CN101522889A - 用于乙醇生产的嗜热微生物 - Google Patents

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CN101522889A CN 200780036097 CN200780036097A CN101522889A CN 101522889 A CN101522889 A CN 101522889A CN 200780036097 CN200780036097 CN 200780036097 CN 200780036097 A CN200780036097 A CN 200780036097A CN 101522889 A CN101522889 A CN 101522889A
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Abstract

一种嗜热微生物被修饰以使得乙醇产量增加，其中第一修饰为将乳酸脱氢酶基因失活，且第二修饰上调丙酮酸脱氢酶基因。

Description

用于乙醇生产的嗜热微生物
技术领域
本发明涉及作为细菌发酵产物的乙醇的生产。具体而言，本发明涉及嗜热细菌的乙醇生产。
背景技术
根据细菌的种类和环境条件，细菌的代谢可以有各种不同的机制。异养菌(包括所有病原菌)通过氧化有机化合物获得能量，碳水化合物(尤其是葡萄糖)、脂质和蛋白质是最常见的可被氧化的化合物。细菌对这些有机化合物的生物氧化可合成作为化学能量来源的ATP。该过程还可产生细菌细胞进行生物合成反应所需的更简单的有机化合物(前体分子)。细菌代谢合适底物的一般过程是糖酵解，它是将葡萄糖转化为丙酮酸并产生ATP的一系列反应。丙酮酸在代谢能产生过程中的转化产物(fate)因微生物和环境条件的不同而有所不同。对于丙酮酸，存在三种主要的反应。
第一种，在有氧条件下，许多微生物可通过柠檬酸循环产生能量并在丙酮酸脱氢酶(PDH)的催化下将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。
第二种，在缺氧条件下，某些产乙醇的生物可以通过下述途径进行乙醇发酵：在丙酮酸脱羧酶(PDC)的催化下将丙酮酸脱羧产生乙醛，并随后在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下通过NADH将乙醛还原为乙醇。
第三种过程是在乳酸脱氢酶(LDH)的催化下将丙酮酸转化为乳酸。
目前利用微生物来生产乙醇的研究已受到诸多关注，这些研究利用了可进行天然无氧发酵的微生物或利用了含有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因的重组微生物。尽管已经在利用这些微生物生产乙醇方面取得了一些成功，但发酵经常会因为乙醇浓度的增加而受到影响，特别是在所述微生物的乙醇耐受水平较低时更是如此。
嗜热细菌已被建议用于乙醇生产，并且使用它们的优势是可使发酵在较高的温度下进行，使得在50℃以上的时候乙醇就可以以蒸气的形式被移除；这也允许发酵在较高的糖浓度中进行。然而，寻找可有效产生乙醇的合适的嗜热细菌还是个难题。
WO88/09309公开了使用嗜热杆菌(Bacillus)菌株LLD-R的乙醇生产。LLD-R是一种在培养物中自发产生的具有孢子形成缺陷的菌株，其中ldh基因通过自发突变或化学诱变被失活。然而，如下文所述，该菌株是不稳定的。
WO01/49865公开了一种用于产生乙醇的革兰氏阳性细菌，所述细菌带有转化的编码丙酮酸脱羧酶的异源基因并且具有本身具有乙醇脱氢酶功能。该细菌为嗜热杆菌，并且可通过利用转座子的插入来使乳酸脱氢酶基因失活而对其进行修饰。WO01/49865中公开的细菌全部衍生自杆菌属LLD-R菌株。菌株LN和TN作为菌株LLD-R的改良衍生物也被公开。然而，所有菌株均含有阻止质粒转化的Hae III型限制性系统，并由此阻止未甲基化DNA内的转化。
WO01/85966公开了通过体内甲基化来克服限制性问题而制得的微生物。这需要将流感嗜血菌(Haemophilus aegyptius)的Hae III甲基转移酶转化到LLD-R、LN和TN菌株中。但LLD-R、LN和TN菌株是不稳定的突变体并可自发地反转为产乳酸的野生型菌株，尤其是在较低pH下以及高糖浓度中。这样就导致了发酵产物从乙醇变为乳酸，使得这些菌株不适于乙醇生产。
WO02/29030中公开了菌株LLD-R及其衍生物在ldh基因的编码区域中包含天然存在的插入元件(IE)。将该元件插入(以及脱离)ldh基因的转座和随后的基因失活是不稳定的，会出现反转。针对这一现象提出的技术方案是将质粒DNA整合至IE序列中。
因此，在本领域中，用于乙醇生产的微生物的生产是基于对实验室产生的用化学方法突变的杆菌微生物进行修饰，以体内甲基化方法对其进行处理并进一步对所述微生物进行修饰以将质粒DNA整合至IE序列中。该方法复杂且不确定，并且在可以如何使用所述菌株方面还存在监管问题。
因此需要用于乙醇生产的改良的微生物。
发明内容
根据本发明的第一方面，对一种嗜热微生物进行修饰以使得乙醇的产量增加，其中第一修饰为将乳酸脱氢酶基因失活，且第二修饰上调丙酮酸脱氢酶基因。
本发明的微生物与野生型相比表现出增加的乙醇产量。
根据本发明的第二方面，一种用于生产乙醇的方法包括在存在C3、C5或C6糖的情况下，在适宜的条件下培养根据上文所提供的定义的微生物。
附图说明
参照附图对本发明进行描述，其中
图1图解说明了糖酵解的代谢途径；
图2图解说明了PDH复合体的基因；
图3为用于靶向上调PDH的启动子置换构建体的示意图；
图4为用于双交换上调PDH突变体的启动子置换构建体的示意图；
图5为意欲产生稳定的PFL-阴性突变体的敲除(knock-out)构建体的示意图；以及
图6为用本发明的突变体微生物获得提高的乙醇产量的图例。
具体实施方式
本发明是基于对嗜热微生物的修饰以破坏乳酸脱氢酶基因的表达并上调PDH基因。
乳酸脱氢酶基因的失活有助于阻止丙酮酸分解为乳酸，从而通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶(在合适的条件下)促进丙酮酸分解为乙醇。优选地，通过基因内缺失或者通过基因缺失来破坏乳酸脱氢酶基因。
上调PDH基因可促进丙酮酸转化成乙酰辅酶A，在合适的条件下乙酰辅酶A可用于产生乙醛，并且最终使用乙醛脱氢酶可得到乙醇。上调PDH的另一个优点是可降低丙酮酸水平，丙酮酸对葡萄糖摄取和糖酵解具有抑制效应。这也会促进乙醇的产生。
该微生物可以是任何嗜热微生物，但优选地，该微生物为杆菌的某些种。具体而言，该微生物优选为地芽胞杆菌属(Geobacillus)种的野生型微生物，特别是热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
在优选的实施方案中，被选择用于修饰的微生物被称为“野生型”，即它们不是实验室产生的突变体。该微生物可从预期含有嗜热生物的环境样品中分离。分离的野生型微生物具有产生乙醇的能力，但由于没有经过修饰，乳酸可能会是主要的发酵产物。该分离物的选择还依赖于在较高的温度下，它们能够在己糖和/或戊糖及其寡聚体上生长的能力。
优选地，本发明的微生物具有某些理想特征，所述特征使得可在发酵过程中使用该微生物。微生物应优选地不具有限制系统，由此避免需要体内甲基化。此外，该微生物应在至少3％乙醇的条件下是稳定的，并且应能够利用包括纤维二糖和淀粉的C3、C5和C6糖(或它们的寡聚体)作为底物。优选地，微生物可以被高频率的转化。此外，微生物在连续培养中的生长速率应可满足0.3h-1及以上(OD600一般为0.3)的稀释速率。
该微生物应是嗜热微生物并可在40℃-85℃的温度范围内生长。优选地，该微生物可在50℃-70℃的温度范围内生长。另外，微生物的理想生长条件在pH 7.2或以下，尤其是在pH 6.9-pH 4.5之间。
该微生物可以带有孢子，也可以不带孢子。发酵过程的成功并不必须取决于微生物形成孢子的能力，但当希望在发酵过程结束后将微生物用作动物饲料的时候，在某些情况下优选可形成孢子的微生物。这是由于当孢子被用作动物饲料时，它具有能够产生良好的免疫刺激作用的能力。能形成孢子的微生物还会在发酵过程中沉降，因此不需离心就能被分离。因此，该微生物可用于动物饲料而不需进行复杂的或昂贵的分离过程。
