KR101270596B1

KR101270596B1 - 아세테이트 키나아제 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주 및 이를 이용한 에탄올 생산 방법

Info

Publication number: KR101270596B1
Application number: KR1020110110372A
Authority: KR
Inventors: 강권규; 홍성구
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-06-03
Also published as: KR20130046049A

Abstract

본 발명은 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 (Clostridium ljungdahlii) 균주 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.

Description

아세테이트 키나아제 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주 및 이를 이용한 에탄올 생산 방법{Clostridium ljungdahlii with acetate kinase gene knocked out and method for producing ethanol using the same}

본 발명은 아세테이트 키나아제를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주 및 이를 이용한 에탄올 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 (Clostridium ljungdahlii) 균주 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법에 관한 것이다.

클로스트리디움 (Clostridium)은 그람 양성균으로 내생포자를 형성하고, 막대 모양의 박테리아로 구성된 절대혐기성 미생물로 구성되어 있는 규모가 큰 속으로 분류된다. 비록 클로스트리디움이 클로스트리디움 보툴리늄 (Clostridium botulnum)과 같은 악명 높은 병원균을 포함하지만 속의 대부분은 전적으로 양성이고, 산업 바이오 연료의 생산뿐만 아니라 클로스트리디움 스포로게네스 (Clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 노브이 (Clostridium novyi)와 같은 항암 전달 시스템과 같은 가능성 있는 계통으로 최근 들어 부탄올을 생산하고 있는 발효미생물인 솔벤토게닉 (solventogenic) 종에 속한다. 주요 수종의 모든 대표적인 게놈 시퀀스는 결정되어 있고, 다양한 DNA 전송 시스템도 개발되었다.

그러나 축적된 게놈 데이터의 효과적인 이용에 있어 먼저 생합성 경로상 삽입되어 있는 불활성 유전자를 이용하기엔 그 연구가 충분하지 않다. 클로스트리디움 유전자의 불활성화는 상대적으로 가장 최근 클로스트리디움 아세토뷰틸리쿰 (C. acetobutylicum), 클로스트리디움 배제린키 (C. beijerinckii), 클로스트리디움 퍼프린겐스 (C. perfringens) 및 클로스트리디움 디피실리 (C. difficile)와 같은 몇 종에서만 보고되었다. 돌연변이가 거의 독점적으로 복제 결함 플라스미드의 상동 재조합을 통해 Campbell-like integration에 의해 가져온 하나의 크로스오버 넉아웃에 국한되어 발견되었다.

클로스트리디움 리준그달리 (Clostridium ljungdahlii) 균주는 미소한 영양분 조작과 함께 1:1의 생산물 비로(동일 부분 에탄올과 아세틸) 에탄올과 아세틸을 제조하는데 사용되어 왔지만, 에탄올 농도는 1일 당 10g/L 이하의 낮은 생산율을 초래하는 수준인 10g/L 미만이다. 게다가 주로 에탄올의 존재와 조합할 때 상대적으로 높은 (8-10g/L) 농도의 아세틸 (2.5-3 g/L 분자 아세트산) 때문에, 배양 안정성이 문제점이다. 게다가, 더 많은 에탄올을 제조하려는 노력에서 가스 속도가 증가될수록, 배양물은 먼저 분자 아세트산에 의해 그 후는 CO에 의해 억제된다. 그 결과, 배양물은 불안정해지고 가스 흡수에 실패하고 부가적인 생산물을 제조한다. 게다가, 발명자들에 의한 초기 작업은 안정된 상태 작동에서 2:1 이상의 에탄올 대 아세틸 비로 제조하는데 어려움을 보였다.

