TW202212566A - 重組微生物及其用途 - Google Patents

Abstract

提供一種基因工程化的微生物，其包含多種CoA轉移酶的表現，賦予某些優勢，包括增加的產品產量及醱酵穩定性。亦提供一種用於增加產品產量之方法，其包含在氣態受質存在下培養該基因工程化的微生物，其中該氣態受質可包含含有CO、CO ₂及H ₂中之一或多種的C1-碳源。

Description

重組微生物及其用途

相關申請案之交叉引用

本申請案主張於2020年9月25日提交之美國臨時專利申請案第63/083,257號之權益，其全部內容以引用之方式併入本文中。

本申請案係關於基因工程化的微生物以及彼等微生物用於自包含二氧化碳（CO ₂）、一氧化碳（CO）及/或氫（H ₂）的受質醱酵生產產物的用途。

緩解即將發生的氣候變化需要大幅減少溫室氣體（(GHG）的排放，諸如藉由燃燒煤及石油之化石燃料產生的排放。儘管燃料及化學品之可持續來源目前不足以顯著取代吾人對化石碳的依賴，但氣體醱酵最近已成為生物固定諸如CO、CO ₂及/或H ₂之氣體進入可持續燃料及化學品的置換平台。特定言之，氣體醱酵技術可以利用廣泛的原料，包括氣化的含碳物質（例如城市固體廢物或農業廢物）或工業廢氣（例如來自鋼廠或煉油廠）以生產乙醇、噴氣燃料及各種其他產品。單獨之氣體醱酵即可取代30%的原油使用量，且將全球CO ₂排放量減少10%，但是，與任何顛覆性技術一樣，在充分發揮這一潛力之前，必須克服許多技術挑戰。

特定言之，仍然需要具有改進的穩定性及受質選擇性的額外微生物以增加自氣態受質生產天然及非天然產物。

本揭示案係針對包含第一外源CoA轉移酶及至少一種額外外源CoA轉移酶的基因工程化Wood-Ljungdahl微生物。第一外源CoA轉移酶可以置換乙醯乳酸脫羧酶基因的編碼區。至少一種額外的外源CoA轉移酶可以置換醛-醇脫氫酶基因的編碼區。微生物可進一步包含外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，以及第一外源CoA轉移酶。外源CoA轉移酶可為 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB。外源CoA轉移酶可為微生物非天然的，或外源CoA轉移酶可為微生物天然的。外源CoA轉移酶可相同或外源CoA轉移酶可不同。外源CoA轉移酶可在乙醯乳酸脫羧酶啟動子及至少一種其他啟動子的控制下。微生物可能不會產生2,3-丁二醇。微生物可產生丙酮及異丙醇中的一或多種。微生物可進一步在一級-二級醇脫氫酶基因、硫酯酶基因、3-羥基丁醯coA脫氫酶基因或其任何組合中包含破壞性突變。外源性CoA轉移酶可產生1-丁醇、丁酸酯、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、異丙醇、脂質、3-羥基丙酸酯、萜烯、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸衍生產物、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸、異丁烯、己二酸、酮基-己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸酯、異戊醇或單乙二醇。微生物可為固定C1的微生物。微生物可進一步包含外源硫解酶、選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶或其任何組合的外源脫羧酶，以及至少一種額外的外源CoA轉移酶。微生物可為細菌。微生物可為選自 醋桿菌屬（ Acetobacterium ）、嗜鹼菌屬（ Alkalibaculum ）、布勞特氏菌屬（ Blautia ）、丁酸桿菌屬（ Butyribacterium ）、梭菌屬（ Clostridium ）、真桿菌屬（ Eubacterium ）、穆爾氏菌屬（ Moorella ）、氧化桿菌屬（ Oxobacter ）、孢子菌屬（ Sporomusa ）及 熱厭氧桿菌屬（ Thermoanaerobacter ）的成員。

本揭示案進一步針對增加產品產量的方法，包含在氣態受質存在下培養包含第一外源CoA轉移酶及至少一種額外外源CoA轉移酶的基因工程化Wood-Ljungdahl微生物。氣態受質可包含含有CO、CO ₂、CH ₄及H ₂中的一或多種的C1-碳源。氣態受質可包含合成氣或工業廢氣。產物可為丙酮及異丙醇中的一或多種。

乙醯乳酸脫羧酶為形成2,3-丁二醇（2,3-BDO）的關鍵步驟（Köpke, 《應用與環境微生物學（Appl Env Microbiol）》, 80: 3394-3405, 2014）並且已證明敲除此酶可消除 2,3-BDO產生（WO 2013/115659）。為了將通量引導至其他異源產物諸如丙酮或異丙醇，預計乙醯乳酸脫羧酶的敲除會增加彼等異源產物的產量。

然而，本發明者發現情況並非一定如此。特定言之，本發明者發現基因嵌入負責在乙醯乳酸脫羧酶基因座處產生異源產物的基因是實現穩定醱酵及高產物效價的關鍵。

此外，先前推測硫解酶反應是生產路徑中的瓶頸，因為兩分子乙醯-CoA縮合為乙醯乙醯-CoA是該路徑中熱力學最不利的步驟。然而，本發明者已驚奇地發現下游CoA轉移酶步驟對於提高通向目標產物的通量最為關鍵。

本發明者亦發現，在具有功能性一級-二級醇脫氫酶基因的同時，負責在雙功能醛-醇脫氫酶基因座處產生異源產物的基因的質粒表現或基因嵌入增加了異丙醇的產生。類似地，負責在雙功能醛-醇脫氫酶基因座處產生異源產物的基因的質粒表現或基因嵌入以及一級-二級醇脫氫酶基因的敲除增加了丙酮的產生。

提供一種基因工程化微生物，其包含在乙醯乳酸脫羧酶基因座，或在乙醯乳酸脫羧酶基因座及醛-醇脫氫酶（ adhE1+ adhE2）基因座兩者處DNA的質粒表現或基因嵌入。在一個實施例中，DNA全部或部分置換乙醯乳酸脫羧酶基因的編碼區。在一個實施例中，DNA不置換乙醯乳酸脫羧酶啟動子。在一個實施例中，DNA全部或部分置換乙醯乳酸脫羧酶基因的編碼區，且DNA亦全部或部分置換醛-醇脫氫酶（ adhE1+ adhE2）基因的編碼區。

在一個實施例中，乙醯乳酸脫羧酶具有EC 4.1.1.5定義的活性，即(S)-2-羥基-2-甲基-3-側氧基丁酸ßà (R)-2-乙偶姻+CO ₂。在一個實施例中，乙醯乳酸脫羧酶為 budA。在一個實施例中， budA包含SEQ ID NO: 3。

在進行基因嵌入後，微生物通常將不具有功能性乙醯乳酸脫羧酶基因，從而微生物將表現乙醯乳酸脫羧酶且不會產生諸如2,3-丁二醇之產物。

在一個實施例中，基因嵌入的DNA編碼一或多種酶。在一個實施例中，此等酶對微生物而言是非天然的，即不天然存在於微生物中。在一個實施例中，此等酶是微生物天然的，即天然存在於微生物中，且簡單地將酶的另一複本添加到微生物的基因體中。

在一個實施例中，由基因嵌入DNA編碼的酶處於乙醯乳酸脫羧酶啟動子，例如P _budA的控制之下。在一個實施例中，DNA包含啟動子，諸如P _fer啟動子。在一個實施例中，酶處於乙醯乳酸脫羧酶啟動子及至少一種其他啟動子的控制之下。在一個實施例中，酶處於P _budA及P _fer兩者的控制之下。

在一個實施例中，丙酮路徑在乙醯乳酸脫羧酶基因座處被基因嵌入。丙酮路徑可包含硫解酶、CoA轉移酶及脫羧酶。在一個實施例中，脫羧酶為乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶。例如，丙酮路徑可包含 thlA 、 ctfAB及 adc或 thlA 、 ctfAB及 kivd。在一個實施例中，CoA轉移酶為丁酸-乙醯乙酸CoA轉移酶、乙酸CoA轉移酶、琥珀醯CoA轉移酶、4-羥基丁醯CoA轉移酶、酮己二酸-琥珀醯CoA轉移酶或丙酸CoA轉移酶。在一個實施例中，CoA轉移酶僅為 ctfA亞基。在一個實施例中，CoA轉移酶僅為 ctfB亞基。在一個實施例中，該路徑可包含 ctfA但不 包含 adc。在一個實施例中，該路徑可包含 ctfB但不 包含 adc。若存在，則一級-二級醇脫氫酶，諸如 secAdh，將丙酮轉化為異丙醇。在編碼此酶的基因中引入破壞性突變（例如敲除突變）將導致丙酮的產生，而此酶的表現將導致異丙醇的產生。因此，視宿主微生物的遺傳背景而定，丙酮路徑的引入將導致丙酮或異丙醇的產生。WO 2012/115527中描述了微生物工程化以產生丙酮及異丙醇。WO 2015/085015中描述了微生物工程化以敲除一級-二級醇脫氫酶活性。

