CN113684167A

CN113684167A - 用于制造分支酸衍生物的基因工程化微生物

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Publication number: CN113684167A
Application number: CN202110977172.4A
Authority: CN
Inventors: J·B·Y·贝赫伦多夫; M·科普克; L·P·特兰; W·E·阿伦
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2021-11-23
Also published as: BR122023023155A2; EP3303594A4; CN107636147B; CN107636147A; EP3303594A1; KR102390716B1; JP2018522536A; BR112017025309A2; US10174303B2; CA2985481A1; EA036334B1; CA2985481C; EA201792544A1; BR122023023164A2; ZA201707234B; MY186542A; EA036334B9; WO2016191625A1; KR20180002704A; US20160348087A1

Abstract

本发明提供基因工程化微生物和制造分支酸衍生物，如对羟基苯甲酸、水杨酸、2‑氨基苯甲酸、2,3‑二羟基苯甲酸和4‑羟基环己烷甲酸的方法。通常，所述微生物包含以下中的至少一种：(a)外源性分支酸丙酮酸裂解酶，(b)外源性异分支酸合成酶，(c)外源性异分支酸丙酮酸裂解酶和(d)包含破坏性突变的预苯酸合成酶。

Description

用于制造分支酸衍生物的基因工程化微生物

本申请是申请日为2016年5月26日，申请号为201680029367.3(国际申请号PCT/US2016/034495)，发明名称为“用于制造分支酸衍生物的基因工程化微生物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求于2015年5月27日申请的美国临时专利申请第62/167,101号的权益，其全部内容以引入的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及基因工程化微生物以及通过微生物发酵，尤其通过气态底物的微生物发酵产生分支酸衍生物的方法。

背景技术

目前一代由生物途径生产的使用粮食或非粮食作物产生糖或纤维素类原料的日用化学品，具有与土地使用、食品安全、供应波动及环境问题相关的缺点。

长期以来认为，可以利用催化方法将含有一氧化碳(CO)和/或二氧化碳(CO₂)及氢气(H₂)的气体转化成各种燃料和化学品。然而，也可使用微生物来将这类气体生物转化成燃料和化学品。生物方法比催化方法具有若干优点，包括较高特异性、较高产率、较低能量成本和更大催化剂抗毒化耐性。

CO是有机物质，诸如煤或石油和石油衍生物的不完全燃烧的主要自由能富集副产物。举例来说，据报告澳大利亚的钢铁工业每年产生并且向大气中释放超过500,000吨CO。

微生物在作为唯一碳源的CO上生长的能力首次发现于1903年。之后确定这是微生物使用自养生长的乙酰基辅酶A(乙酰基-CoA)生化途径，也称伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)途径的特性。已显示包括一氧化碳营养型、光合、产甲烷和产乙酸微生物的多种厌氧微生物会将CO代谢成各种最终产物，即CO₂、H₂、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。

芳香族化合物对羟基苯甲酸(pHBA)是用于液晶聚合物中的主要单体并且也用作产生对羟基苯甲酸酯(parahydroxybenzoate/parahydroxybenzoic ester)，通常被称为对羟基苯甲酸酯(parabens)的前体。液晶聚合物包括Kevlar和Vectran，具有多种用途。对羟基苯甲酸酯和其盐用于多个行业中，包括化妆品行业、医药行业和食品行业。它们是有效的防腐剂并且可以因其杀细菌和杀真菌特性而用于化妆品配方和食品配方中。

因此，存在对产生pHBA和其它高值分支酸衍生物的额外微生物和方法的需求。

发明内容

本发明提供一种能够制造分支酸衍生物的基因工程化微生物。特定来说，本发明提供一种能够制造至少一种分支酸衍生物的基因工程化微生物，其中细菌包含以下中的至少一种：(a)外源性分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)、(b)外源性异分支酸合成酶(EC5.4.4.2)、(c)外源性异分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.2.99.21)和(d)包含破坏性突变的预苯酸合成酶(EC 5.4.99.5)。在特定实施例中，基因工程化微生物是能够通过含有C1的气态底物的发酵产生至少一种分支酸衍生物的C1固定细菌，诸如梭菌属(Clostridium)细菌。

例如，分支酸丙酮酸裂解酶可以是ubiC，异分支酸合成酶可以是pchA，异分支酸丙酮酸裂解酶可以是pchB，并且预苯酸合成酶可以是pheA。预苯酸合成酶中的破坏性突变可降低或消除预苯酸合成酶的表达或活性。这种破坏性突变可以得到与亲本细菌相比，产生降低量的预苯酸或预苯酸衍生物的细菌和/或基本上不产生酪氨酸或苯丙氨酸的细菌。

本发明微生物可以包含至少一种编码以下中的至少一种的核酸：(a)外源性分支酸丙酮酸裂解酶、(b)外源性异分支酸合成酶、(c)外源性异分支酸丙酮酸裂解酶和(d)包含破坏性突变的预苯酸合成酶。在某些实施例中，核酸是针对梭菌属中的表达而优化的密码子。

分支酸衍生物可以是由分支酸直接或间接制造的任何产物。特定来说，分支酸衍生物可以包含6元碳环(例如苯或环己烷环)，所述6元碳环被羧基或羧酸根阴离子取代并且进一步被一个或多个OH基团和/或一个或多个NH₂基团取代。分支酸衍生物包括但不限于：对羟基苯甲酸、水杨酸盐、2-氨基苯甲酸、二羟基苯甲酸和4-羟基环己烷甲酸。

在一个实施例中，本发明微生物表达分支酸丙酮酸裂解酶ubiC，并且产生分支酸衍生物对羟基苯甲酸。在一个实施例中本发明微生物进一步表达反馈不敏感型DAHP合成酶。

在一个实施例中，本发明微生物表达异分支酸合成酶pchA和异分支酸丙酮酸裂解酶pchB，并且产生分支酸衍生物水杨酸。在一个实施例中本发明微生物进一步表达反馈不敏感型DAHP合成酶。

在一个实施例中，本发明微生物包含包括破坏性突变的预苯酸合成酶并且产生2-氨基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和4-羟基环己烷甲酸的分支酸衍生物中的一种或多种。

在一个实施例中，本发明微生物产生至少一种不会通过亲本微生物产生的分支酸衍生物或与亲本微生物相比，产生较高量的至少一种分支酸衍生物。

在一个实施例中，本发明的细菌由C1固定亲本细菌衍生。在一优选实施例中，本发明的细菌来源于选自由自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)组成的群组的亲本细菌。在特别优选的实施例中，本发明的细菌来源于亲本细菌自产乙醇梭菌亲本细菌，在DSMZ登录号DSM23693下寄存。

本发明另外提供一种产生发酵产物的方法，包含在含有C1气态底物存在下发酵本发明微生物。一般来说，发酵产物是分支酸衍生物。在一优选实施例中，气态底物包含至少一种C1碳源。

附图说明

图1是显示在梭菌中通过原生莽草酸途径产生分支酸的图式。

图2是显示在基因工程化梭菌属细菌中产生pHBA的途径的图式。

图3是显示在基因工程化梭菌属细菌中产生水杨酸的途径的图式。

图4是显示在编码pheA的核酸中包含破坏性突变的基因工程化梭菌属细菌中产生芳香族产物的途径的图式。

图5是显示可信pHBA标准品的定量的标准曲线的图。

图6a是显示可信标准品(i)由自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)LZ1561培养物培养基中的上清液制备的pHBA可信标准品(三甲基硅烷化)、(ii)在水中制备的pHBA可信标准品(三甲基硅烷化)的总离子计数和(iii)三甲基硅烷化pHBA的质谱的图。

图6b是显示所选择的离子监测发酵试样和标准品的图：(i)不具有pARO_01质粒的自产乙醇梭菌LZ1561、来自携带pARO_01质粒的自产乙醇梭菌LZ1561的(ii)和(iii)试样、(iv)pHBA可信标准品和(v)pHBA的NIST数据库条目与来自LZ1561/pARO_01的pHBA峰的总离子计数对比。

图7是pARO_01质粒的图式。分支酸丙酮酸裂解酶(ubiC)和反馈不敏感型DAHP合成酶(aroG*)是伍德-永达尔促进剂(Pwl)的控制下。还显示其它穿梭载体特征。

图8是显示测试菌株中生物量积累的图。通过在不同时间点测量培养物试样在600nm处的吸光度来估计生物量。数据点代表n＝3复制培养物的平均值±1标准差。LZ1561指未转化自产乙醇梭菌LZ1561。pARO_01(1)和pARO_01(2)是用pARO_01质粒转化的自产乙醇梭菌LZ1561的生物复本。

图9a和图9b是显示测试株中对羟基苯甲酸积累的图。图9a显示在24、96、144和192小时时间点的各个试样中检测到的pHBA的定量。取样三个复制培养物用于阴性对照菌株(自产乙醇梭菌LZ1561)和携带pARO_01的自产乙醇梭菌LZ1561的两个生物复本。图9b显示n＝3技术复本的平均值±1SD。

图10是显示在编码pheA的核酸中包含破坏性突变的基因工程化梭菌属细菌中产生新颖芳香族化合物的图。ΔpheA菌株产生4-羟基环己烷甲酸、2-氨基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸，而对照菌株(LZ1561)不产生。

图11a是显示存在和不存在水杨酸生物合成途径诱导的水杨酸产生菌株的生物量增长的图。

图11b是显示存在和不存在水杨酸生物合成途径诱导的测试菌株的液体培养物中水杨酸积累的差异的图。

图12是显示通过发酵在编码pheA的核酸中包含破坏性突变的经工程化的梭菌属细菌产生的4-羟基环己烷甲酸、2-氨基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸的浓度的图。

图13是鉴别分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)的示范性来源的表。

图14是鉴别异分支酸合成酶(EC 5.4.4.2)的示范性来源的表。

图15是鉴别异分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.2.99.21)的示范性来源的表。

具体实施方式

梭菌天然地从磷酸烯醇丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸通过莽草酸途径产生分支酸，其充当芳香族氨基酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的前体(图1)。这一途径详细描述于Bentley，《生物化学与分子生物学评论(Crit Rev Biochem Mol Biol)》，25.5：307-384，1990中。本发明提供能够通过气态底物的发酵产生至少一种分支酸衍生物的基因工程化细菌。

本发明人已证明分支酸衍生物能可持续地从C1碳源产生和回收。本发明提供一种使用含有C1的气态底物作为主要碳源和能源来产生至少一种分支酸衍生物的方法。这样一来，本发明相比于依赖糖或纤维素类底物的方法具有多个优点。例如，糖或纤维素类底物通常也适用于食品(例如甘蔗)并且其密集的土地使用对环境造成负面影响。另外，本发明提供任选地通过使用废气(例如来自工业过程的CO)产生分支酸衍生物的替代方法。因此，本发明提供一个来自废气的收益来源，并且此外，在那些废气中捕获碳来降低若气体散入大气中会造成的碳排放。

异养微生物，诸如大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)，通过糖酵解产生相对高含量的ATP。相比之下，使用C1碳源(例如CO或CO₂)的微生物具有较差ATP可用性。例如，典型一氧化碳营养型微生物自产乙醇梭菌的反应动力学分析给出预测的当产生pHBA，分支酸衍生物)时的ATP产率：对每摩尔经固定的CO-0.4ATP。因此，因为能量限制，不预期会产生任何pHBA。类似地，不预期会通过一氧化碳营养型微生物产生其它分支酸衍生物，因为在自养条件下产生这类化合物的代谢负荷。然而本发明人意外地展示，能够由气态底物产生多种分支酸衍生物。另外，所述产物可以由工业废气产生，相比于其它底物提供实用、经济和环境优势。