现在，乳酸脱氢酶的核酸序列是已知的。本领域技术人员可以利用该序列通过各种不同的机制对乳酸脱氢酶基因进行靶向以使该基因失活。优选的乳酸脱氢酶基因的失活方法是通过插入转座子，或者优选地，通过缺失该基因序列或该基因序列的一部分。优选缺失突变，这是因为这一方式避免了该基因序列再次活化的难题，而在利用转座子失活的时候经常出现这种情况。在一个优选的实施方案中，通过整合温度敏感性质粒(如PCT/GB06/01586中公开的质粒pUB190-ldh)将乳酸脱氢酶基因失活，这样可实现质粒和微生物染色体间的自然同源重组或整合。对染色体整合体的筛选可以根据它们对抗菌药(例如卡那霉素)的抗性。进入乳酸脱氢酶基因的整合可通过单交换重组事件或者双(多)交换重组事件发生。优选进行双交换重组事件，以除去LDH基因(或其一部分)以及初始的整合体——即温度敏感的质粒。这样，所述突变微生物不含有任何异源DNA，因此根据转基因生物(GMO)规则它们将不能被归类为GMO。
第二修饰是为了上调PDH。PDH是一种大的酶复合体，包含三个单位--E1：丙酮酸脱羧酶(EC 1.2.4.1，非EC 4.1.1.1)、E2：二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶和E3：二氢硫辛酰胺脱氢酶。该复合物需要几种辅因子，其中包括NAD、FAD、辅酶A硫辛酸和硫胺素焦磷酸(TPP)。四个基因编码该复合体，这是因为单位E1是α和β亚基的异源二聚体，这四个基因一般被称为pdhA、pdhB、pdhC和pdhD(分别对应于E1 α、E1 β、E2和E3)。PDH的单位E1以与PDC EC 4.1.1.1需要TPP的方式相同的方式需要TPP，并催化类似的脱羧反应，不同之处是在存在辅酶A和硫辛酸时——由其他酶单位进行——产物是乙酰辅酶A而不是乙醛。然而，在单位E1未与其他的PDH单位复合的时候，已经测定到了它的PDC活性(Lessard& Perham；The Journal of Biological Chemistry；1994，269：14，10378-10383；Tomar et al；Applied Microbiology and Biotechnology；2003，62，76-82；Frank et al；Science；2004，306：Oct 29，872-876，补充数据)。因此，可通过上调PDH提高EC 1.2.4.1的PDC活性，使得乙醛的产生超过及高于乙酰辅酶A。还预计提高的PDH活性可消除丙酮酸瓶颈，以使得产生更多的乙醇及更少的副产物乙酸和甲酸。
为此，使用标准的“基因组行走(genome walking)”技术分离了该PDH基因和周围序列。分离到了约8.8kb的DNA，对其进行测序，发现其包含图2和表1中所示的以下基因。
表1
Figure A200780036097D00081
 
基因 位置(bp) 推定的功能 阅读框(5’和3’氢基酸)     大小(氨基酸)  
pdhA(β) 3003-3965 丙酮酸脱氢酶β-亚基          +3(MIQ-INF) 320
pdhB 4058-5368 二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶     +2(VAF-MEA) 436
lpd 5373-6785 硫辛酰胺脱氢酶               +3(MVV—ISK) 470
orf7 7432-6833 未知功能-推定的蛋白质         -1(MNK-CTE) 199
orf8    7964-8647   转座酶           +2(MDL—SPP)         227       
推定的启动子区域显示于图2中(箭头)——一个来自pdhA起始位点的上游区，以及pdhC前面可能的第二启动子。以前已经报道了枯草杆菌(Bacillus subtilis)PDH簇第二启动子的实例(Gao et al；Journal ofBacteriology，2002，184：10，2780-2788)，但是大多数有记载的PDH基因簇仅具有一个位于簇上游的启动子(Neveling et al；Biochimica Acta；19981385，367-372)。可以使用本领域已知的技术进行所述上调。具体而言，可以通过在PDH复合体的上游区引入合适的启动子或增强子序列进行上调。
已知该酶复合体在有氧和无氧两种条件下发挥功能(Carlsson et al；Infection and Immunity；1985，49：3，674-678)，但一般认为它是需氧酶(Ch15；Principles of Biochemistry；Lehninger，Nelson & Cox；2nd Ed，WorthPublishers，New York，1993，p447)，并以丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)为它的无氧条件的对应物。这两种酶都将糖酵解中形成的丙酮酸转化成乙酰辅酶A，以进料至TCA循环，但TCA循环仅在有氧条件下完全工作。然而，由于需要使用无氧条件，因此本发明优选使用在无氧条件下起作用的启动子。因此，被认为在无氧条件下起作用的酶的启动子——实例有LDH启动子(来自嗜热脂肪芽胞杆菌(G.steareothermophilus)NCA1503、DSM13240和ATCC14579的Pldh)和铁氧还蛋白启动子(来自嗜热脂肪芽胞杆菌DSM1324的P ferrA)——被鉴定、分离，并被稳定地整合至合适的位点——即紧邻pdhA起始位点的上游。所使用的菌株以及插入至PDH复合体的启动子显示于图2中。在大多数实例中，所述启动子使得PDH表达增加10倍，葡萄糖消耗增加、丙酮酸降低到可不计的水平，并且乙醇生产增加～50％。有意思的是，乙酸水平保持不变，这导致了乙醇:乙酸比率的增加，而有利于乙醇的生产。
表2
 
菌株       启动子                 mM葡萄糖     mM乙醇        mM丙酮    mM乙酸      
TM177      P ldh(1503)         0.0         159.4        0.0       18.8      
TM178     P ldh(1503)         0.0         164.0        0.0       21.1       
TM216     P ldh(1503)二聚体   0.0         163.4       0.0       19.6      
TM218     P ldh(1503)二聚体   0.0         152.1        0.0       21.0       
TM226     P ldh(13240)        0.0         155.8        0.0       20.9      
TM227     P ldh(13240)        0.0         158.4        0.0       19.4      
TM228     P pf11               0.0         152.1        0.0       22.3       
TM229     P pf11                0.0         146.0        0.0       19.9      
TM230    P pf12               0.0         150.6       0.0       17.8      
TM231   P pf12               0.0         148.6        0.0       19.5      
TM180     P ldh(1503)DCO      0.0         152.0        0.0       21.7        
TM89      (对照)                 23.2       92.7          12.2     21.9        
在一个优选的实施方案中，引入第三种修饰来增加PDC活性。这可以通过激活E2(EC2.3.1.12)来实现。可以以类似于使LDH失活的方式进行失活，不同之处是E2基因作为破坏的靶位。
在另一个实施方案中，本发明的微生物还包含另一个修饰，使丙酮酸甲酸裂解酶基因失活，从而防止/减少丙酮酸向乙酰辅酶A和甲酸的转化。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脱氢酶(PDH)的“无氧条件的对应物”，它将丙酮酸转化成乙酰辅酶A和甲酸(见图1)。虽然乙酰辅酶A可经乙醛脱氢酶(AcHD)转化成乙醇，但甲酸是一种可能会抑制产乙醇生物生长的不利的副产物。
