KR20180002704A - 코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코리스메이트-유도된 산물들, 이를 테면 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 생산하는 유전적으로 조작된 미생물과 그 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 미생물은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소, (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소, (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소중 적어도 하나를 포함한다.
Description
관련 출원들에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 5월 27일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 62/167,101에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 미생물 발효, 구체적으로 가스 기질의 미생물 발효에 의한 코리스메이트(chorismate)-유도된 산물들을 만드는 방법 및 유전적으로 조작된 미생물들에 관한 것이다.
현재 당(sugar)이나 셀룰로오스-기반 공급공급원을 생산하기 위해 식품 또는 비-식품 작물을 사용하는 생물학적으로 생산된 화학 물질 상품은 토지 이용, 식량 확보, 공급 변동성 및 환경 문제와 관련된 단점을 가지고 있다.
일산화탄소 (CO) 및/또는 이산화탄소 (CO2) 및 수소 (H2)를 함유하는 가스를 다양한 연료 및 화학 물질로 전환시키는데 촉매 공정이 사용될 수 있다는 것은 오랫동안 인지되어 왔다. 그러나, 미생물은 또한 그러한 기체를 생물학적으로 연료 및 화학 물질로 전환시키는데 사용될 수도 있다. 생물학적 공정은 촉매 공정과 비교하여 더 높은 특이성, 더 높은 수율, 더 낮은 에너지 비용 및 중독에 대한 촉매의 더 큰 저항성을 포함한, 몇 가지 이점이 있다.
CO는 석탄, 오일 및 오일-유래 산물과 같은 유기 물질의 불완전 연소의 자유 에너지-풍부한 주요 부산물이다. 예를 들면, 호주의 철강 산업은 매년 50 만 톤 이상의 CO를 만들고, 이를 대기로 방출한다고 보고된 바 있다.
CO를 유일한 탄소원으로 하여 성장할 수 있는 미생물의 능력이 1903년에 처음 발견되었다. 이것은 나중에 자가영양성(autotrophic) 성장의 아세틸 코엔자임 A (아세틸-CoA) 생화학적 경로를 사용하는 미생물의 특성으로 확인되었는데, 이것은 우드-융둘 (Wood-Ljungdahl) 경로로도 알려져 있다. 일산화탄소영양성광합성, 메탄생성 및 초산생성 미생물을 비롯한 많은 수의 혐기성 미생물이 CO를 CO2, H2, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올과 같은 다양한 최종 산물로 대사시키는 것으로 나타났다.
방향족 화합물 파라-히드록시벤조산 (pHBA)은 액정(liquid crystal) 중합체에 사용되는 주요 단량체이며, 또한 일반적으로 파라벤으로 불리는 파라히드록시벤조에이트 또는 파라히드록시벤조산 에스테르의 제조를 위한 전구물질로 사용된다. 액정 중합체는 여러 용도를 갖는 케블러(Kevlar)와 벡트란(Vectran)을 포함한다. 파라벤 및 및 그 염은 화장품, 제약 및 식품 산업을 포함한 다양한 산업 분야에서 사용된다. 그들은 효과적인 보존제이며, 화장품 및 식품 제제의 살균 및 살진균 효과를 위해 사용될 수 있다.
따라서, pHBA 및 다른 고-부가 가치의 코리메이트-유도된 산물을 생산하기 위한 추가적인 미생물 및 방법이 여전히 요구된다.
본 발명은 코리스메이트-유도된 생산물들을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 적어도 하나 코리스메이트-유도된 생산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물을 제공하며, 이때 상기 세균은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40), (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2), (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21), 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소 (EC 5.4.99.5)중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 미생물은 C1-고정 세균, 이를 테면 C1-함유 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 클로스트리듐(Clostridium) 세균이다.
예를 들면, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소는 ubiC일 수 있고, 상기 이소코리스메이트 합성효소는 pchA일 수 있고, 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소는 pchB일 수 있고, 그리고 프레페네이트 합성효소는 pheA일 수 있다. 프레페네이트 합성효소에서 파괴성 돌연변이(disruptive mutation)는 프레페네이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거할 수 있다. 이러한 파괴성 돌연변이로 인하여 모계 세균 및/또는 실질적으로 티로신 또는 페닐알라닌을 만들지 않는 세균과 비교하였을 때, 프레페네이트 또는 프레페네이트-유도된 산물들의 생산량이 감소된 세균이 만들어질 수 있다.
본 발명의 미생물은 (a) 상기 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소, (b) 상기 외생성 이소코리스메이트 합성효소, (c) 상기 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소중 적어도 하나를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산은 클로스트리듐에서 발현에 최적화되도록 코돈 최적화된다.
상기 코리스메이트-유도된 산물은 코리스메이트로부터 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물이다. 구체적으로, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 6-원자의 탄소 환, 예를 들면, 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 OH 기 및/또는 하나 또는 그 이상의 NH2 기로 추가 치환된, 벤젠 또는 시클로헥산 환을 포함할 수 있다. 코리스메이트-유도된 산물들은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 코리스메이트 피루베이트 분해효소, ubiC를 발현시키고, 파라-히드록시벤조산의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다. 한 구체예에서 본 발명의 미생물은 피드백-비감성(feedback-insensitive) DAHP 합성효소를 더 발현시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 이소코리스메이트 합성효소, pchA 및 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, pchB를 발현시키고, 살리실레이트의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다. 한 구체예에서 본 발명의 미생물은 피드백-비감성(feedback-insensitive) DAHP 합성효소를 더 발현시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 포함하며, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트3,4-디히드록시벤조에이트 및 4-히드록시시클로헥산 카르복실산의 하나 또는 그 이상의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 모계 미생물에 의해 만들어지지 않는 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들거나, 또는 모계 미생물에 의해 만들어지는 양보다 더 많은 양으로 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
한 구체예에서, 본 발명의 세균은 C1-고정 모계 세균으로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다레이(Clostridium ljungdahlii), 그리고 클로스트리듐 라가스다레이(Clostridium ragsdalei)로 구성된 집단에서 선택된 모계 세균으로부터 유도된다. 특별히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 모계 세균으로부터 유도된다.
본 발명은 C1-함유 가스 기질 존재하여 본 발명의 미생물을 발효시키는 것을 포함하는 발효 산물을 만드는 방법을 더 제공한다. 일반적으로, 상기 발효 산물은 코리스메이트-유도된 산물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 가스 기질은 적어도 하나 C1 탄소 공급원을 포함한다.
도 1은 클로스트리디아(clostridia)에서 자생(native) 쉬키메이트(shikimate) 경로를 통하여 코리스메이트를 만드는 것을 보여주는 도표다.
도 2는 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 pHBA 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 3은 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 살리실레이트 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 4는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 산물들의 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 5는 정통(authentic) pHBA 표준의 정량화를 보여주는 표준 곡선 그래프다.
도 6a는 정통 표준의 총 이온 카운트를 나타내는 그래프이다: (i) C. 오토에타노게눔 LZ1561 배양 배지의 상청액에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), (ii) 물에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), 그리고 (iii) 트리메틸실레이트화된 pHBA의 질량 스펙트럼.
도 6b는 발효 시료 및 표준의 선택된 이온 모니터링을 보여주는 그래프다: (i) pARO_01 플라스미드없는 C. 오토에타노게눔 LZ1561, (ii)와 (iii) pARO_01 플라스미드를 품고 있는 C. 오토에타노게눔 LZ1561에서 얻은 시료, (iv) 정통 표준의 pHBA, 그리고 (v) LZ1561/pARO_01에서 pHBA 및 pHBA 정점에 대한 NIST 데이터베이스 엔트리 간의 총 이온 카운트 비교.
도 7은 pARO_01 플라스미드의 그림이다. 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (ubiC) 및 피드백-비감성 DAHP 합성효소 (aroG*)는 우드-융둘 프로모터 (Pwl)의 제어 하에 있다. 다른 셔틀 벡터 특징들 또한 나타낸다.
도 8은 테스트 균주들에서 바이오매스(biomass) 축적을 보여주는 그래프다. 바이오매스는 상이한 시점에서 600nm에서 배양 시료의 흡광도를 측정함으로서 평가되었다. 데이터 포인터는 n=3 레플리케이트(replicate) 배양물의 평균 ± 1 표준 편차를 나타낸다. LZ1561은 형질변환안된 C. 오토에타노게눔 LZ1561을 지칭한다. pARO_01(1) 및 pARO_01(2)는 pARO_01 플라스미드로 형질변환된 C. 오토에타노게눔 LZ1561의 생물학적 레플리케이트이다.
도 9a 및 9b는 테스트 균주들에서 p-히드록시벤조에이트 축척을 나타내는 그래프다. 도 9a는 24, 96, 144, 그리고 192 시간(hr) 시점에서 각 시료에서 탐지된 pHBA의 정량화를 나타낸다. 3가지 레플리케이트 배양물은 음성 대조균주 (C. 오토에타노게눔 LZ1561) 그리고 pARO_01을 품고있는 C. 오토에타노게눔 LZ1561의 2개 생물학적 레플리케이트의 시료다. 도 9b는 n=3 기술적 레플리케이트의 평균 ± 1 SD이다.
도 10은 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 화합물들의 생산을 보여주는 도표다. ΔpheA 균주는 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산을 만들지만, 대조균주 (LZ1561)는 만들지 않는다.
도 11a는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 살리실레이트 생산 균주의 바이오매스 성장을 보여주는 그래프다.
도 11b는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 테스트 균주의 액체 배양물 안에서 살리실레이트 축척 차이를 보여주는 그래프다.
도 12는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 발효에 의해 생산된 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산의 농도를 보여주는 그래프다.
도 13은 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 14는 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 15는 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 2는 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 pHBA 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 3은 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 살리실레이트 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 4는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 산물들의 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 5는 정통(authentic) pHBA 표준의 정량화를 보여주는 표준 곡선 그래프다.
도 6a는 정통 표준의 총 이온 카운트를 나타내는 그래프이다: (i) C. 오토에타노게눔 LZ1561 배양 배지의 상청액에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), (ii) 물에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), 그리고 (iii) 트리메틸실레이트화된 pHBA의 질량 스펙트럼.
도 6b는 발효 시료 및 표준의 선택된 이온 모니터링을 보여주는 그래프다: (i) pARO_01 플라스미드없는 C. 오토에타노게눔 LZ1561, (ii)와 (iii) pARO_01 플라스미드를 품고 있는 C. 오토에타노게눔 LZ1561에서 얻은 시료, (iv) 정통 표준의 pHBA, 그리고 (v) LZ1561/pARO_01에서 pHBA 및 pHBA 정점에 대한 NIST 데이터베이스 엔트리 간의 총 이온 카운트 비교.
도 7은 pARO_01 플라스미드의 그림이다. 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (ubiC) 및 피드백-비감성 DAHP 합성효소 (aroG*)는 우드-융둘 프로모터 (Pwl)의 제어 하에 있다. 다른 셔틀 벡터 특징들 또한 나타낸다.
도 8은 테스트 균주들에서 바이오매스(biomass) 축적을 보여주는 그래프다. 바이오매스는 상이한 시점에서 600nm에서 배양 시료의 흡광도를 측정함으로서 평가되었다. 데이터 포인터는 n=3 레플리케이트(replicate) 배양물의 평균 ± 1 표준 편차를 나타낸다. LZ1561은 형질변환안된 C. 오토에타노게눔 LZ1561을 지칭한다. pARO_01(1) 및 pARO_01(2)는 pARO_01 플라스미드로 형질변환된 C. 오토에타노게눔 LZ1561의 생물학적 레플리케이트이다.
도 9a 및 9b는 테스트 균주들에서 p-히드록시벤조에이트 축척을 나타내는 그래프다. 도 9a는 24, 96, 144, 그리고 192 시간(hr) 시점에서 각 시료에서 탐지된 pHBA의 정량화를 나타낸다. 3가지 레플리케이트 배양물은 음성 대조균주 (C. 오토에타노게눔 LZ1561) 그리고 pARO_01을 품고있는 C. 오토에타노게눔 LZ1561의 2개 생물학적 레플리케이트의 시료다. 도 9b는 n=3 기술적 레플리케이트의 평균 ± 1 SD이다.
도 10은 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 화합물들의 생산을 보여주는 도표다. ΔpheA 균주는 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산을 만들지만, 대조균주 (LZ1561)는 만들지 않는다.
도 11a는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 살리실레이트 생산 균주의 바이오매스 성장을 보여주는 그래프다.
도 11b는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 테스트 균주의 액체 배양물 안에서 살리실레이트 축척 차이를 보여주는 그래프다.
도 12는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 발효에 의해 생산된 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산의 농도를 보여주는 그래프다.
도 13은 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 14는 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 15는 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
클로스트리디아(Clostridia) 는 쉬키메이트 경로를 통하여 포스포에놀피루베이트와 에리트로스-4-포스페이트로부터 코리스메이트를 자생적으로 생산하는데, 이것은 방향족 아미노산 트립토판, 티로신, 그리고 페닐알라닌의 전구물질이다 (도 1). 이 경로는 Bentley, Crit Rev Biochem Mol Biol, 25.5: 307-384, 1990에서 상세하게 기술된다. 본 발명은 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 세균을 제공한다.
발명자들은 코리스메이트-유도된 산물이 실질적으로 생산될 수 있고, C1-탄소 공급원로부터 회수될 수 있음을 증명하였다. 본 발명은 주요 탄소 및 에너지 공급원으로써 C1-함유 가스 기질을 이용하여 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만드는 방법을 제공한다. 이 방식에서, 본 발명은 당- 또는 셀룰로오스-기반의 기질에 의존하는 공정보다 여러가지 장점을 갖는다. 예를 들면, 당- 또는 셀룰로오스-기반의 기질은 전형적으로 식품 (가령, 사탕수수)에 또한 유용하며, 이들의 집중적인 토지 이용은 환경에 부정적인 영향을 미친다. 또한, 본 발명은 임의로 폐가스 (예를 들어, 산업 공정으로부터 나오는 CO)를 사용하여 코리스메이트-유도된 산물의 제조를 위한 대안적인 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 폐가스로부터 수입원을 제공하고, 또한 가스가 대기로 타오를 경우 발생되는 탄소 배출을 줄이기 위해 폐가스 안에 탄소를 포획한다.
