa) , IlvC, (o acetohidroxiácido isómero reductasa) y I1VD (o dihidroxiácido deshidratasa) . En otra modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de pantotenato que incluye cultivar un microorganismo que tenga al menos tres enzimas biosintéticas de isoleucina-valina {ilv) desreguladas, por ejemplo, el microorganismo que tenga desreguladas IlvBN, AlsS (o acetohidroxiácido sintetasa) , IlvC, (o acetohidroxiácido isómero reductasa) y I1VD (o dihidroxiácido deshidratasa) .

Como se menciona en la presente, se ha descubierto que las enzimas de la vía biosintética de pantotenato y/o la vía de isoleucina-valina (ilv) tienen otra actividad en la síntesis del ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") o la vía biosintética del ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metíl-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") . El término "vía biosintética del ácido [R] -3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico" ("HMBPA") incluyen la vía biosintética alternativa que incluye las enzimas biosintéticas y los compuestos (por ejemplo sustratos y similares) comúnmente asociados con la vía biosintética del pantotenato y/o la vía biosintética de isoleucina-valina (ilv) que se utilizan en la formación o síntesis de HMBPA. El término "vía biosintética del HMBPA" incluye la vía biosintética que da origen a la síntesis de HMBPA en los microorganismos (por ejemplo in vivo) así como la vía biosintética que conduce a la síntesis de HMBPA in vi tro.

El término venzima biosintética del HMBPA" incluye cualquier enzima que se utilice en la formación de un compuesto (por ejemplo intermediario o producto) de la vía biosintética del HMBPA. Por ejemplo, la síntesis del ácido 2-hidroxiisovalérico (a-HIV) a partir de ceto isovalerato (ot-KIV) se cataliza por el producto del gen panEl o panE2 {panEl se menciona en la presente también como cetopantoato reductasa y/o se cataliza por el producto del gen ilvC (de otro modo mencionado en la presente como acetohidroxiácido isómero reductasa) . La formación de HMBPA a partir de ß-alanina y a-HIV se cataliza por el producto del gen panC (mencionado de otro modo en la presente como pantotenato sintetasa) .

El término ácido " [R] -3- (2- idroxi~3-metil-butirilamino) -propiónico ("HMBPA") " incluye la forma ácido libre del HMBPA, también mencionado como "[R]-3-(2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propionato ("HMBPA")" asi como la sal de este. Por ejemplo obtenida por sustitución del hidrógeno ácido del ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico o el 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propionato con un catión, por ejemplo calcio, sodio, potasio, amonio, magnesio) , también mencionado como una "sal del ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propionato" o sal del HMBPA. Las sales de HMBPA preferidas son HMBPA de calcio o HMBPA de sodio. Las sales de HMBPA de la presente invención incluyen sales preparadas por los métodos tradicionales a partir de los ácidos libres en la presente descritos.

Una sal de HMBPA de la presente invención del mismo modo puede convertirse en una forma ácido libre del ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propiónico o un 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) -propionato por los métodos habituales.

En las modalidades preferidas, la invención presenta los procesos para la producción aumentada de panto-compuestos (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) que incluye cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada. El término "vía biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) se refiere a la vía biosintética que incluye las enzimas biosintéticas del MTF (por ejemplo los polipéptidos codificados por los genes que codifican las enzimas biosintéticas) , compuestos (por ejemplo sustratos, intermediarios o productos), cofactores y similares que se utilizan en la formación o síntesis del sustrato de PanB, el MTF. El término "vía biosintética" del metilentetrahidrofolato (MTF) se refiere a la vía biosintética que conduce a la síntesis del MTF in vivo (por ejemplo la vía en E. coli, como se representa en la Figura 2), así como la vía biosintética que da origen a la síntesis de MTF in vi tro. El término "enzima biosintética del metilentetrahidrofolato (MTF) incluye cualquier enzima que se utiliza en la formación de un compuesto (intermediario o producto) de la vía biosintética del metilentetrahidrofolato (MTF) .

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento que la desregulación de algunas enzimas biosintéticas del MTF conduce a la producción aumentada de MTF. Una enzima biosintética del MTF, la desregulación de la cual da origen a la producción aumentada del MTF, se denomina una "enzima mejoradora de la biosintesis el MTF". Las "enzimas mejoradoras de la biosintesis del MTF" ejemplares son el producto del gen serA (3-fosfoglicerato deshidrogenasa) y el producto del gen glyA (serina hidroximetiltransferasa) . Un microorganismo "que tenga una vía biosintética del metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada "es un microorganismo que tiene desregulada (por ejemplo sobreexpresada) al menos una enzima aumentada de la biosintesis del MTF de modo que se aumente la producción o biosintesis del MTF (por ejemplo en comparación con la producción de MTF en el microorganismo antes de la desregulación de la enzima biosintética o en comparación con un microorganismo tipo nativo) .

En una modalidad, la invención presenta un proceso para la producción aumentada de los panto-compuestos (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) que consiste en cultivar un microorganismo que tenga una "vía biosintética" del metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada, como se define en la presente. En otra modalidad, la invención caracteriza un proceso para la producción aumentada de los panto-compuestos (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) que incluye cultivar un microorganismo que tenga una enzima mejoradora de la biosíntesis de MTF desregulada. En las modalidades preferidas, la invención presenta los procesos para la producción aumentada de los panto-compuestos (pantoato y/o pantotenato) que incluye cultivar un microorganismo que tenga un producto del gen glyA que es regulado (serina hidroximetiltransferasa) y/o un producto de gen sexA desregulado (3-fosfoglicerato deshidrogenasa) .

Todavía otro aspecto de la presente invención presenta los procesos para la producción aumentada de pantotenato que incluyen cultivar microorganismos en condiciones de cultivo seleccionadas para favorecer la producción de pantotenato, por ejemplo cultivando microorganismos con serina en exceso (un sustrato de glyA) en el medio. El término wserina en exceso" incluye concentraciones de serina aumentadas o mayores que las normalmente utilizadas para cultivar el microorganismo pertinente. Por ejemplo, el cultivo de microorganismos Bacillus descritos en los ejemplos de la presente se hace comúnmente en presencia de aproximadamente 0-2.5 g/L de serina. Por consiguiente, las concentraciones de serina en exceso pueden incluir concentraciones mayores de 2.5 g/L de serina, por ejemplo, entre aproximadamente 2.5 y 10 g/L de serina. Las concentraciones de serina en exceso pueden incluir concentraciones mayores de 5 g/L de serina, por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 10 g/L de serina.

Todavía otro aspecto de la presente invención presenta el cultivo de los microorganismos descritos en la presente en las condiciones tales que la producción de pantotenato aumente más, por ejemplo aumentado los precursores y/o intermediarios de la vía biosintética de pantotenato y/o isoleucina-valina (ilv) como se define en la presente (por ejemplo cultivando microorganismos en presencia de ß-alanina, valina y/o oc-KIV en exceso) o, de otro modo, modificando más los microorganismos de modo que sean capaces de producir concentraciones significativas de ß-alanina en ausencia de alimentación de ß-alanina (es decir, microorganismos independientes de ß-alanina, como se describe en la Solicitud de Patente US Serie No. 09/667, 569) .

Todavía otro aspecto de la invención presenta regular más la actividad de la pantotenato cinasa en las cepas productoras de pantotenato de modo que se aumente la producción de pantotenato. La pantotenato cinasa es una enzima clave que cataliza la formación de la coenzima A (CoA) a partir de pantotenato (por ejemplo véase la Solicitud de la Patente US Serie No. 09/09/667,569). La regulación de pantotenato cinasa (por ejemplo la disminución de la actividad o concentración de la pantotenato cinasa) reduce la producción de CoA, favoreciendo la acumulación de pantotenato. En una modalidad, la actividad de pantotenato cinasa se disminuye delecionando CoaA y realizando la regulación descendente de la actividad de CoaX (Coaa y CoaX ambas son capaces de catalizar el primer paso de la biosintesis de CoA en algunos microorganismos) en otra modalidad, la actividad de la pantotenato cinasa se disminuye delecionando CoaX y realizando la regulación descendente de CoaA. En todavía otra modalidad, la actividad de la pantotenato cinasa se disminuye realizando la regulación descendente de las actividades de CoaA y CoaX.

Algunos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones .

I. Genes diana que codifican diversas enzimas biosintéticas de pantotenato y/o isoleucina-valina (ilv) y/o metílentetrahidrofolato (MTF) En una modalidad, la presente invención muestra la modificación o aumento de la concentración de algunas enzimas biosintéticas de las vías biosintéticas de pantotenato y/o isoleucina-valina {ilv) y/o metilentetrahidrofolato (MTF) . En particular, la invención presenta la modificación de algunas actividades enzimáticas asociadas con las vías modificando o alterando los genes que codifican las enzimas biosintéticas .

El término gen" cuando se utiliza en la presente, incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo una molécula de DNA o un segmento de esta) que, en un organismo, puede ser separado de otro gen u otros genes, mediante el DNA intergénico (es decir, el DNA intervinente o separador que flanquea naturalmente el gen y/o separa los genes en el DNA cromosomal del organismo) . De otro modo, un gen puede traslapar ligeramente otro gen (por ejemplo el extremo 3' del primer gen traslapando el extremo 5' de un segundo gen) , los genes traslapantes separados de otros genes por el DNA intergénico. Un gen puede dirigir la síntesis de una enzima u otra molécula proteína (por ejemplo puede contener secuencias codificantes, por ejemplo, un marco de lectura abierto (ORF) adyacente que codifique una proteína) o puede por sí mismo ser funcional en el organismo. Un gen en un organismo puede estar agrupado en un operón, como se define en la presente, estando el operón separado de otros genes y/o operones por el DNA intergénico. Un "gen aislado", cuando se utiliza en la presente, incluye un gen que esta prácticamente libre de las secuencias que flanquean naturalmente el gen en el DNA cromosomal del organismo desde el cual se deriva el gen (es decir, esta libre de secuencia codificantes adyacentes que codifican una segunda proteina o proteina distinta, secuencias estructurales adyacentes o similares) y como una opción incluye secuencias reguladoras 5' y 3', por ejemplo las secuencias promotoras y/o secuencias terminadoras . En una modalidad, un gen aislado incluye principalmente secuencias codificantes para una proteina (por ejemplo secuencias que codifican las proteínas de Bacillus) . En otra modalidad, un gen aislado incluye secuencias codificantes para una proteína (por ejemplo para una proteína de Bacillus) y secuencias reguladoras 5' y/o 3' adyacentes a partir del DNA cromosomal del organismo desde el cual se obtiene el gen (por ejemplo las secuencias reguladoras 5' y/o 3' adyacentes de Bacillus) . De preferencia, un gen aislado contiene menos de aproximadamente 10 Kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 pb, 25 pb ó 10 pb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente el gen en el DNA cromosomal del organismo a partir del cual se obtiene el gen .

El término "operón" incluye al menos dos genes contiguos u ORF, como una opción traslapando en la secuencia en el extremo 5' ó 3' de al menos un gen ORF. El término "operón" incluye una unidad coordinada de la expresión génica que contiene un promotor y tal vez un elemento regulador asociado con uno o más genes adyacentes u ORF (por ejemplo las enzimas que codifican genes estructurales, por ejemplo, las enzimas biosintéticas) . La expresión de los genes (por ejemplo los genes estructurales) puede regularse en forma coordinada, por ejemplo mediante la unión de las proteínas reguladoras al elemento regulador o por antiterminación de la transcripción. Los genes de un operón (por ejemplo los genes estructurales) pueden ser transcritos para obtener un solo mRNA que codifique todo de las proteínas.

Un "gen que tenga una mutación" o "gen mutante" cuando se utiliza en la presente, incluye un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye al menos una alteración (por ejemplo sustitución, inserción, deleción) de modo que el polipéptido o proteína codificada por el mutante muestre una actividad que difiera del polipéptido o proteína codificado la molécula de ácido nucleico o gen tipo nativo. En una modalidad, un gen que tenga una mutación o gen mutante codifica un polipéptido o proteina que tiene una actividad aumentada en comparación con el polipéptido o proteina codificados por el gen tipo nativo, por ejemplo, cuando se ensaya en condiciones semejantes (por ejemplo se ensaya en microorganismos cultivados a la misma temperatura) . Cuando se utiliza en la presente, una "actividad aumentada" o "actividad enzimática aumentada" es aquella que es al menos 5% mayor que la del polipéptido o proteina codificados por la molécula de ácido nucleico o gen tipo nativo, de preferencia al menos 5-10% mayor, con mayor preferencia al menos 10-25% mayor e incluso con mayor preferencia al menos 25-50%, 50-75 ó 75-100% mayor que la del polipéptido o proteina codificados por la molécula de ácido nucleico o gen tipo nativo. Los intervalos intermedios de los valores antes mencionados, por ejemplo, 75-85%, 85-90, 90-95%, también se proponen para estar comprendidos por la presente invención. Cuando se utiliza en la presente, una "actividad aumentada" o "actividad enzimática aumentada" también puede incluir una actividad que sea al menos 1.25 veces mayor que la actividad del polipéptido o proteina codificados por el gen tipo nativo, de preferencia al menos 1.5 veces mayor, con mayor preferencia al menos 2 veces mayor e incluso con mayor preferencia al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces mayor que la actividad del polipéptido o proteina codificados por el gen tipo nativo.

En otra modalidad, un gen que tiene una mutación o gen mutante codifica un polipéptido o proteina que tiene una actividad reducida comparada con el polipéptido o proteina codificados por el gen tipo nativo, por ejemplo, cuando se ensaya en condiciones semejantes (por ejemplo se ensaya en microorganismos cultivados a la misma temperatura) . Un gen mutante también puede codificar ningún polipéptido o tener una concentración reducida de producción del polipéptido tipo nativo. Cuando se utiliza en la presente, una "actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" es aquella que es al menos 5% menor que la del polipéptido o proteina codificados por la molécula de ácido nucleico o gen tipo nativo, de preferencia al menos 4-10% menos, con mayor preferencia al menos 10-25% menor e incluso más preferente al menos 25-50%, 50-75% o 75-100% menos que la del polipéptido o proteina codificados de la molécula de ácido nucleico o gen tipo nativo. Los intervalos intermedios de los valores antes mencionados, por ejemplo 75-85%, 85-90%, 90-95%, también están propuestos para estar comprendidos por la presente invención. Cuando se utiliza en la presente, una "actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" también puede incluir una actividad que ha sido delecionada o "knocked out" (por ejemplo aproximadamente 100% menos actividad que la del polipéptido o proteina codificados por la molécula del ácido nucleico o gen tipo nativo) .

La actividad puede determinarse de acuerdo con cualquier ensayo bien aceptado para medir la actividad de una proteina especifica que interese. La actividad se puede medir o ensayar directamente, por ejemplo, midiendo una actividad de una proteina en un extracto crudo de células o aislada o purificada de una célula o microorganismo. De otro modo, una actividad puede medirse o ensayarse dentro de una célula o microorganismo o en un medio extracelular . Por ejemplo, el ensayo para un gen mutante (es decir, el mutante que codifica una actividad enzimática reducida) puede llevarse a cabo expresando gel mutado en un microorganismo, por ejemplo, un microorganismo mutante en el cual la enzima sea sensible a la temperatura, y ensayando el gen mutante para la habilidad para complementar un mutante sensible a la temperatura (Ts) para la actividad enzimática. Un gen mutante que codifique una "actividad enzimática aumentada" puede ser aquel que complemente el mutante Ts más eficazmente que, por ejemplo, un gen tipo nativo correspondiente. Un gen mutante que codifique una "actividad enzimática reducida" es que complementa al mutante Ts menos efectivamente que, por ejemplo, un gen tipo nativo correspondiente .