选择PFL作为敲除的靶位，目的是为了促进代谢流向乙醇产生方向，并且是为了改良其余乙醇合成途径的氧化还原平衡。另一个优点是消除甲酸的产生。可以使用与敲除LDH相同的方案(见下文)使PFL失活，以产生一个不依赖于抗生素选择来延续改变的表型的突变体。在该实施方案中，优选地，所述微生物同时包含乳酸脱氢酶的失活及丙酮酸脱氢酶的上调，从而使得在无氧条件下乙醇产生增加。
可以使用使LDH失活的公开技术使该PFL基因失活。可以使用转座子插入，或者可以使用基因缺失(或部分基因缺失)。优选使用基因缺失(或部分缺失)。
在又一优选的实施方案中，所述微生物还包含异源醇脱氢酶基因。该异源基因的表达会产生能够重定向代谢方向以使得乙醇成为主要发酵产物的酶。该基因可从通常进行无氧发酵的微生物中获得，所述微生物包含发酵单胞菌属(zymomonas)种，包含运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)。
制备这些基因并将其整合到微生物中的方法是已知的，例如见Ingramet al，Biotech & BioEng，1998；58(2+3)：204-214和US 5916787，上述每篇文献的内容均通过引用的方式纳入本文。本领域技术人员应知晓，该基因可以被引入到质粒中或者被整合到染色体中。
本发明的微生物可在常规培养条件下培养，这依据所选择的嗜热微生物而定。可基于已知培养要求选择所选底物、温度、pH和其他生长条件，例如参见WO01/49865和WO01/85966，每篇文献均通过引用的方式纳入本文。
现将在以下实施例中参照附图并仅以示例的方式对本发明进行描述。
LDH基因的失活
实施例1：稳定的LDH突变体的产生
设计了一个策略，通过基因置换在热萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucodasius)NCIMB 11955中产生LDH基因的稳定突变，按照以下的两种方法。
在方法1中，在LDH编码序列中部附近存在的两个单一限制位点被用于产生缺失。从涵盖大部分现有LDH序列的基因组DNA产生单个的大PCR产物，并将其克隆至pUC19(New England Biolabs)的多克隆位点的SmaI位点中。然后该pUC19克隆经BstE II和BsrGI依次消化，并在Klenow消化后再次连接(relegated)，以在LDH基因的BstEII和BsrGI之间形成内部缺失。
在方法2中，该LDH基因被克隆成两条PCR产物，用以下的寡聚体引物引入NotI位点，以使这两种PCR产物在pUC190中被连接起来，在LDH序列的中部形成缺失。
将从每种方法获得的、具有内部缺失的LDH基因亚克隆至三个潜在的送递系统中：pUB190、pNW33N和TMO19。
表3  示出了用于缺失方法2中的PCR引物。
 
序列 下划线的限制性位点
引物1(正向) GGAATTCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA SEQ ID NO.1 EcoRI
引物2(反向) GCGGCCGGACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT SEQ ID NO.2 NotI
引物3(正向) GCGGCCGCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT SEQ ID NO.3 NotI
引物4(反向) CTGCAGCGTCAATTCCATCACTTCACGA SEQ ID NO.4 PstI
阴影序列表示添加以补全限制位点的碱基。
表4  列出了所述送递载体的性质。
 
pUB190 pNW33N pTM019
可选择标记物 卡那霉素腺苷转移酶。60℃下的生长和活菌数减少，参照为52℃。在68℃下无生长。一般，严格筛选，无伴随细菌，相对热稳定，但不出现自然耐性。 氯霉素乙酰转移酶。60℃下的生长和活菌数稍微减少，参照为52℃。在65℃下无生长。一般，相对不耐热，少量伴随细菌的问题，但很少形成自然耐性。   通过将Kan PCR产物(pUB190作为模板)插入至pNW33N的EcoRI位点中衍生出pTM019，转化到热葡糖苷酶地芽孢杆菌并从中再分离。因此会具有类似于pUB190和pNW33N的选择性质    
可转化性     好(一次实验中约1,000)        很好，每次实验>2,000，可重复。 中等(每次实验～400)。这可能是由于载体的大小较大。  
可用克隆位点 受限，在构建体中失去部分的多克隆位点。   好-多克隆位点完整。 好-多克隆位点完整。
方法1：基因组DNA的制备
基因组DNA从11955中制备，作为PCR的模板。将20mL的过夜培养的11955培养物(TGP培养基，52℃)在4000rpm下离心20分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于5mL含有2.5mg溶菌酶和50μL核糖核酸酶A(1mg/mL)的STE缓冲液(0.3M蔗糖、25mM Tris-HCl和25mM EDTA，pH为8)中。将其在30℃下培养1小时，然后加入5mg蛋白酶K和50μL 10％ SDS，然后在37℃下再培养1小时。随后用等体积的苯酚:氯仿(1:1)和氯仿依次提取该裂解的培养物，然后用异丙醇沉淀。用冰冷的70％乙醇洗涤两次后，将DNA沉淀物重新溶解于0.5ml TE缓冲液中。
方法2：LDH缺失构建体的形成
使用Robercycler Gradient 96(Stratagene)进行PCR，反应条件如下：循环1-在95℃变性5分钟，在47℃退火1分钟，在72℃延伸2分钟；循环2-30-在95℃变性1分钟，在47℃退火1分钟，在72℃延伸2分钟，再在72℃最终孵育5分钟。所用酶为Pfu聚合酶(Promega)和Taq聚合酶(New England Biolabs，NEB)的等比混合物。所用的缓冲剂和dNTP依照生产商的说明书(Pfu，Promega)。使用的DNA模板为上文中制备的11955基因组DNA，且通过琼脂糖凝胶电泳并用凝胶提取试剂盒(QIAquickGel extraction kit，Qiagen)依照生产商的说明书进行洗脱来纯化获得的PCR产物。纯化的PCR产物与预先用Sma I消化的pUC19(NEB)连接，并且使用标准步骤将连接的混合物用于转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并且通过限制性分析加以鉴定。
将通过在pUC19(在该片段的3’端引入新的PstI位点，在5’端引入NotI位点，使用引物3和4产生)中插入片段2形成的质粒(pTMO02)经Not I和Pst I消化。所得的片段(约0.4kb)被连接至已经经Not I和PstI消化的、含有片段1(使用引物对1和2产生)的pUC19质粒(pTMO01)上。使用标准步骤将连接的混合物用于转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。如前文，挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并且用限制性分析加以表征，以确定插入片段的方向。
通过利用M13mp18反向和正向引物的测序鉴定并验证具有所需构建体的预期限制性模式的质粒(pTMO03)。
通过HindIII和EcoR I的消化将突变的LDH基因片段从pTMO03上切下来，并如上文通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将该片段用Klenow聚合酶处理(NEB，依照生产商的说明书)以产生平端，用于连接至已经Xbal消化、也经Klenow聚合酶处理的pUB190载体中。使用标准方案用该连接混合物转化大肠杆菌SCS110(Stratagene)。如前文所述，挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并且通过限制性分析加以表征。具有所需构建体的预期限制性模式的质粒(pTMO14，以pUB190骨架为基础)被鉴定，并且使用下文描述的方案，通过电穿孔方法将所述质粒应用于转化NCIMB11955。
热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB 11955的电穿孔方案
NCIMB 11955冷冻原种的制备：在TGP培养基中过夜培养(在55℃下以250rpm摇动，250ml的锥形瓶中50mL培养液，OD600～2)，加入等体积的20％甘油，并分成1mL的等份，装于冷冻管中置于-80℃下贮存。将1mL该原种接种至250ml锥形瓶中的50mL预温的TGP中，培养(55℃，250rpm)直至OD600达到1.4。
