JP6783658B2 - 組換え微生物及びその使用方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2014年1月30日出願の米国仮特許出願第61/933,815号及び2014年2月25日出願の米国仮特許出願第61/944,541号の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、本明細書と同時に提出され、以下、2015年1月29日に作成された「LT102WO1_ST25.txt」と題する23,322バイトASCII(テキスト)ファイルとして識別される、ヌクレオチド/アミノ酸配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
アセトゲンは、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、かつアセチル−CoAならびに酢酸塩及びエタノールなどアセチル−CoA由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である(Ragsdale,Biochim Biophys Acta,1784:1873−1898,2008)。
多くのアセトゲンは、少なくとも2つ以上の生成物を自然に生成する。しかしながら、これは、複数の生成物の生成が各個々の生成物の効率及び収率に有害であるため、商業的規模で必ずしも望ましくはない。具体的には、副生成物は、標的生成物の生合成経路から炭素を転用し、毒性の問題をもたらし、標的生成物の回収及び分離を妨げ、標的生成物に有利な発酵条件の制御を複雑化させ、汚染微生物の基質として働く可能性がある。
例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ(Kopke,Appl Environ Microbiol,77:5467−5475,2011)、及びブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Heiskanen,Enzyme Microb Technol,41 362−367,2007)などのアセトゲンは、副生成物として乳酸塩を生成し得る。この乳酸塩の生成は、エタノール、ブタノール、または2,3−ブタンジオールなどの標的生成物の効率及び収率を低減する。加えて、乳酸塩は、低濃度でさえクロストリジウム・オートエタノゲナムなどのアセトゲンに毒性である可能性があり(Kopke,Appl Environ Microbiol,77:5467−5475,2011)、他の細菌のための基質として働く可能性があり、乳酸塩が生成されるときの細菌汚染の可能性はますます。さらに、乳酸塩をエタノールなどの他の生成物から分離することは、煩雑な処理ステップを必要とする可能性がある。
したがって、乳酸塩などの副生成物の生成を低減または排除する微生物及び方法の強い必要性がある。
本発明は、乳酸塩生合成経路の酵素中に妨害突然変異を含む、カルボキシド栄養性(carboxydotrophic)酢酸生成細菌を提供する。一実施形態では、妨害突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素の発現または活性を低減または排除する。
妨害突然変異は、乳酸塩を生成する細菌の能力に影響を及ぼす。一実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する。一実施形態では、本発明の細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない。
本発明の細菌は、エタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの1つ以上などの生成物を生成し得る。一実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して増加した量のエタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの1つ以上を生成する。
一実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する酵素である。好ましい実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、乳酸脱水素酵素(LDH)である。
本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイなどの親細菌に由来してもよい。好ましい実施形態では、親細菌は、DSMZ受託番号DSM23693下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
本発明は、COを含む基質の存在下で本発明の細菌を培養することを含み、それにより細菌が生成物を生成する、生成物を生成する方法をさらに提供する。
LDHノックアウト戦略、及びスクリーニングのために使用されるプライマーを示す図である。 1組のゲル画像である。第1のゲル画像は、野生型(w)及び接合完了体クローン6(6)における5’クロスオーバーのためのプライマーOg24r/Og35f及び3’クロスオーバーのためのプライマーOg21f/Og36rを使用した、ノックアウトプラスミドの単一クロスオーバー統合に対するスクリーニングを示す。第2のゲル画像は、外側フランキングプライマーOg35f/Og36r及びOg21f/Og24rを使用した、二重クロスオーバーに対するスクリーニングを示す。 プライマーLdhAF/Rを使用した、遺伝子ID:126803 Target 129Sに対するコロニーPCRを示すゲル画像である。100bpのPCR産物が野生型の遺伝子型を示した一方で、約1.9kbの産物サイズは、標的部位におけるグループIIイントロンの挿入を確認した。 プライマーCatPR/RepHFを用いたプラスミド損失を示すゲル画像である。プラスミド損失を、耐性マーカー(catP)の増幅及びグラム陽性複製起点(pCB102)によって検査した。 基質として30psiの製鋼オフガス(44% CO、22% CO、2% H、32% N)を有する血清ボトル内の6日間の増殖後の、C.オートエタノゲナムのHPLC分析を示すグラフである。 基質として30psiの製鋼オフガス(44% CO、22% CO、2% H、32% N)を有する血清ボトル内の6日間の増殖後の、不活性化乳酸脱水素酵素を有するC.オートエタノゲナムのHPLC分析を示すグラフである。
本発明者らは、酢酸生成細菌中の乳酸塩生合成経路の妨害が、親微生物と比較してエタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、コハク酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの生成物の増加した、またはより効率的な生成をもたらし、かつコハク酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの前駆体であるピルビン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩の増加した、またはより効率的な生成ももたらし得ることを発見した。バリン、ロイシン、ギ酸塩、及びピルビン酸塩の生成はまた、培地をこれらの化合物で補充する必要性を取り除き、さらなる費用節約をもたらし得る。さらに、細菌の乳酸塩生成の低減または排除は、細菌に対する乳酸塩の毒作用を低減または排除する。
