EA025778B1 - Новые бактерии и способы их применения - Google Patents

Новые бактерии и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA025778B1
EA025778B1 EA201390179A EA201390179A EA025778B1 EA 025778 B1 EA025778 B1 EA 025778B1 EA 201390179 A EA201390179 A EA 201390179A EA 201390179 A EA201390179 A EA 201390179A EA 025778 B1 EA025778 B1 EA 025778B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ethanol
fermentation
day
biomass
acetate
Prior art date
Application number
EA201390179A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390179A1 (ru
Inventor
Бьорн Дэниел Хейстра
Евгения Керн
Михаэль Кепкен
Симон Сеговия
ФунгМин Лью
Original Assignee
Ланзатек Нью Зиленд Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ланзатек Нью Зиленд Лимитед filed Critical Ланзатек Нью Зиленд Лимитед
Publication of EA201390179A1 publication Critical patent/EA201390179A1/ru
Publication of EA025778B1 publication Critical patent/EA025778B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится в общем к области микробной ферментации газов. Оно относится более конкретно к новому штамму бактерий Clostridium autoethanogenum с улучшенной эффективностью в продуцировании этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода (СО).

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится в общем к области микробной ферментации газов. Оно относится более конкретно к новому классу бактерий с улучшенной эффективностью в продуцировании этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода (СО).
Уровень техники
Этанол быстро становится основным богатым водородом жидким транспортным топливом в общемировом масштабе. Всемирное потребление этанола в 2005 году оценивалось как 12,2 миллиарда галлонов (46,2 млрд л). Предсказывалось также, что мировой рынок для промышленности топливного этанола будет расти резко в будущем вследствие увеличенной заинтересованности в этаноле в Европе, Японии, США и некоторых развивающихся государствах.
Например, в США этанол используется для получения Е10, 10% смеси этанола в бензине. В смесях Е10 этанольный компонент действует в качестве оксигенирующего агента, улучшающего эффективность воспламенения и уменьшающего продуцирование загрязняющих атмосферу веществ. В Бразилии этанол удовлетворяет приблизительно 30% потребности транспортного топлива как в виде оксигенирующего агента, смешанного в бензине, так и в виде чистого топлива в его непосредственном виде. В Европе также обеспокоенность в отношении окружающей среды в связи с последствиями выбросов парникового газа (ОНО) была стимулом для Европейского Союза (ЕЙ) для установления для государств-членов Европейского Союза принудительного контроля для потребления поддерживаемых транспортных топлив, таких как производимый биомассой этанол.
Огромное большинство топливного этанола продуцируется через традиционные процессы ферментации на основе дрожжей, которые используют производимые культурными растениями углеводы, такие как сахароза, экстрагируемая из сахарного тростника, или крахмал, экстрагируемый из злаковых культур, в качестве основного источника углерода. Однако на стоимость этих углеводных резервных запасов влияет их ценность в качестве пищи человека или корма для животных, тогда как культивирование продуцирующих крахмал или сахарозу культурных растений для получения этанола не является выдерживаемым во всех географических местоположениях. Таким образом, представляет интерес развитие технологий для превращения источников более низкой стоимости и/или более обильных источников углерода в топливный этанол.
СО является основным, свободным, энергетически богатым побочным продуктом неполного сгорания органических материалов, таких как производимые из угля или масла, и производимых из масла продуктов. Например, сообщается, что металлургическая промышленность в Австралии производит и выбрасывает в атмосферу более 500000 тонн СО ежегодно.
Для превращения газов, состоящих первично из СО и/или СО и водорода (СО и водорода Н2), в различные топлива и химикалии могут быть использованы каталитические процессы. Для превращения этих газов в топлива и химикалии могут быть также использованы микроорганизмы.
Способность микроорганизмов расти на СО в качестве единственного источника углерода была впервые обнаружена в 1903 году. Позднее было определено, что это является свойством организмов, которые используют биохимический путь аутотрофного роста с ацетил-коферментом А (ацетил-КоА) (также известный как путь \УооЙ8-ЦипдйаН1 и путь дегидрогеназы монооксида углерода/ацетил-КоА-синтазы (СОЭН/АС8). Было показано, что большое число анаэробных организмов, включающих в себя карбоксидотрофические, фотосинтетические, метаногенные и ацетогенные организмы, метаболизируют СО до различных конечных продуктов, а именно, СО2, Н2, метана, н-бутанола, ацетата и этанола. Все такие организмы продуцируют по меньшей мере два из этих конечных продуктов, используя СО в качестве единственного источника углерода.
Было продемонстрировано, что анаэробные бактерии, такие как бактерии рода ОоЧпйшт. продуцируют этанол из СО, СО2 и Н2 через путь ацетил-КоА. Например, различные штаммы ОоЧпйшт 1щпдйаЫи, которые производят этанол из газов, описаны в \УО 00/68407, ЕР 117309, патенты США с номерами 5173429, 5593886 и 6368819, \УО 98/00558 и \УО 02/08438. Известно также, что бактерия С1о81пйшт анЮсШаподспит 8р. продуцирует этанол из газов (АЬг1П1 е! а1., АгсЫуез о£ МюгоЬю1оду 161, рр 345-351 (1994)).
Однако продуцирование этанола микроорганизмами ферментацией газов всегда ассоциировано с совместным продуцированием ацетата и/или уксусной кислоты. Так как доступный углерод превращается в ацетат/уксусную кислоту, а не в этанол, эффективность продуцирования этанола с использованием таких ферментационных процессов может быть меньшей, чем желаемая эффективность. Кроме того, хотя побочный продукт ацетат/уксусная кислота может быть использован для некоторой другой цели, он может создавать проблему ликвидации отходов производства. Ацетат/уксусная кислота превращаются в метан микроорганизмами и, следовательно, имеют потенциал содействия образованию выбросов ОНО.
Микробная ферментация СО в присутствии Н2 может приводить, по существу, к полному переносу углерода в спирт. Однако в отсутствие достаточного Н2 некоторая часть СО превращается в спирт, тогда как значительная часть превращается в СО2, как показано в следующих уравнениях:
- 1 025778
6СО+ ЗН2О->С2С5+ 4С0г 12Н2+ 4СО2—>2С2НьОН+ 6Н2О
Продуцирование СО2 представляет неэффективность в улавливании всего углерода и, если он высвобождается, также имеет потенциал содействия выбросу парниковых газов.
\УО 2007/117157 описывает процесс, который продуцирует спирты, в частности этанол, анаэробной ферментацией газов, содержащих монооксид углерода. Ацетат, продуцируемый в качестве побочного продукта этого процесса ферментации, превращается в газ водород и газ диоксид углерода, каждый или оба их которых могут быть использованы в анаэробном ферментационном процессе.
\УО 2008/115080 описывает процесс для получения спирта (спиртов) во множественных стадиях ферментации. Побочные продукты, продуцируемые в результате анаэробной ферментации газа (газов) в первом биореакторе, могут быть использованы для продуцирования продуктов во втором биореакторе. Кроме того, побочные продукты второй стадии ферментации могут рециркулироваться в первый биореактор для продуцирования продуктов.
\УО 2009/064200 описывает новый класс бактерий, которые имеют улучшенную эффективность в продуцировании этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода.
Выгодным было бы обеспечение микроорганизмов, которые способны ферментировать газы, содержащие монооксид углерода, в этанол при увеличенной эффективности, т.е. микроорганизмы, способные улучшать поглощение монооксида углерода, продуцировать больше этанола и/или более высокое отношение этанола к ацетату из того же самого субстрата, чем это делают микроорганизмы известного уровня техники.
Целью данного изобретения является обеспечение нового класса бактерий, который преодолевает один или несколько недостатков известного уровня техники в превращении газообразных источников, содержащих СО, в этанол, или, по меньшей мере, обеспечение общественности полезным выбором.
Сущность изобретения
В первом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, при удельной продуктивности по меньшей мере приблизительно 2 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день.
В других вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при удельной продуктивности по меньшей мере приблизительно 3 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, по меньшей мере приблизительно 5 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, по меньшей мере приблизительно 6 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день или по меньшей мере приблизительно 7 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, при продуктивности по меньшей мере приблизительно 10 г этанола/л ферментационного бульона/день.
В других вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при продуктивности по меньшей мере приблизительно 20 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 30 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 40 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 50 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 60 г этанола/л ферментационного бульона/день или по меньшей мере приблизительно 70 г этанола/л ферментационного бульона/день.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия способна иметь удельное поглощение СО по меньшей мере приблизительно 1,0 ммоль СО/мин/г биомассы.
В одном варианте осуществления эта бактерия способна к удельному поглощению СО по меньшей мере приблизительно 1,2 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,4 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,6 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,8 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 2,0 ммоль СО/мин/г биомассы. В одном конкретном варианте осуществления эта бактерия способна к удельному поглощению СО по меньшей мере приблизительно 1,2 ммоль СО/мин/г биомассы.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия способна к удельной скорости роста по меньшей мере приблизительно 0,8 день-1.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна к удельной скорости роста по меньшей мере приблизительно 1,0 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,2 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,4 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,6 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,8 день-1 или по меньшей мере приблизительно 2,0 день-1.