한편, 한국등록특허 제0879577호에서는 미생물 발효로부터 에탄올의 생산을 증가시키기 위한 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0033087호에서는 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 아세트산 생산 경로에 위치한 아세테이트 키나아제를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주를 개발하여 에탄올 생산 수율을 증가시킨 내용에 관해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아세트산 생산 경로에 위치한 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주가 야생형 균주보다 에탄올 생산량이 두배까지 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 아세테이트 키나아제 넉아웃 클로스트리디움 리준그달리 균주는 야생형에 비해 아세트산 생산량은 감소하고 에탄올 생산수율이 높아진 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 균주는 많은 양의 에탄올을 생산할 수 있어 산업적으로 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 클로스트리디움 리준그달리의 아세테이트 및 에탄올 생합성 경로를 나타낸다.
도 2는 클로스트리디움 리준그달리 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum)의 회분식 배양 및 게놈 DNA 분리를 나타낸다. (A, 혐기성 박테리아의 회분식 배양. 1, PBBM 배지 및 2, 세포 배양; B, 아가 배지에서 세포 성장 테스트. 1, 클로스트리디움 리준그달리 및 2, 클로스트리디움 아우토에타노게눔; C, 클로스트리디움 리준그달리 세포 성장 이미지; D, 클로스트리디움 리준그달리 (1 및 2) 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔 (1' 및 2')로부터 총 게놈 DNA 분리. M, 1kb 마커)
도 3은 클로스트리디움 리준그달리로부터 분리한 아세테이트 키나아제 유전자의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 클로스트리디움 리준그달리로부터 분리한 아세테이트 키나아제와 클로스트리디움 노브이 (Clostridium novyi), 클로스트리디움 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 및 클로스트리디움 보툴리늄 (Clostridium botulinum)의 아세테이트 키나아제의 코딩 영역의 정렬 및 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5는 클로스트리디움 리준그달리로부터 분리한 아세테이트 키나아제 유전자의 계통수를 나타낸다.
도 6은 클로스트리디움 리준그달리 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔이 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 나타낸다. (M, 1kb 사이즈 마커; 1, 알코올 디히드로게나제 유전자; 2, 아세트알데하이드 디히드로게나제 유전자; 3, 아세테이트 키나아제 유전자; 4, 아세틸-CoA-합성 유전자; 5, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자)
도 7은 클로스트리디움 리준그달리 염색체에서 아세테이트 키나아제 목적 유전자로부터 증폭된 PCR 산물부분 (A) 및 pKNOCK 벡터의 구조 (B)를 나타낸다. 벡터 크기는 클로람페니콜 (Cat P) 저항성 유전자를 갖는 약 1.8kb이다.
도 8은 클로스트리디움 리준그달리 게놈 DNA로부터 특이 프라이머를 이용한 아세테이트 키나아제 유전자의 PCR 증폭을 나타낸다. (M, 1kb 사이즈 마커; 1-3, 아세테이트 키나아제 유전자)
도 9는 형질전환 후 DH5α/pGEM-T-Easy-AK 부분의 콜로니 PCR을 나타낸다. (M, 1kb 사이즈 마커; 1-4, 아세테이트 키나아제 유전자 부분)
도 10은 플라스미드 DNA pGEM-T-Easy-AK 부분의 미니프랩을 나타낸다. (M, 1kb 사이즈 마커; 1-5, 시퀀싱 분석에 의해 확인된 플라스미드 DNA 유전자)
도 11은 pGEM-T-Easy-AK 부분의 플라스미드 DNA 미니프랩으로부터 BamHI 및 HindIII 효소로 유전자 절단을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 R6K-복제원점, RP4 플라스미드 oriT 영역 및 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함하는 pKNOCK 벡터를 이용한 삽입 돌연변이의 일반적인 모식도를 나타낸다. pKNOCK 벡터는 그람 음성 박테리아의 염색체로 유전자의 위치-특이적 삽입을 위해 사용되었다.
도 13은 E. coli K12 / pKNOCK-AK 부분으로부터 미니프랩 플라스미드를 나타낸다. (M, 1Kb 사이즈 마커; C, 대조구 벡터; 1-2, 플라스미드 DNA pKNOCK-AK 부분)
도 14는 pKNOCK suicide vector에 의해 유전자 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리로부터 리포터 유전자와 같은 클로람페니콜 저항성 유전자를 PCR로 확인한 결과이다. (M, 1Kb 사이즈 마커; C, 대조구 야생형 세포; 1-4, 돌연변이 클로스트리디움 리준그달리)
도 15는 아세테이트 키나아제 넉아웃 클로스트리디움 리준그달리를 이용한 에탄올 및 아세트산 생산을 나타낸다. 실험은 프락토스 기질을 이용하여 회분식 배양을 위해 CBBM 배지 (pH 5.9)에서 배양한 균주를 확인한 결과를 나타낸다. (WT, 야생형; I, II, III, 아세테이트 키나아제 넉아웃 클로스트리디움 리준그달리)

