EA036334B1 - Генетически модифицированная бактерия clostridium для получения салицилата из хоризмата - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены генетически сконструированный микроорганизм и способ получения салицилата из хоризмата. Указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одно из следующего: (a) нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризматсинтазу, и (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризмат-пируват-лиазу.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным микроорганизмам и способам получения происходящих из хоризмата продуктов путем микробиологической ферментации, в частности путем микробиологической ферментации газообразного субстрата.

Уровень техники

Современные химические продукты, которые получают биологическим путем с применением либо продовольственных, либо непродовольственных сельскохозяйственных культур с получением сырьевых материалов на основе сахаров или целлюлозы, отличаются недостатками, связанными с землепользованием, продовольственной безопасностью, нестабильностью поставок и экологическими проблемами.

Уже долгое время известно, что каталитические процессы можно применять для преобразования газов, содержащих монооксид углерода (СО) и/или диоксид углерода (СО₂) и водород (Н₂), в различные виды топлива и химические вещества. Однако для биологического преобразования таких газов в топливо и химические вещества можно также применять микроорганизмы. Биологические процессы отличаются рядом преимуществ относительно каталитических процессов, в том числе более высокой специфичностью, более высоким выходом, меньшими затратами энергии и большей устойчивостью к отравлению катализатора.

СО представляет собой основной богатый свободной энергией побочный продукт неполного сгорания органических материалов, таких как уголь или нефть, и происходящих из нефти продуктов. Например, сталеобрабатывающая промышленность в Австралии, по имеющимся сведениям, производит и выбрасывает в атмосферу свыше 500000 т СО ежегодно.

Способность микроорганизмов расти, потребляя СО в качестве единственного источника углерода, впервые была обнаружена в 1903 г. Позже было определено, что указанная способность присуща микроорганизмам, использующим для аутотрофного роста биохимический путь ацетилкофермента А (ацетилКоА), также известный как путь Вуда-Льюнгдаля. Значительное число анаэробных микроорганизмов, в том числе карбоксидотрофных, фотосинтезирующих, метаногенных и ацетогенных, как было показано, метаболизируют СО с образованием различных конечных продуктов, а именно СО₂, H₂, метана, нбутанола, ацетата и этанола.

Ароматическое соединение парагидроксибензойная кислота (рНВА) представляет собой основной мономер, применяемый в жидкокристаллических полимерах, а также в качестве предшественника для получения парагидроксибензоатов или сложных эфиров парагидроксибензойной кислоты, обычно называемых парабенами. Жидкокристаллические полимеры включают кевлар и вектран, которые находят разное применение. Парабены и их соли применяют в ряде отраслей, включая косметическую, фармацевтическую и пищевую промышленность. Они представляют собой эффективные консерванты и ввиду бактерицидных и фунгицидных свойств могут применяться в косметических и пищевых составах.

Соответственно сохраняется потребность в дополнительных микроорганизмах и способах получения рНВА и других высокоценных происходящих из хоризмата продуктов.

Краткое описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложен генетически сконструированный (генно-инженерномодифицированный) микроорганизм, способный продуцировать происходящие из хоризмата продукты. В частности, согласно настоящему изобретению предложен генетически сконструированный микроорганизм, способный продуцировать по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт, при этом бактерия содержит по меньшей мере что-либо одно из (а) экзогенной хоризмат-пируват-лиазы (ЕС 41340), (b) экзогенной изохоризматсинтазы (ЕС 5442), (с) экзогенной изохоризмат-пируват-лиазы (ЕС 429921) и (d) префенатсинтазы (ЕС 54995), содержащей нарушающую экспрессию мутацию. Согласно конкретным вариантам реализации указанный генетически сконструированный микроорганизм представляет собой C'1-усваивающую бактерию, такую как бактерия Clostridium, способную продуцировать по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт путем ферментации C'1-содержащего газообразного субстрата.

Например, хоризмат-пируват-лиаза может представлять собой ubiC, изохоризматсинтаза может представлять собой pchA, изохоризмат-пируват-лиаза может представлять собой pchB, а префенатсинтаза может представлять собой pheA. Нарушающая экспрессию мутация префенатсинтазы может понижать или полностью устранять экспрессию или активность префенатсинтазы. Такая нарушающая экспрессию мутация может приводить к образованию бактерии, которая продуцирует пониженное количество префената или происходящих из префената продуктов по сравнению с исходной бактерией, и/или бактерии, которая, по существу, не продуцирует тирозин или фенилаланин.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере что-либо одно из (а) экзогенной хоризмат-пируватлиазы, (b) экзогенной изохоризматсинтазы, (с) экзогенной изохоризмат-пируват-лиазы и (d) префенат- 1 036334 синтазы, содержащей нарушающую экспрессию мутацию. Согласно некоторым вариантам реализации указанную нуклеиновую кислоту кодон-оптимизируют для экспрессии в Clostridium.

Происходящий из хоризмата продукт может представлять собой любой продукт, продуцируемый прямым или непрямым образом из хоризмата. В частности, происходящий из хоризмата продукт может содержать 6-членное углеродное кольцо, например бензеновое или циклогексановое кольцо, замещенное карбоксильной группой или карбоксилатным анионом, и дополнительно замещенное по меньшей мере одной ОН-группой и/или по меньшей мере одной МН₂-группой. Происходящие из хоризмата продукты включают, не ограничиваясь перечисленными, парагидроксибензойную кислоту, салицилат, 2аминобензоат, дигидроксибензоат и 4-гидроксициклогексанкарбоновую кислоту.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению экспрессирует хоризмат-пируват-лиазу ubiC и продуцирует происходящий из хоризмата продукт, парагидроксибензойную кислоту. Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению дополнительно экспрессирует нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФсинтазу.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению экспрессирует изохоризматсинтазу pchA и изохоризмат-пируват-лиазу pchB и продуцирует происходящий из хоризмата продукт, салицилат. Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению дополнительно экспрессирует нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению включает префенатсинтазу, содержащую нарушающую экспрессию мутацию, и продуцирует один или более происходящих из хоризмата продуктов, 2-аминобензоат, 2,3-дигидроксибензоат, 3,4-дигидроксибензоат и 4гидроксициклогексанкарбоновую кислоту.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению продуцирует по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт, который не продуцирует исходный микроорганизм или продуцирует большее количество по меньшей мере одного происходящего из хоризмата продукта, чем исходный микроорганизм.

Согласно одному варианту реализации бактерия согласно настоящему изобретению происходит из С1-усваивающей исходной бактерии. Согласно предпочтительному варианту реализации бактерия согласно настоящему изобретению происходит из исходной бактерии, выбранной из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Согласно конкретному предпочтительному варианту реализации бактерия согласно настоящему изобретению происходит из исходной бактерии Clostridium autoethanogenum, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM23693.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта ферментации, включающий ферментирование микроорганизма согласно настоящему изобретению в присутствии C1содержащего газообразного субстрата. Обычно продукт ферментации представляет собой происходящий из хоризмата продукт. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный газообразный субстрат содержит по меньшей мере один источник С1-углерода.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведена схема, отражающая продуцирование хоризмата природным шикиматным путем у Clostridia.

На фиг. 2 приведена схема, отражающая путь продуцирования рНВА у генетически сконструированной бактерии Clostridium.

На фиг. 3 приведена схема, отражающая путь продуцирования салицилата у генетически сконструированной бактерии Clostridium.

На фиг. 4 приведена схема, отражающая путь продуцирования ароматических продуктов у генетически сконструированной бактерии Clostridium, содержащей нарушающую экспрессию мутацию в нуклеиновой кислоте, кодирующей pheA.

На фиг. 5 приведен график стандартной кривой для количественного определения с использованием аутентичных стандартов рНВА.

На фиг. 6а приведен график, отражающий общее количество ионов аутентичных стандартов (i) аутентичный стандарт рНВА (триметилсилилированной) в супернатанте культуральной среды С. autoethanogenum LZ1561, (ii) аутентичный стандарт рНВА (триметилсилилированной) в воде и (iii) масс-спектр триметилсилилированной рНВА.

На фиг. 6b приведен график, отражающий регистрацию выбранных ионов для ферментированных образцов и стандартов: (i) С. autoethanogenum, LZ1561 без плазмиды pARO_01, (ii) и (iii) образцы С. autoethanogenum LZ1561, несущей плазмиду pARO_01, (iv) аутентичный стандарт рНВА и (v) сравнение общего количества ионов для рНВА в базе данных NIST и пика рНВА для LZ1561/pARO_01.

На фиг. 7 приведена схема плазмиды pARO_01. Хоризмат-пируват-лиаза (ubiC) и нечувствительная к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтаза (aroG*) находятся под контролем промотора пути Вуда-Льюнгдаля (Pwl). Также показаны другие характеристики челночного вектора.

На фиг. 8 приведен график, отражающий накопление биомассы в тестируемых штаммах. Биомассу

- 2 036334 оценивали по изменению поглощения в образцах культур при 600 нм в разные моменты времени. Точки данных соответствуют среднему для культур в n=3 повторностях ±1 стандартное отклонение. LZ1561 относится к ^трансформированной С. autoethanogenum LZ1561. pARO_01(l) и pARO_01(2) - биологические репликаты С. autoethanogenum LZ1561, трансформированной плазмидой pARO_01.

На фиг. 9а и 9b приведены графики, отражающие накопление п-гидроксибензоата в тестируемых штаммах. На фиг. 9а представлено количественное определение рНВА, детектированной в каждом образце в моменты времени 24, 96, 144 и 192 ч. Из культур в трех повторностях получали образцы для определения штамма отрицательного контроля (С. autoethanogenum LZ1561) и С. autoethanogenum LZ1561, несущей pARO_01, два биологических репликата. На фиг. 9b приведено среднее для n=3 технических повторностей ±1 SD.

На фиг. 10 приведен график, отражающий продуцирование новых ароматических соединений генетически сконструированной бактерией Clostridium, содержащей нарушающую экспрессию мутацию в нуклеиновой кислоте, кодирующей pheA. Штамм ΔpheA продуцирует 4гидроксициклогексанкарбоновую кислоту, 2-аминобензойную кислоту и 3,4-дигидроксибензойную кислоту, тогда как контрольный штамм (LZ1561) не продуцирует указанных кислот.

На фиг. 11а приведен график, отражающий прирост биомассы продуцирующего салицилат штамма с индукцией и без индукции пути биосинтеза салицилата.

На фиг. 11b приведен график, отражающий различия в накоплении салицилата в жидких культурах тестируемого штамма с индукцией и без индукции пути биосинтеза салицилата.