在一個實施例中，丙酮路徑在乙醯乳酸脫羧酶基因座處被基因嵌入，且亦在醛-醇脫氫酶基因座處被基因嵌入。在一個實施例中，丙酮路徑在乙醯乳酸脫羧酶基因座處被基因嵌入，且僅CoA轉移酶在醛-醇脫氫酶基因座處被基因嵌入。在一個實施例中，CoA轉移酶為丁酸-乙醯乙酸CoA轉移酶、乙酸CoA轉移酶、琥珀醯-CoA轉移酶、4-羥基丁醯CoA轉移酶或酮己二酸-琥珀醯CoA轉移酶。丙酮路徑可包含 thlA 、 ctfAB及 adc或 thlA 、 ctfAB及 kivd。若存在，則一級-二級醇脫氫酶，諸如 secAdh，將丙酮轉化為異丙醇。在編碼此酶的基因中引入破壞性突變（例如敲除突變）將導致丙酮的產生，而此酶的表現將導致異丙醇的產生。因此，視宿主微生物的遺傳背景而定，丙酮路徑的引入將導致丙酮或異丙醇的產生。WO 2012/115527中描述了微生物工程化以產生丙酮及異丙醇。WO 2015/085015中描述了微生物工程化以敲除一級-二級醇脫氫酶活性。

在一個實施例中，微生物包含丙酮路徑且亦包含一級-二級醇脫氫酶基因的破壞性突變，使得微生物產生丙酮。在一個實施例中，微生物包含丙酮路徑且亦包含功能性一級-二級醇脫氫酶，使得微生物產生異丙醇。

實際上，基因嵌入的DNA基本上可編碼任何酶或酶路徑。例如，基因嵌入DNA編碼之酶可產生1-丁醇、丁酸酯、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、異丙醇、脂質、3-羥基丙酸酯、萜烯、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸衍生產物、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸、異丁烯、己二酸、酮基己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸酯、異戊醇或單乙二醇。

在一個實施例中，酶路徑的能量學表明硫解酶預計需要額外的複本，因為其為唯一的內能酶路徑。在一個實施例中，能量如下， thlA（+26 kJ/mol）、 ctfAB（-5.7 kJ/mol）、 Adc（-41.9 kJ/mol）及 secAdh（-16.2 kJ/mol NADH；-17.4 kJ/mol NADPH）。在一個實施例中，三個複本的 thlA在質粒上表現，表明所需產物生產的改善最小。出乎意料的是，本發明者發現下游CoA轉移酶步驟對於提高通向目標產物的通量最為關鍵。

在一個實施例中，獲得且篩選總共247株具有不同丙酮生物合成路徑設計的菌株，包括參考酶的所有可能的啟動子-基因體合。在一個實施例中，不同的啟動子導致產量提高11倍，同時將啟動子及鑑定的獨特酶變異體組合，導致使用來自參考菌株的基因的最佳性能設計的另外2倍提高。在一個實施例中，表現最佳的設計基於 thlA、 ctfAB及 Adc，且向前推進到連續醱酵測試及基因體整合。在一個實施例中，在優化丙酮路徑之後，篩選工程化的 自產乙醇梭菌 secAdh酶庫用於將丙酮轉化為異丙醇。若干變異體及野生型在氣體中生長時顯示出幾乎完全轉化（＞97%）的20g/L進料丙酮，且向前推進以進行連續醱酵及基因體整合的測試。

在一個實施例中，藉由模擬與中樞代謝及丙酮路徑相關的每種酶的表現量的變化，該模型預測過表現 ctfAB會增加丙酮的通量。

在一個實施例中，微生物是固定C1的微生物。在一個實施例中，微生物是Wood-Ljungdahl微生物。在一個實施例中，微生物是細菌。在一個實施例中，微生物是選自 醋桿菌屬、嗜鹼菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬、真桿菌屬、穆爾氏菌屬、氧化桿菌屬、孢子菌屬及 熱厭氧桿菌屬的成員。

進一步提供一種提高產物產量的方法，其包含在氣態受質存在下培養微生物。在一個實施例中，氣態受質包含含有CO、CO ₂及/或H ₂的C1-碳源。在一個實施例中，氣態受質包含合成氣或工業廢氣。在一個實施例中，產物為1-丁醇、丁酸酯、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、異丙醇、脂質、3-羥基丙酸酯、萜烯、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸衍生產物、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸、異丁烯、己二酸、酮基己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸酯、異戊醇或單乙二醇。

術語「醱酵」應解釋為在受質中產生化學變化的代謝過程。例如，醱酵過程接收一或多種受質且藉由利用一或多種微生物產生一或多種產物。術語「醱酵」、「氣體醱酵」及其類似術語應解釋為接收一或多種受質，諸如氣化產生的合成氣，且藉由利用一或多種固定C1的微生物產生一或多種產品的過程。較佳地，醱酵過程包括使用一或多個生物反應器。醱酵過程可描述為「分批」或「連續」。「分批醱酵」用於描述醱酵過程，其中生物反應器填充有原材料（例如碳源）以及微生物，其中產物保留在生物反應器中直到醱酵完成。在「」「分批」過程中，醱酵完成後，提取產品，且在開始下一個「批次」之前清潔生物反應器。「連續醱酵」用於描述醱酵過程延長更長的時間，且在醱酵期間提取產物及/或代謝物的醱酵過程。較佳地，醱酵過程是連續的。

當用於提及微生物時，術語「非天然存在的」旨在意謂微生物具有至少一種在參考物種的天然存在的菌株中未發現的基因修飾，包括參考物種的野生型菌株。非天然存在的微生物通常在實驗室或研究設施中開發。

術語「基因修飾」、「基因改變」或「基因工程化」泛指藉由人工操作微生物的基因體或核酸。同樣，術語「基因修飾」、「基因改變」或「基因工程化」係指含有此類基因修飾、基因改變或基因工程化的微生物。此等術語可用於區分實驗室產生的微生物與天然存在的微生物。基因修飾的方法包括例如異源基因表現、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、基因表現改變或失活、酶工程化、定向進化、基於知識的設計、隨機突變誘發方法、基因改組及密碼子優化。

微生物（諸如 梭菌綱）的代謝工程化可極大地擴展其生產除天然代謝物（諸如乙醇）以外的許多重要燃料及化學分子的能力。然而，直到最近， 梭菌綱被認為是遺傳上難以處理的，因此通常禁止進行廣泛的代謝工程化工作。近年來，已經開發了若干種不同的 梭菌綱基因體工程化方法，包括基於內含子的方法（ClosTron）（Kuehne, Strain Eng: Methods and Protocols, 389-407, 2011）、等位基因交換方法（ACE）（Heap, 《核酸研究（ Nucl Acids Res）》, 40: e59, 2012; Ng, PLoS One,8: e56051, 2013）、三系雜交（Liew, 《微生物學前沿（ Frontiers Microbiol）》, 7: 694, 2016）、藉由I-SceI介導之方法（Zhang, 《微生物學方法雜誌（ Journal Microbiol Methods）》, 108: 49-60, 2015）、MazF（Al-Hinai, 《環境應用微生物學（ Appl Environ Microbiol）》, 78: 8112-8121, 2012），或其他（Argyros, 《環境應用微生物學》 ,77: 8288-8294, 2011）、Cre-Lox (Ueki, 《分子生物技術（mBio）》, 5: e01636-01614, 2014)及CRISPR/Cas9（Nagaraju, 《生物技術生物燃料（Biotechnol  Biofuels）》, 9: 219, 2016）。然而，由於緩慢而費力的循環時間以及此等基因技術在物種間的可轉移性的限制，迭代引入多個遺傳變化仍然極具挑戰性。此外，吾人尚未充分瞭解 梭菌綱中的C1代謝，無法可靠地預測將最大限度地提高C1吸收、轉化及碳/能量/氧化還原流向產品合成的修飾。因此，在 梭菌綱中引入目標路徑仍然是一個乏味且耗時的過程。

「重組」表示核酸、蛋白質或微生物為基因修飾、工程化或重組的產物。通常，術語「重組體」係指含有源自多種來源的遺傳物質或由其編碼的核酸、蛋白質或微生物，該來源諸如兩種或更多種不同的微生物菌株或物種。

「野生型」係指生物體、菌株、基因或自然界中出現的特徵的典型形式，有別於突變體或變異體形式。

「內源的」係指存在於或表現於本揭示案的微生物所源自的野生型或親本微生物中的核酸或蛋白質。例如，內源基因是天然存在於本揭示案的微生物所源自的野生型或親本微生物中的基因。在一個實施例中，內源基因的表現可由外源調控元件例如外源啟動子控制。

「外源的」係指源自本揭示案的微生物之外的核酸或蛋白質。例如，外源基因或酶可以人工或重組產生且引入或表現於本揭示案的微生物中。外源基因或酶亦可自異源微生物中分離且引入本揭示案的微生物中或在其中表現。外源核酸可適於整合至本揭示案的微生物的基因體中或在本揭示案的微生物中保持在染色體外狀態，例如在質粒中。