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 (Clostridium ljungdahlii) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 아세테이트 키나아제를 코딩하는 유전자 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 유전자 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 야생형 클로스트리디움 리준그달리 균주에 비해 에탄올 생성능이 증가된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 아세트산 생산 경로에 위치한 아세테이트 키나아제를 코딩하는 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리 균주가 야생형 균주보다 에탄올 생산량이 두배까지 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 유전자 넉아웃 클로스트리디움 리준그달리 균주의 배양은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 산소가 유입되지 않은 혐기 상태에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 적절한 배양 방법으로는 유가식 배양(fed-batch culture), 회분식 배양(batch culture) 및 연속식 배양(continuous culture) 등이 가능하며, 바람직하게는 유가식 배양이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 첨가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

배양물의 pH는 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 조절할 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃이다. 배양은 원하는 에탄올의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다. 본 발명의 유전자 넉아웃 클로스트리디움 리준그달리 균주를 배양시켜 에탄올을 발효시켜 생산한 후, 에탄올의 회수는 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 배양 배지로부터 분리해낼 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

재료 및 방법

1. 세균 생장, 접합(conjugation) 및 형질전환

클로스트리디움 리준그달리 균주 ATCC55383은 CBBM (Carbonate Buffered Basal Medium, pH5.9) 액체배지와 고체배지를 이용하여 37℃ 배양기에서 혐기성 상태로 성장시켰고, 클로스트리디움 아우토에타노게눔 균주 DSMZ10061은 DSMZ 배지 640 (기본 배지, pH6.0 : 2.0g 트립티카제 펩톤, 1.0g 효모 추출물, 0.75g 시스테인-HCl, 0.5㎖ 0.1% 레사주린, 1.0㎖ 미량원소 및 100㎖ 염 용액)을 이용하여 37℃ 배양기에서 혐기성 상태로 성장시켰다.

접합을 하기 위해 대장균 공여자 (MT616) 및 헬퍼 (carrying pRK600)를 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양하였고, 클로스트리디움 리준그달리 수여 균주와 클로스트리디움 아우토에타노게눔 수여 균주를 각각 해당 배지에서 배양하였다. 1~2일 후 OD₆₀₀에서 0.6정도 되었을 때 수여 균주 배양액을 각각 1:1로 희석하여 42℃에서 2시간 정도 배양한다. 그 후 10㎖ 튜브에 1㎖의 염 (0.8% NaCl) 용액과 공여자 및 헬퍼 배양액을 250㎕씩 넣고 25~40㎕의 수여 균주 배양액을 첨가하여 원심분리하고 상층액을 버린다. 남은 침전물을 50㎕의 염 액과 섞어서 LB 고체 배지에 한 방울 떨어뜨려 30℃에서 하루 정도 배양하였다. 다음날 실험용 면봉으로 배양물을 긁어서 2㎖의 염 용액에 희석하여 100~200㎕를 카나마이신 3ppm이 첨가된 배지에 도말하였다. 1~2일 배양 후 제대로 접합된 콜로니를 선발하여 형질전환 하였다.