特定来说，本发明提供能够通过引入以下中的至少一种来产生至少一种分支酸衍生物的基因工程化微生物：(a)编码外源性分支酸丙酮酸裂解酶的核酸、(b)编码外源性异分支酸合成酶(又名，异分支酸变位酶)的核酸、(c)编码外源性异分支酸丙酮酸裂解酶的核酸和(d)编码包含破坏性突变的预苯酸合成酶的核酸。在一优选实施例中，基因工程化微生物是能够通过气态底物的发酵产生至少一种分支酸衍生物的C1固定细菌。在优选实施例中，C1固定细菌是梭菌属细菌。

“分支酸衍生物”或“由分支酸衍生的产物”或类似术语涵盖由分支酸(chorismate/chorismic acid)直接或间接产生的产物。分支酸衍生物通常包含6元碳环(例如苯或环己烷环)，所述6元碳环(被羧基或羧酸根阴离子取代并且进一步被一个或多个OH基团和/或一个或多个NH₂基团取代。确切地说，分支酸衍生物包括但不限于：对羟基苯甲酸、水杨酸、2-氨基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和4-羟基环己烷甲酸。

本发明微生物可以包含在泛醌生物合成的第一关键步骤中催化分支酸向对羟基苯甲酸和丙酮酸转化的外源性分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)。酶可以来源于具有这种酶的任何微生物。酶可以是UbiC酶。UbiC酶可以来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)或具有UbiC酶的任何其它微生物。在一个实施例中，UbiC酶来源于大肠杆菌并且包含SEQ ID NO:1或其功能上等效的变异体。

类似地，本发明微生物可以包含编码外源性分支酸丙酮酸裂解酶的核酸。核酸可以是来源于具有这种基因的任何微生物的分支酸丙酮酸裂解酶基因。分支酸丙酮酸裂解酶基因可以是ubiC基因。ubiC基因可以来源于大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌或具有ubiC基因的任何其它微生物。在一个实施例中，ubiC基因来源于大肠杆菌并且包含SEQID NO:2或其经密码子优化的或功能上等效的变异体。

UbiC酶或ubiC基因也可被修饰(例如突变)以增强溶解性、稳定性或其它基因/酶特性。这类变体能够带来增加的产物效价。实例4描述通过对羟基苯甲酸的保持来工程化UbiC酶以降低产物抑制的实验方案。一个特定修饰涉及工程化ubiC基因以表达具有两个表面活性丝氨酸而非半胱氨酸的UbiC酶。丝胺酸残基引起较少蛋白质聚集并且，继而提高溶解性。因此，在一特定实施例中，UbiC酶包含能用丝胺酸替代至少一种表面活性半胱胺酸的突变。

在替代实施例中，分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)可以来自或可以来源于，例如，图13中鉴别的来源中的任何一个。

引入外源性分支酸丙酮酸裂解酶(例如ubiC)或编码外源性分支酸丙酮酸裂解酶(例如ubiC)的核酸导致通过本发明微生物产生对羟基苯甲酸，一种分支酸衍生物。对羟基苯甲酸的产生在图2中说明。包括以下物种的C1固定细菌不能天然地产生对羟基苯甲酸：伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、产生布劳特氏菌(Blautia producta)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、嗜一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、大梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、银醋鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)和凯伍嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter kivui)。实际上，由于泛醌通常仅在需氧微生物中产生，通常不会在一氧化碳营养型微生物中发现分支酸丙酮酸裂解酶。尽管可能预期分支酸产生pHBA而非胺基酸的转换将对微生物的生长或存活有不利影响，本发明人已展示，在标准品条件下微生物所受的影响的程度不至于显著损害其存活和生长。

对羟基苯甲酸也可以指，例如pHBA、4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸或对羟基苯甲酸(para-hydroxybenzoate)。如本文所使用，对这些术语中的任何一个的指代涵盖分子的酸和阴离子形式。

本发明微生物可以包含外源性异分支酸合成酶，亦被称作异分支酸变位酶(EC5.4.4.2)，其催化分支酸向异分支酸转化。酶可以来源于具有这种酶的任何微生物。酶可以是PchA酶。PchA酶可以来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或具有PchA酶的任何其它微生物。在一个实施例中，PchA酶来源于绿脓杆菌并且包含SEQ ID NO:3或其功能上等效的变异体。

类似地，本发明微生物可以包含编码外源性异分支酸合成酶的核酸。核酸可以是来源于具有这种基因的任何微生物的异分支酸合成酶基因。异分支酸合成酶基因可以是pchA基因。PchA基因可以来源于绿脓杆菌或具有pchA基因的任何其它微生物。在一个实施例中，pchA基因来源于绿脓杆菌，并且包含SEQ ID NO:4或其经密码子优化的或功能上等效的变异体。

在替代实施例中，异分支酸合成酶(EC 5.4.4.2)可以来自或可以来源于，例如，图14中鉴别的来源中的任何一个。

本发明微生物可以包含外源性异分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.2.99.21)，其催化异分支酸向水杨酸和丙酮酸转化。酶可以来源于具有这种酶的任何微生物。酶可以是PchB酶。PchB酶可以来源于绿脓杆菌或具有PchB酶的任何其它微生物。在一个实施例中，PchB酶来源于绿脓杆菌并且包含SEQ ID NO:5或其功能上等效的变异体。

类似地，本发明微生物可以包含编码外源性异分支酸丙酮酸裂解酶的核酸。核酸可以是来源于具有这种基因的任何微生物的异分支酸丙酮酸裂解酶基因。异分支酸丙酮酸裂解酶基因可以是pchB基因。pchB基因可以来源于绿脓杆菌或具有pchB基因的任何其它微生物。在一个实施例中，pchB基因来源于绿脓杆菌，并且包含SEQ ID NO:6或其经密码子优化或功能上等效的变异体。

在替代实施例中，异分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.2.99.21)可以来自或可以来源于，例如，图15中鉴别的来源中的任何一个。

引入(1)外源性异分支酸合成酶(例如pchA)和(2)外源性异分支酸丙酮酸裂解酶(例如pchB)导致通过本发明微生物产生水杨酸，一种分支酸衍生物。水杨酸的产生在图3中说明，由此分支酸通过异分支酸合成酶转化为异分支酸且随后通过异分支酸丙酮酸裂解酶进一步转化为水杨酸和丙酮酸。包括以下物种的C1固定细菌不能天然地产生水杨酸：伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、产生布劳特氏菌、甲基营养丁酸杆菌、乙酸梭菌、自产乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德氏梭菌、甲酸乙酸梭菌、永达尔梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、银醋鼠孢菌、类球鼠孢菌和凯伍嗜热厌氧杆菌。

水杨酸也可以指例如2-羟基苯甲酸盐、水杨酸(salicylic acid)或2-羟基苯甲酸。

如本文所使用，对这些术语中的任何一个的指代涵盖分子的酸和阴离子形式。

(d)包含破坏性突变的预苯酸合成酶

本发明微生物可以包含包括破坏性突变的预苯酸合成酶(EC 5.4.99.5)。预苯酸合成酶通常催化分支酸向预苯酸转化(即，

变位酶反应)。因此，包含破坏性突变的预苯酸合成酶不能或不大能够催化分支酸向预苯酸转化。包含破坏性突变的预苯酸合成酶可以是包含破坏性突变的pheA。预苯酸合成酶还可被称作分支酸变位酶。

在一些实施例中，pheA可以是进行预苯酸合成酶(即分支酸变位酶)反应(EC5.4.99.5)和预苯酸脱水酶(EC 4.2.1.51)反应的双功能酶。在这两个反应是通过独立的酶进行的微生物中，剔除EC 5.4.99.5活性将引起预苯酸或预苯酸的下游化合物的产生的显著降低或消除，而仅剔除EC 4.2.1.51活性将不会达到相同表现型，因为仍可以产生预苯酸。在一个实施例中，pheA来源于自产乙醇梭菌并且包含SEQ ID NO:11或其功能上等效的变异体。

类似地，本发明微生物可以编码包含包括破坏性突变的预苯酸合成酶的核酸。核酸可以是包含破坏性突变的pheA基因。在一个实施例中，破坏性突变是pheA基因的基因剔除突变。在一个实施例中，pheA基因来源于自产乙醇梭菌且包含SEQ ID NO:10或其经密码子优化的或功能上等效的变异体。

破坏预苯酸合成酶导致降低或消除苯丙氨酸和酪氨酸的产生。出乎意料地，破坏预苯酸合成酶还导致通常不产生的或仅以极低含量产生的额外产物的产生。

特定来说，对预苯酸合成酶(例如pheA)或编码预苯酸合成酶(例如pheA)的核酸引入破坏性突变，导致通过本发明微生物产生2-氨基苯甲酸、二羟基苯甲酸和4-羟基环己烷甲酸(都是分支酸衍生物)中的一种或多种。这些产物的产生途径在图4中说明。许多微生物，包括梭菌物种，诸如自产乙醇梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌，不能天然地产生这些产物或仅能产生极低含量的这些产物。

提供pheA的示范性来源。然而，应了解pheA的其它适合来源可能是可利用的。预苯酸脱水酶来自或可以来源于，例如，以下来源中的任何一个，其序列是可供公开使用的：

2-氨基苯甲酸也可以指，例如2-氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid)、邻氨基苯甲酸(o-aminobenzoic acid)、邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)、邻氨基苯甲酸(anthranilate)或维生素L1。如本文所使用，对这些术语中的任何一个的指代涵盖分子的酸和阴离子形式。

二羟基苯甲酸可以指，例如2,3-二羟基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)、3,4-二羟基苯甲酸或原儿茶酸。如本文所使用，对这些术语中的任何一个的指代涵盖分子的酸和阴离子形式。

4-羟基环己烷甲酸也可以指，例如，顺4-羟基环己烷甲酸或4-羟基环己烷-1-甲酸。

在另一实施例中，本发明微生物另外包括编码反馈不敏感型DAHP合成酶的核酸，DAHP合成酶在莽草酸途径(图1)中催化第一关键步骤，其中赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸被转化为3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸。本发明人认为在途径中这一步骤受制于芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的反馈抑制，如针对大肠杆菌(E.coli)所述(Hu等人，《基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)》，2003，43:399-406)。因此，本发明人根据这一现有技术，研发了反馈不敏感型DAHP合成酶，其被认为会降低被这一反馈抑制降低的分支酸衍生物流出的风险。编码适合DAHP合成酶的核酸是本领域的普通技术人员已知的。然而，举例来说，编码DAHP合成酶的核酸可以来源于大肠杆菌、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)或酿酒酵母。在一个实施例中，DAHP合成酶可以是来自大肠杆菌的反馈不敏感型DAHP合成酶，具有SEQ ID NO:7的核酸序列和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。反馈不敏感型DAHP合成酶可以引入在与编码前述酶中的一个的基因相同的载体上或在不同载体上。反馈不敏感型DAHP合成酶可以具有它自身的启动子或可以在双顺反子排列中接在前述酶中的一个的启动子之后，其中单个启动子驱动编码酶和反馈不敏感型DAHP合成酶的单个mRNA的转录。