Los expertos en la técnica apreciaran que incluso una sola sustitución de un ácido nucleico o secuencia génica (por ejemplo una sustitución básica que codifique un cambio de aminoácido en la secuencia de aminoácidos correspondientes) puede afectar drásticamente la actividad del polipéptido o proteína codificados en comparación con e polipéptido o proteína tipo nativo correspondiente. Un gen mutante (por ejemplo que codifique un polipéptido o proteína mutante) , como se define en la presente, se distingue fácilmente de un ácido nucleico o gen que codifica un homólogo de proteína en que un gen mutante codifica una polipéptido o proteína que tiene una actividad alterada, como una opción, que puede observarse como un fenotipo diferente o distinto en un microorganismo que expresa el gen mutante o que produce la proteina o polipéptido mutante (es decir, un microorganismo mutante) en comparación con un microorganismo correspondiente que exprese el gen tipo nativo. Por el contrario, un homólogo de la proteína puede tener una actividad idéntica o considerablemente semejante, como una opción imperceptible desde el punto de vista del fenotipo cuando se produce en un microorganismo, en comparación con un microorganismo correspondiente que exprese el gen tipo nativo. Por consiguiente no es, por ejemplo, el grado de identidad de las secuencias entre moléculas de ácido nucleico, genes, proteína o polipéptidos, el que sirve para distinguir entre homólogos y imitantes, sino más bien es la actividad de la proteína o polipéptido codificados lo que distingue entre homólogos y mutantes: los homólogos tienen, por ejemplo, baja identidad de las secuencias (por ejemplo 30-50% de identidad de la secuencia) pero tiene actividades funcionales considerablemente equivalentes, y los mutantes, por ejemplo, comparten 99% de identidad de las secuencias pero tienen actividades funcionales muy diferentes o alteradas.

También los expertos en la técnica apreciaran que las moléculas de ácido nucleico, genes, proteínas o polipéptidos para uso en la presente invención pueden obtenerse de cualquiera de los microorganismos que tengan una vía biosintética del MTF, una vía biosintética de ilv o una vía biosintética de pantotenato. Moléculas de ácido nucleico, genes, proteínas o polipéptidos como estos pueden ser identificados por los expertos utilizando las técnicas conocidas como el escrutinio de la homología, comparación de las secuencias y similares, y pueden ser modificados por el experto en tal forma que la expresión o producción de estas moléculas de ácido nucleico, genes, proteínas o polipéptidos se encuentren en un microorganismo recom inante (por ejemplo utilizando los promotores, sitios de unión al ribosoma, vectores de expresión o integración, modificación de la secuencia de los genes de modo que se aumente la transcripción, adecuados (tomando en cuenta el uso preferible del codón) , por ejemplo, de acuerdo con la técnicas descritas en la presente y las conocidas en la técnica) .

En una modalidad, los genes de la presente invención se obtienen a partir de un microorganismo gram positivo (por ejemplo un microorganismo que conserve el tinte básico, por ejemplo cristal violeta, debido a la presencia de una pared gram positivo que rodee el microorganismo). El término obtenido de "(por ejemplo" obtenido de "un microorganismo gram positivo) se refiere a un gen que se encuentra en el microorganismo en estado natural (por ejemplo se encuentra naturalmente en un microorganismo gram positivo) . En una modalidad preferida, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo que pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en: Bacillus, Coxnyebacteríum (por ejemplo Cornyebacterium glutamicum) , Lactobacillus, Lactococci y Streptomyces. En una modalidad más preferida, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo que es del género Bacillus. En otra modalidad, los géneros de la presente invención se obtienen de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en: Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentusr Bacillus fizmus, Bacillus pantothenticusr Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagularía, Bacillus licheniformisr Bacillus megateriumr Bacillus pumilusr Bacillus thuringiensisr Bacillus halodurans, y otras especies de Bacillus grupos I, por ejemplo, según se caracterizan por el tipo de rRNA e 16S. En otra modalidad preferida, el gen se obtiene del Bacillus hrevis o Bacillus stearothermophilus . En otra modalidad preferida, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis y Bacillus pumilus. En una modalidad particularmente preferida, el gen se obtiene de Bacillus subtilis (por ejemplo es Bacillus subtilis-derivados ) . El término "obtenidos de Bacillus subtílis" o Bacillus sujtilis-derivados" incluye un gen que se encuentra en forma natural en el microorganismo "Bacillus subtilis. Incluido dentro del alcance de la presente invención están los genes obtenidos de Bacillus (por ejemplo los genes purR, los genes serA los genes glyA, los genes coaX, los genes coaA los genes pan y/o los genes ilv de Bacillus o B. subtilis.

En otra modalidad, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo gram negativo (excluye el tinte básico) . En una modalidad preferida, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo que pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Salmonella (por ejemplo Salmonella typhimurium) . Escherichiar Klebsiella, Serratia y Proteus. En una modalidad más preferida, los genes de la presente invención se obtienen de un microorganismo de género Escherichia. En una modalidad incluso más preferida, los genes de la presente invención se obtienen de Escherichia coli. En otra modalidad, los genes de la presente invención se obtienen de Sacharomyces (por ejemplo Sacharomyces cerevisiae) .

II. Moléculas de ácido nucleico y vectores recombinantes La presente invención además, muestra las moléculas de ácido nucleico recombinantes (por ejemplo moléculas de DNA recombinantes) que incluyen los genes descritos en la presente (por ejemplo los genes aislados), de preferencia los genes de Bacillus, con mayor preferencia los genes de Bacillus subtilis, incluso con mayor preferencia los genes biosintéticos del pantotenato de Bacillus subtilis y/o los genes biosintéticos de isoleucina-valina (ilv) y/o los genes biosintéticos de metilentetrahidrofolato (MTF) . El término "molécula de ácido nucleico recombinante" incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo una molécula de DNA) que ha sido alterada, modificada o manipulada de modo que difiere en la secuencia de nucleotidos a partir de la molécula de ácido nucleico natural o nativa de la cual se obtuvo la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo por adición deleción o sustitución de uno o más nucleotidos) . De preferencia, una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de DNA recombinante) incluye un gen aislado de la presente invención ligado de manera operante a las secuencias reguladoras. La frase "ligado de manera operante a la(s) secuencia (s) reguladora (s) " significa que la secuencia de nucleótidos del gen que interesa esta ligada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) en una forma que permita la expresión (por ejemplo aumentada, aumentada, constitutiva, basal, disminuida o reprimida) del gen, de preferencia la expresión de un producto génico codificado por el gen (por ejemplo, cuando la molécula de ácido nucleico recombinante esta incluida en un vector recombinante, como se define en la presente, y se introduce en un microorganismo) .

El término "secuencia reguladora" incluye secuencias de ácido nucleico que afectan (por ejemplo modulan o regulan) la expresión de otras secuencias de ácido nucleico (es decir, genes) . En una modalidad, una secuencia reguladora esta incluida en una molécula de ácido nucleico recombinante en una posición semejante o idéntica y/o en una orientación relativa a un gen especifico que interese según se observa por la secuencia reguladora y el gen que interesa como se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, en una posición y/o orientación natural. Por ejemplo, un gen que interese puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante ligada de manera operante a una secuencia reguladora que acompañe o este junto al gen que interesa en el organismo natural (por ejemplo, ligada de manera operante a las secuencias reguladoras "naturales" (por ejemplo al promotor "natural") . De otro modo, un gen que interese puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante ligada de manera operante a una secuencia reguladora que acompañe o se encuentre junto a otro gen (un gen diferente) en el organismo natural. De otro modo, un gen que interese puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante ligada de manera operante a una secuencia reguladora de otro organismo. Por ejemplo, las secuencias reguladoras procedentes de otros microbios (por ejemplo otras secuencias reguladoras bacterianas, secuencias reguladoras de bacteriófago y similares) pueden estar ligadas de manera operante a un gen especifico que interese.

En una modalidad, una secuencia reguladora es una secuencia no natural o que no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencia que haya sido modificada, mutada, sustituida, derivada, delecionada incluyendo las secuencias que se sintetizan químicamente) . Las secuencias reguladoras preferidas incluyen los promotores, potenciadores, señales de terminación, señales de anti-terminación y otros elementos para el control de la expresión (por ejemplo las secuencias a las cuales se unen los represores o inductores y/o los sitios de unión para las proteínas reguladoras de la transcripción y/o traducción, por ejemplo en el mRNA transcrito) . Secuencias reguladoras como están descritas, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo los promotores constitutivos y promotores constitutivos fuertes) , aquellos que dirigen la expresión que puede ser inducida de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo los promotores inducibles, por ejemplo, los promotores que pueden inducir xilosa) , y aquellos que atenúan o reprimen la expresión de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo las señales de atenuación o secuencias de unión al represor, por ejemplo, un sitio de unión a PurR) , También esta dentro del alcance de la presente invención regular la expresión de un gen que interese eliminando o delecionando secuencias reguladoras. Por ejemplo, las secuencias involucradas en la regulación negativa de la transcripción pueden eliminarse de modo que se aumente la expresión de un gen que interese.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención contiene una secuencia de ácido nucleico o gen que codifica al menos un producto génico bacteriano (por ejemplo una enzima biosintética de pantotenato, una enzima biosintética de isoleucina-valina y/o una enzima biosintética del metilentetrahidrofolato (MTF) ligado de manera operante a un promotor o secuencia promotora. Los promotores preferidos de la presente invención incluyen los promotores Bacillus y/o promotores bacteriófagos (por ejemplo bacteriófago que infecte Bacillus) . En una modalidad, un promotor es un promotor Bacillus, de preferencia un promotor Bacillus fuerte (por ejemplo un promotor asociado con un gen guarda llaves bioquímico en Bacillus o un promotor asociado con un gen de la vía glucolítica en Bacillus) . En otra modalidad, un promotor es un promotor bacteriófago. En una modalidad preferida, el promotor es obtenido de bacteriófago SP01. En una modalidad particularmente preferida, un promotor se elige del grupo que consiste en Pis, P26 ó Pvegr teniendo, por ejemplo, las siguientes secuencias respectivas: GCTATTGACGACAGCTÁTGGTTCACrGTCCACCAACCAÁAACTGTGCTCAGT ACCGCCAATATTTCTCCCTrGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGAT CCACGCTGTGTAAAAAITTTACAAAAAGGTATTGACmCCCTACAGGGTGT GTAATAATTTAAT ACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO:l), GCCTACCTAGOTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAÁAGAT G TTTGITCTACATCCAGAACAACCTCT AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGOTATAATAATCTTAACAACAGC AGGACGC (SEQ ID NO:2), and GAGGAATCATAGAA mGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAAC GlTGATATAATTTAAATTTTAlTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATA AATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (SEQ ID NO:3). Otros promotores preferidos incluyen tef (el promotor del factor de elongación traduccional (TEF) y pyc (promotor piruvato carboxilosa (PYC) ) , que promueven la expresión de alto nivel en Bacil us (por ejemplo Baclllus subtilis) . Otros promotores preferidos, por ejemplo, para uso en microorganismos gram positivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores amy y SP02. Otros promotores preferidos, por ejemplo, para uso en microorganismos gram negativos incluye, pero no se limitan a: eos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, tre, arar SP6, ?-PR ó ?-PL.

En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye una secuencia terminadora o secuencias terminadoras (por ejemplo las secuencias terminadoras de la transcripción) . El término "secuencias terminadoras" incluye las secuencias reguladoras que sirven para terminar la transcripción del mRNA. Las secuencias terminadoras (o terminadores de la transcripción en tándem) además pueden servir para estabilizar el mRNA (por ejemplo adicionando estructura al mRNA), por ejemplo, contra nucleasas.

En todavía otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye secuencias que permiten la detección del vector que contiene las secuencias (es decir, marcadores que puedan ser detectados y/o seleccionado), por ejemplo, genes que codifiquen secuencias para la resistencia a los antibióticos o que superen las mutaciones auxotróficas, por ejemplo, trpC, marcadores de fármacos, marcadores fluorescentes y/o marcadores colorimétricos (como la lacZ/p-galactosidasa) . En todavía otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención incluye un sitio de unión al ribosoma (KBS) artificial o una secuencia que se transcribe en un RBS artificial. El término "sitio de unión al ribosoma artificial (RBS)" incluye un sitio dentro de una molécula de mRNA (por ejemplo codificada dentro del DNA) a la cual se une un ribosoma (por ejemplo para iniciar la traducción) que difiere de un RBS nativo (por ejemplo un RBS que se encuentre en un gen en estado natural) por al menos un nucleótido. Los RBS artificiales preferidos incluyen aproximadamente 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16-, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 o más nucleótidos de los cuales aproximadamente 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-15 o más difieren del RBS natural (por ejemplo el RBS natural de un gen que interese, por e emplo, el RBS natural de panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 4) o el RBS natural de panD ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG (SEQ ID NO: 5) ) . De preferencia, los nucleótidos que difieren están sustituidos de modo que sean idénticos a uno o más nucleótidos de un RBS ideal cuando se alinean en una forma óptima para las comparaciones. Los RBS ideales incluyen, pero no se limitan a: AGAA&GGAGGTGA (SEQ ID NO: 6) , TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (SEQ ID NO: 7), TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (SEQ ID NO: 8), AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (SEQ ID NO: 9), y AGAAAGGAGGTGAOTSJNNNNATG (SEQ ID NO: 10) . Los RBS artificiales pueden utilizarse para sustituir los RBS que se encuentran en estado natural o nativos asociados con un gen especifico. Los RBS artificiales de preferencia aumentan la traducción de un gen especifico. Los RBS artificiales preferidos (por ejemplo dos RBS para aumentar la traducción de panB, por ejemplo, de panB de B. subtilis) incluyen: CCCTCTAGAAGGAGGAGAAñACATG (SEQ ID NO: 11) y CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 12) . Los RBS artificiales, preferidos, (por ejemplo los RBS para aumentar la traducción de panB, por ejemplo, de panB de B. subtilisis) . Incluyen: T AGAAAGGAGGATTTAAATATG (SEQ ID N0:13), TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (SEQ ID NO: 14), TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG (SEQ ID N0:15), •TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (SBQ ID NO: 16), ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG (SEQ ID NO:17), ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG . (SEQLD NO:18), and ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG (SEQ ID NO:19l La presente invención además muestra los vectores (por ejemplo vectores recomoinantes) que incluyen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo genes o moléculas de ácido nucleico recombinantes que contienen estos genes) como se describe en la presente. El término "vector recombinantes" incluye un vector (por ejemplo plásmido, fago, fásmido, virus, cósmido u otro vector ácido nucleico purificado) que haya sido alterado modificado o manipulado de modo que contenga mayores, menores o diferentes secuencias de ácido nucleico en comparación con las contenidas en las molécula de ácido nucleico nativa o natural de la cual se obtiene el vector reconibinante . De preferencia, el vector recombinante incluye un gen que codifica la enzima biosintética o la molécula de ácido nucleico recombinante que incluye el gen, ligada de manera operante a las secuencias reguladoras, por ejemplo las secuencias promotoras, secuencias terminadoras y/o los sitios de unión al ribosoma artificiales (RBS) , como se define en la presente. En otra modalidad, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias que favorecen la replicación en bacterias (por ejemplo secuencias que favorecen la replicación) . En una modalidad, las secuencias que favorecen la replicación funcionan en E. coli. En otra modalidad, las secuencias que favorecen la replicación se obtienen de pBR322.

En todavía otra modalidad, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias para resistencia a antibióticos. El término "secuencias para la resistencia a antibióticos" incluye secuencias que favorecen o confieren resistencia a los antibióticos en el organismo hospedero (por ejemplo Bacillus) . En una modalidad, las secuencias para la resistencia a los antibióticos se eligen del grupo que consiste en secuencias cat (resistencia a cloranfenicol) , secuencias tet (resistencia a tretraciclina) , secuencias erm (resistencia a heritromicina) , secuencias neo (resistencia a neomicina) , secuencias kan (resistencia a canamicina) y secuencias spec (resistencia a espectinomicina) . Los vectores recombinantes de la presente invención además pueden incluir secuencias de recombinación homologa (por ejemplo secuencias diseñadas para permitir la recombinación del gen que interese en el cromosoma del organismo hospedero) . Por ejemplo, es posible utilizar las secuencias bpr, vpr ó amyE como blancos de homología para la recombinación en el cromosoma hospedero. Además los expertos en la técnica apreciarán que el diseño de un vector puede ser diseñado dependiendo de factores tales como la elección del microorganismo que va a ser genéticamente manipulado, el nivel de expresión del producto génico deseado, y similares .

III. microorganismos recombinantes La presente invención además muestra los microorganismos, es decir, los microorganismos recombinantes que incluyen vectores o genes (por ejemplo genes de tipo nativo y/o mutados) como se describe en la presente. Cuando se utiliza en la presente, el término "microorganismo recombinante" incluye un microorganismo (bacteria, célula de levadura, célula nicótica, etc) que haya sido genéticamente alterada, modificada o manipulada (por ejemplo genéticamente manipulada) de modo que muestre un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo cuando la modificación genética afecta las secuencias de ácido nucleico codificantes del microorganismo) en comparación con el microorganismo en su estado natural del cual se obtiene.

En una modalidad, un microorganismo recombinante de la presente invención es un organismo gram positivo (por ejemplo un microorganismo que retenga el tinte básico, por ejemplo cristal violeta, debido a la presencia de una pared gram positiva rodeando al microorganismo) . En una modalidad preferida, el microorganismo recombinante es un microorganismo que pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus, Corynebacterium (por ejemplo Corynebacterium glutamicum) , lactobacíllus, Lactococci y Streptomyces. En una modalidad preferida, el microorganismo recombinante es del género Bacillus. En otra modalidad preferida, el microorganismo recombinante se elige del grupo que consiste en Bacillus subtíllis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformisr Bacillus megateriumr Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus halodurans y otras especies de Bacillus del grupo 1, por ejemplo como se caracteriza por el tipo de rR A de 16S. En otra modalidad preferida, el microorganismo recombinante es Bacillus brevis o Bacillus stearothermophilus. En otra modalidad preferida, el microorganismo recombinante se elige del grupo que consiste en Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis y Bacillus pumilus.

En otra modalidad, el microorganismo recombinante es un organismo gram negativo (excluye el tinte básico) . En una modalidad preferida, el microorganismo recombinante es un microorganismo que pertenece al género seleccionado del grupo que consiste en Salmonella (por ejemplo Salmonella typhimurium) , Escherichiar Klebsiella, Serratía y Proteus. En una modalidad más preferida, el microorganismo es del género Escherichia en una modalidad incluso más preferida, el microorganismo recombinante es Escherichia coli. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) .

Un microorganismo "recombinante" preferido de la presente invención es un microorganismo que tiene una vía o enzima de biosintesis de pantotenato desregulada, una via o enzima biosintética de isoleucina-valina (i2v) desregulada y/o una via o enzima biosintética para metilentetrahidrofolato (MTF) desregualada o modificada. El término "desregulada" o "desregulación" incluye la alteración o modificación de al menos un gen en un microorganismo que codifique una enzima en una via biosintética, de modo que el nivel o actividad de la enzima biosintética en el microorganismo se modifique o altere. De preferencia, al menos un gen que codifique una enzima en una vía biosintética se altera o modifica de modo que el producto génico se mejora o aumenta. La frase "vía desregulada" incluye una vía biosintética en la que más de un gen que codifica una enzima en una vía biosintética se altera o modifica de modo que el nivel o actividad de más de una enzima biosintética se altera o modifica. La habilidad para "desregular" una vía (por ejemplo para desregular simultáneamente más de un gen en una vía biosintética determinada) en un microorganismo en algunos casos surge del fenómeno específico de los microorganismos en los que más de una enzima (por ejemplo dos o tres enzimas biosintéticas) se codifican por genes que se encuentran adyacentes entre sí sobre una pieza contigua de material genético denominado un "operón" (como se define en la presente) . Debido a la regulación coordinada de los genes incluidos en un operón, la alteración o modificación del promotor individual y/o el elemento regulador puede dar origen a la alteración o modificación de la expresión de cada producto génico codificado por el operón. La alteración o modificación de un elemento regulador puede incluir, pero no se limita a remover el promotor endógeno y/o el (los) elemento (s) regulador (es) adicionar promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o remover secuencias reguladoras de modo que se modifique la expresión de los productos génicos, modificando la ubicación cromosomal de un gen u operón, alterando las secuencias de ácido nucleico adyacentes a ungen u operón (o dentro de un operón) como puede ser un sitio de unión al ribosoma, aumentando el número de copias de un gen u operón, modificando las proteínas (por ejemplo las proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores de la transcripción y similares) involucradas en la transcripción de un gen u operón y/o la traducción de un producto génico o productos génicos de un gen u operón, respectivamente, o cualquier otro medio habitual para desregular la expresión de los genes, habitual en la técnica (que incluye, pero no se limita a, el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido, por ejemplo, para bloquear la expresión de proteínas represoras) . La desregulación también puede involucrar y alterar la región codificante de uno o más genes para producir, por ejemplo, una enzima que sea resistente a la realimentación o tenga una actividad específica mayor o menor.

En otra modalidad preferida, un microorganismo recombinante se diseña o manipula de modo que al menos una enzima biosintética del pantotenato, al menos una enzima biosintética de isoleucina-valina y/o al menos una enzima biosintética del MTF sea sobre expresada. El término "sobre expresada" o "sobre expresión" incluye la expresión de un producto génico (por ejemplo una enzima biosintética) a un nivel mayor que el expresado antes de la manipulación del microorganismo o en un microorganismo comparable que no haya sido manipulado. En una modalidad, el microorganismo puede ser genéticamente diseñado o manipulado para sobre expresar un nivel de producto génico mayor que el expresado en un microorganismo comparable que no haya sido manipulado.

La manipulación genética puede incluir, pero no se limita a, alterar o modificar las secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen particular (por ejemplo mediante la adición de promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o por la eliminación de secuencias reguladoras de modo que la expresión sea constitutiva) , modificando el lugar cromosomal de un gen especifico, alterando las secuencias de ácido nucleico adyacentes a un gen especifico como puede ser un sitio de unión al ribosoma, el aumento del número de copias de un gen especifico, la codificación de las proteínas (por ejemplo las proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores de la transcripción y similares) involucrados en la transcripción de un gen especifico y/o la traducción de un producto génico especifico, o cualquier otro medio tradicional para desregular la expresión de un gen específico, habitual en la técnica (que incluye, pero no se limita al uso de moléculas de ácido nucleico antisentido, por ejemplo, para bloquear la expresión de las proteínas represoras) . La manipulación genética también puede incluir la deleción de un gen, por ejemplo, para bloquear una vía o para eliminar un represor.

En otra modalidad, el microorganismo puede ser física o ambientalmente manipulado para sobre expresar un nivel de producto génico mayor que el expresado antes de la manipulación del microorganismo en un microorganismo comparable que no haya sido manipulado. Por ejemplo, un microorganismo puede ser tratado con o cultivado en presencia de un agente conocido o que se sospeche que aumenta la transcripción de un gen específico y/o la traducción de un producto génico específico, de modo que la transcripción y/o traducción se mejore o aumente. De otro modo, un microorganismo puede ser cultivado a una temperatura seleccionada para aumentar la trasncripción de un gen específico y/o la traducción de un producto génico específico de modo que se mejore o aumente la transcripción y/o traducción.

IV. Cultivo y fermentación de los microorganismos xecombinantes El término "cultivo" consiste en mantener y/o hacer crecer un microorganismo vivo de la presente invención (por ejemplo mantener y/o hacer crecer un cultivo o cepa) . En una modalidad, un microorganismo de la invención se cultiva en medios líquidos. En otra modalidad, un microorganismo de la invención se cultiva en medios sólidos o medios semisólidos. En una modalidad preferida, un microorganismo de la invención se cultiva en medios (por ejemplo un medio líquido, estéril) que contenga nutrientes esenciales o benéficos para el mantenimiento y/o crecimiento del microorganismo (por ejemplo fuentes de carbono o sustrato de carbono, por ejemplo carbohidrato, hidrocarburos, aceites, grasa, ácidos grasos, ácidos orgánicos y alcoholes; fuentes de nitrógeno como peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, harina de soya, polvo de soya, sémola de soya, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo ácido fosfórico, las sales de sodio y potasio de este; oligoelementos, por ejemplo las sales de magnesio, hierro, manganeso, calcio, cobre, zinc, boro, molibdeno y/o cobalto, así como factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, promotores del crecimiento y similares) .

De preferencia, los microorganismos de la presente invención se cultivan con pH controlado. El término "pH controlado" incluye cualquier pH que permita la producción del producto deseado (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad los microorganismos se cultivan a un pH de aproximadamente 7. En otra modalidad los microorganismos se cultivan a un pH de entre 6.0 y 8.5. El pH deseado puede mantenerse por cualquiera de los métodos conocidos para los expertos en la técnica.

También de preferencia los microorganismos de la presente invención se cultivan en aireación controlada. El término aireación controlada" incluye ventilación suficiente (por ejemplo oxigeno) para permitir la producción del producto deseado (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad, la aireación se controla regulando las concentraciones de oxigeno en el cultivo, por ejemplo regulando la cantidad de oxigeno disuelto en los medios de cultivo. De preferencia, la aireación del cultivo se regula agitando el cultivo. La agitación puede proporcionarse mediante un propulsor o equipo de agitación mecánica semejante, revolviendo o agitando el recipiente de cultivo (por ejemplo tubo o matraz) o por los diferentes equipos de bombeo. La aireación además puede controlarse haciendo pasar oxigeno o aire estéril a través del medio (por ejemplo a través de la mezcla de fermentación) . Asi mismo de preferencia los microorganismos de la presente invención se cultivan sin formación de espuma en exceso (por ejemplo por la adición de agentes antiespumantes) .

Además, los microorganismos de la presente invención pueden cultivarse a temperaturas controladas. El término "temperatura controlada" incluye cualquier temperatura que permita la producción del producto deseado (pantoato y/o pantotenato) . En una modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15°C y 95°C. En otra modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15°C y 70°C. Las temperaturas preferidas son entre 20°C y 55°C, con mayor preferencia entre 30°C y 50°C.

Los microorganismos pueden ser cultivados (pueden mantenerse y/o hacerse crecer) en medios líquidos y de preferencia se cultivan, en forma continua o intermitente, por métodos de cultivo habituales como cultivo en reposo, cultivo en tubos de ensaye, cultivo con agitación (por ejemplo cultivo en agitación rotatoria, cultivo en matraces con agitación, etc) , cultivos centrífugos con aireación, o fermentación. En otra modalidad preferida, los microorganismos se cultivan en matraces con agitación. En una modalidad más preferida, los microorganismos se cultivan en un termentador (por ejemplo un proceso de fermentación) . Los procesos de fermentación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, procesos en lote, procesos en lotes con alimentación continuos o métodos de fermentación. La frase "proceso en lote" o "fermentación en lote" se refiere a un sistema en el que la composición del medio, los nutrientes, aditivos suplementarios y similares se determinan al principio de la fermentación y no se someten a alteración durante la fermentación, no obstante, se han hecho intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno para evitar la acidificación excesiva del medio y/o la muerte de los microorganismos. La frase "proceso en lote con alimentación" o fermentación "en lote con alimentación" se refiere a una fermentación en lotes con la excepción de que se adiciona uno o más sustratos o suplementos (por ejemplo se adiciona en aumentos o en forma continua) a medida que avanza la fermentación. La frase "proceso continuo" o "fermentación continua" se refiere a un sistema en el que un medio de fermentación definido se adiciona en forma continua a un termentador y una cantidad equivalente de los medios utilizados o "acondicionados" se retira al mismo tiempo, de preferencia para recuperar el producto deseado (pantoato y/o pantotenato) . Se ha desarrollado una variedad de procesos y son bien conocidos en la técnica.

La frase "cultivar en condiciones tales que se produzca un compuesto deseado" incluye mantener y/o hacer crecer los microorganismos en condiciones (temperatura, presión, pH, duración, etc) adecuadas o suficientes para obtener la producción del compuesto deseado o para obtener rendimientos deseados del compuesto especifico que se produce. Por ejemplo, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de un compuesto (pantoato y/o pantotenato) . De preferencia, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para llegar considerablemente a la producción conveniente del compuesto (por ejemplo un tiempo suficiente para llegar a la concentración deseada de pantoato y/o pantotenato o la proporción conveniente de pantoato y/o pantotenato: HMBPA) . En una modalidad, el cultivo se continúa durante aproximadamente 12 a 24 horas. En otra modalidad el cultivo se continua durante 24 a 36 horas de 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas o más de 144 horas. En todavía otra modalidad, los microorganismos se cultivan en condiciones tales que al menos 5 a 10 g/L del compuesto se produzcan en aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 10 a 20 g/L del compuesto se produzcan en aproximadamente 48 horas o al menos aproximadamente 20 a 30 g/L del compuesto en aproximadamente 72 horas. En todavía otra modalidad, los microorganismo se cultivan en condiciones tales que al menos 5 a 20 g/L del compuesto se producen en aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 20 a 30 g/L del compuesto se produzcan en aproximadamente 48 horas o al menos aproximadamente 30 a 50 ó 60 g/L del compuesto en aproximadamente 72 horas. En todavía otra modalidad, los microorganismos se cultivan en condiciones tales que al menos aproximadamente 40 a 60 g/L del compuesto se producen en aproximadamente 36 horas, o al menos aproximadamente 60 a 90 g/L del compuesto se producen en aproximadamente 48 horas. El experto en la técnica se dará cuenta que mediante los procesos descritos en la presente es posible obtener valores por enzima de los limites superiores de los intervalos mencionados, por ejemplo, en una corrida de fermentación particular o con una cepa manipulada específica.

De preferencia, un método de producción de la presente invención permite la producción de un nivel de pantotenato que es "aumentada en comparación con un control adecuado". F.l término "control adecuado" como se define en la presente, incluye cualquier control reconocido por el experto en la técnica por ser adecuado para determinar los niveles o concentraciones aumentadas, aumentadas o elevadas del producto deseado. Por ejemplo, cuando el proceso indica cultivar un microorganismo que tenga una vía biosintética de pantotenato desregulada y el microorganismo además tenga una vía biosintética del MTF desregulada (es decir, que haya sido manipulado de modo que al menos una enzima biosintética del MTF este desregulada, por ejemplo, sobre expresada) , un control adecuado incluye un cultivo del microorganismo antes o ausente [sic] de la manipulación de la enzima o via de MTF (es decir, que tenga solo desregulada la via biosintética del pantotenato) . Del mismo modo, cuando el proceso indica cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada y una via biosintética de ilv desregulada, y el microorganismo además tenga una via biosintética de MTF desregulada (es decir, que haya sido manipulada de modo que al menos una enzima biosintética del MTF este desregulada, por ejemplo sobre expresada) , un control adecuado incluye un cultivo del microorganismo antes o con falta de manipulación de la via o enzima del MTF (es decir, que solo tenga la vía biosintética de pantotenato y la via biosintética de ilv desreguladas) . No es necesario realizar una comparación en cada proceso practicado de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, una persona experta puede determinar los controles adecuados en forma empírica después de realizar una serie de reacciones (por ejemplo cultivos en tubo de ensayo, cultivos en matraces con agitación, fermentaciones), por ejemplo, en las mismas condiciones o similares. Después de haber evaluado un nivel de producción habitual, por ejemplo, por una cepa específica, el técnico podrá reconocer los niveles que sean mejorados o aumentados o elevados sobre estos niveles. En otras palabras, la comparación con un control adecuado incluye la comparación con valores predeterminados (como puede ser un control predeterminado) .

Así pues, en una modalidad en donde una cepa adecuadamente manipulada produce 40 g/L de pantotenato en 36 horas (antes de la manipulación para que se aumente la producción de pantotenato) , la producción de 60, 70, 80, 90 o más g/L de pantotenato (después de la manipulación, por ejemplo, la manipulación para que se sobre exprese al menos una enzima biosintética del MTF) es un ejemplos de la producción aumentada.

La metodología de la presente invención además puede incluir un paso de recuperar un compuesto deseado (pantoato y/o pantotenato) . El término "recuperar" un compuesto deseado incluye extraer, cosechar, aislar o purificar el compuesto del medio de cultivo. La recuperación del compuesto puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier metodología de aislamiento o purificación tradicional conocida en la técnica que incluye, pero no se limita a, el tratamiento con una resina habitual (por ejemplo resina de intercambio aniónico o catiónico, resina de absorción no iónica, etc) , el tratamiento con un absorbente habitual (por ejemplo carbono activado, ácido silícico, gel de sílice, celulosa, alúmina, etc) , la alteración del pH, extracción con disolventes (por ejemplo con un disolvente habitual como un alcohol, acetato de etilo, hexano y similares) , diálisis, filtración, concentración, cristalización, recristalización, el ajuste del pH, liofilización y similares. Por ejemplo, es posible recuperar un compuesto del medio de cultivo retirando primero los microorganismos del cultivo. Los medios luego se pasan a través o sobre una resina de intercambio catiónico para retirar los cationes y luego a través o sobre una resina de intercambio aniónico para retirar aniones inorgánicos y ácidos orgánicos que tengan acideces más fuertes que las del compuesto que interesa. El compuesto resultante después puede convertirse en una sal (por ejemplo una sal de calcio) como se describe en la presente) .

De preferencia, un compuesto deseado de la presente invención se "extrae", "aisla" ó "purifica" de modo que la preparación resultante esté considerablemente libre de otros compuestos del medio (por ejemplo libre de los componentes del medio y/o los subproductos de la fermentación) . La frase "considerablemente libre de otros componentes del medio" incluye las preparaciones del compuesto deseado en las que se separa el compuesto de los componentes del medio o los subproductos de la fermentación del cultivo a partir del cual se produce. En una modalidad, la preparación es mayor que aproximadamente 80% (en peso seco) del compuesto deseado (por ejemplo menor que aproximadamente 20% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación) , con mayor preferencia mayor que aproximadamente 90% del compuesto deseado (por ejemplo menor que aproximadamente 10% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación) , todavía más preferentemente más de aproximadamente 95% del compuesto deseado (por ejemplo menos de aproximadamente 5% de los demás componentes del medio o subproductos de la fermentación) y con mayor preferencia más de aproximadamente 98-99% del compuesto deseado (por ejemplo menos de aproximadamente 1-2% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación) . Cuando el compuesto deseado se haya derivado en una sal, el compuesto de preferencia estará además libre de contaminantes químicos asociados con la formación de la sal. Cuando el compuesto deseado haya sido obtenido como un alcohol, el compuesto de preferencia además estará libre de contaminantes químicos asociados con la fermentación del alcohol .

En otra modalidad, el compuesto deseado no se purifica del microorganismo, por ejemplo, cuando el microorganismo no es riesgoso desde el punto de vista biológico (por ejemplo seguro) . Por ejemplo, todo el cultivo (o sobrenadante del cultivo) puede utilizarse como fuente de producto (producto crudo) . En una modalidad, el cultivo (o el sobrenadante del cultivo) se utiliza sin modificación. En otra modalidad, el cultivo (o sobrenadante del cultivo) se concentra. En todavía otra modalidad, el cultivo (o sobrenadante del cultivo) se seca o liofiliza.

En todavía otra modalidad, el compuesto deseado se purifica parcialmente. El término "se purifica parcialmente" incluye preparaciones del medio que hayan tenido al menos algún procesamiento, por ejemplo, tratamiento (por ejemplo tratamiento en lotes) con una resina comercial. En las modalidades preferidas, la preparación "parcialmente purificada" tiene más de aproximadamente 30% (en peso seco) del compuesto deseado, de preferencia más de aproximadamente 40% del compuesto deseado, con mayor preferencia más de aproximadamente 50% del compuesto deseado, todavía más preferentemente más de aproximadamente 60% del compuesto deseado, y con mucho mayor preferencia más de aproximadamente 70% del compuesto deseado. Las preparaciones "parcialmente purificadas" también de preferencia tienen 80% o menos (en peso seco) del compuesto deseado (es decir, son menos puras que las preparaciones "extraídas", "aisladas" ó "purificadas", como se definen en la presente.

Dependiendo de la enzima biosintética o la combinación de enzimas biosintéticas manipuladas, puede ser deseable o necesario proporcionar (por ejemplo alimentar) a los microorganismos de la presente invención al menos un precursor biosintético para que se produzca el compuesto o los compuestos deseados. El término "precursor biosintético" o "precursor" incluye un agente o compuesto que, cuando se proporciona a, se pone en contacto con, o se incluye en el medio de cultivo de un microorganismo, sirve para favorecer o aumentar la biosintesis del producto deseado. En una modalidad, el precursor biosintético o precursor es aspartato. En otra modalidad, el precursor biosintético o precursor es ß-alanina. La cantidad de aspartato o ß-alaina adicionada de preferencia es una cantidad que origina una concentración en el medio de cultivo suficiente para favorecer la productividad del microorganismo (por ejemplo una concentración suficiente para favorecer la producción de pantoato y/o pantotenato) . Los precursores biosintéticos de la presente invención pueden ser adicionados en forma de una solución o suspensión concentrada (por ejemplo en un disolvente conveniente como agua o búfer) o en forma de un sólido (como en la forma de un polvo) . Además, los precursores biosintéticos de la presente invención pueden ser adicionados como una sola alícuota, en forma continua o intermitente durante un tiempo determinado. El término "ß-alanina en exceso" incluye concentraciones de ß-alanina aumentadas o mayores que las habitualmente utilizadas para cultivar el microorganismo en cuestión. Por ejemplo, el cultivo de los microorganismos Bacillus descritos en los ejemplos de la presente por lo regular se hace en presencia de aproximadamente 0-0.01 g/L de ß-alanina. Por consiguiente, las concentraciones de ß-alanina en exceso pueden incluir concentraciones de aproximadamente 0.01-1, de preferencia a alrededor de 1-20 g/L.

En todavía otra modalidad, el precursor biosintético es valina. En todavía otra modalidad, el precursor biosintético es a-cetoisovalerato . De preferencia valina ó -cetoisovalerato se adicionan en una cantidad que de origen a una concentración en el medio suficiente para la producción del producto deseado (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) . El término "a-KIV en exceso" incluye concentraciones de a-KIV aumentadas o mayores que las utilizadas habitualmente para cultivar el microorganismo pertinente. Por ejemplo, el cultivo de microorganismos Bacillus descrito en los ejemplos de la presente habitualmente se hace en presencia de aproximadamente 0-0.01 g/L de -KIV. Por consiguiente, las concentraciones de -KIV en exceso pueden incluir concentraciones de alrededor de 0.01-1, de preferencia aproximadamente 1-20 g/L de cc-KIV. El término "valina en exceso" incluye concentraciones de valina aumentadas o mayores que las habitualmente utilizadas para cultivar el microorganismo pertinente. Por ejemplo, el cultivo de microorganismos Bacillus descrito en los ejemplos de la presente se hace habitualmente en presencia de aproximadamente 0-0.5 g/L de valina. Por consiguiente, las concentraciones de valina en exceso pueden incluir concentraciones de aproximadamente 0.5-5 g/L, de preferencia a alrededor de 5-20 g/L de valina.

En todavía otra modalidad, el precursor biosintético es serina. De preferencia, la serina se adiciona en una cantidad que permita una concentración en el medio suficiente para la producción del producto deseado (por ejemplo pantoato y/o pantotenato) . La serina en exceso (como se define en la presente) puede también adicionarse de acuerdo con los procesos de producción descritos en la presente, por ejemplo para la producción aumentada de pantotenato. El experto se dará cuenta que los excesos extremos de los precursores biosintéticos pueden ocasionar la toxicidad de los microorganismos. Los precursores biosintéticos también se mencionan en la presente como "sustratos biosintéticos suplementarios".

Otro aspecto de la presente invención incluye procesos de biotransformación que caracterizan los microorganismos recombinantes descritos en la presente. El término "proceso de biotransformación" también mencionado en la presente como "procesos de bioconversión", incluye los procesos biológicos que permitan la producción (por ejemplo la transformación o conversión) de los sustratos y/o compuestos intermediarios adecuados en un producto deseado.

El (los) microorganismo (s) y/o las enzimas que se utilizan en las reacciones de biotransformación están en una forma que les permita llevar a cabo su función propuesta (por ejemplo la producción de un compuesto deseado) . Los microorganismos pueden ser células completas, o pueden ser solo aquellas partes de las células necesarias para obtener el resultado final esperado. Los microorganismos pueden estar en suspensión (por ejemplo en una solución adecuada como pueden ser soluciones amortiguadas o medios) , en enjuague (enjuagues libres de medio de cultivo del microorganismo) , deshidratados con acetona, inmovilizados (por ejemplo con gel de poliacrilamida ó k-carragenina o sobre soportes sintéticos, por ejemplo perlas, matrices y similares), fijos, reticulados o permeabilizados (por ejemplo pueden tener membranas permeabilizadas y/o paredes de modo que los compuestos, por ejemplo los sustratos, intermediarios o productos puedan pasar más fácilmente a través de la membrana o pared) .

Esta invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no deben ser considerados como limitantes .

Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas mencionados a lo largo de esta solicitud se incorporan en la presente como referencia.

EJEMPLOS Ejemplo I: Cepas para la producción de los panto-compuestos Durante el desarrollo de las cepas de Bacillus para la producción de pantotenato se hacen diversas manipulaciones genéticas a los genes y enzimas que participan en la vía biosintética del pantotenato y la via de isoleucina-valina (ilv) (Figura 1) como se describe en la Solicitud de la Patente US Serie No. 09/400,494 y la Solicitud de Patente US Serie No. 09/667,569. Por ejemplo, las cepas que tienen un operón panBCD desergulado y/o que tienen panEl desregulado muestran mejor producción de pantotenato (si se cultivan en presencia de ß-alanina y a-cetoisovalerato (ot-KIV) ) . Las cepas además desreguladas para ilvBNC e ilvD muestran mejor producción de pantotenato en presencia de solo ß-alanina. Además, es posible obtener independencia de ß-alanina desregulando además panD.

Una cepa productora de pantotenato ejemplar es PA824, un protótrofo de triptofano, resistente a Spec y Tet, desregulado para panBCD en el locus panBCD, desergulada para panEl en el locus panEl (dos genes en el genoma de B. subtilis son homólogos para panE, panEl y panE2 de E. coli, el primero codifica la mayor parte de la cetopantoato reductasa involucrada en la producción de pantotenato, mientras que panE2 no contribuye a la síntesis de pantotenato (Solicitud de Patente US Serie No. 09/400,494), desregulada para ilvD en el locus ilvD, sobreexpresando un cásete ilvBNC en el locus amyE, y sobreexpresando panD en el locus hpr. La cepa ??824 por lo regular produce aproximadamente 40-50 g/L de pantotenato, si se cultiva durante 48 horas en recipientes termentadores de 14 litros de acuerdo con los procedimientos de fermentación normalizados (véase por ejemplo la Solicitud de la Patente provisional Serie No. 60/263,063 o la Solicitud de la Patente provisional Serie No. 60/262,995, incorporada como referencia en la presente) . En resumen, los medios en lotes (4.5 L) que contiene oligoelementos se inoculan con los cultivos en matraces con agitación de PA824. Las fermentaciones se controlan en cuanto a la temperatura (por ejemplo, 43°C) , el 02 disuelto y el pH, y se corren como un proceso en lotes con alimentación limitada de glucosa. Después de que se consume el lote inicial de glucosa, se mantienen las concentraciones de glucosa entre aproximadamente 0 y 1 g/L por alimentación continua de medio FEED fresco. El pH se establece a 7.2, se vigila y mantiene alimentando una solución de N¾ ó ¾P04. La concentración de oxígeno disuelto [ 02_ se mantiene a aproximadamente 10-30% regulando la agitación y la tasa de aereación. La formación de espuma se controla adicionando un agente antiespumante adecuado. El título del pantotenato en el caldo de la fermentación se determina (por análisis HPLC) después de separar las células por centrifugación.

Una segunda cepa ejemplar es PA668. La cepa PA668 se obtiene de ??824 que contiene copias adicionales de P26panB amplificadas en el locus vpr y/o panB. La cepa PA668 fue construida utilizando un vector de expresión panB (pAN636) que permite la selección de múltiples copias utilizando cloranfenicol . En resumen, un fragmento de restricción pAN636 Notl (excluyendo las secuencias vectores) se ligó y luego se utilizó para transformar PA824 con selección sobre placas que contenían 5 µg/mL de cloranfenicol . Los transformantes resistentes a 30 µg/mL de cloranfenicol se aislaron y tamizaron para la producción de pantotenato en cultivos en tubos de ensayo de 48 horas. Los aislados producen aproximadamente 10% más de pantotenato comparado con PA824. En fermentaciones de 10 L, una primera cepa, PA668-2A, produce pantotenato en cantidades comparadas con PA824 cultivada en condiciones similares (por ejemplo, -45-50 g/L a 36 horas) . Después de 36 horas, cuando la producción de pantotenato comienza abitualmente a hacerse más lenta con PA824, PA668-2A sigue produciendo concentraciones importantes de pantotenato (~60-65 g/L de pantotenato a las 48 horas) . Una segunda cepa, PA668-24, produce pantotenato a una velocidad incluso mayor, llegando a 60-70 g/L después de 48 horas.

Una tercera cepa de producción, PA721B-39, se manipuló para incluir además un cásete P2epanBpanD que puede ser amplificado, como sigue. Primero se construyó un cásete de expresión individual capaz de integrar panB y panD en el locus bpx. La combinación de ambos genes en un cásete de expresión simplifica la cepa resultante eliminando un marcador de resistencia a antibiótico. El cásete de expresión P2epanBpanD fue construido para que incluya dos sitios de unión al ribosoma panD diferentes (los RBS que hablan sido anteriormente sintetizados en la Patente Internacional No. WO 01/21772 y la Solicitud de la Patente US No. 60/262,995). El cásete además incluyó el sitio de unión al ribosoma (RBS1), del gen panB sintético, pero el diseño permite alteración futura del panB RBS por simple sustitución del cásete de oligonucleótidos . En el primer paso de construcción, el gen panD se unió a los dos casetes del gen panD como se muestra en la Figura 3 para la construcción de pAN665. A continuación, los casetes panBpanD resultantes fueron transferidos al vector de expresión pOTP61 de B. subtilis, como se muestra en la Figura 4. En la Tabla 1 se presenta un resumen de las características esenciales de cada plásmido (pAN670 y pAN674) construido.

Tabla 1. Plásmidos que contienen los casetes de expresión génica panBpanD de B. subtilis Plásmido panD RBS Vector Cepa hospedera pAN665 Estándar pASK- E. coli 1BA3 pAN670 POTP61 B. subtilis pAN669 ND-C2 pAS - E. coli 1BA3 pAN674 ir POTP61 B. subtilis Estos nuevos plásmidos combinan la producción de PanB y PanD adicional a partir de un solo vector y se pronosticó que producen niveles aumentados de PanB en relación con el vector de expresión panB (pAN636) presente en PA668. La estrategia para instalar los vectores P26 panBpanD en la cepa productora de pantotenato aprovecha el ligamiento genético entre bpr y panEl. Primero se construyó un derivado de PA824 que se cura del cásete de expresión panD residente transformando la cepa con DNA cromosomal aislado de PA930 {panEl :: cat) y seleccionando para la resistencia a cloranfenicol . Los transformantes resultantes fueron tamizados para la sensibilidad a tetraciclina, y se salvaron dos aislados sensibles a Tet denominados PA715. Esta cepa es la cepa hospedera para valorar los vectores P26 panBpanD (véase más adelante) . Para restablecer el cásete P26 panEl en PA715, cada vector primero se transformó en una cepa (PA328) que contiene P26 panEl pero no contiene un cásete integrado en el locus bpr. PA328 contiene el locus P26 panBCD, aunque no está manipulada para la sobreproducción de oc-KIV. Los transformantes de PA328 resistentes a tetraciclina se obtuvieron utilizando los fragmentos de restricción Notl adecuados a partir de los dos vectores y las cepas resultantes fueron denominadas PA710 y PA714.

El siguiente paso fue transferir los casetes a PA715 de modo que pudieran ser evaluados en la cepa ??824 antecedente. Esto se llevó a cabo aislando DNA cromosomal de las cepas PA710 y PA714 y utilizando cada uno de los dos DNA por separado para transformar PA715, con selección para resistencia a tetraciclina . Los transformantes resistentes a tetraciclina fueron tamizados para la sensibilidad a cloranfenicol ; esto identifica los transformantes deseados que también hayan adquirido el gen P26 panEl del DNA donador por ligación con los casetes P26 panBpanD en el locus bpr. Se obtuvieron aislados sensibles a cloranfenicol obtenidos de las transformaciones en las cuales se utilizó DNA cromosomal de PA710 ó PA714. Se rescataron los aislados que produjeron los títulos más elevados de pantotenato en los ensayos de cultivo en tubos de ensayo. Estas cepas fueron denominadas PA717 y PA721, respectivamente. Cultivos en tubos de ensayo duplicados de las nuevas cepas, así como de PA824 y PA715, fueron crecidos en SVY + 10 g/L de aspartato a 43 °C durante 48 horas y luego se ensayaron para pantotenato, HMBPA y ß-alanina. Además, los extractos de cada una de las cepas fueron corridos sobre un gel SDS-PAGE. Los resultados de los ensayos de los cultivos en tubos de ensayo se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Producción de pantotenato por las cepas PA717 y PA721 crecidas en SVY + 10 g/L de aspartato Cepa Cásete panBD [pan] [HMBPA] [ß-ala] (g/L) (g/L) (g/L) PA824 — 4.9 0.94 2.5 4.6 0.79 2.3 PA715 NINGUNO 1.7 <0.1 0.5 1.7 <0.1 0.4 PA717-24 P-AN670 4.8 0.34 1.3 4.9 0.40 1.3 PA721-35 P-AN674 5.7 0.50 1.4 5.3 0.40 1.3 PA721-39 P-AN674 4.1 0.38 2.0 4.6 0.40 2.2 Como se esperaba, cada una de las nuevas cepas produjo más pantontenato y ß-alanina que PA715. Dos de las cepas (PA717-24 Y PA721-39) produj eron aproximadamente tanto pantotenato como PA824, mientras que PA721-35 produjo más pantotenato que PA824. Las tres nuevas cepas produjeron menos HMBPA que PA824. El análisis en gel de proteina mostró que las tres nuevas cepas producen más PanB que cualquiera de las cepas control .

Las cepas PA717-24, PA721-35 y PA721-39 también se evaluaron en cultivos en matraces con agitación en un medio a base de harina de soya. Como se muestra en la Tabla 3, estas cepas con el cásete P26 panBpanD amplificable produjeron pantotenato y HMBPA en concentraciones semejantes a las concentraciones observadas con PA668-2 y PA668-24, las cuales contienen los casetes P26 panB y P2e panD amplificables, separados.

Tabla 3. Experimento en matraces con agitación durante 48 horas Condiciones: 40 mL de medio/matraz con agitación, con deflectores, de 200 mL, cubiertas 4X Bioshield, 300 rpm, 2.5% del inoculo (1.0 mL) .

Medio de soya: 20 g/L de harina de soya Cargill 200/20, 8 g/L de (NH4)2S04, 5 g/L de glutamato, Ix PSTE, fosfato 0.1 M pH 7.2 y MOPS 0.3 M pH 7.2 , 60 g/L de glucosa o maltosa con g 10 mM y Ca 1.4 mM. Promedio de matraces duplicados .

Además de producir pantotenato (asi como otros panto-compuestos representados en la Figura 1 y descritos en la presente) , se ha demostrado que algunas cepas manipuladas para producir cantidades comerciales de panto-compuestos deseados también producen un subproducto identificado como ácido 3- (2-hidroxi-3-metil-butirilamino) ropiónico (HMBPA) (también mencionado en la presente como ^-alanina-2- (R) -hidroxiisovalerato", "ß-alanina 2-hidroxiisovalerato", "P-alanil-a-hidroxiisovalerato" y/o "fantotenato") . (El término "fantotenato" también se abrevia como "fan" en la presente) .

El HMBPA es el producto de la condensación del ácido [R] -ot-hidroxiisovalérico (oc-HIV) y ß-alanina, catalizado por la enzima PanC. El a-HIV se genera por la reducción de a-KIV, una reducción que se cataliza por las oc-ceto reductasas PanE (por ejemplo, PanEl y/o PanE2) y/o IlvC. Asi pues, se ha propuesto que en los microorganismos existen al menos dos vias que compiten para a-KIV, el sustrato para la enzima biosintética PanB, a saber, la vía biosintética del pantotenato y la vía biosintética del HMBPA. (Una tercera y cuarta vias que compiten para oc-KIV son aquellas que conducen a la producción de valina o leucina a partir de oc-KIV, véase por ejemplo la Figura 1) . Al menos la vía biosintética de pantotenato y la vía biosintética de HMBPA además producen sustratos competitivos para la enzima PanC, a saber oc-HIV y pantoato. La producción de HMB A puede tener efectos importantes sobre la producción de pantotenato. Por ejemplo, la vía del HMBPA puede competir con la via del pantotenato para los precursores (oc-KIV y ß-alanina) y para algunas de las enzimas (PanC, PanD, PanEl y/o IlvC) . Además, debido a que la estructura del HMBPA es semejante a la del pantotenato, éste puede tener la propiedad no deseada de regular negativamente uno o más pasos en la via del pantotenato. Con base en la identificación del HMBPA, la Solicitud de Patente provisional US Serie No. 60/262,995 enseña que la producción de pantotenato puede mejorarse ó hacerse óptima por cualquier medio que favorezca el uso de los sustratos (a-KIV y ß-alanina) y/o enzimas (PanC, PanD, PanEl y/o IlvC) en los procesos biosintéticos de pantotenato en comparación con los procesos biosintéticos de HMBPA.

Ejemplo II: Aumento de la producción de pantotenato aumentando la disponibilidad de serina Al menos un método para optimizar la producción de pantotenato involucra la regulación de la disponibilidad de serina en los cultivos de microorganismos. En particular, se puede demostrar que el aumento de la disponibiliad de serina conduce a producción aumentada de pantotenato (por ejemplo en relación con la producción de HMBPA) , mientras que la disminución de la disponibilidad de serina conduce a la producción disminuida de pantotenato en relación con la producción de HMBPA. Este método se basa en la comprensión que el compuesto, metilentetrahidrofolato (MTF) , que se obtiene de serina, define un grupo idroximetilo para a- IV durante la reacción biosintética de pantotenato para producir cetopantoato (véase, por ejemplo las Figuras 1 y 2) . Asi pues, la regulación de las concentraciones de serina es un medio para regular efectivamente las concentraciones de cetopantoato y, a su vez, regular la producción de pantoato y/o pantotenato en microorganismos adecuadadamente manipulados. Para demostrar esta regulación se hizo crecer PA824 en cultivos en tubos de ensayo de glucosa SVY más 5 g/L de ß-alanina y ± 5 g/L de serna durante 48 horas a 43°C.

Tabla 4 : Producción de pantotenato y HMBPA por PA824 con y sin la adición de serina Como se demuestra en los datos presentados en la Tabla 4, la adición de serina aumenta el grado de producción de pantotenato (disminuyendo al mismo tiempo la producción de HMBPA) .

Ejemplo III. Manipulación de células bacterianas con cantidades aumentadas de serina hidroximetil transferasa, el producto del gen glyA Como alternativa a la alimentación de serina, otro método para aumentar los niveles de serina y/o los niveles de utilización de serina (y por consiguiente los niveles de metilentetrahidrofolato) para regular los niveles de producción de pantotenato es aumentar la síntesis o la actividad de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa ó de serina hidroximetil transferasa (los productos del gen serA y Goya, respectivamente) , aumentando con ello la biosintesis de serina y metilentetrahidrofolato en microorganismos adecuadamente manipulados .

La expresión del gen Goya se aumentó transformando células de B. subtilis con un cásete de expresión que contenia el gen Goya de B. subtilis clonado corriente abajo de un promotor constitutivo fuerte. Para construir el cásete de expresión, se utilizaron los cebadores RY417 y RY418 como se representan en la Tabla 5 para amplificar el gen glyA por PCR a partir del DNA cromosomal aislado de B. subtilis PY79.

Tabla 5: Cebadores utilizados en la amplificación de glyA y serA de B . subtilis CCCTCTAGAGGAGGAGAAAAC&TGTTTCGAGXATTGGTC RY405 TCAGACAAAATG SEQ ID NO:20 CCCGGATCCAArTATGGCAGAXCAAXGAGCXTCACAGAC RY406 ACAA SEQXD NO:21 GGAT TAGAGGAGGTGTA^CMSJAAACATTTACGTGCG RY4L7 CAAGACGAA SEQ E> NO:22 CGGGGATCCCCC¾TCAAC5\ATTAC3lCACTTCiaTTGñ X RY4Í8 GTAC SEQ ID N0:23 RY417 contiene el sitio de unión al ribosoma sintético RBS2 justo corriente abajo de un sitio Xbal. El DNA amplificado entonces se cortó con Xbal y BamHI y se clonaron entre los sitios Xbal y BamHI en el vector pAN004 (Figura 5) para producir el plásmido pA 396 (Figura 6; SEQ ID NO: 24) . El vector pA 004 contiene el promotor fago SP01 P26 inmediatamente corriente arriba del sitio de clonación Xbal para impular la expresión del gen glyA clonado. Justo corriente abajo del cásete de expresión, pAN396 contiene un gen cat que funciona en B. subtilis. Para transformar B. subtilis el fragmento Noti DNA que contiene el cásete P26 glyA y el gen cat se aisló de pAN396, se autoligó y transformó en células competentes de B. subtilis PY79. Algunos transformantes resistentes a cloranfenicol fueron elegidos y denominados PA1007 y PA1008. El DNA cromosomal se aisló de cada una de estas cepas y se utilizó para transformar células competentes de PA721B-39 y PA824 para producir células PAlOll y PA1014, respectivamente. La electroforesis en gel de SDS poliacrilamida de los extractos celulares de los aislados seleccionados de PAlOll y PA1014 confirmaron que estas cepas contenían cantidades aumentadas del producto del gen glyA en comparación con sus cepas progenitoras PA721B-39 (descrita en el Ejemplo I) y PA824 (descrita en la Patente Internacional No. O 01/21772) .

Para probar el efecto del aumento en la expresión de glyA sobre la producción de pantotenato, se hicieron crecer PA1011 y PA1014 en cultivos en tubos de ensayo de glucosa SVY más 5 g/L de ß-alanina a 43°C durante 48 horas. Como se muestra por los datos de la Tabla 6, PA1014 produjo más pantotenato (4.5 g/L) que su cepa progenitora PA824 (3.2 g/L) . Del mismo modo, PA1011 produjo en promedio más pantotenato (4.35 g/L) que su cepa progenitora PA721B-39 (4.05 g/L) .

Tabla 6. Producción de pantotenato y HMBPA por PA1011 y PA1014 en comparación con PA721B-39 y PA824 Cepa DOeoo Pantotenato HMBPA g/L g/L PA101 #1 14 4.5 0.27 PA101 #2 15 4.5 0.31 PA824 16 3.1 0.31 PA824 15 3.3 0.28 PA1011 #1 17 4.5 0.24 PA1011 #2 12 4.2 0.27 PA721B-39 18 4.0 0.22 PA721B-3 16 4.1 0.25 Manipulación de células bacterianas con cantidades aumentadas de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa , el producto del gen serA El producto del gen serA, 3-fosfoglicerato deshidrogenase, es la primera enzima comprometida en la vía de la biosíntesis de serina (véase la Figura 2) . Puesto que la serina es uno de los sustratos para la síntesis de MTF, manipulamos la sobreexpresión del gen serA para aumentar las concentraciones de serina en la célula. De la misma manera que se describió en lo anterior para el gen glyA en el Ejemplo III, la expresión del gen serA se aumentó transformando las células de B. subtilis con un cásete de expresión que contenia el gen serA de B. subtilis clonado corriente abajo de un promotor constitutivo, fuerte. Para construir el c sete de expresión se utilizaron los cebadores RY405 y RY406 representados en la Tabla 1 para amplificar el gen serA utilizando PCR a partir del DNA cromosomal aislado del B. subtilis PY79. El DNA amplificado luego se cortó con Xbal y BamHI y se clonó entre los sitios Xbal y BamHI en el vector pAN004 (Figura 5) para producir el plásmido pAN393 (Figura 7; SEQ ID NO: 25) . Para transformar B. subtilisr el fragmento NotJ DNA que contenía el cásete P?6 serA y el gen cat se aisló de pAN393, se autoligó y transformó en células competentes de B. subtilis PY79. Algunos transformantes resistentes a cloranfenicol fueron seleccionados y denominados PA1004 y PA1005. El DNA cromosomal se aisló de cada una de estas cepas y se utilizó para transformar células competentes de PA721B-39 y PA824 para producir cepas PA1010 y PA1013, respectivamente. La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de los extractos celulares de los aislados seleccionados de PA1010 y PA1013 confirmó que estas cepas contenían cantidades aumentadas del producto del gen serA en comparación con sus cepas progenitoras PA721B-39 y PA824.

Para probar el efecto de la creciente expresión de serA sobre la producción de pantotenato, se hicieron crecer PA1010 y PA1013 en cultivos en tubos de ensayo de glucosa SVY más 5 g/L de ß-alanina a 43 °C durante 48 horas. Como se muestra en los datos presentados' en la Tabla 7, PA1010 produjo en promedio más pantotenato (4.7 g/L) que su cepa precursora PA721B-39 (4.1 g/L). Del mismo modo, PA1013 produjo en promedio más pantotenato (4.1 g/L) que su cepa precursora PA824 (3.1 g/L) .

Tabla 7. Producción de pantotenato y ????? por PA1010 y PA1013 en comparación con PA721B-39 y PA824 Ejemplo V. Experimentos en matraz con agitador y Termentador con cepas que tienen expresión aumentada de ser y glyA Con base en el desempeño en los tubos de ensayo, dos cepas con un cásete amplificable serA y dos cepas con un cásete amplificable glyA fueron seleccionadas en cada uno de dos precursores, PA824 y PA721B-39. Las cuatro cepas fueron crecidas junto con los precursores en matraces con agitación (Tabla 8) . En medio de harina de soya MOPS glucosa (SMG) , las cuatro cepas produjeron más pantotenato que sus cepas precursoras . En medio harina de soya MOPS maltosa (SMM) una de las cuatro cepas pareció ser superior a la cepa precursora.

La cepa que sobreexpresaba serA y la cepa que sobreexpresaba glyA de cada precursor se corrieron simultáneamente en fermentadores Chemap de 10 litros. La cepa que sobreexpresaba glyA procedía de PA824, PA1014-3, que había dado el título más alto de pantotenato en SMM, también tuvo el mejor desempeño en los termentadores (Tabla 9) . La cepa PAl 014-3 produjo 71 g/L de pantotenato en 36 horas en el sobrenadante del cultivo y 86 g/L de pantotenato en 48 horas en el sobrenadante del cultivo comparado con el precursor PA824 que produjo 41 g/L y 46 g/L de pantotenato, respectivamente. La cepa de serA, PAl012-4, también produjo mucho más pantotenato que el control PA824 en el sobrenadante del cultivo, 52 g/L y 60 g/L a 36 y 48 horas, respectivamente. Estos resultados demuestran claramente la eficacia de aumentar glyA y serA.

Los derivados que sobreexpresan serA y que sobreexpresan glyA de PA721B-39 fueron evidentemente mejorados sobre sus cepas precursoras también. Ambos produjeron aproximadamente 80 g/L de pantotenato (82 g/L y 79 g/L, respectivamente) en los sobrenadantes del cultivo en 48 horas. El efecto de los niveles aumentados de PanB en los derivados de ??721?-39 contra os derivados de PA824 se manifiesta por si mismo en la reducción de HMBPA. PA721B-39 y sus derivados producen menos HMBPA después de 48 horas comparados con PA824 o incluso PA668-24. El aumento de GlyA también parece reducir el flujo de carbono a HMBPA.

Tabla 8. Evaluación de la producción de pantotenato matraz con agitación de cepas que sobreexpresan serA g-lyA Todos los datos son el promedio de los matraces con agitación duplicados, después de 48 horas.

Condiciones: 40 mL de medio/matraz con agitación y deflectores, de 200 mL, cubiertas 4X Bioshield, 300 rpm, 2.5 % de inoculo y 43°C. Medio: 20 g/L de harina de soya Cargill 200/20, 1 x PSTE, 8 g/L de (NH4)2S04 y 5 g/L de glutamato. Búfer: fosfato 0.1 M pH 7.2 y MOPS 0.3 M pH 7.2. Fuente de carbono (esterilizada por separado como 20 x stock) : 60 g/L de glucosa o maltosa como Mg 10 mM y Ca 1.4 mM.

Tabla 9. Evaluaciones de la producción de pantotenato un fermentador de 10 litros con cepas que sóbreexpre serA ó glyA Corrida Cepa Precursor Cásete HMBPA (g/L) Pantotenato adicionado (g/D 36 h 40 h 36 h 40 h P285 PA824 18 25 41 46 P284 PA1012-4 PA824 serA 20 21 52 60 P286 PA1014-3 PA824 glyA 14 16 71 86 P259 PA721B-39 4 5 34 42 P287 PA1010-6 PA721B-39 serA 4 5 65 82 P289 PA1011-2 PA721B-39 glyA 2 3 56 79 P275 PA668-24 PA824 3 9 55 72 El medio utilizado es PFM-•222. Este es el mismo que el medio PFM-155 descri o en US Serie No. 60/262 , 995 (presentada el 19 de enero de 2001) excepto por los siguientes ; cambios : (1) en el material del lote : no hay Amberex 1003 Cargill 200/20 (harina de soya) 40 g/L se ha cambiado a Cargill 20/80 (sémola de soya) 50 gL, MgS04-7H20 se sustituyó con MgCl2-7H20, 1 g/L, y SM-1000X se sustituyó con PSTE-1000X (PSTE-1000X = MnCl2-4H20, 2.0 g/L; ZnS04-7H20, 1.5 g/L; CoCl2-6H20, 2.0 g/L; CuS04-5H20, 0.25 g/L; Na2Mo0 · 2H20, 0.75 g/L). En el material alimentado: SM-1000X se sustituyó con PSTE-1000X.

La producción creciente de pantotenato también se obtuvo combinando la sobreexpresión de serA y glyA en una sola cepa, y/o introduciendo una mutación que originó serA ó glyA, o ambos, resistentes a realimentación.

Ejemplo VI. Aumento de la expresión del gen glyA por mutación del gel purR Como se describe en los Ejemplos III y V, la expresión del gen glyA puede aumentarse adicionando una o más copias de un cásete en el cual el cásete glyA sea impulsado por un promotor constitutivo, fuerte. Otro método para aumentar la expresión de glyA es alterar su regulación. La literatura que describe una fusión glyA: :lacZ sugiere que el promotor glyA sea de intensidad moderada en las condiciones normales (aproximadamente 400 unidades Miller) , pero que este promotor sea capaz de ser inducido a niveles relativamente altos (1800 unidades Miller) si su regulador negativo, el gen purR, se deleciona (Saxild y col. (2001) J. Bacterial. 183: 6175-6183) . Por tanto, se realizaron experimentos para determinar si la expresión de glyA, y la producción consiguiente de pantotenato se podía aumentar delecionando purR a partir de una cepa productora de pantotenato.

El gen purR de B. subtilís se amplificó por PCR a partir del DNA cromosomal de PY79, y el fragmento resultante se clonó en el DNA vector pGEM5-Zf (+) clivado por PvuII para obtener el plásmido pAN835F (SEQ ID NO: 26, Figura 8) . Este paso eliminó los sitios PvuII en ambos extremos de la inserción, dejando un sitio PvuII único en medio del marco de lectura abierto de purR. A continuación, un fragmento romo del DNA de la PCR que contenía el gen de resistencia para canamicina gram positivo de pAN363F (SEQ ID NO: 27) se ligó en este sitio PvuII único de p7AN835F para obtener pAN838F (SEQ ID NO: 28, Figura 9) . pAN838F entonces se transformó en PY79, PA668-24 y PA824, seleccionando para resistencia a canamicina a 10 mg/L para obtener nuevas series de cepas denominadas PA1059, PA1060 y PA1061, respectivamente. Se demostró por PCR que todos los nuevos aislados contenían el alelo purR: :kan con disrupción lo que se esperaba de un suceso de cruzamiento doble. Se probaron algunos aislados de PA1060 y PA1061 para la producción de pantotenato en cultivos en tubos de ensayo crecidos en SVY glucosa más ß-alanina (Tabla 10) . Los mejores aislados obtenidos de PA668-24, PA1060-2 y PA1060-4, dieron un mejoramiento desde 3.0 g/L de pantotenato hasta 5.3 a 5.1 g/L, respectivamente, el cual es un aumento de 75%. Del mismo modo, los mejores aislados obtenidos de PA824, PA1061-1 y PA1061-2, dieron un aumento de aproximadamente 3.1 g/L a 5.4 g/L, también una ganancia de 75%. Estos resultados sugieren que el gen glyA es inducido considerablemente en estas nuevas cepas por disrupción del gen purR. De otro modo, los mejoramientos en la producción de pantotenato en PA1060 y PA1061 pueden deberse a efectos pleiotrópicos más complejos. En cualquier caso, la desregulación del reguión purR tiene un efecto positivo sobre la producción de pantotenato.

En otras modalidades, la disrupción de purR puede instalarse en otras cepas productoras de pantotenato, por ejemplo aquellas que tengan un alelo ¿ffSe A integrado o más de una copia del operón P26panBCD . El gen purR también puede utilizarse como un sitio para la adición de los casetes de expresión deseados, como puede ser P26panB . También es posible utilizar la resistencia a los análogos de guanina, como 8-azaguanina, como una selección para una mutación de purR.

Tabla 10. Producción de pantotenato y fantotenato por los derivados de PA824 y PA668-24 que contienen disrupcion de purR, en cultivos en tubos de ensayo crecidos en SVY glucosa más 5 g/L de ß-alanina b . d . = por debaj o de la detección Concentración de los antibióticos en la caja de petri de la cual se tomó la colonia del inoculo Ejemplo VII. Sobreexpresion del gen serA a partir de un cásete no amplificable Este ejemplo describe otro método para aumentar la producción de serina, en el cual un procedimiento de 2 pasos deposita un promotor con constitutivo, fuerte (¾_;) enfrente del gen serA crornosorna1. Se construyeron dos plásmidos, cada uno con un contenido aproximado de 700 pares de bases de la secuencia de DNA procedente de la región inmediatamente corriente arriba del gen serA nativo. El primer plásmido, pAN821, también contiene la mitad 3f de la región codificante de serA, y entre las dos secuencias antes mencionadas, un gen de resistencia a canamicina (SEQ ID NO: 30, Figura 10) . Cuando se transforma en B. subtílis, seleccionado para resistencia a canamicina, pAII821 dará una disrupción del gen serA, dando origen a la auxotrofia de serina. Esto crea una secuencia genética denominada el alelo AserA: :kan.

El segundo plásmido, diseñado para introducir la estructura P2eser , fue construido insertando la secuencia corriente arriba de serA en el extremo 5' del promotor P2e en pAN395. El plásmido resultante, pAN824, se muestra en la Figura 11 (SEQ ID NO: 31) . El plásmido pAN395 es semejante a pAN393 descrito en el Ejemplo IV. El marco de lectura abierto del gen serA se sintetizó por PCR utilizando DNA PY79 de B. subtilis como el modelo. El cebador corriente arriba contiene un sitio Xbal y un sitio de unión al ribosoma sintético moderadamente fuerte, RBS2. El cebador corriente abajo contiene un sitio BamRI . Este marco de lectura abierto serA se utilizó para sustituir los genes panBCD en el plásmido con número de copias medio, pAN006, para obtener pAN395 (SEQ ID NO: 29, Figura 12) . Este plásmido contiene el gen sexA expresado a partir del promotor ??6 Y el sitio de unión al ribosoma RBS2.

El alelo AserA: :kan de pAN821 se introdujo en la cepa PA824 para obtener PA1026. Como se esperaba, PA1026 no creció en medio mínimo. En el segundo paso, el cásete P2SserA del plásmido pAN824 se introdujo en PA1026, seleccionando para prototrofía de serina, para obtener la cepa PA1028. Por PCR diagnóstica se confirmó que varios aislados de PA1028 tenían la estructura cromosomal esperada (P26serA) . Estos aislados luego se probaron para la producción de pantotenato en cultivos en tubos de ensayo crecidos durante 48 horas en SVY más 5 g/L de ß-alanina (Tabla 11) . Los aislados de PA1028 (obtenidos de PA824) dieron aumentos desde 10% hasta 25% en la producción de pantotenato. Como se muestra en la Tabla 12, en experimentos en matraces en agitación, PA824 produjo aproximadamente 7 g/L de pantotenato, mientras que PA1028 produjo 11 g/L.

Ejemplo VIII. Construcción de cepas productoras de pantotenato que contienen un cásete P2eserA no amplificable, integrado, y un cásete Pseglyü. amplificable Puesto que un cásete P26serA no amplificable integrado a serA condujo a mayor síntesis de pantotenato (véase, por ejemplo, la Tabla 12) , y puesto que un cásete P26<3ly& amplificable, resistente a cloranfenicol en glyA dio origen a una síntesis de pantotenato mucho mayor (véase por ejemplo PA1014-3, Tabla 8), se propuso que podría ser sinérgica una combinación de los dos. La cepa PA1028-4, que es un derivado de PA824 que contiene el cásete P?6serA no amplificable, integrado en serA, se transformó a resistencia a cloranfenicol -en 5 mg/L utilizando DNA cromosomal de PA1014-3 para obtener una serie de cepas denominadas PA1038, que ahora contienen el cásete P2eglyA amplificable, para resistencia a cloranfenicol . Los aislados de PA1038 fueron probados para la producción de pantotenato utilizando cultivos en tubos de ensayo normalizados crecidos en SVY más ß-alanina (Tabla 13) . Como se esperaba, PA1038 mostró un aumento drástico en la producción de pantotenato de aproximadamente 4.2 g/L por ??824 a 6.6-7.5 g/L por la serie de PA1038. PA1038-3 y PA1038-12 aislados además se probaron en matraces con agitación como se muestra en la Tabla 12. Ambos produjeron un promedio de 13.6 g/L de pantotenato, en comparación con 7.4 g/L de pantotenato producido por PA824.

Tabla 11. Producción de pantotenato y fantotenato por los derivados de PA824 que contienen una sola copia de PzeserA en el locus de serAr en cultivos en tubos de ensayo de 48 horas crecidos en SVY más 5 g/L de ß-alanina Cepa Precursor DO600 [fan] g/L [pan] g/L PA824 17 0.44 4.0 PA824 15 0.45 4.0 PA1028-1 PA28 13 0.46 4.4 PA1028-2 18 0.49 4.9 PA1028-3 15 0.44 4.4 PA1028-4 13 0.43 4.5 PA1028-5 14 0.45 4.4 PA1028-6 11 0.43 4.8 PA1028-8 15 0.51 5.0 Tabla 12. Evaluación de la producción de pantotenato en matraces con agitación de cepas que sobreexpresan serA y/o glyA Cepa Precursor Cásete de Cásete de serA Fantotenato Pantotenato glyA (g/L) (g/D PA284 0.6 7.4 PA1014 -3 PA824 N X P26 glyA 0.7 12.0 PA1028 -4 PA824 P26 serA @ serA 0.8 11.1 PA1038 -3 PA1028-4 N X P26 glyA P26 serA @ serA 0.5 13.6 PA1038 -12 PA1028-4 N X P26 glyA P26 serA @ serA 0.6 13.6 Todos los datos son el promedio de los matraces con agitación duplicados después de 48 5 horas. Condiciones: 40 mL de medio/matraz con agitación, con deflectores, de 200 mL, cubiertas 4X Bioshield, 300 rpm, 2.5% del inoculo y 43°C. Inoculo: SVY base con maltosa, 24 horas a 43°C. Medio: 20 g/L de harina de soya Cargill 200/20, 8 g/L (NH4)2S0 , 5 g/L de glutamato y lx 10 PSTE Búfer: fosfato 0.1 M pH 7.2 y MOPS 0.3 M pH 7.2. Fuente de carbono: (Esterilizado por separado como 20X stock); 30 g/L de maltosa, MgCl2 5 mM y CaCl2 0.7 mM.

Tabla 13. Producció de pantotenato por PA1038, un derivado de PA824 que contiene un cásete Pz6serA no amplificable en serA y un cásete Pz6glyA amplificable en glyA Cepa Inoculo medio DO600 [fan] g/L [pan] g/L PA824 tet 15 16 0.56 4.4 PA824 14 0.59 4.3 PA82 tet 15 12 0.57 4.3 PA82 14 0.58 4.2 PA1038-3 cam 5, tet 15 16 0.47 7.2 PA1038-4 14 0.49 7.0 PA1038-5 15 0.52 7.0 PA1038-6 15 0.51 7.2 PA1038-9 14 0.56 7.2 PA1038-11 13 0.49 6.6 PA1038-12 16 0.58 7.5 Los cultivos en los tubos de ensayo fueron crecidos con SVY glucosa más 5 g/L de ß-alanina a 43°C durante 48 horas .

Ejemplo IX. Aumento en la producción de MTF alterando la via del clivaje de glicina Como se demuestra en los ejemplos anteriores, el aumento en la producción de MTF en bacterias aumenta la producción de pantotenato en cepas que han sido manipuladas para producir más pantotenato mediante la manipulación de los genes panBCD y/o panE. Se ha demostrado que la producción de pantotenato puede aumentarse incrementando la expresión del gen glyA o el serA. Es posible aumentar promotores más fuertes o sitios de unión al ribosoma para aumentar la expresión de glyA o serA como se demuestra en los Ejemplos III a V y VII a VIII. De otro modo, es posible desregular la expresión del gen glyA en Bacillus mediante la disrupción del gen represor purR como se muestra en el Ejemplo VI.

Otro método para aumentar la producción de MTF es favorecer la expresión de enzimas de la vía del clivaje de glicina. Por ejemplo, las enzimas codificadas por los genes gcvT'r gcvPA, gcvPB, gcvH y pdhD catalizan el rompimiento de glicina a MTF, C02 y NH3. Un promotor constitutivo, fuerte, como pude ser el promotor P2e del fago SP01 antes descrito puede clonarse enfrente del operón gcvT-gcvPA-gcvPB o enfrente del gen gcvH ó pdhD para favorecer su expresión. Además de los enfoques antes mencionados, más glicina, que es no costosa, puede adicionarse al medio para favorecer más la producción de MTF por cualquier cepa manipulada como se describe en la presente .

Equivalentes Los expertos en la técnica se darán cuenta, o podrán averiguar utilizando no más que experimentación habitual, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención en la presente descritas. Estos equivalentes están propuestos para estar comprendidos por las siguientes cláusulas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Basf Aktiengesellschaft <120> MICROORGANISMOS Y PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN AUMENTADA DE PANTOTENATO <130> BGI-154PC <150> 60/393826 <151> 2002-07-03 <160> 31 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 194 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia promotora <220> <221> -35_señal <222> (136) .. (141) <220> <221> -10_señal <222> (159) .. (164) <400> 1 gctattgacg acagctatgc ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg gcaaccccgc ctgt <210> 2 <211> 163 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia promotora <220> <221> -35_señal <222> (113) .. (118) <2 0> <221> -10_señal <222> (136) .. (141) <400> 2 gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60 tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120 atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc 163 <210> 3 <211> 127 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia promotora <220> <221> -35_señal <222> (34) .. (39) <220> <221> -10_señal <222> (58) .. (63) <220> <221> -35_señal <222> (75) .. (80) <220> <221> -10_señal <222> (98) .. (103) <400> 3 gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga tgcaatg <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 4 taaacatgag gaggagaaaa catg 2 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 5 attcgagaaa tggagagaat ataatatg 2 <210> 6 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 6 agaaaggagg tga 13 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitie de unión del ribosoma <220> <221> misc_feature <222> 17, 18, 19, 20 <223> n = a, t, c, ó g <400> 7 ttaagaaagg aggtgannnn atg 23 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <221> misc_feature <222> 16, 17, 18, 19, 20 <223> n = a, c, t, ó g <400> 8 ttagaaagga ggtgannnnn atg 23 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <221> misc_feature <222> 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 <223> n = a, c, t, ó g <400> 9 agaaaggagg tgannnnnnn atg 2 <210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial . <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <220> <221> misc_feature <222> 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> n = a, c, t, ó g <400> 10 agaaaggagg tgannnnnna 22 <210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 11 ccctctagaa ggaggagaaa acatg 25 <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 12 ccctctagag gaggagaaaa catg 24 <210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 13 ttagaaagga ggatttaaat atg 23 <210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 14 ttagaaagga ggtttaatta atg 23 <210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 15 ttagaaagga ggtgatttaa atg 23 <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 16 ttagaaagga ggtgtttaaa atg 23 <210> 17 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 17 attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg 28 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoma <400> 18 attcgagaaa ggaggtgaat aataatg 27 <210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sitio de unión del ribosoirta <400> 19 attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28 <210> 20 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: primer o cebador de PC 5' <223> para el gen serA <400> 20 ccctctagag gaggagaaaa catgtttcga gtattggtct cagacaaaat g 51 <210> 21 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: primer o cebador de PCR 3' <223> para el gen serA <400> 21 cccggatcca attatggcag atcaatgagc ttcacagaca caa 43 <210> 22 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: primer o cebador de PCR 5' <223> para el gen glyA <400> 22 ggatctagag gaggtgtaaa catgaaacat ttacctgcgc aagacgaa 48 <210> 23 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: primer o cebador de PCR 3' <223> para el gen glyA <400> 23 cggggatccc ccatcaacaa ttacacactt ctattgattc tac 43 <210> 24 <211> 7925 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Plásrr.ido de sobreexpresión <223> serA <400> 24 gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60 ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120 gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180 aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240 tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300 ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360 gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420 ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480 tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540 cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600 aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660 tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720 cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780 tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840 ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900 ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960 aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020 tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080 ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140 ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200 tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260 actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320 acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380 accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440 atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatccaat tatggcagat 1500 caatgagctt cacagacaca atatcaggga catttgttag ttctttcaca attttatctt 1560 ccagatgtct gtcaaaggaa agcatcatga tggcttctcc gcctttttcc ttacggccaa 1620 cctgcatagt tgcaatgtta atatcattat ctccgagaat acgtcctact cggccgatga 1680 cacctgttgt atcttgatgc tggatataca ccaagtgacc agtcggataa aaatcaatat 1740 taaatccatt gatctcgaca attcgttctc cgaaatgagg aatatacgta gccgttacag 1800 taaaggtgct gcggtctcct gtcactttta cgctgatgca gttatcgtat ccagattcag 1860 aagaggaaat tttttcactg aagctaatgc cgcgttcttt tgcgacaccc ccggcattga 1920 cctcattaac agtagagtct acgcgcggtt ttaaaaagcc tgacagaagg gcttttgtaa 1980 tgaacgatgt ttcaagttta gcaattgtgc cttcatattg aatggcaaca tcctgtactg 2040 gttctttcat gcactgtgat acaaggctgc caatttttcc tgcaatttga tggtaaggct 2100 taattttagc aaattcatct tttgtcatgg caggcaggtt gatagctgac atgacaggca 2160 ggccttttgc gaactgcaga acttcttctg acacttgggc ggcgacattg agctgtgctt 2220 ctttcgttga tgctcccaag tgaggagtgg caatgactaa tggatgatca acaagtttgt 2280 tgtcaactgg cggttcgact tcgaaaacgt caagcgctgc tcccgcaaca tgcccgtttt 2340 ccaaagcttc gagaagtgct gcttcatcga taattccgcc tcgcgcacag ttaattaagc 2400 gaacgccttt tttcgttttt gcaatcgttt ctttattcaa taagcctttt gtttcttttg 2460 ttaaaggcgt gtgaacggta atgatatccg cactttcaag cacttcttca aatgtacg'gc 2520 tgtttacgcc gatttttttc gctctttctt ccgttaagaa aggatcaaaa acgtgcacag 2580 tcataccgaa cgctcctcga cgctgtgcaa tttcacttcc gattcggcct aatcctacaa 2640 taccaagcgt ttttccataa agctctgaac cgacataagc tgtgcggttc cactctctgg 2700 atttcactga gatattagcc tgcggaatgt gtctcattaa agaagagatc attgcaaatg 2760 tatgctcagc tgtcgaaatg gtgttgccgt tcggagcatt gatcacgatt accccgtgtt 2820 tcgtagcctc atcaatatcg atattatcga caccgacacc ggctcttccg acaattttta 2880 aagaagtcat tttgttgaaa aggtcttctg ttacttttgt cgcgcttcgc accaaaagag 2940 catcaaaagt atgtaattca tcttctgcat ctgctacgtt tttttgaacg atttcaataa 3000 agtctgattc aataagtggc tgtaaaccgt cgttgctcat tttgtctgag accaatactc 3060 gaaacatgtt ttctcctcct ctagagcgtc ctgctgttgt taagattatt ataccacacc 3120 ttgtagataa agtcaacaac tttttgcaaa atttttcagg aattttagca gaggttgttc 3180 tggatgtaga acaaaacatc tttccgctct tgtgctgtta ggatatcttt cttggaagct 3240 aggtaggcct cgagttatgg cagttggtta aaaggaaaca aaaagaccgt tttcacacaa 3300 aacggtcttt ttcgatttct ttttacagtc acagccactt ttgcaaaaac cggacagctt 3360 catgccttat aactgctgtt tcggtcgaca agcttcgcga agcggccgca aaattcactg 3420 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3480 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3540 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3600 catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3660 gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg actatgcttg taaaccgttt 3720 tgtgaaaaaa tttttaaaat aaaaaagggg acctctaggg tccccaatta attagtaata 3780 taatctatta aaggtcattc aaaaggtcat ccaccggatc agcttagtaa agccctcgct 3840 agattttaat gcggatgttg cgattacttc gccaactatt gcgataacaa gaaaaagcca 3900 gcctttcatg atatatctcc caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata 3960 aaagcagact tgacctgata gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc 4020 ttgagttaag ccgcgccgcg aagcggcgtc ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc 4080 cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc 4140 gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca agtatgacgg 4200 gctgatactg ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga 4260 ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat 4320 cgccagccca gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata 4380 g'atcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc 4440 tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga 4500 agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg 4560 gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa 4620 tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg 4680 ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca 4740 ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc 4800 gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc 4860 tcatgatgtt taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg ttgctgctcc 4920 ataacatcaa acatcgaccc acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc cgaggcatag 4980 actgtacccc aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac 5040 cgctgcgttc ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgagcg catacgctac ttgcattaca 5100 gcttacgaac cgaacaggct tatgtccact gggttcgtgc cttcatccgt ttccacggtg 5160 tgcgtcaccc ggcaaccttg ggcagcagcg aagtcgaggc atttctgtcc tggctggcga 5220 acgagcgcaa ggtttcggtc tccacgcatc gtcaggcatt ggcggccttg ctgttcttct 5280 acggcaaggt gctgtgcacg gatctgccct ggcttcagga gatcggaaga cctcggccgt 5340 cgcggcgctt gccggtggtg ctgaccccgg atgaagtggt tcgcatcctc ggttttctgg 5400 aaggcgagca tcgtttgttc gcccagcttc tgtatggaac gggcatgcgg atcagtgagg 5460 gtttgcaact gcgggtcaag gatctggatt tcgatcacgg cacgatcatc gtgcgggagg 5520 gcaagggctc caaggatcgg gccttgatgt tacccgagag cttggcaccc agcctgcgcg 5580 agcaggggaa ttgatccggt ggatgacctt ttgaatgacc tttaatagat tatattacta 5640 attaattggg gaccctagag gtcccctttt ttattttaaa aattttttca caaaacggtt 5700 tacaagcata acgggttttg ctgcccgcaa acgggctgtt ctggtgttgc tagtttgtta 5760 tcagaatcgc agatccggct tcaggtttgc cggctgaaag cgctatttct tccagaattg 5820 ccatgatttt ttccccacgg gaggcgtcac tggctcccgt gttgtcggca gctttgattc 5880 gataagcagc atcgcctgtt tcaggctgtc tatgtgtgac tgttgagctg taacaagttg 5940 tctcaggtgt tcaatttcat gttctagttg ctttgtttta ctggtttcac ctgttctatt 6000 aggtgttaca tgctgttcat ctgttacatt gtcgatctgt tcatggtgaa cagctttaaa 6060 tgcaccaaaa actcgtaaaa gctctgatgt atctatcttt tttacaccgt tttcatctgt 6120 gcatatggac agttttccct ttgatatcta acggtgaaca gttgttctac ttttgtttgt 6180 tagtcttgat gcttcactga tagatacaag agccataaga acctcagatc cttccgtatt 6240 tagccagtat gttctctagt gtggttcgtt gtttttgcgt gagccatgag aacgaaccat 6300 tgagatcatg cttactttgc atgtcactca aaaattttgc ctcaaaactg gtgagctgaa 6360 tttttgcagt taaagcatcg tgtagtgttt ttcttagtcc gttacgtagg taggaatctg 6420 atgtaatggt tgttggtatt ttgtcaccat tcatttttat ctggttgttc tcaagttcgg 6480 ttacgagatc catttgtcta tctagttcaa cttggaaaat caacgtatca gtcgggcggc 6540 ctcgcttatc aaccaccaat ttcatattgc tgtaagtgtt taaatcttta cttattggtt 6600 tcaaaaccca ttggttaagc cttttaaact catggtagtt attttcaagc attaacatga 6660 acttaaattc atcaaggcta atctctatat ttgccttgtg agttttcttt tgtgttagtt 6720 cttttaataa ccactcataa atcctcatag agtatttgtt ttcaaaagac ttaacatgtt 6780 ccagattata ttttatgaat ttttttaact ggaaaagata aggcaatatc tcttcactaa 6840 aaactaattc taatttttcg cttgagaact tggcatagtt tgtccactgg aaaatctcaa 6900 agcctttaac caaaggattc ctgatttcca cagttctcgt catcagctct ctggttgctt 6960 tagctaatac accataagca ttttccctac tgatgttcat catctgagcg tattggttat 7020 aagtgaacga taccgtccgt tctttccttg tagggttttc aatcgtgggg ttgagtagtg 7080 ccacacagca taaaattagc ttggtttcat gctccgttaa gtcatagcga ctaatcgcta 7140 gttcatttgc tttgaaaaca actaattcag acatacatct caattggtct aggtgatttt 7200 aatcactata ccaattgaga tgggctagtc aatgataatt actagtcctt ttcctttgag 7260 ttgtgggtat ctgtaaattc tgctagacct ttgctggaaa acttgtaaat tctgctagac 7320 cctctgtaaa ttccgctaga cctttgtgtg ttttttttgt ttatattcaa gtggttataa 7380 tttatagaat aaagaaagaa taaaaaaaga taaaaagaat agatcccagc cctgtgtata 7440 actcactact ttagtcagtt ccgcagtatt acaaaaggat gtcgcaaacg ctgtttgctc 7500 ctctacaaaa cagaccttaa aaccctaaag gcttaagtag caccctcgca agctcgggca 7560 aatcgctgaa tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc tgagtcgctg tctttttcgt 7620 gacattcagt tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg ggggtaaatg gcactacagg 7680 cgccttttat ggattcatgc aaggaaacta cccataatac aagaaaagcc cgtcacgggc 7740 ttctcagggc gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta tctgactttt tgctgttcag 7800 cagttcctgc cctctgattt tccagtctga ccacttcgga ttatcccgtg acaggtcatt 7860 cagactggct aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca acaggcttac ccgtcttact 7920 gtcaac 7926 <210> 25 <211> 7701 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Plásmido de sobreexpresión <223> -glyA <400> 25 gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60 ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120 gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180 aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240 tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300 ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360 gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420 ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480 tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540 cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600 aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660 tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720 cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780 tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840 ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900 ccaattttcg tttgttgaac- taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960 aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020 tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080 ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140 ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200 tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260 actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctc cgcatg gggagacccc 1320 acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380 accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440 atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatccccc atcaacaatt 1500 acacacttct attgattcta caaaaaaaga cattgagttt caagaacatc gtcaaaaaac 1560 ccgccgggca taagcccaag cgggttttag gatcttaata atctaattct ttatataaag 1620 gaaatttatc agtcagagca gctacacgct gtcttgcttc ttcaagtttt ccttcatctt 1680 cgtggttttt caatgcaagc gcaatgatag caccgacttc ttctaatgcg tctccgtcaa 1740 aaccgcggct ggttacagca gctgtaccaa gacggatgcc gcttgttacg aaaggttttt 1800 caggatcata tggaatcgcg tttttgttag acgtaatacc aatttcatca agtacatgct 1860 ccgcaacctt accagtcagt ccgagcgaac gaaggtcaac aaggataagg tggttgtctg 1920 ttccgcctga aacgagctgg atgccctctt tcgttaaggc ttcagccaga cgtttcgcgt 1980 ttgaaatgac gttttgtgca tatgttttga aatcgtcctg caatacttca ccgaatgaaa 2040 cagcttttgc ggcaataacg tgcatcagag ggccgccttg aattccaggg aagatcgatt 2100 tatcaatttt cttgccaaac tcttcacggc aaaggatcat accgccgcga ggaccgcgaa 2160 gtgttttatg tgttgttgtt gtaacgaaat cagcgtaagg aaccgggttt ggatgaaggc 2220 ctgccgcaac aagtcctgcg atatgtgcca tatccaccat gaagtaagcg ccgacttcat 2280 cagcaatttc acggaatttc ttaaagtcga ttgtacgagg atacgcactt gctcctgcta 2340 cgataagctt cggtttatga gcgagggctt tttcacgcac gtcatcgtaa tcaatatatt 2400 gagtttcttt atctacgccg tactcaacaa agttatattg aacaccgctg aagttgactg 2460 ggcttccgtg tgttaaatgg ccgccgtggg agaggttcat cccaagtaca gtatcgcctt 2520 gctccaaaat cgtgaagtac actgccatgt ttgcttgtgc gcctgaatga ggctgaacgt 2580 ttacatgctc cgctccaaag atttccttcg cgcggtcacg ggcgatatct tcaacgacat 2640 cgacgtgctc gcatccgccg tagtagcgtt tgcccggata tccttctgcg tacttatttg 2700 tcaaaacaga tccttgtgct tccataaccg cttcacttac aaagttctca gaagcaatca 2760 attcgatctt agtctgttgg cgttcacgct catttttaat ggcgttaaac acttgttcgt 2820 cttgcgcagg taaatgtttc atgtttacac ctcctctaga gcgtcctgct gttgttaaga 2880 ttattatacc acaccttgta gataaagtca acaacttttt gcaaaatttt tcaggaattt 2940 tagcagaggt tgttctggat gtagaacaaa acatctttcc gctcttgtgc tgttaggata 3000 tctttcttgg aagctaggta ggcctcgagt tatggcagtt ggttaaaagg aaacaaaaag 3060 accgttttca cacaaaacgg tctttttcga tttcttttta cagtcacagc cacttttgca 3120 aaaaccggac agcttcatgc cttataactg ctgtttcggt cgacaagctt cgcgaagcgg 3180 ccgcaaaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 3240 caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 3300 cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg 3360 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 3420 atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgactat 3480 gcttgtaaac cgttttgtga aaaaattttt aaaataaaaa aggggacctc tagggtcccc 3540 aattaattag taatataatc tattaaaggt 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gtgtcaccta aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 3360 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 3420 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3480 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3540 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3600 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3660 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3720 aaaaggccgc gttgctggcg tttttcgata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3780 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3840 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3900 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3960 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 4020 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 4080 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4140 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 4200 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4260 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4320 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4380 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4440 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4500 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4560 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4620 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4680 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4740 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4800 acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4860 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4920 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4980 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 5040 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata ccgcgcccgg cgaccgagtt 5100 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata gtgtatgaca tagcagaact ttaaaagtgc 5160 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5220 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5280 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5340 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5400 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5460 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 5520 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 5580 cgttaaatat ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 5640 cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 5700 gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 5760 atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt gcggtcgagg tgccgtaaag 5820 ctctaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 5880 acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 5940 tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taa 5983 <210> 31 <211> 7330 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido <400> 31 ttgcggccgc ttcgaaagct gtaatataaa aaccttcttc aactaacggg gcaggttagt 60 gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag 120 tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca 180 tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta 240 atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag 300 ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata 360 ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa 420 tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat 480 acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg 540 ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata 600 aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca 660 atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt 720 ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt 780 atctaaagtg aatttaggag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt 840 taaaagtcaa tattactgta acataaatat atattttaaa aatatcccac tttatccaat 900 tttcgtttgt tgaactaatg ggtgctttag ttgaagaata aagaccacat taaaaaatgt 960 ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc tttcttatct 1020 tgataataag ggtaactatt gaattcggta ccaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca 1080 tccgtcagga tggccttctg cttaatttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc 1140 cgccaccctc cgggccgttg cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta 1200 ctcaggagag cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga 1260 gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact 1320 accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg gggtcaggtg ggaccaccgc 1380 gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt ctgcgttctg atttaatctg 1440 tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacaggat ccaattatgg cagatcaatg 1500 agcttcacag acacaatatc agggacattt gttagttctt tcacaatttt atcttccaga 1560 tgtctgtcaa aggaaagcat catgatggct tctccgcctt tttccttacg gccaacctgc 1620 atagttgcaa tgttaatatc attatctccg agaatacgtc ctactcggcc gatgacacct 1680 gttgtatctt gatgctggat atacaccaag tgaccagtcg gataaaaatc aatattaaat 1740 ccattgatct cgacaattcg ttctccgaaa tgaggaatat acgtagccgt tacagtaaag 1800 gtgctgcggt ctcctgtcac ttttacgctg atgcagttat cgtatccaga ttcagaagag 1860 gaaatttttt cactgaagct aatgccgcgt tcttttgcga cacccccggc attgacctca 1920 ttaacagtag agtctacgcg cggttttaaa aagcctgaca gaagggcttt tgtaatgaac 1980 gatgtttcaa gtttagcaat tgtgccttca tattgaatgg caacatcctg tactggttct 2040 ttcatgcact gtgatacaag gctgccaatt tttcctgcaa tttgatggta aggcttaatt 2100 ttagcaaatt catcttttgt catggcaggc aggttgatag ctgacatgac aggcaggcct 2160 tttgcgaact gcagaacttc ttctgacact tgggcggcga cattgagctg tgcttctttc 2220 gttgatgctc ccaagtgagg agtggcaatg actaatggat gatcaacaag tttgttgtca 2280 actggcggtt cgacttcgaa aacgtcaagc gctgctcccg caacatgccc gttttccaaa 2340 gcttcgagaa gtgctgcttc atcgataatt ccgcctcgcg cacagttaat taagcgaacg 2400 ccttttttcg tttttgcaat cgtttcttta ttcaataagc cttttgtttc ttttgttaaa 2460 ggcgtgtgaa cggtaatgat atccgcactt tcaagcactt cttcaaatgt acggctgttt 2520 acgccgattt ttttcgctct ttcttccgtt aagaaaggat caaaaacgtg cacagtcata 2580 ccgaacgctc ctcgacgctg tgcaatttca cttccgattc ggcctaatcc tacaatacca 2640 agcgtttttc cataaagctc tgaaccgaca taagctgtgc ggttccactc tctggatttc 2700 actgagatat tagcctgcgg aatgtgtctc attaaagaag agatcattgc aaatgtatgc 2760 tcagctgtcg aaatggtgtt gccgttcgga gcattgatca cgattacccc gtgtttcgta 2820 gcctcatcaa tatcgatatt atcgacaccg acaccggctc ttccgacaat ttttaaagaa 2880 gtcattttgt tgaaaaggtc ttctgttact tttgtcgcgc ttcccaccaa aagagcatca 2940 aaagtatgta attcatcttc tgcatctgct acgttttttt gaacgatttc aataaagtct 3000 gattcaataa gtggctgtaa accgtcgttg ctcattttgt ctgagaccaa tactcgaaac 3060 atgttttctc ctcctctaga gcgtcctgct gttgttaaga ttattatacc acaccttgta 3120 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acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat 4860 tcccccttac acggaggcat caagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 4920 gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 4980 aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 5040 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 5100 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 5160 ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 5220 gcttaactat gcggcatcac agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 5280 accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 5340 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 5400 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 5460 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 5520 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 5580 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 5640 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 5700 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 5760 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 5820 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 5880 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 5940 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 6000 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 6060 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 6120 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 6180 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 6240 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gagccaccta tctcagcgat 6300 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 6360 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgacacccac gctcaccggc 6420 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 6480 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tcttcaagaa 7330

Claims (1)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. - Un proceso para la producción aumentada de pantotenato, que consiste en cultivar un microorganismo que 5 tenga una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada, en las condiciones tales que se aumente la producción 'de pantotenato. 2. - Un proceso para la producción aumentada de pantotenato, que consiste en cultivar un microorganismo que 10 tenga: (i) una via biosintética desregulada de pantotenato, y (ii) una via biosintética desregulada de metilentetrahidrofolato (MTF) , 15 en condiciones tales que se aumente la producción de pantotenato . 3. - El proceso de la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo tiene desreguladas al menos dos enzimas biosintéticas del pantotenato. 20 4. - El proceso de la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo tiene desreguladas al menos tres enzimas biosintéticas del pantotenato. 5.- El proceso de la reivindicación 2 , caracterizado porque el microorganismo tiene desreguladas al 25 menos cuatro enzimas biosintéticas del pantotenato. 6. - El proceso de la reivindicación 5, caracterizado porque el microorganismo tiene una cetopantoato hidroximetiltransferasa desregulada,. una cetopantoato, reductasa desregulada, una pantotenato sintetasa desregulada y una aspartato-a-descarboxilasa desregulada. 7. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el microorganismo además tiene una vía biosintética isoleucina-valina (ilv) desregulada. 8. - Ei proceso de la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo tiene al menos dos enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas . 9. - El proceso de la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo tiene al menos tres enzimas biosintéticas de isoleucina-valina (ilv) desreguladas . 10. - El proceso de la reivindicación 9, caracterizado porque el microorganismo tiene una acetohidroxiácido ácido sintetasa desregulada, una acetohidroxiácido isomeroreductasa desregulada y una dihidroxiácido dihidratasa desregulada. 11. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el microorganismo tiene al menos una enzima biosintética de MTF desregulada. 12.- El proceso de la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo tiene un gen glyA desregulado . 13·.- El proceso de la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo tiene un gen serA desregulado . 14. - El proceso de la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo tiene un gen glyA desregulado y un gen serA desregulado. 15. - El proceso de la reivindicación 12 ó 14, caracterizado porque el microorganismo tiene un gen purR mutado, delecionado o con disrupción. 16. - Un proceso para la producción aumentada de pantotenato, que consiste en cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada, una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, y una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada, de modo que aumente la producción de pantotenato. 17. - Un proceso para la producción aumentada de pantotenato, que consiste en cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada, una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, y una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada, de modo que se produzca al menos 50 g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar el microorganismo . 18. - El proceso de la reivindicación 17, que consiste en cultivar el microorganismo de modo que se produzcan al menos 60 g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 19. - El proceso de la reivindicación 17, que consiste en cultivar el microorganismo de modo que se produzcan al menos 70 g/L de pantotenato después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 20. - ün proceso para la producción aumentada de pantotenato, que consiste en cultivar un microorganismo que tenga una via biosintética de pantotenato desregulada, una via biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulada, y una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada, de modo que se produzca al menos 60 g/L de pantotenato después de 48 horas de cultivar el microorganismo . 21. - El proceso de la reivindicación 20, que consiste en cultivar el microorganismo de modo que se produzcan al menos 70 g/L de pantotenato después de 48 horas de cultivar el microorganismo. 22. - El proceso de la reivindicación 20, que consiste en cultivar el microorganismo de modo que se produzcan al menos 80 g/L de pantotenato después de 48 horas de cultivar el microorganismo. 23. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la producción de pantotenato aumenta más regulando la actividad de la pantotenato cinasa. 24. - El proceso de la reivindicación 23, caracterizado porque se disminuye la actividad de pantotenato cinasa. 25. - El proceso de la reivindicación 24, caracterizado porque se deleciona CoaA y se regula hacia abajo CoaX. 26. - El proceso de la reivindicación 24, caracterizado porque se deleciona CoaX y se regula hacia aba o CoaA. 27. - El. proceso de la reivindicación 24, en donde se hace una regulación descendente de CoaX y CoaA. 28. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo se cultiva en condiciones de serian en exceso. 29. - Un proceso para producir pantotenato que consiste en culutivar un microorganismo que tiene una via biosintética de pantotenato desregulada en condiciones de serina en exceso, de modo que se produzca pantotenato. 30. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo tiene la via biosintética de pantotenato desregulada de modo que la producción de pantotenato sea independiente de la alimentación de ß-alanina. 31. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo es un microorganismo gram positivo. 32. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo pertenece al género Bacillus. 33. - El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo es Bacillus subtilis. 34. - Un producto sintetizado de conformidad con el proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 35. - Una composición que contiene pantotenato producido de conformidad con el proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 36. - Un microorganismo recombinante para la producción aumentada de pantotenato, el microorganismo tiene una via biosintética de pantotenato desreguulada, y una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada. 37. - Un microorganismo recombinante para la producción aumentada de pantotenato, el microorganismo tiene una via biosintética de pantotenato desreguulada, una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada y una vía de isolecucina-valina (ilv) desregulada. 38. - El microorganismo de la reivindicación 36 ó 37 además tiene reducida actividad de pantotenato cinasa. 39. - El microorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 que es un microorganismo gram positivo . 40. - El microorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 perteneciente al género Bacillus. 41. - El microorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 que es Bacillus subtilis. 42. - Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recom inante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y (c) al menos un gen que codifica la enzima biosintética de isoleucina-valina (ilv) desregulado; en condiciones tales que al menos 30 g/L de pantotenato se producen después de 36 horas de cultivar el microorganismo . 43. - El proceso de la reivindicación 42, caracterizado porque el microorganismo además tiene una via biosintética de metilentetrahidrofolato (MTF) desregulada y el microorganismo se cultiva en condiciones tales que al menos 50 g/L de pantotenato se producen después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 44. - ün proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y en condiciones de serina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 45. - Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y (c) una vía biosintética desregulada de metilentetrahidrofolato (MTF) ; en condiciones de valina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 46.- Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar, un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y (c) un gen glyA desregulado; en condiciones de valina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 47.- Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y (c) un gen purR mutado, delecionado o con disrupción; en condiciones de valina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 48. - Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, y (c) un gen serA desregulado; en condiciones de valina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo. 49. - Un proceso para producir pantotenato que consiste en cultivar un microorganismo recombinante que tiene: (a) un gen panB desregulado; (b) un gen panD desregulado, (c) un gen serA desregulado; (d) un gen glyA desregulado; y en condiciones de valina en exceso, de modo que al menos 50 g/L de pantotenato se produzcan después de 36 horas de cultivar el microorganismo.