2. 아세테이트 키나아제 유전자 분리

① 프라이머 디자인

클로스트리디움 리준그달리의 경로상 아세테이트를 생산 경로에 위치한 유전자를 넉아웃 시키기 위해 해당 유전자의 염기서열 분석 후 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (phosphate acetyltransferase) 유전자 PAT 총 길이 서열의 프라이머는 PAT1, 정방향 5'-ATGTATAATTGTGCTATAATATTGGC-3' (서열번호 2), 역방향 5'-TTATTTCTTTAATCCTTTTTTATATACCC-3' (서열번호 3), 넉아웃 벡터 제작을 위한 프라이머는 PAT2, 정방향 5'-GGATCCGCTTTCATAATGAAGGTGAAT-3' (서열번호 4), 역방향 5'-CTCGAGCCATTAAGCTCTCTATGTC-3' (서열번호 5)와 같이 제작하였다. 아세테이트 키나아제 유전자 AK 총 길이 서열의 프라이머는 AK1, 정방향 5'-ATGAAAATATTAGTAGTAAACTGTGG-3' (서열번호 6), 역방향 5'-TTATTTATTTTCAACTATTTCTTTTG-3' (서열번호 7), 넉아웃 벡터 제작을 위한 프라이머는 AK2, 정방향 5'-GGATCCGCAGCATCCATTCTTATTGACG-3' (서열번호 8), 역방향 5'-AAGCTTCGAATCTATGAGAAGTTCC-3' (서열번호 9)와 같이 프라이머를 합성하였다.

② PCR 증폭

포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자 PAT1과 아세테이트 키나아제 유전자 AK1의 총 길이를 얻기 위해 클로스트리디움 리준그달리 DNA를 주형으로 사용하여 95℃에서 5분간 전 변성시키고, 94℃에서 1분; 55℃에서 1분; 72℃에서 2분을 35회 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자 PAT2와 아세테이트 키나아제 유전자 AK2의 클로닝을 하기 위해 클로스트리디움 리준그달리 DNA를 주형으로 사용하여 95℃에서 5분간 전 변성시키고, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 1분을 35회 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장시켰다.

③ pGEM 벡터 클로닝

PCR로 증폭한 산물 150ng/㎕를 1.5㎖ 튜브에 담고 2X 라이게이션 버퍼 5㎕, pGEM-T 벡터 DNA 1㎕ (50ng/㎕)와 T4 DNA 리가아제 1㎕를 첨가하고 탈이온수로 최종 10㎕를 맞추어 실온에서 2시간 이상 반응 후 대장균 컨피턴트 세포에 형질전환 하였다. E. coli DH5α 컨피턴트 세포 제조는 LB고체 배지에 보존된 E. coli 세포의 단일 콜로니를 5㎖의 LB 배지에 접종하여 37℃, 250rpm에서 하룻밤 진탕 배양한 종배양액을 50㎖의 LB 배지에 1%가 되도록 접종한 후 OD₆₀₀ = 0.4 가 될 때까지 37℃, 250rpm에서 진탕배양 하였다. 배양액을 0℃에서 10분간 방치한 후 2,600g에서 10분간 원심분리하여 침전된 균체를 10㎖의 CaCl₂ 용액에 현탁시키고 2,600g에서 10분간 원심분리하여 침전된 균체를 25㎖의 살균 냉각된 CaCl₂ 용액 (50mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 뒤 0℃에서 30분간 방치하였다. 4℃에서 2,600 rpm 으로 10분간 원심하여 균체를 모으고 4㎖의 냉각된 CaCl₂/글리세롤 (15% (v/v) 글리세롤, 50mM CaCl₂) 용액을 넣어 현탁시켰다. 이 현택액을 100㎕씩 분주하여 -80℃에 보관하면서 컨피턴트 세포로 사용하였다.