在一个实施例中，本发明微生物包含外源性分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)和外源性反馈不敏感型DAHP合成酶。在特定实施例中，微生物包含外源性UbiC酶和外源性反馈不敏感型DAHP合成酶。在一特定实施例中，本发明包含具有SEQ ID NO:1的核酸序列的外源性ubiC基因和具有SEQ ID NO:7的核酸序列的外源性反馈不敏感型DAHP合成酶。在一个实施例中，包含外源性分支酸丙酮酸裂解酶和外源性反馈不敏感型DAHP合成酶的微生物相比于不含反馈不敏感型DAHP合成酶的微生物展现出更多的对羟基苯甲酸产生。

类似地，本发明微生物可以包含编码外源性分支酸丙酮酸裂解酶和反馈不敏感型DAHP合成酶的核酸。

在一个实施例中，本发明微生物包含(i)外源性异分支酸变位酶(EC 5.4.4.2)、(ii)异分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.2.99.21)和(iii)外源性反馈不敏感型DAHP合成酶。在特定实施例中，微生物包含外源性PchA酶、外源性PchB酶和外源性反馈不敏感型DAHP合成酶。在一个实施例中，包含外源性反馈不敏感型DAHP合成酶的微生物相比于不含反馈不敏感型DAHP合成酶的微生物展现出更多的水杨酸产生。

.在另一实施例中，本发明微生物不包含反馈不敏感型DAHP合成酶并且替代地仅包含内源性DAHP合成酶。预期芳香族氨基酸的产生或天然浓度足够低以致不诱导反馈抑制，没有必要引入反馈不敏感型DAHP合成酶。

本发明微生物可以任何浓度或以任何量产生分支酸衍生物。在一个实施例中，本发明微生物以至少约5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、750mg/L、1g/L、1.5g/L或2g/L的浓度产生分支酸衍生物。在一个实施例中，本发明微生物以至少10mg/L、50gm/L、100mg/L、500mg/L、800mg/L或1g/L的浓度产生至少一种分支酸衍生物。

此外，本发明微生物可以经工程化来以某一选择性或最低选择性产生产物。在一个实施例中，目标分支酸衍生物占通过本发明微生物产生的全部发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施例中，目标分支酸衍生物占通过本发明微生物产生的全部发酵产物的至少10％，从而本发明微生物具有至少10％的目标分支酸衍生物选择性。在另一实施例中，目标分支酸衍生物占通过本发明微生物产生的全部发酵产物的至少30％，从而本发明微生物具有至少30％的目标分支酸衍生物选择性。

本发明另外提供一种产生发酵产物，确切地说，分支酸衍生物的方法，包含在气态底物存在下发酵本发明微生物。

本发明还提供通过在气态底物存在下发酵本发明微生物产生的分支酸衍生物。

定义和背景

术语“基因修饰”或“基因工程化”大体上指操控微生物的基因组或核酸。基因修饰的方法包括例如异源基因表达、基因或启动子插入或删除、核酸突变、经改变的基因表达或失活作用、酶工程化、定向进化、基于知识的设计、无规诱变方法、基因改组和密码子优化。

“重组”表示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰、工程化或重组的产物。一般来说，术语“重组”是指含有来源于多个来源的遗传物质或由来源于多个来源的遗传物质编码的核酸、蛋白质或微生物，所述多个来源如两个或更多个不同菌株或物种的微生物。如本文所使用，术语“重组”还可以用于描述包含突变核酸或蛋白质的微生物，包括内源性核酸或蛋白质的突变形式。

“内源性”是指在本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。例如，内源性基因是天然存在于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物的基因。在一个实施例中，内源性基因的表达可以通过，如外源性启动子，的外源性调控元件控制。

“外源性”是指不存在于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。在一个实施例中，外源性基因或酶可以来源于异源(即不同)菌株或物种并且被引入到本发明微生物中或在本发明微生物中表达。在另一实施例中，外源性基因或酶可以人工方式或以重组方式形成并且引入本发明微生物中或在本发明微生物中表达。外源性核酸可经调适来整合于本发明微生物的基因组中或在本发明微生物中保持染色体外状态，例如在质粒中。

“酶活性”广泛地指酶促活性，包括但不限于：酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此，“增加”酶活性包括增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。

“突变”是指本发明微生物中的核酸或蛋白质相比于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物而言已经被修饰。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因的删除、插入或取代。在另一个实施例中，突变可以是酶中的一种或多种氨基酸的删除、插入或取代。

特定来说“破坏性突变”是降低或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以使基因或酶部分失活、充分失活，或删除基因或酶。破坏性突变可以是基因剔除(knockout；KO)突变。破坏性突变可以是降低、防止或阻断通过酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可包括例如，编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因的表达的基因调控元件中的突变、产生降低或抑制酶的活性的蛋白的核酸的引入或抑制酶的表达的核酸(例如反义RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白的引入。破坏性突变可以使用本领域中已知的任何方法引入。

“密码子优化”指用于在特定菌株或物种中优化或提高核酸转译的核酸(如基因)的突变。密码子优化可带来较快转译速率或更高转译精确性。在一优选实施例中，本发明的基因是针对在梭菌属，尤其自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌，中表达而密码子优化的。在另一优选实施例中，本发明的基因是针对在自产乙醇梭菌LZ1561(寄存在DSMZ登录号DSM23693下)中表达而密码子优化的。

“过度表达”是指相比于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物，本发明微生物中的核酸或蛋白质的表达增加。过度表达可利用本领域中已知的任何手段实现，包括修饰基因复本数、基因转录速率、基因转译速率或酶降解速率。

术语“变异体”包括序列不同于参考核酸和蛋白质的序列(如现有技术中所公开或本文中举例说明的参考核酸和蛋白质的序列)的核酸和蛋白质。本发明可以使用与参考核酸或蛋白质执行基本上相同的功能的变异核酸或蛋白质来实施。例如，变异蛋白质可以与参考蛋白质执行基本上相同的功能或与参考蛋白质催化基本上相同的反应。变异基因可以编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变异启动子启动一种或多种基因的表达的能力可以与参考启动子基本上相同。

这类核酸或蛋白质在本文中可以称为“功能等效变异体”。举例来说，核酸的功能等效变异体可以包括等位基因变异体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变异体的实例。这些包括如丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌或永达尔梭菌物种中的同源基因，其细节在如基因库或NCBI等网站上可供公开使用。功能等效变异体还包括序列由于针对特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变异体与参考核酸优选将具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或更大的核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变异体与参考蛋白质优选将具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或更大的氨基酸同源性(同源性百分比)。变异核酸或蛋白质的功能等效性可以使用本领域中已知的任何方法评估。

核酸可以使用本领域中已知的任何方法传递到本发明微生物中。例如，核酸可以按裸露核酸形式传递，或者可以用一种或多种介质(例如，脂质体)调配。视情况，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施例中可以使用限制抑制剂。其它载体可包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在一优选实施例中，使用质粒将核酸传递至本发明微生物中。举例来说，转化(包括转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或结合来实现。在具有活性限制酶体系的某些实施例中，可能需要在将核酸引入至微生物中之前将核酸甲基化。

此外，核酸可以设计为包含调控元件，如启动子，来增加或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想地，启动子是伍德-永达尔途径启动子、铁氧化还原蛋白启动子、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

“微生物”是微观生物，尤其为细菌、古细菌、病毒或真菌。本发明微生物通常是细菌。如本文所使用，“微生物”的叙述应被认为涵盖“细菌”。

“亲本微生物”是用于产生本发明微生物的微生物。亲本微生物可以是天然产生的微生物(即野生型微生物)或已经经过预先修饰的微生物(即突变或重组微生物)。本发明微生物可以经修饰以表达或过度表达在亲本微生物中不表达或过度表达的一种或多种酶。类似地，本发明微生物可以经修饰以含有亲本微生物所没有的一种或多种基因。I在一个实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一优选实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌LZ1561，寄存在DSMZ寄存号DSM23693下。

术语“来源于”表示核酸、蛋白质或微生物从不同的(例如亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物经过修饰或调适，从而产生新的核酸、蛋白质或微生物。这类修饰或调适通常包括核酸或基因的插入、删除、突变或取代。一般来说，本发明微生物来源于亲本微生物。在一个实施例中，本发明微生物来源于自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一优选实施例中，本发明微生物来源于自产乙醇梭菌LZ1561，寄存在DSMZ寄存号DSM23693下。

本发明微生物可以根据功能特性进一步分类。例如，本发明微生物可以来自或可以来源于C1固定微生物、厌氧生物、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳营养菌和/或产甲烷菌。表1提供微生物的代表性列表且鉴别他们的功能特性。

¹伍氏醋酸杆菌可由果糖而非由气体产生乙醇。

²尚未调查大梭菌是否能够在CO上生长。

³已报告热醋穆尔氏菌、穆尔氏菌属HUC22-1中的一个菌株由气体产生乙醇。

⁴尚未调查卵形鼠孢菌是否能够在CO上生长。

⁵尚未调查土壤醋酸鼠孢菌是否能够在CO上生长。

⁶尚未调查类球鼠孢菌是否能够在CO上生长。

“C1”是指一个碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。“C1含氧物”是指还包含至少一个氧原子的一个碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。“C1碳源”是指充当针对本发明微生物的部分或唯一碳源的一个碳分子。举例而言，C1碳源可包含CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂中的一种或多种。优选地，C1碳源包含CO和CO₂中的一种或两种。“C1固定微生物”是具有能够由C1碳源产生一种或多种产物的微生物。通常，本发明微生物是C1固定细菌。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的C1固定微生物衍生。

“厌氧生物”是生长不需要氧气的微生物。在存在氧气的情况下，厌氧生物可能发生不利反应或甚至死亡。通常，本发明微生物是厌氧生物。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的厌氧生物衍生。

“产乙酸菌”是产生或能够产生醋酸(或乙酸)作为厌氧呼吸的产物的微生物。通常，产乙酸菌是使用伍德-永达尔途径作为其能量守恒和合成乙酰CoA与乙酰CoA衍生物(如乙酸盐)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学学报(BiochimBiophys Acta)》,1784:1873-1898,2008)。产乙酸菌使用乙酰CoA途径作为(1)从CO₂还原合成乙酰CoA的机制，(2)终端电子接收、节能程序，(3)CO₂在细胞碳的合成中的固定(同化)机制(《原核生物(The Prokaryotes)》第3版，第354页，纽约，NY，2006中：Drake，产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes))。所有天然存在的产乙酸菌是C1固定、厌氧性、自养性和非甲烷氧化性的。通常，本发明微生物是产乙酸菌。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的产乙酸菌衍生。

“乙醇原”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本发明微生物是乙醇原。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的乙醇原衍生。

“自养生物”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养生物使用无机碳源，如CO和/或CO₂。通常，本发明微生物是自养生物。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的自养生物衍生。

“一氧化碳营养生物”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常，本发明微生物是一氧化碳营养生物。在一优选实施例中，本发明微生物是由表1中所鉴别的一氧化碳营养生物衍生。