本発明は、乳酸塩生合成経路の酵素中に妨害突然変異を含む、カルボキシド栄養性酢酸生成細菌を提供する。
「突然変異」は、本発明の細菌が由来する野生型または親微生物と比較した、本発明の細菌中の核酸またはタンパク質の修飾を指す。用語「遺伝子修飾」は、用語「突然変異」を包含する。一実施形態では、突然変異は、酵素をコードする遺伝子中の1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、突然変異は、酵素中の1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
典型的には、突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素の発現または活性を低減または排除(すなわち、妨害)する「妨害突然変異」である。妨害突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素または酵素をコードする遺伝子を部分的に不活性化、完全に不活性化、または欠失してもよい。妨害突然変異は、ノックアウト(KO)突然変異であってもよい。妨害突然変異は、乳酸塩の生合成を低減、阻止、または遮断するいずれの突然変異であってもよい。妨害突然変異は、例えば、乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子中の突然変異、乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節要素中の突然変異、乳酸塩生合成経路の酵素の活性を低減または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または乳酸塩生合成経路の酵素の発現を阻害する核酸(例えば、アンチセンスRNA、siRNA、CRISPR)またはタンパク質の導入を含んでもよい。
妨害突然変異は、乳酸塩を生成しないか、もしくは実質的に生成しない、または細菌が由来する親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、本発明の細菌をもたらす。例えば、本発明の細菌は、乳酸塩を生成しない可能性があるか、または親細菌よりも少なくとも約1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは95%少ない乳酸塩を生成し得る。例えば、本発明の細菌は、約0.001、0.01、0.10、0.30、0.50、または1.0g/L未満の乳酸塩を生成し得る。対照的に、発酵条件に応じて、未修飾C.オートエタノゲナムLZ1561は、最大で約2g/Lの乳酸塩を生成し得る。他の未修飾細菌の菌株は、さらに多くの乳酸塩を生成し得る。
妨害突然変異は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。例示的な方法は、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータ挿入または欠失、改変遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識型設計、ランダム突然変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化を含む。そのような方法は、例えば、Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001、Pleiss,Curr Opin Biotechnol,22:611−617,2011、及びPark,Protein Engineering and Design,CRC Press,2010に記載される。妨害突然変異は、適宜、一本鎖もしくは二本鎖DNA、RNA、cDNA、またはこれらの組み合わせなどの核酸を使用して導入されてもよい。核酸は、構築物またはベクターと称されてもよく、1つ以上の調節要素、複製起点、マルチクローニング部位、及び/または選択可能マーカーを含んでもよい。一実施形態では、核酸は、親細菌中の乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子を妨害するように適合されてもよい。一実施形態では、核酸は、核酸によってコードされる1つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合されてもよい。構築物またはベクターは、プラスミド(例えば、pMTL、pIMP、pJIR)、ウイルス(バクテリオファージを含む)、コスミド、及び人工染色体を含んでもよい。構築物は、親細菌の形質転換後に染色体外に留まってもよく、または細菌のゲノムへの統合のために適合されてもよい。したがって、構築物は、統合(例えば、相同組換え及び宿主のゲノムへの標的統合を可能にする領域)、または染色体外構築物の発現及び複製(例えば、複製起点、プロモータ、及び他の調節配列)を補助するように適合される核酸配列を含んでもよい。
核酸は、相同組換えを使用して導入されてもよい。そのような核酸は、妨害される遺伝子内の領域または該遺伝子に隣接した領域に相同のアームを含んでもよい(「相同アーム)」。これらの相同アームは、妨害される遺伝子内の相同組換え、及び1つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を可能にする。相同アームがゲノム中の標的領域に対して100%の相補性を有することが好ましいが、100%の相補性は、配列がゲノム中の標的領域との標的組換えを可能にするために十分に相補的である限り必要ではない。典型的には、相同アームは、厳しい条件下で標的領域への交雑を可能にし得る相同性のレベルを有する(Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。親細菌中の標的核酸配列(すなわち、親細菌中の標的遺伝子または標的領域の配列)の知識は概して、適切な相同アームを設計するのに十分である。例えば、LDHを妨害するために、本明細書に記載されるフランキング相同アームが使用されてもよい(例えば、配列番号1〜2)。C.リュングダリイにおいて、相同アームは、GenBank CP001666.1に基づき設計されてもよい。他の菌株に対して、相同アームは、他の公的に入手可能である核酸配列情報に基づき設計されてもよい。