종속영양성(Heterotrophic) 미생물들, 이를 테면 대장균(E. coli )과 S. 세르비시에(s. cerevisiae)는 해당작용을 통하여 상대적으로 높은 수준의 ATP를 만든다. 대조적으로, C1-탄소 공급원 (가령, CO 또는 CO2)를 이용하는 미생물들은 ATP 이용성이 저조하다. 예를 들면, 전형적인 일산화탄소영양성 미생물인 C. 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)의 반응 역학 분석에서 pHBA, 코리스메이트-유도된 산물)을 생산할 때, 고정된 CO mol 당 -0.4 ATP의 예상 ATP 수율을 제시한다. 이와 같이, 에너지 제약으로 인해 pHBA가 생성되지 않을 것으로 예상된다. 유사하게, 자가영양성 조건 하에서 그러한 화합물을 생산하는 대사 부하로 인하여, 일산화탄소영양성 미생물에 의해 다른 코리스메이트-유도된 산물이 생산될 것으로 기대되지는 않는다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 가스 기질로부터 다수의 코리스메이트-유도된 산물들이 만들어질 수 있음을 보여 주었다. 또한, 전술한 산물은 산업 폐기물 가스로부터 제조될 수 있고, 이점은 다른 기질에 비해 실용적, 경제적 및 환경적 이점을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산, (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (a.k.a., 이소코리스메이트 뮤타제)를 암호화하는 핵산, (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산중 최소 한가지를 도입시킴으로써, 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물들을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 유전적으로 조작된 미생물은 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 C1-고정 세균이다. 바람직한 구체예들에서, 상기 C1-고정 세균은 클로스트리듐 세균이다.
“코리스메이트-유도된 산물(chorismate-derived product)” 또는 “코리스메이트로부터 유도된 산물(product derived from chorismate)”, 또는 유사한 용어들은 코리스메이트 (또는 코리스민산)으로부터 직접 또는 간접적으로 만들어진 산물들을 포괄한다. 코리스메이트-유도된 산물들은 전형적으로 6-원자의 탄소 환, 예를 들면, 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 OH 기 및/또는 하나 또는 그 이상의 NH2 기로 추가 치환된, 벤젠 또는 시클로헥산 환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리스메이트-유도된 산물들은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트3,4-디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 미생물은 유비퀴논 생합성의 제 1 단계에서 코리스메이트로부터 파라-히드록시벤조산과 피루베이트로의 전환을 촉매하는 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.1.3.40)를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 UbiC 효소일 수 있다. UbiC 효소는 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 씨트로박터 플레운디(Citrobacter freundii), 또는 UbiC 효소를 갖는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, UbiC 효소는 대장균(escherichia coli)으로부터 유도되며, 서열번호: 1 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자일 수 있다. 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자는 ubiC 유전자일 수 있다. 상기 ubiC 유전자는 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 씨트로박터 플레운디(Citrobacter freundii), 또는 UbiC 유전자를 갖는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 ubiC 유전자는 대장균(Escherichia coli)으로부터 유도되며, 서열번호: 2 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
상기 UbiC 효소 또는 ubiC 유전자는 용해도, 안정성, 또는 다른 유전자/효소 성질을 개선시키기 위하여 또한 변형(가령, 돌연변이)될 수 있다. 이러한 변형은 산물의 역가를 증가시킬 수 있다. 실시예 4는 파라-히드록시벤조산 잔류(retention)를 통하여 산물 억제를 감소시키도록 UbiC 효소를 조작하는 실험 프로토콜을 기술한다. 한 가지 특정 변형은 ubiC 유전자를 조작하여, 시스테인 대신 두 개의 표면-활성 세린을 갖는 UbiC 효소를 발현시키는 것이다. 상기 세린 잔기로 인하여 단백질 응집은 감소되고, 이로 인하여 용해도는 개선된다. 따라서, 특정 구체예에서, UbiC 효소는 적어도 하나 표면-활성 시스테인을 세린으로 대체시키는 돌연변이를 포함한다.
대체 구체예에서, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40)는 예를 들면, 도 13에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (가령, ubiC) 또는 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산 (가령, ubiC)의 도입으로 본 발명의 미생물에 의해 코리스메이트-유도된 산물인 파라-히드록시벤조산이 생산된다. 파라-히드록시벤조산의 생산은 도 2에서 설명된다. 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리박테이룸 바치(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프루덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 리중다레이, 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 라가스다레이, 클로스트리듐 스카토로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 모오렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermthermautotrophica), 모오렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 펜니기(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스페로이데스(Sporomusa sphaeroides), 그리고 테르모안에어로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui) 종들을 포함하는 C1 고정 세균은 자생적으로 파라-히드록시벤조산을 만들지 않는다. 사실, 유비퀴논은 일반적으로 호기성 호흡 미생물에서만 생산되기 때문에, 일산화탄소영양성 미생물에서는 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 일반적으로 찾아볼 수 없다. 아미노산 대신 pHBA를 생산하는 코리스메이트의 전환은 미생물의 성장이나 생존에 악영향을 미칠 것으로 예상되지만, 본 발명자들은 이들 미생물이 표준 조건 하에서 생존 및 성장을 현저하게 저해하는 정도로 영향을 주지 않는다는 것을 보여 주었다.
파라-히드록시벤조산은 또한 예를 들면, pHBA, 4-히드록시벤조산, p-히드록시벤조산, 또는 파라-히드록시벤조에이트로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
본 발명의 미생물은 코리스메이트의 이소코리스메이트로의 전환을 촉매하는 이소코리스메이트 뮤타제(EC 5.4.4.2)로도 지칭되는, 외생성 이소코리스메이트 합성효소 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 PchA 효소일 수 있다. PchA 효소는 슈도모나스 에어루기노사 또는 PchA 효소를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, PchA 효소는 슈도모나스 에어루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유도되며, 서열번호: 3 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 이소코리스메이트 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 이소코리스메이트 합성효소 유전자일 수 있다. 이소코리스메이트 합성효소 유전자는 pchA 유전자일 수 있다. pchA 유전자는 슈도모나스 에어루기노사 또는 pchA 유전자를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, pchA 유전자는 슈도모나스 에어루기노사로부터 유도되며, 서열번호: 4 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
대체 구체예에서, 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2)는 도 14에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 미생물은 이소코리스메이트를 살리실레이트와 피루베이트로의 전환을 촉매하는 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.2.99.21)를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 PchB 효소일 수 있다. PchB 효소는 슈도모나스 에어루기노사 또는 PchB 효소를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, PchB 효소는 슈도모나스 에어루기노사 로부터 유도되며, 서열번호: 5 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자일 수 있다. 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자는 pchB 유전자일 수 있다. pchB 유전자는 슈도모나스 에어루기노사 또는 pchB 유전자를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, pchB 유전자는 슈도모나스 에어루기노사로부터 유도되며, 서열번호: 6 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
대체 구체예에서, 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21) 예를 들면, 도 15에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
(1) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (가령, pchA) 및 (2) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (가령, pchB)의 도입으로 본 발명의 미생물에 의한 코리스메이트-유도된 산물인, 살리실레이트가 생산된다. 살리실레이트의 생산은 도 3에서 설명되며, 이에 따르면 코리스메이트는 이소코리스메이트 합성효소에 의해 이소코리스메이트로 전환되고, 그 다음 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소에 의해 살리실레이트와 피루베이트로 더 전환된다. 아세토박테리움 우디, 알칼리박테이룸 바치, 블라우티아 프루덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 카르복시디보란스, 클로스트리듐 코스카티, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 리중다레이, 클로스트리듐 마그눔, 클로스트리듐 라가스다레이, 클로스트리듐 스카토로게네스, 유박테리움 리모숨, 모오렐라 테르마우토트로피카, 모오렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스페로이데스, 그리고 테르모안에어로박터 키부이 종이 포함된 C1 고정 세균은 자생적으로 살리실레이트를 생산하지 않는다.
살리실레이트는 예를 들면, 2-히드록시벤조에이트살리실산, 또는 2-히드록시벤조산으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
(d) 파괴성 돌연변이를 포함하는
프레페네이트
합성효소
본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이가 포함된 프레페네이트 합성효소 효소 (EC 5.4.99.5)를 포함할 수 있다. 프레페네이트 합성효소 전형적으로 코리스메이트의 프레페네이트로의 전환 (가령, 코리스메이트 ↔ 프레페네이트 뮤타제 반응)을 촉매한다. 따라서, 파괴성 돌연변이가 포함된 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트를 프레페네이트로 전환시키지 못하거나, 또는 전환 능력이 떨어진다. 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소는 파괴성 돌연변이가 포함된 pheA일 수 있다. 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트 뮤타제라고도 지칭될 수 있다.
일부 구체예들에서, pheA는 프레페네이트 합성효소 (가령, 코리스메이트 뮤타제) (EC 5.4.99.5) 및 프레페네이트 탈수효소 (EC 4.2.1.51) 반응 모두를 실행하는 이중기능성 효소일 수 있다. 별도 효소에 의해 이들 두 반응이 실행되는 미생물에서, EC 5.4.99.5 활성을 해체시키면 프레페네이트 또는 프레페네이트의 하류 화합물의 생산이 상당히 감소하거나, 또는 생산되지 않는 결과를 초래할 것이고, 한편 EC 4.2.1.51 활성만 해체시키면 프레페네이트는 여전히 생산될 수 있기 때문에 동일한 표현형을 얻지 못할 것이다. 한 구체예에서, pheA는 클로스트리듐 오토에타노게눔으로부터 유도되며, 서열번호: 11 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 파괴성 돌연변이가 포함된 pheA 유전자일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 파괴성 돌연변이는 pheA 유전자의 녹아웃(knockout) 돌연변이다. 한 구체예에서, pheA 유전자는 클로스트리듐 오토에타노게눔로부터 유도되며, 서열번호: 10 또는 코돈-최적화된 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
파괴성 프레페네이트 합성효소로 인하여 페닐알라닌 및 티로신의 생산은 감소 또는 생산되지 않는다. 놀랍게도, 파괴성 프레페네이트 합성효소로 인하여 일반적으로 추가 산물들이 생산되지 않거나, 또는 매우 낮은 수준으로 생산되는 결과를 또한 초래한다.
구체적으로, 프레페네이트 합성효소 (가령, pheA) 또는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산 (가령, pheA) 안에 파괴성 돌연변이의 도입으로 본 미생물에 의해 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트 그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산중 하나 또는 그 이상이 생산되는데, 이들 모두 코리스메이트-유도된 산물이다. 이들 산물들의 생산 경로는 도 4에서 설명된다. 클로스트리디아(clostridia) 이를 테면 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이 종을 포함한 많은 미생물들은 자생적으로 이들 산물을 만들지 않거나, 또는 이들 산물을 매우 낮은 수준으로 만든다.
pheA의 예시적인 공급원이 제시된다. 그러나, pheA에 대한 다른 적합한 공급원이 이용가능할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 프레페네이트 탈수 효소는 다음의 공급원 중 어느 하나이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있으며, 그 서열은 공개적으로 이용 가능하다:
2-아미노벤조에이트는 예를 들면, 2-아미노벤조산, o-아미노벤조산, 안트라닐산, 안트라닐레이트, 또는 비타민 L1로도 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
디히드록시벤조에이트는 예를 들면, 2,3-디히드록시벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조산, 3,4-디히드록시벤조에이트, 3,4-디히드록시벤조산 또는 트로토카테큐산으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
4-히드록시시클로헥산 카르복실산은 예를 들면, cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산 또는 4-히드록시시클로헥산-1-카르복실레이트로도 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 미생물은 쉬키메이트 경로 (도 1)의 첫번째 단계를 촉매하는 피드백-비감성 DAHP 합성효소 DAHP 합성효소를 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있는데, 이때 에리트로스-4-포스페이트와 포스포에놀피루베이트는 3-데옥시-D-아라비노헵토소네이트-7-포스페이트로 전환된다. 본 발명자들은 상기 경로에서 이 단계는 대장균의 경우 설명된 바와 같이(Hu et al. J. Basic Microbiol. 2003, 43:399-406), 방향족 아미노산 (트립토판, 페닐알라닌, 티로신)에 의한 피드백 억제를 받는 것으로 본다. 따라서, 선행기술에 근거하여 본 발명자들은 피드백 비감수성 DAHP 합성 효소를 개발하였으며, 이로써 상기 피드백 억제에 의해 감소된 코리스메이트-유도된 산물로의 유출 위험이 감소될 것으로 본다. 적절한 DAHP 합성효소를 암호화하는 핵산은 당분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 그러나, 예시를 통하여, DAHP 합성효소가 암호화된 핵산은 대장균, 클로스트리듐 베이헤린키(Clostridium beijerinckii), 또는 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, DAHP 합성효소는 대장균의 피드백-비감성 DAHP 합성효소일 수 있고, 서열번호: 7의 핵산 서열 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 피드백-비감성 DAHP 합성효소는 전술한 효소중 하나를 암호화하는 유전자와 동일한 벡터, 또는 상이한 벡터로 도입될 수 있다. 상기 피드백-비감성 DAHP 합성효소는 자체 고유 프로모터를 가지거나, 또는 바이시스트로닉(bicistronic) 정렬로 전술한 효소중 하나에 대한 프로모터를 따를 수 있으며, 이때 단일 프로모터는 상기 효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소 모두를 암호화하는 단일 mRNA의 전사를 구동한다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.1.3.40), 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 미생물은 외생성 UbiC 효소, 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1의 핵산 서열을 갖는 외생성 ubiC 유전자, 그리고 서열번호: 7의 핵산 서열을 갖는 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 한 구체예에서, 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소와 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 포함하는 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소가 없는 미생물과 비교하였을 때, 파라-히드록시벤조산을 더 많이 생산한다는 것이 실증된다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 (i) 외생성 이소코리스메이트 뮤타제, (EC 5.4.4.2), (ii) 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.2.99.21), 그리고 (iii) 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 미생물은 외생성 PchA 효소, 외생성 PchB 효소, 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 한 구체예에서, 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함하는 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소가 없는 미생물과 비교하였을 때, 살리실산을 더 많이 생산한다는 것이 실증된다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함하지 않고, 대신 단지 내생성 DAHP 합성효소만을 포함한다. 방향족 아미노산의 생산 또는 자연 농도가 피드백 저해를 유도하지 않을 정도로 충분히 낮을 것으로 예상되는 경우, 피드백-비감성 DAHP 합성 효소의 도입은 필요없다.