“甲烷营养生物”是能够利用甲烷作为唯一碳和能量来源的微生物。在某些实施例中，本发明微生物是由甲烷营养生物衍生。

更广泛地说，本发明微生物可由表1中所鉴别的任何属或种类衍生。在一个优选实施例中，本发明微生物是梭菌属细菌。

在一优选实施例中，本发明微生物是由包含种类自产乙醇梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌的梭菌属的集群衍生。这些种类首先由Abrini，《微生物学档案(Arch Microbiol)》，161:345-351，1994(自产乙醇梭菌)、Tanner，《国际系统细菌学杂志(Int J SystemBacteriol)》，43:232-236，1993(永达尔梭菌)，和Huhnke，WO 2008/028055(拉氏梭菌)报告和表征。

这三个种类有许多相似性。具体地说，所有这些种类都是梭菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和一氧化碳营养型成员。这些种类具有相似的基因型和表现型以及节能和发酵代谢模式。此外，这些种类丛集于梭菌rRNA同源第I族与16S rRNA DNA(其超过99％相同)中，具有约22到30mol％的DNA G+C含量，为革兰氏阳性(gram-positive)，具有相似形态和大小(0.5到0.7×3到5μm之间的细胞的对数生长)，为嗜温性(在30℃到37℃下最佳地生长)，具有约4到7.5的相似pH值范围(具有约5.5到6的最佳pH值)，缺乏细胞色素，并且经由Rnf复合体节能。另外，在这些种类中已显示羧酸还原为其对应的醇(Perez，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》，110:1066-1077，2012)。重要的是，所有这些种类还展示在含CO气体上的强自养生长，产生乙醇和醋酸(或乙酸)作为主要发酵产物，并且在某些条件下产生少量的2,3－丁二醇和乳酸。

然而，这三个种类还具有多个不同。这些种类从不同源分离：自产乙醇梭菌从兔肠中分离、永达尔梭菌从养鸡场废弃物中分离，并且拉氏梭菌从淡水沉积物中分离。这些种类不同在于各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的利用。此外，这些种类不同在于某些维生素(例如硫胺、生物素)营养缺陷。尽管发现所有种类中的这些基因和蛋白质在总体组织和数量上相同，但这些种类在伍德-永达尔途径基因和蛋白质的核序列和氨基酸序列上仍存在差异(

《生物技术前沿观点(Curr Opin Biotechnol)》，22:320-325,2011)。

因此，总的来说，自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的多种特征并不特定于所述种类，但是梭菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和一氧化碳营养型成员的这一集群的一般特征却特定于所述种类。然而，由于这些种类实际上是不同的，所以这些种类中的一种的基因修饰或操作在这些种类的另一种中可能不具有相同的作用。举例来说，可观察到生长、性能或产物制造的不同。

本发明微生物还可以由产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的分离物或突变体衍生。自产乙醇梭菌的分离物和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini，《微生物学档案》，161:345-351，1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)。永达尔梭菌的分离物和突变体包括ATCC 49587(Tanner，《国际系统细菌学杂志》，43:232-236，1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo，《使用永达尔梭菌由合成气体制造生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gasusing Clostridium ljungdahlii)》，博士论文，North Carolina State University，2010)。拉氏梭菌的分离物和突变体包括PI 1(ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

术语“底物”是指本发明微生物的碳源和/或能量源。通常，底物是气态的并且包含C1碳源，例如CO、CO₂和/或CH₄。优选地，底物包含CO或CO+CO₂的C1碳源。底物可更包含其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。

底物一般包含至少一定量的CO，如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％CO。底物可包含一定范围的CO，如约20-80、30-70或40-60mol％CO。优选地，底物包含约40-70mol％CO(例如钢铁厂或高炉气体)、约20-30mol％CO(例如氧气顶吹转炉气体(basic oxygen furnace gas))或约15-45mol％CO(例如合成气)。在一些实施例中，底物可包含相对较低量的公司，如约1-10或1-20mol％CO。本发明微生物通常将底物中的至少一部分CO转化为产物。

底物可包含一定量的H₂。举例来说，底物可包含约1、2、5、10、15、20或30mol％H₂。在一些实施例中，底物可包含相对较高量的H2，如约60、70、80或90mol％H₂。在其它实施例中，底物基本上不含H₂。

底物可包含一定量的CO₂。举例来说，底物可包含约1-80或1-30mol％CO₂。在一些实施例中，底物可包含小于约20、15、10或5mol％CO₂。在另一个实施例中，底物基本上不含CO₂。

虽然底物通常是气态的，但是底物也可以按替代形式提供。举例来说，底物可溶解于使用微泡分布发生器经含CO气体饱和的液体中。另外举例而言，底物可吸附到固体载体上。

底物和/或C1碳源可为以工业工艺的副产物形式获得或来自一些其它来源，诸如来自汽车废气或生物质气化的废气。在某些实施例中，工业工艺选自由以下组成的群组：含铁金属产品制造(如钢铁厂制造)、非铁产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施例中，底物和/或C1碳源可在其被发射于大气中之前使用任何适宜方法从工业工艺采集。

底物和/或C1碳源可为合成气，诸如通过煤炭或精炼厂残留物的气化、生物质的气化或天然气的重整获得的合成气。底物的组成会对反应效率和/或成本产生显著影响。举例来说，氧气(O₂)的存在会降低厌氧发酵工艺的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何不合需要的杂质，如毒素、不合需要的组分或尘粒，和/或增加期望组分的浓度。

本发明微生物可以经过培养而产生一种或多种产物。举例来说，自产乙醇梭菌产生或可经过工程化而产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、丁醇(WO2008/115080和WO 2012/053905)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO 2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)和1-丙醇(WO 2014/0369152)。除了一种或多种目标产物以外，本发明微生物还可产生乙醇、乙酸盐和/或2,3-丁二醇。

“选择率”是指目标产物的产量与由微生物产生的全部发酵产物的产量的比率。此外，本发明微生物可以经工程化来以特定选择率或最低选择率产生产物。在一个实施例中，目标产物占由本发明微生物产生的全部发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施例中，目标产物占由本发明微生物产生的全部发酵产物的至少10％，使得本发明微生物至少10％的目标产物选择率。在另一个实施例中，目标产物占由本发明微生物产生的全部发酵产物的至少30％，使得本发明微生物具有至少30％的目标产物选择率。

通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包括由一个或多个容器、塔或管道布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适合气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所用，术语“培养”和“发酵”可互换地使用。这些术语涵盖培养/发酵工艺的生长期和产物生物合成期。

通常在含有足以允许微生物生长的营养物、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持培养。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是所属领域中众所周知的。

培养/发酵应该理想地在适用于产生目标产物的条件下进行。要考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的气体不会变成限制因素的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。具体来说，可以控制底物的引入速率来确保液相中的气体的浓度不会变成限制因素，因为在气体限制条件下培养会消耗产物。

在高压下操作生物反应器允许增加气体从气相到液相的传质速率。因此，在高于大气压的压力下进行培养/发酵通常是优选的。此外，由于给定的气体转化率在某种程度上随底物保留时间而变，并且保留时间指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低培养/发酵设备的资金成本。这又意味着当在高压而非大气压下维持生物反应器时，可以缩短保留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最优反应条件将部分取决于使用的特定微生物。然而，一般来说，在高于大气压的压力下运作发酵为优选的。此外，由于给定的气体转化速率在某种程度上随底物保留时间而变，并且获得所需保留时间又指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。

可使用所属领域中已知的任何方法或方法组合从发酵液分离或纯化目标产物，所述方法包括例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气提、相分离和萃取发酵(包括例如液-液萃取)。在某些实施例中，通过从生物反应器连续去除一部分发酵液，将微生物细胞与发酵液分离(宜通过过滤)并且从发酵液回收一种或多种目标产物来从发酵液回收目标产物。可例如通过蒸馏回收醇和/或丙酮。可例如通过吸附于活性炭上而回收酸。优选使分离的微生物细胞返回到生物反应器。去除目标产物之后剩余的无细胞渗透物同样优选返回到生物反应器。其它营养物(如维生素B)可以添加到无细胞渗透物中以补给营养物培养基，随后使其返回到生物反应器中。

实例

以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范畴。

实例1

本实例描述培养自产醇梭菌和永达尔梭菌的一般方法。

自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物)和永达尔梭菌DSM13528来源于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstraβe 7 B,38124布伦瑞克，德国(Braunschweig,Germany))。

使用标准厌氧技术，使菌株在37℃下在pH 5.6的PETC培养基中生长(Hungate,《微生物学方法(Methods Microbiol)》,3B:117-132,1969；Wolfe,《微生物生理学进展(AdvMicrobiol Physiol)》,6:107-146,1971)。在顶部空间使用果糖(异养生长)或30psi含CO的钢铁厂气体(从新西格兰布鲁克(Glenbrook,NZ)的新西兰钢铁(New Zealand Steel)现场收集；组成：44％CO、32％N₂、22％CO₂、2％H₂)(自养生长)作为底物。对于固体培养基，添加1.2％细菌琼脂(BD，美国新泽西州富兰克林湖07417(Frankton Lakes,NJ 07417,USA))。

痕量金属溶液组分	每1.0L痕量金属溶液中的量
		氮基三乙酸	2g
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	1g
		Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.8g
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.2g
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.2mg
CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.02g
		NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.02g
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>	0.02g
		NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.02g
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.02g

沃尔夫氏维生素溶液组分	每1.0L沃尔夫氏维生素溶液中的量
		生物素	2mg
叶酸	2mg
		盐酸吡哆醇	10mg
硫胺盐酸盐	5mg
		核黄素	5mg
烟碱酸	5mg
		D-(+)-泛酸钙	5mg
维生素B12	0.1mg
		对氨基苯甲酸	5mg
硫辛酸	5mg

还原剂溶液组分	每100mL还原剂溶液中的量
		NaOH	0.9g
半胱氨酸盐酸盐	4g
		Na<sub>2</sub>S	4g

实例2

本实例说明包含对羟基苯甲酸表达质粒的菌株的构建。

根据自产乙醇梭菌密码子使用表通过基因技术对分支酸丙酮酸裂解酶(ubiC)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)进行优化(SEQ ID NO:2)，并且在伍德-永达尔途径启动子(US20110256600)的控制下克隆于pMTL8315表达载体中(图7)。还包括反馈不敏感型突变体3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(aroG*)的编码序列(SEQ ID NO:8)，之后为呈双顺反子形式的ubiC(图7)。通过与作为供体的大肠杆菌菌株CA434结合而将质粒pARO_01(SEQ ID NO:9)转移到自产乙醇梭菌LZ1561(DSM23693)中。供体菌株在补充有25μg/mL氯霉素和100μg/mL大观霉素的LB培养基中生长隔夜。通过离心由1.5mL培养物收集细胞并且在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中洗涤。在厌氧工作站中，将供体细胞小球再悬浮于200μL按指数规律生长的受体LZ1561中。将结合混合物点样于PETC-MES琼脂培养基上，并在37℃下进行培育。24小时之后，从结合培养盘刮下细胞并铺展在补充有7.5μg/mL甲砜霉素(西格玛(Sigma))和10μg/mL三甲氧苄二氨嘧啶(西格玛)的PETC-MES琼脂培养基上。使三种带有质粒的菌落(亦即三份生物复制(biological triplicate))分离物在含有7.5μg/mL甲砜霉素并且具有模拟钢铁厂废气的气体掺合物(50％CO、10％H₂、30％CO₂、10％N₂，之后在本申请中称作“工厂气体”)作为碳源的PETC-MES液体培养基中生长。