使锥形瓶在冰上冷却10分钟，然后将培养物在50mL Falcon管中在4℃以4000rpm离心20分钟。将沉淀物重悬于50mL冰冷的电穿孔培养基中，并离心(4000rpm，20分钟)。再以这种方式进行三次洗涤(1×25mL和2×10mL)，然后将沉淀物重悬于1.5mL冰冷的电穿孔培养基中，并分成60μL的等份，于0.5mL eppendorf管中在-80℃保存以备用(或立即使用)。
为进行电穿孔，在置于冰上的eppendorf管中的60μL电感受态细胞中加入1-2μL DNA，并轻轻搅拌。将该悬液转移至预冷的电穿孔杯(1mm间距)中，并且在2500V、10μF电容、600Ω电阻下进行电穿孔。电脉冲后立即加入1mL预温的TGP，混合并将悬液转移至螺旋盖管中，在52℃下振摇水浴中培养1小时。培养后，将悬液直接接种(例如2×0.5ml)于含合适抗生素的TGP琼脂上，或者以4000rpm离心20分钟并且将沉淀物重悬于200μL-500μL TGP中后涂布，并于52℃下培养过夜。在24小时后观察有抗生素抗性的转化株。
电穿孔培养基                  TGP培养基
0.5M山梨糖醇                  胰蛋白胨17g/L
0.5M甘露醇                    大豆蛋白胨3g/L
10％甘油                      K2HPO4 2.5g/L
                              NaCl 5g/L
                              pH至7.3
                              高压灭菌后加入：
                              丙酮酸钠4g/l
                              甘油4ml/L
                              (来自过滤灭菌的浓缩液)
单交换LDH负性原代整合体的筛选
用于整合至生物体基因组中的质粒(如pTMO14)是温度敏感的。基于pUB190的敲除载体在54℃下能够在宿主内复制，但在超过65℃时不能复制。因此，为了在存在卡那霉素的情况下在68℃下生长，宿主必须将该质粒整合至其基因组中。
通过划线将卡那霉素抗性菌落——来自用pTMO14转化的热萄糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB 11955——在含12μg/mL卡那霉素的TGP琼脂上纯化至单个菌落的。通过强制与基因组LDH等位基因同源重组，将该转化体用于产生11955的原代整合体。这是通过以下方法实现的：将该菌株在250mL锥形烧瓶的50mL TGP培养基中于52℃下和以250rpm培养过夜，离心培养物(4,000rpm，20min)，将细胞悬浮于1mL TGP中并涂布含12μg/mL卡那霉素的TGP琼脂平板，在68℃下培养过夜。在这些条件下，pUB190无法作为自主复制质粒进行复制。大部分以此种方式获得的菌落——在用于测试乳酸产生的时候——显示LDH-表型，同时乙醇的产量增加，这表明通过在LDH基因座处的整合形成了LDH突变体。
通过双交换生成基因置换LDH突变体
通过上述的转化鉴定了pTMO14的推定的原代整合体(株TM15)，并将其应用于获得双重组体。这是通过在不含卡那霉素的TGP培养基(每50mL的Falcon管中有5mL，250rpm，每次传代转移1％)中对TM15进行5次连续传代培养来实现的，条件在54℃8小时至52℃16小时之间变化。在上述5次传代后，所得培养物被连续稀释，并且将100μL样品涂布至TGP平板上，培养过夜。所得菌落在含有12μg/mL卡那霉素的TGP琼脂上的影印培养被用于鉴定卡那霉素敏感性菌落。在琼脂上划线以得到纯化的单菌落后，检测这些卡那霉素敏感性衍生物的乳酸产生，正如所料，证实其为LDH+和LDH-的混合物。将一种LDH-衍生物TM89进一步用PCR和Southern印迹进行表征。
LDH基因置换的证据
用TM15(原代整合体)和TM89(推定的双重组体LDH-)制备基因组DNA，并用作引物1和4的PCR模板，使用条件如上所述。11955的基因组DNA被作为对照。如上文所述纯化该PCR产物(从所有3个模板中都得到约0.8kb条带)，并且将样品用Not I消化，然后在0.7％的琼脂糖电泳凝胶上进行电泳。11955的PCR产物正如预计，没有显示出被Not I消化，而TM89的PCR产物在约0.4kb的位置有2个条带，表明用突变的等位基因置换了野生型基因。原代整合体TM15的PCR产物的Not I消化主要给出了2个与TM89相同的条带，并有微量的未切割条带(0.8kb)。这一点可通过从TM15基因组DNA的Southern印迹中获得的结果来解释。
用Not I，Pst I和Not I，以及HindIII和Not I消化11955、TM15和TM89的基因组DNA，并在电泳琼脂糖凝胶进行电泳。该DNA被转移至带正电荷的尼龙膜(Roche)上，并与DIG标记(DIG标记试剂盒，Roche，依照生产商的说明书)的探针杂交，所述探针是利用引物1和4(表3)从11955 LDH基因PCR产生的。用提供的检测试剂盒(Roche)使所述杂交条带显影。Southern印迹证明TM15的Not I消化物中存在约7.5kb的大量扩增条带，在TM15的HindIII/Not I和Pst I/Not I的消化物中存在约7.0kb和0.4kb的类似扩增条带，这表明在该原代整合体的LDH基因座上整合了多串联拷贝的pTMO14。进行所有三种限制性消化，TM89显示出不同的限制性模式，显示出比11955多一条杂交带，这与基因置换是相符的。
实施例2：稳定上调的PDH突变体的形成
a)克隆pdh簇并对其测序
基于已知的杆菌属PDH序列和地芽胞杆菌属PDH序列之间的序列同源性，设计了引物5′-AYGCCCGTTTAAATGRTCGATTTCATG-3′(正向；SEQ ID NO.31)和5′-CGAAGTGGCTGGCAATTTGGCTT-3′(反向；SEQ ID NO.32)，并使用来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955的基因组DNA为模版将这些引物用于扩增1.8kb的片段。如前文所述进行该PCR，用纯化的PCR产物连接至pUC19(NEB)中。使用标准的方案将连接混合物用于转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，并分离所包含的质粒，通过限制性分析对其进行表征并且测序。然后，该第一片段被用作探针来筛选以下的库。
使用标准的方案，将来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955的基因组DNA用10种不同的限制性酶进行消化。限制性酶BglII、EcoRV、HindIII和MfeI产生大小为2.5-5kb的DNA片段，将它们克隆以形成多个菌落库(pLITMUS28，New England Biolabs，根据供应商的说明书)。用标记的DNA探针筛选这些库(DIG-标记试剂盒，Roche，根据供应商的说明书)。
将与探针杂交的任何克隆中的DNA片段分离并测序。鉴定了一个包含3.6kb EcoRV基因组DNA片段的克隆，该片段涵盖以前鉴定的1.8kbpdh区域，并从该区域向下游再延伸～1.8kb。该片段编码三个完整基因，5’端以肽脱甲酰基酶2(pdf2)开始。在pdf2的下游是编码推定基因(显示出与来自枯草芽胞杆菌的理论推测蛋白质ykaA(BSU14570)的同源性)的开放阅读框，而下游的下一个阅读框的大小为1110bp，被认为编码丙酮酸脱氢酶Aα亚基(pdhA(α))。紧邻pdhA(α)基因并向EcoRV片段3’端延伸的是一个基因的一部分，该基因被认为编码pdhA β亚基(pdhA(β))。pdhAα和β基因的串联排列与在紧密相关物种中鉴定的已知的pdh基因簇相符合。
重复该用于鉴定所述EcoRV片段的方法，目的是分离其他的DNA片段。使用结合于EcoRV片段3′区域的正向引物5′-ACAAGCAAAAGAAGATATTAAAGAG-3′(SEQ ID NO.5)和反向引物5′-TTTAAGTGCTCTAGGAAAATAACAG-3′(SEQ ID NO.6)，如上文通过PCR形成新的探针GT-DIG2。一系列的限制性酶(其中某些被证明仅切割GTDIG-2区上游)被用于消化从热葡糖苷酶地芽孢杆菌分离的基因组DNA。