На фиг. 12 приведен график, отражающий концентрацию 4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 2-аминобензойной кислоты и 3,4-дигидроксибензойной кислоты, полученных путем ферментации сконструированной бактерии Clostridium, содержащей нарушающую экспрессию мутацию в нуклеиновой кислоте, кодирующей pheA.

На фиг. 13 приведена таблица, где указаны примеры источников хоризмат-пируват-лиазы (ЕС 41340).

На фиг. 14 приведена таблица, где указаны примеры источников изохоризматсинтазы (ЕС 5442).

На фиг. 15 приведена таблица, где указаны примеры источников изохоризмат-пируват-лиазы (ЕС 429921).

Подробное описание изобретения

Clostridia естественным образом продуцируют хоризмат, который служит в качестве предшественника ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина, продуцируемых из фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата через шикиматный путь (фиг. 1). Указанный путь подробно описан в источнике Bentley, Crit Rev Biochem Mol Biol, 25,5 307-384, 1990. Согласно настоящему изобретению предложена генетически сконструированная бактерия, способная продуцировать по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт путем ферментации газообразного субстрата.

Авторы настоящего изобретения продемонстрировали возможность устойчивого получения и выделения из источника С1-углерода происходящих из хоризмата продуктов. Согласно настоящему изобретению предложен способ получения по меньшей мере одного происходящего из хоризмата продукта с использованием С1-содержащего газообразного субстрата в качестве главного источника углерода и энергии. Таким образом, согласно настоящему изобретению обеспечивается ряд преимуществ по сравнению с процессами, задействующими субстраты на основе сахара или целлюлозы. Так субстраты на основе сахара или целлюлозы, как правило, также подходят для пищевого применения (как, например, сахарный тростник), и связанное с ними интенсивное землепользование имеет отрицательные экологические последствия. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен альтернативный способ получения происходящих из хоризмата продуктов, необязательно посредством использования газообразных отходов (например, СО, образующегося в ходе промышленных процессов). Соответственно согласно настоящему изобретению предложен источник получения прибыли из газообразных отходов и, кроме того, захват углерода из указанных газообразных отходов со снижением выброса диоксида углерода, имеющего место при сгорании указанных газов в атмосфере.

Гетеротрофные микроорганизмы, такие как Е. coli и S. cerevisiae, продуцируют относительно высокие уровни АТФ путем гликолиза. Напротив, микроорганизмы, использующие источники С1-углерода (например, СО или СО₂), отличаются низкой доступностью АТФ. Например, при анализе реакционной кинетики типичного карбоксидотрофного микроорганизма С. autoethanogenum расчетный выход АТФ при продуцировании рНВА, происходящего из хоризмата продукта, составляет -0,4 АТФ на моль фиксируемого СО. Соответственно ввиду энергетических ограничений продуцирование какого-либо количества рНВА маловероятно. Аналогичным образом, маловероятно, что карбоксидотрофный микроорганизм будет продуцировать другие происходящие из хоризмата продукты ввиду метаболической нагрузки при продуцировании таких соединений в аутотрофных условиях. Тем не менее, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что неожиданным образом из газообразного субстрата может быть получен ряд происходящих из хоризмата продуктов. Кроме того, указанные продукты могут быть получены из газообразных промышленных отходов, что обеспечивает практические, экономические и экологические

- 3 036334 преимущества относительно применения других субстратов.

В частности, согласно настоящему изобретению предложены генетически сконструированные микроорганизмы, способные продуцировать по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт за счет введения по меньшей мере чего-либо одного из (а) нуклеиновой кислоты, кодирующей экзогенную хоризмат-пируват-лиазу, (b) нуклеиновой кислоты, кодирующей экзогенную изохоризматсинтазу (также известную как изохоризматмутаза), (с) нуклеиновой кислоты, кодирующей экзогенную изохоризматпируват-лиазу, и (d) нуклеиновой кислоты, кодирующей префенатсинтазу, содержащую нарушающую экспрессию мутацию. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный генетически сконструированный микроорганизм представляет собой С1-фиксирующую бактерию, способную продуцировать по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт путем ферментации газообразного субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанная С1-фиксирующая бактерия представляет собой бактерию Clostridium.

Термины происходящий из хоризмата продукт, или продукт, происходящий из хоризмата, или аналогичные термины охватывают продукты, продуцируемые прямым или непрямым образом из хоризмата (или хоризмовой кислоты). Происходящие из хоризмата продукты, как правило, содержат 6членное углеродное кольцо, например бензеновое или циклогексановое кольцо, замещенное карбоксильной группой или карбоксилатным анионом и дополнительно замещенное одной или более ОН-групп и/или одной или более МН₂-групп. В частности, происходящие из хоризмата продукты включают, не ограничиваясь перечисленными, парагидроксибензойную кислоту, салицилат, 2-аминобензоат, 2,3дигидроксибензоат, 3,4-дигидроксибензоат и 4-гидроксициклогексанкарбоновую кислоту.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать экзогенный фермент хоризмат-пируват-лиазу (ЕС 41340), которая катализирует конверсию хоризмата в парагидроксибензойную кислоту и пируват на первом обязательном этапе биосинтеза убихинона. Указанный фермент может происходить из любого микроорганизма, у которого имеется такой фермент. Указанный фермент может представлять собой фермент UbiC. Фермент UbiC может происходить из Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundu или любого другого микроорганизма, у которого имеется фермент UbiC. Согласно одному варианту реализации указанный фермент UbiC происходит из Escherichia coli и содержит SEQ ID NO 1 или ее функционально эквивалентный вариант.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную хоризмат-пируват-лиазу. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ген хоризмат-пируват-лиазы, происходящий из любого микроорганизма, у которого имеется такой ген. Указанный ген хоризмат-пируват-лиазы может представлять собой ген ubiC. Указанный ген ubiC может происходить из Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundu или любого другого микроорганизма, у которого имеется ген ubiC. Согласно одному варианту реализации указанный ген ubiC происходит из Escherichia coli и содержит SEQ ID NO 2 или ее кодоноптимизированный или функционально эквивалентный вариант.

Фермент UbiC или ген ubiC может также быть модифицирован (например, мутирован) для повышения растворимости, стабильности или других свойств гена/фермента. Такие модификации могут приводить к увеличению титра продукта. В примере 4 описан экспериментальный протокол для конструирования фермента UbiC для уменьшения ингибирования продукта за счет удержания парагидроксибензойной кислоты. Одна конкретная модификация включает конструирование гена ubiC для экспрессии фермента UbiC с двумя поверхностно-активными серинами вместо цистеинов. Остатки серин обеспечивают менее выраженную агрегацию белков и, следовательно, улучшение растворимости. Соответственно согласно конкретному варианту реализации фермент UbiC содержит мутацию, обеспечивающую замену по меньшей мере одного поверхностно-активного цистеина на серин.

Согласно альтернативным вариантам реализации указанная хоризмат-пируват-лиаза (ЕС 41340) может быть получена или может происходить, например, из любых источников, идентифицированных на фиг. 13.

Введение экзогенной хоризмат-пируват-лиазы (например, ubiC) или нуклеиновой кислоты, кодирующей экзогенную хоризмат-пируват-лиазу (например, ubiC), приводит к продуцированию микроорганизмом согласно настоящему изобретению парагидроксибензойной кислоты - происходящего из хоризмата продукта. Продуцирование парагидроксибензойной кислоты иллюстрирует фиг. 2. С1фиксирующие бактерии, включающие виды Acetobacterium woodu, Alkalibaculum bacchu, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatu, Clostridium draket, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalet, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigu, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides и Thermoanaerobacter kivut, естественным образом не продуцируют парагидроксибензойную кислоту. Фактически, поскольку убихинон обычно продуцируют только аэробно дышащие микроорганизмы, хоризмат-пируват-лиаза, как правило, отсутствует у карбоксидотрофных микроорганизмов. Хотя можно ожидать, что перенаправление хоризмата на продуцирование рНВА вместо аминокислот будет оказывать вредные эффекты на рост или выживание микроорганизма, авторы на- 4 036334 стоящего изобретения показали, что воздействие на микроорганизм не достигает степени, значимо ухудшающей выживание и рост в стандартных условиях.

Парагидроксибензойная кислота может называться также, например, рНВА, 4-гидроксибензойной кислотой, п-гидроксибензойной кислотой или парагидроксибензоатом. В настоящем документе любыми из указанных терминов охвачена указанная молекула как в форме кислоты, так и в форме аниона ^Η0-·_Γ° пара-гидроксибензойная кислота

Μ

ОН

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать экзогенный фермент изохоризматсинтазу, также называемую изохоризматмутазой (ЕС 5442), которая катализирует конверсию хоризмата в изохоризмат. Указанный фермент может происходить из любого микроорганизма, у которого имеется такой фермент. Указанный фермент может представлять собой фермент PchA. Указанный фермент PchA может происходить из Pseudomonas aeruginosa или любого другого микроорганизма, у которого имеется фермент PchA. Согласно одному варианту реализации указанный PchA фермент происходит из Pseudomonas aeruginosa и содержит SEQ ID NO 3 или ее функционально эквивалентный вариант.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризматсинтазу. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ген изохоризматсинтазы, происходящий из любого микроорганизма, у которого имеется такой ген. Указанный ген изохоризматсинтазы может представлять собой ген pchA. Указанный ген pchA может происходить из Pseudomonas aeruginosa или любого другого микроорганизма, у которого имеется ген pchA. Согласно одному варианту реализации указанный ген pchA происходит из Pseudomonas aeruginosa и содержит SEQ ID NO 4 или ее кодон-оптимизированный или функционально эквивалентный вариант.

Согласно альтернативным вариантам реализации изохоризматсинтаза (ЕС 5442) может быть получена или может происходить, например, из любых источников, идентифицированных на фиг. 14.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать экзогенный фермент изохоризмат-пируват-лиазу (ЕС 429921), которая катализирует конверсию изохоризмата в салицилат и пируват. Указанный фермент может происходить из любого микроорганизма, у которого имеется такой фермент. Указанный фермент может представлять собой фермент PchB. Указанный фермент PchB может происходить из Pseudomonas aeruginosa или любого другого микроорганизма, у которого имеется фермент PchB. Согласно одному варианту реализации указанный фермент PchB происходит из Pseudomonas aeruginosa и содержит SEQ ID NO 5 или ее функционально эквивалентный вариант.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризмат-пируват-лиазу. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ген изохоризмат-пируват-лиазы, происходящий из любого микроорганизма, у которого имеется такой ген. Указанный ген изохоризмат-пируват-лиазы может представлять собой ген pchB. Указанный ген pchB может происходить из Pseudomonas aeruginosa или любого другого микроорганизма, у которого имеется ген pchB. Согласно одному варианту реализации указанный ген pchB происходит из Pseudomonas aeruginosa и содержит SEQ ID NO 6 или ее кодон-оптимизированный или функционально эквивалентный вариант.