使液体培养物在22psi下的含有甲砜霉素和工厂气体的血清瓶中的10mL PETC-MES培养基中生长。每天采集样品一次来测量生物量(图8)和pHBA(图9a和图9b)。

为了测量pHBA，样品(100μL)外加有10μL 0.1N NaOH，加以冷冻并且随后冷冻干燥。随后用100μL BSTFA+TCMS(99:1)和100μL吡啶衍生样品。随后在60℃下培育样品30min以形成羧酸官能团的三甲基硅烷基衍生物。GC-MS方法的详情是：注入体积为1uL；注入温度为250℃；分流比为10:1。初始温度为50℃(保持5min)；最终温度220℃(20℃/min)；恒定流速1mL/min(He载气)；管柱Zebron ZB-5MS 30m×0.25mm×0.25μm。在全扫描模式40-400m/z下操作瓦里安离子阱4000(Varian Ion Trap 4000)。进行PFTBA调谐。

在图9a中，LZ1561(对照菌株)具有三份技术复制(即，生长和取样进行三次)。还制备具有pARO_01的LZ1561的两份生物复制，各自具有三份技术复制。“技术复制”是指在单独实验中使每种菌株生长并进行取样，而“生物复制”是指从新再制造菌株。通过这种方式，生物复制会造成微生物中背景生物学变化，而技术复制会造成归因于技术问题，包括培养物、取样和分析方法的变化。图9a显示pHBA在单独实例中重复产生。图8和图9b给出生长和pHBA产率的总体图示。

实例3

本实例说明通过气体发酵制造对羟基苯甲酸。

如实例1中所述在工厂气体上生长携带质粒pARO_01(SEQ ID NO:9)的自产乙醇梭菌。如实例1中对培养物进行的GC-MS分析测定出pHBA由表达分支酸丙酮酸裂解酶的细菌产生。使用这一方法进行pHBA分析的线性范围横跨0-12.5mg/mL(图5)。

通过与可靠的pHBA标准物的保留时间和特征碎片离子对比校验pHBA，并且根据NIST质谱资料库预测特征离子(图6)。

在表达分支酸-丙酮酸裂解酶的所有培养物中均观察到pHBA产生，所述裂解酶编码在pMTL8315表达载体上。八天之后，任何一种培养物中观察到的pHBA的滴定度峰值为17mg pHBA/L(图9b)。未在不含表达载体的对照样品中观察到pHBA。

可检测量的pHBA通过基因工程化细菌产生并且存在于培养物中。

实例4

本实例说明用于通过酶工程化增加pHBA产量的实验方案。

UbiC通过保留pHBA进行产物抑制。可对编码ubiC的核酸序列加以修饰以使得与利用酶进行产物保留有关的氨基酸突变，并且使产物释放得到增强。为了做到这一点，通过分析具有结合产物的现有结构来鉴别与pHBA结合有关的氨基酸。随后通过使与pHBA结合和保留有关的氨基酸突变来使产物抑制降到最低。为了以针对pHBA产量的最大催化效率鉴别酶，可制造有针对性的ubiC突变体库，其中pHBA结合氨基酸的不同组合会有所改变，并且以用酶分析对这些突变酶加以分析。改良突变体随后表达于自产乙醇梭菌LZ1561中以验证出pHBA产率改良程度最大的菌株。

实例5

本实例说明包含水杨酸表达质粒的菌株的构建。

对pchA的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)和pchB的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)加以密码子优化，并在四环素诱导型启动子的控制下克隆于表达载体中。通过与作为供体的大肠杆菌菌株CA434结合而将质粒转移到自产乙醇梭菌LZ1561(DSM23693)中。供体菌株在补充有25μg/mL氯霉素和100μg/mL大观霉素的LB培养基中生长隔夜。通过离心由1.5mL培养物收集细胞并且在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中洗涤。在厌氧工作站中，将供体细胞小球再悬浮于200μL按指数规律生长的受体自产乙醇梭菌中。将结合混合物点样于PETC-MES琼脂培养基上，并在37℃下进行培育。24小时之后，从结合培养盘刮下细胞并铺展在补充有7.5μg/mL甲砜霉素(西格玛)和10μg/mL三甲氧苄二氨嘧啶(西格玛)的PETC-MES琼脂培养基上。使三种带有质粒的菌落(亦即三份生物复制)分离物在含有7.5μg/mL甲砜霉素并且具有工厂气体作为碳源的PETC-MES液体培养基中生长。

使液体培养物在22psi下的含有甲砜霉素和工厂气体的血清瓶中的10mL PETC-MES培养基中生长。

以分光光度法监测生物量。在OD600 nm＝0.3下，通过添加40ng无水四环素/mL来诱导水杨酸生物合成途径的表达。在不添加无水四环素的情况下使一式两份培养物(三份生物复制的技术复制)生长，以使得水杨酸生物合成途径保持为未经诱导的。每天采集样品一次

使用气相色谱质谱分析(GCMS)，采用配备有安捷伦(Agilent)CP-SIL 5CB-MS(50m×0.25μm×0.25μm)管柱和自动取样器的赛默科技(Thermo Scientific)ISQ LT GCMS来测量水杨酸浓度。通过用600μL乙腈和50μL 0.1N NaOH稀释300μL样品来制备样品。以14,000rpm涡旋随后离心样品3分钟；将800μL上清液转移到玻璃小瓶，并且在赛默(Thermo)

中干燥样品。干燥后，将样品随后悬浮于含有22mg/ml甲氧基胺盐酸盐的100μL吡啶溶液中，随后在60℃下在密封玻璃小瓶中加热60分钟。在此之后，添加300μL N,O-双三氟乙酰胺(BSTFA)，随后在60℃下在密封玻璃小瓶中加热60分钟。将样品转移到自动取样器，使用1.5μL注射量，20:1的分流比和250℃的入口温度进行分析。用80℃(不保持)的烘箱程序，以3℃/min逐渐上升到140℃，以20℃/min逐渐上升到230℃，最后保持4min来进行层析。管柱流速为38cm²/min，伴随氦气作为载气。MS离子源保持在280℃下。针对定量离子使用267m/z，针对定性离子使用135和45m/z来进行定量。

图11a显示经诱导和未经诱导的样品中生物量增长的对比。图11b显示水杨酸重复产生。

实例6

本实例说明用于提高分支酸衍生物的产量而进行的pheA基因敲除。

pheA(例如来自自产乙醇梭菌，CAETHG_0905(CP006763.1:973789..974925))是编码酶预苯酸合成酶的基因。预苯酸合成酶催化分支酸转化成预苯酸，所述预苯酸是芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的前体。通过使用ClosTron方法(Heap等人，《微生物学方法杂志(J Microbiol Methods)》2010,80(1):49-55)破坏基因而敲除pheA功能。由DNA2.0产生ClosTron质粒pMTL007C-E2并通过与作为供体的大肠杆菌菌株CA434结合而转移到自产乙醇梭菌LZ1561(DSM23693)中。供体菌株在补充有25μg/mL氯霉素的LB培养基中生长隔夜。通过离心由1.5mL培养物收集细胞并且在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中洗涤。在厌氧工作站中，将供体细胞小球再悬浮于200μL按指数规律生长的受体自产乙醇梭菌LZ1561中。将结合混合物点样于PETC琼脂培养基上，并在37℃下进行培育。24小时之后，刮下细胞并再悬浮于500μL PBS中，并铺展在补充有7.5μg/mL甲砜霉素(西格玛)和10μg/mL三甲氧苄二氨嘧啶(西格玛)的PETC琼脂培养基上。使带有质粒的分离物在含有7.5μg/mL甲砜霉素并且具有工厂气体作为碳源的PETC-MES液体培养基中生长。

在含有抗生性克拉霉素(5μg/mL)的PETC固体培养基上对菌落进行划线。这一步骤选用于将内含子再靶向序列整合到基因组中。将内含子序列整合到靶向位点中会引起在基因组中插入1800个碱基对，其用于与菌落PCR一起进行筛选，对阳性ClosTron突变体的PCR产物进行纯化和测序以确定插入位点。

使液体培养物在22psi下的含有克拉霉素和工厂气体的血清瓶中的10mL PETC-MES培养基中生长。由这一血清瓶制备甘油储备液

在2L BioFlo 115水套系统(新泽西州爱迪生市新不伦瑞克科学公司(NewBrunswick Scientific Corp.,Edison,NJ)以1.5L工作体积进行生物反应器实验。CSTR系统配备有两个六叶Rushton叶轮，并且挡板会增强发酵液混合和气体到液体的传质。穿过顶板插入pH和氧化还原电势(ORP)电极(Broadley-James公司)并且以5min时间间隔记录其读数。通过自动化添加5M氢氧化铵溶液将pH维持在5.0。

由甘油储备液制备接种物。将一毫升甘油储备液转移到具有22psi工厂气体作为碳源的50mL PETC培养基中。在振荡器上在37℃下培育培养物两到三天，直到观察到可见生长为止。随后在1L肖特瓶(Schott bottle)中使用培养物来接种200mL新制培养基，并且添加工厂气体，达到22psi压力。将肖特瓶再培育24到36小时，之后转移到发酵罐。

搅拌设定在200rpm下，并且气体流速设定在35mL/min/L。一天之后，以4小时时间间隔使搅拌速率增加25rpm，增加到900rpm的最大值。以4小时时间间隔使气体流速增加25mL/min/L，增加到可实现目标CO吸收的最大流速。在发酵过程中以0.3mL/h的初始抽吸速率添加Na₂S，并且随后当顶部空间中的H₂S浓度降低到小于200～ppm时，以0.2mL/h增量增加速率。使用气相色谱(GC)每小时测量一次CO和H₂消耗量和CO₂产量以及H₂S浓度。在发酵过程中每隔一定间隔从发酵罐取得液体样品以使用HPLC测定细胞质量和代谢物浓度。

在以分批模式开始之后，当OD值达到2时，将发酵罐调成不间断的。通过一个或多个精密蠕动泵(马斯特菲(Masterflex)L/S数码驱动泵)控制培养基和营养物流入速率，同时通过使用触发泵以从CSTR去除发酵液的液位探针使发酵罐体积保持恒定。以一个步骤将稀释速率设定成0.5天^-1并且以24小时时间间隔进一步增加到1天^-1，随后增加到1.7天^-1。

添加到发酵中的额外设备为中空纤维膜(通用电气医疗集团(GE Healthcare))，其孔径为0.2μm并且表面积为1,200cm²。所述膜用于增加发酵中的细胞浓度。通过膜高速抽吸发酵液并返回到发酵罐，同时以比培养基泵速率要慢的速率将无细胞过滤物流抽吸到过滤槽。这使得细菌细胞在发酵罐中的保留时间有所增加。

如图10中所示，使用GC-MS鉴别出三种新型化合物。这些化合物为顺-4-羟基环己烷甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和2-氨基苯甲酸。这些化合物仅在这一pheA::CT培养物中被检测到，并且未在亲本菌株(LZ1561)培养物中被检测到。

使用气相色谱(GC)分析，采用配备有安捷伦CP-SIL 5CB-MS(50m×0.25μm×0.25μm)管柱、自动取样器和火焰离子化检测器(FID)的安捷伦6890N GC测量3,4二羟基苯甲酸、2-氨基苯甲酸和顺-4-羟基环己烷甲酸的浓度。通过用400μL乙腈稀释400μL样品制备样品，随后以14,000rpm离心3分钟；将上清液转移到玻璃小瓶并且在赛默