- 2 025778
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия способна продуцировать этанол при отношении этанола к ацетату по меньшей мере приблизительно 2:1.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при отношении этанола к ацетату по меньшей мере приблизительно 3:1, по меньшей мере приблизительно 4:1, по меньшей мере приблизительно 5:1, по меньшей мере приблизительно 7:1 или по меньшей мере приблизительно 10:1.
В одном варианте осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол, по существу, без ацетата.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия способна выдерживать спирт до приблизительно 30 г/л ферментационного бульона.
В одном варианте осуществления эта бактерия способна выдерживать спирт до приблизительно 40 г/л ферментационного бульона, до приблизительно 50 г/л ферментационного бульона, до приблизительно 60 г/л ферментационного бульона или до приблизительно 70 г/л ферментационного бульона.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия имеет две или более из следующих характеристик:
способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, при удельной продуктивности по меньшей мере 2 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день;
способна продуцировать этанол при концентрации по меньшей мере приблизительно 10 г этанола/л ферментационного бульона/день;
способна к удельному поглощению СО по меньшей мере приблизительно 1,0 ммоль СО/мин/г биомассы;
способна к удельной скорости роста по меньшей мере приблизительно 1,0 г/день;
способна продуцировать этанол при отношении этанола к ацетату по меньшей мере приблизительно 2:1; и способна выдерживать спирт до приблизительно 30 г/л ферментационного бульона.
В одном варианте осуществления бактерии этого изобретения произведены из ОоЧпбшт аШоеШаподепит. В одном предпочтительном варианте осуществления бактерия этого изобретения является штаммом ОоЧпбшт аШое+аподепит.
В одном конкретном варианте осуществления эта бактерия имеет определяющие характеристики штамма ОоЧпбшт аи1ое1Ьаподепит, депонированного в ΌδΜΖ под номером доступа ΌΜ823693. В одном варианте осуществления эта бактерия является штаммом СЗоЧпбшт аШоеШаподепит. депонированным в ΌδΜΖ под номером доступа ΌΜδ23693.
В следующем аспекте это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят штамма СЗоЧпб1ит аи1ое1Ьаподепит, депонированного в ΌδΜΖ под номером доступа ΌΜδ23693.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает способ получения одного или нескольких спиртов, предусматривающий ферментацию субстрата, содержащего СО, с использованием бактерии, описанной здесь выше.
В одном варианте осуществления этот способ предусматривает стадии:
(a) обеспечения субстрата, содержащего СО, в биореакторе, содержащем культуру бактерии этого изобретения; и (b) анаэробного ферментирования этой культуры в биореакторе с получением одного или нескольких спиртов.
В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способ уменьшения общих выбросов атмосферного углерода из промышленного процесса, предусматривающий:
(a) захват СО-содержащего газа, продуцируемого в результате этого промышленного процесса, перед высвобождением этого газа в атмосферу;
(b) анаэробное ферментирование СО-содержащего газа для продуцирования одного или нескольких спиртов культурой, содержащей одну или несколько бактерий этого изобретения.
В одном варианте осуществления этих аспектов способов ферментацию проводят при температуре от приблизительно 34 до приблизительно 37°С. В одном предпочтительном варианте осуществления это ферментацию проводят при температуре приблизительно 34°С.
В некоторых вариантах осуществления этих аспектов способов ацетат продуцируется в качестве побочного продукта ферментации. Предпочтительно, один или несколько продуцируемых спиртов включают в себя этанол.
В конкретных вариантах этих аспектов способов эта бактерия поддерживается в водной культу- 3 025778 ральной среде.
В конкретных вариантах осуществления этих аспектов способов ферментация субстрата происходит в биореакторе.
В некоторых вариантах осуществления этот субстрат содержит по меньшей мере приблизительно 25% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 30% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 40% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 50% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 65% СО по объему или по меньшей мере приблизительно 70% СО по объему. В конкретных вариантах осуществления этот субстрат содержит по меньшей мере приблизительно 75% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 80% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 85% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 90% СО по объему или по меньшей мере приблизительно 95% СО по объему.
В одном варианте осуществления этот субстрат содержит приблизительно 30% или менее Н2 по объему. В других вариантах осуществления этот субстрат содержит приблизительно 20% или менее Н2 по объему, приблизительно 15% или менее Н2 по объему, приблизительно 10% или менее Н2 по объему, приблизительно 5% или менее Н2 по объему, приблизительно 4% или менее Н2 по объему, приблизительно 3% или менее Н2 по объему, приблизительно 2% или менее Н2 по объему, приблизительно 2% или менее Н2 по объему, приблизительно 1% или менее Н2 по объему или по существу не содержит Н2.
В одном варианте осуществления этот субстрат содержит меньшее или равное приблизительно 20% по объему количество СО2. В конкретных вариантах осуществления этот субстрат содержит меньшее или равное приблизительно 15% по объему количество СО2, меньшее или равное приблизительно 10% по объему количество СО2, меньшее или равное приблизительно 5% по объему количество СО2.
В некоторых вариантах осуществления субстрат, содержащий СО, является газообразным субстратом, содержащим СО.
В некоторых вариантах осуществления этот газообразный субстрат содержит газ, получаемый в качестве побочного продукта промышленного процесса.
В некоторых вариантах осуществления этот промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов черных металлов, производства продуктов цветных металлов, процессов очистки нефти и нефтепродуктов, газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства углеродной сажи, производства аммиака, производства метанола и производства кокса.
В одном варианте осуществления этот газообразный субстрат может содержать газ, полученный из сталеплавильного завода.
В другом варианте осуществления этот газообразный субстрат может содержать автомобильные выхлопные газы.
В некоторых вариантах осуществления аспектов, касающихся способов, спирт извлекают из ферментационного бульона, причем этот ферментационный бульон является водной культуральной средой, содержащей бактериальные клетки и этот спирт.
В некоторых вариантах осуществления ацетат продуцируется в качестве побочного продукта ферментации.
В следующем варианте осуществления из этого бульона извлекают спирт и ацетат.
Хотя это изобретение описано в общих чертах здесь, оно не ограничивается этим и включает в себя также варианты, примеры которых обеспечены в следующем описании.
Краткое описание фигур
Изобретение будет теперь описано подробно со ссылкой на сопутствующие фигуры, на которых фиг. 1 показывает потребление СО Ό8Μ19630 и Ό8Μ23693;
фиг. 2 - продуцирование метаболитов Ό8Μ19630 (фиг. 2а) и Ό8Μ23693 (фиг. 2Ь);
фиг. 3 - оптимизированное накапливание биомассы и продуцирование метаболитов Ό8Μ23693, как описано в примере 2;
фиг. 4 - генетическую карту нового штамма С. аШосОишодспиш ΕΖ1561 (Ό8Μ23693), показывающую вариации относительно штамма ΕΖ1560 (Ό8Μ19630);
фиг. 5 - 8ЕО Ш.1: нуклеотидная последовательность белка гена Μπΐδ репарации ошибочного спаривания ДНК в штамме ΕΖ1561;
фиг. 6 - 8ЕО Ш.2: нуклеотидная последовательность белка гена Μπΐδ репарации ошибочного спаривания ДНК в штамме ΕΖ1560;
фиг. 7 - 8ЕО Ш.3: аминокислотная последовательность белка гена Μπΐδ репарации ошибочного спаривания ДНК в штамме ΕΖ1561;
фиг. 8 - 8ЕО Ш.4: аминокислотная последовательность белка гена Μπΐδ репарации ошибочного спаривания ДНК в штамме ΕΖ1560;
фиг. 9 - 8ЕО Ш.5: нуклеотидная последовательность, обнаруженная как подвергнутая реаранжировке в штаммах ΕΖ1561 и ΕΖ1560;
фиг. 10 - 8ЕО Ш.6: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора оперона Р1Р0-АТФ-синтазы в штамме ΕΖ1561;
фиг. 11 - 8ЕО Ш.7: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора опе- 4 025778 рона ΡιΡο-АТФ-синтазы в штамме ΡΖ1560;
фиг. 12 - 8ЕЭ Ш.8: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора оперона Κηί-комплекса в штамме ΡΖ1561;
фиг. 13 - 8ЕЭ Ш.9: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора оперона Κηί-комплекса в штамме ΡΖ1560;
фиг. 14 - 8ЕЭ Ш.10: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора белка углеродного голодания в штамме ΡΖ1561;
фиг. 15 - 8ЕЭ Ш.11: нуклеотидная последовательность предположительного района промотора белка углеродного голодания в штамме ΡΖ1560;
фиг. 16 - 8ЕЭ Ш.12: нуклеотидная последовательность гена бета-субъединицы комплекса СОдегидрогеназы/СО-метилирующей ацетил-КоА-синтазы в штамме ΡΖ1561;
фиг. 17 - 8ЕЭ Ш.13: нуклеотидная последовательность гена бета-субъединицы комплекса СОдегидрогеназы/СО-метилирующей ацетил-КоА-синтазы в штамме ΡΖ1560;
фиг. 18 - 8ЕЭ Ш.14: аминокислотная последовательность гена бета-субъединицы комплекса СОдегидрогеназы/СО-метилирующей ацетил-КоА-синтазы в штамме ΡΖ1561;
фиг. 19 - 8ЕЭ Ш.15: аминокислотная последовательность гена бета-субъединицы комплекса СОдегидрогеназы/СО-метилирующей ацетил-КоА-синтазы в штамме ΡΖ1560;
фиг. 20 - 8ЕЭ Ш.16: нуклеотидная последовательность гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы в штамме ΡΖ1561;
фиг. 21 - 8ЕЭ Ш.17: нуклеотидная последовательность гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы в штамме ΡΖ1560.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения разработали новые бактерии. Эти бактерии характеризуются наличием одного или нескольких из ряда неожиданных свойств (описанных здесь далее) и в одном предпочтительном варианте всех этих свойств. Применение этих новых бактерий в процессах анаэробной ферментации обеспечивает неожиданное преимущество в отношении существующих штаммов бактерий, которое может позволить увеличение общей эффективности процесса ферментации для получения таких продуктов, как этанол и/или ацетат.