「乳酸塩生合成経路」は、乳酸塩の生成をもたらす反応の経路である。一実施形態では、乳酸塩生合成経路は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換する1つ以上の酵素を含む。一実施形態では、乳酸塩生合成経路は、乳酸脱水素酵素の酵素を含む。細菌に応じて、いくつかの異なる酵素が乳酸塩生合成経路に関与してもよい。細菌が乳酸塩生合成経路中に2つ以上の酵素、例えば、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換することが可能な2つ以上の酵素を含むとき、2つ以上のそのような酵素を妨害することは、単一の酵素を妨害することによって達成され得るレベルを超えて、生成物の生成を増加する効果を有し得る。一実施形態では、細菌は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換することが可能な2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれよりも多くの酵素中の妨害突然変異を含む。全てのそのような酵素の発現及び/または活性を妨害することが、生成物生成において何らかの利点を有し得る一方で、概して、本発明の利点、すなわち、1つ以上の主要または標的生成物の増加した生成を得るために、全てのそのような酵素の発現及び/または活性を妨害する必要はない。
一実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、酵素が乳酸脱水素酵素活性を有するように、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に(すなわち、内因性でまたは天然に)変換する。酵素は、それがまたピルビン酸塩を乳酸塩に変換する限り、追加の触媒作用を有してもよい。例えば、酵素は、乳酸脱水素酵素活性を有する任意の脱水素酵素であってもよい。ピルビン酸塩を乳酸塩に変換する酵素への妨害突然変異の導入は、その酵素の発現または活性を低減または排除(すなわち、「妨害」)する。
好ましい実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、乳酸脱水素酵素(LDH)である。妨害突然変異のLDHへの導入は、LDHの発現または活性を低減または排除(すなわち、「妨害」)する。
本発明の細菌は、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異に加えて、乳酸塩生合成経路と関連しない1つ以上の遺伝子またはタンパク質の遺伝子修飾を含む、1つ以上の他の遺伝子修飾を含んでもよい。
1つの特定の実施形態では、本発明の細菌は、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異に加えて、またはその代わりに乳酸塩生合成経路の酵素の阻害因子を発現させてもよい。
「酵素活性」は広く、反応を触媒するための酵素の活性、酵素の量、または酵素の利用可能性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す。したがって、酵素活性を「減少させること」または「低減すること」は、反応を触媒するための酵素の活性、酵素の量、または酵素の利用可能性を減少させること、または低減することを含む。酵素は、それが第1の化合物の少なくとも一部分が第2の化合物に変換される反応を触媒することができる場合、第1の化合物または基質を第2の化合物または生成物に「変換することが可能」である。
用語「変異体」は、核酸及びタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸及びタンパク質の配列などの、参照核酸及びタンパク質の配列から変化する、核酸及びタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異体核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異体プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、1つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ活性レベルを有する変異体核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等の変異体」と称されてもよい。一例として、機能的に同等の核酸変異体は、対立遺伝子変異型、遺伝子のフラグメント、突然変異遺伝子、多型などを含んでもよい。他の微生物からの相同遺伝子もまた、機能的に同等の変異体の例である。これらは、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、またはクロストリジウム・リュングダリイなどの種の相同遺伝子を含み、それらの詳細は、GenbankまたはNCBIなどのウェブサイト上で公的に入手可能である。機能的に同等の変異体はまた、配列が特定の生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含む。核酸の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、またはそれを超える核酸配列同一性(相同性パーセント)を有する。タンパク質の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、またはそれを超えるアミノ酸同一性(相同性パーセント)を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価され得る。
しかしながら、変異体核酸またはタンパク質はまた、参照核酸またはタンパク質と比較して減少した活性レベルを有する可能性がある。例えば、変異体核酸は、減少した発現レベルを有する可能性があるか、または変異酵素は、参照核酸または酵素のそれぞれと比較して、特定の反応を触媒する能力が減少する可能性がある。乳酸塩生合成経路中の酵素の活性を評価するための酵素アッセイ及びキットは、当該技術分野において既知である(Wang,J Bacteriol,195:4373−4386,2013、Sigma−Aldrich(MAK066),Thermo(88953)、Worthington Biochemical Corporation(LS002755))。
核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本発明の細菌に送達されてもよい。例えば、核酸は、ネイキッド核酸として送達されてもよく、または1つ以上の薬剤(例えば、リポソーム)で配合されてもよい。制限阻害因子は、ある特定の実施形態で使用され得る(Murray,Microbiol Molec Biol Rev,64:412−434,2000)。一例として、形質転換(形質導入またはトランスフェクションを含む)は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的なもしくは自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または共役によって達成されてもよい(例えば、Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989を参照されたい)。