分离从NcoI消化得到的片段，并如上文进行克隆(pLITMUS28，NewEngland Biolabs，依照生产商的说明书)。在用GT-DIG2探针进行筛选时，鉴定了一个含NcoI DNA片段的克隆，该NcoI DNA片段由位于EcoRV片段下游的～6kb DNA组成。NcoI和EcoRV片段的序列形成了一条长度为8884bp的连续序列(毗连(序列)群(contig))。序列分析已显示，该毗连(序列)群包含由4个毗连基因组成的pdh基因簇，在该基因簇每一侧有两个推定的基因。该重叠群中编码的基因的组织结构在图2中示出。
b)单交换PDH突变体——理论证据
用于在热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955的LDH-突变体中形成上调的PDH突变体的策略包括：使用前文鉴定的pdhA序列来设计并产生含有pdhA编码序列及位于其之前使得异源启动子易于插入的限制位点的盒，然后将它们插入至合适的整合载体中。需要强的组成型启动子，例如来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌的LDH启动子。该方法显示于图3中。
所需的突变体的形成是通过：将该整合载体转化至宿主菌株中并选择卡那霉素抗性的整合体。这种单交换突变体在不存在抗生素的情况下是不稳定的，这是因为该整合事件容易反复。
i)发挥上调作用的载体的开发
为了使上述策略发挥作用，必须构建新的送递载体，以使得可使用多克隆位点中的NdeI限制位点。以下的表5描述并比较了用pUB190开发的载体：
 
大小(kb) 标记物 mcs Ndel 来源
pUB190 6.7 amp，kan 否 3 用pUC19连接的pUB110
pTMO19 5.4 cat，kan 是 0 来自pUB190的KanR基因插入至pNW33N的EcoRI位点                
pTMO23 2.7 amp 是 0 除去Ndel位点的pUC19
pTMO31 5.1 amp，kan 是 0 EcoRI/SnaBI pUB110片段插入至pUC19          
表5.构建用于发挥上调作用的载体
ii)pdhA主链片段
将从前述克隆至pUC19中的原始1.8kb PCR产物得到的pdhA序列用于设计整合XbaI/NdeI位点的正向引物5′-AATCTAGACATATGGGTGCGAAAACATCCAGATT-3′(SEQ ID NO.7)，使得该NdeI位点的末端ATG代表pdhA基因的推定ATG起始密码子。起始密码子是通过其他pdhA基因的比对及检查可能的阅读框来指定的。
这与反向引物5’-CCAAGCTTTCTTTAATATCTTCTTTTGCTTG-3’(SEQ ID NO.8)(整合一个HindIII位点)组合使用，以使用前述的PCR方案来扩增pdhA(α)基因的前部分。形成了约1kb的PCR产物，将其纯化并连接至pUC19(NEB)中。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析表征所述质粒，然后用NdeI和HindIII消化所述pdhA片段，并使用标准的方案将其亚克隆进pTMO31中。通过测序证实pTMO31中的最终构建体，并命名为pTMO46。
iii)启动子片段和最终送递构建体的形成
然后将启动子片段作为KpnI/NdeI片段克隆至pTMO46构建体中——于pdhA基因之前。选择以下启动子区用于初始的构建体：
 
启动子 来源 用于PCR的寡核苷酸
P_ldh(11955)(302bp)     热葡糖苷酶地芽孢杆菌BCINB 11955乳酸脱氢酶启动子 正向CCGGTACCAAAGAGGGCAATCTGAAAGGAAG(SEQ ID NO.9)反向GGCATATGTGTCTGTCATCCTTTCCAAA(SEQ ID NO.10)
P_ldh(11955短)(172bp)       热葡糖苷酶地芽孢杆菌BCINB 11955乳酸脱氢酶启动子 正向CCGGTACCTGATGTAATTGGATGTGATGAT(SEQ ID NO.11)反向GGCATATGTGTCTGTCATCCTTTCCAAA(SEQ ID NO.12)  
P_ldh(NCA1503)(171bp)       嗜热脂肪芽孢杆菌NCA1503乳酸脱氢酶启动子         正向CCGGTACCGCGGGACGGGGAGCTGAGTGCTC(SEQ ID NO.13)反向GGCATATGATTCATCCTCCCTCAATATAATG(SEQ ID NO.14)
P_ldh(DSM13240)(165bp)        嗜热脂肪芽孢杆菌菌株10(DSM13240)乳酸脱氢酶启动子 正向CCGGTACCGCGGGACGGGGAGCTAGGCGCC(SEQ ID NO.15)反向GGCATATGTATTCACCTCTTCTTCCTTTTT(SEQ ID NO.16)
P_amy(356bp) 嗜热脂肪芽孢杆菌NCA1503α-淀粉酶启动子         正向CCGGTACCGATCATCCCCCGCTCCCTTCTCC(SEQ ID NO.17)反向AACATATGGCCCTTCCCCCTTAATCAAATG(SEQ ID NO.18)
P_ferrA(156bp) 嗜热脂肪芽孢杆菌菌株10(DSM13240)铁氧还蛋白启动子 正向CCGGTACCTATGTGTAAAAATACAAGAGAG(SEQ ID NO.19)反向GGCATATGAATCGAACCTCCCCAAGTTTAT(SEQ ID NO.20)
P_ferrB(183bp) 嗜热脂肪芽孢杆菌菌株10(DSM13240)铁氧还蛋白启动子 正向CCGGTACCTATGATAACAAAACTAAATAAGATGGATATGTGTAAAAAT(SEQ ID NO.21)反向GGCATATGAATCGAACCTCCCCAAGTTTAT(SEQ ID NO.22)   
P_pflX(168bp) 蜡状芽孢杆菌ATCC14579丙酮酸甲酸裂解酶启动子                 正向CCGGTACCAGTTAACACTATATATATAGTA(SEQ ID NO.23)反向GGCATATGAATCTCCTCCATTTTTGATTAG(SEQ ID NO.24)
表6.用于PDH上调的启动子及其来源
设计引物以从基因组DNA(如前文所述从热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955、嗜热脂肪芽胞杆菌NCA1503、嗜热脂肪芽胞杆菌DSM13240和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)ATCC14579分离)产生这些启动子区域作为KpnI/NdeI片段，使用前述的组分和方案获得PCR产物。将纯化的PCR产物连接进pTMO23(删除NdeI位点的pUC19)，并使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征，然后将所述启动子片段用KpnI和NdeI消化并使用标准的方案将其亚克隆至pTMO46中。通过测序证实pTMO46中的最终构建体，并命名为表7中的质粒。
 
载体 亲本 启动子 选择
pTMO58 pTMO46 P_ldh(11955) amp，kan
pTMO59 pTMO46 P_ldh(1503) amp，kan
pTMO83，84 pTMO46 P_ldh(短11955) amp，kan
pTMO93，94 pTMO46 P_ldh(1503二体) amp，kan
pTMO97，98 pTMO46 P_ldh(13240) amp，kan
pTMO103，104 pTMO46 P_ferrA amp，kan
pTMO99，100 pTMO46 P_pflX amp，kan
pTMO101，102 pTMO46 P_pflY amp，kan
表7.用于PDH上调的单交换构建体
iv)最终构建体至热葡糖苷酶地芽孢杆菌主链的整合
使用上述的电穿孔方案用以上的质粒转化TM89。如上述挑选推定的整合体，并在ASYE葡萄糖培养基(无氧条件)中测试乙醇和有机酸的产生，并测试PDH活性。结果在表8中显示。
表8
表8对新启动子整合体在ASYE(0.5％)+2％葡萄糖中的8小时培养物的PDH测定
该新启动子明显给出了相对高水平的PDH活性，显著高于该时间点的TM89(然而，从TM89记录到的低蛋白水平表明，TM89可能已经过了其产量的最高点)。每个启动子的两个整合体之间很少一致，这使得对这些启动子相对强度的比较很困难。
还在增加的葡萄糖水平和较低充气条件下，对用于测试PDH水平的相同菌株进行了乙醇产量的测试，进一步尝试确定任何这些新启动子是否赋予优于原启动子的任何优点。结果显示于以下的表9中：
表9