Таким образом, в широком смысле, в одном аспекте данное изобретение относится к новой бактерии и биологически чистому изоляту бактерии с увеличенной эффективностью в процессе анаэробной ферментации. В одном аспекте эта бактерия способна продуцировать спирт, предпочтительно этанол, анаэробной ферментацией СО-содержащего субстрата бактериями этого изобретения.
Определения
Если нет особых указаний, следующие термины, используемые во всем этом описании, определяются следующим образом.
Субстрат, содержащий СО, субстрат, включающий в себя СО и подобные термины следует понимать как включающие в себя любой субстрат, в котором монооксид углерода доступен бактериям, например, для роста и/или ферментации. В конкретных вариантах этого изобретения субстрат, содержащий СО, является газообразным. Такие субстраты могут называться здесь газообразными субстратами, содержащими СО, газообразными субстратами, содержащими СО и т.п.
В описании, следующем далее, варианты этого изобретения описаны на примере доставки и ферментирования газообразного субстрата, содержащего СО. Однако должно быть понятно, что этот газообразный субстрат, содержащий СО, может быть обеспечен в виде растворенного в жидкости субстрата. В основном жидкость насыщают содержащим монооксид углерода газом, и затем эту жидкость добавляют в биореактор. Это может достигаться с использованием стандартной методологии. В качестве примера мог бы использоваться диспергирующий микропузырьки генератор (Нсщгьак с1 а1., 8са1е-ир οί пикгоЬиЬЫе Й18рег81оп депегаЮг ίοτ аегоЫс ГегтеШайоп; Лррйей ВюсйетМгу апй Вю!есйпо1оду Уо1ите 101, ЫитЬег 3/0с1оЬег. 2002). В качестве дополнительного примера газообразный субстрат, содержащий СО, может быть адсорбирован на твердый носитель. Такие альтернативные способы охватываются использованием термина субстрат, содержащий СО.
Термины увеличение эффективности, увеличенная эффективность и т.п. при использовании в отношении ферментационного процесса включают в себя, но не ограничиваются ими, увеличение одного или нескольких из: скорости роста микроорганизмов, катализирующих эту ферментацию, поглощения или потребления СО этими микроорганизмами, объема желаемого продукта (такого как спирты), продуцируемого на объем потребляемого субстрата (такого как СО), концентрации желаемого продукта (такого как спирты), продуцируемого в культуральной среде, скорости продуцирования или уровня продуцирования желаемого продукта и относительной доли желаемого продукта в сравнении с другими побочными продуктами этой ферментации.
Термин ацетат включает в себя как только ацетатную соль, так и смесь молекулярной или свободной уксусной кислоты, так и ацетатную соль, такую как смесь ацетатной соли и свободной уксусной кислоты, присутствующую в ферментационном бульоне, как описано здесь. Отношение молекулярной уксусной кислоты к ацетату в этом ферментационном бульоне зависит от рН этой системы.
- 5 025778
Термин биореактор включает в себя ферментационное устройство, состоящее из одного или нескольких сосудов и/или башен или системы труб, которая включает в себя непрерывно перемешиваемый реактор с мешалкой (С8ТК), реактор с иммобилизованными клетками (1СК), реактор со слоем со струйным течением жидкости (ТВК), барботируемую колонку, ферментер с поднятием газа, статический миксер или другой сосуд или другое устройство, подходящее для контакта газа-жидкости.
Термин толерантность (устойчивость) к спирту в данном контексте должен восприниматься как ссылка на уровень спирта, предпочтительно этанола, который будут выдерживать бактерия или популяция бактерий, продолжая выживать, расти и/или продуцировать уровень желаемого продукта.
Бактерии этого изобретения или их культуры или изоляты могут быть описаны как находящиеся в выделенной или биологически чистой форме. Эти термины предназначены для обозначения того, что эти бактерии отделены от их окружения или одного или нескольких компонентов, клеточных или других, с которыми они могут быть ассоциированы при нахождении в природе или в другом случае. Термины выделенные (изолированные) или биологически чистые не должны восприниматься как указывающие на степень, до которой эти бактерии были очищены. Однако в одном варианте эти изоляты или культуры этих бактерий содержат преобладающее количество бактерий этого изобретения.
Это изобретение обеспечивает биологически чистый изолят бактерии, где эта бактерия способна продуцировать продукты, включающие в себя этанол и необязательно ацетат, анаэробной ферментацией субстрата, содержащего СО, и где эта бактерия способна к одному или нескольким из продуцирования этанола при удельной продуктивности приблизительно 2 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день;
продуцирования этанола при продуктивности по меньшей мере приблизительно 10 г/л ферментационного бульона/день;
удельного поглощения СО по меньшей мере приблизительно 1,0 ммоль СО/мин/г биомассы; удельной скорости роста по меньшей мере приблизительно 0,8 день-1;
продуцирования этанола при отношении этанола к ацетату по меньшей мере приблизительно 2:1; и выдерживания спирта до приблизительно 30 г/л бульона.
В одном предпочтительном варианте осуществления бактерия этого изобретения способна иметь два, три, четыре или пять из вышеупомянутых признаков.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при удельной продуктивности по меньшей мере приблизительно 3 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, по меньшей мере приблизительно 4 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, по меньшей мере приблизительно 5 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, меньшей мере приблизительно 6 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день, по меньшей мере приблизительно 7 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при продуктивности по меньшей мере приблизительно 20 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 30 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере приблизительно 40 г этанола/л ферментационного бульона/день или по меньшей мере приблизительно 50 г этанола/л ферментационного бульона/день. Эта максимальная величина учитывает стехиометрию, поглощение СО и десорбирование этанола.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна к поглощению СО по меньшей мере 1,2 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,4 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,6 ммоль СО/мин/г биомассы, по меньшей мере приблизительно 1,8 ммоль СО/мин/г биомассы или по меньшей мере приблизительно 2,0 ммоль СО/мин/г биомассы. В одном конкретном варианте осуществления эта бактерия способна к удельному поглощению СО по меньшей мере приблизительно 1,2 ммоль СО/мин/г биомассы.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна к удельной скорости роста по меньшей мере приблизительно 1,0 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,2 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,4 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,6 день-1, по меньшей мере приблизительно 1,8 день-1 или по меньшей мере приблизительно 2,0 день-1.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна продуцировать этанол при отношении этанола к ацетату по меньшей мере приблизительно 3:1, по меньшей мере приблизительно 4:1, по меньшей мере приблизительно 5:1, по меньшей мере приблизительно 7:1 или по меньшей мере приблизительно 10:1. В одном предпочтительном варианте осуществления, во время ферментации нет чистой продуктивности ацетата.
В некоторых вариантах осуществления эта бактерия способна выдерживать спирт до приблизительно 40 г/л ферментационного бульона, до приблизительно 50 г/л ферментационного бульона или до приблизительно 60 г/л ферментационного бульона. В одном конкретном варианте осуществления эта бактерия способна выдерживать спирт до приблизительно 70 г/л ферментационного бульона.
В одном предпочтительном варианте осуществления бактерии этого изобретения произведены из СЗоЧпйшт аШосШаподспит. В одном более предпочтительном варианте осуществления эти бактерии произведены из штамма СЗоЧпйинп аШосШаподспит Ό8Μ19630 (ΌδΜΖ, Германия) (описанного в
- 6 025778 №02009/064200).
В одном предпочтительном варианте осуществления бактерия этого изобретения является штаммом С1о8йгбшт аШоеОшподепит.
С1о8йгбшт аиЮебшподепит описан, например, в ЛЬгии е! а1., ЛгеЫуек оГ М1егоЫо1 (1994) 161: 345351.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эти бактерии имеют определяющие характеристики штамма С1о8йгбшт аи1ое1Наподепит Ό8Μ23693, депонированного в ΌδΜΖ, в Германии, в соответствии с Будапештским договором, 7 июня 2010 года. В одном конкретном варианте осуществления эта бактерия является штаммом С1о8Нгбшт аи1ое1Ьаподепит Ό8Μ23693.
Это изобретение относится также к бактериям, произведенным из бактерий этого изобретения.
Бактерии некоторых вариантов осуществления этого изобретения способны к увеличенной скорости продуцирования спирта, увеличенной скорости роста и/или увеличенной толерантности к спирту. Это обеспечивает преимущество над другими штаммами ОоЧпШа 8р., в том числе С1о8йгбшт аШоебн аподепит. Таким образом, применение бактерий данного изобретения может увеличивать общую эффективность ферментационного процесса для продуцирования продуктов, таких как ацетат и/или спирт.