「異源的」係指不存在於本揭示案的微生物所源自的野生型或親本微生物中的核酸或蛋白質。例如，異源基因或酶可源自不同的菌株或物種且引入本揭示案的微生物中或在其中表現。異源基因或酶可以以其在不同菌株或物種中出現的形式引入或表現於本揭示案的微生物中。或者，可以以某種方式修飾異源基因或酶，例如藉由對其在本揭示案的微生物中表現進行密碼子優化或藉由對其進行改造以改變功能，諸如逆轉酶活性的方向或改變受質特異性。

術語「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核苷酸序列」、「核酸」及「寡核苷酸」可互換使用。其係指任何長度的核苷酸的聚合形式，該核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知的功能。以下為聚核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼或非編碼區、由連鎖分析定義之基因座（基因座）、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核醣體RNA、短干擾RNA（siRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、核酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包含一或多種修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸或核苷酸類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可能間雜有非核苷酸組分。聚合後可進一步修飾聚核苷酸，諸如藉由與標記組分綴合。

如本文所用，「表現」係指聚核苷酸自DNA模板轉錄（諸如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄物）及/或轉錄的mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。轉錄物及編碼的多肽可統稱為「基因產物」。

術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用以指任何長度的胺基酸的聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含修飾的胺基酸，且其可以間雜有非胺基酸。該術語亦涵蓋經修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作，諸如與標記組分的綴合。如本文所用，術語「胺基酸」包括天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及D或L光學異構體，以及胺基酸類似物及肽模擬物。

「酶活性」或簡稱「活性」泛指酶促活性，包括但不限於酶的活性、酶的量或酶催化反應的可用性。因此，「增加」酶活性包括增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反應的可用性。類似地，「降低」酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反應的可用性。

「突變的」係指與本揭示案的微生物所源自的野生型或親本微生物相比，在本揭示案的微生物中已經被修飾的核酸或蛋白質。在一個實施例中，突變可為編碼酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一個實施例中，突變可為酶中一或多個胺基酸的缺失、插入或取代。

特定言之，「破壞性突變」為降低或消除（即「破壞」）基因或酶的表現或活性的突變。破壞性突變可以部分滅活、完全滅活或刪除基因或酶。破壞性突變可為減少、防止或阻斷由酶產生的產物的生物合成的任何突變。破壞性突變可為敲除（KO）突變。破壞亦可為減弱（KD）突變，其降低但不完全消除基因、蛋白質或酶的表現或活性。儘管KO通常能有效提高產品產量，但其有時會帶來超過收益的生長缺陷或遺傳不穩定性的懲罰，特別是對於非生長偶合產品。破壞性突變可包括例如編碼酶的基因中的突變，參與編碼酶的基因表現的基因調節元件中的突變，引入產生蛋白質的核酸，該蛋白質減少或抑制酶的活性，或引入抑制酶表現的核酸（例如反義RNA、siRNA、CRISPR）或蛋白質。可以使用此項技術已知的任何方法引入破壞性突變。

破壞性突變的引入導致本發明的微生物與本揭示案的微生物所源自的親本微生物相比不產生靶產物或基本上不產生靶產物或靶產物的量減少。例如，本揭示案的微生物可以不產生目標產物或比親本微生物少至少約1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%目標產物。例如，本揭示案的微生物可產生小於約0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0 g/L的目標產物。

「基因嵌入」係指一種基因工程化方法，涉及在基因座中取代DNA或在基因座中插入新的DNA。通常，基因嵌入會用一或多個不同的基因置換一個基因。例如，乙醯乳酸脫羧酶（ budA）基因可以被一或多種不同的基因全部或部分置換。在一個實施例中，僅置換基因的編碼區。在一個實施例中，基因的整個操縱子被置換，包括任何啟動子區域。

「密碼子優化」係指核酸（諸如基因）的突變，用於優化或改進核酸在特定菌株或物種中的轉譯。密碼子優化可能會導致較快的轉譯速度或較高的轉譯準確度。在一個實施例中，本揭示案的基因針對在 梭菌屬，尤其 自產乙醇梭菌、 楊氏梭菌或 拉氏梭菌中表現進行密碼子優化。在另一個實施例中，本揭示案的基因針對在 自產乙醇梭菌LZ1561中表現進行密碼子優化， 自產乙醇梭菌LZ1561保藏在DSMZ保藏號DSM23693。

「過表現」係指與本揭示案的微生物所源自的野生型或親本微生物相比，本揭示案的微生物中核酸或蛋白質的表現增加。過表現可藉由此項技術已知的任何方式實現，包括修改基因複本數、基因轉錄率、基因轉譯率或酶降解率。

術語「變異體」包括其序列與參考核酸及蛋白質的序列不同的核酸及蛋白質，諸如在先前技術中揭示或在本文中例示的參考核酸及蛋白質的序列。可使用執行與參考核酸或蛋白質基本上相同的功能的變異體核酸或蛋白質來實施本揭示案。例如，變異體蛋白質可執行與參考蛋白質基本上相同的功能或催化基本上相同的反應。變異體基因可編碼與參考基因相同或基本上相同的蛋白質。變異體啟動子可具有與參考啟動子基本上相同的促進一或多種基因表現的能力。

此類核酸或蛋白質在本文中可稱為「功能等效變異體」。例如，核酸的功能等效變異體可包括等位基因變異體、基因片段、突變基因、多態性及其類似物。來自其他微生物的同源基因亦為功能等效變異體的實例。此等包括 丙酮丁醇梭菌、 拜氏梭菌或 楊氏梭菌之物種中的同源基因，其詳細信息可在諸如Genbank或NCBI之網站上揭示獲得。功能等效變異體還包括其序列因特定微生物的密碼子優化而變化的核酸。核酸的功能等效變異體將較佳與所參考核酸序列具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更高的核酸序列同一性（同源性百分比）核酸。蛋白質的功能等效變異體將較佳與參考蛋白質具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更高的胺基酸同一性（同源性百分比）。可使用此項技術已知的任何方法評估變異體核酸或蛋白質的功能等效性。

可以使用此項技術已知的任何方法將核酸遞送至本揭示案的微生物。例如，核酸可以作為裸核酸遞送或者可以與一或多種試劑，諸如脂質體一起調配。若適當，核酸可為DNA、RNA、cDNA或其組合。在某些實施例中可使用限制性抑制劑。額外載體可包括質粒、病毒、噬菌體、黏質體及人工染色體。在一個實施例中，使用質粒將核酸遞送至本揭示案的微生物。例如，轉型（包括轉導或轉染）可藉由電穿孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然能力、原生質體轉型、原噬菌體誘導或綴合來實現。在某些具有活性限制酶系統的實施例中，可能有必要在將核酸引入微生物之前將核酸甲基化。

此外，核酸可設計成包含調節元件，諸如啟動子，以增加或以其他方式控制特定核酸的表現。啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。理想地，啟動子為Wood-Ljungdahl路徑啟動子、鐵氧化還原蛋白啟動子、丙酮酸:鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合操縱子啟動子、ATP合酶操縱子啟動子或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。

「微生物」為微觀生物體，尤其為細菌、古細菌、病毒或真菌。本揭示案之微生物通常為細菌。如本文所用，「微生物」之引述應理解為涵蓋「細菌」。

「親本微生物」為用於產生本揭示案微生物之微生物。親本微生物可為天然存在之微生物（例如野生型微生物）或先前已經過修飾之微生物（即突變或重組微生物）。本揭示案之微生物可經修飾以表現或過表現一或多種在親本微生物中不表現或不過表現之酶。類似地，本揭示案之微生物可經修飾以含有一或多個親本微生物所不含之基因。本揭示案之微生物亦可經修飾以不表現或表現較少量之一或多種表現於親本微生物中之酶。在一個實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌 自產乙醇梭菌、楊氏梭菌或拉氏梭菌。在一較佳實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌LZ1561，其根據布達佩斯條約（Budapest Treaty）之條款及所授予之寄存編號DSM23693，在2010年6月7日寄存在位於Inhoffenstraße 7B, D-38124 Braunschweig, Germany之德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）。此菌株描述於國際專利申請案第PCT/NZ2011/000144號，其作為WO 2012/015317公開。

術語「源自」指示核酸、蛋白質或微生物由不同（例如親本或野生型）核酸、蛋白質或微生物修飾或調適，以產生新核酸、蛋白質或微生物。此類修飾或調適通常包括核酸或基因之插入、缺失、突變或取代。一般而言，本揭示案之微生物源自親本微生物。在一個實施例中，本揭示案之微生物源自自產乙醇梭菌、楊氏梭菌或拉氏梭菌。在一實施例中，本揭示案之微生物源自以DSMZ寄存編號DSM23693寄存之自產乙醇梭菌LZ1561。

本揭示案的微生物可以基於功能特性進一步分類。例如，本揭示案的微生物可為或可以源自固定C1的微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌、羧基營養菌及/或甲烷營養菌。表1提供了微生物的代表性列表且鑑別了其功能特徵。