Согласно альтернативным вариантам реализации указанная изохоризмат-пируват-лиаза (ЕС 429921) может быть получена или может происходить, например, из любых источников, идентифицированных на фиг. 15.

Введение (1) экзогенной изохоризматсинтазы (например, pchA) и (2) экзогенной изохоризматпируват-лиазы (например, pchB) приводит к продуцированию салицилата, происходящего из хоризмата продукта, микроорганизмом согласно настоящему изобретению Продуцирование салицилата иллюстрирует фиг. 3, на которой видно, что изохоризматсинтаза преобразует хоризмат в изохоризмат, а затем изохоризмат-пируват-лиаза преобразует его в салицилат и пируват С1-фиксирующие бактерии, включающие виды Acetobacterium woodu, Alkalibaculum bacchu, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatu, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlu, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigu, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides и Thermoanaerobacter kivui, естественным образом не продуцируют салицилат.

Салицилат может также быть называться, например, 2-гидроксибензоатом, салициловой кислотой или 2-гидроксибензойной кислотой. В настоящем документе любыми из указанных терминов охвачена указанная молекула как в форме кислоты, так и в форме аниона

- 5 036334

(d) Префенатсинтаза, содержащая нарушающую экспрессию мутацию.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать фермент префенатсинтазу (ЕС 54995), содержащую нарушающую экспрессию мутацию. Префенатсинтаза, как правило, катализирует конверсию хоризмата в префенат (т.е. мутазную реакцию хоризмат*-* префенат). Соответственно фермент префенатсинтаза, содержащий нарушающую экспрессию мутацию, неспособен или обладает меньшей способностью катализировать конверсию хоризмата в префенат. Указанная префенатсинтаза, содержащая нарушающую экспрессию мутацию, может представлять собой pheA, содержащую нарушающую экспрессию мутацию. Указанная префенатсинтаза может также называться хоризматмутазой.

Согласно некоторым вариантам реализации указанный фермент pheA может представлять собой бифункциональный фермент, осуществляющий как префенатсинтазную (т.е. хоризматмутазную) (ЕС 54995), так и префенатдегидратазную (ЕС 42151) реакции. У микроорганизмов, у которых указанные две реакции осуществляют отдельные ферменты, нокаут активности ЕС 54995 приводит к значимому уменьшению или полному прекращению продуцирования префената или следующих за префенатом соединений, тогда как нокаут активности только ЕС 42151 не приводит к такому же фенотипу, поскольку префенат все же может продуцироваться. Согласно одному варианту реализации pheA происходит из Clostridium autoethanogenum и содержит SEQ ID NO 11 или ее функционально эквивалентный вариант.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую префенатсинтазу, содержащую нарушающую экспрессию мутацию. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ген pheA, содержащий нарушающую экспрессию мутацию. Согласно одному варианту реализации указанная нарушающая экспрессию мутация представляет собой нокаутную мутацию гена pheA. Согласно одному варианту реализации указанный ген pheA происходит из Clostridium autoethanogenum и содержит SEQ ID NO 10 или ее кодоноптимизированный или функционально эквивалентный вариант.

Разрушение префенатсинтазы приводит к снижению или полному прекращению продуцирования фенилаланина и тирозина. Неожиданным образом, разрушение префенатсинтазы также приводит к продуцированию дополнительных продуктов, которые, как правило, не продуцируются или продуцируются исключительно в очень незначительных количествах.

В частности, введение нарушающей экспрессию мутации в префенатсинтазу (например, pheA) или нуклеиновую кислоту, кодирующую префенатсинтазу (например, pheA) приводит к продуцированию чего-либо одного или более из 2-аминобензоата, дигидроксибензоата и 4гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, представляющих собой происходящие из хоризмата продукты, микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Пути продуцирования указанных продуктов иллюстрирует фиг. 4. Многие микроорганизмы, в том числе виды Clostridia, такие как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei, естественным образом не продуцируют указанные продукты или продуцируют их исключительно в очень незначительных количествах.

Приведены примеры источников pheA. Однако следует отметить, что могут быть доступны и другие подходящие источники pheA. Префенатдегидратаза может быть получена или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых являются общедоступны ми.

Описание	Микроорганизм	Номер доступа Genbank
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Acetobacterium woodn	Af A49374 1
Префенатдегидратаза	Blautia producta	WP 033143345 1
Префенатдегидратаза	Clostridium aceticum	WP 044823168 1
Префенатдегидратаза	Clostridium autoethanogenum	AGY75132 1
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Clostridium carboxidivorans	WP_007060905 1
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Clostridium coskat и	WP_063600678 1
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Clostridium drakei	WP-032076381 1
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Clostridium ljungdahlii	WP-063554005.1
префенатдегидратаза	Clostridium magnum	KZL89370.1
Бифункциональная хоризматмутаза/ префенатдегидратаза	Clostridium scatologenes	WP_029159263.1
Хоризматмутаза	Eubacterium limosum	WP 058695931.1
Хоризматмутаза	Oxobacter pfennigii	WP 054874911.1
Префенатдегидратаза	Sporomusa ovata	EQB25731.1
Префенатдегидратаза	Thermoanaerobacter kivui	WP_049685038.1

- 6 036334

2-Аминобензоат может также называться, например, 2-аминобензойной кислотой, оаминобензойной кислотой, антраниловой кислотой, антранилатом или витамином L1. В настоящем документе любыми из указанных терминов охвачена указанная молекула как в форме кислоты, так и в форме аниона

2-аминобензоат

2-аминобензойная кислота

Дигидроксибензоат может называться, например, 2,3-дигидроксибензоатом, 2,3дигидроксибензойной кислотой, 3,4-дигидроксибензоатом, 3,4-дигидроксибензойной кислотой или протокатеховой кислотой. В настоящем документе любыми из указанных терминов охвачена указанная молекула как в форме кислоты, так и в форме аниона

2,3-дигидроксибензоат

4-Гидроксициклогексанкарбоновая кислота может также называться, например, цис-4гидроксициклогексанкарбоновой кислотой или 4-гидроксициклогексан-1-карбоксилатом. В настоящем документе любыми из указанных терминов охвачена указанная молекула как в форме кислоты, так и в форме аниона “θ'-γί⁰ 4-гидроксициклогексанкарбоновая кислота ок °^·° 4-гидроксициклогексанкарбоксилат

Согласно другому варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу. ДАГФ-синтаза катализирует первый обязательный этап шикиматного пути (фиг. 1), в ходе которого эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват преобразуются в 3-дезокси-Оарабиногептозонат-7-фосфат. Авторы настоящего изобретения полагают, что на указанном этапе пути происходит ингибирование по типу обратной связи ароматическими аминокислотами (триптофаном, фенилаланином, тирозином) согласно описанному для Е. coli (Hu et al. J Basic Microbiol 2003, 43 399-406). Соответственно авторы настоящего изобретения на основании указанной информации, известной из уровня техники, разработали нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу, ко торая, предположительно, снижает риск снижения притока происходящих из хоризмата продуктов за счет указанного ингибирования по типу обратной связи. Нуклеиновые кислоты, кодирующие подходящие ДАГФ-синтазы, известны специалистам в данной области техники. При этом, например, кодирующая ДАГФ-синтазу нуклеиновая кислота может происходить из Escherichia coli, Clostridium beijerinckii или Saccharomyces cerevisiae. Согласно одному варианту реализации указанная ДАГФ-синтаза может представлять собой нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу Escherichia coli, имеющую последовательность нуклеиновых кислот, представленную в SEQ ID NO 7, и последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO 8. Указанная нечувствительная к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтаза может быть введена в тот же вектор, что и ген, кодирующий один из вышеуказанных ферментов, или в другой вектор. Указанная нечувствительная к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтаза может иметь собственный промотор или может располагаться за промотором одного из вышеуказанных ферментов в бицистронном порядке, при этом один промотор управляет транскрипцией одной мРНК, которая кодирует и указанный фермент, и указанную нечувствительную к

- 7 036334 регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению включает экзогенный фермент хоризмат-пируват-лиазу (ЕС 41340) и экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу. Согласно конкретным вариантам реализации указанный микроорганизм содержит экзогенный фермент UbiC и экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу. Согласно конкретному варианту реализации настоящее изобретение включает экзогенный ген ubiC, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO 1, и экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу, имеющую последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO 7. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм, содержащий и экзогенный фермент хоризмат-пируват-лиазу, и экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу, демонстрирует более высокие уровни продукции парагидроксибензойной кислоты по сравнению с микроорганизмом, не содержащим нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую и экзогенную хоризмат-пируват-лиазу, и нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению включает (i) экзогенную изохоризматмутазу, (ЕС 5442), (ii) фермент изохоризмат-пируват-лиазу (ЕС 429921) и (iii) экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу. Согласно конкретным вариантам реализации указанный микроорганизм содержит экзогенный фермент PchA, экзогенный фермент PchB и экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм, содержащий экзогенную нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу, демонстрирует более высокие уровни продукции салициловой кислоты по сравнению с микроорганизмом, не содержащим нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую и экзогенную хоризмат-пируват-лиазу и нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Согласно другому варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению не содержит нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу, а вместо этого содержит эндогенную ДАГФ-синтазу. В случае предполагаемого достаточно низкого уровня продуцирования или естественной концентрации ароматических аминокислот, не способного индуцировать ингибирование по типу обратной связи, нет необходимости вводить нечувствительную к регуляции по типу обратной связи ДАГФ-синтазу.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может продуцировать происходящие из хоризмата продукты в любой концентрации или в любом количестве. Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению продуцирует происходящие из хоризмата продукты в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 750 мг/л, 1, 1,5 или 2 г/л. Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению продуцирует по меньшей мере один происходящий из хоризмата продукт в концентрации, составляющей по меньшей мере 10, 50, 100, 500, 800 мг/л или 1 г/л.

Кроме того, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать продукты с определенной селективностью или с минимальной селективностью. Согласно одному варианту реализации происходящий из хоризмата целевой продукт составляет по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 30, 50 или 75% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанный происходящий из хоризмата целевой продукт составляет по меньшей мере 10% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, что микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении указанного происходящего из хоризмата целевого продукта, составляющей по меньшей мере 10%. Согласно другому варианту реализации указанный происходящий из хоризмата целевой продукт составляет по меньшей мере 30% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, что микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении указанного происходящего из хоризмата целевого продукта, составляющей по меньшей мере 30%.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта ферментации, в частности, происходящего из хоризмата продукта, включающий ферментирование микроорганизма согласно настоящему изобретению в присутствии газообразного субстрата.

Согласно настоящему изобретению также предложены происходящие из хоризмата продукты, получаемые путем ферментирования микроорганизма согласно настоящему изобретению в присутствии газообразного субстрата.

Определения и уровень техники.

- 8 036334

Термин генетическая модификация или генетическое конструирование в широком смысле относится к манипуляциям с геномом или нуклеиновыми кислотами микроорганизма. Способы генетической модификации включают, например, гетерологичную генную экспрессию, вставки или делеции генов или промоторов, мутацию нуклеиновой кислоты, измененную генную экспрессию или инактивацию, конструирование ферментов, направленную эволюцию, интеллектуальный дизайн, методы случайного мутагенеза, перестановку генов и кодон-оптимизацию.

Рекомбинантный показывает, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм представляет собой продукт генетической модификации, конструирования или рекомбинации. Обычно термин рекомбинантный относится к нуклеиновой кислоте, белку или микроорганизму, содержащей(ему) генетический материал или закодированной(ому) генетическим материалом, происходящим из нескольких источников, например двух или более разных штаммов или видов микроорганизмов. В настоящем документе термин рекомбинантный может также применяться для описания микроорганизма, который содержит мутированную нуклеиновую кислоту или мутированный белок, в том числе мутированную форму эндогенной нуклеиновой кислоты или эндогенного белка.

Эндогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которая(ый) присутствует или экспрессируется в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, эндогенный ген представляет собой ген, естественным образом присутствующий в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экспрессию эндогенного гена может контролировать экзогенный регуляторный элемент, такой как экзогенный промотор.

Экзогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который не присутствует в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экзогенный ген или фермент может происходить из гетерологичного (т.е. отличного) штамма или вида и быть введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Согласно другому варианту реализации экзогенный ген или фермент может быть искусственным или рекомбинантным способом создан и быть введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть адаптированы для интеграции в геном микроорганизма согласно настоящему изобретению или для сохранения экстрахромосомного статуса в микроорганизме согласно настоящему изобретению, например в плазмиде.

Активность фермента относится в широком смысле к ферментативной активности, в том числе, однако, не ограничиваясь указанным, к активности фермента, количеству фермента или доступности фермента для катализа реакции. Соответственно увеличение активности фермента включает увеличение активности фермента, увеличение количества фермента или увеличение доступности фермента для катализа реакции.

Мутированный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который был модифицирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению относительно микроорганизма дикого типа или исходного микроорганизма, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, вставку или замену в гене, кодирующем фермент. Согласно другому варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, вставку или замену одной или более аминокислот в ферменте.

В частности, нарушающая экспрессию (дизруптивная) мутация представляет собой мутацию, которая уменьшает или полностью прекращает (т.е. разрушает) экспрессию или активность гена или фермента. Нарушающая экспрессию мутация может частично инактивировать, полностью инактивировать или полностью удалять ген или фермент. Нарушающая экспрессию мутация может представлять собой нокаутную (KO) мутацию. Нарушающая экспрессию мутация может представлять собой любую мутацию, которая уменьшает, предотвращает или блокирует биосинтез продукта, продуцируемого ферментом. Нарушающая экспрессию мутация может включать, например, мутацию в гене, кодирующем фермент, мутацию в генетическом регуляторном элементе, вовлеченном в экспрессию гена, кодирующего фермент, введение нуклеиновой кислоты, которая продуцирует белок, который уменьшает или ингибирует активность фермента, или введение нуклеиновой кислоты (например, антисмысловой РНК, миРНК, коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)), или белка, который ингибирует экспрессию фермента. Нарушающая экспрессию мутация может быть введена с применением любого способа, известного в данной области техники.

Кодон-оптимизация относится к мутации нуклеиновой кислоты, такой как ген, для оптимизации или улучшения трансляции указанной нуклеиновой кислоты у конкретного штамма или вида. Кодоноптимизация может приводить к повышению скоростей трансляции или повышению точности трансляции. Согласно предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодоноптимизированы для экспрессии у Clostridium, в частности у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии у Clostridium au

- 9 036334 toethanogenum LZ1561, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM23693.

Избыточно экспрессируемый относится к увеличению экспрессии нуклеиновой кислоты или белка микроорганизмом согласно настоящему изобретению по сравнению с микроорганизмом дикого типа или исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Избыточная экспрессия может обеспечиваться с применением любых способов, известных в данной области техники, в том числе модификации числа копий гена, скорости генной транскрипции, скорости генной трансляции или скорости разложения фермента.

Термин варианты включает нуклеиновые кислоты и белки, последовательность которых отличается от последовательности референсных нуклеиновой кислоты и белка, например последовательности референсных нуклеиновой кислоты и белка, раскрытых в уровне техники или представленных в примерах, приведенных в настоящем документе. Практическая реализация настоящего изобретения может осуществляться с применением вариантов нуклеиновых кислот или белков, выполняющих, по существу, ту же функцию, что и референсная нуклеиновая кислота или референсный белок. Например, вариант белка может выполнять, по существу, ту же функцию или катализировать, по существу, ту же реакцию, что и референсный белок. Вариант гена может кодировать тот же или, по существу, тот же белок, что и референсный ген. Вариант промотора может обладать, по существу, такой же способностью содействовать экспрессии одного или более генов, что и референсный промотор.

Такие нуклеиновые кислоты или белки могут называться в настоящем документе функционально эквивалентными вариантами. Например, функционально эквивалентные варианты нуклеиновой кислоты могут включать аллельные варианты, фрагменты гена, мутированные гены, полиморфизмы и т.п. Гомологичные гены других микроорганизмов также являются примерами функционально эквивалентных вариантов. Указанные гены включают гомологичные гены таких видов, как Clostridium acetobvutylicum, Clostridium beijerinckii или Clostridium ljungdahlii, подробные описания которых размещены в открытом доступе на таких веб-сайтах, как Genbank или NCBI. Функционально эквивалентные варианты также включают нуклеиновые кислоты, последовательность которых варьирует в результате кодоноптимизации для конкретного микроорганизма. Функционально эквивалентный вариант нуклеиновой кислоты предпочтительно отличается идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты относительно референсной нуклеиновой кислоты, составляющей по меньшей мере приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 98% или более (процент гомологии). Функционально эквивалентный вариант белка предпочтительно отличается идентичностью аминокислот относительно референсного белка, составляющей по меньшей мере приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 98% или более (процент гомологии). Функциональная эквивалентность варианта нуклеиновой кислоты или белка может быть оценена с применением любого способа, известного в данной области техники.

Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением любого способа, известного в данной области техники Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в виде депротеинизированных нуклеиновых кислот или введены в состав с одним или более агентов, таких как липосомы. Нуклеиновые кислоты могут быть представлены ДНК, РНК, кДНК или их комбинациями в зависимости от обстоятельств. Согласно определенным вариантам реализации могут применяться ингибиторы рестрикции. Дополнительные векторы могут включать плазмиды, вирусы, бактериофаги, космиды и искусственные хромосомы. Согласно предпочтительному варианту реализации нуклеиновые кислоты доставляют в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением плазмиды. Например, трансформация (в том числе трансдукция или трансфекция) может быть осуществлена путем электропорации, обработки ультразвуком, полиэтиленгликоль-опосредованной трансформации, использования химической или естественной компетентности, трансформации протопласта, индукции профага или конъюгации. Согласно определенным вариантам реализации, включающим системы активных рестрикционных ферментов, может требоваться метилирование нуклеиновой кислоты перед введением указанной нуклеиновой кислоты в микроорганизм.

Кроме того, могут быть разработаны нуклеиновые кислоты, содержащие регуляторный элемент, такой как промотор, для увеличения или регуляции экспрессии конкретной нуклеиновой кислоты иным образом. Указанный промотор может представлять собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор. В идеальном случае указанный промотор представляет собой промотор пути Вуда-Льюнгдаля, промотор ферредоксина, промотор пируват ферредоксин-оксидоредуктазы, промотор оперона Rnfкомплекса, промотор оперона АТФ-синтазы или промотор оперона фосфотрансацетилазы/ацетаткиназы.

Микроорганизм представляет собой микроскопический организм, в частности бактерию, архею, вирус или гриб. Микроорганизм согласно настоящему изобретению, как правило, представляет собой бактерию. Следует понимать, что в настоящем документе термин микроорганизм включает термин бактерия.

Исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, применяемый для получения микроорганизма согласно настоящему изобретению. Исходный микроорганизм может представлять собой встречающийся в природе микроорганизм (т.е. микроорганизм дикого типа) или микроорганизм, кото

- 10 036334 рый был ранее модифицирован (т.е. мутантный или рекомбинантный микроорганизм). Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован таким образом, чтобы экспрессировать или избыточно экспрессировать один или более ферментов, которые не экспрессирует или избыточно не экспрессирует исходный микроорганизм. Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован таким образом, чтобы содержать один или более генов, не содержавшихся в исходном микроорганизме. Согласно одному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum LZ1561, депонированную в DSMZ под номером доступа DSM23693.

Термин происходящий из указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм на основе другой нуклеиновой кислоты, другого белка или микроорганизма (например, исходной нуклеиновой кислоты, исходного белка или микроорганизма или нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма дикого типа) был модифицирован или адаптирован с получением новой нуклеиновой кислоты, нового белка или микроорганизма. Такие модификации или адаптации, как правило, включают вставки, делеции, мутации или замены в нуклеиновых кислотах или генах. В общем случае микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из исходного микроорганизма. Согласно одному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethanogenum LZ1561, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM23693.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть дополнительно классифицирован на основании функциональных характеристик. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой С1-фиксирующий микроорганизм, анаэроб, ацетоген, этанологен, карбоксидотроф и/или метаноген или может происходить из С1-фиксирующего микроорганизма, анаэроба, ацетогена, этанологена, карбоксидотрофа и/или метаногена. В таблице приведен репрезентативный перечень микроорганизмов и идентифицированы их функциональные характеристики.

¹ - acetobacterium woodi может продуцировать этанол из фруктозы, однако не из газа;

² - не был исследован вопрос, способен ли Clostridium magnum расти на СО;

³ - один штамм Moorella thermoacetica, Moorella sp HUC22-1, как было описано, продуцирует

Acetobactenum woodn__________

Alkahbaculum bacchu___________

Blautia producla_________________

Butyribactenum methylotrophicum

Clostridium aeeticum____________

Clostridium autoethanogenum

Clostridium carboxidivorans______

Clostridium coskatu______________

Clostridium drake?_______________

Clostridium formicoaeeticum_____

Clostridium ljungdahlii____________

Clostridium magnum____________

Clostridium ragsdalei____________

Clostridium scatologenes_________

Eubactenum hmosum__________

Moorella thermoautotrophica

Moorella ihermoacetica (ранее

Clostridium thermoacet/cum)_____

Qxobacter pfennign_____________

Sporomusa ovata______________

Sporomusa sdvacetica___________

Sporomusa sphaeroides_________

Thermoanaerobacter kivui этанол из газа;

⁴ - не был исследован вопрос, способен ли Sporomusa ovata расти на СО;

⁵ - не был исследован вопрос, способен ли Sporomusa silvacetica расти на СО;

⁶ - не был исследован вопрос, способен ли Sporomusa sphaeroides расти на СО.

С1 относится к содержащей один атом углерода молекуле, например СО, СО2, СН4 или СН3ОН. Продукт окисления С1 относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая также содержит по меньшей мере один атом кислорода, например СО, СО2 или СН3ОН. Источник С1-углерода относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая служит в качестве одного из источников или единственного источника углерода для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Например,

- 11 036334 источник С1-углерода может содержать что-либо одно или более из СО, СО2, CH₄, СН3ОН или СН2О2. Предпочтительно источник С1-углерода содержит что-либо одно из СО и СО2, либо и то, и другое. CIФиксирующий микроорганизм представляет собой микроорганизм, способный продуцировать один или более продуктов из источника С1-углерода. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой С1-фиксирующую бактерию. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из С1-фиксирующего микроорганизма, идентифицированного в таблице.

Анаэроб представляет собой микроорганизм, которому не требуется кислород для роста. В присутствии кислорода может наблюдаться негативная реакция или даже гибель анаэроба. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой анаэроба. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из анаэроба, идентифицированного в таблице.

Ацетоген представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать ацетат (или уксусную кислоту) в качестве продукта анаэробного дыхания. Как правило, ацетогены являются облигатно анаэробными бактериями, использующими путь Вуда-Льюнгдаля в качестве главного механизма сохранения энергии, а также для синтеза ацетил-КоА и происходящих из ацетил-КоА продуктов, таких как ацетат (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784 1873-1898, 2008). Ацетогены используют путь ацетил-КоА в качестве (1) механизма восстановительного синтеза ацетил-КоА из CO2, (2) конечного электронно-акцепторного процесса сохранения энергии, (3) механизма фиксации (ассимиляции) СО₂ при синтезе клеточного углерода (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In The Prokaryotes, 3rd edition, p 354, New York, NY, 2006). Все встречающиеся в природе ацетогены являются С1-фиксирующими, анаэробными, аутотрофными и неметанотрофными. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой ацетоген. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из ацетогена, идентифицированного в таблице.

Этанологен представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать этанол. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой этанологен. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из этанологена, идентифицированного в таблице.

Аутотроф представляет собой микроорганизм, способный к росту в отсутствие органического углерода. Вместо этого аутотрофы используют неорганические источники углерода, такие как СО и/или СО₂. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой аутотрофа. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из аутотрофа, идентифицированного в таблице.

Карбоксидотроф представляет собой микроорганизм, способный утилизировать СО в качестве единственного источника углерода. Как правило, микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой карбоксидотрофа. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из карбоксидотрофа, идентифицированного в таблице.

Метанотроф представляет собой микроорганизм, способный утилизировать метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Согласно некоторым вариантам реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из метанотрофа.

В более широком смысле микроорганизм согласно настоящему изобретению может происходить из любого рода или вида из идентифицированных в таблице. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой бактерию Clostridium.

Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из кластера Clostridia, включающего виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Указанные виды впервые были описаны и охарактеризованы Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232236, 1993 (Clostridium ljungdahlu), и Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).

Указанные три вида во многом сходны. В частности, все указанные виды являются С1фиксирующими, анаэробными, ацетогенными, этанологенными и карбоксидотрофными представителями рода Clostridium. Указанные виды обладают аналогичными генотипами и фенотипами, способами сохранения энергии и ферментативным метаболизмом. Кроме того, указанные виды кластеризованы в группу гомологии I клостридиальных рРНК с более чем 99% идентичностью 16S рРНК/ДНК, отличаются содержанием G+C в ДНК, составляющим приблизительно 22-30 мол.%, являются грамположительными, обладают аналогичной морфологией и размерами (размер клеток на стадии логарифмического роста составляет 0,5-0,7х3-5 мкм), мезофильными (оптимальный диапазон температур для роста 30-37°С), отличаются аналогичными диапазонами показателей рН приблизительно от 4 до 7,5 (при оптимальных показателях рН, составляющих приблизительно 5,5-6), лишены цитохромов и сохраняют энергию с помощью Rnf-комплекса. Также для указанных видов было продемонстрировано восстановление карбоновых кислот до соответствующих спиртов (Perez, Biotechnol Bioeng, 110: 1066-1077, 2012). Что важно, все указанные виды также демонстрируют выраженный аутотрофный рост на СО-содержащих газах, продуци- 12 036334 руют этанол и ацетат (или уксусную кислоту) в качестве главного продукта ферментации и продуцируют незначительные количества 2,3-бутандиола и молочной кислоты в определенных условиях.

Однако у указанных трех видов имеется также и ряд различий. Указанные виды были выделены из разных источников Clostridium autoethanogenum - из ЖКТ кролика, Clostridium ljungdahlii - из куриного помета, a Clostridium ragsdalei - из пресноводных отложений. У указанных видов различается утилизация различных сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) и других субстратов (например, бетаина, бутанола). Кроме того, указанные виды различаются по ауксотрофности в отношении определенных витаминов (например, тиамина, биотина). У указанных видов различаются последовательности нуклеиновых кислот и последовательности аминокислот генов и белков пути Вуда-Льюнгдаля, хотя общая организация и число указанных генов и белков, как было обнаружено, у всех видов одинаковы (Kopke, Curr. Opin Biotechnol, 22: 320325, 2011).

Соответственно в целом многие из характеристик Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei не являются специфическими для указанного вида, а представляют собой общие характеристики указанного кластера С1-фиксирующих, анаэробных, ацетогенных, этанологенных и карбоксидотрофных представителей рода Clostridium. Однако, поскольку указанные виды все же представляют собой различные виды, генетическая модификация или манипуляция с одним из указанных видов может не оказывать идентичного эффекта на другой вид из числа указанных видов. Например, могут наблюдаться различия в росте, производительности или продуцировании продукта.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также происходить из изолята или мутанта Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Изоляты и мутанты Clostridium autoethanogenum включают JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) и LZ1561 (DSM23693). Изоляты и мутанты Clostridium ljungdahlii включают АТСС 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5593886), C-01 (ATCC 55988) (US 6368819), O-52 (ATCC 55989) (US 6368819) и ОТА-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Изоляты и мутанты Clostridium ragsdalei включают PI 1 (АТСС ВАА-622, АТСС РТА-7826) (WO 2008/028055).

Субстрат относится к источнику углерода и/или энергии для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Как правило, субстрат является газообразным и содержит источник С1-углерода, например СО, СО₂ и/или CH4. Предпочтительно субстрат содержит источник С1-углерода, представленный СО или СО+СО2. Субстрат может дополнительно содержать другие не содержащие углерода компоненты, такие как Н2, N2, или электроны.

Субстрат обычно содержит, по меньшей мере, некоторое количество СО, например приблизительно 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мол.% СО. Субстрат может содержать СО в некотором диапазоне концентраций, например приблизительно 20-80, 30-70 или 40-60 мол.% СО. Предпочтительно субстрат содержит приблизительно 40-70 мол.% СО (например, газ сталелитейных производств или доменный газ), приблизительно 20-30 мол.% СО (например, газ основных сталеплавильных печей с подачей кислорода), или приблизительно 15-45 мол % СО (например, сингаз). Согласно некоторым вариантам реализации субстрат может содержать относительно незначительное количество СО, например приблизительно 1-10 или 1-20 мол.% СО. Микроорганизм согласно настоящему изобретению, как правило, преобразует по меньшей мере часть СО в субстрате в продукт.

Субстрат может содержать некоторое количество Н2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1, 2, 5, 10, 15, 20 или 30 мол.% Н₂. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать относительно большое количество Н2, например приблизительно, 60, 70, 80 или 90 мол.% Н₂. Согласно дополнительным вариантам реализации субстрат, по существу, не содержит Н₂.

Субстрат может содержать некоторое количество СО2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1-80 или 1-30 мол.% СО₂. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать менее чем приблизительно 20, 15, 10 или 5 мол.% СО₂. Согласно другому варианту реализации указанный субстрат, по существу, не содержит СО₂.

Хотя субстрат, как правило, является газообразным, он может также быть представлен альтернативными формами. Например, субстрат может быть растворен в жидкости, насыщенной СО-содержащим газом, с применением генератора дисперсий микропузырьков. Согласно дополнительному примеру субстрат может быть адсорбирован на твердой подложке.

Субстрат и/или источник С1-углерода может представлять собой газообразные отходы, образующиеся в качестве побочного продукта промышленного процесса или получаемые из какого-либо другого источника, например из выхлопных газов автотранспорта или при газификации биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производств продуктов черной металлургии, таких как сталелитейное производство, производство продуктов цветной металлургии, процессы нефтепереработки, газификация угля, получение электроэнергии, получение технического углерода, получение аммиака, получение метанола и производство кокса. Согласно указанным вариантам реализации субстрат и/или источник С1-углерода может захватываться в

- 13 036334 ходе промышленного процесса до выброса в атмосферу с применением любого удобного способа.

Субстрат и/или источник С1-углерода может представлять собой сингаз, такой как сингаз, получаемый путем газификации угля или остатков после перегонки нефти, газификации биомассы или риформинга природного газа. Состав субстрата может оказывать значимое влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, присутствие кислорода (О₂) может снижать эффективность процесса анаэробной ферментации. В зависимости от состава субстрата желательным может быть проведение обработки, очистки или фильтрации субстрата для удаления каких-либо нежелательных загрязняющих примесей, таких как токсины, нежелательные компоненты или пылевые частицы, и/или увеличения концентрации требуемых компонентов.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть культивирован для получения одного или более продуктов. Например, Clostridium autoethanogenum продуцирует или может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать этанол (WO 2007/117157), ацетат (WO 2007/117157), бутанол (WO 2008/115080 и WO 2012/053905), бутират (WO 2008/115080), 2,3-бутандиол (WO 2009/151342), лактат (WO 2011/112103), бутен (WO 2012/024522), бутадиен (WO 2012/024522), метилэтилкетон (2-бутанон) (WO 2012/024522 и WO 2013/185123), этилен (WO 2012/026833), ацетон (WO 2012/115527), изопропанол (WO 2012/115527), липиды (WO 2013/036147), 3-гидроксипропионат (3-НР) (WO 2013/180581), изопрен (WO 2013/180584), жирные кислоты (WO 2013/191567), 2-бутанол (WO 2013/185123), 1,2-пропандиол (WO 2014/0369152) и 1-пропанол (WO 2014/0369152). Помимо одного или более целевых продуктов микроорганизм согласно настоящему изобретению может также продуцировать этанол, ацетат и/или 2,3-бутандиол.

Селективность относится к пропорции продуцируемого целевого продукта и всех продуцируемых микроорганизмом продуктов ферментации. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать продукты с определенной селективностью или с минимальной селективностью. Согласно одному варианту реализации целевой продукт составляет по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 30, 50 или 75% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации целевой продукт составляет по меньшей мере 10% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 10%. Согласно другому варианту реализации целевой продукт составляет по меньшей мере 30% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 30%.

Как правило, культивирование проводят в биореакторе. Термин биореактор включает устройство для культивирования/ферментации, состоящее из одного или более резервуаров, колонн или систем трубок, например реактор непрерывного действия с перемешиванием (CSTR), реактор с иммобилизацией клеток (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажная колонка, газлифтный ферментер, статический смеситель, или другой сосуд, или другое устройство, подходящее для контакта газа и жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации указанный биореактор может содержать первый ростовой реактор и второй реактор для культивирования/ферментации. Субстрат может вводиться в один или оба указанных реактора. В настоящем документе термины культура (культивирование) и ферментация (ферментирование) используются взаимозаменяемо. Указанные термины охватывают и фазу роста, и фазу биосинтеза продукта процесса культивирования/ферментации.

Культуру, как правило, поддерживают на водной культуральной среде, которая содержит питательные вещества, витамины и/или минеральные вещества, достаточные для обеспечения роста микроорганизма. Предпочтительно указанная водная культуральная среда представляет собой ростовую среду для анаэробных микроорганизмов, такую как минимальная ростовая среда для анаэробных микроорганизмов. Подходящие среды хорошо известны в данной области техники.

Желательно проведение культивирования/ферментации в подходящих условиях для продуцирования целевого продукта. Учитываемые условия реакции включают давление (или парциальное давление), температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, рН среды, окислительновосстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (при применении реактора непрерывного действия с перемешиванием), уровень инокулята, максимальные концентрации газообразного субстрата, при которых концентрация газа в жидкой фазе не становится ограничивающим фактором, и максимальные концентрации продукта, позволяющие избежать ингибирования продукта. В частности, может осуществляться контроль скорости введения субстрата для обеспечения того, чтобы концентрация газа в жидкой фазе не становилась ограничивающим фактором, поскольку в условиях ограниченного количества газа продукты могут потребляться культурой.

Функционирование биореактора при повышенном давлении обеспечивает увеличение скорости перехода газовой массы из газовой фазы в жидкую фазу. Соответственно обычно предпочтительно проведение культивирования/ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость конверсии газа отчасти является функцией от времени удерживания суб

- 14 036334 страта, а время удерживания обуславливает требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может позволить значительно снизить требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты на оборудование для культивирования/ферментации. В свою очередь, это означает, что время удерживания, определяемое как результат деления объема жидкости в биореакторе на скорость входящего потока газа, может быть снижено при поддержании биореакторов в условиях повышенного давления, а не атмосферного давления. Оптимальные условия реакции отчасти зависят от конкретного применяемого микроорганизма. Однако, в целом, предпочтительно проведение ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость конверсии газа отчасти является функцией от времени удерживания, а достижение требуемого времени удерживания, в свою очередь, обуславливает требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может позволить значительно снизить требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты на оборудование для ферментации.

Целевые продукты могут быть отделены или очищены из ферментативного бульона с применением любого способа или комбинации способов, известных в данной области техники, включая, например, фракционную дистилляцию, испарение, первапорацию, отдувку газа, фазовое разделение и экстрактивную ферментацию, в том числе например, жидкость-жидкостную экстракцию. Согласно некоторым вариантам реализации целевые продукты выделяют из ферментативного бульона путем непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделения клеток микроорганизмов от бульона (что удобно осуществлять путем фильтрации) и выделения из бульона одного или более целевых продуктов. Спирты и/или ацетон могут быть выделены, например, путем дистилляции. Кислоты могут быть выделены, например, путем адсорбции на активированном угле. Отделенные клетки микроорганизмов предпочтительно возвращают в биореактор. Бесклеточный пермеат, оставшийся после извлечения целевых продуктов, также предпочтительно возвращают в биореактор. Для восполнения среды перед возвращением в биореактор к бесклеточному пермеату могут быть добавлены дополнительные питательные вещества (такие как витамины В).

Примеры

Приведенные ниже примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, однако, разумеется, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.

Пример 1.

В указанном примере описаны общие способы культивирования С. autoethanogenum и С. ljungdahlii.

С. autoethanogenum DSM 10061 и DSM 23693 (производный от DSM 10061) и С. ljungdahlii DSM 13528 получали из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Инхоффенштрассе, 7В, 38124, Брауншвейг, Германия).

Штаммы выращивали при 37°С на среде РЕТС при рН 5,6 с применением стандартных анаэробных техник (Hungate, Methods Microbiol, 3В: 117-132, 1969, Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971). Фруктозу (гетеротрофный рост) или СО-содержащий газ со сталелитейного производства под давлением 30 фунт/кв дюйм (собранный на объекте New Zealand Steel, Гленбрук, Новая Зеландия, состав 44% СО, 32% N2, 22% СО₂, 2% Н₂) в объеме свободного пространства реактора (аутотрофный рост) применяли в качестве субстрата. Для получения твердой среды добавляли 1,2% бактоагара (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, США).

- 15 036334

Компонент среды РЕТС	Количество на 1,0 л среды РЕТС
NHiCI	1 г
K.C1	0,1 г
MgSOi 7ΗιΟ	0,2 г
NaCl	0,8 г
КН2РО4	0,1 г
CaCI2	0,02 г
Раствор следовых металлов (см. ниже)	10 мл
Витаминный раствор Вулфа (см. ниже)	10 мл
Дрожжевой экстракт (необязательно)	1 г
Резазурин (основной раствор 2 г/л)	0,5 мл
NaHCO;	2 г
Раствор восстанавливающих агентов (см, ниже)	0,006-0,008 % (по объему)
Фруктоза (для гетеротрофного роста)	5 г

Компонент раствора следовых металлов	Количество на 1,0 л раствора следовых металлов
Нитрилотриуксусная кислота	2 г
MnSO4 Н,0	1 г
Fe(SO4)2(NH;)2 · 6Н2О	0,8 г
CoCb · 6Н2О	0,2 г
ZnSO4 · 7Н2О	0,2 мг
CuCb · 2HjO	0,02 г
NaMoO4 2H2O	0,02 г
Na2SeO3	0,02 г
NiCl2 6H2O	0,02 г
Na;WO; · 2H2O	0,02 г

Компонент витаминного раствора Вулфа	Количество на 1,0 л витаминного раствора Вулфа
Биотин	2 мг
Фолиевая кислота	2 мг
Пиридоксин гидрохлорид	10 мг
Тиамин НС1	5 мг
Рибофлавин	5 мг
Никотиновая кислота	5 мг
Кальция D-(+)naHT0TeHaT	5 мг
Витамин В12	0,1 мг
Р-аминобензойная кислота	5 мг
Тиоктовая кислота	5 мг

Компонент раствора восстанавливающих агентов	Количество на 100 мл раствора восстанавливающих агентов
NaOH	0,9 г
Цистеин-НС1	4 г
Na2S	4 г

Пример 2.

В указанном примере продемонстрировано конструирование штамма, содержащего плазмиду для экспрессии п-гидроксибензоата.

Последовательность нуклеотидов хоризмат-пируват-лиазы (ubiC) (SEQ ID NO 1) оптимизировали (SEQ ID NO 2) в соответствии с таблицей частот использования кодонов у С. autoethanogenum от GeneArt и клонировали в экспрессионный вектор pMTL8315 (фиг. 7) под контролем промотора пути ВудаЛьюнгдаля (US 20110256600). Также включали кодирующую последовательность нечувствительной к регуляции по типу обратной связи мутантной 3-дезокси-О-арабино-гептулозонат-7-фосфатсинтазы (ДАГФ-синтазы) (aroG*) (SEQ ID NO 8), за которой следовала ubiC в бицистронном формате (фиг. 7). Плазмидой pARO_01 (SEQ ID NO 9) трансформировали С. autoethanogenum LZ1561 (DSM 23693) посредством конъюгации со штаммом Е. coli CA434 в качестве донорного. Донорные штаммы выращивали в течение ночи на среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл спектиномицина. Клетки из 1,5 мл культуры собирали путем центрифугирования и промывали в забуференном фосфатом солевом растворе (ФСБ). Внутри анаэробной установки осадок донорных клеток ресуспендировали в 200 мкл с экспоненциально растущим реципиентом LZ1561. Смесь для конъюгации наносили на агаровую среду PETC-MES и инкубировали при 37°С. Через 24 ч клетки соскребали с чашки для конъюгации и распределяли по агаровой среде PETC-MES с добавлением 7,5 мкг тиамфеникола/мл (Sigma) и 10 мкг триметоприма/мл (Sigma). Три несущие плазмиду колонии изолятов (т.е. биологические трипликаты) выращивали на жидкой среде PETC-MES, содержащей 7,5 мкг тиамфеникола/мл и газовую смесь, имитирующую отходящий газ сталелитейного производства, в качестве источника углерода (50% СО, 10% Н₂, 30% CO2, 10% N2, далее в настоящей заявке называемую отходящим газом).

Жидкие культуры выращивали в 10 мл среды PETC-MES во флаконах для сыворотки, содержащих тиамфеникол и отходящий газ, при давлении 22 фунта/кв дюйм. Образцы отбирали ежедневно для изме

- 16 036334 рения биомассы (фиг. 8) и рНВА (фиг. 9а и 9b).

Для измерения рНВА в образцы (100 мкл) добавляли 10 мкл 0,1H NaOH, замораживали и затем высушивали сублимацией. Затем образцы дериватизировали 100 мкл BSTFA+TCMS (99 1) и 100 мкл пиридина. Затем образцы инкубировали при 60 °С в течение 30 мин с образованием триметилсилильных производных функциональной группы карбоновой кислоты. Подробные характеристики метода ГХ-МС вводимый объем - 1 мкл, температура блока введения -250°С, коэффициент деления потока -10:1. Начальная Т 50°С (время выдерживания 5 мин), конечная Т 220°С (20°С/мин), постоянный поток - 1 мл/мин (газноситель Не), колонка Zebron ZB-5MS 30 мх0,25 ммх0,25 мкм. Ионная ловушка Varian 4000, работающая в режиме полного сканирования 40-400 м/з. Настройка: ПФТБА.

На фиг. 9а LZ1561 (контрольный штамм) представлены три технических репликата (т.е. полученных путем троекратного выращивания и взятия образцов). Также получали два биологических репликата LZ1561 с pARO_01, с тремя техническими репликатами для каждого Технический репликат относится к выращиванию и взятию образцов каждого штамма в отдельных экспериментах, тогда как биологический репликат относится к воспроизведению штамма с самого начала. Таким образом, биологические репликаты отражают фоновые биологические вариации микроорганизма, тогда как технические репликаты отражают вариации, обусловленные техническими аспектами, включающими культивирование, взятие образцов и способы анализа. На фиг. 9а видно, что рНВА продуцировалась неоднократно в отдельно взятых случаях. На фиг. 8 и 9b приведена общая информация о росте и продуктивности в отношении рНВА.

Пример 3.

В указанном примере продемонстрировано получение п-гидроксибензоата посредством ферментации газа.

С. autoethanogenum, несущий плазмиду pARO_01 (SEQ ID NO 9), выращивали на отходящем газе согласно описанию в примере 1. В ходе ГХ-МС-анализа культуры, осуществляемого согласно примеру 1, было определено, что бактерия, экспрессирующая хоризмат-пируват-лиазу, продуцировала рНВА. Линейный диапазон анализа на рНВА с применением указанного способа составлял 0-12,5 мг/мл (фиг. 5).

Данные для рНВА валидировали путем сравнения со временем удерживания и характеристическими фрагментными ионами аутентичного стандарта рНВА и предсказанными характеристическими ионами из базы данных масс-спектральных данных NIST (фиг. 6).

Продуцирование рНВА наблюдалось во всех культурах, экспрессирующих хоризмат-пируват-лиазу, кодируемую экспрессионным вектором pMTL8315. Наблюдаемый в каждой отдельно взятой культуре пиковый титр рНВА составлял 17 мг рНВА/л через восемь дней (фиг. 9b). В контрольном образце без экспрессионного вектора присутствия рНВА не наблюдалось.

Генетически сконструированная бактерия продуцировала детектируемые уровни рНВА, обнаруживаемые в культуре.

Пример 4.

В указанном примере продемонстрирован экспериментальный протокол для увеличения продуцирования рНВА путем конструирования ферментов.

UbiC подвергается ингибированию продуктом за счет удержания рНВА. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ubiC, может быть модифицирована таким образом, чтобы происходила мутация аминокислот, вовлеченных в удержание продукта ферментом, и высвобождение продукта усиливалось. Для достижения указанной цели аминокислоты, вовлеченные в связывание рНВА, идентифицируют путем анализа существующих структур со связанным продуктом. Затем ингибирование продукта минимизируют путем мутирования аминокислот, вовлеченных в связывание и удержание рНВА. Для идентификации ферментов с максимальной каталитической эффективностью для выхода рНВА может быть получена направленная библиотека мутантов ubiC, где изменяются различные комбинации рНВАсвязывающих аминокислот, и указанные мутантные ферменты могут быть проанализированы с применением ферментного анализа. Затем усовершенствованные мутанты экспрессируют у С. autoethanogenum LZ1561 для валидации штаммов с наиболее усовершенствованной продуктивностью рНВА.

Пример 5.

В указанном примере продемонстрировано конструирование штамма, содержащего плазмиду для экспрессии салицилата.

Последовательности нуклеотидов pchA (SEQ ID NO 4) и pchB (SEQ ID NO 6) кодоноптимизировали и клонировали в экспрессионный вектор под контролем тетрациклининдуцируемого промотора. Плазмидой трансформировали С. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693) посредством конъюгации со штаммом Е. coli СА434 в качестве донора. Донорные штаммы выращивали в течение ночи на среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл спектиномицина. Клетки из 1,5 мл культуры собирали путем центрифугирования и промывали в забуференном фосфатом солевом растворе (ФСБ). Внутри анаэробной установки осадок донорных клеток ресуспендировали в 200 мкл с экспоненциально растущим реципиентом С. autoethanogenum. Смесь для конъюгации наносили на агаровую среду PETC-MES и инкубировали при 37°С. Через 24 ч клетки соскребали с чашки для конъюгации и распределяли по агаровой среде PETC-MES с добавлением 7,5 мкг тиамфеникола/мл (Sigma) и 10 мкг тримето- 17 036334 прима/мл (Sigma). Три несущие плазмиду колонии изолятов (т.е. биологические трипликаты) выращивали на жидкой среде PETC-MES, содержащей 7,5 мкг тиамфеникола/мл, с отходящим газом в качестве источника углерода.

Жидкие культуры выращивали в 10 мл среды PETC-MES во флаконах для сыворотки, содержащих тиамфеникол и отходящий газ, при давлении 22 фунта/кв дюйм.

Мониторинг биомассы осуществляли спектрофотометрически. При OD 600 нм=0,3 экспрессию пути биосинтеза салицилата индуцировали путем добавления 40 нг ангидротетрациклина/мл. Культуры в двух повторностях (технические репликаты трех биологических трипликатов) выращивали без добавления ангидротетрациклина, чтобы не индуцировать путь биосинтеза салицилата. Образцы отбирали ежедневно.

Концентрации салицилата измеряли посредством анализа с применением газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ-МС), используя систему ГХ-МС Thermo Scientific ISQ LT, оснащенную колонкой Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 мх0,25 мкмх0,25 мкм) и автоматическим пробозаборником. Образцы получали путем разведения 300 мкл образца в 600 мкл ацетонитрила и 50 мкл 0,1 Н NaOH. Образцы перемешивали на вортексе, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 14 000 об/мин, 800 мкл супернатанта переносили в стеклянный флакон, и высушивали образец в Thermo SpeedVac®. Затем высушенные образцы суспендировали в 100 мкл раствора пиридина, содержащего 22 мг/мл метоксиамина HCl, после чего нагревали в герметизированном стеклянном флаконе в течение 60 мин при 60°С. После этого добавляли 300 мкл N,O-бис-трифторацетамида (BSTFA), затем нагревали в герметизированном стеклянном флаконе в течение 60 мин при 60°С. Образцы переносили в автоматический пробозаборник для анализа с объемом вводимой пробы 1,5 мкл, коэффициентом деления потока 201 и температурой на входе 250°С. Хроматографию проводили с использованием следующей программы термостата от 80°С (без выдерживания) с подъемом со скоростью 3°С/мин до 140°С, с подъемом со скоростью 20°С/мин до 230°С и с заключительным выдерживанием продолжительностью 4 мин. Скорость потока через колонку составляла 38 см²/мин, в качестве газа-носителя использовали гелий. Температуру источника ионов МС поддерживали на уровне 280 °С. Количественное определение проводили с применением иона с 267 м/з для количественного анализа и ионов с 135 и 45 м/з для качественного анализа.

На фиг. 11а приведено сравнение роста биомассы в индуцированных и неиндуцированных образцах. На фиг. 11b видно, что продуцирование салицилата происходило неоднократно.

Пример 6.

В указанном примере продемонстрирован нокаут pheA для усиления продуцирования происходящих из хоризмата продуктов.

Ген pheA (например, из С. autoethanogenum, CAETHG_0905 (СР006763.1:973789.974925)) представляет собой ген, который кодирует фермент префенатсинтазу. Префенатсинтаза катализирует конверсию хоризмата в префенат, который представляет собой предшественник ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Нокаут функции pheA осуществляли путем разрушения указанного гена с применением метода ClosTron (Heap et al., J Microbiol Methods 2010, 80(1):49-55). ClosTron-плазмиду pMTL007C-E2 получали в DNA20 и трансформировали С autoethanogenum LZ1561 (DSM23693) посредством конъюгации со штаммом Е. coli CA434 в качестве донорного. Донорные штаммы выращивали в течение ночи на среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола. Клетки из 1,5 мл культуры собирали путем центрифугирования и промывали в забуференном фосфатом солевом растворе (ФСБ). Внутри анаэробной установки осадок донорных клеток ресуспендировали в 200 мкл с экспоненциально растущим реципиентом С. autoethanogenum LZ1561. Смесь для конъюгации наносили на агаровую среду РЕТС и инкубировали при 37°С. Через 24 ч клетки соскребали, ресуспендировали в 500 мкл ФСБ и распределяли по агаровой среде РЕТС с добавлением 7,5 мкг/мл тиамфеникола (Sigma) и 10 мкг/мл триметоприма (Sigma). Несущие плазмиду изоляты выращивали на жидкой среде PETC-MES, содержащей 7,5 мкг тиамфеникола/мл, с отходящим газом в качестве источника углерода.

Колонии наносили методом штриха на твердую среду PET, содержащую антибиотик кларитромицин (5 мкг/мл). Указанный этап обеспечивал отбор по интеграции перенаправляющей интрон последовательности в геном. Интеграция последовательности интрона в целевой сайт приводит к встраиванию в геном 1800 п.о., скрининг которого проводили с применением ПЦР колонии. Продукт ПЦР положительных по ClosTron мутантов очищали и секвенировали для подтверждения сайта встраивания.

Жидкие культуры выращивали в 10 мл среды PETC-MES во флаконах для сыворотки, содержащих кларитромицин и отходящий газ при давлении 22 фунта/кв дюйм. Из указанного флакона для сыворотки готовили базовую культуру в глицерине.

Эксперименты в биореакторе проводили в системе с водяной рубашкой BioFlo 115 объемом 2 л (New Brunswick Scientific Corp, Эдисон, Нью-Джерси) с рабочим объемом 1,5 л. Система CSTR была оснащена двумя 6-лопастными мешалками Раштона, распределители усиливают перемешивание ферментативного бульона и массопередачу между газом и жидкостью. Электроды для измерения рН и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП-электрод) (Broadley-James Corporation) проводили через верхнюю крышку, и их показатели регистрировали с 5-минутными интервалами. Значение рН поддержи- 18 036334 вали на уровне 5,0 путем автоматизированного добавления 5 М раствора гидроксида аммония.

Из базовой культуры в глицерине получали инокулят. 1 мл базовой культуры в глицерине переносили в 50 мл среды РЕТС с отходящим газом при давлении 22 фунта/кв дюйм в качестве источника углерода. Культуру инкубировали при 37°С на шейкере в течение 2-3 дней до появления наблюдаемого видимого роста. Затем указанные культуры использовали для инокуляции 200 мл свежей среды в бутылке Schott объемом 1 л и добавляли отходящий газ до достижения давления 22 фунта/кв.дюйм. Бутылку Schott инкубировали дополнительно в течение 24-36 ч до переноса в ферментеры.

Устанавливали следующие настройки скорость перемешивания - 200 об/мин, скорость потока газа 35 мл/мин/л. Через 1 день скорость перемешивания начинали увеличивать на 25 об/мин с 4-часовыми интервалами до максимального значения, составляющего 900 об/мин. Скорость потока газа увеличивали на 25 мл/мин/л с 4-часовыми интервалами до максимального значения скорости потока, при котором может обеспечиваться целевое поглощение СО. На протяжении всего курса ферментации добавляли Na₂S с начальной скоростью нагнетания, составляющей 0,3 мл/ч, и позже, после падения концентрации H2S в объеме свободного пространства реактора ниже 200~м.д., увеличиваемой с шагом 0,2 мл/ч. Потребление СО и Н₂ и продуцирование СО₂, наряду с концентрацией H2S, измеряли каждый час с применением газовой хроматографии (ГХ). Жидкие образцы отбирали из ферментера с регулярными интервалами на протяжении курса ферментации для определения клеточной массы и концентраций метаболитов с применением ВЭЖХ.

После старта в режиме периодического культивирования ферментер переводили в непрерывный режим после достижения показателя OD, составляющего 2. Скоростью добавления среды и питательных веществ управляли при помощи одного или более прецизионных перистальтических насосов (насосы Masterflex L/S Digital Drive), при поддержании постоянного объема в ферментере с применением датчика уровня, запускающего насос для удаления ферментативного бульона из CSTR. Скорость разведения устанавливали на уровне 0,5/день за 1 этап, а затем увеличивали до 1/день, 1,7/день с 24-часовыми интервалами.

В качестве дополнительного оборудования для ферментации использовали половолоконную мембрану (GE Healthcare) с размером пор, составляющим 0,2 мкм, и площадью поверхности, составляющей 1200 см². Мембрану использовали для увеличения концентрации клеток в ферментативном объеме. Ферментативный бульон прокачивали через мембрану с высокой скоростью и возвращали обратно в ферментер, при этом бесклеточный фильтрат нагнетали в резервуар для фильтрата с меньшей скоростью, чем среду. Это позволяло увеличить время удерживания бактериальных клеток в ферментере.

Как видно на фиг. 10, с применением ГХ-МС были идентифицированы три новых соединения. Указанные соединения представляли собой цис-4-гидроксициклогексанкарбоновую кислоту, 3,4дигидроксибензойную кислоту и 2-аминобензойную кислоту. Указанные соединения были детектированы только в указанной культуре pheA CT и не были детектированы в культуре исходного штамма (LZ1561).

Концентрации 3,4-дигидроксибензойной кислоты, 2-аминобензойной кислоты и цис-4гидроксициклогексанкарбоновой кислоты измеряли с применением газовой хроматографии (ГХ) на ГХхроматографе Agilent 6890N, оснащенном колонкой Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 мх0,25 мкмх0,25 мкм), автоматическим пробозаборником и пламенно-ионизационным детектором (FID). Образцы получали путем разведения 400 мкл образца в 400 мкл ацетонитрила с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин, супернатант переносили в стеклянный флакон, и образец высушивали в Thermo Speed Vac®. Затем высушенные образцы суспендировали в 400 мкл раствора N,O-6ucтрифторацетамида (BSTFA) и пиридина (в отношении 3:1) и нагревали в герметизированном стеклянном флаконе в течение 60 мин при 60°С. Образцы переносили в автоматический пробозаборник для анализа с объемом вводимой пробы 1 мкл, коэффициентом деления потока 30 1 и температурой на входе 250°С. Хроматографию проводили с использованием следующей программы термостата 70 °С (без выдерживания) с подъемом со скоростью 3°С/мин до 110°С, с подъемом со скоростью 15°С/мин до 230°С с последующим заключительным подъемом со скоростью 40°С/мин до 310°С, с заключительным выдерживанием продолжительностью 3 мин. Скорость потока через колонку составляла 1,8 мл/мин, в качестве газаносителя использовали гелий. Температуру FID поддерживали на уровне 320°С с поступлением водорода со скоростью 40 мл/мин, воздуха со скоростью 400 мл/мин и гелия со скоростью 20 мл/мин в качестве вспомогательного газа.

На фиг. 12 приведена концентрация цис-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3,4дигидроксибензойной кислоты и 2-аминобензойной кислоты на протяжении одного курса ферментации. Как показано на фиг. 12, концентрация соединения цис-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты увеличивалась приблизительно до 0,9 г/л на 6 день ферментации. Происходило накопление 2аминобензойной кислоты до концентрации, составляющей приблизительно 0,45 г/л на 8-9 день ферментации. 3,4-Дигидроксибензойная кислота продуцировалась в меньших количествах с пиковыми концентрациями, составляющими около 0,3 г/л, на 6-8 дни. На 6 день наблюдалась общее накопление цис-4гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 2-аминобензойной кислоты и 3,4-дигидроксибензойной ки

- 19 036334 слоты, составляющее >1,3 г/л.

О продуцировании цис-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты из литературных источников известно немногое. Имеется только одно сообщение о детекции цис-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты в образце мочи ребенка с применением ГХ-МС. Было выдвинуто предположение, что указанное соединение представляет собой побочный продукт метаболизма кишечных бактерий (Kronick, Chnica Chimica Acta, 132: 205-208, 1983). Вероятно, указанное соединение представляет собой прямой продукт хоризмата или префената, поскольку механизм реакции может быть объяснен расщеплением молекулы пирувата с последующим восстановлением, дополнительно требующим 2,5 молекул Н₂, которые могут поставляться за счет НАД(Ф).

2-Аминобензойная кислота представляет собой известный промежуточный продукт пути синтеза триптофана из хоризмата. Антранилатсинтаза катализирует аминирование с последующей ароматизацией хоризмата с получением ароматического остова молекулы триптофана. Известно, что генная экспрессия антранилатсинтазы строго регулируется и подвергается ингибированию по типу обратной связи конечным продуктом триптофаном (Dosselaere, Crit Rev Microbiol, 27: 75-131, 2001). 2-Аминобензойная кислота секретировалась в ферментативный бульон только после прекращения роста, что указывает на то, что она представляет собой избыточный продукт, который после остановки роста больше не устраняется в результате реакции.

Все источники, в том числе публикации, патентные заявки и патенты, упоминаемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый источник был индивидуально конкретным образом включен посредством ссылки и полностью приведен в настоящем документе.

Ссылки в настоящем описании на какую-либо информацию, известную из уровня техники, не означают и не должны быть истолкованы как признание того, что указанный уровень техники составляет часть общедоступных сведений в данной области деятельности в любой стране.

Применение терминов в единственном числе, в том числе сопровождаемых определением указанный(ая,ое) и аналогичных объектов в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте приведенной ниже формулы изобретения) подразумевает как единственное, так и множественное число, если в настоящем документе не указано иное или если это явным образом не противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий (в том числе), содержащий в себе должны трактоваться как неограничивающие термины (т.е. означающие в том числе, но не ограничиваясь перечисленным), если не указано иное. Упоминаемые в настоящем документе диапазоны значений предназначены только для того, чтобы служить в качестве способа сокращения индивидуальных обозначений каждого отдельного значения, попадающего в указанный диапазон, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание в той же степени, как если бы они были индивидуальным образом упомянуты в настоящем документе. Все описанные в настоящем документе способы могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту. Применение всех и каждого из примеров или выражений для описания примеров (например, такой как) в настоящем документе предназначено исключительно для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения, если не заявлено иное. Никакие выражения в настоящем описании не должны быть истолкованы как указывающие на существенное значение любого не заявленного элемента для практической реализации настоящего изобретения.

Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения описаны в настоящем документе. Для специалистов в данной области техники после прочтения приведенного выше описания могут стать очевидными вариации указанных предпочтительных вариантов реализации. Авторы настоящего изобретения ожидают, что специалисты будут надлежащим образом использовать такие вариации, и предполагают возможность практической реализации настоящего изобретения иным образом, чем, в частности, описанный в настоящем документе. Соответственно настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, упоминаемые в прилагаемой к настоящему документу формуле изобретения, в установленных соответствующим законодательством границах. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных вариациях охвачена настоящим изобретением, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Генетически модифицированная бактерия Clostridium, использующая для аутотрофного роста ацетил-КоА биохимический путь и продуцирующая из хоризмата салицилат путем ферментации газообразного субстрата, содержащего по меньшей мере одно соединение, выбранное из СО, СО₂ и Н₂, содержащая:

   a) нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризматсинтазу, и

   b) нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную изохоризмат-пируват-лиазу.

   - 20 036334
2. 2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая изохоризматсинтазу, представляет собой pchA.
3. 3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая изохоризмат-пируватлиазу, представляет собой pchB.
4. 4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанные нуклеиновые кислоты кодон-оптимизированы для экспрессии в Clostridium.
5. 5. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно экспрессирует ДАГФ-синтазу, нечувствительную к регуляции по типу обратной связи.
6. 6. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой Closthdium autoethanogenum, Closthdium ljungdahlii или Closthdium ragsdalei.
7. 7. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что представляет собой Closthdium autoethanogenum DSM23693.
8. 8. Способ получения салицилата из хоризмата, включающий ферментацию газообразного субстрата, содержащего по меньшей мере одно соединение, выбранное из СО, СО2 и Н2, генетически модифицированной бактерией по п.1.