В некоторых вариантах осуществления бактерии этого изобретения способны обнаруживать продуктивность, скорости роста, отношение спирта к кислоте, потребление СО и толерантность к спирту, упомянутые здесь ранее, при повышенных уровнях СО в газообразном субстрате. Например, этот газообразный субстрат может содержать по меньшей мере приблизительно 50% СО по объему, по меньшей мере приблизительно 65% СО по объему или по меньшей мере приблизительно 70% СО по объему. В некоторых вариантах осуществления этот газообразный субстрат содержит по меньшей мере приблизительно 80% СО по объему или по меньшей мере приблизительно 90% СО по объему или по меньшей мере приблизительно 95% СО по объему.
Подобным образом продуктивность, скорости роста, отношение спирта к кислоте, потребление СО и толерантность к спирту, описанные здесь ранее, являются достигаемыми в некоторых вариантах осуществления при низких - несуществующих уровнях Н2 в газообразном субстрате. Этот газообразный субстрат может содержать приблизительно 30% или менее Н2 по объему. В конкретных вариантах осуществления этот газообразный субстрат содержит приблизительно 20% или менее Н2 по объему, приблизительно 15% или менее Н2 по объему, приблизительно 10% или менее Н2 по объему, приблизительно 5% или менее Н2 по объему, приблизительно 4% или менее Н2 по объему, приблизительно 3% или менее Н2 по объему, приблизительно 2% или менее Н2 по объему, приблизительно 1% или менее Н2 по объему или, по существу, не содержит Н2.
В некоторых вариантах осуществления бактерии этого изобретения способны обнаруживать продуктивность, скорости роста, отношение спирта к кислоте, потребление СО и толерантность к спирту, упомянутые здесь ранее, при подаче газообразного субстрата, содержащего относительно мало СО2. В одном варианте осуществления этот газообразный субстрат содержит меньшее или равное приблизительно 20% количество СО2 по объему. В некоторых вариантах осуществления этот газообразный субстрат содержит меньшее или равное приблизительно 15% количество СО2 по объему, меньшее или равное приблизительно 10% количество СО2 по объему или меньшее или равное приблизительно 5% количество СО2 по объему. В одном конкретном варианте осуществления этот газообразный субстрат, по существу, не содержит СО2.
В некоторых вариантах осуществления культура бактерии этого изобретения поддерживается в водной культуральной среде. Предпочтительно эта водная культуральная среда является минимальной анаэробной средой для выращивания микробов. Подходящие среды известны в данной области и описаны, например, в патентах США с номерами 5173429 и 5593886 и №О 02/08438 и в К1а88оп е! а1., [(1992) Вюсопуегеюп оГ 8уп1Не818 Оа8 иНо Пдшб ог Оа8еои8 Рие18. Еп/. М1сгоЬ. ТесНпо1. 14:602-608], №цаГрош апб Уоипе81 [(2006). Е!Напо1 апб асе!а!е 8уп1Не818 Ггот \\И81е да8 И8шд Ьа1сН сиНиге оГ С1о8йгбшт ЦипдбаЫи. Еп/утеапб МюгоЫа1 ТесНпо1оду, Уо1ите 38, 188ие8 1-2, р. 223-228] и Бе\У18 е! а1., [(2002). Мактд (Не соппесйоп-сопуег8юп оГ Ыота88-депега1еб ргобисег да8 !о е(Напо1. ЛЬ8(. Вюепегду, р. 2091-2094]. В конкретных вариантах осуществления этого изобретения минимальная анаэробная среда для роста микробов является средой, описанной здесь ниже в разделе Примеры.
Настоящее изобретение обеспечивает также способы получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата, содержащего СО, причем эти способы предусматривают поддержание культуры одного или нескольких бактериальных изолятов этого изобретения в присутствии этого субстрата и анаэробную ферментацию этого субстрата до одного или нескольких спиртов одним или несколькими бактериальными изолятами.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ уменьшения общих выбросов атмосферного углерода из промышленного процесса, предусматривающий:
(a) захват СО-содержащего газа, продуцируемого в результате этого промышленного процесса, перед высвобождением этого газа в атмосферу;
(b) анаэробное ферментирование СО-содержащего газа для продуцирования одного или нескольких спиртов культурой, содержащей один или несколько бактериальных изолятов этого изобретения.
- 7 025778
В некоторых вариантах способов этого изобретения ацетат продуцируется в качестве побочного продукта этой ферментации. Продуцируемым спиртом является этанол.
В некоторых вариантах осуществления эта культура поддерживается в жидкой питательной среде.
Ферментация может проводиться в любом подходящем биореакторе, таком как непрерывно перемешиваемый реактор с мешалкой (С8ТК), реактор в виде барботируемой колонки (ВСК) и реактор со слоем со струйным течением жидкости (ТВК). Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого изобретения этот биореактор может содержать первый реактор, для выращивания, в котором культивируют микроорганизмы, и второй, ферментационный реактор, в который подают ферментационный бульон из реактора для выращивания и в котором продуцируется наибольшая часть продукта ферментации (этанола и ацетата).
Как описано выше, источником углерода для реакции ферментации является газообразный субстрат, содержащий СО. Этот газообразный субстрат может быть СО-содержащим отходящим (отработавшим) газом, полученным в качестве побочного продукта промышленного процесса, или некоторым другим источником, таким как автомобильные выхлопные газы. В некоторых вариантах осуществления этот промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов черных металлов, такого как сталеплавильный завод, производства продуктов цветных металлов, процессов очистки нефти и нефтепродуктов, газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства углеродной сажи, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В этих вариантах осуществления СО-содержащий газ может улавливаться из промышленного процесса перед его выбросом в атмосферу с использованием любого подходящего способа. В зависимости от состава СОсодержащего субстрата может быть также желательной его обработка для удаления любых нежелательных примесей, таких как частицы пыли, перед введением его в ферментацию. Например, этот газообразный субстрат может быть отфильтрован или промыт с использованием известных способов.
Кроме того, часто является желательным увеличение концентрации СО в потоке субстрата (или парциального давления СО в газообразном субстрате) и, следовательно, увеличение эффективности реакций ферментации, где субстратом является СО. Увеличение парциального давления СО в газообразном субстрате увеличивает перенос массы СО в ферментационные среды. Состав потоков газа, используемых для снабжения реакции ферментации, может оказывать существенное влияние на эффективность и/или стоимость этой реакции. Например, О2 может уменьшать эффективность процесса анаэробной ферментации. Обработка нежелательных или ненужных газов в стадиях процесса ферментации до и после ферментации может увеличивать нагрузку на такие стадии (например, когда этот газ сжимается перед вхождением в биореактор, ненужная энергия может быть использована для сжимания газов, которые не являются необходимыми в этой ферментации). Таким образом, может быть желательной обработка потоков субстрата, в частности потоков субстрата, произведенных из промышленных источников, для удаления нежелательных компонентов и увеличения концентрации желательных компонентов.
Потоки субстрата, происходящие из промышленного источника, обычно являются вариабельными по составу. Кроме того, потоки субстрата, происходящие из промышленных источников, содержащие высокие концентрации СО (такие как, например, по меньшей мере 40% СО, по меньшей мере 50% СО или по меньшей мере 65% СО), часто имеют низкий компонент Н2 (такой как менее 20% или менее 10%, или, по существу, 0%). Вследствие этого, особенно желательным является то, что микроорганизмы способны продуцировать продукты анаэробной ферментация субстратов, содержащих определенный диапазон концентраций СО и Н2, в частности высокие концентрации СО и низкие концентрации Н2. Бактерии данного изобретения имеют неожиданно высокую скорость роста скорость продуцирования этанола при ферментации субстрата, содержащего СО (и не содержащего Н2).
Присутствие водорода в потоке субстрата может приводить к улучшению эффективности общего захвата углерода и/или продуктивности этанола. Например, АО 02/08438 описывает получение этанола с использованием потока газа различных композиций. АО 02/08438 содержит сообщение о потоке субстрата, содержащем 63% Н2, 32% СО и 5% СН4, обеспеченном для культуры С. (щпдбаЫи. в биореакторе для стимуляции микробного роста и продуцирования этанола. Когда эта культура достигала стационарного состояния и рост микробов уже не был главной целью, этот поток субстрата переключали на 15,8% Н2, 36,5% СО, 38,4% Ν2 и 9,3% СО2 для обеспечения СО в небольшом избытке и стимуляции продуцирования этанола. Этот документ описывает также потоки газов с более высокими и более низкими концентрациями СО и Н2.
Будет понятно, что процесс данного изобретения, описанный здесь, может быть использован для уменьшения общих выбросов атмосферного углерода из промышленных процессов посредством захвата СО-содержащих газов, продуцируемых в качестве результата таких процессов, и использования их в качестве субстратов для ферментационных процессов, описанных здесь.
Альтернативно, в других вариантах осуществления этого изобретения СО-содержащий газообразный субстрат может происходить из газификации биомассы. Этот процесс газификации включает в себя частичное сжигание биомассы в ограниченной подаче воздуха или кислорода. Полученный газ обычно содержит в основном СО и Н2, с минимальными объемами СО2, метана, этилена и этана. Например, биомасса побочных продуктов, полученная во время экстракции и обработки пищевых продуктов, таких как
- 8 025778 сахар из сахарного тростника или крахмал из кукурузы и зерна злаков, или отходов непищевой биомассы, образуемой лесной промышленностью, могут быть газифицированы для получения СОсодержащегося газа, подходящего для применения в данном изобретении.