表 1	Wood-Ljungdahl	固定C1	厭氧菌	產乙酸菌	產乙醇菌	自養生物	羧基營養菌
伍氏醋酸桿菌	+	+	+	+	+/ - 1	+	-
巴氏嗜鹼菌	+	+	+	+	+	+	+
皮洛布勞特氏菌	+	+	+	+	-	+	+
食甲基丁酸桿菌	+	+	+	+	+	+	+
醋酸梭菌	+	+	+	+	-	+	+
自產乙醇梭菌	+	+	+	+	+	+	+
嗜羧酸梭菌	+	+	+	+	+	+	+
科斯卡塔梭菌	+	+	+	+	+	+	+
德雷克氏梭菌	+	+	+	+	-	+	+
蟻酸醋酸梭菌	+	+	+	+	-	+	+
楊氏梭菌	+	+	+	+	+	+	+
大梭菌	+	+	+	+	-	+	+/ - 2
拉氏梭菌	+	+	+	+	+	+	+
糞味梭菌	+	+	+	+	-	+	+
黏液真桿菌	+	+	+	+	-	+	+
熱自養穆爾氏菌	+	+	+	+	+	+	+
熱醋酸穆爾氏菌（原名 熱醋酸梭菌）	+	+	+	+	- 3	+	+
普氏產醋桿菌	+	+	+	+	-	+	+
卵形孢子菌	+	+	+	+	-	+	+/ - 4
醋酸孢子菌	+	+	+	+	-	+	+/ - 5
類球孢子菌	+	+	+	+	-	+	+/ - 6
基伍嗜熱厭氧菌	+	+	+	+	-	+	-

1	伍氏醋酸桿菌可以自果糖中產生乙醇，但不能從氣體中產生乙醇。
2	尚未研究 大梭菌是否可以在CO上生長。
3	已報導一種 熱醋酸穆爾氏菌菌株 ，即 穆爾氏菌屬HUC22-1可自氣體產生乙醇。
4	未調查 卵形孢子菌是否可以在CO上生長。
5	未調查 醋酸孢子菌是否可以在CO上生長。
6	未調查 類球孢子菌是否可以在CO上生長。

「Wood-Ljungdahl」係指如亦即藉由Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報（ Biochim Biophys Acta）》, 1784: 1873-1898, 2008所述之固定碳之Wood-Ljungdahl路徑。「Wood-Ljungdahl微生物」可預測係指含有Wood-Ljungdahl路徑之微生物。一般而言，本揭示案之微生物含有天然Wood-Ljungdahl路徑。在此，Wood-Ljungdahl路徑可為天然未經修飾的Wood-Ljungdahl路徑，或者其可為具有一定程度之基因修飾（例如過表現、異源表現、基因剔除等）之Wood-Ljungdahl路徑，只要其仍用以將CO、CO ₂及/或H ₂轉化成乙醯基-CoA。

「C1」係指一碳分子，例如CO、CO ₂、CH ₄或CH ₃OH。「C1氧合物」係指亦包含至少一個氧原子之一碳分子，例如CO、CO ₂或CH ₃OH。「C1碳源」係指充當本揭示案微生物之一部分或唯一碳源之一碳分子。舉例而言，C1碳源可包含CO、CO ₂、CH ₄、CH ₃OH或CH ₂O ₂中之一或多者。較佳地，C1碳源包含CO或CO ₂中之一者或兩者。「固定C1的微生物」為能夠自C1碳源產生一或多種產物之微生物。通常，本揭示案的微生物是固定C1的細菌。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中鑑別的固定C1的微生物。

「厭氧菌」為生長不需要氧氣之微生物。若氧氣以高於某一臨限值存在，則厭氧菌可消極反應或甚至死亡。然而，一些厭氧菌能夠耐受低含量之氧（例如0.000001-5%氧氣）。通常，本揭示案之微生物為厭氧菌。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中界別之厭氧菌。

「產乙酸菌（acetogens）」為使用Wood-Ljungdahl路徑作為其能量守恆及合成乙醯基-CoA及乙醯基-CoA來源之產物（諸如乙酸酯）之主要機制的絕對厭氧細菌（Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報》, 1784:1873-1898, 2008）。特定言之，產乙酸菌使用Wood-Ljungdahl路徑作為（1）自CO ₂還原合成乙醯基-CoA之機制，（2）終端接受電子、能量守恆方法，（3）固定（同化）細胞碳之合成中之CO ₂之機制（Drake, 《產乙酸原核生物（Acetogenic Prokaryotes）》,《原核生物（The Prokaryotes）》, 第3版, 第354頁, New York, NY, 2006）。所有天然存在之產乙酸菌為固定C1、厭氧、自養及非甲烷營養的。通常，本揭示案之微生物為產乙酸菌。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中鑑別之產乙酸菌。

「產乙醇菌」為產生或能夠產生乙醇之微生物。通常，本揭示案之微生物為產乙醇菌。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中鑑別之產乙醇菌。

「自養生物」為能夠在無有機碳存在之情況下生長之微生物。實際上，自養生物使用無機碳來源，諸如CO及/或CO ₂。通常，本揭示案之微生物為自養生物。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中鑑別的自養生物。

「羧基營養菌」為能夠利用CO作為唯一碳來源及能量來源之微生物。通常，本揭示案之微生物為羧基營養菌。在一個實施例中，本揭示案的微生物源自表1中鑑別的一氧化碳營養生物。

「羧基營養菌」為能夠利用甲烷作為唯一碳來源及能量來源之微生物。在某些實施例中，本揭示案的微生物為甲烷營養菌或源自甲烷營養菌。在其他實施例中，本揭示案的微生物並非甲烷營養菌或並非源自甲烷營養菌。

更廣泛地，本揭示案的微生物可源自表1中鑑別的任何屬或種。例如，微生物可為選自由 醋桿菌屬、嗜鹼菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬、真桿菌屬、穆爾氏菌屬、氧化桿菌屬、孢子菌屬及熱厭氧桿菌屬組成之群組的屬的成員。特定言之，微生物可源自選自由以下組成之群組的親本細菌：伍氏醋酸桿菌（ Acetobacterium woodii）、巴氏嗜鹼菌（ Alkalibaculum bacchii）、皮洛布勞特氏菌（ Blautia producta）、食甲基丁酸桿菌（ Butyribacterium methylotrophicum）、醋酸梭菌（ Clostridium aceticum）、自產乙醇梭菌（ Clostridium autoethanogenum）、嗜羧酸梭菌（ Clostridium carboxidivorans）、科斯卡塔梭菌（ Clostridium coskatii）、德雷克氏梭菌（ Clostridium drakei）、蟻酸醋酸梭菌（ Clostridium formicoaceticum）、永達爾梭菌（ Clostridium ljungdahlii）、大梭菌（ Clostridium magnum）、拉氏梭菌（ Clostridium ragsdalei）、糞味梭菌（ Clostridium scatologenes）、黏液真桿菌（ Eubacterium limosum）、熱自養穆爾氏菌（ Moorella thermautotrophica）、熱醋酸穆爾氏菌（ Moorella thermoacetica）、普氏產醋桿菌（ Oxobacter pfennigii）、卵形孢子菌（ Sporomusa ovata）、醋酸孢子菌（ Sporomusa silvacetica）、類球孢子菌（ Sporomusa sphaeroides）及基伍嗜熱厭氧菌（ Thermoanaerobacter kivui）。

在一個實施例中，本揭示案的微生物源自梭菌綱的簇，包含物種 自產乙醇梭菌、楊氏梭菌及 拉氏梭菌。此等物種首先由Abrini, 《微生物學檔案（ Arch Microbiol）》, 161: 345-351, 1994（ 自產乙醇梭菌）、Tanner, 《國際系統細菌學雜誌（ Int J System Bacteriol）》, 43: 232-236, 1993（ 楊氏梭菌）及Huhnke, WO 2008/028055（ 拉氏梭菌）進行報導及表徵。

此等三個物種有許多相似之處。特定言之，此等物種均為梭菌屬的固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養的成員。此等物種具有相似的基因型及表型以及能量守恆及醱酵代謝的模式。此外，此等物種聚集在梭菌綱rRNA同源組I中，16S rRNA DNA具有超過99%的相同性，DNA G + C 含量為約22-30 mol%，革蘭氏陽性，具有相似的形態及大小（對數生長的細胞在0.5-0.7 × 3-5 μm之間），嗜溫（在30-37℃下生長最佳），具有約4-7.5的相似pH範圍（最佳pH為約5.5-6），缺乏細胞色素，且經Rnf複合物保存能量。此外，在此等物種中已顯示羧酸還原為其相應的醇 (Perez, 《生物技術與生物工程（ Biotechnol Bioeng）》 , 110:1066-1077, 2012)。重要的是，此等物種亦均在含CO的氣體上顯示強烈的自養生長，產生乙醇及乙酸酯（或乙酸）作為主要醱酵產物，且在某些條件下產生少量的2,3-丁二醇及乳酸。