본 발명의 미생물은 임의의 농도 또는 임의의 양으로 코리스메이트-유도된 산물들을 만들 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 적어도 약 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1g/L, 1.5g/L 또는 2 g/L의 농도로 코리스메이트-유도된 산물들을 만든다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 적어도 10 mg/L, 50gm/L, 100mg/L, 500mg/L,800mg/L, 또는 1g/L의 농도로 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
더욱이, 본 발명의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 산물을 만들도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 또는 75%를 차지한다. 한 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 10%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 표적 코리스메이트-유도된 산물에 대하여 적어도 10%의 선택성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 30%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 표적 코리스메이트-유도된 산물에 대하여 적어도 30%의 선택성을 갖는다.
본 발명은 가스 기질 존재하여 본 발명의 미생물을 발효시키는 것으로 포함하는 발효 산물, 구체적으로 코리스메이트-유도된 산물을 만드는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 가스 기질 존재하에 본 발명의 미생물을 발효시킴으로써 생산되는 코리스메이트-유도된 산물들을 또한 제공한다.
정의 및 배경
용어 “유전적 변형(genetic modification)” 또는 “유전 공학(genetic engineering)”은 넓은 의미로 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 의미한다. 유전적 변형 방법은 예를 들면, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결손, 핵산 돌연변이, 변경된(altered) 유전자 발현 또는 비활성화, 효소 공학, 지향된(directed) 진화, 지식-기반 설계, 무작위 돌연변이생성 방법, 유전자 셔플링, 그리고 코돈 최적화를 포함한다.
“재조합체(Recombinant)”란 핵산, 단백질, 또는 미생물의 유전적 변형, 조작, 또는 재조합의 산물을 나타낸다. 일반적으로, 상기 “재조합체”라는 용어는 다수 원료, 이를 테면 2 또는 그 이상의 상이한 균주 또는 미생물 종으로부터 유도된 유전 물질을 포함하는 또는 암호화된 핵산, 단백질, 또는 미생물을 의미한다. 상기 “재조합체”라는 용어는 돌연변이된 형태 내생성 핵 또는 단백질이 포함된 돌연변이된 핵산 또는 단백질을 포함하는 미생물을 설명할 때 또한 사용될 수 있다.
"내생성(Endogenous)"은 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 존재하거나 또는 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, 내생성 유전자는 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 자생적으로 존재하는 유전자다. 한 구체예에서, 내생성 유전자의 발현은 외생성 조절 요소, 이를 테면 외생성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
“외생성(Exogenous)”이란 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 한 구체예에서, 외생성 유전자 또는 효소는 이종 (가령, 상이한) 균주 또는 종으로부터 유도될 수 있으며, 그리고 본 발명의 미생물로 도입되거나 또는 발현될 수 있다. 또다른 구체예에서, 외생성 유전자 또는 효소는 인위적으로 또는 재조합적으로 만들어질 수 있고, 그리고 본 발명의 미생물로 도입되거나 또는 발현될 수 있다. 외생성 핵산은 본 발명의 미생물의 게놈에 통합되거나, 또는 본 발명의 미생물안에 염색체 외의 상태로 있는, 예를 들어 플라스미드에 유지되도록 개작될 수 있다.
“효소 활성(Enzyme activity)”은 효소의 활성, 효소의 양 또는 반응을 촉매하는 효소의 이용가능성을 포함하지만 이에 국한되지는 않는, 효소의 활성을 광범위하게 말한다. 따라서, "증가하는(increasing)" 효소 활성은 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 또는 반응을 촉진시키는 효소의 이용가능성을 증가시키는 것을 포함한다.
“돌연변이된(Mutated)”이란 본 발명의 미생물이 유래된 야생형 또는 모계 미생물과 비교하여, 본 발명의 미생물에서 변형된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서 결손, 삽입, 또는 치환일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 돌연변이는 효소에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결손, 삽입, 또는 치환일 수 있다.
구체적으로, “파괴성 돌연변이(disruptive mutation)”는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거(가령, "파괴")하는 돌연변이다. 상기 파괴성 돌연변이는 이 유전자 또는 효소를 부분적으로 비활성화시키거나, 완전하게 비활성화시키거나, 또는 결손시킬 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 녹아웃 (KO) 돌연변이일 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 효소에 의해 만들어진 산물의 생합성을 감소, 방해 또는 차단시키는 임의의 돌연변이일 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 예를 들면, 효소를 암호화하는 유전자에서 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서 돌연변이, 효소의 활성을 감소 또는 억제시키는 단백질을 생산하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 억제하는 핵산(가령, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함한다. 상기 파괴성 돌연변이는 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
“코돈 최적화(Codon optimization)”란 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 개선된 해독을 위하여 핵산, 이를 테면 유전자의 돌연변이를 의미한다. 코돈 최적화로 해독 속도가 빨라지거나 또는 해독 정확도가 높아질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자는 클로스트리듐, 특히 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다. 추가 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다.
“과다발현된(Overexpressed)”이란 본 발명의 미생물이 유래된 야생형 또는 모계 미생물과 비교하여, 본 발명의 미생물에서 핵산 또는 단백질의 발현이 증가된 것을 지칭한다. 과발현은 유전자 복사 수, 유전자 전사율, 유전자 해독율 또는 효소 분해율의 변형을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 “변이체(variants)”는 선행 기술에 개시되거나, 또는 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열과 같이, 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 변화된 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 발명은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들면, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나, 또는 기준 단백질과 실질적으로 동일한 반응을 촉매할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 변이체 프로모터는 기준 프로모터로서 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진시키는 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
이러한 핵산 또는 단백질은 본 명세서에서 "기능적으로 대등한 변이체(functionally equivalent variants)"로 지칭될 수 있다. 예로서, 핵산의 기능적으로 대등한 변이체는 대립 유전자(allelic) 변이체, 유전자 단편, 돌연변이된 유전자, 다형성(polymorphisms) 및 이와 유사한 것등을 포함할 수 있다. 다른 미생물의 상동성(Homologous) 유전자 또한 기능적으로 대등한 변이체의 예이다. 이들은 이를 테면 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이헤린키, 또는 클로스트리듐 리중다레이 종에는 상동성 유전자를 포함하는데, 이의 상세는 웹사이트, 이를 테면 Genbank 또는 NCBI에서 공개되어 있다. 기능적으로 대등한 변이체는 또한 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변화된 핵산을 포함한다. 기능적으로 대등한 핵산 변이체는 기준 핵산에 대하여 적어도 대략적으로 70%, 대략적으로 80%, 대략적으로 85%, 대략적으로 90%, 대략적으로 95%, 대략적으로 98%, 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성 (상동성 백분율)을 갖는 것이 바람직할 것이다. 기능적으로 대등한 단백질 변이체는 기준 단백질에 대하여 적어도 대략적으로 70%, 대략적으로 80%, 대략적으로 85%, 대략적으로 90%, 대략적으로 95%, 대략적으로 98%, 또는 그 이상의 아미노산 동일성 (상동성 백분율)을 가지는 것이 바람직할 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 미생물로 전달될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 네이키드(naked) 핵산으로 전달될 수 있거나, 또는 이를 테면, 리포좀과 같은 하나 이상의 물질로 제제화될 수 있다. 상기 핵산은 DNA, RNA, cDNA, 또는 적절한 경우 이의 조합이될 수 있다. 제한(Restriction) 억제제들이 특정 구체예들에서 이용될 수 있다. 추가 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 플라스미드를 이용하여 본 발명의 미생물로 전달된다. 예를 들면, (형질 도입 또는 형질 감염을 포함한) 형질전환은 전기 천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 자연적 컴피턴스, 원형질체 형질전환, 프로파아지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정 구체예에서, 핵산을 미생물에 도입하기 전, 핵산의 메틸화가 필요할 수 있다.
더욱이, 핵산은 특정 핵산의 발현을 증가시키거나, 또는 달리 조절하기 위해 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터 일 수 있다. 이상적으로는, 상기 프로모터는 우드-융둘(Wood-Ljungdahl) 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루베이트:페레독신 산화환원 효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 합성 효소 오페론 프로모터, 또는 포스포 트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터이다.
"미생물(microorganism)"은 현미경적 유기체, 구체적으로 박테리아, 고균(archea), 바이러스 또는 곰팡이이다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 세균이다. 본 명세서에 사용된 "미생물"의 기재는 "세균(bacterium)"를 포괄해야 한다.
“모계(parental) 미생물”이란 본 발명의 미생물을 만들 때 이용된 미생물이다. 상기 모계 미생물은 자연 발생적 미생물 (가령, 야생형 미생물)이거나, 또는 기존에 변형된 미생물 (가령, 돌연변이체 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명의 미생물은 이의 모계 미생물에서 발현되지 않았거나, 또는 과다발현되지 않았던 하나 또는 그 이상의 효소를 발현 또는 과다발현시키도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 미생물은 이의 모계 미생물에 포함되지 않았던 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 모계 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이이다. 바람직한 구체예에서, 상기 모계 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561이다.
용어 “~로부터 유도된(derived from)"이란 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 만들기 위하여, 상이한 (가령, 모계 또는 야생형) 핵산, 단백질, 또는 미생물로부터 변형된 또는 개작된 핵산, 단백질, 또는 미생물을 나타낸다. 이러한 변형 또는 개작(adaptations)에는 전형적으로 핵산 또는 유전자의 삽입, 결손, 돌연변이, 또는 치환이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 모계 미생물로부터 유도된다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561로부터 유도된다.
본 발명의 미생물은 기능적 특성에 따라 세분될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물은 C1 고정 미생물, 혐기성 미생물, 아세토겐, 에타놀로겐, 일산화탄소요구성 및/또는 메타노겐이거나, 또는 이들로부터 유도될 수 있다. 표 1은 대표적인 미생물 목록을 제공하고, 그 기능적 특성을 제공한다.
“C1”이란 한 개의 탄소 분자, 예를 들면, CO, CO2, CH4, 또는 CH3OH를 말한다. “C1-옥시게네이트”는 적어도 한 개의 산호 원자를 포함하는 한 개의 탄소 분자, 예를 들면, CO, CO2, 또는 CH3OH를 말한다. “C1-탄소 공급원”이란 본 발명의 미생물을 위한 부분적 또는 유일한 탄소원으로서 작용하는 한 개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들면, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH, 또는 CH2O2중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO와 CO2중 하나, 또는 이 둘 모두를 포함한다. “C1-고정 미생물(C1-fixing microorganism)”이란 C1- 탄소원으로부터 하나 이상의 산물을 생산하는 능력을 가진 미생물을 말한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 C1-고정 세균이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 C1-고정 미생물로부터 유도된다.
"혐기성균(anaerobe)"은 성장하는데 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성균은 산소가 존재하면 부정적으로 반응하거나 또는 심지어 죽을 수도 있다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 혐기성균이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 혐기성균으로부터 유도된다.
"아세토겐(acetogen)"이란 혐기성 호흡의 산물로서 아세테이트 (또는 아세트산)를 생산하거나 생산할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 아세토겐은 에너지 보존 및 아세틸 -CoA 및 아세틸 -CoA 유도 산물, 이를 테면 아세테이트의 합성을 위한 주요 기전으로서, 우드-융돌(Wood-Ljungdahl) 경로를 사용하는 의무적 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). 아세토겐은 아세틸-CoA 경로를 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원 합성을 위한 기전으로, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 프로세스로, (3) 세포의 탄소 합성에서 이산화탄소의 고정 (동화) 기전으로 이용한다(Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). 모든 자연 발생적 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 자가영양성, 그리고 비-메탄영양요구성이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 아세토겐으로부터 유도된다.
“에타놀로겐(ethanologen)” 은 에탄올을 생산하거나 또는 생산할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 에타놀로겐이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 에타놀로겐으로부터 유도된다.
“자가영양요구성(autotroph)”이란 유기 탄소 부재하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신, 자가영양요구성은 무기 탄소 공급원, 이를 테면 CO 및/또는 CO2를 이용한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 자가영양요구성이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 자가영양요구성으로부터 유도된다.
“일산화탄소요구성(carboxydotroph)”은 유일한 탄소 공급원로 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 일산화탄소요구성이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 일산화탄소요구성으로부터 유도된다.
“메탄영양요구성(methanotroph)”은 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로써 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 미생물은 메탄영양요구성으로부터 유도된다.
더욱 광범위하게, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 임의의 속(genus) 또는 종(species)으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 세균이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이종을 포함하는 클로스트리디아(clostridia) 클러스트로부터 유도된다. 이들 종은 Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (클로스트리듐 오토에타노게눔), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (클로스트리듐 리중다레이), 그리고 Huhnke, WO 2008/028055 (클로스트리듐 라가스다레이)에서 최초 보고되고, 특징화되었다.