④ 플라스미드 분리

콜로니 PCR을 통해서 총 12개의 시료를 선별하고 플라스미드 DNA를 추출하였다. 단일 박테리아 콜로니는 클로람페니콜을 포함한 LB배지에 5㎖ 접종한 후 37℃ 배양기에서 200rpm으로 쉐이킹하여 16시간 동안 배양하였다. 배양액 1㎖을 1.5㎖ 튜브에 분주하고 4℃에서 12,000rpm으로 1분간 원심분리 하였다. 침전된 세포를 차가운 상태의 GTE 용액 I (글루코스 2.25g, 1M Tris-HCl pH8.0, 6.25㎖, 0.5M EDTA 5㎖ per 250㎖) 200㎕를 첨가하여 혼합하고 용액 II (0.2N NaOH, 1% SDS) 200㎕를 첨가한 후, 텝핑하였다. 곧바로 용액 III (3M 포타슘 아세테이트 pH7.5) 200㎕를 첨가하여 텝핑하고 -20℃에 5분 동안 보관한 뒤 4℃에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 다른 튜브에 옮겨, 3㎕의 RNase (10mg/㎖)를 첨가하고 37℃ 항온기에서 30분간 방치한 뒤 PCI (Phenol/Chloroform/Isoamylalchol, 25:24:1)를 500㎕ 넣고 실온에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상층액에 100% 에탄올 1㎖을 첨가해서 30분 동안 -20℃ 냉동고에 보관한 후, 4℃, 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 그 후, 70% 에탄올 500㎕를 넣고 텝핑하고, 12,000rpm으로 5분간 원심분리해서 최종 침전물을 건조하여 멸균수 50㎕에 녹여 사용하였다.

⑤ 염기서열분석 및 NCBI 데이터베이스로부터 상동성 분석

클로스트리디움 리준그달리의 경로상 아세테이트를 생산 경로에 위치한 아세테이트 키나아제 유전자의 염기서열을 이용하여 단백질 블라스트를 실시하여 NCBI 데이터베이스로부터 상동성 분석을 수행하였다.

3. pKnock 벡터 구축

① 아세테이트 키나아제 PCR 분석

E. coli DH5α에 클로닝하여 선발된 콜로니로부터 추출한 클로스트리디움 리준그달리의 아세테이트 키나아제 유전자 AK를 AK2, 정방향 5'-GGATCCGCAGCATCCATTCTTATTGACG-3' (서열번호 8), 역방향 5'-AAGCTTCGAATCTATGAGAAGTTCC-3' (서열번호 9) 프라이머를 사용하여 클로스트리디움 리준그달리 DNA를 주형으로 사용하여 95℃에서 5분간 전 변성시키고, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 1분을 35회 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장시켰다.

② pKNOCK - Cm 벡터 클로닝

클로스트리디움 리준그달리로부터 고함량 에탄올 생산을 위해 pKNOCK suicide vector를 이용하여 아세테이트 키나아제 유전자의 넛아웃을 수행하였다. 클로스트리디움 리준그달리의 아세테이트 키나아제 유전자 총 길이를 증폭하여 pGEM-T easy 벡터에 먼저 클로닝한 후 선발한 콜로니를 직접 콜로니 PCR을 수행하여 확인하였다. 확인된 콜로니의 플라스미드 DNA를 추출한 산물을 제한효소 BamHI과 HindIII를 사용하여 37℃에서 2시간 자른 후 자른 산물을 이용하여 pKNOCK-Cm 벡터에 클로람페니콜 저항성 선발마커를 이용하여 마커 교환을 수행하였다. 클로닝 후 선발된 콜로니를 E. coli K12에 형질전환하여 배양하였다. pKNOCK-Cm suicide vector에 의해 아세테이트 키나아제 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리의 클로람페니콜 저항성 선발마커 삽입여부를 확인하기 위해 대조군과 함께 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 클로람페니콜 저항성 유전자 프라이머 세트는 정방향: 5'-ATGGTATTTGAAAAAATTG-3' (서열번호 10), 역방향: 5'-TTAACTATTTATCAATTCC-3' (서열번호 11) 으로 95℃에서 5분간 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 1분 과정을 35회 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장시켰다.

③ 전기천공법 ( Electroporation )을 이용한 형질전환

-80℃ 초 저온 냉동고에 보관해둔 컨피턴트 세포을 꺼내 얼음에 넣어 녹인 후 라이게이션을 마친 DNA 1~3㎕와 섞어서 전기천공용 큐벳에 주입한 후 1440V 와 1250V로 전기충격을 가해서 형질전환 시켰다. 그리고 즉시 GS 배지 1㎖을 첨가하여 혼합한 후 멸균된 시험관에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 항생제가 포함된 배지에 200㎕를 도말하고 16 시간 동안 배양하여 콜로니를 관찰했다. 선발한 콜로니는 PCR을 수행하여 플라스미드의 크기를 관찰하고 라이케이션 유, 무를 확인했다. 이를 NCBI 데이터베이스로부터 얻어진 아세테이트 키나아제 유전자 AK의 프라이머를 이용하여 도입 여부를 확인하였다.