Обычно предпочтительно, что СО-содержащий газообразный субстрат содержит основную долю СО. В конкретных вариантах осуществления этот газообразный субстрат содержит по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 65% или по меньшей мере от предпочтительно 70 до приблизительно 95% по объему. Газовый субстрат не должен обязательно содержать водород. Этот газообразный субстрат содержит также необязательно некоторое количество СО2, например, от приблизительно 1 до приблизительно 30% по объему, например, от приблизительно 5 до приблизительно 10% СО2.
Будет понятно, что для того, чтобы эти бактерии росли и происходила ферментация СО в этанол, кроме СО-содержащего субстратного газа, в биореактор должна добавляться подходящая жидкая питательная среда. Питательная среда будет содержать витамины и минеральные вещества, достаточные для возможности роста используемого микроорганизма. Анаэробные среды, подходящие для ферментации этанола с использованием СО в качестве единственного источника углерода, известны в данной области. Например, подходящие среды описаны в патентах США с номерами 5173429 и 5593886 и \7О 02/08438, а также \7О 02/08438, а также в других публикациях, цитируемых здесь ранее. В одном варианте осуществления этого изобретения этой средой является среда, описанная ниже в разделе примеры.
Эту ферментацию желательно проводить при подходящих условиях для осуществления ферментации СО в этанол. Условия реакции, которые должны учитываться, включают в себя давление, температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, рН среды, окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) среды, скорость перемешивания (если используется непрерывно перемешиваемый танк-реактор), уровень инокулята, максимальные концентрации газообразного субстрата для гарантии того, что СО в этой жидкой фазе не становится недостаточным, и во избежание ингибирования продукта максимальными концентрациями продукта.
Оптимальные условия реакции будут зависеть отчасти от конкретного используемого в этом изобретении микроорганизма. Однако обычно предпочтительно эта ферментация проводится при давлении более высоком, чем давление окружающей среды. Работа при увеличенных давлениях позволяет иметь существенное увеличение в скорости переноса СО из газовой фазы в жидкую фазу, где он может поглощаться микроорганизмом в качестве источника углерода для продуцирования этанола. Это, в свою очередь, означает, что время удерживания (определяемое как объем жидкости в биореакторе, деленный на скорость потока газа) может быть уменьшено при поддержании биореакторов при повышенном давлении, а не при атмосферном давлении.
Кроме того, поскольку конкретная скорость превращения СО в этанол является отчасти функцией времени удерживания субстрата и достижение желаемого времени удерживания, в свою очередь, диктует требуемый объем биореактора, применение находящихся под давлением систем может сильно уменьшать требуемый объем биореактора и вследствие этого капитальные затраты оборудования для ферментации. В соответствии с примерами, приведенными в патенте США №5593886, объем реактора может быть уменьшен в линейной пропорции относительно увеличений в рабочем давлении реактора, т.е. биореакторы, работающие при 10 атмосферах, требуют только одной десятой объема биореакторов, работающих при давлении 1 атмосферы.
Преимущества проведения ферментации газа до этанола при повышенных давлениях были также описаны в другом месте. Например, \7О 02/08438 описывает ферментации газа до этанола, выполняемые под давлением 30 фунтов на квадратный дюйм (207 кПа) и 75 фунтов на квадратный дюйм (517 кПа), давая продуктивности этанола 150 и 369 г/л/день соответственно. Однако было обнаружено, что примерные ферментации, выполняемые с использованием сходных сред и композиций вводимых газов при атмосферном давлении, продуцируют в 10-20 раз менее этанола на литр в день.
Желательно также, чтобы скорость введения СО-содержащего газообразного субстрата была такой, чтобы гарантировать, что концентрация СО в жидкой фазе не становится ограничивающей. Это является следствием того, что СО-ограниченные условия могут быть условиями, в которых этанольный продукт потребляется этой культурой.
В некоторых вариантах осуществления процесс ферментации по данному изобретению, описанный выше, будет приводить к ферментационному бульону, содержащему этанол, а также бактериальные клетки, в водной культуральной среде. В предпочтительных вариантах осуществления этого способа этанол извлекают из этого ферментационного бульона.
В некоторых вариантах осуществления извлечение этанола предусматривает непрерывное удаление части бульона и извлечение спирта из удаленной части этого бульона.
В конкретных вариантах осуществления извлечение этанола включает в себя пропускание удаленной части этого бульона, содержащего этанол, через разделяющий узел для отделения бактериальных клеток от бульона с получением бесклеточного спиртсодержащего пермеата и возврат этих бактериальных клеток в этот биореактор.
- 9 025778
В некоторых вариантах осуществления способы этого изобретения являются непрерывными процессами.
В конкретных вариантах осуществления ацетат продуцируется в качестве побочного продукта этой ферментации.
В одном следующем варианте осуществления этанол и ацетат извлекают из бульона.
В некоторых вариантах осуществления извлечение этанола и ацетата предусматривает непрерывное удаление части бульона и извлечение отдельно этанола и ацетата из этой удаленной части бульона.
В некоторых вариантах осуществления извлечение этанола и ацетата включает в себя пропускание удаленной части бульона, содержащего этанол и ацетат, через разделяющий узел для отделения бактериальных клеток от этанола и ацетата с получением бесклеточного этанол- и ацетатсодержащего пермеата и возврат этих бактериальных клеток в этот биореактор.
В приведенных выше вариантах осуществления извлечение этанола и ацетата предпочтительно включает в себя сначала удаление этанола из бесклеточного пермеата с последующим удалением ацетата из бесклеточного пермеата. Предпочтительно, этот бесклеточный пермеат возвращают затем в биореактор.
Этанол является предпочтительным желаемым конечным продуктом этой ферментации. Этанол может быть извлечен из этого ферментационного бульона способами, известными в данной области, такими как фракционная перегонка или выпаривание, и экстракционная ферментация. Дистилляция этанола из ферментационного бульона дает азеотропную смесь этанола и воды (т.е. 95% этанола и 5% воды). Безводный этанол может быть затем получен посредством применения технологии дегидратации этанола с использованием молекулярных сит, которая также хорошо известна в данной области. Процедуры экстракционной ферментации включают в себя применение смешивающегося с водой растворителя, который предоставляет низкий риск токсичности в отношении ферментационного организма, для извлечения этанола из разведенного ферментационного бульона. Например, олеиловый спирт является растворителем, который может быть использован в этом типе процесса экстракции. Олеиловый спирт непрерывно вводят в ферментер, после чего этот растворитель поднимается, образуя слой на верхней части ферментера, который непрерывно экстрагируется и подается посредством центрифуги. Затем воду и клетки легко отделяют от олеилового спирта и возвращают в ферментер, тогда как загруженный этанолом растворитель подают в узел мгновенного испарения. Большинство этанола испаряется и конденсируется, тогда как олеиловый спирт не является летучим и извлекается для повторного использования в этой ферментации.
Ацетат может быть также извлечен из ферментационного бульона с использованием способов, известных в данной области. Способы извлечения ацетата описаны подробно в АО 2007/117157 и АО 2008/115080.
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения этанол и ацетат извлекают из ферментационного бульона непрерывным удалением части этого бульона из ферментационного биореактора, отделением микробных клеток из этого бульона (преимущественно фильтрованием) и извлечением сначала этанола и затем ацетата из этого бульона. Этанол может быть преимущественно извлечен дистилляцией, а ацетат может быть извлечен адсорбцией на активированном угле с использованием способов, описанных выше. Эти отделенные микробные клетки предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. Бесклеточный пермеат, остающийся после удаления этанола и ацетата, также предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. Дополнительные питательные вещества (такие как витамины В) могут быть добавлены к бесклеточному пермеату для пополнения питательной среды перед ее возвратом в биореактор. Кроме того, если рН этого бульона корректировали, как описано выше, для усиления адсорбции уксусной кислоты на активированном угле, этот рН должен быть корректирован опять до рН бульона в ферментационном биореакторе перед возвратом его в биореактор.
Стехиометрия реакции.
Без связывания себя какой-либо теорией авторы изобретения считают, что химические реакции для ферментации СО до этанола (а) и уксусной кислоты (Ь) в процессе данного изобретения являются следующими:
6СО+ЗН2О-->СН2СН2ОН+4СО2 4СО+2Н2О-->1СН2СООН+2СО2
Это изобретение будет теперь описано более подробно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
- 10 025778
Примеры
Материалы и способы.
Раствор А
ΝΗφΑϋ 3,083 г КС1 0,15 г
М§С12 ОНтО 0,4 г КаС1 (необязательно) 0,12 г
СаС12'2Н2О 0,294 г Дистиллированная вода до 1 л
Раствор В
Биотин 20,0 мг О-ί* [-пантотенат кальция 50,0 мг
Фолиевая кислота 20,0 мг Витамин Вц 50,0 мг
ПиридоксинНС1 10,0 мг п-аминобензойная кислота 50,0 мг
ТиаминНС1 50,0 мг Тиоктовая кислота 50,0 мг
Рибофлавин 50,0 мг Дистиллированная вода до 1 л
Никотиновая кислота 50,0 мг
Раствор С
Компонент ммоль/л Н2О Компонент ммоль/л Н2О
РеС13 0,1 ИаэЗеОз 0,01
СоС12 0,05 Ыа2МоО4 0,01
ΝίΟ2 0,05 ζηθ2 0,01
НзВОз 0,05 МпС12 0,01
Να2\νθ3 0,01
Приготовление раствора Сг(11).