이들 3 종은 많은 유사성을 가진다. 구체적으로, 이들 종은 클로스트리듐 속의 모두 C1-고정, 혐기성, 초산생성, 에타놀로겐, 그리고 일산화탄소영양성 구성원이다. 이 종들은 유사한 유전자형과 표현형, 그리고 에너지 보존과 발효 대사의 방식을 가지고 있다. 더욱이, 이들 종은 99% 이상의 동일성을 가지고, 약 22-30 mol%의 DNA G + C 함량을 보유한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디아 rRNA 상동성 군 I에 군집되며, 그램-음성이며, 형태와 크기가 유사하고(0.5-0.7 x 3-5 μm 사이에서 대수적으로 성장하는 세포), 중온성(mesophilic) (30-37 ℃에서 최적으로 성장)이며, pH 약 4-7.5 (최적의 pH는 약 5.5-6임)의 유사한 pH 범위를 갖고, 사이토크롬이 결여되어 있고, 그리고 Rnf 보합체를 통하여 에너지를 보존한다. 또한, 이들 종에서 카르복시산은 상응하는 알코올로 환원되었다.(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 중요한 것은, 이 종들은 모두 CO를 함유한 기체에서 강한 자가영양성 (autotrophic) 성장을 보이고, 주요 발효 산물로써 에탄올과 아세테이트 (또는 아세트산)를 생산하며, 특정 조건에서 2,3-부탄디올과 젖산을 소량 생산한다.
그러나, 이들 세 종은 또한 많은 차이점을 가지고 있다. 이 종들은 상이한 출처로부터 분리되었다: 클로스트리듐 오토에타노게눔은 토끼 장으로부터, 클로스트리듐 리중다레이는 양계장 폐기물로부터, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이는 담수 침전물로부터 분리되었다. 이들 종은 다양한 당 (예, 람노오스, 아라비노스), 산 (예, 글루코 네이트, 시트르산), 아미노산 (예, 아르기닌, 히스티딘) 및 기타 기질 (예, 베타인, 부탄올)의 용도에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(가령, 티아민, 바이오틴)에 대하여 영양요구성이 상이하다. 이들 종은 우드-융둘(Wood-Ljungdahl) 경로 유전자와 단백질의 핵산과 아미노산 서열에서 차이가 있지만, 이들 유전자와 단백질의 일반적인 체계와 수는 모든 종에서 동일하다는 것이 밝혀졌다(Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).
따라서, 요약하면, 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이 의 특징중 많은 것들은 이종에 특이적이지 않으며, 클로스트리듐 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토 제닉, 에타놀로겐 및 일산화탄소영양성 구성원에 대하여 오히려 일반적인 특징이다. 그러나, 이 종들은 사실상 구별되기 때문에, 이들 종의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종의 또다른 것에서 동일한 효과를 가지지 않을 수도 있다. 예를 들어, 성장, 수행 또는 산물의 생산에 있어서 차이가 관찰될 수 있다,
본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이.의 분리주 또는 돌연변이체로부터 또한 유도될 수 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 의 분리주 및 돌연변이체는 JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200), 그리고 LZ1561 (DSM23693)을 포함한다. 클로스트리듐 리중다레이 의 분리주 및 돌연변이체는 ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5,593,886), C-01 (ATCC 55988) (US 6,368,819), O-52 (ATCC 55989) (US 6,368,819), 그리고 OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)를 포함한다. 클로스트리듐 라가스다레이의 분리주 및 돌연변이체는 PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055)를 포함한다.
“기질(Substrate)”이란 본 발명의 미생물의 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 전형적으로, 상기 기질은 가스이며, C1-탄소 공급원, 예를 들면, CO, CO2, 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 상기 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 상기 기질은 다른 비-탄소 성분들, 이를 테면 H2, N2, 또는 전자를 더 포함할 수 있다.
상기 기질은 일반적으로 적어도 소량의 CO, 이를 테면 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 상기 기질은 일정 범위의 CO, 이를 테면 약 20-80, 30-70, 또는 40-60 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질은 약 40-70 mol%의 CO (가령, 제강 공장 또는 고로 가스), 약 20-30 mol%의 CO (가령, 기본 산소 가마 가스), 또는 약 15-45 mol%의 CO (가령, 합성 가스)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 상대적으로 저량의 CO, 이를 테면 약 1-10 또는 1-20 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 상기 기질에 있는 적어도 일부분의 CO를 산물로 전환시킨다.
상기 기질은 약간의 양의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 30 mol%의 H2를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 상대적으로 많은 양의 H2, 이를 테면 약 60, 70, 80, 또는 90 mol%의 H2를 포함할 수 있다. 추가 구체예들에서, 상기 기질은 실질적으로 H2를 포함하지 않는다.
상기 기질은 약간의 양의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 약 1-80 또는 1-30 mol%의 CO2를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 약 20, 15, 10, 또는 5 mol% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 기질은 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
상기 기질은 전형적으로 가스이지만, 상기 기질은 대체 형태로 또한 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 마이크로버블 분산 생성기를 사용하여 CO-함유 가스로 포화된 액체에 용해될 수 있다. 추가의 예로써, 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물, 또는 자동차 배기 가스 또는 바이오매스 가스화와 같은 일부 다른 공급원로부터 얻어지는 폐가스일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 산업 공정은 철 금속 산물 제조, 이를 테면 제강 제조, 비-철 산물 제조, 석유 정제 공정, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 그리고 코크 제조로 구성된 집단에서 선택된다. 이들 구체예에서, 상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기로 방출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포획될 수 있다.
상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성 가스일 수 있는데, 이를 테면, 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오매스의 가스화 또는 천연 가스의 개질에 의해 얻어진 합성 가스일 수 있다. 상기 기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효과를 감소시킬 수 있다. 상기 기질의 조성에 따라, 기질을 처리하거나, 문지러거나 또는 여과하여 독소, 원하지 않는 성분, 또는 먼지 입자와 같은 임의의 원하지 않는 불순물을 제거하고, 그리고/또는 바람직한 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 미생물은 배양되어, 하나 또는 그 이상의 산물이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 클로스트리듐 오토에타노게눔은 다음을 생산하거나 또는 생산하도록 조작될 수 있다: 에탄올 (WO 2007/117157), 아세테이트 (WO 2007/117157), 부탄올 (WO 2008/115080 및 WO 2012/053905), 부티레이트 (WO 2008/115080), 2,3-부탄디올 (WO 2009/151342), 젖산염 (WO 2011/112103), 부텐 (WO 2012/024522), 부타디엔 (WO 2012/024522), 메틸 에틸 케톤 (2-부탄온) (WO 2012/024522 및 WO 2013/185123), 에틸렌 (WO 2012/026833), 아세톤 (WO 2012/115527), 이소프로판올 (WO 2012/115527), 지질 (WO 2013/036147), 3-히드록시프로피오네이트 (3-HP) (WO 2013/180581), 이소프렌 (WO 2013/180584), 지방산 (WO 2013/191567), 2-부탄올 (WO 2013/185123), 1,2-프로판디올 (WO 2014/0369152), 그리고 1-프로판올 (WO 2014/0369152). 하나 또는 그 이상의 표적 산물에 추가하여, 본 발명의 미생물은 에탄올, 아세테이트, 및/또는 2,3-부탄디올을 또한 만들 수 있다.
“선택성(Selectivity)”이란 미생물에 의해 만들어진 모든 발효 산물에 대하여 표적 산물의 생산 비율을 지칭한다. 본 발명의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 산물을 만들도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 또는 75%를 차지한다. 한 구체예에서, 상기 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 10%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 상기 표적 산물에 대하여 적어도 10%의 선택성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 30%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 상기 표적 산물에 대하여 적어도 30%의 선택성을 갖는다.
전형적으로, 상기 배양은 생물반응장치에서 실행된다. 용어 “생물반응장치(bioreactor)”는 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정화 셀 반응기 (ICR), 살수 배드 반응기 (TBR), 버블 칼럼 (bubble column), 가스 리프트 발효기(gas lift fermenter), 고정 믹서(static mixer), 또는 가스-액체 접촉에 적합한 기타 용기 또는 장치와 같은 하나 또는 그 이상의 용기, 타워 또는 파이핑 배열로 구성된 배양/발효 장치를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 생물반응장치는 제 1 성장 반응기 및 제 2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 상기 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 모두에 제공될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "배양(culture)"과 "발효(fermentation)"는 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 과정의 성장 단계와 산물 생합성 단계를 모두 포함한다.
배양은 일반적으로 미생물의 성장을 허용하는데 충분한 양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 이를 테면, 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당분야에 공지되어 있다.
배양/발효는 표적 산물의 생산에 적절한 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 고려해야 할 반응 조건은 압력 (또는 분압), 온도, 기체 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도 (연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 액상의 기체가 제한적이 되지 않도록 최대 가스 기질 농도, 그리고 산물 억제를 피하기 위하여 최대 산물의 농도를 포함한다. 구체적으로, 기체-제한 조건 하에서 배양으로 인하여 산물이 소모될 수 있기 때문에, 기질의 유입 속도는 액상 기체 농도가 제한되지 않도록 조정될 수 있다.
고압에서 생물반응장치를 작동시키면 기체상으로부터 액체상으로 기체량 전달 속도가 증가된다. 따라서, 일반적으로 대기압보다 높은 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 기체 전환율은 부분적으로 기질 잔류 시간에 대한 함수이며, 잔류 시간은 생물반응장치의 필요 용적량을 결정하기 때문에, 가압 시스템의 사용으로 요구되는 생물반응장치의 용적을 크게 감소시킬 수 있고, 결과적으로 배양/발효 장비의 자본 비용은 절감될 수 있다. 다시, 생물반응장치 안에 액체 용적을 주입 기체 유속으로 나눈 것으로 정의되는 잔류 시간은 대기압보다 오히려 상승된 압력으로 생물반응장치가 유지될 때, 또한 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적의 반응 조건은 사용된 특정 미생물에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 대기압보다 높은 압력에서 발효시키는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 기체 전환율은 부분적으로 기질 잔류 시간에 대한 함수이며, 원하는 잔류 시간을 얻는 것은 생물반응장치의 필요 용적량을 결정하기 때문에, 가압 시스템의 사용으로 요구되는 생물반응장치의 용적을 크게 감소시킬 수 있고, 결과적으로 발효 장비의 자본 비용은 절감될 수 있다.
표적 산물은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 방법의 조합, 예를 들어 분별 증류, 증발, 투석증발(pervaporation), 가스 스트리핑, 상 분리 및 액체 추출이 포함된 추출 발효를 사용하여 발효액으로부터 분리 또는 정제될 수 있다 . 특정 구체예들에 있어서, 표적 산물들은 생물반응장치로부터 발효액의 일부를 연속적으로 제거하고, 발효액으로부터 미생물 세포를 분리하고 (통상적으로 여과를 통하여), 그리고 발효액으로부터 하나 이상의 표적 산물을 회수한다. 알코올 및/또는 아세톤은 예를 들면, 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은 예를 들면, 활성탄에서 흡착시킴으로써, 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포들은 생물반응장치로 되돌려보내는 것이 바람직하다. 표적 산물이 제거된 후에 남아있는 무-세포 투과액(permeate)도 생물반응장치로 되돌려보내는 것이 바람직하다. 생물반응장치로 되돌리기에 앞서, 배지를 보충하기 위해, 비타민 B와 같은 추가 영양분을 무-세포 투과액에 첨가할 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명을 추가로 설명하지만, 본 발명의 범주를 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 C. 오토에타노게눔 및 C. 리중다레이를 배양하는 일반적인 방법을 기술한다.
C. 오토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693 (DSM10061의 유도물) 그리고 C. 리중다레이 DSM13528는 DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)에서 구하였다.
균주들은 표준 혐기성 기술을 이용하여 37 ℃, PETC 배지, pH 5.6에서 성장시켰다 (Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971). 과당 (종속영양성 성장) 또는 공간 부분에서 30 psi의 CO-함유하는 제강 가스 (뉴질랜드 New Zealand Steel site에서 수집; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) (자가영양성 성장)를 기질로 이용하였다. 고체 배지의 경우, 1.2 % 박토 한천(bacto agar) (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA)가 추가되었다.
실시예
2
본 실시예는 p-히드록시벤조에이트 발현 플라스미드를 포함하는 균주의 구축을 실증한다.