4. 형질전환 균주의 합성 가스 (55% CO , 20% H ₂ , 15% Ar , 10% CO ₂ )에서의 배양

클로스트리디움 리준그달리의 회분식 배양을 위해 1~1.8 atm의 압력 시스템으로 CO 및 N₂ 가스와 과당 기질을 주입할 수 있는 세럼 유리병 (총 부피 163㎖)을 사용하여 37℃ 배양기에서 배양하였다. 가스 주입 전 만들어진 배양액은 121℃에서 15분간 멸균을 하였다. 멸균 후 액체 배지가 들어있는 유리병 속에 합성가스 (55%의 CO, 20% H₂, 15% Ar, 10% CO₂)를 주입하였다. 배양액은 5% (v/v)으로 접종하였고, 환원물질로는 멸균수 100㎖에 NaOH 0.9g, 시스테인 HCl·H₂O 4.0g, Na₂S·9H₂O 4.0g을 혼합하여 희석하였다.

5. 에탄올 및 아세테이트 분석

에탄올 및 아세테이트 분석을 위해 열전도 탐지기 (thermal conductivity detctor, TCD)와 Carboxen 1000, 100/120 mesh (Suppelco Column) 그리고 적합한 소프트웨어 프로그램을 갖춘 가스 크로마토그래피 (Perkin-Elmer, Chromatograph XL GC)가 사용되었다. 초기 기계 온도는 40℃ (3.5분)로 준비하였고, 분당 가스계의 흐름 속도가 30℃ 증가하여 220℃까지 도달하였고, 분석 온도는 110℃에서 탐지되었다. 추출된 액체상태의 에탄올과 아세테이트는 Porapak QS, 100/120 mesh의 GC 컬럼으로 된 가스 크로마토그래피 (Perkin-Elmer, Chromatograph XL GC)로 분석되었고, 이 GC 컬럼은 100℃로 유지되어 측정되고, 분당 30℃씩 램프가 증가하여 200℃까지 도달하였다. 탐지온도인 이온화검출기 (flame ionization detector, FID)는 220℃에서 설정되었고 유입가스 (N₂)량은 분당 30㎖로 고정되었다.

실시예 1. 클로스트리디움 리준그달리 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔 의 회분식 배양 및 게놈 DNA 분리

클로스트리디움 리준그달리 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔의 회분식 배양을 수행하였다. 도 2A에서와 같이 각각의 혐기성 미생물을 PBBM 액체배지에서 회분식 배양으로 37℃에서 48시간 배양하였고, 도 2B에서와 같이 고체배지에도 도말하여 37℃에서 배양한 미생물을 얻을 수 있었다. 이와 같이 배양된 혐기성 미생물의 활동 모습을 육안으로 확인하기 위해 ZESS-I Axio 현미경을 이용하여 분석한 결과 도 2C 와 같이 활발하게 성장하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 배양된 미생물의 게놈 DNA를 추출하여 전기영동 한 결과는 도 2D에서와 같이 확인할 수 있었다.

실시예 2. 균주로부터 유전자 분리

클로스트리디움 리준그달리 및 클로스트리디움 아우토에타노게눔으로부터 고함량 에탄올과 아세테이트 생산에 관여하는 유전자 5개의 염기서열을 NCBI로부터 얻은 다른 혐기성 미생물의 염기서열과 분석한 결과 (표 2)를 토대로 상동성이 높은 영역에서 프라이머를 디자인한 결과는 표 1과 같다. 합성한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 한 결과 도 6과 같이 각각의 균주에 5개의 유전자가 잘 보존되고 있음을 확인할 수 있었고, NCBI 데이터베이스로부터 얻어진 염기서열로부터 각 유전자의 정렬 결과는 표 3과 같다. 또한 클로스트리디움 리준그달리 생합성 경로에서 넉아웃시킬 아세테이트 키나아제 유전자 염기서열은 도 3과 같이 확인되었다.