Трехгорлую колбу на 1 л снабжали плотно прилегающим впускным отверстием для газа для возможности работы под инертным газом и последующего переноса желаемого продукта в подходящую колбу для хранения. Эту колбу загружали СгС13-6Н2О (40 г, 0,15 моль) гранулами цинка [20 меш] (18,3 г, 0,28 моль), ртутью (13,55 г, 1 мл, 0,0676 моль) и 500 мл дистиллированной воды. После промывания Ν2 в течение одного часа, эту смесь нагревали до приблизительно 80°С для инициирования этой реакции. После двух часов при постоянном потоке Ν2 эту смесь охлаждали до комнатной температуры и непрерывно перемешивали еще 48 ч, когда эта реакционная смесь превращалась в темно-синий раствор. Этот раствор переносили в продуваемые Ν2 флаконы для сыворотки и хранили в рефрижераторе для последующего использования.
Бактерии.
Два используемых типа С1о5йтбшт аи1ое1йаподепит были бактериями, депонированными в Сегтаи Кекоигсе Сейте Гог Вю1ощса1 Ма1епа1 (ΌδΜΖ), и им были присвоены номера доступа ΌδΜ 19630 и ΌδΜ 23693. ΌδΜ 23693 был получен из штамма С1окйтбшт аи1ое1йаподепит ΌδΜ 19630 (ΌδΜΖ, Сегтапу) посредством процесса повторяемой селекции.
Взятие проб и аналитические процедуры.
Пробы сред брали из реактора СδΤК с интервалами на протяжении хода каждой ферментации. Каждый раз при взятии проб сред заботились о том, чтобы была гарантия того, что газ не может входить в реактор или выходить из реактора.
ВЭЖХ.
НРЬС δу5ΐет Адйей 1100 δе^^е5. Подвижная фаза: 0,0025н. серная кислота. Поток и давление: 0,800 мл/мин. Колонка: АШесй 1ОА; Сай1од # 9648, 150x6,5 мм, размер частиц 5 мкм. Температура колонки: 60°С. Детектор: показатель преломления. Температура детектора: 45°С.
Способ приготовления проб.
400 мкл пробы и 50 мкл 0,15 М ΖιιδΟ4 и 50 мкл 0,15 М Ва(ОН)2 загружают в пробирку Эппендорфа. Эти пробирки центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин, 4°С. 200 мкл супернатанта переносят во флакон ВЭЖХ и 5 мкл инжектируют в прибор ВЭЖХ.
Анализ пространства головки.
Измерения проводили на Уапап СР-4900 тюго СС с двумя установленными каналами. Канал 1 был колонкой молекулярных сит 10 ммоль, работающей при 70°С, 200 кПа аргоне и времени обратного промывания 4,2 с, тогда как канал 2 был колонкой 10 м РРО, работающей при 90°С, 150 кПа гелия и без обратного вымывания. Температура инжектора для обоих каналов была 70°С. Время вытекания устанавливали на 120 с, но все представляющие интерес пики обычно элюировали до 100 с.
Плотность клеток.
Плотность клеток определяли счетом бактериальных клеток в определенной аликвоте ферментационного бульона. Альтернативно, оптическую плотность проб измеряли при 600 нм (спектрофотометр) и сухую массу определяли согласно опубликованным процедурам.
Секвенирование.
Секвенирование генома выявило несколько изменений в геномах штамма С. айоеШаподепит ΤΖ1560 (ΌδΜ19630) и нового штамма ΤΖ1561 (ΌδΜ23693), которые, по-видимому, способствуют улуч- 11 025778 шенной производительности.
Оба штамма выращивали анаэробно в среде РЕТС до оптической плотности (ОИ600 нм) и геномную ДНК выделяли из 100 мл ночных культур. Клетки собирали центрифугированием (6000/д. 15 мин, 4°С), промывали калийфосфатным буфером (10 мМ; рН 7,5) и суспендировали в 1,9 мл ЗТЕ-буфера (50 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 200 мМ сахароза; рН 8,0). Эту суспензию обрабатывали 300 мкл лизоцима (приблизительно 100000 Е; 30 мин, 37°С) и 280 мкл раствора ДСН (10% (м/о); 10 мин). РНК расщепляли добавляют 240 мкл раствора ЭДТА (0,5 М; рН 8), 20 мкл Трис-НС1 (1 М; рН 7,5) и 10 мкл РНКазы А (50000 Е) в течение 1 ч. Протеолиз выполняли добавлением 100 мкл протеиназы К (0,5 Е) в течение 1-3 ч при 37°С. Наконец, добавляли 600 мкл перхлората натрия (5 М), проводили экстракцию смесью фенолхлороформ и осаждение изопропанолом. Чистоту и количество ДНК проверяли с использованием спектрофотометра ШпоЭгор® (Тйегто Изйег Заепййс, УаИйат, МА, ИЗА) и гель-электрофореза.
ЗЬо1дип''-секвенирование (метод дробовика) генома выполняли с использованием 454 О§ (Косйе Аррйей 8с1епсе, 1пй1ароЙ8, ΙΝ, ИЗА). 192368 отдельных считываний с общей длиной 44424523 оснований были созданы для ΕΖ1560 (10-кратная степень покрытия), тогда как 579545 считываний спаренных концов с общей длиной 202591572 п.н. были созданы для ΕΖ1561 (47,5-кратная степень покрытия). Эти считывания собирали с использованием №\\Ыег раскаде (Косйе Аррйей Заепсе, 1пй1ароЙ8, ΙΝ, ИЗА) и последовательности сравнивали с использованием Оепеюиз (Вютайегз Ь1й., Аиск1апй, ΝΖ) с МАИУЕ раскаде (Иагйпд е! а1., 2004, Оепоте Кез. 14: 1394-1403) и прибора Аг1ет18 Сотрапзоп Тоо1 (Сагуег е! а1., 2008, Вюш&гтайс 24:2672-6).
В целом, 64 изменения были обнаружены в собранных геномных последовательностях ΕΖ1560 (ИЗМ19630) и нового штамма ΕΖ1561 ΕΖ1561 (ИЗМ23693) (фиг. 4). Хотя большинство изменений были вариациями отдельных оснований, были обнаружены одна делеция 21 п.н. (в гене, кодирующем предположительный белок Ми!З репарации ошибочного спаривания ДНК; ЗЕО Ш.1-4) и событие реаранжировки района 15408 п.н. (ЗЕО Ш.5), содержащего 11 генов (участвующих в фиксации азота, метаболизме сахаров, транспорте сахаров и катаболическом контроле). Из 62 вариаций отдельных оснований 22 были точковыми мутациями и 40 инсерциями/делециями. 18 из этих вариаций были обнаружены в межгенных районах и 44 в кодирующих районах. Хотя 5 из этих вариаций в кодирующем районе были молчащими и не приводили к изменению аминокислотной последовательности, 14 приводили к изменению в отдельных аминокислотах и 25 к смещению рамки считывания.
Наиболее примечательными были изменения в положениях 212530 (предположительный район промотора оперона ΡιΡ0 АТФ-синтазы, ЗЕО ГО.6-7), 1174874 (предположительный район промотора оперона КпГ-комплекса, ЗЕО ГО.8-9), 3717495 (предположительный район промотора белка углеродного голодания, ЗЕО ГО.10-11) и две вариации в кластере генов \Уоой-Ещпд<1ай1 в положениях 3741730 (бетасубъединица комплекса СО-дегидрогеназа/СО-метилирующая ацетил-КоА-синтаза, ЗЕО Ш.12-15) и 3748058 (ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы, ЗЕО Ш.16-17), которые могут быть прослежены обратно непосредственно до роста на СО/Н2 и метаболизма энергии. Большинство других измененных генов являются неохарактеризованными генами.
Пример 1.
A. Периодическая ферментация в СЗТК.
Приблизительно 1500 мл раствора А переносили в ферментер на 1,5 л и разбрызгивали азотом. Добавляли Резазурин (1,5 мл раствора 2 г/л) и Н3РО4 (85% раствор, 2,25 мл) и рН доводили до 5,3 с использованием концентрированного ΝΗ4ΟΗ (водн.). Нитрилотриуксусную кислоту (9,3 мл 0,15 М раствора) добавляли перед 1,5 мл раствора С. Затем добавляли №С12 (0,75 мл 0,1 М раствора) и №-ь\УО3 (1,5 мл 0,01 М раствора). Добавляли 15 мл раствора В и этот раствор разбрызгивали Ν2 перед переключением на СО-содержащий газ (50% СО; 28% Ν2, 2% Н2, 20% СО2) при 70 мл/мин. Затем этот ферментер инокулировали 200 мл культуры СЗозЮйшт аи1ое1йаподепит 19630. Ферментер поддерживали при 37°С и перемешивали при 300 об/мин. Во время этого эксперимента добавляли раствор Ν28 (0,2 М раствор) при скорости приблизительно 0,3 мл/ч. Подачу субстрата увеличивали в соответствии с требованиями микробной культуры.