エレクトロポレーションの使用は、クロストリジウム・リュングダリイ(Koepke,PNAS,107:13087−13092,2010、国際公開第WO/2012/053905号)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(国際公開第WO/2012/053905号)、クロストリジウム・アセチカム(Schiel−Bengelsdorf,Synthetic Biol,15:2191−2198,2012)、及びアセトバクテリウム ウッディイ(Stratz,Appl Environ Microbiol,60:1033−1037,1994)を含む、いくつかのカルボキシド栄養性アセトゲンに対して報告されている。エレクトロポレーションの使用はまた、クロストリジウム・アセトブチリクム(Mermelstein,Biotechnol,10:190−195,1992)、及びクロストリジウム・セルロリティカム(Jennert,Microbiol,146:3071−3080,2000)を含むクロストリジウムにおいても報告されている。プロファージ誘発は、クロストリジウム・スカトロゲネス(Parthasarathy,Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants,Masters Project,Western Kentucky University,2010)を含むカルボキシド栄養性アセトゲンに対して実証されており、共役は、クロストリジウム ディフィシル(Herbert,FEMS Microbiol Lett,229:103−110,2003)及びクロストリジウム/アセトブイリカム(acetobuylicum)(Williams,J Gen Microbiol,136:819−826,1990)を含む多くのクロストリジウムに対して記載されている。ある特定の実施形態では、活性制限酵素系を有することによって、本発明の細菌への核酸の導入前に核酸をメチル化する必要がある場合がある(国際公開第WO2012/105853号)。
用語「組換え体」は、核酸、タンパク質、または微生物が遺伝子修飾、突然変異、または組換えの産物であることを示す。概して、用語「組換え体」は、微生物の2つ以上の異なる菌株または種など、複数の源に由来する遺伝物質を含有する、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」はまた、内因性核酸またはタンパク質の突然変異型を含む、突然変異した核酸またはタンパク質を含む微生物を記載するために使用されてもよい。
「親細菌」は、本発明の細菌を生成するために使用される細菌である。親細菌は、自然発生する細菌(すなわち、野生型細菌)またはすでに修飾された細菌(すなわち、突然変異もしくは組換え細菌)であってもよい。本発明の細菌は、親細菌と比較して少量の酵素を発現するように修飾されてもよく、または本発明の細菌は、親細菌によって発現する酵素を発現しないように修飾されてもよい。一実施形態では、親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである。好ましい実施形態では、親細菌は、DSMZ受託番号DSM23693下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナム(すなわち、クロストリジウム・オートエタノゲナムLZ1561)である。
用語「〜由来の」は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる(例えば、親または野生型)核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、突然変異、または置換を含む。概して、本発明の細菌は、親細菌由来である。一実施形態では、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ由来である。好ましい実施形態では、本発明の細菌は、DSMZ受託番号DSM23693下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムLZ1561由来である。
一実施形態では、親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・コスカッティ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、アセトバクテリウム ウッディイ、アルカリバクラム・バッチィ、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロミュサ・オヴァタ、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモスム、及びサーモアナエロバクター・キウヴィの種を含むカルボキシド栄養性酢酸生成細菌の群から選択される。これらのカルボキシド栄養性酢酸生成細菌は、一酸化炭素(CO)及び二酸化炭素(CO)などの気体の1炭素原子源上で化学独立栄養的に増殖し、嫌気性条件下でエネルギー源として一酸化炭素(CO)及び/または水素(H)を使用し、アセチル−CoA、酢酸塩、及び他の生成物を生成するそれらの能力によって定義される。それらは、同じ発酵モード、すなわちウッド・ユングダールまたは還元的アセチル−CoA経路を共有し、一酸化炭素脱水素酵素(CODH)、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素脱水素酵素/アセチル−CoAシンターゼ(CODH/ACS)からなる酵素セットの存在によって定義され、その組み合わせは、この種の細菌に特徴的かつ特有である(Drake,The Prokaryotes,354−420,Springer,New York,NY,2006)。基質を、生成物が直接またはアセチル−CoAを介して形成されるバイオマス、二次代謝産物、及びピルビン酸塩に変換する糖発酵細菌の化学合成従属栄養増殖とは対照的に、アセトゲンは、基質を、生成物、バイオマス、及び二次代謝産物が形成されるアセチル−CoAに直接誘導する。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、乳酸脱水素酵素を含む親微生物由来であり、本発明の細菌は、乳酸脱水素酵素中の妨害突然変異を含む。例えば、親微生物は、GenBank AEI90736.1を含む核酸配列、またはGenBank CP006763.1、KEGG CAETHG_1147、もしくはGenBank HQ876025.1を含むアミノ酸配列を含む、C.オートエタノゲナムであってもよい。親微生物は、GenBank YP_003781368.1を含む核酸配列、またはGenBank CP001666.1もしくはKEGG CLJU_c32190を含むアミノ酸配列を含む、C.リュングダリイであってもよい。親微生物は、GenBank AEI90737.1を含む核酸配列、またはGenBank HQ876026.1を含むアミノ酸配列を含む、C.ラグスダレイであってもよい。他の親細菌は、他の核酸及びアミノ酸配列を有してもよい。
「カルボキシド栄養細菌(carboxydotroph)」は、高濃度の一酸化炭素(CO)に耐えることが可能である微生物である。典型的には、本発明の細菌は、カルボキシド栄養細菌である。
本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイの種を含むカルボキシド栄養性クロストリジウム、及びクロストリジウム・オートエタノゲナムJAI−1T(DSM10061)(Abrini,Arch Microbiol,161:345−351,1994)、クロストリジウム・オートエタノゲナムLBS1560(DSM19630)(国際公開第WO2009/064200号)、クロストリジウム・オートエタノゲナムLZ1561(DSM23693)、クロストリジウム・リュングダリイPETCT(DSM13528=ATCC 55383)(Tanner,Int J Syst Bacteriol,43:232−236,1993)、クロストリジウム・リュングダリイERI−2(ATCC 55380)(米国特許第5,593,886号)、クロストリジウム・リュングダリイC−01(ATCC 55988)(米国特許第6,368,819号)、クロストリジウム・リュングダリイO−52(ATCC 55989)(米国特許第6,368,819号)、クロストリジウム・ラグスダレイP11T(ATCC BAA−622)(国際公開第WO2008/028055号)の菌株を含むがこれらに限定されない関連分離株、「クロストリジウム・コスカッティ」(米国公開第2011/0229947号)などの関連分離株、またはクロストリジウム・リュングダリイOTA−1(Tirado−Acevedo,Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii,PhD thesis,North Carolina State University,2010)などの突然変異した菌株のクラスターに由来してもよい。
これらの菌株は、クロストリジウムrRNAクラスターI内のサブクラスターを形成し、それらの16S rRNA遺伝子は、約30%の同様の低いGC含有量を有して99%を超えて同一である。しかしながら、DNA−DNA再会合及びDNAフィンガープリント実験は、これらの菌株が異なる種に属することを示した(国際公開第WO2008/028055号)。このクラスターの菌株は、同様の遺伝子型及び表現型の両方を有する共通の特徴によって定義され、それらは全て、同じエネルギー節約及び発酵代謝のモードを共有する。さらに、このクラスターの菌株は、シトクロムを欠いており、Rnf複合体を介してエネルギーを節約する。このクラスターの全ての種は、同様の形態及びサイズを有し(対数増殖細胞は、0.5〜0.7×3〜5μmである)、中温性であり(最適増殖温度は30〜37℃の間)、偏性嫌気性である(Abrini,Arch Microbiol,161:345−351,1994、Tanner,Int J Syst Bacteriol,43:232−236,1993、及び国際公開第WO2008/028055号)。さらに、それらは全て、同じpH範囲(pH4〜7.5、最適初期pHは5.5〜6)、同様の増殖率を有するCO含有ガス上の強力な独立栄養増殖、ならびに主な発酵最終生成物としてのエタノール及び酢酸、及びある特定の条件下で形成される少量の2,3‐ブタンジオール及び乳酸と同様の代謝プロファイルなど、同じ主要な系統発生的形質を共有する(Abrini,Arch Microbiol,161:345−351,1994、Kopke,Curr Opin Biotechnol,22:320−325,2011、Tanner,Int J Syst Bacteriol,43:232−236,1993、及び国際公開第WO2008/028055号)。インドール生成を3つ全ての種で同様に観察した。
しかしながら、種は、種々の糖(例えば、ラムノース、アラビノース)、酸(例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩)、アミノ酸(例えば、アルギニン、ヒスチジン)、または他の基質(例えば、べタイン、ブタノール)の基質利用が異なった。さらに、特定のビタミン(例えば、チアミン、ビオチン)に栄養要求性である種と、そうではない種があることがわかった。ガス取り込みに関与するウッド・ユングダール経路遺伝子の組織及び数は、酢酸及びアミノ酸配列の差に関わらず、全ての種で同じであることが分かっている(Kopke,Curr Opin Biotechnol,22:320−325,2011)。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの微生物の範囲内で示されている(Perez,Biotechnol Bioeng,110:1066−1077,2012)。したがって、これらの形質は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイなどの1つの微生物に特有なのではなく、むしろカルボキシド栄養性、エタノール合成クロストリジウムに対して一般的な形質であり、性能の差がある可能性はあるが、機構がこれらの菌株にわたって同様に作用することが予想され得る。
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、かつアセチル−CoAならびに酢酸塩などのアセチル−CoA由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である(Ragsdale,Biochim Biophys Acta,1784:1873−1898,2008)。好ましい実施形態では、本発明の細菌は、アセトゲンである。
本発明は、COを含む基質の存在下で本発明の細菌を培養することを含み、それにより細菌が生成物を生成する、生成物を生成する方法をさらに提供する。
用語「基質」は、本発明の細菌のための炭素及び/またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、一酸化炭素(CO)を含むガス状基質である。基質は、体積で約20%〜100%、20%〜70%、30%〜60%、または40%〜55%のCOなど、大きな割合のCOを含んでもよい。特定の実施形態では、基質は、体積で約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、または60%のCOを含む。本発明の細菌は概して、基質中のCOの少なくとも一部分を生成物に変換する。
基質が水素(H)を含有する必要はないが、Hの存在は、生成物形成に有害であるはずはなく、改善した全体的効率をもたらし得る。例えば、特定の実施形態では、基質は、2:1、1:1、または1:2のH:COのおよその比率を含んでもよい。一実施形態では、基質は、体積で約30%、20%、15%、または10%未満のHを含む。他の実施形態では、基質は、低濃度のH、例えば、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満のHを含む。さらなる実施形態では、基質は、Hを実質的に含有しない。
基質はまた、二酸化炭素(CO)、例えば、体積で約1%〜80%または1%〜30%のCOを含有してもよい。一実施形態では、基質は、体積で約20%未満のCOを含む。さらなる実施形態では、基質は、体積で約15%、10%、または5%未満のCOを含む。別の実施形態では、基質は、COを実質的に含有しない。