클로스트리디움 리준그달리로부터 아세테이트 키나아제 유전자의 아미노산 상동성 분석을 NCBI 데이터베이스를 통해 수행한 결과 클로스트리디움 노브이 (Clostridium novyi), 클로스트리디움 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 보툴리늄 (Clostridium botulinum) 유전자와 99%의 높은 상동성이 있음을 확인할 수 있었고 (도 4), 이에 대한 유전자 간의 계통 분석은 도 5와 같이 나타났다.

실시예 3. 벡터구축

클로스트리디움 리준그달리로부터 고함량 에탄올 생산을 위해 아세테이트 키나아제 유전자의 넉아웃을 수행하였다. 이때 사용된 벡터는 pKNOCK suicide vector로 도 7과 같다. 클로스트리디움 리준그달리의 아세테이트 키나아제 유전자 총길이를 증폭하여 (도 8) pGEM-T easy 벡터에 먼저 클로닝한 후 (도 9), 선발한 콜로니의 플라스미드 DNA를 추출한 결과는 도 10과 같다. 이 산물을 제한효소 BamHI과 HindIII를 사용하여 자른 후 (도 11), 자른 산물을 이용하여 pKNOCK-Cm 벡터에 클로람페니콜 저항성 선발 마커를 이용하여 마커 교환을 수행하였다. 그 결과 도 12와 같이 클로스트리디움 리준그달리의 아세테이트 키나아제 유전자의 특정 염기 서열 사이에 클로람페니콜 저항성 선발마커와 함께 pKNOCK-Cm 벡터의 부분이 마커 교환 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 균주의 항생제 선발 및 형질전환

벡터 구축을 위하여 그람 양성 균주의 항생제 선발 시험을 한 결과 표 4와 같이 클로람페니콜 항생제에서 모두 음성을 보였고, 또한 1x 도 34 ㎍/㎖의 항생 능력을 갖고 있으므로 클로람페니콜로 선발하였다.

구축된 균주의 pKNOCK-AK 영역을 확인하기 위해 콜로니를 배양하여 플라스미드를 추출한 후 확인하였다 (도 13). pKNOCK-Cm suicide vector에 의해 아세테이트 키나아제 유전자가 넉아웃된 클로스트리디움 리준그달리의 클로람페니콜 저항성 선발마커 삽입여부를 확인하기 위해 대조구과 함께 PCR을 수행한 결과 620bp에서 클로람페니콜 저항성 마커 삽입이 확인되었다 (도 14).

실시예 5. 형질전환 균주의 합성 가스 (55% CO , 20% H ₂ , 15% Ar , 10% CO ₂ ) 에서의 배양 및 에탄올 측정

클로스트리디움 리준그달리의 회분식 배양을 통해 아세테이트 키나아제 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 균주를 배양하여 최종적으로 에탄올과 아세트산 생산량을 측정하였다. 그 결과 배양 후 48시간부터 야생형에 비해 형질전환 균주 I, II, III는 1.5배 정도 에탄올 생산량의 차이를 보였고, 96시간 때 최고 2배 정도의 에탄올 생산량 차이를 보였다. 반면에 아세트산은 야생형은 배양 후 96시간째 최고 1 g/L의 생산량을 보였으나 형질전환 균주들은 0.3~0.5 g/L의 생산량을 보였다. 따라서 본 발명에서 목적하였던 클로스트리디움 리준그달리의 생합성 경로상 아세트산 생산 경로에 위치한 아세테이트 키나아제 유전자의 넉아웃을 통해 야생형 균주보다 두 배가량의 에탄올을 생산해 낼 수 있었다 (도 15).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 아세테이트 키나아제 (acetate kinase)를 코딩하는 유전자가 넉아웃되어 야생형 클로스트리디움 리준그달리 균주에 비해 에탄올 생성능이 2배 증가된 클로스트리디움 리준그달리 (Clostridium ljungdahlii) 균주.
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제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법.