Эта бактериальная культура не размножалась в используемых экспериментальных условиях. Эта культура обнаруживала 350 мМ поглощение СО после 48 ч роста (фиг. 1а и табл. 2), тогда как время удвоения этой культуры было 40,8 ч (фиг. 2а). Это соответствует удельной скорости роста 0,41 день-1. Удельное поглощение СО увеличивалось во время этого эксперимента с максимальной величиной 0,54 мМ СО/мин/г биомассы. Удельное поглощение в день 1,0: 0,28 мм/СО/мин/г биомассы (табл. 1). Удельное поглощение в день 2,0: 0,54 мМ СО/мин/г биомассы (табл. 2).
B. Периодическая ферментация в СЗТК.
Приблизительно 1500 мл раствора А переносили в ферментер на 1,5 л и разбрызгивали азотом. Добавляли Резазурин (1,5 мл раствора 2 г/л) и Н3РО4 (85% раствор, 2,25 мл) и рН доводили до 5,3 с использованием концентрированного ΝΗ4ΟΗ (водн.). Нитрилотриуксусную кислоту (9,3 мл 0,15 М раствора) добавляли перед 1,5 мл раствора С. Добавляли №-ь\УО3, (1,5 мл 0,01 М раствора). Добавляли 15 мл раствора В и этот раствор разбрызгивали Ν2 перед переключением на СО-содержащий газ (50% СО; 50% Ν2)
- 12 025778 при 60 мл/мин. Затем этот ферментер инокулировали 180 мл культуры С1о8йтбшт аи1ое1Ьаподепит 23693. Ферментер поддерживали при 37°С и перемешивали при 300 об/мин. Во время этого эксперимента добавляли раствор Ν2δ (0,5 М раствор) при скорости приблизительно 0,12 мл/ч. Подачу субстрата увеличивали в соответствии с требованиями микробной культуры.
Эта бактериальная культура размножалась в используемых экспериментальных условиях. Эта культура обнаруживала 8400 мМ поглощение СО после 43 ч роста (фиг. 2Ь), тогда как время удвоения этой культуры было 9,6 ч (фиг. 2Ь). Это соответствует удельной скорости роста 1,73 день-1. Максимальное удельное поглощение СО, достигаемое во время этого эксперимента, было 1,17 ммоль СО/мин/г биомассы. Удельное поглощение в день 1,0: 1,17 мм/СО/мин/г биомассы (табл. 1). Удельное поглощение в день 2,0: 1,03 мМ СО/мин/г биомассы (табл. 2). Эти условия ферментации были идентичными или, по меньшей мере, высоко сходными с условиями, используемыми в примере 1А. Препарат среды имеет идентичные компоненты при сходных концентрациях, тогда как оба газа содержали СО по меньшей мере 50% (о/о). Эти сходные условия ферментации в сравнении с большим различием в поглощении СО показывают, что производительность этой культуры изменялась вследствие улучшенной эффективности разработанной культуры С1о8йтбшт аи1ое1Ьаподепит 23693 в сравнении с исходным (родительским) штаммом С1о8йтбшт аи1ое1Ьаподепит 19630.
Результаты.
Таблица 1
День 1
Жтамм ОЭМ19630 П5М23693
Потребление СО, мМ/л 113 мМ 3700 мМ
Продуцир о в ание этанола, г/л 0,48 г/л 7,98/л
Продуцир о в ание ацетата, г/л 4,58 г/л 4,Об г/л
Биомасса г/л 0,29 г/л 1,83 г/л
Удельное поглощение 0,28 СО/мин/г биомассы 1,17 СО/мин/г биомассы
Удельное продуциро вание э т анола 2,5 г/л/г биомассы/день 4,3 г/л/г биомассы/день
Таблица 2
День 2
Штамм Э8М19630 О8М236ЭЗ
Потребление СО, мМ/л 350 мМ. 8150 мМ.
Продуцирование 1,84 г/л 26,14/л
этанола, г/л
Продуцирование 4,5 г/л 3,476 г/л
ацетата, г/л
Биомасса г/л 0,41 г/л 5,42 г/л
Удельное поглощение 0,54 СО/мин/г биомассы 1,03 СО/мин/г биомассы
Удельное 0,54 г/л/г 1,03 г/л/г
продуцирование этанола биомассы/день биомассы/день
Пример 2.
Приблизительно 1500 мл раствора А переносили в ферментер на 1,5 л и разбрызгивали азотом. Добавляли Резазурин (1,5 мл раствора 2 г/л) и Н3РО4 (85% раствор, 0,56 мл) и рН доводили до 5,3 с использованием концентрированного ΝΗ4ΟΗ (водн.). Добавляли раствор С (1,5 мл), после чего добавляли №-ь\УО3 (1,5 мл 0,01 М раствора). Добавляли 15 мл раствора В и этот раствор разбрызгивали Ν2 перед переключением на СО-содержащий газ (50% СО; 50% Ν2) при 60 мл/мин. Затем этот ферментер инокулировали 100 мл культуры С1о8йтбшт аи1ое1Ьаподепит 23693. Ферментер поддерживали при 37°С и перемешивали при 300 об/мин. Во время этого эксперимента добавляли раствор Ν2δ (0,5 М раствор) при скорости приблизительно 0,15 мл/ч. Подачу субстрата увеличивали в соответствии с требованиями микробной культуры.
Эта бактериальная культура размножалась в используемых экспериментальных условиях. Эти условия ферментации были идентичными или по меньшей мере высоко сходными с условиями, используемыми в примере 1А+В, тогда как оба газа содержали СО по меньшей мере 50% (о/о). Эту культуру выращивали до стационарной фазы роста, где максимальную концентрацию этанола измеряли при помощи ВЭЖХ (55,8 г/л).
Конкретные способы и композиции, описанные здесь, являются репрезентативными предпочтительными вариантами осуществления и являются примерными и не предназначены для ограничения объема этого изобретения. Другие цели, аспекты и варианты осуществления будут приходить на ум специалистам с квалификацией в данной области после рассмотрения этого описания и включены в объем и
- 13 025778 идею этого изобретения. Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, что могут быть произведены варьирующиеся замены и модификации в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от объема и идеи этого изобретения. Это изобретение, описанное здесь иллюстративно, может подходящим образом использоваться на практике в отсутствие любого элемента или любых элементов или ограничения или ограничений, которые не описаны конкретно здесь в качестве неотъемлемых. Так, например, в каждом случае здесь, в вариантах или примерах данного изобретения, термины содержащий, включающий в себя, состоящий и т.д. должны читаться как расширительные и без ограничений. Кроме того, названия, заголовки или т.п. обеспечены для улучшения понимания читателем этого документа, а не для ограничения объема данного изобретения.
Полные описания всех заявок, патентов и публикаций, цитируемых выше и ниже, если они имеются, включены тем самым посредством ссылки. Однако ссылка на любые заявки, патенты и публикации в этом описании не должна приниматься как признание или любая форма предположения, что они составляют имеющий юридическую силу известный уровень техники или образуют часть обычного общего известного уровня техники в любой из стран мира.
Список последовательностей <110> Ьапга-есН Ией 2еа1апЭ ЫтТ-еЭ НеТдз-га, Вдогп Б Ыевд, ЕипдтТп Коерке, М1сНае1 Кегп, Ενдеη^а Зедоν^а, 81топ <120> НОВЫЕ БАКТЕРИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> 508947РСТРВ <150> из 61/368486 <151> 2010-07-28 <160> 17 <170> Ра-еп-1п νе^з^оп 3.5 <210> 1 <211> 2655 <212> ДНК <213> С1оз-г1Э1ит аи-ое-Наподепит

Claims (14)

1. Штамм микроорганизма С1о81пйшт аШосФаподспит. депонированный в Германской Коллекции Микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером доступа ΌδΜ23693, обладающий способностью продуцировать этанол посредством анаэробной ферментации субстрата, содержащего СО.
2. Штамм по п.1, удельная продуктивность которого равна по меньшей мере 2 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день.
3. Штамм по п.2, удельная продуктивность которого равна по меньшей мере 7 г этанола/л ферментационного бульона/г биомассы/день.
4. Штамм по п.1, дополнительно продуцирующий ацетат.
5. Штамм по любому из пп.1-4, удельная продуктивность которого составляет по меньшей мере 10 г этанола/л ферментационного бульона/день.
6. Штамм по п.5, удельная продуктивность которого равна по меньшей мере 50 г этанола/л ферментационного бульона/день.
7. Штамм по любому из пп.4-6, где отношение этанола к ацетату равно по меньшей мере 2:1.
8. Штамм по п.7, где отношение этанола к ацетату равно по меньшей мере 7:1.
9. Штамм по п.8, где отношение этанола к ацетату равно по меньшей мере 10:1.
10. Штамм по любому из пп.1-9, имеющий удельное поглощение по меньшей мере 1,0 ммоль СО/мин/г биомассы.
11. Штамм по п.10, имеющий удельное поглощение по меньшей мере 2,0 ммоль СО/мин/г биомассы.
12. Штамм по любому из пп.1-11, имеющий удельную скорость роста по меньшей мере 0,8 день-1.
13. Штамм по п.12, имеющий удельную скорость роста по меньшей мере 2,0 день-1.
14. Штамм по п.1, который выдерживает концентрацию спирта до 70 г/л ферментационного бульона.