然而，此等三個物種亦具有許多不同之處。此等物種自不同來源分離：來自兔腸道的 自產乙醇梭菌、來自雞場廢物的 楊氏梭菌及來自淡水沈積物的 拉氏梭菌。此等物種在利用各種糖（例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、檸檬酸）、胺基酸（例如精胺酸、組胺酸）及其他受質（例如甜菜鹼、丁醇）方面存在差異。此外，此等物種對某些維生素（例如硫胺素、生物素）的營養缺陷型不同。此等物種在Wood-Ljungdahl路徑基因及蛋白質的核酸及胺基酸序列上存在差異，儘管已發現此等基因及蛋白質的一般組織及數目在所有物種中菌相同（Köpke, 《生物技術的最新觀點（ Curr Opin Biotechnol）》, 22: 320 -325, 2011)。

因此，總而言之， 自產乙醇梭菌、 楊氏梭菌或 拉氏梭菌 的許多特徵並非該物種所特有的，而是該梭菌屬的固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養成員的此簇的普遍特徵。然而，由於此等物種實際上是不同的，因此對此等物種之一的基因修飾或操作可能不會對此等物種中的另一個產生相同的影響。例如，可以觀測到生長、效能或產品生產的差異。

本揭示案的微生物亦可源自 自產乙醇梭菌，楊氏梭菌或 拉氏梭菌的分離株或突變體。 自產乙醇梭菌的分離株及突變體包括JA1-1（DSM10061）（Abrini, 《微生物學檔案》, 161: 345-351, 1994）、LZ1560（DSM19630）（WO 2009/064200）及LZ1561（DSM23693）（WO 2012/015317）。 楊氏梭菌的分離株及突變體包括ATCC 49587（Tanner, 《國際系統細菌學雜誌》, 43: 232-236, 1993）、PETCT（DSM13528, ATCC 55383）、ERI‐2（ATCC 55380）（US 5,593,886）、C‐01 （TCC 55988）（US 6,368,819）、O‐52（ATCC 55989）（US 6,368,819）及OTA‐1（Tirado‐Acevedo, 《使用 楊氏梭菌自合成氣產生生物乙醇（Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii）》, PhD thesis, 北卡羅來納州立大學（North Carolina State University）, 2010）。 拉氏梭菌的分離株及突變體包括PI 1（ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826）（WO 2008/028055）。

「受質」係指用於本揭示案的微生物的碳源及/或能量源。通常，受質是氣態的且包含C1-碳源，例如CO、CO ₂及/或CH ₄。較佳地，受質包含CO或CO+CO ₂的C1-碳源。受質亦可包含其他非碳組分，諸如H ₂、N ₂或電子。

受質通常包含至少一定量的CO，諸如約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mol% CO。受質可包含一定範圍的CO，諸如約20-80、30-70或40-60 mol% CO。較佳地，受質包含約40-70 mol% CO（例如鋼廠或高爐煤氣）、約20-30 mol% CO（例如鹼性氧氣爐氣）或約15-45 mol% CO（例如合成氣）。在一些實施例中，受質可包含相對低量的CO，諸如約1-10或1-20 mol% CO。本揭示案的微生物通常將受質中的至少一部分CO轉化為產物。在一些實施例中，受質不包含或基本上不包含（＜ 1 mol%）CO。

受質可包含一定量的H ₂。例如，受質可包含約1、2、5、10、15、20或30 mol%的H ₂。在一些實施例中，受質可包含相對高量的H ₂，諸如約60、70、80或90 mol%的H ₂。在其他實施例中，受質不包含或基本上不包含（＜1mol%）H ₂。

受質可包含一定量的CO ₂。例如，受質可包含約1-80或1-30 mol% CO ₂。在一些實施例中，受質可包含小於約20、15、10或5 mol%CO ₂。在另一實施例中，受質不包含或基本上不包含（＜1mol%）CO ₂。

儘管受質通常為氣態，但受質亦可以替代形式提供。舉例而言，受質可使用微泡分散發生器溶解於用CO氣體飽和之液體中。另外舉例而言，受質可吸附至固體載體上。

受質及/或C1-碳源可為作為工業製程的副產物獲得或來自另一來源（諸如內燃機廢氣、沼氣、掩埋產氣、直接空氣捕獲）或來自電解之廢氣。受質及/或C1-碳源可為藉由熱解、焙燒或氣化產生之合成氣。換言之，可藉由熱解、焙燒或氣化來回收廢材料，以產生用作受質及/或C1-碳源之合成氣。受質及/或C1-碳源可為包含甲烷的氣體，且在某些實施例中，受質及/或C1-碳源可為非廢氣。

在某些實施例中，工業製程選自黑色金屬產品製造，諸如鋼鐵製造、有色金屬產品製造、石油精煉、電力生產、炭黑生產、造紙及紙漿製造、氨生產、甲醇生產、焦炭製造、石油化工生產、碳水化合物醱酵、水泥製造、好氧消化、厭氧消化、催化製程、天然氣提取、纖維素醱酵、石油提取、地質儲層的工業加工、天然氣煤及石油等化石資源的加工，或其任何組合。工業製程中的具體加工步驟的實例包括催化劑再生、流化催化劑裂化及催化劑再生。空氣分離及直接空氣捕獲是其他適合工業製程。鋼鐵及鐵合金製造中的具體實例包括高爐煤氣、鹼性氧氣爐煤氣、焦爐煤氣、鐵爐爐頂煤氣的直接還原及煉鐵的殘餘氣體。其他一般實例包括來自燃燒鍋爐及燃燒加熱器的煙道氣，諸如天然氣、石油或燃煤鍋爐或加熱器，以及燃氣輪機排氣。在此等實施例中，受質及/或C1-碳源可在其排放至大氣中之前使用任何已知方法自工業製程捕獲。

受質及/或C1-碳源可為稱為合成氣的合成氣體，其可自重整、部分氧化或氣化製程中獲得。氣化製程的實例包括煤的氣化、煉油廠殘渣的氣化、石油焦的氣化、生物質的氣化、木質纖維素材料的氣化、廢木材的氣化、黑液的氣化、城市固體廢物的氣化、城市液體廢物的氣化、工業固體廢物的氣化、工業液體廢物的氣化、垃圾來源燃料的氣化、污水的氣化、污水污泥的氣化、廢水處理產生的污泥的氣化、沼氣的氣化，諸如當添加沼氣以增強另一種材料的氣化時。重整製程的實例包括蒸汽甲烷重整、蒸汽石腦油重整、天然氣重整、沼氣重整、掩埋產氣重整、石腦油重整及乾甲烷重整。部分氧化製程的實例包括熱及催化部分氧化製程、天然氣的催化部分氧化、烴的部分氧化。城市固體廢物的實例包括輪胎、塑膠及纖維，諸如鞋、服裝及紡織品中的纖維。城市固體廢物可能只是掩埋場類型的廢物，且可分類或未分類。生物質之實例可包括木質纖維素材料及微生物生物質。木質纖維素材料可包括農業廢料及森林廢料。

受質及/或C1-碳源可為包含甲烷的氣流。此類含甲烷氣體可以諸如在壓裂、廢水處理、牲畜、農業及城市固體掩埋場期間自化石甲烷排放獲得。亦設想可以燃燒甲烷以產生電或熱，且C1副產物可用作受質或碳源。

受質的組成可能對反應的效率及/或成本具有顯著影響。例如，氧氣（O ₂）的存在會降低厭氧醱酵過程的效率。視受質的組成而定，可能需要處理、擦洗或過濾受質以移除任何非所要雜質，諸如毒素、非所要組分或灰塵顆粒，及/或增加所需組分的濃度。

在某些實施例中，醱酵在無碳水化合物受質，諸如糖、澱粉、木質素、纖維素或半纖維素存在的情況下進行。

本揭示案之微生物可與氣流一起培養以產生一或多種產物。舉例而言，本揭示案之微生物可產生或可經工程化以產生乙醇（WO 2007/117157）、乙酸酯（WO 2007/117157)、1-丁醇（WO 2008/115080、WO 2012/053905及WO 2017/066498）、丁酸酯（WO 2008/115080）、2,3-丁二醇（WO 2009/151342及WO 2016/094334）、乳酸酯（WO 2011/112103）、丁烯（WO 2012/024522）、丁二烯（WO 2012/024522）、甲基乙基酮（2-丁酮）（WO 2012/024522及WO 2013/185123）、乙烯（WO 2012/026833）、丙酮（WO 2012/115527）、異丙醇（WO 2012/115527）、脂質（WO 2013/036147）、3-羥基丙酸酯（3-HP）（WO 2013/180581）、萜類，包括異戊二烯（WO 2013/180584）、脂肪酸（WO 2013/191567）、2-丁醇（WO 2013/185123）、1,2-丙二醇（WO 2014/036152）、1-丙醇（WO 2017/066498）、1‑己醇（WO 2017/066498）、1-辛醇（WO 2017/066498）、分支酸衍生產物（WO 2016/191625）、3‑羥基丁酸酯（WO 2017/066498）、1,3‑丁二醇（WO 2017/066498）、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸（WO 2017/066498）、異丁烯（WO 2017/066498）、己二酸（WO 2017/066498）、1,3-己二醇（WO 2017/066498）、3-甲基-2-丁醇（WO 2017/066498）、2-丁烯-1-醇（WO 2017/066498）、異戊酸酯（WO 2017/066498）、異戊醇（WO 2017/066498）及單乙二醇（WO 2019/126400）。在某些實施例中，微生物生物質本身可視為產物。此等產物可進一步轉化以產生柴油、噴射機燃料及/或汽油之至少一種組分。另外，微生物生物質可進一步加工以產生單細胞蛋白質（SCP）。

「天然產物」為藉由未經基因修飾之微生物產生之產物。舉例而言，乙醇、乙酸酯及2,3-丁二醇為自產乙醇梭菌、楊氏梭菌及拉氏梭菌之天然產物。「非天然產物」為藉由經基因修飾微生物產生而非藉由產生經基因修飾微生物之未經基因修飾微生物產生之產物。

「選擇性」係指靶產物之產量與藉由微生物產生之所有醱酵產物之產量的比率。本揭示案之微生物可經工程化而以一定選擇性或最小選擇性產生產物。在一個實施例中，目標產物占由本揭示案的微生物產生的所有醱酵產物的至少約5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一個實施例中，靶產物占藉由本揭示案之微生物產生之所有醱酵產物之至少10%，使得本揭示案之微生物對至少10%之靶產物具有選擇性。在另一實施例中，靶產物占藉由本揭示案之微生物產生之所有醱酵產物之至少30重量%，使得本揭示案微生物對至少30%之靶產物具有選擇性。

通常，培養在生物反應器中進行。術語「生物反應器」包括由一或多個容器、塔或管道排列組成之培養/醱酵裝置，諸如連續攪拌槽反應器（CSTR）、固定細胞反應器（ICR）、滴流床反應器（TBR）、氣泡柱、氣舉醱酵器、靜態混合器，或適用於氣液接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二培養/醱酵反應器。基材可提供給此等反應器中的一個或兩個。如本文所用，術語「培養」及「醱酵」可互換使用。此等術語涵蓋培養/醱酵過程的生長期及產物生物合成階段。

培養物通常維持在含有足以允許微生物生長的營養物、維生素及/或礦物質的水性培養基中。較佳地，水性培養基是厭氧微生物生長培養基，諸如最小厭氧微生物生長培養基。合適的介質是此項技術中熟知的。 實例

以下實例進一步說明本發明，但當然不應視為以任何方式限制其範疇。 實例 1

本實例描述了Δ budAΔ secAdh微生物。

乙醯乳酸脫羧酶為形成2,3-丁二醇（2,3-BDO）的關鍵步驟（Köpke, 《應用與環境微生物學》, 80: 3394-3405, 2014）並且已證明敲除此酶可消除 2,3-BDO產生（WO 2013/115659）。為了將通量引導至其他異源產物（諸如丙酮）， 預計敲除相應的 budA基因會提高產量。

在已含有一級-二級醇脫氫酶 （ secAdh ）基因敲除 （ ΔsecAdh ）（ WO2015/085015）的 自產乙醇梭菌菌株敲除 budA得到Δ budAΔ secAdh菌株 。 budA 的敲除如先前所述進行（WO 2013/115659）。

單菌落經分離且重新劃線到新鮮的適當選擇平板上，且隨後篩選雙交叉事件。確認具有正確大小的PCR產物的雙交叉事件再次重新劃線以確保質粒丟失。將正確的菌落挑入液體培養基中且製備冷凍原液。藉由全基因體定序確認基因型，且藉由生長研究及連續攪拌釜反應器（CSTR）運行檢查表型。如圖1所示，觀測到代謝物產量及氣體消耗/產量的波動。 實例 2

此實例描述Δ budAΔ secAdh微生物自質粒表現的丙酮路徑（ thlA、 ctfAB、 adc） 。

實例1的Δ budAΔ secAdh微生物進一步修飾以引入含有丙酮路徑（ thlA、 ctfAB、 adc）的質粒。此菌株比具有相同路徑且在相同生長條件下但未敲除 budA的親本Δ secAdh菌株產生更少的丙酮。此令人驚訝，因為 budA的敲除預計會將碳通量自2,3-BDO重定向至其他代謝物，諸如丙酮及/或乙醇。

此外，此菌株在具有以下氣體混合物的CSTR中生長不佳或表現出穩定的丙酮生產：50% CO 10% H ₂、30% CO ₂、餘量為N ₂（圖2）。此外，在生長期間觀測到振盪模式：生產的峰及谷、CO 和氫的吸收與乙酸酯和CO ₂生產的谷和峰相協調。 實例 3

此實例描述一種Δ secAdh微生物，其在乙醯乳酸脫羧酶（ budA）基因座處基因嵌入丙酮路徑（ thlA、 ctfAB、 adc）。

使用 budAKO質粒作為骨架建構在 budA基因座處丙酮路徑基因嵌入的KI/KO質粒且在5'及3' budAKO同源臂之間插入丙酮路徑。丙酮路徑含有在Pfer啟動子控制下的 thlA、 ctfAB及 adc。使用GeneArt無縫選殖及組裝套組（賽默飛世爾科技（ThermoFisher Scientific））組裝完整的KI/KO質粒。正確的KI/KO質粒進行PCR篩選及定序確認。

獲得KI突變體的製程與先前在建構 budAKO菌株中描述的相同，產生在 budA基因座處引入丙酮路徑的Δ budAΔ secAdh菌株。進行PCR篩選且生長具有正確大小的PCR產物的菌落，分離基因體DNA且進行全基因體DNA定序以確認基因型。

菌株在具有以下氣體混合物之CSTR中生長：50% CO 10% H ₂、30% CO ₂，餘量為 N ₂。該菌株生長良好且產生高水準的丙酮（圖 3）。 實例 4

此比較例描述一種微生物，其具有功能性一級-二級醇脫氫酶（ secAdh）及在雙功能醛-醇脫氫酶（ adhE1+ adhE2）基因座處基因嵌入丙酮路徑（ thlA、 ctfAB、 adc） 。一級-二級醇脫氫酶（ secAdh）將丙酮轉化為異丙醇，使得此菌株產生異丙醇而非丙酮。

丙酮路徑插入 adhE1+adhE2基因座處，步驟與上述步驟類似。同源臂經PCR擴增，且基因型經定序確認。

該菌株在CSTR中生長不良，且不能充分產生異丙醇或乙醇（圖4）。在反應器中需要約6天才能獲得足夠的細胞生物質來生產乙醇及異丙醇。在為期兩週的實驗過程中，醱酵不穩定。因此，在 adhE1+adhE2基因座處基因嵌入不會帶來與在 budA基因座處基因嵌入相同的益處。 實例 5

此實例描述 budA基因座處其他基因或路徑的整合。

Wood-Ljungdahl微生物已經工程化以生產多種非天然產物，包括1-丁醇（WO 2008/115080、WO 2012/053905及WO 2017/066498）、丁酸酯（WO 2008/115080）、丁烯（WO 2012/024522）、丁二烯（WO 2012/024522）、甲基乙基酮（2-丁酮）（WO 2012/024522及WO 2013/185123）、乙烯（WO 2012/026833）、丙酮（WO 2012/115527）、異丙醇（WO 2012/115527）、脂質（WO 2013/036147）、3-羥基丙酸酯（3-HP）（WO 2013/180581）、萜烯，包括異戊二烯（WO 2013/180584）、脂肪酸（WO 2013/191567）、2-丁醇（WO 2013/185123）、1,2-丙二醇（WO 2014/036152）、1-丙醇（WO 2017/066498）、1-己醇（WO 2017/066498）、1-辛醇（WO 2017/066498）、分支酸衍生產物（WO 2016/191625）、3-羥基丁酸酯（WO 2017/066498）、1,3-丁二醇（WO 2017/066498）、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸（WO 2017/066498）、異丁烯（WO 2017/066498）、己二酸（WO 2017/066498）、1,3-己二醇（WO 2017/066498）、3-甲基-2-丁醇（WO 2017/066498)、2-丁烯-1-醇（WO 2017/066498）、異戊酸酯（WO 2017/066498）、異戊醇（WO 2017/066498）及單乙二醇（WO 2019/126400）。此等基因或路徑中的任一者均可在 budA基因座處基因嵌入，以產生具有改進效能的菌株。

在一個實施例中，基因嵌入DNA編碼包含例如 thlA及 hbd的3-羥基丁酸路徑。在一個實施例中，基因嵌入DNA編碼替代性3-羥基丁酸路徑，包含例如 thlA 、 ctfAB及 hbd。在一個實施例中，基因嵌入DNA編碼包含例如 thlA 、 hbd 、 bcd及 etfAB的丁醇路徑。在一個實施例中，基因嵌入DNA包含甲羥戊酸路徑，其包含例如 thlA 、 HMGS及 HMGR。此等路徑可能在一或多種啟動子，例如P _budA及/或P _fer的控制下。 實例 6