中干燥样品。干燥后，将样品随后悬浮于400μL N,O-双三氟乙酰胺(BSTFA)和吡啶(3:1比率)的溶液中，并在60℃下在密封玻璃小瓶中加热60分钟。将样品转移到自动取样器，使用1μL注射量，30:1的分流比和250℃的入口温度进行分析。用70℃(不保持)的烘箱程序，以3℃/min逐渐上升到110℃，以15℃/min逐渐上升到230℃，随后以40℃/min最终逐渐上升到310℃，同时保持3min来进行层析。管柱流速为1.8ml/min，伴随氦气作为载气。将FID保持在320℃，伴随用氢(以40ml/min)、空气(以400ml/min)和氦气(以20ml/min)作为补充气体。

图12显示，发酵运作过程中顺-4-羟基环己烷甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和2-氨基苯甲酸的浓度。如图12中所示，在第6天发酵时，化合物顺-4-羟基环己烷甲酸的浓度增加到约0.9g/L。在第8-9天发酵时，2-氨基苯甲酸的浓度累计为约0.45g/L。在第6-8天之间，3,4-二羟基苯甲酸所产生的量较小，浓度峰值为约0.3g/L。在第6天观察到顺-4-羟基环己烷甲酸、2-氨基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸的总累积量为>1.3g/L。

有关顺-4-羟基环己烷甲酸的产生，文献中所知甚少。仅有一个文献报告，使用GC-MS在儿童尿液样品中检测到了顺-4羟基环己烷甲酸。所述化合物被假设为肠细菌性代谢的副产物(Kronick，《临床化学学报(Clinica Chimica Acta)》,132:205-208,1983)。这种化合物似乎可能是分支酸或预苯酸的直接产物，因为反应机制可通过丙酮酸分子裂解，随后需要另外2.5个H₂分子还原来得到解释，所述H₂分子可通过NAD(P)H来提供。

2-氨基苯甲酸是分支酸-色氨酸途径中的已知中间物。邻氨基苯甲酸合成酶催化分支酸的氨基化，随后催化芳构化而获得色氨酸分子的芳香族主链。已知邻氨基苯甲酸合成酶的基因表达通过最终产物色氨酸得到高度调节并经历反馈抑制(Dosselaere，《微生物学评论(Crit Rev Microbiol)》,27:75-131,2001)。当生长停止时，2-氨基苯甲酸仅在发酵液中分泌，其表明所述2-氨基苯甲酸是当生长停止时不再反应的溢流产物(overflowproduct)。

本文中所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请及专利特此以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每一参考文献单独地并且特定地以引用的方式并入并在本文中整体阐述一般。在本说明书中提到任何现有技术时不承认并且不应该认为承认现有技术形成任何国家所致力领域中的公共常识的一部分。

除非本文另外指出或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的内容中(尤其在以下权利要求书的内容中)使用术语“一(a/an)”和“所述”和类似指示物应理解为涵盖单数与复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被理解为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文中对值的范围的叙述仅意图充当单独地提及处于所述范围内的每一个单独的值的速记方法，并且每一个单独的值并入本说明书中，如同在本文中单独地叙述一般。除非在本文中另外指出或另外明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法可以按任何适合的顺序进行。除非另有主张，否则本文中所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明并且不对本发明的范畴造成限制。本说明书中的任何语言都不应理解为指示任何非请求保护的要素对于实践本发明是必需的。

本发明的优选实施例描述于本文中。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这些变化形式，并且本发明人意图以与本文中具体描述不同的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文中另外指出或另外明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能的变化形式的任何组合。

序列表

<110> 朗泽科技新西兰有限公司

<120> 用于制造分支酸衍生物的基因工程化微生物

<130> LT109WO1

<150> US 62/167,101

<151> 2015-05-27

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 1

Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Glu Ile Pro Ala Leu Glu Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu

20 25 30

Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val

35 40 45

Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu

50 55 60

Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu

65 70 75 80

Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro

85 90 95

Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys

100 105 110

Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp

115 120 125

Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro

145 150 155 160

Ala Ser Pro Leu Tyr

165

<210> 2

<211> 273

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 2

tttcccgcgc gctgggaaat cctagagatt ctttgagagc ccttggaaaa tatataggcg 60

cgttgcgcga aaattcgcgc gcttgcaaaa ggctctcgga gagattcccc ttagagagat 120

atagaggata ggggcccgga ggatatatag ggtttgggaa agagagatct gcgcgcgctg 180

aggggaggag agagagatcg ctctagatcg atagcggata gacctctaga gatcccgcgc 240

gatagagaaa gggcctctcg agagatcgcg caa 273

<210> 3

<211> 476

<212> PRT

<213> 绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 3

Met Ser Arg Leu Ala Pro Leu Ser Gln Cys Leu His Ala Leu Arg Gly

1 5 10 15

Thr Phe Glu Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gln Ala Leu Asp Arg Pro Val

20 25 30

Leu Val Ala Ala Ser Phe Glu Ile Asp Pro Leu Asp Pro Leu Gln Val

35 40 45

Phe Gly Ala Trp Asp Asp Arg Gln Thr Pro Cys Leu Tyr Trp Glu Gln

50 55 60

Pro Glu Leu Ala Phe Phe Ala Trp Gly Cys Ala Leu Glu Leu Gln Gly

65 70 75 80

His Gly Glu Gln Arg Phe Ala Arg Ile Glu Glu Asn Trp Gln Leu Leu

85 90 95

Cys Ala Asp Ala Val Val Glu Gly Pro Leu Ala Pro Arg Leu Cys Gly

100 105 110

Gly Phe Arg Phe Asp Pro Arg Gly Pro Arg Glu Glu His Trp Gln Ala

115 120 125

Phe Ala Asp Ala Ser Leu Met Leu Ala Gly Ile Thr Val Leu Arg Glu

130 135 140

Gly Glu Arg Tyr Arg Val Leu Cys Gln His Leu Ala Lys Pro Gly Glu

145 150 155 160

Asp Ala Leu Ala Leu Ala Ala Tyr His Cys Ser Ala Leu Leu Arg Leu

165 170 175

Arg Gln Pro Ala Arg Arg Arg Pro Ser Gly Pro Thr Ala Gly Ala Gln

180 185 190

Gly Asp Ala Ser Ala Gln Glu Arg Arg Gln Trp Glu Ala Lys Val Ser

195 200 205

Asp Ala Val Ser Ser Val Arg Gln Gly Arg Phe Gly Lys Val Val Leu

210 215 220

Ala Arg Thr Gln Ala Arg Pro Leu Gly Asp Ile Glu Pro Trp Gln Val

225 230 235 240

Ile Glu His Leu Arg Leu Gln His Ala Asp Ala Gln Leu Phe Ala Cys

245 250 255

Arg Arg Gly Asn Ala Cys Phe Leu Gly Ala Ser Pro Glu Arg Leu Val

260 265 270

Arg Ile Arg Ala Gly Glu Ala Leu Thr His Ala Leu Ala Gly Thr Ile

275 280 285

Ala Arg Gly Gly Asp Ala Gln Glu Asp Ala Arg Leu Gly Gln Ala Leu

290 295 300

Leu Asp Ser Ala Lys Asp Arg His Glu His Gln Leu Val Val Glu Ala

305 310 315 320

Ile Arg Thr Ala Leu Glu Pro Phe Ser Glu Val Leu Glu Ile Pro Asp

325 330 335

Ala Pro Gly Leu Lys Arg Leu Ala Arg Val Gln His Leu Asn Thr Pro

340 345 350

Ile Arg Ala Arg Leu Ala Asp Ala Gly Gly Ile Leu Arg Leu Leu Gln

355 360 365

Ala Leu His Pro Thr Pro Ala Val Gly Gly Tyr Pro Arg Ser Ala Ala

370 375 380

Leu Asp Tyr Ile Arg Gln His Glu Gly Met Asp Arg Gly Trp Tyr Ala

385 390 395 400

Ala Pro Leu Gly Trp Leu Asp Gly Glu Gly Asn Gly Asp Phe Leu Val

405 410 415

Ala Leu Arg Ser Ala Leu Leu Thr Pro Gly Arg Gly Tyr Leu Phe Ala

420 425 430

Gly Cys Gly Leu Val Gly Asp Ser Glu Pro Ala His Glu Tyr Arg Glu

435 440 445

Thr Cys Leu Lys Leu Ser Ala Met Arg Glu Ala Leu Ser Ala Ile Gly

450 455 460

Gly Leu Asp Glu Val Pro Leu Gln Arg Gly Val Ala

465 470 475

<210> 4

<211> 1431

<212> DNA

<213> 绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 4

atgagccggc tggcgcccct gagccagtgc ctgcacgcct tgcgcggcac cttcgagcgc 60

gccatcggcc aggcgcaggc gctcgatcgt ccggtgctgg tggcggcatc gttcgagatc 120

gacccattgg acccgctgca ggtattcggt gcctgggacg accggcaaac gccctgcctg 180

tactgggaac agcccgagct ggcgttcttc gcctggggct gcgccctgga gctgcaaggc 240

cacggcgaac agcgcttcgc ccggatcgag gaaaactggc aattgctctg cgccgacgcc 300

gtggtcgagg gcccgctggc gccgcgcctg tgcggcggat tccgcttcga tccgcgcggc 360

ccgcgcgagg aacactggca agccttcgcc gatgccagcc tgatgctcgc cggcatcacc 420

gtgctgcgcg agggcgaacg ctaccgggta ctctgccaac acctggccaa gcccggcgaa 480

gatgccctgg ccctggccgc ctaccactgc tcggcgctac tgcgcctgag gcagccggcc 540

agacgccggc cctcggggcc gaccgctggc gcgcagggcg acgcttcggc gcaggagcgc 600

aggcaatggg aagccaaggt gagcgacgcg gtaagcagtg tccgccaggg acgcttcggc 660

aaggtcgtgc tggcccgcac ccaggcccgg cctctcggcg acatcgagcc gtggcaggtc 720

atcgaacacc tgcgtctgca acatgccgac gcccagctgt tcgcctgtcg ccgcggcaac 780

gcctgcttcc tcggcgcctc cccggaacgc ctggtccgca ttcgcgccgg cgaggcactc 840

acccatgccc tggccgggac catcgcccgc ggcggcgatg cccaggaaga tgcgcggctc 900

ggacaggccc tgctggacag cgccaaggac aggcacgaac accagttggt ggtggaggcg 960

atccgtacgg ccctggaacc cttcagcgag gtgctggaaa tccccgatgc gcccggcctg 1020

aaacgactgg cgcgagtcca gcacctgaac acgccgatcc gcgcccgcct cgctgacgca 1080

ggcggcatcc tgcggctgct acaagcgctg catccgaccc ccgcggtggg cggctaccca 1140

cgcagcgcgg cgctggacta catccgccag cacgaaggga tggaccgcgg ctggtacgcc 1200

gcgccgctgg gctggctcga cggcgaaggc aacggcgatt tcctggtggc gctgcgctcg 1260

gccctgctca cgccgggccg gggctacctg ttcgccggct gcggtctggt aggcgattcg 1320

gaaccggccc acgagtatcg cgaaacctgc cttaagctca gtgccatgcg ggaagctcta 1380

tccgccatag gcggcctgga cgaagtgccc ttgcagcgcg gcgtcgcctg a 1431

<210> 5

<211> 102

<212> PRT

<213> 绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 5

Met Met Lys Thr Pro Glu Asp Cys Thr Gly Leu Ala Asp Ile Arg Glu

1 5 10 15

Ala Ile Asp Arg Ile Asp Leu Asp Ile Val Gln Ala Leu Gly Arg Arg

20 25 30

Met Asp Tyr Val Lys Ala Ala Ser Arg Phe Lys Ala Ser Glu Ala Ala

35 40 45

Ile Pro Ala Pro Glu Arg Val Ala Ala Met Leu Pro Glu Arg Ala Arg

50 55 60

Trp Ala Glu Glu Asn Gly Leu Asp Ala Pro Phe Val Glu Gly Leu Phe

65 70 75 80

Ala Gln Ile Ile His Trp Tyr Ile Ala Glu Gln Ile Lys Tyr Trp Arg

85 90 95

Gln Thr Arg Gly Ala Ala

100

<210> 6

<211> 309

<212> DNA

<213> 绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 6

atgatgaaaa ctcccgaaga ctgcaccggc ctggcggaca tccgcgaggc catcgaccgg 60

atcgacctgg atatcgtcca ggccctcggc cgccgcatgg actacgtcaa ggcggcgtcg 120

cgcttcaagg ccagcgaggc ggcgattccg gcgcccgagc gggtcgccgc gatgctcccc 180

gagcgcgccc gctgggccga ggaaaacgga ctcgacgcgc ccttcgtcga gggactgttc 240

gcgcagatca tccactggta catcgccgag cagatcaagt actggcgcca gacacggggt 300

gccgcatga 309

<210> 7

<211> 350

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 7

Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala

20 25 30

Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys

35 40 45

Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His

50 55 60

Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu

85 90 95

Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His

100 105 110

Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys

115 120 125

Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly

145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Asp Ala

165 170 175

Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys

195 200 205

Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser

210 215 220

Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala

245 250 255

Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser

260 265 270

Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln

275 280 285

Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His

290 295 300

Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr

305 310 315 320

Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly

340 345 350

<210> 8

<211> 1053

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 8

atgaattatc aaaatgatga tttaagaata aaagaaatta aagaattatt acctcctgta 60

gctttattag aaaaatttcc tgcaactgaa aatgcagcaa atactgtagc acatgcaaga 120

aaagcaatac ataaaatact taaaggtaat gatgatagat tattagtagt aataggacct 180

tgtagtatac atgatcctgt agcagcaaaa gaatatgcaa ctagactttt agcattaaga 240

gaagaattaa aagatgaatt agaaatagta atgagagtat attttgaaaa acctagaact 300

actgtaggat ggaaaggact tataaatgat cctcatatgg ataatagttt tcaaataaat 360

gatggactta gaatagcaag aaaattactt ttagatataa atgatagtgg attacctgca 420

gctggtgaat ttttagatat gataactcct caatatttag cagatttaat gagttgggga 480

gcaattggag caagaactac tgaaagtcaa gtacatagag aagatgcaag tggacttagt 540

tgtcctgtag gatttaaaaa tggaactgat ggaactataa aagtagcaat agatgcaata 600

aatgcagctg gtgcacctca ttgttttctt agtgtaacaa aatggggaca tagtgcaata 660

gtaaatacta gtggaaatgg tgattgtcat ataatactta gaggtggaaa agaacctaat 720

tattctgcaa aacatgtagc agaagtaaaa gaaggactta ataaagctgg acttcctgca 780

caggtaatga tagatttttc tcatgcaaat agtagtaaac aatttaagaa acaaatggat 840

gtatgtgcag atgtatgtca gcaaatagct ggaggtgaaa aagcaataat tggagtaatg 900

gtagaaagtc atttagtaga aggtaatcaa agtttagaaa gtggtgaacc tttagcttat 960

ggaaaaagta taactgatgc atgtatagga tgggaagata ctgatgcact tcttagacaa 1020

cttgcaaatg cagtaaaagc aagaagagga taa 1053

<210> 9

<211> 6561

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60

atcaggaaac agctatgacc gcggccgcag atagtcataa tagttccaga atagttcaat 120

ttagaaatta gactaaactt caaaatgttt gttaaatata taccaaacta gtatagatat 180

tttttaaata ctggacttaa acagtagtaa tttgcctaaa aaattttttc aatttttttt 240

aaaaaatcct tttcaagttg tacattgtta tggtaatatg taattgaaga agttatgtag 300

taatattgta aacgtttctt gattttttta catccatgta gtgcttaaaa aaccaaaata 360

tgtcacatgc aattgtatat ttcaaataac aatatttatt ttctcgttaa attcacaaat 420

aatttattaa taatatcaat aaccaagatt atacttaaat ggatgtttat tttttaacac 480

ttttatagta aatatattta ttttatgtag taaaaaggtt ataattataa ttgtatttat 540

tacaattaat taaaataaaa atagggtttt aggtaaaatt aagttatttt aagaagtaat 600

tacaataaaa attgaagtta ttgctttaag gagggaatta ttcatatgag tcatcctgca 660

cttactcaac ttagagcatt aagatatttt aaagaaatac ctgcattaga acctcaatta 720

ttagattggt tattacttga agatagtatg actaaaagat ttgaacaaca gggaaaaact 780

gtaagtgtaa ctatgataag agaaggattt gtagaacaaa atgaaatacc tgaagaatta 840

cctttattac ctaaagaaag tagatattgg ttaagagaaa tattactttg tgcagatggt 900

gaaccttggt tagctggaag aactgtagta cctgtaagta ctttaagtgg acctgaactt 960

gcacttcaaa aattaggaaa aactccttta ggaagatatc tttttactag tagtacttta 1020

actagagatt ttatagaaat tggaagagat gcaggattat ggggaagaag aagtagatta 1080

agattaagtg gaaaaccttt attacttact gaattatttc ttcctgcaag tcctctttat 1140

taagaattcg agctcggtag gaggtcagaa tgaattatca aaatgatgat ttaagaataa 1200

aagaaattaa agaattatta cctcctgtag ctttattaga aaaatttcct gcaactgaaa 1260

atgcagcaaa tactgtagca catgcaagaa aagcaataca taaaatactt aaaggtaatg 1320

atgatagatt attagtagta ataggacctt gtagtataca tgatcctgta gcagcaaaag 1380

aatatgcaac tagactttta gcattaagag aagaattaaa agatgaatta gaaatagtaa 1440

tgagagtata ttttgaaaaa cctagaacta ctgtaggatg gaaaggactt ataaatgatc 1500

ctcatatgga taatagtttt caaataaatg atggacttag aatagcaaga aaattacttt 1560

tagatataaa tgatagtgga ttacctgcag ctggtgaatt tttagatatg ataactcctc 1620

aatatttagc agatttaatg agttggggag caattggagc aagaactact gaaagtcaag 1680

tacatagaga agatgcaagt ggacttagtt gtcctgtagg atttaaaaat ggaactgatg 1740

gaactataaa agtagcaata gatgcaataa atgcagctgg tgcacctcat tgttttctta 1800

gtgtaacaaa atggggacat agtgcaatag taaatactag tggaaatggt gattgtcata 1860

taatacttag aggtggaaaa gaacctaatt attctgcaaa acatgtagca gaagtaaaag 1920

aaggacttaa taaagctgga cttcctgcac aggtaatgat agatttttct catgcaaata 1980

gtagtaaaca atttaagaaa caaatggatg tatgtgcaga tgtatgtcag caaatagctg 2040

gaggtgaaaa agcaataatt ggagtaatgg tagaaagtca tttagtagaa ggtaatcaaa 2100

gtttagaaag tggtgaacct ttagcttatg gaaaaagtat aactgatgca tgtataggat 2160

gggaagatac tgatgcactt cttagacaac ttgcaaatgc agtaaaagca agaagaggat 2220

aactctagag tcgacgtcac gcgtccatgg agatctcgag gcctgcagac atgcaagctt 2280

ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 2340

tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 2400

tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgctagcata aaaataagaa 2460

gcctgcattt gcaggcttct tatttttatg gcgcgccgcc attatttttt tgaacaattg 2520

acaattcatt tcttattttt tattaagtga tagtcaaaag gcataacagt gctgaataga 2580

aagaaattta cagaaaagaa aattatagaa tttagtatga ttaattatac tcatttatga 2640

atgtttaatt gaatacaaaa aaaaatactt gttatgtatt caattacggg ttaaaatata 2700

gacaagttga aaaatttaat aaaaaaataa gtcctcagct cttatatatt aagctaccaa 2760

cttagtatat aagccaaaac ttaaatgtgc taccaacaca tcaagccgtt agagaactct 2820

atctatagca atatttcaaa tgtaccgaca tacaagagaa acattaacta tatatattca 2880

atttatgaga ttatcttaac agatataaat gtaaattgca ataagtaaga tttagaagtt 2940

tatagccttt gtgtattgga agcagtacgc aaaggctttt ttatttgata aaaattagaa 3000

gtatatttat tttttcataa ttaatttatg aaaatgaaag ggggtgagca aagtgacaga 3060

ggaaagcagt atcttatcaa ataacaaggt attagcaata tcattattga ctttagcagt 3120

aaacattatg acttttatag tgcttgtagc taagtagtac gaaaggggga gctttaaaaa 3180

gctccttgga atacatagaa ttcataaatt aatttatgaa aagaagggcg tatatgaaaa 3240

cttgtaaaaa ttgcaaagag tttattaaag atactgaaat atgcaaaata cattcgttga 3300

tgattcatga taaaacagta gcaacctatt gcagtaaata caatgagtca agatgtttac 3360

ataaagggaa agtccaatgt attaattgtt caaagatgaa ccgatatgga tggtgtgcca 3420

taaaaatgag atgttttaca gaggaagaac agaaaaaaga acgtacatgc attaaatatt 3480

atgcaaggag ctttaaaaaa gctcatgtaa agaagagtaa aaagaaaaaa taatttattt 3540

attaatttaa tattgagagt gccgacacag tatgcactaa aaaatatatc tgtggtgtag 3600

tgagccgata caaaaggata gtcactcgca ttttcataat acatcttatg ttatgattat 3660

gtgtcggtgg gacttcacga cgaaaaccca caataaaaaa agagttcggg gtagggttaa 3720

gcatagttga ggcaactaaa caatcaagct aggatatgca gtagcagacc gtaaggtcgt 3780

tgtttaggtg tgttgtaata catacgctat taagatgtaa aaatacggat accaatgaag 3840

ggaaaagtat aatttttgga tgtagtttgt ttgttcatct atgggcaaac tacgtccaaa 3900

gccgtttcca aatctgctaa aaagtatatc ctttctaaaa tcaaagtcaa gtatgaaatc 3960

ataaataaag tttaattttg aagttattat gatattatgt ttttctatta aaataaatta 4020

agtatataga atagtttaat aatagtatat acttaatgtg ataagtgtct gacagtgtca 4080

cagaaaggat gattgttatg gattataagc ggccggccag tgggcaagtt gaaaaattca 4140

caaaaatgtg gtataatatc tttgttcatt agagcgataa acttgaattt gagagggaac 4200

ttagatggta tttgaaaaaa ttgataaaaa tagttggaac agaaaagagt attttgacca 4260

ctactttgca agtgtacctt gtacctacag catgaccgtt aaagtggata tcacacaaat 4320

aaaggaaaag ggaatgaaac tatatcctgc aatgctttat tatattgcaa tgattgtaaa 4380

ccgccattca gagtttagga cggcaatcaa tcaagatggt gaattgggga tatatgatga 4440

gatgatacca agctatacaa tatttcacaa tgatactgaa acattttcca gcctttggac 4500

tgagtgtaag tctgacttta aatcattttt agcagattat gaaagtgata cgcaacggta 4560

tggaaacaat catagaatgg aaggaaagcc aaatgctccg gaaaacattt ttaatgtatc 4620

tatgataccg tggtcaacct tcgatggctt taatctgaat ttgcagaaag gatatgatta 4680

tttgattcct atttttacta tggggaaata ttataaagaa gataacaaaa ttatacttcc 4740

tttggcaatt caagttcatc acgcagtatg tgacggattt cacatttgcc gttttgtaaa 4800

cgaattgcag gaattgataa atagttaact tcaggtttgt ctgtaactaa aaacaagtat 4860

ttaagcaaaa acatcgtaga aatacggtgt tttttgttac cctaagttta aactcctttt 4920

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 4980

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 5040

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 5100

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 5160

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 5220

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 5280

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 5340

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 5400

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 5460

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 5520

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 5580

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 5640

ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 5700

ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 5760

cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcag ggccccctgc ttcggggtca ttatagcgat 5820