코리스메이트 피루베이트 분해효소 (ubiC)의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)은 C. 오토에타노게눔 코돈-사용 표(GeneArt)에 따라 최적화시키고 (서열번호: 2), 우드-융돌(Wood-Ljungdahl) 경로 프로모터 (US 20110256600)의 제어 하에 pMTL8315 발현 벡터 (도 7) 안으로 클론시켰다. 피드백-비감성 돌연변이체 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 (DAHP) 합성효소 (aroG*)의 코딩 서열 (서열번호: 8)은 바이시스트로닉 형식에서 ubiC에 따라 또한 포함되었다 (도 7). 플라스미드 pARO_01 (서열번호: 9)는 공여자로써 대장균 균주 CA434와 접합을 통하여 C. 오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜 및 100 μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 LZ1561에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC-MES 한천 배지 상에 찍어넣고, 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 7.5 μg 티암페니콜/mL (Sigma) 및 10 μg 트리메토프림/mL (Sigma)이 보충된 PETC-MES 한천 배지상에 도말하였다. 플라스미드를 품고있는 3개의 콜로니 (가령 생물학적 트리플리케이트) 분리주는 7.5 μg 티암페니콜/mL와 탄소 공급원으로써 제강 배지 가스를 모의한 가스 혼합물 (50 % CO, 10 % H2, 30 % CO2, 10 % N2, 이하 본 출원에서는 “제강 가스(mill gas)”로 지칭됨)이 함유된 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
액체 배양물은 티암페니콜과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병 안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다. 바이오매스 (도 8)와 pHBA (도 9a 및 도 9b)를 측정하기 위하여 시료를 매일 채취하였다.
pHBA를 측정하기 위하여, 시료 (100 μL)에 10 μL 0.1N NaOH를 찔러넣고, 냉동시키고, 그 다음 동결건조시켰다. 그 다음 이 시료는 100 μL BSTFA + TCMS (99:1) 및 피리딘 100 μL으로 유도화되었다. 그 다음 이 시료는 60 ℃에서 30 분간 항온처리되어, 카르복실산 기능기의 트리메틸실일 유도체가 형성되었다. GC-MS 방법의 상세는 다음과 같다: 주사. 용적. 1uL; 주사. T 250 ℃; 분할 비 10:1. 초기 T 50 ℃ (5 분 유지); 최종 T 220 ℃ (20℃/min); 항속(const. flow) 1 mL/min (He 운반체 가스); 컬럼 Zebron ZB-5MS 30m x 0.25mm x 0.25μm. Varian Ion Trap 4000, 풀 스캔 모드 40-400 m/z에서 작동. Tune PFTBA
도 9a에서, LZ1561 (대조 균주)는 3개의 기술적 레플리케이트 (가령, 성장 및 시료채취 3회)를 갖는다. pARO_01를 갖는 LZ1561의 2개 생물학적 레플리케이트도 또한 준비되었고, 이들 각각은 3개의 기술적 레플리케이트를 가진다. “기술적 레플리케이트(Technical replicate)”란 별도의 실험에서 각 균주를 성장시키고, 시료채취하는 것을 말하며, “생물학적 레플리케이트(biological replicate)”는 스크래취(scratch)로부터 균주를 재생하는 것을 말한다. 이러한 방식으로, 레플리케이트는 이 미생물의 배경 생물학적 변이를 설명하는 반면, 기술적 레플리케이트는 배양, 샘플링 및 분석 방법을 포함한 기술적 측면으로 인한 변이를 설명한다. 도 9a는 pHBA가 별도 경우에서 반복적으로 생산되었다는 것을 보여준다. 도 8과 도 9b는 성장 및 pHBA 생산성의 전반적으로 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 가스 발효를 통하여 p-히드록시벤조에이트의 생산을 실증한다.
플라스미드 pARO_01 (서열번호: 9)를 품고 있는 C. 오토에타노게눔은 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 제강 가스에서 성장되었다. 실시예 1에서 실행된 것과 같이, 배양물의 GC-MS 분석에서 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 발현시키는 세균에 의해 pHBA가 만들어졌다는 것이 확인되었다. 이 방법을 이용한 pHBA 분석의 선형 범위는 0-12.5 mg/mL (도 5)이었다.
pHBA는 pHBA 표준의 잔류 시간 및 특징적인 단편 이온과 NIST 질량 분석 데이터베이스로부터의 예측된 특성 이온을 비교하여 검증되었다 (도 6).
pMTL8315 발현 벡터 상에 암호화된 코리스메이트-피루베이트 분해효소를 발현시키는 모든 배양물에서 pHBA 생산이 관찰되었다. 임의의 하나의 배양물에서 관찰된 pHBA의 정점 역가는 8일 후 17 mg pHBA/L이었다(도 9b). 상기 발현 벡터가 없는 대조 시료에서 pHBA는 관찰되지 않았다.
배양물에 존재하는 상기 유전적으로 조작된 세균에 의해 pHBA는 탐지가능한 수준으로 생성되었다.
실시예 4
본 실시예는 효소 공학을 통하여 pHBA의 생산을 증가시키는 실험 프로토콜을 실증한다.
UbiC는 pHBA의 잔류를 통하여 산물 억제를 받는다. ubiC를 암호화하는 핵산 서열은 상기 효소에 의한 산물 잔류에 관여하는 아미노산이 돌연변이되도록 변형되어, 이 산물의 방출은 증가될 수 있다. 이를 위하여, pHBA 결합에 관여하는 아미노산은 결합 산물을 가진 구조의 분석에 의해 동정된다. 산물 저해는 pHBA 결합 및 잔류에 관여하는 아미노산을 돌연변이시킴으로써 최소화된다. pHBA 수율에 있어서 가장 큰 촉매 효능을 갖는 효소를 확인하기 위해, ubiC 돌연변이체의 표적 라이브러리를 만들 수 있고, 이때 pHBA-결합 아미노산의 다양한 조합이 변형되고, 이러한 돌연변이 효소는 효소 분석법으로 분석할 수 있다. 그 다음 대부분 pHBA 생산성이 개선된 균주들을 입증하기 위하여, 개선된 돌연변이체들이 C. 오토에타노게눔 LZ1561에서 발현된다.
실시예 5
본 실시예는 살리실레이트 발현 플라스미드를 포함하는 균주의 구축을 실증한다.
pchA (서열번호: 4) 및 pchB (서열번호: 6)의 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되었고, 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 발현 벡터 안으로 클론되었다. 이 플라스미드는 공여자로써 대장균 균주 CA434와 접합을 통하여 C. 오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜 및 100 μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 C. 오토에타노게눔에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC-MES 한천 배지 상에 찍어넣고, 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 7.5 μg 티암페니콜/mL (Sigma) 및 10 μg 트리메토프림/mL (Sigma)이 보충된 PETC-MES 한천 배지상에 도말하였다. 플라스미드를 품고 있는 3개의 콜로니 (가령 생물학적 트리플리케이트) 분리주는 7.5 μg 티암페니콜/mL와 탄소 공급원으로써 제강 가스가 함유된 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
액체 배양물은 티암페니콜과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병 안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다.
바이오매스를 분광광도계로 모니터링하였다 OD600 nm = 0.3에서 40 ng 무수물테트라사이클린/mL을 추가하여 살리실레이트 생합성 경로의 발현을 유도하였다. 듀플리케이트 배양물 (3개의 생물학적 트리플리케이트의 기술적 레플리케이트)는 무수물테트라사이클린 없이 성장되었고, 살리실레이트 생합성 경로은 유도안된 상태로 유지되었다. 시료를 매일 채취하였다.
Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 m × 0.25 μm × 0.25 μm) 컬럼 및 오토샘플러가 구비된 Thermo Scientific ISQ LT GCMS를 이용하여, 기체 크로마토그래피 질량 분석(GCMS)에 의해 살리실레이트 농도가 측정되었다. 600 μL의 아세토니트릴과 50 μL 0.1N NaOH로 300 μL의 시료를 희석하여 시료를 준비하였다. 상기 시료는 볼텍스한 후, 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리되었고; 800 μL의 상청액은 유리 바이알로 이동된 후, 시료는 Thermo SpeedVac®에서 건조되었다. 건조 후, 이 시료는 22 mg/ml 메톡시아민 HCl이 포함된 100 μL의 피리딘 용액에 현탁되었고, 그 다음 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 이후, 300 μL N,O-비스트리플로오르아세타미드(BSTFA)가 추가되었고, 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 분석을 위하여 시료는 1.5 μL 주사를 이용하여 오토샘플러로 옮겨진다: 분할 비는 20대 1, 그리고 유입 온도는 250℃임. 크로마토크래피는 80 ℃ (유지 없음)에서 분당 3 ℃의 경사로 140℃까지, 그리고 분당 20 ℃의 경사로 230℃까지 오븐 프로그램과, 최종 4-분의 유지로 실시되었다. 컬럼 유속은 분당 38 cm2이며, 운반 가스는 헬륨이다. MS 이온 공급원은 280 ℃에서 유지되었다. 정량화(Quantitation)는 정량화 이온을 위하여 267m/z를 이용하여 실행하였고, 퀄리파이어(qualifier) 이온으로서 135 및 45m/z가 사용되었다.
도 11a은 유도된 시료와 유도안된 시료에서 바이오매스 성장을 비교한 것을 나타낸다. 도 11b에서 살리실레이트가 반복적으로 생산되었다는 것을 보여준다.
실시예 6
본 실시예는 코리스메이트-유도된 산물들의 강화된 생산을 위한 pheA 녹아웃을 실증하였다.
pheA (가령, C. 오토에타노게눔, CAETHG_0905 (CP006763.1:973789..974925)에서)는 효소 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 유전자다. 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트가 방향족 아미노산 페닐알라닌 및 티로신의 전구물질인 프레페네이트로 전환을 촉매한다. pheA 기능은 ClosTron 방법 (Heap et al., J Microbiol Methods. 2010, 80(1):49-55)을 이용하여 이 유전자를 파괴함으로써 녹아웃되었다. ClosTron 플라스미드 pMTL007C-E2는 DNA2.0에 의해 생성되었고 공여자로써 대장균 균주 CA434 와 접합을 통하여 C. 오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 C. 오토에타노게눔 LZ1561에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC 한천 배지 상에 찍어넣고, 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 500 μL PBS에 재현탁시키고, 그리고 7.5 μg/mL 티암페니콜 (Sigma) 및 10 μg/mL 트리메토프림 (Sigma)이 보충된 PETC 한천 배지 상에 도말하였다. 플라스미드를 품고있는 분리주는 탄소원으로 제강 가스와 함께 7.5 μg 티암페니콜/mL을 함유하는 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
항생제 클라리트로마이신 (5 μg/mL)이 함유된 PETC 고체 배지 상에 콜로니를 스트리킹하였다(streaked). 이 단계는 인트론 재표적 서열을 게놈에 통합하기 위해 선택되었다. 인트론 서열을 표적 부위에 통합시키면, 게놈에서 1800개의 염기쌍의 삽입을 초래하고, 이들은 콜로니 PCR에 의해 스크리닝되었다. 포지티브 ClosTron 돌연변이체의 PCR 산물은 정제되고, 서열화되어, 삽입 부위가 확인되었다.
액체 배양물은 클라리트로마이신과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다. 이 혈청 병으로부터 글리세롤 스톡이 준비되었다.
생물반응장치 실험은 2 L BioFlo 115 워터 재킷 시스템(New Brunswick Scientific Corp., Edison, NJ)에서 실행되었는데, 작업 용적은 1.5 L이다. 상기 CSTR 시스템에는 6개-블레이드의 Rushton 임펠러 2개가 장착되어 있으며, 배플(baffles)은 발효액의 혼합과 가스의 액체량 이동을 개선시킨다. pH 및 산화-환원 전위 (ORP) 전극 (Broadley-James Corporation)은 해드플레이트를 통하여 삽입되었고, 5분 간격으로 이들의 판독이 기록되었다. 수산화암모늄 5 M 용액의 자동 첨가에 의해 pH는 5.0으로 유지되었다.
접종물은 글리세롤 스톡으로부터 준비되었다. 1 mL의 글리세롤 스톡은 탄소원으로 22 psi 제강 가스를 가진 PETC 배지 50ml로 전달되었다. 상기 배양물은 가시적인 성장이 관찰될 때까지 2-3일 동안 37 ℃에서 배양되었다. 그 다음 이 배양물을 이용하여 1L-Schott 병 안에 200 mL의 새로운 배지를 접종하였고, 제강 가스는 22 psi 압력으로 추가되었다. Schott 병은 발효통으로 이동하기에 앞서 다시 24-36시간 동안 배양되었다.
교반은 200 rpm로 설정되었으며, 가스 유속은 35 mL/min/L으로 설정되었다. 하루 뒤, 교반 속도는 4시간 간격으로 25 rpm씩 증분되어 최대 값 900 rpm이 되도록 하였다. 가스 유속은 표적 CO 수취가 이루어질 수 있는 최대 유속으로 4시간 간격으로 25 mL/min/L 씩 증가되었다. Na2S는 발효 전체 과정에 걸쳐 추가되는데, 초기 발효 속도 0.3 mL/h이며, 이후 헤드스페이스에서 H2S 농도가 200~ppm 아래로 떨어지면, 0.2 mL/h씩 증분되어 증가시켰다. H2S 농도와 함께, CO 및 H2 소비, 그리고 CO2 생산은 기체 크로마토그래피(GC)를 사용하여 매시간 측정되었다 HPLC를 사용하여 세포 질량 및 대사산물 농도를 결정하기 위해, 발효 과정에 걸쳐 일정한 간격으로 발효기로부터 액체 시료를 채취했다.
배치(batch) 모드로 시작한 후, OD가 2의 값에 도달하면 발효기를 연속 모드로 전환시켰다. 배지 및 양분 유입 속도는 하나 또는 이상의 정밀 연동 펌프 (Masterflex L/S 디지털 구동 펌프)에 의해 제어되었으며, 발효기 용적은 CSTR로부터 발효액 제거를 위해 펌프를 작동시키는 레벨 프로브를 사용하여 일정하게 유지되었다. 희석 비율은 한 단계에서 0.5 일-1 로 설정되었으며, 24시간 간격으로 1 일-1 에서 1.7 일-1 로 증가되었다.
상기 발효에 추가되는 추가 장비는 공극 크기가 0.2 μm이며, 표면적이 1,200 cm2인 중공 섬유막(GE Healthcare)이다. 이 막은 발효에서 세포 농도를 증가시키는데 사용되었다. 이 발효액을 막을 통해 고속으로 펌핑한 후, 발효기로 다시 되돌려 보내고, 무-세포 여과액의 흐름은 배지 펌프 속도보다 느린 속도로 여과액 탱크로 펌핑했다. 이로 인하여 발효통 안의 세균 세포의 잔류류 시간이 증가되었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, GC-MS를 이용하여 3가지 새로운 화합물이 동정되었다. 이들 화합물은 cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 3,4-디히드록시벤조산, 그리고 2-아미노벤조산이다. 이들 화합물은 오직 pheA::CT 배양에서만 탐지되었고, 모계 균주 (LZ1561) 배양에서는 탐지되지 않았다.