此實例描述組學及動力學集成建模引導的通量優化。

在一個實施例中，對來自組合文庫的十一種菌株進行蛋白質組學量測。此等分析包括一組菌株，此等菌株具有由不同強度的不同啟動子驅動的相同參考基因，導致不同的丙酮及3-HB水準（圖5）。總共有1916種不同的蛋白質可在所有菌株中進行量化，其中丙酮路徑特異性酶在所有樣品中均很豐富，按豐度中位數排序時，屬於資料集的前3.2%。統計分析顯示，相對於基準菌株，所有組合菌株中此等酶的水準存在顯著差異。丙酮產量與丙酮路徑酶的豐度密切相關，在產量最低的菌株中發現的豐度最低。一致地，發現 ctfAB的兩個亞基相較於 thlA及 Adc具有相對較低的表現量，而不管使用的啟動子（圖5）。在一個實施例中，藉由測定 ctfAB的倍數變化來證明預測的丙酮及異丙醇通量。在一個實施例中，動力學整體模型預測到丙酮及異丙醇的總通量將隨著 ctfAB表現的增加而增加。 實例 7

此比較例描述測試具有用啟動子pWL及 ctfAB選擇的序列的菌株。

在一個實施例中，將啟動子pWL及 ctfAB的序列選殖至載體中，且隨後轉化至表現最佳的丙酮及異丙醇菌株中。進行生長實驗來比較此等菌株。在一個實施例中，當存在額外的 ctfAB複本時，觀測到所需產物的顯著增加以及其他代謝物的減少。此等結果隨後在CSTR中得到確認，產生約20g/L異丙醇（圖 6A-C）。 實例 8

此比較例描述測試整個路徑的額外複本（具有 thlA、 ctfAB及 Adc的菌株）。

在一個實施例中，在質粒上額外表現丙酮路徑（ thlA 、 ctfAB 、 adc）、僅額外表現 ctfAB或無額外路徑表現的微生物的醱酵（圖7）。在僅具有額外 ctfAB的菌株中看到的改進比在具有額外複本的每個路徑基因的菌株中看到的多。在一個實施例中，此由於選擇具有已知蛋白質豐度改善的啟動子及 ctfAB變異體 。 實例 9

此比較例描述 ctfAB的額外複本整合至基因體中。

在一個實施例中，在用額外的 ctfAB複本確認改進後，將序列整合至基因體中。在基因中進行基因嵌入的同時，一些基因同時被敲除。此等被預測為丙酮及異丙醇生產的有益敲除。在產生的每個菌株中，觀測到異丙醇產量的提高，類似於先前描述的質粒菌株，但不具有 ctfAB的額外複本。在一個實施例中，相較於不具有額外 ctfAB複本的整合基因體菌株，具有額外 ctfAB複本的整合基因體菌株顯示出異丙醇產量的提高（圖8）。 實例 10

此實例描述 ctfAB的額外複本至基因體中的整合。

在一個實施例中，組學量測、動力學建模及無細胞原型均表明 ctfAB是丙酮生產的限制步驟。發現 ctfAB的第二複本藉由表現 ctfAB變異體及啟動子組合而在該菌株中之質粒上展現最高蛋白質豐度，此導致丙酮選擇性有40%的進一步增加（圖9中，左圖）。

在一個實施例中，整合菌株導致丙酮選擇性及培養穩定性顯著改善，達到＞4週的穩態生產（圖9，左圖）。

在一個實施例中，變異體對於異丙醇生產表現出最高效價及穩定性。在一個實施例中，整合菌株具有與丙酮整合菌株相當的效能水準（即使在醱酵方案的小調整後選擇性甚至略有提高）（圖9，右圖）。對於丙酮及異丙醇，表現c tfAB的額外複本進一步提高了效能，在高達約3 g/L/h的高速率下實現90%選擇性（圖9），氣體利用率為85%。

本文中所引用之所有參考文獻（包括揭示案、專利申請案及專利）均以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同各參考文獻個別地且特定地以引用的方式併入且全文闡述於本文中一般。在本說明書中對任何先前技術之參考並非且不應視為承認先前技術形成任何國家所致力領域之公共常識的一部分。

除非本文另外指明或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本揭示案之內容中（尤其在以下申請專利範圍之內容中）使用術語「一（a/an）」及「該」及類似指示物應視為涵蓋單個與複數個。除非另外說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」視為開放式術語（亦即意謂「包括（但不限於）」）。術語「基本上由……組成」將組成、製程或方法之範疇限制於規定材料或步驟，或實質上不影響所主組成、製程或方法之基礎及新穎特徵的材料或步驟。使用替代物(例如「或」)應理解為意謂替代物中之一者、兩者或其任何組合。如本文所用，除非另外指明，否則術語「約」意謂指定範圍、值或結構之±20%。

除非本文另外指明，否則本文中數值範圍之列舉僅意欲充當個別提及屬於所述範圍內之各獨立值之簡寫方法，且各獨立值併入本說明書中，其併入程度如同在本文中個別列舉一般。舉例而言，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、整數範圍、尺寸範圍或厚度範圍均理解為包括所列舉範圍內之任何整數值，且適當時包含其分數（諸如整數之十分之一及百分之一）。

除非本文另外指明或另外明顯與上下文相矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何適合次序進行。除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言（例如「諸如」）僅意欲較佳地闡明本揭示案而不對本揭示案之範疇造成限制。本說明書中之語言不應視為暗指任何未主張之要素對於實踐本揭示案而言必不可少。

本文描述了本揭示案的實施例。在閱讀前文之描述時，彼等實施例之變化對於一般技術者可變得顯而易知。本發明者期望熟習此項技術者適當時採用此類變化，且本發明者意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本發明。因此，若適用法律允許，則本揭示案包括在隨附於本文之申請專利範圍中所敍述之標的物之所有修改及等效物。此外，除非本文另外指明或另外與上下文明顯相矛盾，否則本揭示案涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。

在第一實施例中，本揭示案係關於包含第一外源CoA轉移酶及至少一種額外外源CoA轉移酶的基因工程化Wood-Ljungdahl微生物。

第一實施例的微生物，其中第一外源CoA轉移酶置換乙醯乳酸脫羧酶基因的編碼區。

第一實施例的微生物，其中至少一種額外的外源CoA轉移酶置換醛-醇脫氫酶基因的編碼區。

第一實施例的微生物，進一步包含外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，以及第一外源CoA轉移酶。

第一實施例的微生物，進一步包含外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合。

第一實施例的微生物，進一步包含外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合，其中外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合與第一外源CoA轉移酶一起起作用或與至少一種額外外源CoA轉移酶一起起作用。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB，且其中外源CoA轉移酶對微生物而言是非天然的。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB，且其中外源CoA轉移酶對微生物而言是天然的。

第一實施例之微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CTFA及CtfB，或 拜氏梭菌CTFA及CtfB，且其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CTFA及CtfB，或 拜氏梭菌CTFA及CtfB，其中外源CoA轉移酶相同。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB，其中外源CoA轉移酶不同 。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CTFA及CtfB，或 拜氏梭菌CTFA及CtfB，其中外源CoA轉移酶在乙醯乳酸脫羧酶啟動子及至少一個其它啟動子的控制下。

第一實施例的微生物，其中該微生物不產生2,3-丁二醇。

第一實施例的微生物，其中該微生物產生丙酮及異丙醇中的一或多種。

第一實施例的微生物，進一步包含一級-二級醇脫氫酶基因、硫酯酶基因、3-羥基丁醯coA脫氫酶基因或其任何組合的破壞性突變。

第一實施例的微生物，其中外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌CtfA及CtfB，且其中外源CoA轉移酶能夠產生1-丁醇、丁酸、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、丙酮、異丙醇、脂質、3-羥基丙酸酯、萜烯、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸衍生產物、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸、異丁烯、己二酸、酮基-己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸酯、異戊醇或單乙二醇。

第一實施例的微生物，其中該微生物是固定C1的微生物。

第一實施例的微生物，進一步包含外源硫解酶、選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合，以及至少一種額外外源CoA轉移酶。

第一實施例的微生物，進一步包含外源硫解酶、選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合。

第一實施例的微生物，其中該微生物是細菌。

第一實施例的微生物，其中該微生物是選自 醋桿菌屬、嗜鹼菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬、真桿菌屬、穆爾氏菌屬、氧化桿菌屬、孢子菌屬或 熱厭氧桿菌屬的成員。

一種增加產物產量的方法，其包含在氣態受質存在下培養第一實施例的微生物。

用於增加產物產量的方法包含在氣態受質存在下培養第一實施例的微生物，其中氣態受質包含含有CO、CO ₂及H ₂中的一或多種的C1-碳源。

增加產物產量的方法包含在氣態受質存在下培養第一實施例的微生物，其中氣態受質包含合成氣或工業廢氣。

用於增加產物產量的方法包含在氣態受質存在下培養第一實施例的微生物，其中產物是丙酮及異丙醇中的一或多種。

無

圖1為描繪了具有破壞的乙醯乳酸脫羧酶基因（Δ budA）及破壞的一級-二級醇脫氫酶基因（Δ secAdh）的微生物的醱酵的一組曲線圖。頂部圖顯示代謝產物（乙醇及乙酸酯）。底部圖顯示氣體消耗及產生（CO、CO ₂及H ₂）。

圖2為描繪了在質粒上表現丙酮路徑 （ thlA ， ctfAB ， ADC ）的的Δ budAΔ secAdh微生物的醱酵的一組曲線圖。丙酮路徑受P _fer啟動子控制。頂部圖顯示代謝物產生（乙醇、乙酸酯及丙酮）。底部圖顯示氣體消耗及產生（CO、CO ₂及H ₂）。

圖3為描繪了在乙醯乳酸脫羧酶基因（ budA）基因座處基因嵌入丙酮路徑（ thlA 、 ctfAB 、 adc ）的 ΔsecAdh微生物的醱酵的一組曲線圖 。丙酮路徑受P _budA啟動子及P _fer啟動子的控制。頂部圖顯示代謝物產生（乙醇、乙酸酯及丙酮）。底部圖顯示氣體消耗及產生（CO、CO ₂及H ₂）。

圖4為描繪了在雙功能醛-醇脫氫酶（ adhE1+ adhE2）基因座及功能性一級-二級醇脫氫酶（ secAdh）基因處基因嵌入丙酮路徑（ thlA 、 ctfAB 、 adc）的微生物醱酵的一組曲線圖。一級-二級醇脫氫酶（ secAdh）將丙酮轉化為異丙醇，使得此菌株產生異丙醇而非丙酮。丙酮路徑受P _adhE1/E2啟動子及P _fer啟動子的控制。頂部圖顯示代謝物產生（乙醇、乙酸酯、丁二醇及異丙醇）。底部圖顯示氣體消耗及產生（CO、CO ₂及H ₂）。

圖5為描繪所選菌株之蛋白質表現及丙酮產生水準的 條形圖，表明尤其在具有低丙酮產量之菌株中通常低 ctfAB表現。基於醱酵資料的代謝模型亦指出 ctfAB反應為丙酮/異丙醇產生中的一個限制步驟。

圖6A-C為描繪丙酮及異丙醇質粒菌株在生產所需產物中的比較的幾組曲線圖。頂部圖顯示具有額外 ctfAB複本的菌株中丙酮產量的增加。中間圖和底部圖顯示了在具有額外 ctfAB複本的菌株中增加的異丙醇產量。

圖7為描繪在質粒上額外表現丙酮路徑（ thlA 、 ctfAB 、 adc）、僅額外表現 ctfAB或無額外路徑表現的微生物醱酵的曲線圖。丙酮路徑受P _fer啟動子控制。

圖8為描繪與不具有額外 ctfAB複本的整合基因體菌株相比，具有額外 ctfAB複本的整合基因體菌株顯示異丙醇產量改善的曲線圖。

圖9為描繪 ctfAB的額外複本對丙酮及異丙醇產生的影響的一組柱狀圖。左圖顯示連續的丙酮產生及 ctfAB額外複本的影響。右圖顯示使用不同 secAdh變異體的連續異丙醇產生 以及額外 ctfAB複本的影響。


          <![CDATA[<110>  美商朗澤公司(LanzaTech, Inc.)]]>
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          <![CDATA[<223>  adhE1，自產乙醇梭菌]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          atgaaagtta caaacgtaga agaactaatg aaaagactag aagaaataaa ggatgctcaa       60
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          gcagctaata gtgctagaat agaactagct aaaatggcag tagaagaaag cggaatggga      180
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          accgaaccaa ttgtagaaga tgaagaaaag taattattaa ataaaaatgg tgttcaaata     2640
          aaatttgaac accattttta tttttaagga gtaaatatga ataataataa catagaaaca     2700
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          aaagagagta tatgtttttc ctaagatggg agaaaaggca atgatgattt cagtagcaac     4560
          atccgcagga acagggtcag aagttactcc atttgcagta attacggacg aaagaacagg     4620
          agctaaatat cctctggctg attatgaatt aactccaaac atggctatag ttgatgcaga     4680
          acttatgatg ggaatgccaa aggggctaac agcagcttca ggtatagatg cgttgactca     4740
          tgcactggag gcctatgtgt caataatggc ttcagaatat accaacggat tggctcttga     4800
          agcaacaaga ttagtattca aatatttgcc aatagcttat acagaaggta caattaatgt     4860
          aaaggcaaga gaaaaaatgg ctcatgcttc atgtattgca ggtatggcct ttgccaatgc     4920
          atttttaggg gtatgccact ctatggcaca taaattggga gcacagcacc acataccaca     4980
          tggaattgcc aatgcactta tgatagatga agttataaaa ttcaatgctg tagaggctcc     5040
          aaggaaacaa gcggcatttc cacaatataa atatccaaat gttaaaagaa gatatgctag     5100
          aatagctgat tacctaaatt taggtggaag tacagatgat gaaaaagtac aattgctaat     5160
          aaatgctata gatgacttaa aaactaagtt aaatattcca aagactatta aagaagcagg     5220
          agtttcagaa gataaattct atgctacttt agatacaatg tcagaactgg cttttgatga     5280
          tcaatgtaca ggagctaatc cacgatatcc actaatagga gaaataaaac aaatgtatat     5340
          aaatgcattt gatacaccaa aggcaactgt ggagaagaaa acaagaaaga aaaagtaa       5398
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  500]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  含有PadhE1/E2啟動子之區，自產乙醇梭菌]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          atatccacta aaaaaataaa attataataa aaaatacaaa aaaataattg acaatatata       60
          aataattatg cataattata tcatgataac aattagttaa gcataattac atatatatga      120
          acataatatg acatcttaga agcatatctt tcgttagtaa taatataatt tcctttagaa      180
          gaaaatgatt tatttaaaat aaatagtgta atgtttttta taatttcaaa aagttcccca      240
          atttagcata ctaggcatga taaaaatagc ttgaataagt gcttgctatt atttattgat      300
          acatagagaa tttcactctt tgcattttat ctaacatcaa ggggtttatt tgtcacaaat      360
          tatgtaaaaa taaaacaaag atgtaagaaa atcctatgat ataaattttg taaacataat      420
          aaattagctt tgataagatt ggaagaatga tagttactac ttagaactgc taaaaattag      480
          gaaagaggtg tcgctaatta                                                  500
          

Claims (22)

1. 一種基因工程化的Wood-Ljungdahl微生物，其包含第一外源CoA轉移酶及至少一種額外的外源CoA轉移酶。
2. 如請求項1之微生物，其中該第一外源CoA轉移酶置換乙醯乳酸脫羧酶基因的編碼區。
3. 如請求項1之微生物，其中該至少一種額外的外源CoA轉移酶置換醛-醇脫氫酶基因的編碼區。
4. 如請求項1之微生物，其進一步包含外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的外源脫羧酶，或其任何組合。
5. 如請求項4之微生物，其中該外源硫解酶及選自乙醯乙酸脫羧酶或α-酮異戊酸脫羧酶的該外源脫羧酶，或其任何組合與第一外源CoA轉移酶一起起作用或與至少一種另外的外源CoA轉移酶一起起作用。
6. 如請求項1之微生物，其中該等外源CoA轉移酶是 丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum ）CtfA及CtfB，或 拜氏梭菌（ Clostridium beijerincki ）CtfA及CtfB。
7. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶對該微生物而言是非天然的。
8. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶對於該微生物是天然的。
9. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶相同。
10. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶不同。
11. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶在乙醯乳酸脫羧酶啟動子及至少一種其他啟動子的控制下。
12. 如請求項1之微生物，其中該微生物不產生2,3-丁二醇。
13. 如請求項1之微生物，其中該微生物產生丙酮及異丙醇中的一或多種。
14. 如請求項1之微生物，其進一步包含一級-二級醇脫氫酶基因、硫酯酶基因、3-羥基丁醯coA脫氫酶基因或其任何組合的破壞性突變。
15. 如請求項6之微生物，其中該等外源CoA轉移酶能夠產生1-丁醇、丁酸、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、異丙醇、脂質、3-羥基丙酸酯、萜烯、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸衍生產物、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸、異丁烯、己二酸、酮-己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸、異戊醇或單乙二醇。
16. 如請求項1之微生物，其中該微生物是固定C1的微生物。
17. 如請求項1之微生物，其中該微生物是細菌。
18. 如請求項1之微生物，其中該微生物是選自 醋桿菌屬（ Acetobacterium ）、嗜鹼菌屬（ Alkalibaculum ）、布勞特氏菌屬（ Blautia ）、丁酸桿菌屬（ Butyribacterium ）、梭菌屬（ Clostridium ）、真桿菌屬（ Eubacterium ）、穆爾氏菌屬（ Moorella ）、氧化桿菌屬（ Oxobacter ）、孢子菌屬（ Sporomusa ）或 熱厭氧桿菌屬（ Thermoanaerobacter ）的成員。
19. 一種增加產品產量的方法，其包含在氣態受質存在下培養如請求項1之微生物。
20. 如請求項19之方法，其中該氣態受質包含含有CO、CO ₂及H ₂中之一或多種的C1-碳源。
21. 如請求項19之方法，其中該氣態受質包含合成氣或工業廢氣。
22. 如請求項19之方法，其中該產物為丙酮及異丙醇中的一或多種。

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