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置(Hensirisak,Appl Biochem Biotechnol,101:211−227,2002)を使用して、CO含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
基質は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副生成物として得られる、または何らかの他の源からの排ガスであってもよい。ある特定の実施形態では、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、CO含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。COは、合成ガス、すなわち、一酸化炭素及び水素を含むガスの一成分であってもよい。産業プロセスから生成されるCOは通常、燃焼処理されてCOを生成し、したがって、本発明は、CO温室効果ガス排出を低減することにおいて特定の有用性を有する。基質の組成は、反応の効率及び/または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素(O)の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、またはろ過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去する、及び/または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
本発明の細菌は、1つ以上の生成物を生成するために培養されてもよい。概して、本発明の細菌は、エタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートからなる群から選択される1つ以上などの生成物を生成する。本発明の細菌はまた、アセト乳酸塩またはリンゴ酸アセトインなどの他の生成物も生成し得る。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して増加した量のエタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの1つ以上を生成する。例えば、本発明の細菌は、本発明の細菌が由来する親細菌と比較して約1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、または500%多い1つ以上の生成物を生成し得る。生成物生成のこの増加は、少なくとも部分的に、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異によるものである可能性があり、それは、乳酸塩の生成から離れて、他の生成物の生成に向かって炭素及びエネルギーを転用する。
用語「主生成物」は、最高の濃度及び/または収率で生成される単一の生成物を指す。一実施形態では、主生成物は、エタノールまたは2,3−ブタンジオールである。
加えて、1つ以上の生成物の生成を1つ以上の他の生成物よりも選好するように、本発明の細菌を操作することが可能である。例えば、ピルビン酸塩の乳酸塩への変換を妨害することは、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの生成よりも2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、及び2−オキソグルタレート(oxogluterate)の生成を選好し得る。
本明細書において、生成物(例えば、クエン酸塩)の記述は、生成物の塩(例えば、クエン酸塩)及び酸(例えば、クエン酸)両方の形態を含む。多くの場合、生成物の塩及び酸形態の混合物は、ブロスのpHに応じて変化する比率で発酵ブロス中に存在する。さらなる例として、用語「酢酸塩」は、酢酸塩及び酢酸を包含し、用語「ギ酸塩」は、ギ酸塩及びギ酸を包含し、用語「リンゴ酸塩」は、リンゴ酸塩及びリンゴ酸を包含し、かつ用語「乳酸塩」は、乳酸塩及び乳酸を包含する。
文脈上別段の解釈が要求される場合を除いて、1つ以上の異性体(例えば、D、L、メソ、S、R、シス、またはトランス形態)で存在する本明細書の任意の化合物への言及は、概して、化合物の任意の1つ以上のそのような異性体を包含すると解釈されるべきである。例えば、「乳酸塩」への言及は、概して、乳酸塩のD及びL異性体の両方を包含する。
典型的には、培養はバイオリアクタ内で実施される。用語「バイオリアクタ」は、連続撹拌槽反応器(CSTR)、固定化細胞反応器(ICR)、トリクルベッド反応器(TBR)、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの1つ以上の容器、塔、または配管からなる培養/発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第1の増殖反応器及び第2の培養/発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの1つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「培養」及び「発酵」は、同じ意味で使用される。これらの用語は、培養/発酵プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。
培養物は概して、細菌の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び/または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第5,173,429号、米国特許第5,593,886号、及び国際公開第WO2002/008438号に記載される。
培養/発酵は、望ましくは、標的生成物の生成のための適切な条件下で実施されるべきである。考慮すべき反応条件は、圧力(またはCOの分圧)、温度、ガス流速、液体流速、培地pH、培地酸化還元電位、撹拌速度(連続撹拌槽反応器を使用する場合)、接種レベル、液相中のCOが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、CO含有基質の導入速度は、生成物がCO制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のCOの濃度が制限的にならないことを確実にするために制御されてもよい。
発酵プロセスと関連して使用される場合、用語「効率を増加させること」、「増加した効率」などは、発酵を触媒する微生物の増殖速度、増殖及び/または生成物生成速度、消費される基質の体積当たり生成される所望の生成物(アルコールなど)の体積、所望の生成物の生成速度または生成レベル、及び発酵の他の副生成物と比較した生成される所望の生成物の相対的比率のうちの1つ以上を増加させることを含むがこれらに限定されない。
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのCO物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養/発酵を実施することが好ましい。また、所与のCO変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、及びその結果として培養/発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。米国特許第5,593,886号における例によると、反応器体積は、反応器動作圧力の増加に線形比例して低減され得る。つまり、10気圧の圧力で動作するバイオリアクタは、1気圧の圧力で動作するバイオリアクタの10分の1の体積である必要しかない。加えて、国際公開第WO2002/008438号は、それぞれ150g/L/日及び369g/L/日のエタノール生産性をもたらす、30psig及び75psigの圧力下で実施されるガス−エタノール発酵を記載する。対照的に、大気圧で同様の培地及び入力ガス組成を使用して実施される発酵は、1日、1リットル当たり10〜20倍少ないエタノールを生成することがわかった。
本発明の方法は、1つ以上の生成物を回収または精製することをさらに含んでもよい。例えば、エタノールまたはエタノール及び/もしくは他の生成物を含油する混合アルコール流は、部分蒸留、蒸発、パーベーパレーション、または抽出発酵(例えば、液液抽出)を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって発酵ブロスから回収されてもよい。酢酸塩または酸などの副生成物はまた、活性炭吸着システム電気透析、または連続ガスストリッピングを含む、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。一実施形態では、生成物は、連続的にバイオリアクタからブロスの一部分を除去し、(便利にろ過によって)ブロスから微生物細胞を分離し、ブロスから生成物を回収することによって、発酵ブロスから回収されてもよい。分離した微生物細胞は、バイオリアクタに戻されてもよい。加えて、無細胞透過物もまた、任意にビタミンBなどの栄養素の補充を伴い、生成物が除去された後にバイオリアクタに戻されてもよい。
コハク酸塩は、例えば、酸性化、イオン交換クロマトグラフィと併せた電気透析(Song,Enzyme Microb Technol,39:352−361,2006)、ろ過及び硫酸の添加と併せたCa(OH)での沈殿(Lee,Appl Microbiol Biotechnol,79:11−22,2008)、またはトリ−n−オクチルアミンなどのアミン系抽出剤を用いた反応抽出(Huhet,Proc Biochem 41:1461−1465,2006)を使用して、発酵ブロスから回収され得る。全ての方法に対して、塩ではなく遊離酸形態を有することが極めて重要である。しかしながら、コハク酸のためのほとんどのバイオテクノロジー生成プロセスは、6〜7の中性またはわずかに酸性のpHで動作する。コハク酸のpKa(pKa=4.16及び5.61)を所与として、コハク酸の大部分は、これらの条件下で遊離酸としてではなく塩として存在する。しかしながら、C.オートエタノゲナム及び他のカルボキシド栄養性アセトゲンは、望ましくは4〜6の低いpHで耐性を有し、かつ増殖することが既知である。
バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの分枝鎖アミノ酸は、バイオマスの濃縮(例えば、逆浸透を介した)、結晶化、もしくは除去(例えば、限外ろ過もしくは遠心分離)、またはイオン交換クロマトグラフィ(Ikeda,Microbial Production of L−Amino Acids,1−35,2003)を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。
2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、及び他の生成物は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。例えば、低濃度の2,3−ブタンジオールは、選択的イオン透過膜にわたる好適な電位の印加を伴う、電気透析などの膜技術を使用して回収されてもよい。他の好適な技術は、一価イオンが圧力下で膜を選択的に通過するナノろ過を含む。
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
本実施例は、一般的な材料及び方法を記載する。
オートエタノゲナムDSM10061及びDSM23693(DSM10061の誘導体ならびにC.リュングダリイDSM13528は、DSMZ(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstrase 7 B,38124 Braunschweig,Germany)から供給された。C.ラグスダレイATCC BAA−622は、ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA 20108,USA)から供給された。大腸菌DH5αは、Invitrogen (Carlsbad,CA 92008,USA)から供給された。
大腸菌を、LB(Luria−Bertani)培地中で、37℃で好気増殖させた。固体培地は、1.5%寒天を含有した。
クロストリジウム菌株を標準的な嫌気性技術(Hungate,Methods Microbiol,3B:117−132,1969、Wolfe,Adv Microbiol Physiol,6:107−146,1971)を使用して、pH5.6でPETC培地中で37℃において増殖させた。フルクトース(従属栄養増殖)またはヘッドスペース(独立栄養増殖)内の30psiのCO含有製鉄ガス(New Zealand Steel site(Glenbrook,NZ)から回収。組成:44% CO、32% N、22% CO、2% H)を基質として使用した。固体培地に対して、1.2%バクトアガー(BD,Franklin Lakes,NJ 07417,USA)を添加した。
唯一のエネルギー及び炭素源としてCO含有製鉄ガスを使用して、37℃において1.5Lバイオリアクタ内で、C.オートエタノゲナムDSM23693を用いた発酵を実施した。MgCl、CaCl(0.5mM)、KCl(2mM)、HPO(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)を含有する定義された培地を調製した。培地をバイオリアクタ内に移し、45分間121℃で加熱滅菌した。加熱滅菌後、培地をチアミン、パントテン酸塩(0.05mg/L)、及びビオチン(0.02mg/L)で補充し、3mMのシステイン−HClで還元した。嫌気性条件を達成するために、反応を0.2μmのフィルタを通して窒素を注入した。接種前、ガスをCO含有製鉄ガスに切り替え、反応器に連続的に供給した。ガス流量を最初に80mL/分で設定し、中間指数増殖期中に200mL/分に増加させたと同時に、撹拌を200rpmから350rpmに増加させた。NaSを0.25mL/時でバイオリアクタ内に添加した。いったんOD600が0.5に達すると、バイオリアクタを1.0mL/分の速度の連続モードに切り替えた(希釈率0.96d−1)。試料を採取して、バイオマス及び代謝産物を測定した。加えて、流入及び流出ガスのヘッドスペース分析を定期的に実施した。