Figure A200780036097D00221
表9在两种氧限制条件下研究了新启动子在3％的葡萄糖中的效力。
很明显的是，为了完全表征并比较这些启动子，需要产生双重组体，这是因为启动子置换的不稳定性会引起上述测定中的不一致。在最终生物体中也需要稳定的PDH上调突变。
c)双交换PDH突变体
i)最终送递构建体的形成
使用另一系列的载体产生稳定的双交换整合体，所述载体以表7中的pTMO58系列为基础，其中pdhA基因上游的序列被置于启动子片段的前端，如图4中所示。这使得在重组事件中切割载体序列以及将置换启动子稳定地插入至pdh基因前端。
例如，如前述通过PCR扩增热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955pdh簇前面的一部分序列，以在两端都引入KpnI位点。该序列(1072bp)包括326bp的pdf2基因和整个的插入开放阅读框——ykaA同系物——但缺失ykaA和pdhA翻译起始点之间的序列。将纯化的PCR产物连接至pUC19中，并使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征，然后将所述上游片段用KpnI消化并使用标准的方案将其亚克隆至pTMO59。通过限制性分析——以确立该插入片段的方向——并通过测序证实该最终构建体，并且命名为pTMO70。
ii)最终构建体至热葡糖苷酶地芽孢杆菌主链的整合
使用上述的电穿孔方案用pTMO70转化TM89。如上文所述挑选推定的整合体，并在ASYE葡萄糖培养基(无氧条件)中测试乙醇和有机酸的产生，并测试PDH活性。
iii)在TM89中形成双交换P ldh(NCA1503)
选择用pTMO70的转化的两个原代整合体，用于在如上述无卡那霉素的振荡液体培养基中得到连续的传代培养物。在3次传代培养后，将样品稀释并涂于TGP琼脂上。将具有合适菌落数目的平板影印培养于TGP+卡那霉素平板上，挑出卡那霉素敏感的菌落并进行纯化。在ASYE(0.5％)+2％葡萄糖中测试这些菌株的乙醇产量。在16种测试的推定双重组体中，5种(TM179-TM183)呈现出所需的表型(其他似乎与亲本TM89相同)。结果在表10中给出。
 
菌株 残留葡萄糖 乙醇 丙酮酸 乙酸
TM179 0.0 150.5 0.0 25.8
TM180 0.0 152.0 0.0 21.7
TM181 0.0 152.8 0.0 24.3
TM182 0.0 149.5 0.0 23.0
TM183 0.0 146.1 0.0 24.9
TM89 17.4 99.0 10.7 25.3
表10.推定的双交换突变体中的代谢物形成。
d)检查在双重组体中存在来自载体的KanR基因
为了检查来自载体构建中使用的载体的kanR基因不再存在于双重组体菌株TM89和TM180中，使用为kanR基因设计的引物进行了PCR反应，如图3中所示。对照PCR反应包括使用用于pdh基因及前端区域的引物，预计其在TM89和TM180中将以单拷贝存在。分离来自五个菌株(TM15和LC12.1，来自TM89和TM180的单交换整合体，以及TM177)的基因组DNA，将它们用作模板。TM15、LC12.1和TM177都显示卡那霉素抗性，预计它们含有包含kanR基因的载体DNA。用前述的条件和组分进行PCR反应，实验细节在图5中给出。
结果表明，用kan引物在所有单交换菌株中都得到了预计大小(约0.6kb)的PCR产物，这符合预期，但是用kan引物没有从TM89或TM180得到PCR产物。这表明kanR基因不存在于这些双重组体中，这符合预期。然而，使用所有5种基因组DNA，这些pdh区引物都产生了预计大小的产物。LC12.1和TM180基因组DNA产生比其他三个菌株小约0.2kb的产物，这是因为P_ldh(NCA1503)置换插入片段比野生型序列小。
实施例3：稳定的PFL负突变株的产生
严格按照与策略2中LDH敲除相同的方式构建PFL敲除载体，并在图5中给出轮廓图。
a)PFL敲除载体的构建
使用来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌11955的基因组DNA作为模板，将基于已知的杆菌属PFL序列之间的序列同源性设计的简并引物5′-CGTGAAAACGGWGGCGTYCTTGATATGGATACA-3′(正向SEQID NO.25)和5′-TTCGCACCTGGWGCAAAYGGTTCTCC-3′(反向SEQID NO.26)用于扩增1.7kb的片段。如上文所述进行PCR，将得到的纯化PCR产物连接至pUC19(NEB)中。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒，通过限制性分析进行表征并且测序。将所形成的质粒命名为pTMO59。
用引物进行第二系列的PCR，以在片段3的3′末端及片段4的5′末端引入NotI位点。在PCR1中，将引物5′-CCGGAATTTCACTTCCCACGGACCAGGTTA-3′(正向SEQ ID NO.27)和5′-AAGCGGCCGCTATCCAAGAAGGTGGAAACGC-3′(反向SEQ ID NO.28)在前述的条件和组分的情况下与pTMO95组合使用，并将纯化的PCR产物连接至pUC19(NEB)中。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征并且测序。将所形成的质粒命名为pTMO105。
在PCR2中，引物5′-AAGCGGCCGCTGCGCGTCGAATTTGGCGATGA-3′(正向，SEQ ID NO.29)和5′-CCAAGCTTCCGTATACAACGTTAGACGTAA-3′(反向，SEQ ID NO.30)在前述的条件和组分的情况下与pTMO95组合使用，并将纯化的PCR产物连接至pUC19(NEB)中。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征并且测序。将所形成的质粒命名为pTMO107。
用NotI和HindIII消化含片段4的质粒pTMO107。将所形成的片段(622bp)连接至以NotI和HindIII预先消化的含有片段3的pTMO105中。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。如前文，挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征，以确定所述插入片段的方向。通过使用M13mp18反向和正向引物进行测序来鉴定并证实具有所需构建体的预期限制性模式的质粒(pTMO110)。
通过用EcoRI和HindIII消化从pTMO110切下突变的PFL基因片段，将所纯化的片段与以EcoRI和HindIII预先消化的pTMO31连接。使用标准的方案用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(Stratagene)。挑选氨苄西林抗性菌落，分离其包含的质粒并通过限制性分析进行表征，以确定所述插入片段的方向。将所形成的质粒命名为pTMO111。
b)单交换的PFL负变株
如前文所述通过电穿孔将质粒pTMO111导入TM89和TM180中。将两个菌株的转化体培养于液体培养基(2TY+kan12μg/mL)中，并在68℃下以很高细胞浓度涂布于TGP+kan12μg/mL琼脂上以进行整合筛选，如上文所述。
通过在68℃下在TGP+kan12μg/mL琼脂上划线纯化菌落，并用其接种2TY+kan12μg/mL种子培养基以进行产量测试，使用的是15mL Falcon管中的10mL的ASYE(0.5％)+2％葡萄糖(即在低氧条件下)，以及在前文中已被证明可使TM89和TM180产生可测量水平甲酸的条件。在较高氧气水平下不会出现甲酸的产生(见表9)。在TM89和TM180中测试pTMO111推定整合体的结果显示于以下表11中。
表11
Figure A200780036097D00261
表11 TM89和TM180的pTMO111推定整合体(68℃)。
在该测试中，TM89推定整合体的代谢谱(表11)看起来都与TM89很类似。生长不好的pTMO111/TM89/1.1和pTMO111/TM89/1.3是例外，它们产生与TM89类似的甲酸水平(约20mM)，并具有相似的其他代谢物水平和相似的残留葡萄糖水平。然而，该TM89推定整合体可能不是真正的pflB基因座处的整合体。或者，情况可能是这样，即TM89的突变在这些情况下不稳定，并且观察到的结果反映了所选为回复体(质粒环出)，这可能反映了整合体在低充气条件下的较高不稳定性。
TM180推定整合体看起来十分不同。它们与TM180对照相比，都显示出不产生甲酸、低乙酸以及很低的残留葡萄糖。这些为真正的pflB基因座处的整合体，并因此在PFL产生中有缺陷。
c)稳定的基因置换PFL负变株
将两个菌株(pTMO111在TM180和TM89中)的原始整合体都用于产生基因置换的推定双交换。将每个菌株的多个原始整合体在无卡那霉素的振荡液体培养基中连续传代培养，然后将培养物连续稀释，涂布在TGP上，并影印培养在含kan(12μg/mL)的TGP上以鉴定Kans的菌落，如前文所述。
当就甲酸产量的减少对这些KanS菌落进行筛选时，每个宿主的4个菌落均表明有甲酸产量的丧失。这些分离物的代谢谱在表12中给出。
表12：在TM89和TM180中推定的稳定基因置换PFL负变株
在中度氧和低氧两种条件下测试了基于TM89的PFL突变体TM236和TM237。用低氧水平时，这两个菌株的生长很弱。它们仅利用少量的葡萄糖并且仅产生痕量(约5mM)的乙醇。观察到的唯一显著的产物是丙酮酸(约12mM)，没有可测量的甲酸或乙酸。然而，随着氧气的增加，它们的代谢谱变得与TM89更加类似。该表型与PFL敲除一致，其中PDH表达在低通风/无氧条件下太低以至于不能有效地代替PFL的作用；并且该表型将可解释表12中原始整合体所显示出的表型，其中pTMO111在TM89中的推定的原始整合体明显类似于TM89。这将可解释PFL突变体在这些条件下的弱生长，并可为通过同源重组回复至野生型提供强的选择。TM89-TM244和TM245的其他推定的PFL负变株分离自不同的原始整合体，但它们具有与TM36和TM37相似的谱。
基于TM180的PFL突变体TM240、TM241、TM242和TM243(TM243来自与另外三种不同的原始整合体)显示的表型类似于所观察到的表11中基于TM180的原始整合体的表型(与TM180相比，无可测量的甲酸产量、更高的甲酸和更低的乙酸)。因此认为它们是来自基因置换的稳定的PFL突变体。
d)PFL基因置换的证据
为了检验上述的推定PFL突变体是否为真正的基因置换体，建立了一个PCR实验。制备了TM236、TM241、TM242和TM243的基因组DNA。所用的引物是SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，用于从11955产生原始PFL PCR产物，11955提供了用于敲除设计的PFL序列。用于PFL敲除构建体pTMO111中的PFL序列全在引物序列SEQ ID NO.25和26中，这意味着该PFL序列不存在于pTMO111中。因此，利用这些引物，该敲除构建体不会产生PCR产物，而基因置换菌株和野生菌株会产生PCR产物。
来自PFL负基因置换突变体的基因组DNA将产生单PCR产物，该产物比野生的产物小0.4kb，并携带一个新的NotI位点。
以11955基因组DNA和pTMO111质粒DNA作为对照，使用这些引物和基因组DNA可证明，所有4种突变体都产生约1.3kb(理论上1342bp)的单PCR产物，不同于11955的约1.7kb(理论上1694bp)的单产物。如预期，用pTMO111没有得到产物。将来自5个菌株的PCR产物用凝胶纯化，用NotI消化，并在琼脂电泳凝胶上进行电泳。来自所有4个PFL负变株的PCR产物都被完全消化成两个约0.6-0.7kb(理论上：650bp和691bp)的产物，而11955的产物不被NotI切割。该测验是决定性的，因此可以得出结论，这4个菌株都是真正的PFL突变体，所述PFL突变株中的天然pfl基因已经被一个含0.4kb的缺失片段和新NotI位点的pfl基因所置换(通过同源重组)。
木聚糖发酵：
用TM242在市售的木聚糖(Sigma)中进行快速且简单的试管培养实验，所述木聚糖已经经过高压灭菌并且经过多种半纤维素酶的处理。本发明人在HPLC分析中观察到了糖类峰的消失，并且本发明人在进一步的实验中观察到了乙醇的产生——说明该生物不但具有能够发酵经酶处理的半纤维素(商业的木质纤维乙醇生产的最终目标)的能力，而且该生物能够利用需要大量的酶和时间来降解的二聚体——纤维二糖和木二糖——产成葡萄糖和木糖。这对现有技术来说是重大的进步和优点。使用半纤维素酶的乙醇产生的结果显示于表13。
表13-乙醇产生的结果：
Figure A200780036097D00301
94 阿拉伯呋喃糖酶
95 阿拉伯呋喃糖酶
96 木聚糖内切酶
97 β-木糖苷酶(Xylobiase)(β-木糖苷酶(beta-xyloxidase))
还在使用不同糖类作为碳源的情况下测验了突变体11955和TM242的无氧发酵。结果显示于表14。
表14
Figure A200780036097D00311
Figure A200780036097D00321
Figure A200780036097D00331
本文定义为TM89的微生物已经以NCIMB编号41275保藏，质粒pUB190-ldh已经以NCIMB编号41276保藏。保藏单位是：NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA，United Kingdom。
序列表
<110>TMO可再生能源有限公司
<120>用于乙醇生产的嗜热微生物
<130>JWJ01298WO
<160>32
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
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Figure A200780036097D00341
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<211>31
<212>DNA
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<223>引物序列
<400>2
Figure A200780036097D00342
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<211>31
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<223>引物序列
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<220>
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<212>DNA
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<220>
<223>引物序列
<400>6
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<210>7
<211>34
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<213>人工序列
<220>
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<400>7
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<210>8
<211>31
<212>DNA
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<220>
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<400>8
Figure A200780036097D00353
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>热葡糖苷酶地芽孢杆菌(G.thermoglucosidasius)
<400>9
Figure A200780036097D00354
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>热葡糖苷酶地芽孢杆菌
<400>10
Figure A200780036097D00355
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>热葡糖苷酶地芽孢杆菌
<400>11
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<212>DNA
<213>热葡糖廿酶地芽孢杆菌
<400>12
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<210>13
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<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌(G.stearothermophilus)
<400>13
Figure A200780036097D00358
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
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<400>15
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<211>30
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
<400>16
Figure A200780036097D00363
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<211>31
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
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<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
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<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
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<400>20
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<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
<400>21
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<211>30
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌
<400>22
Figure A200780036097D00369
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>蜡状芽孢杆菌(B.cereus)
<400>23
Figure A200780036097D00371
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>热葡糖苷酶地芽孢杆菌
<400>24
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<213>蜡状芽孢杆菌
<400>25
Figure A200780036097D00373
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<213>人工序列
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<100>26
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<213>人工序列
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Figure A200780036097D00375
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Figure A200780036097D00376
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>29
Figure A200780036097D00377
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<213>人工序列
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Figure A200780036097D00381
<210>31
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>31
Figure A200780036097D00382
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>32
Figure A200780036097D00383

Claims (22)

1.一种经过修饰以增加乙醇产量的嗜热微生物，其中第一修饰为将乳酸脱氢酶基因失活，且第二修饰上调丙酮酸脱氢酶基因。
2.根据权利要求1的微生物，其中所述第二修饰是将一个基因启动子插入至丙酮酸脱氢酶的上游，其中所述启动子在无氧条件下起作用。
3.根据权利要求1或2的微生物，包含第三修饰，以使二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶基因(EC 2.3.1.12)失活。
4.根据前述权利要求任一项的微生物，包含另一修饰以使丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因失活。
5.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物不包含限制系统。
6.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物为地芽胞杆菌属(geobacillus)种。
7.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物为热葡糖苷酶地芽孢杆菌(geobacillus thermoglucosidasius)。
8.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物为产孢子细菌(spore-former)。
9.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在包含上限至30％(w/v)乙醇的培养基中是稳定的。
10.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物能代谢纤维二糖、木二糖和/或淀粉，或者它们的寡聚体。
11.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物可被高频转化。
12.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物生长于40℃-85℃的温度下，优选50℃-70℃。
13.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物包含一个非天然的pdc基因。
14.根据前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物包含一个非天然的adh基因。
15.根据前述权利要求任一项的微生物，其中的天然乳酸脱氢酶基因或它的一部分已缺失。
16.根据前述权利要求任一项的微生物，其中在所述微生物的乳酸脱氢酶基因中无整合元件。
17.一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括：在存在C3、C5或C6糖或它们的寡聚体的情况下，在适宜的条件下培养根据前述权利要求任一项的微生物。
18.根据权利要求17的方法，其中在40℃-70℃的温度下进行所述方法。
19.根据权利要求18的方法，其中所述温度为52℃-65℃。
20.根据权利要求17-19任一项的方法，其中所述微生物处于pH4-7.5的培养物中。
21.一种动物饲料，所述饲料包含根据权利要求1-16任一项的微生物。
22.一种微生物，其中所述LDH基因被失活或者以比野生型低的水平表达，并且其中所述PDH基因以高于野生型的水平表达，所述微生物包含灭活的PFL基因。
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