EA201390179A 2010-07-28 2011-07-28 Новые бактерии и способы их применения EA025778B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36848610P 2010-07-28 2010-07-28
PCT/NZ2011/000144 WO2012015317A1 (en) 2010-07-28 2011-07-28 Novel bacteria and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390179A1 EA201390179A1 (ru) 2013-08-30
EA025778B1 true EA025778B1 (ru) 2017-01-30

Family

ID=45530328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390179A EA025778B1 (ru) 2010-07-28 2011-07-28 Новые бактерии и способы их применения

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20130217096A1 (ru)
EP (1) EP2598630B1 (ru)
JP (1) JP5922657B2 (ru)
KR (1) KR101375038B1 (ru)
CN (1) CN103415612B (ru)
AU (1) AU2011283282C1 (ru)
BR (1) BR112013003644B1 (ru)
CA (1) CA2786903C (ru)
EA (1) EA025778B1 (ru)
WO (1) WO2012015317A1 (ru)
ZA (1) ZA201300612B (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110256600A1 (en) * 2011-02-02 2011-10-20 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant Microorganisms and Methods of Use Thereof
TWI537389B (zh) 2011-03-31 2016-06-11 藍瑟科技紐西蘭有限公司 用於控制丁二醇生產之發酵方法
MY165103A (en) * 2012-01-31 2018-02-28 Lanzatech New Zealand Ltd Recombinant microorganisms and methods of use thereof
US8735115B2 (en) * 2012-03-30 2014-05-27 Lanzatech New Zealand Limited Method for controlling the sulphur concentration in a fermentation method
US20130316364A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Lanzatech New Zealand Limited Selection Method and Recombinant Microorganisms and uses Therefor
US10233478B2 (en) 2012-09-19 2019-03-19 Ineos Bio Sa Process for reducing CO2 emissions and increasing alcohol productivity in syngas fermentation
US9850503B2 (en) 2013-06-10 2017-12-26 Ineos Bio Sa Control of conductivity in anaerobic fermentation
WO2015116737A1 (en) * 2014-01-28 2015-08-06 Lanzatech New Zealand Limited Bacterium with increased tolerance to butyric acids
JP6783658B2 (ja) * 2014-01-30 2020-11-11 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 組換え微生物及びその使用方法
US9617566B2 (en) * 2014-07-11 2017-04-11 Lanzatech New Zealand Limited Control of bioreactor processes
BR122023023164A2 (pt) * 2015-05-27 2024-03-05 Lanzatech Nz, Inc. Bactéria geneticamente modificada fixadora de c1 capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato, e, método de fabricação de um produto de fermentação
EP3981869A1 (en) 2015-12-03 2022-04-13 LanzaTech NZ, Inc. Arginine as sole nitrogen source for c1-fixing microorganism
JP2018153152A (ja) * 2017-03-21 2018-10-04 積水化学工業株式会社 有機化合物生産システム、並びに、有機化合物の生産方法
ES2926336T3 (es) 2017-09-08 2022-10-25 Lanzatech Inc Proceso para la producción de metabolitos utilizando sustratos que contienen C1 ricos en hidrógeno
DE112017007887T5 (de) * 2017-09-29 2020-05-07 Intel Corporation Antennenpackage mit kugel-anbringungs-array zum verbinden von antennen- und basissubstraten
KR20200091458A (ko) 2017-12-19 2020-07-30 란자테크, 인크. 에틸렌 글리콜의 생물학적 생성을 위한 미생물 및 방법
KR20200110705A (ko) 2018-02-12 2020-09-24 란자테크, 인크. 탄소 전환 효율을 개선하기 위한 공정
CA3097019A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 Lanzatech, Inc. Intermittent electrolysis streams
JP7280951B2 (ja) 2018-11-19 2023-05-24 ランザテク，インコーポレイテッド 発酵とガス化との統合
MY197690A (en) 2019-01-29 2023-07-05 Lanzatech Inc Production of bio-based liquefied petroleum gas
BR112021015449A2 (pt) 2019-02-08 2021-10-05 Lanzatech, Inc. Métodos para recuperar produto a partir de um caldo de fermentação e para recuperar produto a partir de uma corrente enriquecida com produto
EP4162056A4 (en) 2020-06-06 2024-05-29 Lanzatech, Inc. MICROORGANISM WITH TARGETED SEQUENCE INSERTION AT THE ACETOLACTATE DECARBOXYLASE GENE LOCUS
CN116348603B (zh) 2021-02-08 2024-07-02 朗泽科技有限公司 重组微生物及其用途
TW202307202A (zh) 2021-08-06 2023-02-16 美商朗澤科技有限公司 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法
US12077800B2 (en) 2022-06-16 2024-09-03 Lanzatech, Inc. Liquid distributor system and process of liquid distribution

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211585A1 (en) * 2000-07-25 2003-11-13 Gaddy James L. Methods for increasing the production of ethanol from microbial fermentation
WO2008028055A2 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
WO2010064933A1 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Lanzatech New Zealand Limited Optimised fermentation media
WO2011078709A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Lanzatech New Zealand Limited, Alcohol production process

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173429A (en) 1990-11-09 1992-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
US5807722A (en) 1992-10-30 1998-09-15 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of acetic acid from waste gases with Clostridium ljungdahlii
UA72220C2 (ru) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Translated By PlajНЕСМЕШИВАЕМАЯ С ВОДОЙ СМЕСЬ РАСТВОРИТЕЛЬ/СОРАСТВОРИТЕЛЬ ДЛЯ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ АНАЭРОБНОГО МИКРОБНОГО БРОЖЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ), МОДИФИЦИРОВАННЫЙ РАСТВОРИТЕЛЬ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
WO2000068407A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Bioengineering Resources, Inc. Clostridium strains which produce ethanol from substrate-containing gases
US20130252083A1 (en) * 2004-01-13 2013-09-26 John E. Stauffer Lead-zinc battery
NZ546496A (en) 2006-04-07 2008-09-26 Lanzatech New Zealand Ltd Gas treatment process
NZ553984A (en) 2007-03-19 2009-07-31 Lanzatech New Zealand Ltd Alcohol production process
CN101918538B (zh) * 2007-11-13 2013-01-30 兰扎泰克新西兰有限公司 一种厌氧菌及其用途
WO2009151342A1 (en) 2008-06-09 2009-12-17 Lanzatech New Zealand Limited Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation
WO2010064932A1 (en) 2008-12-01 2010-06-10 Lanzatech New Zealand Limited Optimised fermentation media
US20130045517A1 (en) * 2010-05-04 2013-02-21 Lanzatech New Zealand Limited Fermentation of waste gases
TWI548739B (zh) * 2010-10-22 2016-09-11 藍瑟科技紐西蘭有限公司 製造烴產物之方法及系統
US20130224839A1 (en) * 2011-02-02 2013-08-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant Microorganism and Methods of Production Thereof
US9410130B2 (en) * 2011-02-25 2016-08-09 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US20130236941A1 (en) * 2012-03-12 2013-09-12 Cobalt Technologies Inc. Integrated Biorefinery
JP5842701B2 (ja) * 2012-03-27 2016-01-13 信越化学工業株式会社 希土類元素が拡散された酸化物セラミック蛍光材料

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211585A1 (en) * 2000-07-25 2003-11-13 Gaddy James L. Methods for increasing the production of ethanol from microbial fermentation
WO2008028055A2 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
WO2010064933A1 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Lanzatech New Zealand Limited Optimised fermentation media
WO2011078709A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Lanzatech New Zealand Limited, Alcohol production process

Also Published As

Publication number Publication date
US10494600B2 (en) 2019-12-03
KR20130097174A (ko) 2013-09-02
JP2013532481A (ja) 2013-08-19
BR112013003644B1 (pt) 2020-11-17
EA201390179A1 (ru) 2013-08-30
CN103415612A (zh) 2013-11-27
JP5922657B2 (ja) 2016-05-24
US20130217096A1 (en) 2013-08-22
CA2786903A1 (en) 2012-02-02
EP2598630A1 (en) 2013-06-05
ZA201300612B (en) 2014-03-26
AU2011283282C1 (en) 2014-03-13
EP2598630B1 (en) 2015-11-25
AU2011283282A1 (en) 2013-02-21
WO2012015317A1 (en) 2012-02-02
KR101375038B1 (ko) 2014-03-14
US20160017276A1 (en) 2016-01-21
EP2598630A4 (en) 2013-10-23
CA2786903C (en) 2015-01-20
AU2011283282B2 (en) 2013-10-03
CN103415612B (zh) 2016-01-20
BR112013003644A2 (pt) 2018-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10494600B2 (en) Bacteria and methods of use thereof
EP2217696B1 (en) Novel bacteria and methods of use thereof
CA3013354C (en) Integrated fermentation and electrolysis process
EP3411490B1 (en) Low pressure separator having an internal divider and uses therefor
CN103270164B (zh) 用于生产醇和/或酸的方法和系统
EA019266B1 (ru) Микробиологический способ производства спирта
EA021007B1 (ru) Способ ферментативного превращения углеродсодержащего сырья
EA024474B1 (ru) Способ производства углеводородных продуктов
EA023403B1 (ru) Способ ферментации
US8852918B2 (en) Bacteria and methods of use thereof
AU2008321615B2 (en) Novel bacteria and methods of use thereof
EA046101B1 (ru) Интегрированный процесс ферментации и электролиза

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent