EA044562B1 - Получение полигидроксибутирата в микроорганизме вуда-льюнгдаля - Google Patents
Получение полигидроксибутирата в микроорганизме вуда-льюнгдаля Download PDFInfo
- Publication number
- EA044562B1 EA044562B1 EA202090887 EA044562B1 EA 044562 B1 EA044562 B1 EA 044562B1 EA 202090887 EA202090887 EA 202090887 EA 044562 B1 EA044562 B1 EA 044562B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- microorganism
- coa
- pseudomonas
- clostridium
- rnv
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 168
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 title claims description 17
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 title claims description 17
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 68
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 65
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 41
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 claims description 22
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 21
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 claims description 20
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 claims description 20
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 claims description 12
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 claims description 12
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 claims description 12
- 241000193033 Azohydromonas lata Species 0.000 claims description 12
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 12
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 claims description 12
- 241000204988 Haloferax mediterranei Species 0.000 claims description 12
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 12
- 229940011019 arthrospira platensis Drugs 0.000 claims description 12
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 claims description 11
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims description 11
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 11
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 claims description 11
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 241001277679 Pseudomonas mandelii Species 0.000 claims description 10
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 claims description 9
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 claims description 9
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 claims description 7
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims description 7
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 claims description 4
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 48
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 241001656809 Clostridium autoethanogenum Species 0.000 description 28
- 241000894007 species Species 0.000 description 25
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 24
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 15
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 14
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 description 13
- 241001611023 Clostridium ragsdalei Species 0.000 description 12
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 10
- 230000000789 acetogenic effect Effects 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 241001171821 Clostridium coskatii Species 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 241000037909 Alkalibaculum Species 0.000 description 5
- 241000178985 Moorella Species 0.000 description 5
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 description 5
- 101100463818 Pseudomonas oleovorans phaC1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100297400 Rhizobium meliloti (strain 1021) phaAB gene Proteins 0.000 description 5
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 5
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 description 5
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 5
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 5
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 5
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001468167 Clostridium magnum Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000204376 Sporomusa ovata Species 0.000 description 4
- 241000217849 Sporomusa sphaeroides Species 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 4
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N (S)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N 0.000 description 3
- 241001468161 Acetobacterium Species 0.000 description 3
- 241001468163 Acetobacterium woodii Species 0.000 description 3
- 241001464894 Blautia producta Species 0.000 description 3
- 241001656810 Clostridium aceticum Species 0.000 description 3
- 241001611022 Clostridium carboxidivorans Species 0.000 description 3
- 241000328950 Clostridium drakei Species 0.000 description 3
- 241000193161 Clostridium formicaceticum Species 0.000 description 3
- 241000186587 Clostridium scatologenes Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186398 Eubacterium limosum Species 0.000 description 3
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001509483 Oxobacter pfennigii Species 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 3
- 241000204388 Sporomusa Species 0.000 description 3
- 241000543642 Sporomusa silvacetica Species 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N crotonic acid Chemical compound C\C=C\C(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 101150046540 phaA gene Proteins 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LDHQCZJRKDOVOX-UHFFFAOYSA-N trans-crotonic acid Natural products CC=CC(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxypropionate Chemical compound OCCC([O-])=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001202853 Blautia Species 0.000 description 2
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 description 2
- 101001028272 Escherichia coli (strain K12) Long-chain acyl-CoA thioesterase FadM Proteins 0.000 description 2
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 2
- -1 Fd red Chemical compound 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 101000693728 Homo sapiens S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Proteins 0.000 description 2
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000178986 Oxobacter Species 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025541 S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Human genes 0.000 description 2
- 101100280476 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) fabM gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 108010057885 aldehyde ferredoxin oxidoreductase Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 2
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000001450 methanotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150048611 phaC gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical compound CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZKZXTBSUSEYQZ-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-ethoxy-3-methoxyphenyl)methyl]-6,7-dimethoxy-3-methylisoquinoline;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.C1=C(OC)C(OCC)=CC=C1CC1=NC(C)=CC2=CC(OC)=C(OC)C=C12 YZKZXTBSUSEYQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940044613 1-propanol Drugs 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710090359 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase Proteins 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100025854 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710175445 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022714 Acyl-coenzyme A thioesterase 13 Human genes 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004827 Carbamate kinase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 101100005275 Clostridium perfringens catP gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 229910002548 FeFe Inorganic materials 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186544 Moorella thermoautotrophica Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108010035473 Palmitoyl-CoA Hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710182361 Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000190967 Rhodospirillum Species 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229920013625 Synpol Polymers 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 1
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229920003232 aliphatic polyester Polymers 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N butan-2-one Chemical compound CCC(C)=O.CCC(C)=O RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N butene Natural products CC=CC IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003031 high energy carrier Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005504 petroleum refining Methods 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000010248 power generation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N thiamphenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N 0.000 description 1
- 229960003053 thiamphenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявку
В данной заявке испрашивается приоритет по заявке на патент США 62/568127, поданной 4 октября
2017 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к генетически модифицированным микроорганизмам и способам получения полигидроксибутирата (РНВ) посредством микробиологической ферментации, в частности, посредством микробиологической ферментации газообразного субстрата.
Уровень техники
Полимерные материалы, получаемые из нефти, стали жизненно необходимыми в современной жизни, преимущественно благодаря их легкости, прочности, долговечности и устойчивости к разложению. Однако, зависимость от полимерных материалов, получаемых из нефти, привела к множеству серьезных проблем, включая истощение запасов сырой нефти, загрязнение и накопление на свалках. Для уменьшения воздействия полимерных материалов на окружающую среду предпринимаются усилия по замене обычных полимерных материалов, получаемых из нефти, на биополимеры, например, полилактид, полисахариды, алифатические полиэфиры и полигидроксиалканоаты, которые имеют физико-химические свойства, аналогичные свойствам обычных пластмасс (Anjum, Int J Biol Macromol, 89: 161-174, 2016). Однако, микроорганизмы и способы получения таких биополимеров, практически, все еще не разработаны.
Сущность изобретения
В данном изобретении предлагается генетически модифицированный микроорганизм, способный продуцировать РНВ. В частности, в данном изобретении предлагается не встречающийся в природе микроорганизм Вуда-Льюнгдаля, содержащий (а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетилКоА, (b) фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и (с) фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в РНВ.
В одном варианте осуществления изобретения фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, представляет собой ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазу (ЕС 2.3.1.9). Например, ацетил-КоАС-ацетилтрансфераза может быть получена из
Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
В одном варианте осуществления изобретения фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3гидроксибутирил-КоА, представляет собой ацетоацетил-КоА-редуктазу (ЕС 1.1.1.36) или 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.157). Например, ацетоацетил-КоА-редуктаза может быть получена из
Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
В другом примере 3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназа может быть получена из Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum или Clostridium kluyveri.
В одном варианте осуществления изобретения фермент, который преобразует 3-гидроксибутирилКоА в полигидроксибутират, представляет собой полигидроксиалканоат-синтазу (ЕС 2.3.1.-). Например, полигидроксиалканоат-синтаза может быть получена из
Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum или Streptomyces coelicolor.
- 1 044562
В одном варианте осуществления изобретения микроорганизм является представителем рода, выбранного из группы, состоящей из: Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium,
Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa и Thermoanaerobacter. Например, микроорганизм может быть получен из родительского микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из:
Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides и Thermoanaerobacter kiuvi.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм получен из родительской бактерии, выбранной из группы, состоящей из: Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei.
В одном варианте осуществления изобретения микроорганизм потребляет газообразные субстраты, содержащие один или большее количество из: СО, CO2 и Н2. В другом варианте осуществления изобретения микроорганизм является анаэробным. В еще одном варианте осуществления изобретения микроорганизм не способен разлагать РНВ.
В данном изобретении также предлагается способ получения РНВ, включающий в себя культивирование микроорганизма по изобретению в присутствии газообразного субстрата. Например, газообразный субстрат может содержать один или большее количество из: СО, СО2 и Н2. В одном варианте осуществления изобретения культивирование проводят в анаэробных условиях. В другом варианте осуществления изобретения культивирование проводят в отсутствие углеводных субстратов. В еще одном варианте осуществления изобретения культивирование проводят в отсутствие света.
Эти и другие особенности и преимущества данного изобретения будут более понятны из нижеизложенного подробного описания, рассматриваемого в совокупности с прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется приведенными в ней формулировками, а не конкретным рассмотрением признаков и преимуществ, изложенных в данном описании.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 проиллюстрирована диаграмма, на которой изображен ферментативный путь получения полигидроксибутирата (РНВ).
На фиг. 2 проиллюстрирована карта плазмиды pPHB_01.
На фиг. 3 проиллюстрирован график, на котором изображено продуцирование РНВ в С. autoethanogenum, несущем плазмиду путем биосинтеза РНВ (pPHB_01) либо пустую плазмиду (pMTL83157) в качестве отрицательного контроля. Бактерии вырастили анаэробно в бутылках с повышенным давлением, в которых источником углерода являлись только СО и СО2. Выход РНВ (выраженный в мас.% сухой клеточной массы (СКМ)) определили методом ВЭЖХ. Значения представляют собой средние значения биологических триплетов плюс или минус стандартные отклонения относительно этих средних значений. РНВ не был обнаружен в образцах, содержащих плазмиду pMTL83157 (пустую).
На фиг. 4A-4D проиллюстрированы графики, на которых изображен рост С. autoethanogenum при различных условиях роста. Бактерии содержали пустую плазмиду (pMTL83157) либо плазмиду, содержащую путь синтеза РНВ (pPHB_01). На каждом графике проиллюстрирован различный набор условий. На фиг. 4А (условие 1) проиллюстрировано повторение условий, применяемых для получения данных, наблюдаемых на фиг. 3, с использованием газовой смеси, содержащей 50/18/3/29 CO/CO2/H2/N2 в качестве единственного источника углерода. На фиг. 4В (условие 2) проиллюстрированы идентичные условию 1 условия, но с новым газовым субстратом (50/30/10/10 CO/CO2/H2/N2). На фиг. 4С (условие 3) проиллюстрированы идентичные условию 2 условия, но с продленным временем инкубации. На фиг. 4D (условие 4) проиллюстрированы идентичные условию 3 условия, но с периодическим обновлением газового субстрата. Значения представляют собой средние значения биологических триплетов плюс или минус стандартные отклонения относительно этих средних значений.
На фиг. 5 проиллюстрирован график, на котором изображено продуцирование РНВ в С. autoethanogenum в условиях 1-4, как описано совместно с фиг. 4A-4D. Значения представляют собой средние значения биологических триплетов плюс или минус стандартные отклонения относительно этих средних значений. РНВ не был обнаружен в образцах, содержащих плазмиду pMTL83157 (пустую).
На фиг. 6 проиллюстрирован график, на котором изображено продуцирование РНВ в С. autoethano- 2 044562 genum из газообразных источников углерода при непрерывной ферментации. Бактерии конъюгировали с плазмидой pPHB_01, содержащей путь синтеза РНВ. При завершении ферментации измерили РНВ. Газовые субстраты содержали 20% водорода либо 2% водорода в составе их смесей из 50/20/20/10 СО/СО2/Н2/Аг или 50/20/2/28 CO/CO2/H2/N2, соответственно. pH поддерживали на уровне 5. Значения представляют собой средние значения в точности воспроизведенных ферментации плюс или минус стандартные отклонения относительно этих средних значений.
На фиг. 7 проиллюстрирован график, на котором изображено усиление продуцирования РНВ в С. autoethanogenum из источников газообразного углерода при непрерывной ферментации. Бактерии конъюгировали с плазмидой pPHB_01, содержащей путь синтеза РНВ. При завершении ферментации измерили РНВ. Газовые субстраты содержали 20% водорода либо 2% водорода в составе их смесей из 50/20/20/10 СО/СО2/Н2/Аг или 50/20/2/28 CO/CO2/H2/N2, соответственно. 20% водорода, низкая биомасса имела пониженную концентрацию биомассы по сравнению с другими циклами. 20% водорода, изменение pH начиналось с pH 6, а затем снизилось до 5,5. 20% водорода, pH 6 поддерживали в течение всего цикла ферментации, пока культуры не уменьшились. Значения представляют собой средние значения в точности воспроизведенных ферментаций плюс или минус стандартные отклонения относительно этих средних значений.
На фиг. 8 проиллюстрирован график, на котором изображены значения РНВ для моделирования с использованием реконструкций метаболической модели в масштабе генома (GEM). Экспериментально обнаруженный РНВ сравнивали с уровнями РНВ, предсказанными GEM, с использованием максимизации выхода РНВ. Максимизация выхода РНВ также был испытана с поглощением 2 ммоль/гСКМ/ч любого из: NADH (восстановленного никотинамидадениндинуклеотида), NADPH (восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата), Fdred (восстановленного ферредоксина) или АТР (аденозинтрифосфата). Испытанными условиями были РНВ20 (контроль); PHBLowB (низкая биомасса) и PHBpH5,5 (pH 5,5). Было установлено, что АТР ограничивает РНВ наиболее (было достигнуто наивысшее значение РНВ), за ним следует Fdred, NADPH и затем NADH. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение двух биологических повторов хемостатов.
Описание изобретения
Уже давно обнаружено, что каталитические процессы, например, процесс Фишера-Тропша, могут быть использованы для преобразования газов, содержащих диоксид углерода (CO2), монооксид углерода (СО) и/или водород (H2), например, промышленного отработанного газа или синтез-газа, в разнообразные топлива и химреагенты. Однако, в последнее время ферментация газа стала альтернативной платформой для биологической фиксации углерода таких газов. В частности, было продемонстрировано, что ацетогенные микроорганизмы (т.е. Вуда-Льюнгдаля) преобразуют газы, содержащие СО, CO2 и/или H2 в продукцию, например, этанол и 2,3-бутандиол. Целесообразность получения более сложных полимерных молекул, например, РНВ, из этих газов является хорошо обоснованной (Drzyzga, J Chem Technol Biotechnol, 90: 1735-1751, 2015). Однако, путь Вуда-Льюнгдаля работает на термодинамической границе жизни (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), что затрудняет накопление микроорганизмами ВудаЛьюнгдаля достаточного количества углерода даже для роста и поддержания клеток, продуцируется гораздо меньше сложных углеродных продуктов. Эти метаболические проблемы усугубляются плохим растворением газообразных субстратов (например, СО, CO2 и/или H2) в ферментационных средах по сравнению с углеводными или сахарными субстратами. Поэтому представляется маловероятным, что микроорганизмы Вуда-Льюнгдаля могут быть сконструированы с возможностью синтеза РНВ или других полигидроксиалканоатов, тем более, что эти полимеры изначально продуцируются такими видами, как Rhodospirillum rubrum и Cupriavidus necator в качестве средств для хранения избытка углерода. Действительно, на сегодняшний день попытки создать ацетогенные микроорганизмы для получения РНВ из CO2 и/или H2 были безуспешными (европейский проект SYNPOL, биополимеры из брожения синтезгаза, 2012-2017).
Однако, после кропотливых исследований и инженерных разработок авторы изобретения достигли первого в мире синтеза РНВ в микроорганизмах Вуда-Льюнгдаля. Это является важной вехой на пути к получению возобновляемых и устойчивых биополимеров.
В первом аспекте, в данном изобретении предлагается микроорганизм Вуда-Льюнгдаля, способный продуцировать РНВ. Во втором аспекте, в данном изобретении предлагается способ получения РНВ посредством культивирования вышеупомянутого микроорганизма Вуда-Льюнгдаля в присутствии газообразного субстрата.
Путь
Поскольку микроорганизмы Вуда-Льюнгдаля нативно не продуцируют РНВ, получение РНВ в микроорганизме Вуда-Льюнгдаля требует введения по меньшей мере одного гетерологичного фермента. Микроорганизм по изобретению, как правило, содержит три гетерологичных фермента, а именно: (а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, (b) фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и (с) фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в полигидроксибутират. Этот путь проиллюстрирован на фиг. 1.
(1) Преобразование ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА
- 3 044562
Преобразование ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА может быть катализировано любым подходящим ферментом. Хотя возможно, что нативная активность для этой реакции может присутствовать в некоторых ацетогенных бактериях, как правило, необходимо вводить гетерологичный (т.е. не нативный) фермент, чтобы катализировать эту реакцию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазу (также известную как тиолазу или 3кетотиолазу), которая имеет активность, определяемую ЕС 2.3.1.9 (т.е. 2-ацетилКоА^КоА+ацетоацетил-КоА). Ацетил-КоА-С-ацетилтрансфераза может быть получена из любого подходящего микроорганизма-хозяина, например,
Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
В частности, ацетил-КоА-С-ацетилтрансфераза может представлять собой или может быть получена из Acinetobacter baumannii PhaA (SCZ16966), Aeromonas hydrophilia PhaA (WP_043162470), Alcaligenes latus PhaA (AAC83659), Arthrospira platensis PhaA (WP_006617472), Bacillus subtilis PhaA (CUB52080), Burkholderia cepacia PhaA (WP_043187452), Clostridium acetobutylicum Th1A (WP_0109661571), Cupriavidus necator PhaA (WP_013956452.1), Cupriavidus necator BktB (WP_011615089.1), Cupriavidus necator phaA (WP_010810132.1), Escherichia coli AtoB (NP_416728.1), Haloferax mediterranei PhaA (WP_004059344), Pseudomonas aeruginosa PhaA (WP_038823536), Pseudomonas fluorescens PhaA (WP_073525707), Pseudomonas mandelii PhaA (WP_019582144), Pseudomonas oleovorans PhaA (WP_074859314), Pseudomonas putida PhaA (WP_058540218) или Streptomyces coelicolor PhaA (WP_011030221).
(2) Преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА
Преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА может быть катализировано любым подходящим ферментом. Хотя возможно, что нативная активность для этой реакции может присутствовать в некоторых ацетогенных бактериях, как правило, необходимо вводить гетерологичный (т.е. не нативный) фермент, чтобы катализировать эту реакцию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой ацетоацетил-КоА-редуктазу, которая обладает активностью, определяемой ЕС 1.1.1.36 (т.е. (R)-3-гидроксиацил-КоА + NADP+θ3-оксоацил-КоА+NADPH+Н+). Ацетоацетил-КоА-редуктаза может быть получена из любого подходящего микроорганизма-хозяина, например,
Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
В частности, ацетоацетил-КоА-редуктаза может представлять собой Acinetobacter baumannii PhaB (WP_095389464), Aeromonas hydrophilia PhaB (WP_041216919), Alcaligenes latus PhaB (AAC83660), Arthrospira platensis PhaB (WP_043469113), Bacillus subtilis PhaB (WP_070548955), Burkholderia cepacia PhaB (WP_059234032), Cupriavidus necator PhaB (WP_010810131.1), Haloferax mediterranei PhaB (WP_004572392), Pseudomonas aeruginosa PhaB (WP_031690879), Pseudomonas fluorescens PhaB (WP_030141425), Pseudomonas mandelii PhaB (WP_094467462), Pseudomonas oleovorans PhaB (WP_074858624), Pseudomonas putida PhaB (BAB96554) или Streptomyces coelicolor PhaB (WP_011027734). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, которая имеет активность, определяемую ЕС 1.1.1.157 (т.е. (S)-3-гидроксибутаноил-КоА+NADP+=3-ацетоацетил-КоА+NADPH+Н+). 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой или может быть получена из любого подходящего микроорганизма-хозяина, например, Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum или Clostridium kluyveri. В частности, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой Clostridium beijerinckii Hbd (WP_011967675.1), Clostridium acetobutylicum Hbd (NP_349314.1) или Clostridium kluyveri Hbd1 (WP_011989027.1).
Предпочтительно, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, является ^-специфическим, т.е. продуцирует (R)-3-гидроксибутирил-КоА, так как (R)-3гидроксибутирил-КоА является типичным субстратом для ферментативного продуцирования РНВ. Однако, в некоторых случаях, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА,
- 4 044562 является (S)-специфическим, т.е. продуцирует (S)-3-гидроксибутирил-КоА. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что нативная или введенная эпимеразная активность в ацетогенной бактерии может позволить взаимопреобразования (S)- и (R)-3гидроксибутирил-КоА, например, (S)-3-гидроксибуmирил-КоА может быть преобразован в (R)-3гидроксибутирил-КоА, который затем может быть преобразован в РНВ.
(3) Преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в РНВ
Преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в РНВ может быть катализировано любым подходящим ферментом. Хотя возможно, что нативная активность для этой реакции может присутствовать в некоторых ацетогенных бактериях, как правило, необходимо вводить гетерологичный (т.е. не нативный) фермент, чтобы катализировать эту реакцию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой полигидроксиалканоат-синтазу, которая обладает активностью, определяемой ЕС 2.3.1.-, например, ЕС 2.3.1.В2 (тип I) (т.е. 3-гидроксибутирил-КоА+ [(R)-3-гидроксибутаноат]n= [(R)-3-гидроксибутаноат]n+1+ КоА), ЕС 2.3.1.В3 (тип II) (т.е. 3-гидроксиацил-КоА+[(R)-3гидроксиацил]n=[(R)-3-гидроксиацил]n+1+КоА) или ЕС 2.3.1.В4 (тип III) (т.е. 3-гидроксиацил-КоА+[(R)3-гидроксиацил]n=[(R)-3-гидроксиацил]n+1+КоА). Этот фермент также может упоминаться как полигидроксиалканоат-полимераза, полигидроксибутират-синтаза, полигидроксибутират-полимераза и аналогичными терминами. Полигидроксиалканоат-синтаза может быть получена из любого подходящего микроорганизма-хозяина, например,
Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae,
Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum или Streptomyces coelicolor.
В частности, полигидроксиалканоат-синтаза может представлять собой или может быть получена из Acinetobacter baumannii PhaC (SCY71072), Aeromonas caviae PhaC (WP_045524574), Aeromonas hydrophilia PhaC1 (WP_017780191) или PhaC2 (AAV41872), Alcaligenes latus PhaC (WP_084267317), Arthrospira platensis PhaC (WP_006617456), Bacillus subtilis PhaC (CUB58881), Burkholderia cepacia PhaC (WP_027784567), Cupriavidus necator PhaC (WP_011615085 или WP_013956451.1), Haloferax mediterranei PhaC (WP_004056138), Pseudomonas aeruginosa PhaC1 (WP_038823539) или PhaC2 (WP_025271419), Pseudomonas fluorescens PhaC1 (WP_057399292) or PhaC2 (WP_030141001), Pseudomonas mandelii PhaC1 (WP_094467460) или PhaC2 (WP_010465951), Pseudomonas oleovorans PhaC1 (AAL17611) или PhaC2 (WP_037049875), Pseudomonas putida PhaC1 (BAB96552) или PhaC2 (WP_029886362), Pseudomonas sp. 61-3 PhaC1 (BAA36198) или PhaC2 (BAA36202), Rhodospirillum rubrum PhaC1 (WP_011388028), PhaC2 (WP_011390166), или PhaC3 (WP011398569), или Streptomyces coelicolor PhaC.
В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или большее количество деструктивных мутаций могут быть введены в один или большее количество эндогенных ферментов для уменьшения или устранения конкуренции с введенными гетерологичными ферментами. В частности, деструктивная мутация представляет собой мутацию, которая уменьшает или устраняет (т.е., разрушает) экспрессию или активность гена или фермента. Деструктивная мутация может частично деактивировать, полностью деактивировать или удалить ген или фермент. Деструктивная мутация может представлять собой нокаутную (КО) мутацию. Деструктивная мутация может представлять собой любую мутацию, которая снижает, предотвращает или блокирует биосинтез продукта, продуцируемого ферментом. Деструктивная мутация может включать в себя, например, мутацию в гене, кодирующем фермент, мутацию в генетическом регуляторном элементе, участвующем в экспрессии гена, кодирующего фермент, введение нуклеиновой кислоты, которая продуцирует белок, который уменьшает или ингибирует активность фермента, или введение нуклеиновой кислоты (например, антисмысловой РНК, миРНК, направляющей РНК) и/или белка (например, белка Cas), который ингибирует экспрессию фермента. Деструктивная мутация может быть введена с использованием любого способа, известного в данной области техники.
Например, микроорганизм по изобретению может иметь деструктивную мутацию в эндогенном ферменте тиоэстеразе. У Clostridium autoethanogenum были идентифицированы три предполагаемые тиоэстеразы: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза) и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как предполагаемая тиоэстераза). У Clostridium ljungdahlii были также идентифицированы три предполагаемые тиоэстеразы: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза). Дест- 5 044562 руктивная мутация может влиять на любую из этих тиоэстераз или любые другие тиоэстеразы, которые могут быть эндогенными для микроорганизма по изобретению.
Микроорганизм
Микроорганизм представляет собой микроскопический организм, в частности, бактерию, архею, вирус или грибок. Микроорганизм по данному изобретению, как правило, представляет собой бактерию. В контексте данного изобретения следует считать, что термин микроорганизм включает в себя термин бактерия.
Микроорганизм по изобретению не встречается в природе. Подразумевается, что термин не встречающийся в природе при применении в отношении микроорганизма означает, что указанный микроорганизм имеет по меньшей мере одну генетическую модификацию, не встречающуюся в природном штамме перечисленных видов, в том числе в штаммах дикого типа перечисленных видов. Не встречающиеся в природе микроорганизмы, как правило, разрабатывают в лаборатории или исследовательском центре. В отличие от этого, термин дикий тип относится к типичной форме организма, штамма, гена или характеристики, в какой они встречаются в природе.
Термины генетическая модификация, генетическое изменение или генная инженерия в широком смысле относятся к манипулированию геномом или нуклеиновыми кислотами микроорганизма руками человека. Аналогичным образом, термины генетически модифицированный, генетически измененный или генетически сконструированный относятся к микроорганизму, содержащему такую генетическую модификацию, генетическое изменение или генетическое конструирование. Эти термины могут быть использованы для разграничения созданного в лаборатории микроорганизма от встречающегося в природе микроорганизма. Способы генетической модификации включают в себя, например, экспрессию гетерологичного гена, вставку или делецию гена или промотора, мутацию нуклеиновой кислоты, экспрессию или инактивацию измененного гена, ферментную инженерию, направленное развитие, конструирование на основе знаний, способы случайного мутагенеза, генную перетасовку и оптимизацию кодонов.
Рекомбинантный означает, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм является продуктом генетической модификации, инженерии или рекомбинации. В целом, термин рекомбинантный относится к нуклеиновой кислоте, белку или микроорганизму, который содержит или кодируется генетическим материалом, полученным из нескольких источников, например, двух или большего количества разных штаммов или видов микроорганизмов. Микроорганизм по данному изобретению, как правило, является рекомбинантным.
Термин полученный из означает, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм модифицированы или адаптированы из отличной (например, родительского или дикого типа) нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма с целью получения новой нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма. Такие модификации или адаптации, как правило, включают в себя вставку, делецию, мутацию или замену нуклеиновых кислот или генов. В целом, микроорганизм по изобретению получают из родительского микроорганизма, который представляет собой микроорганизм, используемый для создания микроорганизма по изобретению. Родительский микроорганизм может быть встречающимся в природе микроорганизмом (т.е. микроорганизмом дикого типа) или микроорганизмом, который был предварительно модифицирован (т.е. мутантным или рекомбинантным микроорганизмом). Микроорганизм по изобретению может быть модифицирован для экспрессии или сверхэкспрессии одного или большего количества ферментов, которые не были экспрессированы или сверхэкспрессированы в родительском микроорганизме. Аналогично, микроорганизм по изобретению может быть модифицирован для включения в него одного или большего количества генов, которые не были включены в него родительским микроорганизмом. Микроорганизм по изобретению также может быть модифицирован, чтобы не экспрессировать или экспрессировать меньшие количества одного или большего количества ферментов, которые были экспрессированы в родительском микроорганизма. В одном варианте осуществления изобретения микроорганизм по изобретению получен из родительского микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из: Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по изобретению получен из родительского микроорганизма Clostridium autoethanogenum LZ1561, который был депонирован 7 июня 2010 года в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ), расположенной в Inhoffenstrae 7B, D-38124 Braunschwieg, Германия 7 июня 2010 года в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры с предоставленным инвентарным номером DSM23693. Этот штамм описан в международной патентной заявке № PCT/NZ2011/000144, которая опубликована как WO 2012/015317.
Микроорганизм по данному изобретению может быть дополнительно классифицирован на основе функциональных характеристик. Например, микроорганизм по данному изобретению может представлять собой или может быть получен из микроорганизма Вуда-Льюнгдаля, С1-фиксирующего микроорганизма, анаэроба, ацетогена, этанологена и/или карбоксидотрофа. В табл. 1 приведен репрезентативный перечень микроорганизмов и указаны их функциональные характеристики.
- 6 044562
Таблица 1
| Вуда-Льюнгдаля | С1 -фиксирующий микроорганизм | Анаэроб | Ацетоген | Этанологен | Автотроф | Карбоксидотроф | |
| Acetobacterium woodii | + | + | + | + | +/-1 | + | - |
| Alkalibaculum bacchii | + | + | + | + | + | + | + |
| Blautia producta | + | + | + | + | - | + | + |
| Butyribacterium methylotrophicum | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium aceticum | + | + | + | + | - | + | + |
| Clostridium autoethanogenum | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium carboxidivorans | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium coskatii | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium drakei | + | + | + | + | - | + | + |
| Clostridium formicoaceticum | + | + | + | + | - | + | + |
| Clostridium Ijungdahlii | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium magnum | + | + | + | + | - | + | +/-2 |
| Clostridium ragsdalei | + | + | + | + | + | + | + |
| Clostridium scatologenes | + | + | + | + | - | + | + |
| Eubacterium limosum | + | + | + | + | - | + | + |
| Moorella thermautotrophica | + | + | + | + | + | + | + |
| Moorella thermoacetica (ранее Clostridium thermoaceticum) | + | + | + | + | 3 | + | + |
| Oxobacter pfennigii | + | + | + | + | - | + | + |
| Sporomusa ovata | + | + | + | + | - | + | +/-4 |
| Sporomusa silvacetica | + | + | + | + | - | + | +/-5 |
| Sporomusa sphaeroides | + | + | + | + | - | + | +/-6 |
| Thermoanaerobacter kiuvi | + | + | + | + | - | + | - |
Acetobacterium woodi может продуцировать этанол из фруктозы, но не из газа.
2Не было исследовано, можно ли выращивать Clostridium magnum на СО.
3Сообщалось, что один штамм из Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, продуцирует этанол из газа.
4Не было исследовано, можно ли выращивать Sporomusa ovata на СО.
5Не было исследовано, можно ли выращивать Sporomusa silvacetica на СО.
6Не было исследовано, можно ли выращивать Sporomusa sphaeroides на СО.
Термин Вуда-Льюнгдаля относится к пути фиксации углерода Вуда-Льюнгдаля, описанном, например, в Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008. Микроорганизмы Вуда-Льюнгдаля, предсказуемо, относятся к микроорганизмам, составляющим путь Вуда-Льюнгдаля. В целом, микроорганизм по изобретению составляет нативный путь Вуда-Льюнгдаля. В контексте данного изобретения путь Вуда-Льюнгдаля может быть нативным, немодифицированным путем Вуда-Льюнгдаля или он может быть путем Вуда-Льюнгдаля с некоторой степенью генетической модификации (например, сверхэкспрессией, гетерологической экспрессией, нокаутом и т.д.) при условии, что он по-прежнему функционирует для преобразования СО, СО2 и/или Н2 в ацетил-КоА.
С1 относится к молекуле с одним атомом углерода, например, СО, СО2 или СН3ОН. Clоксигенат относится к молекуле с одним атомом углерода, которая также содержит по меньшей мере один атом кислорода, например, СО, СО2 или СН3ОН. Источник Cl-углерода относится к молекуле с одним атомом углерода, которая служит частичным или единственным источником углерода для микроорганизма по данному изобретению. Например, источник С1-углерода может включать в себя одно или большее количество соединений, выбранных из СО, СО2, СН3ОН или СН2О2. Источник С1-углерода предпочтительно включает в себя одно или большее количество соединений, выбранных из СО и СО2. С1-фиксирующий микроорганизм представляет собой микроорганизм, способный продуцировать один или большее количество продуктов из источника С1-углерода. Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой С1-фиксирующую бактерию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получают из С1-фиксирующего микроорганизма, приведенного в табл. 1. Для целей данного изобретения метан (СН4) мог бы рассматриваться как источник С1-углерода, но только если бактерия по данному изобретению была сконструирована так, чтобы она составляла метаболический путь метана, как описано, например, в WO 2016/138050, поскольку ацетогенные бактерии не способны к нативному использованию метана в качестве источника углеро да.
Анаэроб представляет собой микроорганизм, не требующий кислорода для роста. Анаэроб может реагировать негативно или даже умереть при наличии кислорода выше определенного порогового значения. Однако, некоторые анаэробы способны выдерживать низкие уровни кислорода (например, 0,0000015% кислорода). Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой анаэроб. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получают из анаэроба, приведенного в табл. 1.
Ацетогены представляют собой облигатно-анаэробные бактерии, использующие путь ВудаЛьюнгдаля в качестве их основного механизма для сохранения энергии и синтеза ацетил-КоА и продуктов, полученных из ацетил-КоА, например, ацетата (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Ацетогены используют путь Вуда-Льюнгдаля в качестве (1) механизма для восстановительного синтеза ацетил-КоА из CO2, (2) терминального электроноакцепторного, энергосберегающего процесса, (3) механизма для фиксации (ассимиляции) CO2 при синтезе клеточного углерода (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). Все встречающиеся в природе ацетогены являются С1-фиксирующими, анаэробными, автотрофными и неметанотрофными. Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой ацетоген. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получен из ацетогена, приведенного в табл. 1.
Этанологен представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать этанол. Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой этанологен. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получен из этанологена, приведенного в табл. 1.
Автотроф представляет собой микроорганизм, способный расти в отсутствие органического углерода. Вместо этого автотрофы используют неорганические источники углерода, например, СО и/или СО2. Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой автотроф. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получен из автотрофа, приведенного в табл. 1.
Карбоксидотроф представляет собой микроорганизм, способный использовать СО в качестве единственного источника углерода и энергии. Как правило, микроорганизм по данному изобретению представляет собой карбоксидотроф. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получен из карбоксидотрофа, приведенного в табл. 1.
В более широком смысле, микроорганизм по данному изобретению может быть получен из микроорганизмов любого рода или вида, приведенных в табл. 1. Например, микроорганизм может быть представителем рода, выбранного из группы, состоящей из: Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa и Thermoanaerobacter. В частности, микроорганизм может быть получен из родительской бактерии, выбранной из группы, состоящей из:
Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta,
Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides и Thermoanaerobacter kiuvi.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм по данному изобретению получают из кластера Clostridia, включающего в себя виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Такие виды были впервые описаны и охарактеризованы Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii) и Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).
Эти виды имеют много общего. В частности, все эти виды являются С1-фиксирующими, анаэробными, ацетогенными, этанологичными и карбоксидотрофными представителями рода Clostridium. Такие виды имеют аналогичные генотипы и фенотипы и способы сохранения энергии и ферментативного метаболизма. Кроме того, эти виды объединены в кластеры в группе I гомологии клостридиальной рРНК с 16S рРНК ДНК, идентичной более чем на 99%, имеют содержание ДНК G+С, составляющее около 2230% мол., являются грамположительными, имеют аналогичную морфологию и размер (логарифмически растущие клетки в интервале между 0,5-0,7х3-5 мкм), являются мезофильными (оптимально растут при температуре 30-37°С), имеют аналогичные диапазоны pH около 4-7,5 (при оптимальном значении pH около 5,5-6), не содержат цитохромов и сохраняют энергию посредством комплекса Rnf. Кроме того, как
- 8 044562 было показано, у этих видов происходит восстановление карбоновых кислот с образованием их соответствующих спиртов (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Важно отметить, что все эти виды также демонстрируют сильный автотрофный рост на СО-содержащих газах, продуцируют этанол и ацетат (или уксусную кислоту) в качестве основных продуктов ферментации и при определенных условиях продуцируют в небольших количествах 2,3-бутандиол и молочную кислоту.
Однако, эти виды также имеют целый ряд различий. Эти виды были выделены из разных источников: Clostridium autoethanogenum - из кишечника кролика, Clostridium ljungdahlii - из отходов курятников и Clostridium ragsdalei - из пресноводных осадочных отложений. Эти виды отличаются по утилизации различных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) и других субстратов (например, бетаина, бутанола). Кроме того, эти виды отличаются по ауксотрофии к определенным витаминам (например, тиамину, биотину). Эти виды имеют различия в последовательностях нуклеиновых кислот и аминокислот генов и белков, использующих путь Вуда-Льюнгдаля, хотя, как было обнаружено, общая организация и количество этих генов и белков одинаковы у всех видов (Корке, Curr Opin Biotechnol, 22:320-325,2011).
Таким образом, в заключение, многие из характеристик Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei не являются специфическими для этих видов, но представляют собой достаточно общие характеристики для этого кластера С1-фиксирующих, анаэробных, ацетогенных, этанологичных и карбоксидотрофных представителей рода Clostridium. Однако, поскольку в действительности эти виды отличаются, генетическая модификация или манипулирование одним из этих видов может не иметь идентичного эффекта в другом из этих видов. Например, могут наблюдаться различия в росте, производительности или продуцировании продукта.
Микроорганизм по данному изобретению также может быть получен из изолята или мутанта Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Изоляты и мутанты Clostridium autoethanogenum включают в себя JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) и LZ1561 (DSM23693) (WO 2012/015317). Изоляты и мутанты Clostridium ljungdahlii включают в себя АТСС 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5,593,886), C-01 (ATCC 55988) (US 6,368,819), 0-52 (ATCC 55989) (US 6,368,819) и OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Изоляты и мутанты Clostridium ragsdalei включают в себя PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).
Предпочтительно, микроорганизм по изобретению не является фототрофным или фотосинтезирующим. Предпочтительно, микроорганизм по изобретению не является метанотрофным.
Предпочтительно, микроорганизм по изобретению не является представителем рода Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Cupriavidus (Ralstonia), Rhizobium, Rhodospirillum или Pseudomonas. В частности, микроорганизм по изобретению предпочтительно не происходит от Rhodospirillum rubrum, Bacillus cereus, Cupriavidus necator (ранее Ralstonia eutropha) или Pseudomonas putida. В других вариантах осуществления изобретения микроорганизм по изобретению предпочтительно не получен из Escherichia coli.
Ферменты
Эндогенный или нативный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который присутствует или экспрессирован в микроорганизме дикого типа или родительском микроорганизме, из которого получают микроорганизм по данному изобретению. Например, эндогенный ген или белок представляет собой ген или белок, который нативно присутствует в микроорганизме дикого типа или родительском микроорганизме, из которого получают микроорганизм по данному изобретению. В одном варианте осуществления изобретения экспрессию эндогенного гена можно регулировать посредством экзогенного регуляторного элемента, например, экзогенного промотора.
Экзогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который образовывается вне микроорганизма по изобретению. Например, экзогенный ген или фермент может быть создан искусственно или рекомбинантно и введен в или экспрессирован в микроорганизме по данному изобретению. Экзогенный ген или фермент также может быть выделен из гетерологичного микроорганизма и введен в или экспрессирован в микроорганизме по данному изобретению. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть адаптированы, чтобы интегрировать их в геном микроорганизма по данному изобретению или оставить их во внехромосомном состоянии в микроорганизме по данному изобретению, например, в плазмиде.
Гетерологический относится к нуклеиновой кислоте или белку, который отсутствует в микроорганизме дикого типа или родительском микроорганизме, из которого получают микроорганизм по данному изобретению. Например, гетерологический ген или фермент может быть получен из отличного штамма или видов и введен в или экспрессирован в микроорганизме по данному изобретению.
Как правило, по меньшей мере один из ферментов, которые (а) преобразуют ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, (b) преобразуют ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА или (с) преобразуют 3гидроксибутирил-КоА в РНВ является гетерологичным (т.е. не нативным) по отношению к бактерии. Например, один, два или все три из этих ферментов могут быть гетерологичными (т.е. не нативными) по отношению к бактерии. Однако, если бактерия обладает нативной ферментативной активностью для одной или большего количества из этих стадий, то, возможно, не обязательно вводить гетерологичные
- 9 044562 ферменты для катализа этих стадий.
В контексте данного изобретения термин экспрессия относится к процессу, посредством которого полинуклеотид транскрибируется с матрицы ДНК (например, в мРНК или другой РНК-транскрипт), и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК впоследствии транслируется в пептиды, полипептиды или белки.
Ферментативная активность или просто активность в широком смысле относится к ферментативной активности, включая, но не ограничиваясь ими: к активности фермента, количеству фермента или доступности фермента, необходимого для катализирования реакции. Соответственно, увеличение ферментативной активности включает в себя увеличение активности фермента, увеличение количества фермента или повышение доступности фермента, необходимого для катализирования реакции. Аналогично, уменьшение ферментативной активности включает в себя уменьшение активности фермента, уменьшение количества фермента или уменьшение доступности фермента, необходимого для катализирования реакции.
Оптимизация кодонов относится к мутации нуклеиновой кислоты, например, генной, для оптимизированной или улучшенной трансляции нуклеиновой кислоты в конкретном штамме или видах. Оптимизация кодонов может привести к увеличенным скоростям трансляции или более высокой точности трансляции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гены по изобретению оптимизированы по кодонам для экспрессии в Clostridium, в частности, в Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. В контексте данного документа термины оптимизированные по кодонам и адаптированные по кодонам могут быть использованы взаимозаменяемо.
Термин варианты включает в себя нуклеиновые кислоты и белки, чья последовательность варьируется от последовательности эталонной нуклеиновой кислоты и белка, например, последовательности эталонной нуклеиновой кислоты и белка, раскрытых в предшествующем уровне техники или приведенных в качестве примера в данном документе. Данное изобретение может быть осуществлено на практике с использованием вариантных нуклеиновых кислот или белков, которые выполняют по существу ту же функцию, что и у эталонной нуклеиновой кислоты или белка. Например, вариантный белок может выполнять по существу ту же функцию или катализировать по существу ту же реакцию, что и эталонный белок. Вариантный ген может кодировать тот же или по существу тот же белок, что и эталонный ген. Вариантный промотор может обладать по существу такой же способностью стимулировать экспрессию одного или большего количества генов, что и эталонный промотор.
Такие нуклеиновые кислоты или белки могут упоминаться в данном документе как функционально эквивалентные варианты. Например, функционально эквивалентные варианты нуклеиновой кислоты могут включать в себя аллельные варианты, фрагменты гена, мутированные гены, полиморфизмы и аналогичные варианты. Гомологичные гены из других микроорганизмов также являются примерами функционально эквивалентных вариантов. Они могут включать в себя гомологичные гены в таких видах, как Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii или Clostridium ljungdahlii, подробности о которых общедоступны на веб-сайтах, например, GenBank или NCBI. Функционально эквивалентные варианты также включают в себя нуклеиновые кислоты, последовательность которых варьируется в результате оптимизации кодонов для конкретного микроорганизма. Функционально эквивалентный вариант нуклеиновой кислоты предпочтительно будет иметь по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или более идентичности последовательности нуклеиновой кислоты (процент гомологии) с эталонной нуклеиновой кислотой. Функционально эквивалентный вариант белка предпочтительно будет иметь по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или более идентичности аминокислоты (процент гомологии) с эталонным белком. Функциональная эквивалентность варианта нуклеиновой кислоты или белка может быть оценена с использованием любого способа, известного в данной области техники.
Ферменты, описанные в данном документе, как правило, экспрессируются из нуклеиновой кислоты, которая была введена в микроорганизм по данному изобретению. Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в микроорганизм по данному изобретению с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в виде голых нуклеиновых кислот или могут быть составлены с одним или большим количеством агентов, например, липосомами. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК, РНК, кДНК или их комбинации, в зависимости от ситуации. В определенных вариантах осуществления изобретения могут быть использованы ингибиторы ограничения. Дополнительные векторы могут включать в себя плазмиды, вирусы, бактериофаги, космиды и искусственные хромосомы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновые кислоты доставляются в микроорганизм по данному изобретению с использованием плазмиды. Например, преобразование (включая трансдукцию или трансфекцию) может быть достигнуто посредством электропорации, ультразвука, опосредованной полиэтиленгликолем трансформации, химической или физической компетенции, трансформации протопластов, профаговой индукции или конъюгации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, имеющих активные системы рестрикционных ферментов, это может быть необходимо для метилирования нуклеиновой кислоты перед введением нук- 10 044562 леиновой кислоты в микроорганизм.
Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть сконструированы таким образом, чтобы они включали в себя регуляторный элемент, например, промотор, чтобы увеличить или иным образом контролировать экспрессию конкретной нуклеиновой кислоты. Промотор может быть конститутивным промотором или индуцируемым промотором. В идеальном варианте, промотор представляет собой промотор пути Вуда-Льюнгдаля, промотор ферредоксина, промотор пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы, промотор оперона Rnf-комплекса, промотор оперона АТФ-синтазы или промотор оперона фосфотрансацетилазы/ацетаткиназы.
Субстраты
Субстрат относится к источнику углерода и/или энергии для микроорганизма по данному изобретению. Как правило, субстрат является газообразным и содержит источник С1-углерода, например, СО и/или CO2. Предпочтительно, субстрат содержит источник С1-углерода в виде СО или СО+СО2. Субстрат может дополнительно содержать другие неуглеродные компоненты, например, Н2, N2 или электроны.
В целом, субстрат содержит по меньшей мере некоторое количество СО, например, около 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% мол. СО. Субстрат может содержать СО в диапазоне, например, около 20-80, 30-70 или 40-60% мол. СО. Предпочтительно, субстрат содержит около 40-70% мол. СО (например, газа сталелитейных заводов или доменный газ), около 20-30% мол. СО (например, газ конвертерной печи) или около 15-45% мол. СО (например, синтез-газ). В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат может содержать относительно низкое количество СО, например, около 1-10 или 1-20% мол. СО. Микроорганизм по данному изобретению, как правило, преобразует по меньшей мере часть СО в субстрате в продукт. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат не содержит или по существу не содержит (<1% мол.) СО.
Субстрат может содержать некоторое количество H2. Например, субстрат может содержать около 1, 2, 5, 10, 15, 20 или 30% мол. H2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат может содержать относительно высокое количество H2, например, около 60, 70, 80 или 90% мол. H2. В дополнительных вариантах осуществления изобретения субстрат не содержит или по существу не содержит (<1% мол.) H2.
Субстрат может содержать некоторое количество CO2. Например, субстрат может содержать около 1-80 или 1-30% мол. CO2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат может содержать менее чем около 20, 15, 10 или 5% мол. CO2. В другом варианте осуществления изобретения субстрат не содержит или по существу не содержит (<1% мол.) CO2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рост штамма, продуцирующего РНВ, сравнивают с ростом контрольного штамма (пустой плазмиды или ЕР) с использованием двух различных газовых смесей, содержащих СО и СО2, с 20% Н2 по подобию синтез-газа (50% СО, 20% СО2, 20% Н2, 10% аргона), обозначенных как условия РНВ20 и ЕР20, соответственно, или 2% H2 по подобию отходящего газа сталелитейных заводов (50% СО, 20% CO2, 2% H2, 28% азота), обозначенных как условия РНВ2 и ЕР2, соответственно.
Хотя, как правило, субстрат является газообразным, указанный субстрат также может быть предложен в альтернативных формах. Например, субстрат может быть растворен в жидкости, насыщенной СОсодержащим газом, с использованием дисперсионного генератора микропузырьков. В качестве дополнительного примера, субстрат может быть адсорбирован на твердой подложке.
Субстрат и/или источник С1-углерода может представлять собой отработанный газ, полученный в виде побочного продукта промышленного процесса или из какого-либо другого источника, например, из выхлопных газов автомобилей или от газификации биомассы. В определенных вариантах осуществления изобретения промышленный процесс выбран из группы, состоящей из: производства продукции черных металлов, например, сталелитейного производства, производства продукции из цветных металлов, переработки нефти, газификации угля, производства электроэнергии, производства чистого углерода, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В этих вариантах осуществления изобретения субстрат и/или источник С1-углерода может быть извлечен из промышленного процесса перед его выбросом в атмосферу с применением любого удобного способа.
Субстрат и/или источник С1-углерода может представлять собой синтез-газ, например, синтез-газ, полученный при газификации угля или остатков нефтеперерабатывающих заводов, газификации биомассы или лигноцеллюлозного материала или при риформинге природного газа. В другом варианте осуществления изобретения синтез-газ может быть получен в результате газификации твердых бытовых отходов или твердых промышленных отходов.
Композиция субстрата может оказывать значительное влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, присутствие кислорода (О2) может понизить эффективность процесса анаэробной ферментации. В зависимости от композиции субстрата может быть желательным обработать, очистить или отфильтровать субстрат для удаления любых нежелательных примесей, например, токсинов, нежелательных компонентов или частиц пыли, и/или для увеличения концентрации желаемых компонентов.
В определенных вариантах осуществления изобретения ферментацию или культивирование прово- 11 044562 дят в отсутствие углеводных субстратов, например, сахара, крахмала, лигнина, целлюлозы или гемицеллюлозы.
В контексте данного документа термин PHBLowB используется для отсылки к экспериментам с использованием более низкой устойчивой концентрации биомассы, например, в 3 раза более низкой устойчивой концентрации биомассы. В контексте данного документа термин PHBpH5,5 используется для отсылки к экспериментам, проводимым при pH 5,5. См. фиг. 8.
Продукты
Микроорганизм по изобретению может быть выращен для получения одного или большего количества продуктов. В частности, микроорганизм по изобретению может продуцировать РНВ или его предшественников, например, ацетоацетил-КоА или 3-гидроксибутирил-КоА.
РНВ представляет собой полимер 3-гидроксибутиратных мономеров. РНВ, полученный в соответствии с изобретением, может содержать любое количество 3-гидроксибутиратных мономеров, например, около 10-1000000 мономеров. В качестве дополнительных примеров, РНВ может содержать около 10100000 мономеров, 100-100000 мономеров, 100-10000 мономеров, 500-5000 мономеров, 1000-10000 мономеров или 5000-20000 мономеров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения РНВ содержит около 100-12000 мономеров.
Молекулярная масса РНВ, продуцируемого бактерией по данному изобретению, может находиться в диапазоне около 1000-100000000 Да. Например, молекулярная масса РНВ может составлять около 1000-10000 Да, 10000-1000000 Да, 10000-10000000 Да или 10000000-100000000 Да. Предпочтительно, молекулярная масса РНВ может составлять около 10000-1000000 Да, например, 10000-100000 Да, 10000500000 Да, 100000-500000 Да, 300000-800000 Да или 500000-1000000 Да.
Продуцирование РНВ часто называется процентной долей сухой клеточной массы. Микроорганизм по изобретению может продуцировать, например, 0,005-0,995 мас.% РНВ. Предпочтительно, микроорганизм по изобретению продуцирует около 0,01 мас.%, 0,1 мас.%, 0,5 мас.%, 1 мас.%, 1,5 мас.%, 2 мас.%, 3 мас.%, 5 мас.%, 10 мас.%, 20 мас.%, 30 мас.%, 40 мас.%, 50 мас.%, 60 мас.%, 70 мас.%, 80 мас.%, 90 мас.% или 95 мас.% РНВ.
Физические характеристики РНВ хорошо известны в данной области техники. В грубом приближении РНВ имеет модуль Юнга, составляющий 1497-3500 МПа, предел прочности на разрыв, составляющий 18-43 МПа, относительное удлинение при разрыве, составляющее 1,9-45%, кристалличность, составляющую 60-80%, температуру плавления, составляющую 162-180°С, температуру кристаллизации, составляющую 45-116°С и/или температуру стеклования, составляющую -1,2-10°С.
Кроме того, микроорганизм по изобретению может также продуцировать или может быть генетически сконструирован для продуцирования других продуктов, например, этанола (WO 2007/117157), ацетата (WO 2007/117157), бутанола (WO 2008/115080 и WO 2012/053905), бутирата (WO 2008/115080), 2,3бутандиола (WO 2009/151342 и WO 2016/094334), лактата (WO 2011/112103), бутена (WO 2012/024522), бутадиена (WO 2012/024522), метилэтилкетона (2-бутанона) (WO 2012/024522 и WO 2013/185123), этилена (WO 2012/026833), ацетона (WO 2012/115527), изопропанола (WO 2012/115527), липидов (WO 2013/036147), 3-гидроксипропионата (3-НР) (WO 2013/180581), изопрена (WO 2013/180584), жирных кислот (WO 2013/191567), 2-бутанола (WO 2013/185123), 1,2-пропандиола (WO 2014/036152), 1пропанола (WO 2014/0369152) и продуктов, полученных из хоризмата (WO 2016/191625). В дополнение к одному или большему количеству целевых продуктов микроорганизм по изобретению также может продуцировать этанол, ацетат и/или 2,3-бутандиол. В определенных вариантах осуществления изобретения саму микробную биомассу можно рассматривать как продукт.
Предпочтительно, микроорганизм по изобретению не способен разлагать РНВ. Организмы, которые нативно продуцируют РНВ и другие полигидроксиалканоаты, как правило, синтезируют указанные полимеры в качестве материала накопления углерода, когда другие питательные вещества (например, азот и фосфор) ограничены, а углерод имеется в избытке. Эти организмы могут затем деполимеризовать/разлагать полимеры, когда ограниченное питательное вещество пополняется, чтобы иметь доступ к сберегаемому углероду. В целях максимизации продуцирования РНВ ненативные продуценты, например, микроорганизмы по данному изобретению, часто имеют то преимущество, что они не способны ферментативно расщеплять полимеры после их продуцирования. Это, по существу, блокирует углерод в полимерах окончательно и может повысить выход.
Селективность относится к отношению получения целевого продукта к получению всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом. Микроорганизм по изобретению может быть сконструирован для продуцирования продуктов с определенной селективностью или с минимальной селективностью. В одном варианте осуществления изобретения целевой продукт составляет по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% или 75% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом по изобретению. В одном варианте осуществления изобретения целевой продукт составляет по меньшей мере 10% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом по изобретению, таким образом, микроорганизм по изобретению обладает селективностью по отношению к целевому продукту, составляющей по меньшей мере 10%. В другом варианте осуществления изобретения целевой продукт составляет по меньшей мере 30% всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганиз- 12 044562 мом по изобретению, таким образом, микроорганизм по изобретению обладает селективностью по отношению к целевому продукту, составляющей по меньшей 30%.
Ферментация
В данном изобретении также предлагается способ получения РНВ, включающий в себя культивирование микроорганизма по изобретению в присутствии газообразного субстрата, посредством которого микроорганизм продуцирует РНВ. Газообразный субстрат, в целом, содержит один или большее количество из СО, CO2 и Н2.
Как правило, культивирование проводят в биореакторе. Термин биореактор включает в себя устройство для культивирования/ферментации, состоящее из одного или большего количества сосудов, колонн или разводок трубопроводов, например, реактор непрерывного действия с механическим перемешиванием (CSTR), реактор на основе иммобилизованных клеток (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажная колонна, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд, или другое устройство, подходящее для вступления в контакт газа с жидкостью. В некоторых вариантах осуществления изобретения биореактор может содержать первый реактор для выращивания и второй реактор для культивирования/ферментации. Один или оба из таких реактора могут быть обеспечены субстратом. В контексте данного документа термины культивирование и ферментация используют взаимозаменяемо. Эти термины охватывают как фазу роста, так и фазу биосинтеза продукта в процессе культивирования/ферментации.
Культивирование, как правило, поддерживают в водной среде для культивирования, содержащей питательные вещества, витамины и/или минералы в достаточном количестве для обеспечения роста микроорганизма. Предпочтительно, водная среда для культивирования представляет собой среду для анаэробного микробного роста, например, среду для минимального анаэробного микробного роста. Подходящие среды хорошо известны в данной области техники.
Для получения целевого продукта культивирование желательно проводить в соответствующих условиях. Как правило, культивирование проводят в анаэробных условиях. Условия реакции, которые следует учитывать, включают в себя давление (или парциальное давление), температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, pH среды, окислительно-восстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (при применении реактора непрерывного действия с механическим перемешиванием), уровень инокулята, максимальные концентрации газового субстрата, которые гарантируют, что газ в жидкой фазе не станет ограничивающим фактором, а также максимальные концентрации продукта во избежание ингибирования продукта.
Работа биореактора при повышенных давлениях позволяет повысить скорость массопереноса газа из газовой фазы в жидкую фазу. Соответственно, может быть предпочтительно осуществлять ферментацию при давлениях выше атмосферного давления. Кроме того, поскольку заданная скорость преобразования газа частично зависит от времени пребывания субстрата в реакторе, при этом время пребывания в реакторе определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно уменьшить требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты на оборудование для ферментации. Это, в свою очередь, означает, что при поддержании биореакторов при повышенном давлении, а не при атмосферном давлении, может быть уменьшено время пребывания, определяемое, как объем жидкости в биореакторе, деленный на скорость потока нагнетаемого газа. Оптимальные условия реакции будут частично зависеть от конкретного используемого микроорганизма. Однако, в целом, предпочтительно проводить ферментацию при давлении выше атмосферного давления. Кроме того, поскольку заданная скорость преобразования газа частично зависит от времени пребывания субстрата в реакторе, а достижение требуемого времени пребывания в реакторе, в свою очередь, определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно уменьшить требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты на оборудование для ферментации.
В определенных вариантах осуществления изобретения ферментацию проводят в отсутствие света или в присутствии некоторого количества света, недостаточного для удовлетворения энергетических потребностей фотосинтезирующих или фототрофных микроорганизмов.
Способы по изобретению могут дополнительно включать в себя разделение или очистку РНВ. РНВ может быть отделен или очищен с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, клетки могут быть собраны осаждением (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50-55, 2001) или непрерывным разделением (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643-651, 2009; Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012) с последующей лиофилизацией. После сушки вымораживанием полимер может быть удален из клеток вместе с веществами, например, этилацетатом (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 5055, 2001), ацетоном (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643-651, 2009) или гипохлоритом натрия (Heinrich, AMB Express, 2:59, 2012). Затем Полимер может быть удален из остаточной/солюбилизированной клеточной массы. Большое количество альтернативных способов очистки полигидроксиалканоатов было опубликовано и разработано, но еще не подтверждено для очистки в больших масштабах (Kunasundari, Express Polym Lett, 5, 620-634, 2011).
- 13 044562
Примеры
Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение, но, конечно, не должны рассматриваться как ограничивающие его объем каким-либо образом.
Пример 1
Этот пример демонстрирует конструкцию микроорганизма Вуда-Льюнгдаля, способного синтезировать РНВ.
Гены пути РНВ (phaC, phaA и phaB) из С. necator (SEQ ID NO: 1, 4 и 7) были введены в С. autoethanogenum, микроорганизм Вуда-Льюнгдаля, который нативно не продуцирует РНВ. Следует отметить, что эти виды имеют значительные различия в содержании хромосомных GC. В частности, С. necator имеет 66% GC-содержание (Pohlmann, Nat Biotechnol, 24:1257-1262, 2006), а С. autoethanogenum имеет только 31% GC-содержание (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014). Предвидя проблемы экспрессии генов на основе использования кодонов, последовательности генов РНВ из С. necator были адаптированы к кодонам, чтобы лучше соответствовать более высокому профилю экспрессии для белков в С. autoethanogenum. Гены с новыми последовательностями (SEQ ID NO: 3, 6 и 9), кодирующие идентичные белки, как и в С. necator, были синтезированы и собраны в вектор экспрессии pMTL83157 (SEQ ID NO: 10). Эта плазмида аналогична серии pMTL8000 (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009) с нативным промотором Вуда-Льюнгдаля, взятым из С. autoethanogenum для управления транскрипцией гена. Эти гены были размещены после промотора в том же порядке, в каком они появляются в геноме С. necator: phaC, phaA и phaB. Также использовали маркер отбора антибиотиков, catP. Полученная плазмида была названа pPHB_01 (SEQ ID NO: 11) (фиг. 2).
pPHB_01 вставили в С. autoethanogenum посредством бактериальной конъюгации с использованием Е. coli HB101, как описано в другом документе (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Кроме того, пустую плазмиду pMTL83157 вставили в С. autoethanogenum в качестве отрицательного контроля. Эти штаммы были затем использованы для испытания продуцирования РНВ из газообразных субстратов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм содержит фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 5, и/или фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в полигидроксибутират, имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 8.
Пример 2
Этот пример демонстрирует продуцирование РНВ из газообразных субстратов в бутылках Шотта.
Штаммы, сконструированные в Примере 1, выращивали небольшими партиями для испытания на продуцирование РНВ. Все работы проводились в строго анаэробных условиях (Hungate, Methods in microbiology, pages 117-132, Academic Press, New York, NY, 1969). Бутылки Шотта, выдерживающие высокое давление, содержащие модифицированную среду РЕТС (Корке, Appl Environ Microbiol, 11: 54675475, 2011) с тиамфениколом для удержания плазмиды и 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту для буферизации, инокулировали штаммами, и в качестве единственного источника углерода в бутылки добавили газ, содержащий СО, СО2, H2 и N2 (при 50, 18, 3 и 29%, соответственно), до 21 фунт/кв.дюйм (0,1448 МПа). Культуры клеток выращивали при 37°С при вращательном встряхивании.
Рост клеток периодически контролировали до тех пор, пока культуры не вступили в стационарную фазу. После завершения роста клетки больше не обрабатывали в анаэробных условиях. Клетки собрали центрифугированием, их супернатанты отбросили, заморозили при -20°С и высушили лиофилизацией.
Выход РНВ оценили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) таким же образом, как описано в другом документе (Karr, Appl Environ Microbiol, 46, 1339-1344, 1983). Вкратце, высушенные клетки обработали концентрированной серной кислотой и нагрели для преобразования РНВ в кротоновую кислоту. Образцы охладили, разбавили, отфильтровали и проанализировали методом ВЭЖХ с детектором УФ/видимого излучения для количественного определения кротоновой кислоты. Результаты первоначального продуцирования РНВ суммированы на фиг. 3, на которой проиллюстрировано успешное продуцирование ~ 1,15 мас.% РНВ в микроорганизме Вуда-Льюнгдаля.
Однако, учитывая низкие выходы по сравнению с нативными продуцентами, например, Cupriavidus и Pseudomonas, которые способны синтезировать полимеры, например, РНВ таким образом, что они составляют свыше 90% своего веса, представляется, что синтез РНВ из газа в микроорганизмах ВудаЛьюнгдаля не так прост, как у нативных продуцентов, растущих на негазообразных субстратах. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения постулируют, что продуцирование РНВ в микроорганизмах Вуда-Льюнгдаля может потребовать адаптации кодонов, чтобы преодолеть различия в предпочтении pH, потребности в кислороде, путях использования субстрата и т.д. между микроорганизмами Вуда-Льюнгдаля и нативными продуцентами РНВ.
После достижения образования РНВ в С. autoethanogenum из газообразных субстратов работу, описанную выше, повторили с изменением условий роста в целях изучения условий, которые могут способствовать/улучшить выход РНВ. В частности, были проведены эксперименты для повторения условий,
- 14 044562 описанных выше (условие 1, фиг. 4А), чтобы измененить композиции газа на 50/30/10/10 CO/CO2/H2/N2 (условие 2, фиг. 4В), чтобы продлить инкубацию культуры до стационарной фазы (условие 3, фиг. 4С) и периодически обновлять газ в бутылках (условие 4, фиг. 4D). Как проиллюстрировано на фиг. 4A-4D, рост был аналогичным как для сконструированного штамма, так и для контрольного штамма при всех испытанных условиях.
Клетки собрали и проанализировали на продуцирование РНВ, как описано выше. Результаты проиллюстрированы на фиг. 5, где показано продуцирование ~1,65 мас.% РНВ в условии 1, ~1,50 мас.% РНВ в условии 2, ~1,50 мас.% РНВ в условии 3 и ~0,85 мас.% РНВ в условии 4.
Пример 3
Этот пример демонстрирует продуцирование РНВ из газообразных субстратов при непрерывной ферментации.
Штамм, сконструированный в примере 1, был испытан при непрерывной ферментации с использованием газа в качестве основного источника углерода в условиях, аналогичных описанным в Valgepea, Cell Syst, 4: 505-515, 2017. Аналогично экспериментам, выполненным в бутылках Шотта, непрерывные культуры клеток выращивали и обрабатывали анаэробно. В отличие от бутылок Шотта, культуры клеток выращивали в непрерывном режиме в течение приблизительно 20 дней с постоянной подачей питательной среды. Для выращивания и получения РНВ использовали две разные газовые композиции: 50/20/20/10 СО/СО2/Н2/Аг и 50/20/2/28 CO/CO2/H2/N2. Поглощение газа контролировали методом массспектрометрии (МС) и периодически отбирали пробы для количественного определения жидких метаболитов методом ВЭЖХ.
РНВ не определяли количественно до завершения непрерывной ферментации. Аналогично экспериментам с бутылкой Шотта, клетки собрали центрифугированием, заморозили и высушили лиофилизацией. Высушенные клетки впоследствии проанализировали на РНВ посредством обработки серной кислотой и нагревания для преобразования РНВ в кротоновую кислоту. Затем провели количественное определение РНВ методом ВЭЖХ. Результаты продуцирования РНВ при непрерывной ферментации проиллюстрированы на фиг. 6. В частности, микроорганизмы, выращенные на 20% газообразном водороде продуцировали ~0,45 мас.% РНВ, а микроорганизмы, выращенные на 2% газообразном водороде, продуцировали ~0,25 мас.% РНВ.
Пример 4
Этот пример демонстрирует оптимизацию ферментера для повышения продуцирования РНВ.
В пределах непрерывной ферментации были испытаны различные условия для увеличения содержания РНВ в клетках. Пулы ацетил-КоА и NADPH увеличиваются при более низких концентрациях биомассы (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017). Таким образом, провели испытание, приведет ли более низкий стационарный уровень биомассы к более высокому РНВ за счет увеличения уровней пулов ацетил-КоА и NADPH. Было показано, что снижение скорости поглощения СО и, в целом, концентрации биомассы в ферментере увеличивает поток клеточных ресурсов к РНВ (фиг. 7).
Другим обнаруженным фактором, повышающим РНВ, был pH. При более высоком pH меньшее количество уксусной кислоты будет диффундировать и отсоединять движущую силу протонов (PMF) (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017). Таким образом, провели испытание, будет ли тратиться меньше энергии для поддержания PMF при увеличении pH от 5 до 5,5 или 6. Дополнительная доступная энергия обеспечит дополнительную АТР для поддержки продуцирования РНВ посредством уменьшения продуцирования ацетата, необходимого для продуцирования АТР. Изменение pH с 5,0 до 5,5 или 6,0 привело к увеличению продуцирования РНВ (~ в 12,5 раз при pH 5,5). Однако, значение pH 6,0 трудно сохранять, поскольку С. autoethanogenum оптимально растет при более кислом pH.
Пример 5
Этот пример демонстрирует изменения уровня транскрипции и метаболизма при продуцировании РНВ по сравнению с контрольным штаммом (пустой плазмидой).
Анализ данных транскриптома из секвенирования РНК был основан на ранее опубликованном Rсценарии (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017) со следующими модификациями: использование эталонной последовательности СР006763.1 С. autoethanogenum и ее аннотированного генома, описанного в Brown, Biotechnol. Biofuels, 7: 40, 2014; добавление нуклеотидной последовательности для трех генов РНВ (SEQ ID NO: 3, 6, 9.)
Использовали пакет метаболомики, доступный в R (Livera and Bowne, R package, 2014) для проведения статистического анализа данных внутриклеточной метаболомики. Этот сценарий нормализует и интегрирует данные метаболомики в соответствие линейной модели (De Livera, Anal. Chem., 84: 1076810776, 2012). Внутриклеточные концентрации метаболитов были нормализованы по биомассе (мкмоль/гСКМ) перед импортом данных в сценарий. Было использовано подобие линейной модели с использованием обычной статистики (т.е. небайесовской) для статистического анализа данных метаболома (De Livera, Anal. Chem., 84: 10768-10776, 2012; De Livera, Metabolomics Tools for Natual Product Discovery, 2013).
Хотя аргинин не подавали, для пути аргининдеиминазы наблюдалось усиление активности, обнаружен альтернативный путь для обеспечения АТР в ацетогенах (Valgepea, Metab. Eng. 41: 202-211, 2017)
- 15 044562 (значение q<0,01): аргининдеиминаза (CAETHG_3021, в ~7 раз); орнитинкарбамоилтрансфераза (CAETHG_3022, в ~6 раз); карбаматкиназа (CAETHG_3025, в ~3,3 раза). Кроме того, три гена, кодирующие комплекс Rnf, который является частью комплекса энергосбережения в ацетогенах (Schuchmann and Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014), показал увеличение в ~2 раза в штамме РНВ: (CAETHG_3231, значение q=0,02; CAETHG_3228, значение q=0,04 и CAETHG_3230, значение q=0,03). Эти наблюдения подчеркивают изменения в энергетическом метаболизме из-за гетерологичного продуцирования. Кроме того, экспрессия двух генов пути Вуда-Льюнгдаля (WLP), кодирующего СО-дегидрогеназу/ацетил-КоАсинтазу (CAETHG_1610, в ~ 1,4 раза; CAETHG_1611, в ~ 1,2 раза) и гена, кодирующего (FeFe)гидрогеназу (CAETHG_1691 (~ в 2,5 раза) были активированы в штамме РНВ. Эти изменения могут отражать увеличение, необходимое для продуцирования ацетил-КоА и NADPH для продуцирования РНВ (фиг. 1).
На уровне метаболом штамм РНВ имел более высокое внутриклеточное соотношение NADH/NAD+ по сравнению с ЕР. Это предполагает потенциальные изменения в окислительно-восстановительном состоянии после экспрессии РНВ. Продуцирование ацетата, основного нативного побочного продукта метаболизма С. autoethanogenum (Abrini, Arch. Microbiol., 161: 345-351, 1994; Marcellin, Green Chem., 18: 3020-3028, 2016), уменьшено по сравнению со штаммом EP на синтез-газе (значение р<0,01; двусторонняя равная дисперсия t-испытания). На отходящим газе сталелитейного завода никаких изменений не наблюдалось.
Пример 6
Этот пример показывает результаты реконструкций метаболической модели в масштабе генома (GEM). Метаболическая модель в масштабе генома GEM iCLAU786 (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017) была использована с добавлением пути РНВ. Моделирование проводили для штамма РНВ, выращенного на синтез-газе, во всех условиях, перечисленных выше.
Моделирование потока подтвердило, что было рассеяно меньшее количество СО2 в условиях с более высоким РНВ (т.е. низкая биомасса и pH 5,5). Кроме того, как было отмечено ранее (Valgepea, Cell Syst, 4: 505-515, 2017), эти моделирования также показали, что CO2 непосредственно восстанавливался до формиата посрдством Н2 через активность формиат-H2-лиазы ферментного комплекса электронбифуркационной гидрогеназы-формиат-дегидрогеназы (HytA-E/FdhA) (Wang, J. Bacteriol, 195: 4373-4386, 2013). Это дает преимущество по сравнению с восстановлением CO2 посредством расходования окислительно-восстановительного потенциала формиат-дегидрогеназы, потому что окислительновосстановительный потенциал не расходуется в процессе восстановления CO2 в WLP с использованием бывшего ферментного комплекса. Было также отмечено, что в экспериментах низкая биомасса и pH 5,5 уравновешивание общего количества восстановленного ферредоксина достигалось посредством увеличения или уменьшения потока для некоторых ключевых реакций, например, AOR (альдегидферредоксин-оксидоредуктазы), комплекса Nfn, или реакции бифуркации метилен-ТГФ-редуктазы, по сравнению с контролем (РНВ20).
Удивительно, что контрольное условие (РНВ20), in silico, имело более низкие затраты на поддержание АТР (ммоль/гСКМ/ч) и затраты на поддержание АТР от общего продуцирования АТР (%mATP) по сравнению с условием PHBpH5,5.
Также было запущено моделирование для определения, являются ли АТР, NADH, NADPH или восстановленный ферредоксин (Fdred) ограничивающими продуцирование РНВ. Моделирование показало, что при доставке АТР продуцирование РНВ (ммоль/гСКМ/ч) достигало своего максимального значения среди ограничивающих кандидатов во всех испытуемых условиях (т.е. РНВ20, РНВ низкая биомасса и PHBpH5,5). Это наблюдение согласуется с пониманием того, что метаболизм ацетогена ограничен АТР (Schuchmann and Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014). Модель также показала, что после ограничения посредством ATP, продуцирование РНВ ограничивается наличием Fdred, NADPH и затем NADH (фиг. 8).
Этот результат подтверждает важность АТР и Fdred как высокоэнергетических носителей в ацетогенах. Поскольку АТР преимущественно поддерживает анаболизм и работоспособность клеток, Fdred имеет важное значение для энергосберегающего комплекса Rnf (Biegel, Cell. Mol. Life Sci. 68: 613-634, 2011) и известно, что только Fdred обеспечивает электроны для восстановления CO2 до СО в карбонильной ветви WLP (Schuchmann and Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014).
Все ссылки, в том числе публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была отдельно и конкретно указана для включения посредством ссылки и изложена в данном документе в полном объеме. В данном описании ссылка на любой известный уровень техники не является и не должна рассматриваться как признание того, что такой известный уровень техники является частью общедоступных известных знаний в области деятельности в любой стране.
Следует считать, что применение терминов в единственном числе и аналогичных ссылок в контексте описания данного изобретения (особенно в контексте приведенной ниже формулы изобретения) включает в себя как единственное, так и множественное число, если только в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Термины состоящий из, имеющий, включаю
-
Claims (5)
- щий в себя и содержащий следует рассматривать как неограничивающие термины (т.е. означающие включая, но не ограничиваясь ими), если не указано иное. Термин по существу состоящий из ограничивает объем композиции, процесса или способа указанными материалами или стадиями, или тем, что не оказывает существенного влияния на основные и новые характеристики композиции, процесса или способа. Использование альтернативы (например, или) следует понимать, как означающее одну, обе либо любую из вышеуказанных комбинацию альтернатив. В контексте данного документа термин около означает ±20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное.Перечисление в данном документе диапазонов значений просто предназначено для того, чтобы служить сокращенным способом ссылки по отдельности на каждое отдельное значение, попадающее в указанный диапазон, если в данном документе не указано иное, при этом каждое отдельное значение включено в данное описание, как если бы оно было отдельно приведено в данном документе. Например, любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон соотношений, диапазон целых чисел, диапазон размеров или диапазон толщин следует понимать, как включающий в себя значение любого целого числа в указанном диапазоне и, при необходимости, его доли (например, одну десятую и одну сотую целого числа), если не указано иное.Все способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Применение любых и всех примеров или типичных формулировок (например, например), предложенных в данном документе, предназначено просто для лучшего освещения данного изобретения и не налагает ограничения на объем данного изобретения, если не заявлено иное. Ни одно выражение, приведенное в данном описании, не следует понимать, как указание на какой-либо незаявленный элемент, как необходимый для практического осуществления данного изобретения.В данном документе описаны предпочтительные варианты осуществления данного изобретения. Вариации таких предпочтительных вариантов осуществления изобретения могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения приведенного выше описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие вариации при необходимости, при этом авторы изобретения предполагают, что данное изобретение будет осуществлено на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, данное изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты предмета изобретения, приведенные в прилагаемой формуле изобретения, как это установлено действующим законодательством. Кроме того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных их вариациях включена в данное изобретение, если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Не встречающийся в природе микроорганизм Вуда-Льюнгдаля Closthdium autoethanogenum для продуцирования полигидроксибутирата, содержащий:a. нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологический фермент, который преобразует ацетилКоА в ацетоацетил-КоА и представляет собой ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазу (ЕС 2.3.1.9),b. нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологический фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА и представляет собой ацетоацетил-КоА-редуктазу (ЕС 1.1.1.36) или 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.157), а такжеc. нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологический фермент, который преобразует 3гидроксибутирил-КоА в полигидроксибутират и представляет собой полигидроксиалканоат-синтазу (ЕС 2.3.1.-), где указанный микроорганизм потребляет газообразные субстраты, содержащие Н2 и по меньшей мере один из СО и СО2.
- 2. Микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что ацетил-КоА-С-ацетилтрансфераза получена из: Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
- 3. Микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что ацетоацетил-КоА-редуктаза получена из: Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida или Streptomyces coelicolor.
- 4. Микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа получена из: Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum или Clostridium kluyveri.
- 5. Микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что полигидроксиалканоат-синтаза получена из: Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa,-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/568,127 | 2017-10-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044562B1 true EA044562B1 (ru) | 2023-09-06 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016191625A1 (en) | Genetically engineered microorganisms for the production of chorismate-derived products | |
| JP2021506247A (ja) | エチレングリコールの生物生産のための微生物および方法 | |
| JP2024009798A (ja) | Ｗｏｏｄ－ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物におけるポリヒドロキシブチレートの生成 | |
| CN111225978A (zh) | Wood-ljungdahl微生物的基因敲除 | |
| TW202212566A (zh) | 重組微生物及其用途 | |
| TWI824995B (zh) | 用於改良氣體醱酵產乙酸菌之效率的精胺酸增補 | |
| JP6554102B2 (ja) | 発酵プロセス | |
| US20220213517A1 (en) | Production of polyhydroxybutyrate in wood-ljungdahl microorganisms | |
| EA044562B1 (ru) | Получение полигидроксибутирата в микроорганизме вуда-льюнгдаля | |
| AU2021284451B2 (en) | Microorganism with knock-in at acetolactate decarboxylase gene locus | |
| EP3397769A1 (en) | Microorganism with modified hydrogenase activity | |
| JP2023523343A (ja) | ガス基質からのβ－ケトアジペートの発酵生成 | |
| TW202307202A (zh) | 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法 | |
| JP2014161252A (ja) | 組換え細胞 |