3,4 디히드록시 벤조산, 2-아미노벤조산 및 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산 농도는 Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 m × 0.25 μm × 0.25 μm) 컬럼, 오토샘플러, 그리고 불꽃 이온화 탐지기(FID)가 구비된 Agilent 6890N GC를 이용하여 기체 크로마토그래피(GC) 질량 분석에 의해 측정되었다. 시료는 400 μL의 시료를 400 μL의 아세토니트릴로 희석시키고, 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 준비되었고; 이 상청액은 유리 바이알로 이동된 후, 시료는 Thermo SpeedVac®에서 건조되었다. 건조후, 이 시료는 400 μL의 N,O-비스트리플로오르아세타미드(BSTFA) 및 피리딘(3:1 비율)의 용액에 재현탁되었고, 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 시료는 1 μL 주사를 이용하여 분석을 위한 오토샘플러로 옮겨진다: 분할 비는 30대 1, 그리고 유입 온도는 250℃임. 크로마토크래피는 70 ℃ (유지 없음)에서 분당 3 ℃의 경사로 110℃까지, 그리고 분당 15 ℃의 경사로 230℃까지, 그리고 분당 40 ℃의 최종 경사로 310℃까지의 오븐 프로그램과, 최종 3-분의 유지로 실시되었다. 컬럼 유속은 분당 1.8 ml이며, 운반 가스는 헬륨이다. FID는 320 ℃에서 유지되었으며, 수소는 40 ml/min에서, 공기는 400 ml/min에서, 그리고 메이커업 가스(makeup gas)로써 헬륨은 20 ml/min로 유지되었다.
도 12는 발효 운용 과정에 걸쳐 cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 3,4-디히드록시벤조산, 그리고 2-아미노벤조산의 농도를 보여준다. 도 12에 나타난 바와 같이, 발효 6일차에 화합물 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산는 약 0.9g/L의 농도로 증가되었다. 2-아미노벤조산는 발효 8-9일차에 약 0.45g/L의 농도로 축적되었다. 3,4-디히드록시벤조산은 더 적은 양으로 생성되었는데, 6-8일차에 대략 0.3g/L의 농도에서 정점을 찍었다. 6일차에 관찰된 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산, 2-아미노벤조산 및 3,4-디히드록시벤조산의 전체 축적은 >1.3 g/L이었다.
cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산 생산에 대하여 문헌에서 공지된 것은 거의 없다. GC-MS를 이용하여 어린이 소변에서 cis-4 히드록시시클로헥산카르복실산이 탐지되었다는 유일한 보고가 있다. 이 화합물은 장내 세균 대사의 부산물로 이라고 가설이 있다 (Kronick, Clinica Chimica Acta, 132: 205-208, 1983). 이 화합물은 반응 기전이 피루베이트 분자의 절단에 이어, NAD(P)H를 통하여 제공될 수 있는 추가 2.5 H2 분자를 필요로 하는 환원에 의해 설명될 수 있기 때문에, 코리스메이트 또는 프레파네이트의 직접적인 반응 산물로 보인다.
2-아미노벤조산은 상기 코리스메이트에서 트립토판 경로의 알려진 중간산물이다. 안트라닐레이트 합성효소는 아민화에 이어 코리스메이트의 방향족화를 촉매하여, 트립토판 분자의 방향족 골격을 얻게 된다. 안트라닐레이트 합성효소의 유전자 발현은 고도로 조절되고, 최종 산물 트립토판에 의한 피드백 억제를 받게되는 것으로 알려져 있다 (Dosselaere, Crit Rev Microbiol, 27: 75-131, 2001). 2-아미노벤조산은 성장이 멈출 때만 발효액으로 분비되며, 이것은 성장이 중단될 때, 더 이상 반응하지 않은 과다유출 산물임을 나타낸다.
본원에 인용된 출판물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 문헌은 각각의 문헌이 개별적으로, 그리고 참고 문헌으로 인용된 것으로서 본원에 그 전문이 기재되어있는 것과 동일한 정도로 참고 자료에 편입된다. 이 명세의 선행 기술에 대한 언급은 선행 기술이 임의의 나라에서 노력 분야에서 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 받아들여서도 안된다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 이하의 청구 범위의 문맥에서) 단수("a" 및 "an" 그리고 "the") 및 유사한 지시자의 사용은 명시적되거나 또는 명백하게 상반되는 기재가 없는 한, 단수와 복수를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including) "및 "함유하는(containing)" 용어들은 다른 언급이 없는 한, 개방형-용어 (즉, "포함하지만 이에 국한되지 않는"을 의미 함)로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위 언급은 단지 본원에서 다른 언급이 없는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로 이용하기 위한 것이며, 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 또는 명백한 반대 지시가 없는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 임의의 그리고 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "~와 같은")의 사용은 다른 언급이 없는 한, 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 구체예들이 본원에 기술된다. 상기 바람직한 구체예들의 변형은 전술한 설명을 읽음으로써 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자는 숙련된 기술자들이 그러한 변형을 적절하게 사용할 것을 기대하며, 본 발명자는 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시되도록 만들었다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률에 의해 허용된 바와 같이, 본 명세서에 첨부된 청구 범위에 기재된 주제의 모든 변경 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기 언급 된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> UCL Business PLC
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<150> GB 1509413.9
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Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
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Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
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Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
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Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
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Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
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Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
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Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg
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Asp Lys Val Lys Gln Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Thr Leu Gln Gln
245 250 255
Gln Glu Cys Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Lys Glu Gly Gln Arg Gln Glu
260 265 270
Asn Lys Asn Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Thr
275 280 285
Arg Val Val Leu His Asp Gly Asp Pro Asn Glu Pro Val Ser Asp Tyr
290 295 300
Ile Asn Ala Asn Ile Ile Met Pro Glu Phe Glu Thr Lys Cys Asn Asn
305 310 315 320
Ser Lys Pro Lys Lys Ser Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Cys Leu Gln Asn
325 330 335
Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Val Phe Gln Glu Asn Ser Arg Val
340 345 350
Ile Val Met Thr Thr Lys Glu Val Glu Arg Gly Lys Ser Lys Cys Val
355 360 365
Lys Tyr Trp Pro Asp Glu Tyr Ala Leu Lys Glu Tyr Gly Val Met Arg
370 375 380
Val Arg Asn Val Lys Glu Ser Ala Ala His Asp Tyr Thr Leu Arg Glu
385 390 395 400
Leu Lys Leu Ser Lys Val Gly Gln Ala Leu Leu Gln Gly Asn Thr Glu
405 410 415
Arg Thr Val Trp Gln Tyr His Phe Arg Thr Trp Pro Asp His Gly Val
420 425 430
Pro Ser Asp Pro Gly Gly Val Leu Asp Phe Leu Glu Glu Val His His
435 440 445
Lys Gln Glu Ser Ile Val Asp Ala Gly Pro Val Val Val His Cys Ser
450 455 460
Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Val Ile Asp Ile Leu Ile
465 470 475 480
Asp Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Asp Cys Asp Ile Asp Val Pro Lys
485 490 495
Thr Ile Gln Met Val Arg Ser Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu
500 505 510
Ala Gln Tyr Arg Phe Ile Tyr Met Ala Val Gln His Tyr Ile Glu Thr
515 520 525
Leu Gln Arg Arg Ile Glu Glu Glu Gln Lys Ser Lys Arg Lys Gly His
530 535 540
Glu Tyr Thr Asn Ile Lys Tyr Ser Leu Val Asp Gln Thr Ser Gly Asp
545 550 555 560
Gln Ser Pro Leu Pro Pro Cys Thr Pro Thr Pro Pro Cys Ala Glu Met
565 570 575
Arg Glu Asp Ser Ala Arg Val Tyr Glu Asn Val Gly Leu Met Gln Gln
580 585 590
Gln Arg Ser Phe Arg
595
<210> 10
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHP-2 first SH2 domain
<400> 10
Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu
1 5 10 15
Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn
20 25 30
Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His
35 40 45
Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu
50 55 60
Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His
65 70 75 80
Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro
85 90 95
Leu
<210> 11
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHP-2 second SH2 domain
<400> 11
Trp Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Glu Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His
20 25 30
Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu
35 40 45
Ser Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln
50 55 60
Glu Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr
65 70 75 80
Asp Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly
85 90 95
Thr Val Leu Gln Leu Lys Gln Pro Leu
100 105
<210> 12
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHP-2 both SH2 domains
<400> 12
Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu
1 5 10 15
Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn
20 25 30
Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His
35 40 45
Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu
50 55 60
Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His
65 70 75 80
Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Phe His Gly His Leu
100 105 110
Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu Lys Gly Lys His Gly
115 120 125
Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro Gly Asp Phe Val Leu
130 135 140
Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser Asn Asp Gly Lys Ser
145 150 155 160
Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu Leu Lys Tyr Asp Val
165 170 175
Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Tyr
180 185 190
Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly Thr Val Leu Gln Leu Lys
195 200 205
Gln Pro Leu
210
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3-zeta endodomain
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 754
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70-SH2 domain fused to a CD3-zeta endodomain
<400> 14
Met Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
1 5 10 15
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
20 25 30
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
35 40 45
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
65 70 75 80
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
100 105 110
Pro Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro
130 135 140
Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys
145 150 155 160
Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg
165 170 175
Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His
180 185 190
His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly
195 200 205
Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg
210 215 220
Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro
225 230 235 240
Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala
245 250 255
Met Val Arg Asp Tyr Val Arg Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala
260 265 270
Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile
275 280 285
Ala Thr Thr Ala His Glu Arg Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr
290 295 300
Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly
305 310 315 320
Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser
325 330 335
Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys
340 345 350
Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp
355 360 365
Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys
370 375 380
Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala
385 390 395 400
Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln
405 410 415
Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala
420 425 430
Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser
435 440 445
Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys
450 455 460
Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly
465 470 475 480
Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys
485 490 495
Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys
500 505 510
Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu
515 520 525
Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala
530 535 540
Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe
545 550 555 560
Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu
565 570 575
Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe
580 585 590
Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His
595 600 605
Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp
610 615 620
Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp
625 630 635 640
Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp
645 650 655
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln
660 665 670
Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu
675 680 685
Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr
690 695 700
Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp
705 710 715 720
Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala
725 730 735
Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala
740 745 750
Cys Ala
<210> 15
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 endodomain
<400> 15
Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln
1 5 10 15
Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr
20 25 30
Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val
35 40 45
Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser
50 55 60
Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro
65 70 75 80
Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro
85 90 95
Leu
<210> 16
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BTLA4 endodomain
<400> 16
Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly Leu Gln
1 5 10 15
Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys Val Arg
20 25 30
Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr Asn Pro
35 40 45
Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro Glu Met
50 55 60
Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln Arg Pro
65 70 75 80
Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg
85 90 95
Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu
100 105 110
Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro
115 120 125
Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His
130 135 140
<210> 17
<211> 168
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LILRB1 endodomain
<400> 17
Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys
1 5 10 15
Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp
20 25 30
Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu
50 55 60
Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr
65 70 75 80
Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro
85 90 95
Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu
100 105 110
Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln
115 120 125
Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala
130 135 140
Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser
145 150 155 160
Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His
165
<210> 18
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LAIR1 endodomain
<400> 18
His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu
1 5 10 15
Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu
20 25 30
Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg
35 40 45
Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr
50 55 60
Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala
65 70 75 80
Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala
85 90 95
Ala Val Ala Arg His
100
<210> 19
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA4 endodomain
<400> 19
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg
20 25 30
Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro
35 40 45
Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
50 55 60
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIR2DL1 endodomain
<400> 20
Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile
1 5 10 15
Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ala
20 25 30
Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg
35 40 45
Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr
50 55 60
Tyr Thr Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg
65 70 75 80
Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Ile Ile Val Tyr Thr
85 90 95
Glu Leu Pro Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro
100 105 110
<210> 21
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIR2DL4 endodomain
<400> 21
Gly Ile Ala Arg His Leu His Ala Val Ile Arg Tyr Ser Val Ala Ile
1 5 10 15
Ile Leu Phe Thr Ile Leu Pro Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser
20 25 30
Lys Lys Lys Glu Asn Ala Ala Val Met Asn Gln Glu Pro Ala Gly His
35 40 45
Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val
50 55 60
Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Ile Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr
65 70 75 80
Gly Pro Ser Gln Arg Ser Lys Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ser Val Cys
85 90 95
Ile Glu Leu Pro Asn Ala Glu Pro Arg Ala Leu Ser Pro Ala His Glu
100 105 110
His His Ser Gln Ala Leu Met Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu
115 120 125
Ser Gln Thr Gln Leu Ala Ser Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Ile
130 135 140
<210> 22
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIR2DL5 endodomain
<400> 22
Thr Gly Ile Arg Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Ile Ile Leu Phe Ile Ile Leu Phe Phe Phe Leu Leu His Cys Cys Cys
20 25 30
Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp
35 40 45
Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Asp Gln Asp Pro Gln Glu Val
50 55 60
Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Thr Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Thr Met Tyr
85 90 95
Met Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Leu Ser Pro Ala His Lys
100 105 110
His His Ser Gln Ala Leu Arg Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu
115 120 125
Ser Gln Asn Arg Val Ala Ser Ser His Val Pro Ala Ala Gly Ile
130 135 140
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIR3DL1 endodomain
<400> 23
Lys Asp Pro Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile
1 5 10 15
Ile Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Leu Trp Cys Ser
20 25 30
Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg
35 40 45
Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Glu Glu Val Thr
50 55 60
Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg
65 70 75 80
Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ile Leu Tyr Thr
85 90 95
Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro
100 105 110
<210> 24
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIR3DL3 endodomain
<400> 24
Lys Asp Pro Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser
1 5 10 15
Val Val Ile Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg
20 25 30
Trp Cys Ala Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala
35 40 45
Gly Asn Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln
50 55 60
Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys
65 70 75 80
Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ser
85 90 95
Val
<210> 25
<211> 701
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTPN6-SH2 domain fused to a PD1 endodomain
<400> 25
Met Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe
1 5 10 15
Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro
20 25 30
Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile
35 40 45
Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser
50 55 60
Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His
65 70 75 80
Cys Ser Trp Pro Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Arg Trp Phe His
100 105 110
Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly
115 120 125
Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp
130 135 140
Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile
145 150 155 160
Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala
165 170 175
Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu
180 185 190
Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys
195 200 205
Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His Gly His Met Ser Gly Gly
210 215 220
Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu
225 230 235 240
Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu
245 250 255
Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His
260 265 270
Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu
275 280 285
Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly
290 295 300
Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr
305 310 315 320
Ala Thr Arg Val Asn Ala Ala Asp Ile Glu Asn Arg Val Leu Glu Leu
325 330 335
Asn Lys Lys Gln Glu Ser Glu Asp Thr Ala Lys Ala Gly Phe Trp Glu
340 345 350
Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys Asn Leu His Gln Arg
355 360 365
Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys Asn Arg Tyr Lys Asn
370 375 380
Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu Gln Gly Arg Asp Ser
385 390 395 400
Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Asn Gln
405 410 415
Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Ala Ser Gln Gly
420 425 430
Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln Met Ala Trp Gln Glu
435 440 445
Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu Val Glu Lys Gly Arg
450 455 460
Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly Met Gln Arg Ala Tyr
465 470 475 480
Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His Asp Thr Thr Glu Tyr
485 490 495
Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp Asn Gly Asp Leu Ile
500 505 510
Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp Pro Asp His Gly Val
515 520 525
Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe Leu Asp Gln Ile Asn Gln
530 535 540
Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro Ile Ile Val His Cys Ser
545 550 555 560
Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile Val Ile Asp Met Leu Met
565 570 575
Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys Asp Ile Asp Ile Gln Lys
580 585 590
Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu
595 600 605
Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe Ile Glu Thr
610 615 620
Thr Lys Lys Lys Leu Glu Val Leu Gln Ser Gln Lys Gly Gln Glu Ser
625 630 635 640
Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala Met Lys Asn Ala His Ala
645 650 655
Lys Ala Ser Arg Thr Ser Ser Lys His Lys Glu Asp Val Tyr Glu Asn
660 665 670
Leu His Thr Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys Val Lys Lys Gln Arg Ser
675 680 685
Ala Asp Lys Glu Lys Ser Lys Gly Ser Leu Lys Arg Lys
690 695 700
<210> 26
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70 kinase domain
<400> 26
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
1 5 10 15
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
20 25 30
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
35 40 45
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
50 55 60
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
65 70 75 80
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
100 105 110
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
115 120 125
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
130 135 140
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
165 170 175
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
180 185 190
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
195 200 205
Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys
210 215 220
Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
225 230 235 240
Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp
245 250 255
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
260 265 270
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
275 280 285
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
290 295
<210> 27
<211> 280
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTPN6 phosphatase domain
<400> 27
Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys Asn Leu
1 5 10 15
His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys Asn Arg
20 25 30
Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu Gln Gly
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile
50 55 60
Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Ala
65 70 75 80
Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln Met Ala
85 90 95
Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu Val Glu
100 105 110
Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly Met Gln
115 120 125
Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His Asp Thr
130 135 140
Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp Asn Gly
145 150 155 160
Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp Pro Asp
165 170 175
His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe Leu Asp Gln
180 185 190
Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro Ile Ile Val
195 200 205
His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile Val Ile Asp
210 215 220
Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys Asp Ile Asp
225 230 235 240
Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser Gly Met Val
245 250 255
Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe
260 265 270
Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Leu
275 280
<210> 28
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHP-2 phosphatase domain
<400> 28
Trp Glu Glu Phe Glu Thr Leu Gln Gln Gln Glu Cys Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Ser Arg Lys Glu Gly Gln Arg Gln Glu Asn Lys Asn Lys Asn Arg Tyr
20 25 30
Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Thr Arg Val Val Leu His Asp Gly
35 40 45
Asp Pro Asn Glu Pro Val Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Ile Ile Met
50 55 60
Pro Glu Phe Glu Thr Lys Cys Asn Asn Ser Lys Pro Lys Lys Ser Tyr
65 70 75 80
Ile Ala Thr Gln Gly Cys Leu Gln Asn Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg
85 90 95
Met Val Phe Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Lys Glu
100 105 110
Val Glu Arg Gly Lys Ser Lys Cys Val Lys Tyr Trp Pro Asp Glu Tyr
115 120 125
Ala Leu Lys Glu Tyr Gly Val Met Arg Val Arg Asn Val Lys Glu Ser
130 135 140
Ala Ala His Asp Tyr Thr Leu Arg Glu Leu Lys Leu Ser Lys Val Gly
145 150 155 160
Gln Ala Leu Leu Gln Gly Asn Thr Glu Arg Thr Val Trp Gln Tyr His
165 170 175
Phe Arg Thr Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Asp Pro Gly Gly Val
180 185 190
Leu Asp Phe Leu Glu Glu Val His His Lys Gln Glu Ser Ile Met Asp
195 200 205
Ala Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly
210 215 220
Thr Phe Ile Val Ile Asp Ile Leu Ile Asp Ile Ile Arg Glu Lys Gly
225 230 235 240
Val Asp Cys Asp Ile Asp Val Pro Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ser
245 250 255
Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Arg Phe Ile Tyr
260 265 270
Met Ala
<210> 29
<211> 519
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTPN6 SH2 domain fusion: ZAP70 kinase domain
<400> 29
Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser
20 25 30
Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln
35 40 45
Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu
85 90 95
Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His
100 105 110
Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly
115 120 125
Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp
130 135 140
Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser
145 150 155 160
Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu
180 185 190
His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr
195 200 205
Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Glu Glu
210 215 220
Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile Ala
225 230 235 240
Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly Val
245 250 255
Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Lys
260 265 270
Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala Gln
275 280 285
Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly Val
290 295 300
Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly Gly
305 310 315 320
Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val Ser
325 330 335
Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu
340 345 350
Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu
355 360 365
Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys
370 375 380
Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly Lys
385 390 395 400
Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys Phe
405 410 415
Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu Ala
420 425 430
Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu Val
435 440 445
Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu Cys
450 455 460
Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys Trp
465 470 475 480
Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala Cys
485 490 495
Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr Gln
500 505 510
Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
515
<210> 30
<211> 581
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70 SH2 domain fusion: PTPN6 phosphatase domain
<400> 30
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Glu
290 295 300
Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys Asn Leu His Gln Arg
305 310 315 320
Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys Asn Arg Tyr Lys Asn
325 330 335
Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu Gln Gly Arg Asp Ser
340 345 350
Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Asn Gln
355 360 365
Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Ala Ser Gln Gly
370 375 380
Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln Met Ala Trp Gln Glu
385 390 395 400
Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu Val Glu Lys Gly Arg
405 410 415
Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly Met Gln Arg Ala Tyr
420 425 430
Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His Asp Thr Thr Glu Tyr
435 440 445
Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp Asn Gly Asp Leu Ile
450 455 460
Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp Pro Asp His Gly Val
465 470 475 480
Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe Leu Asp Gln Ile Asn Gln
485 490 495
Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro Ile Ile Val His Cys Ser
500 505 510
Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile Val Ile Asp Met Leu Met
515 520 525
Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys Asp Ile Asp Ile Gln Lys
530 535 540
Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu
545 550 555 560
Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe Ile Glu Thr
565 570 575
Thr Lys Lys Lys Leu
580
<210> 31
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 endodomain
<400> 31
Met Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
1 5 10 15
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
20 25 30
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 32
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 41BB endodomain
<400> 32
Met Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 33
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40 endodomain
<400> 33
Met Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 34
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICOS endodomain
<400> 34
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 35
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD27 endodomain
<400> 35
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BTLA endodomain
<400> 36
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10 15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
20 25 30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
35 40 45
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
50 55 60
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
85 90 95
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
100 105 110
<210> 37
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD30 endodomain
<400> 37
His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
20 25 30
Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
35 40 45
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
50 55 60
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
85 90 95
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
100 105 110
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GITR endodomain
<400> 38
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 39
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HVEM endodomain
<400> 39
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 40
<211> 682
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 endodomain fused to amino-terminus of full-length ZAP
<400> 40
Met Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
1 5 10 15
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
20 25 30
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
50 55 60
Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu
85 90 95
Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser
100 105 110
Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu
115 120 125
Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn
145 150 155 160
Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro Gly
165 170 175
Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg Gln
180 185 190
Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser Gln
195 200 205
Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg Met
210 215 220
Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg Lys
245 250 255
Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val Tyr
260 265 270
His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro Glu
275 280 285
Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys Leu
290 295 300
Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn Ser
305 310 315 320
Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His
325 330 335
Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser
340 345 350
Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro
355 360 365
Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp
370 375 380
Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu
385 390 395 400
Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg
405 410 415
Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys
420 425 430
Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg
435 440 445
Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu
450 455 460
Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala
465 470 475 480
Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile
485 490 495
Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met
500 505 510
Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg
515 520 525
Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly
530 535 540
Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser
545 550 555 560
Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe
565 570 575
Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met
580 585 590
Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly
595 600 605
Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro
610 615 620
Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile
625 630 635 640
Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met
645 650 655
Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly
660 665 670
Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
675 680
<210> 41
<211> 683
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 41BB endodomain fused to amino-terminus of full-length ZAP
<400> 41
Met Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
65 70 75 80
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
85 90 95
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
100 105 110
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
115 120 125
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
130 135 140
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
145 150 155 160
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
165 170 175
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
180 185 190
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
195 200 205
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
210 215 220
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
245 250 255
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
260 265 270
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
275 280 285
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
290 295 300
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
325 330 335
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn
340 345 350
Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys
355 360 365
Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser
370 375 380
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
385 390 395 400
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
405 410 415
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
420 425 430
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
435 440 445
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
450 455 460
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
465 470 475 480
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
485 490 495
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
500 505 510
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
530 535 540
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
545 550 555 560
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
565 570 575
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
645 650 655
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
660 665 670
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
675 680
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<211> 677
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40 endodomain fused to amino-terminus of full-length ZAP
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1 5 10 15
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20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Pro Asp Pro Ala Ala
50 55 60
His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg Ala Glu Ala Glu Glu
65 70 75 80
His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu Leu Arg Gln
85 90 95
Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser Leu Val His Asp Val
100 105 110
Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu Asn Gly Thr Tyr Ala
115 120 125
Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala Glu Leu Cys Glu Phe
130 135 140
Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn Leu Arg Lys Pro Cys
145 150 155 160
Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro Gly Val Phe Asp Cys Leu
165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn Ser Ser Ala Ser Asn Ala
305 310 315 320
Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser Thr Leu Thr
325 330 335
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340 345 350
Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro Met Pro Met
355 360 365
Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu Glu Leu Lys
370 375 380
Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile Ala Asp Ile
385 390 395 400
Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly Val Tyr Arg
405 410 415
Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Lys Gln Gly
420 425 430
Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala Gln Ile Met
435 440 445
His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly Val Cys Gln
450 455 460
Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly Gly Pro Leu
465 470 475 480
His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val Ser Asn Val
485 490 495
Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu Glu
500 505 510
Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Val
515 520 525
Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ala Leu
530 535 540
Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly Lys Trp Pro
545 550 555 560
Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys Phe Ser Ser
565 570 575
Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu Ala Leu Ser
580 585 590
Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu Val Met Ala
595 600 605
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610 615 620
Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp
625 630 635 640
Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala Cys Tyr Tyr
645 650 655
Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ala
660 665 670
Glu Ala Ala Cys Ala
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<213> Artificial Sequence
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50 55 60
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<213> Artificial Sequence
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Met Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
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20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr
115 120 125
Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr
130 135 140
Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu
145 150 155 160
Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His
165 170 175
Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly
180 185 190
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195 200 205
Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser
210 215 220
Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr
225 230 235 240
Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu
245 250 255
His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr
260 265 270
Leu Arg Gln Pro Tyr
275
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<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX40 endodomain fused to the amino-terminus of PTPN6 SH2 domain
<400> 45
Met Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Arg Trp Phe His
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly
65 70 75 80
Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp
85 90 95
Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile
100 105 110
Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala
115 120 125
Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu
130 135 140
Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys
145 150 155 160
Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His Gly His Met Ser Gly Gly
165 170 175
Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu
180 185 190
Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu
195 200 205
Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His
210 215 220
Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu
225 230 235 240
Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly
245 250 255
Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr
260 265 270
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Akt kinase domain
<400> 46
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1 5 10 15
Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly
20 25 30
Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met
35 40 45
Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His
50 55 60
Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro Phe Leu
65 70 75 80
Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys Phe Val
85 90 95
Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu
100 105 110
Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val
115 120 125
Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp
130 135 140
Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile
145 150 155 160
Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met
165 170 175
Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu
180 185 190
Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val
195 200 205
Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His
210 215 220
Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg
225 230 235 240
Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys
245 250 255
Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile
260 265 270
Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val Tyr Glu
275 280 285
Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp
290 295 300
Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr
305 310 315 320
Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg
325 330 335
Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala
340 345 350
<210> 47
<211> 630
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70-SH2 domain fused directly to an Akt kinase domain
<400> 47
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu
275 280 285
Ala Lys Pro Lys His Arg Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys
305 310 315 320
Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile
325 330 335
Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu
340 345 350
Gln Asn Ser Arg His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln
355 360 365
Thr His Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu
370 375 380
Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala
385 390 395 400
Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser
405 410 415
Glu Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu
420 425 430
Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu
435 440 445
Gly Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu
450 455 460
Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val
465 470 475 480
Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg
485 490 495
Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu
500 505 510
Met Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser
515 520 525
Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly
530 535 540
Gly Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly
545 550 555 560
Ile Val Trp Gln His Val Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys
565 570 575
Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe
580 585 590
Thr Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met
595 600 605
Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr
610 615 620
Ser Ala Ser Gly Thr Ala
625 630
<210> 48
<211> 651
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70-SH2 domain fused to an Akt kinase domain via a linker
<400> 48
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Glu
290 295 300
Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg Val Thr Met Asn Glu
305 310 315 320
Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile
325 330 335
Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu
340 345 350
Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr
355 360 365
Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro Phe Leu Thr Ala Leu
370 375 380
Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr
385 390 395 400
Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe
405 410 415
Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu
420 425 430
Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu
435 440 445
Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp Phe
450 455 460
Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe
465 470 475 480
Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp
485 490 495
Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu
500 505 510
Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu
515 520 525
Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly
530 535 540
Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys Asp Pro Lys
545 550 555 560
Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Met Gln His
565 570 575
Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val Tyr Glu Lys Lys Leu
580 585 590
Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr
595 600 605
Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp
610 615 620
Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg Pro His Phe
625 630 635 640
Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala
645 650
<210> 49
<211> 630
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70 mutated to be non-functional and fused to an Akt kinase
domain
<400> 49
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Lys Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu
275 280 285
Ala Lys Pro Lys His Arg Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys
305 310 315 320
Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile
325 330 335
Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu
340 345 350
Gln Asn Ser Arg His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln
355 360 365
Thr His Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu
370 375 380
Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala
385 390 395 400
Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser
405 410 415
Glu Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu
420 425 430
Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu
435 440 445
Gly Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu
450 455 460
Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val
465 470 475 480
Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg
485 490 495
Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu
500 505 510
Met Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser
515 520 525
Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly
530 535 540
Gly Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly
545 550 555 560
Ile Val Trp Gln His Val Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys
565 570 575
Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe
580 585 590
Thr Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met
595 600 605
Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr
610 615 620
Ser Ala Ser Gly Thr Ala
625 630
<210> 50
<211> 590
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kinase containing domain of JAK2
<400> 50
Arg Asn Glu Asp Leu Ile Phe Asn Glu Ser Leu Gly Gln Gly Thr Phe
1 5 10 15
Thr Lys Ile Phe Lys Gly Val Arg Arg Glu Val Gly Asp Tyr Gly Gln
20 25 30
Leu His Glu Thr Glu Val Leu Leu Lys Val Leu Asp Lys Ala His Arg
35 40 45
Asn Tyr Ser Glu Ser Phe Phe Glu Ala Ala Ser Met Met Ser Lys Leu
50 55 60
Ser His Lys His Leu Val Leu Asn Tyr Gly Val Cys Val Cys Gly Asp
65 70 75 80
Glu Asn Ile Leu Val Gln Glu Phe Val Lys Phe Gly Ser Leu Asp Thr
85 90 95
Tyr Leu Lys Lys Asn Lys Asn Cys Ile Asn Ile Leu Trp Lys Leu Glu
100 105 110
Val Ala Lys Gln Leu Ala Trp Ala Met His Phe Leu Glu Glu Asn Thr
115 120 125
Leu Ile His Gly Asn Val Cys Ala Lys Asn Ile Leu Leu Ile Arg Glu
130 135 140
Glu Asp Arg Lys Thr Gly Asn Pro Pro Phe Ile Lys Leu Ser Asp Pro
145 150 155 160
Gly Ile Ser Ile Thr Val Leu Pro Lys Asp Ile Leu Gln Glu Arg Ile
165 170 175
Pro Trp Val Pro Pro Glu Cys Ile Glu Asn Pro Lys Asn Leu Asn Leu
180 185 190
Ala Thr Asp Lys Trp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Trp Glu Ile Cys Ser
195 200 205
Gly Gly Asp Lys Pro Leu Ser Ala Leu Asp Ser Gln Arg Lys Leu Gln
210 215 220
Phe Tyr Glu Asp Arg His Gln Leu Pro Ala Pro Lys Trp Ala Glu Leu
225 230 235 240
Ala Asn Leu Ile Asn Asn Cys Met Asp Tyr Glu Pro Asp Phe Arg Pro
245 250 255
Ser Phe Arg Ala Ile Ile Arg Asp Leu Asn Ser Leu Phe Thr Pro Asp
260 265 270
Tyr Glu Leu Leu Thr Glu Asn Asp Met Leu Pro Asn Met Arg Ile Gly
275 280 285
Ala Leu Gly Phe Ser Gly Ala Phe Glu Asp Arg Asp Pro Thr Gln Phe
290 295 300
Glu Glu Arg His Leu Lys Phe Leu Gln Gln Leu Gly Lys Gly Asn Phe
305 310 315 320
Gly Ser Val Glu Met Cys Arg Tyr Asp Pro Leu Gln Asp Asn Thr Gly
325 330 335
Glu Val Val Ala Val Lys Lys Leu Gln His Ser Thr Glu Glu His Leu
340 345 350
Arg Asp Phe Glu Arg Glu Ile Glu Ile Leu Lys Ser Leu Gln His Asp
355 360 365
Asn Ile Val Lys Tyr Lys Gly Val Cys Tyr Ser Ala Gly Arg Arg Asn
370 375 380
Leu Lys Leu Ile Met Glu Tyr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Arg Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Gln Lys His Lys Glu Arg Ile Asp His Ile Lys Leu Leu Gln Tyr
405 410 415
Thr Ser Gln Ile Cys Lys Gly Met Glu Tyr Leu Gly Thr Lys Arg Tyr
420 425 430
Ile His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Ile Leu Val Glu Asn Glu Asn
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Tyr Ala Pro Glu Ser Leu Thr Glu Ser Lys Phe Ser Val Ala Ser Asp
485 490 495
Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Phe Thr Tyr Ile Glu
500 505 510
Lys Ser Lys Ser Pro Pro Ala Glu Phe Met Arg Met Ile Gly Asn Asp
515 520 525
Lys Gln Gly Gln Met Ile Val Phe His Leu Ile Glu Leu Leu Lys Asn
530 535 540
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545 550 555 560
Ile Met Thr Glu Cys Trp Asn Asn Asn Val Asn Gln Arg Pro Ser Phe
565 570 575
Arg Asp Leu Ala Leu Arg Val Asp Gln Ile Arg Asp Asn Met
580 585 590
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> consensus Tobacco Etch Virus (TEV) cleavage site
<400> 51
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 52
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TeV protease domain
<400> 52
Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser Thr Ile
1 5 10 15
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20 25 30
Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg
35 40 45
Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val
50 55 60
Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg Asp Met
65 70 75 80
Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln Lys Leu
85 90 95
Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val Thr Thr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Glu Leu Val Tyr Ser Gln
225 230 235 240
<210> 53
<211> 541
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZAP70-SH2 domain fused to a TEV protease sequence
<400> 53
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
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195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Phe
290 295 300
Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser Thr Ile Cys His Leu
305 310 315 320
Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu Tyr Gly Ile Gly Phe
325 330 335
Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly
340 345 350
Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val Lys Asn Thr
355 360 365
Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg Asp Met Ile Ile Ile
370 375 380
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385 390 395 400
Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val Thr Thr Asn Phe Gln
405 410 415
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420 425 430
Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile Gln Thr Lys Asp Gly
435 440 445
Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp Gly Phe Ile Val Gly
450 455 460
Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn Asn Tyr Phe Thr Ser
465 470 475 480
Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn Gln Glu Ala Gln Gln
485 490 495
Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser Val Leu Trp Gly Gly
500 505 510
His Lys Val Phe Met Ser Lys Pro Glu Glu Pro Phe Gln Pro Val Lys
515 520 525
Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Glu Leu Val Tyr Ser Gln
530 535 540
<210> 54
<211> 460
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTPN6-SH2 domain fused to a TEV protease sequence
<400> 54
Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser
20 25 30
Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln
35 40 45
Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu
85 90 95
Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His
100 105 110
Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly
115 120 125
Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp
130 135 140
Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser
145 150 155 160
Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu
180 185 190
His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr
195 200 205
Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Phe Lys
210 215 220
Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser Thr Ile Cys His Leu Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu Tyr Gly Ile Gly Phe Gly
245 250 255
Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Thr
260 265 270
Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val Lys Asn Thr Thr
275 280 285
Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg Asp Met Ile Ile Ile Arg
290 295 300
Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln Lys Leu Lys Phe Arg Glu
305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val Thr Thr Asn Phe Gln Thr
325 330 335
Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr Ser Cys Thr Phe Pro Ser
340 345 350
Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile Gln Thr Lys Asp Gly Gln
355 360 365
Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile
370 375 380
His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn Asn Tyr Phe Thr Ser Val
385 390 395 400
Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn Gln Glu Ala Gln Gln Trp
405 410 415
Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser Val Leu Trp Gly Gly His
420 425 430
Lys Val Phe Met Ser Lys Pro Glu Glu Pro Phe Gln Pro Val Lys Glu
435 440 445
Ala Thr Gln Leu Met Asn Glu Leu Val Tyr Ser Gln
450 455 460
<210> 55
<211> 438
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> membrane tethered transcription factor
<400> 55
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser
35 40 45
Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro
65 70 75 80
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
85 90 95
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
100 105 110
Asp Phe Ala Cys Asp Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly
115 120 125
Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg
130 135 140
His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ala Gln Ile Lys Arg Val Val
145 150 155 160
Ser Glu Lys Lys Thr Ala Gln Ala Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys
165 170 175
Ser Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Met
180 185 190
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly
195 200 205
Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp
210 215 220
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro
225 230 235 240
Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp
245 250 255
Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile
260 265 270
Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Met Gln Ile Leu Val Ala
275 280 285
Ser Asp Ala Thr Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp
290 295 300
Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys
305 310 315 320
Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr
325 330 335
Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg
340 345 350
Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp
355 360 365
Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu
370 375 380
Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr
385 390 395 400
Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln
405 410 415
His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly
420 425 430
Gln Arg Gln Leu Thr Val
435
<210> 56
<211> 438
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> target receptor
<400> 56
Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp
35 40 45
Ile Tyr Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Lys
100 105 110
Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
165 170 175
Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly Ser
195 200 205
Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly Gly
245 250 255
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Met
260 265 270
Asp Pro Ala Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val
275 280 285
His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro
290 295 300
Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp
325 330 335
Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala
340 345 350
Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val
355 360 365
Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr
385 390 395 400
Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly
405 410 415
Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly
420 425 430
His Cys Ser Trp Pro Leu
435
<210> 57
<211> 509
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> receptor containing a CAR against CD19 with a cleavable CD3-zeta
endodomain
<400> 57
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly
165 170 175
Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr
195 200 205
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala
245 250 255
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp
305 310 315 320
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
325 330 335
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg
340 345 350
Gln Ala Glu Arg Met Ala Gln Ile Lys Arg Val Val Ser Glu Lys Lys
355 360 365
Thr Ala Gln Ala Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Met Arg Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 58
<211> 827
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> receptor containing a CAR against CD19 with a CD3-zeta endodomain
and a cleavable CD148 endodomain
<400> 58
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly
165 170 175
Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr
195 200 205
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala
245 250 255
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Pro
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp
305 310 315 320
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
325 330 335
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
370 375 380
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
420 425 430
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
435 440 445
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
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Met Ala Val Phe Gly Cys Ile Phe Gly Ala Leu Val Ile Val Thr Val
465 470 475 480
Gly Gly Phe Ile Phe Trp Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ala Lys Asn Asn
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Cys Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser
530 535 540
Gln Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg
545 550 555 560
Tyr Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile Ser Arg Val Lys Leu Ser Val
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Gln Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly
580 585 590
Tyr His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn
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Thr Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala
610 615 620
Ile Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu
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Glu Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln Asp Tyr Gly Asp Ile Thr Val
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Ala Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe
660 665 670
Thr Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu Ser His Pro Leu Arg Gln Phe
675 680 685
His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu
690 695 700
Leu Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro
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Val Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2a self-cleaving peptide
<400> 60
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1 5 10 15
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20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dual SH2 domains from SHP-2 fused to ZAP70 kinase domain
<400> 61
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115 120 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 6
<212> PRT
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<220>
<223> ITIM conserved sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa may be Ser, Ile, Val or Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa may be Ile, Val or Leu
<400> 63
Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa
1 5
Claims (24)
- 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 C1-고정 세균으로서, 상기 세균은 다음중 적어도 하나를 포함하는, 세균:
a. 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40),
b. 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2),
c. 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21), 및
d. 파괴성 돌연변이가 포함된 프레페네이트 합성효소 (EC 5.4.99.5). - 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 가스 기질의 발효에 의해, 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 클로스트리듐(Clostridium) 세균인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소는 ubiC인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 이소코리스메이트 합성효소는 pchA인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소는 pchB인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 프레페네이트 합성효소는 pheA인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 파괴성 돌연변이는 프레페네이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하는, 세균.
- 청구항 7에 있어서, 상기 세균은 모계 세균과 비교하였을 때, 감소된 양의 프레페네이트 또는 프레페네이트-유도된 산물들을 만드는, 세균.
- 청구항 7에 있어서, 상기 세균은 실질적으로 티로신 또는 페닐알라닌을 만들지 않는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 다음중 적어도 하나를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 세균:
a. 상기 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소,
b. 상기 외생성 이소코리스메이트 합성효소,
c. 상기 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 및
d. 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소. - 청구항 10에 있어서, 상기 핵산은 클로스트리듐(Clostridium)에서 발현을 위하여 코돈 최적화된, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 OH 기 및/또는 하나 또는 그 이상의 NH2 기로 추가 치환된, 6-원자의 탄소 환을 포함하는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트, 4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 그리고 이의 염 및 이온으로 구성된 집단에서 선택되는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 코리스메이트 피루베이트 분해효소, ubiC를 발현시키고, 그리고 파라-히드록시벤조산의 코리스메이트-유도된 산물을 만드는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 이소코리스메이트 합성효소, pchA 및 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, pchB를 발현시키고, 그리고 살리실레이트의 코리스메이트-유도된 산물을 만드는, 세균.
- 청구항 14 및 청구항 15 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 세균은 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 더 발현시키는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 포함하며, 그리고 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트또는 4-히드록시시클로헥산 카르복실산의 코리스메이트-유도된 산물을 만드는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 모계 세균에 의해 만들어지지 않은 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만드는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 모계 세균에 의해 생산되는 양보다 더 많은 양으로 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만드는, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다레이 (Clostridium ljungdahlii ), 그리고 클로스트리듐 라가스다레이(Clostridium ragsdalei)로 구성된 모계 세균으로부터 유도된, 세균.
- 청구항 20에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum)은 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum ) DSM23693인, 세균.
- 청구항 1에 있어서, 상기 가스 기질은 CO, CO2, 그리고 H2중 적어도 하나를 포함하는, 세균.
- 발효 산물을 만드는 방법으로서,
발효 산물을 만들기 위하여 가스 기질 존재하에 청구항 1에 따른 세균을 발효시키는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 23항에 있어서, 상기 가스 기질은 CO, CO2, 그리고 H2중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
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