tttttcggta tatccatcct ttttcgcacg atatacagga ttttgccaaa gggttcgtgt 5880

agactttcct tggtgtatcc aacggcgtca gccgggcagg ataggtgaag taggcccacc 5940

cgcgagcggg tgttccttct tcactgtccc ttattcgcac ctggcggtgc tcaacgggaa 6000

tcctgctctg cgaggctggc cggctaccgc cggcgtaaca gatgagggca agcggatggc 6060

tgatgaaacc aagccaacca ggaagggcag cccacctatc aaggtgtact gccttccaga 6120

cgaacgaaga gcgattgagg aaaaggcggc ggcggccggc atgagcctgt cggcctacct 6180

gctggccgtc ggccagggct acaaaatcac gggcgtcgtg gactatgagc acgtccgcga 6240

gctggcccgc atcaatggcg acctgggccg cctgggcggc ctgctgaaac tctggctcac 6300

cgacgacccg cgcacggcgc ggttcggtga tgccacgatc ctcgccctgc tggcgaagat 6360

cgaagagaag caggacgagc ttggcaaggt catgatgggc gtggtccgcc cgagggcaga 6420

gccatgactt ttttagccgc taaaacggcc ggggggtgcg cgtgattgcc aagcacgtcc 6480

ccatgcgctc catcaagaag agcgacttcg cggagctggt gaagtacatc accgacgagc 6540

aaggcaagac cgatcgggcc c 6561

<210> 10

<211> 1137

<212> DNA

<213> 自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）

<400> 10

ttggaagatt tggagtattt aagagatgag ataaataaaa tagataaaga aatgattgaa 60

ctttttgaaa agagggcaaa agtatctcgc aaagtagcag aatataaaat ggaaaattct 120

atggatatac ttgataaatc aagagaagaa gaggtaataa aggttaactt aaaaaatctt 180

aaagataagt ctataaaaga tgaaactaaa atctttttga agaatgttat ggaaataagc 240

aggaacatac aaaaaagaga attcaaacaa tcttctaaaa gtagtgaaat taagcctaaa 300

gggcaaaata gtgatttatt taaaattgga tttcaaggag taccagcatc tttcagtcat 360

gaagcactgt tagagtattt tggaaatgaa tcagaagcat taaactttga aagctttaaa 420

gatgtatttg aagctctaaa aaatggggct ataaagtatg gcgttcttcc tattgaaaat 480

tcctctacag gtggcatccc acaggtttat gatcttatag gagaatatga cttttacata 540

gttggagaaa aatgtattga agtaaatcac aatttattag gagtaaaggg agcgtctatt 600

tccgatataa aagaagttta ttctcatagt caagcattta tgcaaagtag taaatttctg 660

gagaaacaca agaattggaa gctaaatccc tattttaata cagctagaag tgccaaatat 720

ataagtgagc aaaatgttaa gagtaaagct gctatagcaa gtaaaaatgc agcaaaactt 780

tatggacttg atataataga aaaaaatata aattataaca gcaataatta cactagattt 840

ataataatag gaaaaaatat agaaagtgat aaacaacgtg acaagataag tatattgatt 900

actctgccgc atgaaccagg aactctttat aatgttttga agtatttcca tgaaaataac 960

ttgaatatga ctaaaataga gtcaaggcct ataataaata aatcctggca gtacttcttt 1020

tacattgatt ttaatggaaa tattatggat aaagatacta ggtatgcttt aaatggtata 1080

gaagaagaaa gcgcatattt taaacttttg gggaattaca aaggagattg tttttag 1137

<210> 11

<211> 378

<212> PRT

<213> 自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）

<400> 11

Met Glu Asp Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Glu Ile Asn Lys Ile Asp Lys

1 5 10 15

Glu Met Ile Glu Leu Phe Glu Lys Arg Ala Lys Val Ser Arg Lys Val

20 25 30

Ala Glu Tyr Lys Met Glu Asn Ser Met Asp Ile Leu Asp Lys Ser Arg

35 40 45

Glu Glu Glu Val Ile Lys Val Asn Leu Lys Asn Leu Lys Asp Lys Ser

50 55 60

Ile Lys Asp Glu Thr Lys Ile Phe Leu Lys Asn Val Met Glu Ile Ser

65 70 75 80

Arg Asn Ile Gln Lys Arg Glu Phe Lys Gln Ser Ser Lys Ser Ser Glu

85 90 95

Ile Lys Pro Lys Gly Gln Asn Ser Asp Leu Phe Lys Ile Gly Phe Gln

100 105 110

Gly Val Pro Ala Ser Phe Ser His Glu Ala Leu Leu Glu Tyr Phe Gly

115 120 125

Asn Glu Ser Glu Ala Leu Asn Phe Glu Ser Phe Lys Asp Val Phe Glu

130 135 140

Ala Leu Lys Asn Gly Ala Ile Lys Tyr Gly Val Leu Pro Ile Glu Asn

145 150 155 160

Ser Ser Thr Gly Gly Ile Pro Gln Val Tyr Asp Leu Ile Gly Glu Tyr

165 170 175

Asp Phe Tyr Ile Val Gly Glu Lys Cys Ile Glu Val Asn His Asn Leu

180 185 190

Leu Gly Val Lys Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ile Lys Glu Val Tyr Ser

195 200 205

His Ser Gln Ala Phe Met Gln Ser Ser Lys Phe Leu Glu Lys His Lys

210 215 220

Asn Trp Lys Leu Asn Pro Tyr Phe Asn Thr Ala Arg Ser Ala Lys Tyr

225 230 235 240

Ile Ser Glu Gln Asn Val Lys Ser Lys Ala Ala Ile Ala Ser Lys Asn

245 250 255

Ala Ala Lys Leu Tyr Gly Leu Asp Ile Ile Glu Lys Asn Ile Asn Tyr

260 265 270

Asn Ser Asn Asn Tyr Thr Arg Phe Ile Ile Ile Gly Lys Asn Ile Glu

275 280 285

Ser Asp Lys Gln Arg Asp Lys Ile Ser Ile Leu Ile Thr Leu Pro His

290 295 300

Glu Pro Gly Thr Leu Tyr Asn Val Leu Lys Tyr Phe His Glu Asn Asn

305 310 315 320

Leu Asn Met Thr Lys Ile Glu Ser Arg Pro Ile Ile Asn Lys Ser Trp

325 330 335

Gln Tyr Phe Phe Tyr Ile Asp Phe Asn Gly Asn Ile Met Asp Lys Asp

340 345 350

Thr Arg Tyr Ala Leu Asn Gly Ile Glu Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Lys

355 360 365

Leu Leu Gly Asn Tyr Lys Gly Asp Cys Phe

370 375

Claims

1.一种能够制造至少一种分支酸衍生物的基因工程化C1固定细菌，其中所述细菌包含以下中的至少一种：

a.外源性分支酸丙酮酸裂解酶，

b.外源性异分支酸合成酶，

c.外源性异分支酸丙酮酸裂解酶，和

d.包含破坏性突变的预苯酸合成酶，所述破坏性突变部分失活、充分失活、删除或剔除预苯酸合成酶。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌是能够通过气态底物的发酵制造至少一种分支酸衍生物的梭菌属(Clostridium)细菌。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述分支酸丙酮酸裂解酶是ubiC。

4.根据权利要求1所述的细菌，其中所述异分支酸合成酶是pchA。

5.根据权利要求1所述的细菌，其中所述异分支酸丙酮酸裂解酶是pchB。

6.根据权利要求1所述的细菌，其中所述预苯酸合成酶是pheA。

7.根据权利要求1所述的细菌，其中所述破坏性突变降低或消除所述预苯酸合成酶的表达或活性。

8.根据权利要求7所述的细菌，其中与亲本细菌相比，所述细菌产生降低量的预苯酸或预苯酸衍生物。

9.根据权利要求7所述的细菌，其中所述细菌基本上不产生酪氨酸或苯丙氨酸。

10.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌包含至少一种编码以下中的至少一种的核酸：

a.所述外源性分支酸丙酮酸裂解酶，

b.所述外源性异分支酸合成酶,

c.所述外源性异分支酸丙酮酸裂解酶，和

d.包含破坏性突变的所述预苯酸合成酶。

11.根据权利要求10所述的细菌，其中所述核酸是针对梭菌属中的表达而优化的密码子。

12.根据权利要求1所述的细菌，其中所述分支酸衍生物包含6元碳环，所述6元碳环被羧基或羧酸根阴离子取代并且进一步被一个或多个OH基团和/或一个或多个NH₂基团取代。

13.根据权利要求1所述的细菌，其中所述分支酸衍生物选自由以下组成的群组：对羟基苯甲酸、水杨酸、2-氨基苯甲酸、二羟基苯甲酸、4-羟基环己烷甲酸，和其盐和离子。

14.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌表达ubiC的分支酸丙酮酸裂解酶并且产生对羟基苯甲酸的分支酸衍生物。

15.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌表达pchA的异分支酸合成酶和pchB的异分支酸丙酮酸裂解酶，并且产生水杨酸的分支酸衍生物。

16.根据权利要求14和15中任一项所述的细菌，其中所述细菌进一步表达反馈不敏感型DAHP合成酶。

17.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌包含包括破坏性突变的预苯酸合成酶，并且产生2-氨基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸或4-羟基环己烷甲酸的分支酸衍生物。

18.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生至少一种不由亲本细菌产生的分支酸衍生物。

19.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌比亲本细菌产生更大量的至少一种分支酸衍生物。

20.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌由选自由以下组成的群组的亲本细菌衍生：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)。

21.根据权利要求20所述的细菌，其中所述自产乙醇梭菌是自产乙醇梭菌DSM23693。

22.根据权利要求1所述的细菌，其中所述气态底物包含CO、CO₂和H₂中的至少一种。

23.一种制造发酵产物的方法，所述方法包含在气态底物存在下发酵根据权利要求1所述的细菌以产生发酵产物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述气态底物包含CO、CO₂和H₂中的至少一种。