2つの取り付けられたチャネルを備えたVarian CP−4900マイクロGC上で、ヘッドスペースのガス組成を測定した。チャネル1が、70℃、200kPaのアルゴン、及び4.2秒のバックフラッシュ時間で動作する10m Mol−sieveカラムであった一方で、チャネル2は、90℃、150kPaのヘリウムで、かつバックフラッシュなしで動作する10m PPQカラムであった。両方のチャネルに対する注入器温度は、70℃であった。実行時間を120秒に設定したが、全ての対照のピークは、通常100秒前に溶出する。
35℃で動作するRID(示差屈折率検出器)及び60℃で保持されたAlltech IOA−2000有機酸カラム(150×6.5mm、粒径5μm)を備えた、Agilent 1100 Series HPLCシステムを使用して、代謝最終産物のHPLC分析を実施した。微酸性水を0.7mL/分の流速での移動相として使用した(0.005M HSO)。タンパク質及び他の細胞残渣を除去するために、400μLの試料を100μLの2%(w/v)5−スルホサリチル酸と混合し、3分間14,000×gで遠心分離して、沈殿残渣を分離した。次いで、10μLの上清を分析のためにHPLC内に注入した。
Supelco PDMS 100 1cmファイバ、Alltech EC−1000(30m×0.25mm×0.25μm)カラム、及び水素炎イオン化検出器(FID)を備えた、Agilent 6890NヘッドスペースGCを使用して、代謝最終産物のGC分析を実施した。5mLの試料をHungate管に移し、水槽内で40℃まで加熱し、正確に5分間ファイバに曝露した。注入器を250℃で保持し、1mL/分の一定流量をキャリヤガスとして使用した。オーブンプログラムは、5分間で40℃、続いて最大で200℃まで10℃/分の増加であった。次いで、温度を50℃/分の速度で40℃まで低下させ、最後に1分間保持する前に、温度を50℃/分の速度で220℃までさらに上げ、続いて、この温度で5分間保持した。40mL/分の水素、450mL/分の空気、及び15mL/分の窒素を補給ガスとして使用して、FIDを250℃で保持した。
完全な形質転換の実験中、標準的な嫌気性技術(Hungate,Methods Microbiol,3B:117−132,1969、Wolfe,Adv Microbiol Physiol,6:107−146,1971)を使用して、37℃において、還元剤の存在下で、かつ30psiの製鉄排ガス(New Zealand Steel site(Glenbrook,NZ)から回収。組成:44% CO、32% N、22% CO、2% H)を用いて、YTF培地中でC.オートエタノゲナムDSM23693を増殖させた。
コンピテント細胞を作るために、C.オートエタノゲナムDSM23693の50mLの培養物を5日間連続、新鮮なYTF培地に継代培養した。これらの細胞を使用して、0.05のOD600nmで、40mM DL−トレオニンを含有する50mLのYTF培地に接種した。培養物が0.5のOD600nmに達したとき、細胞を30分間氷上でインキュベートし、次いで、嫌気性チャンバに移し、4,700×g及び4℃で採取した。培養物を氷のように冷たいエレクトロポレーション緩衝液(270mMスクロース、1mM MgCl、7mMリン酸ナトリウム、pH7.4)で2回洗浄し、最終的に600μLの新鮮なエレクトロポレーション緩衝液の体積中で懸濁させた。この混合物を、2μgのメチル化プラスミド混合物及び1μLのタイプIの制限阻害剤(Epicentre Biotechnologies)を含有する0.4cmの電極ギャップを有する予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移し、すぐに以下の設定、2.5kV、600Ω、及び25μFを有するGene pulser Xcellエレクトロポレーションシステム(Bio−Rad)を使用してパルス供給した。3.7〜4.0msの時定数を達成した。培養物を5mLの新鮮なYTF培地に移した。管保持具を備えたSpectronic Helios Epsilon Spectrophotometer(Thermo)を使用して、600nmの波長で細胞の再生を監視した。バイオマスの初期の低下後、細胞は再び増殖し始めた。いったんバイオマスがその点から二倍になると、約200μLの培養物を5g/Lのフルクトースを含有するYTF寒天プレート及びPETC寒天プレート(両方とも1.2%バクトアガー及び15μg/mLのチアンフェニコールを含有する)上に広げた。3〜4日間の37℃での30psiの製鉄ガスを用いたインキュベーションの後、1プレート当たり500コロニーが明確に視認できた。
C.オートエタノゲナム:6つのクローン及びDNA転移の識別を検証するために、PURELINK(商標)Genomic DNAミニキット(Invitrogen)を製造業者の使用説明書に従って使用して、ゲノムDNAをPETC液体培地中で6つ全てのコロニー/クローンから単離した。野生型オートエタノゲナムDSM23693のDNAと一緒にこれらのゲノムDNAを、PCRにおけるテンプレートとして使用した。iproof High Fidelity DNA Polymerase(Bio−Rad Labratories)、以下の実施例に記載される特異的プライマー、ならびに以下のプログラム、最終伸長ステップ(7分間72℃)の前に2分間98℃での初期変性、続いて、25回の変性サイクル(10秒間98℃)、アニーリング(15秒間61℃)、及び伸長(90秒間72℃)を用いて、PCRを実施した。野生型C.オートエタノゲナムDSM23693からのゲノムDNAを、対照PCRにおけるテンプレートとして使用した。
クローンの識別を確認するために、プライマーfD1(配列番号10)及びrP2(配列番号11)を使用して、かつ上記のPCR条件を使用して、PCRを16s rRNAに対しても実施した。PCR産物をZymo CLEAN AND CONCENTRATOR(商標)キットを使用して精製し、プライマーrP2を使用して配列した。
実施例2
本実施例は、乳酸脱水素酵素活性を排除するC.オートエタノゲナムの遺伝子修飾を実証する。
C.オートエタノゲナムの識別された(Kopke,Appl Environ Microbiol,77:5467−5475,2011)乳酸脱水素酵素(AEI90736.1)遺伝子ldh(HQ876025.1)の不活性化の実証は、2つの方法、相同組換え及びClosTronを使用することによって実証した。
相同組換え:乳酸塩をもはや生成することができないC.オートエタノゲナム菌株を作るために、ノックアウト構築物を二重相同組換えによってldhを妨害するように設計した。ldh遺伝子に隣接した約1kbの相同アーム(配列番号1〜2)をpMTL85151プラスミド(図1)及び得られるプラスミドpMTL85151−ldh−ko(配列番号3)にクローン化した。標準的な組換えDNA及びクローン化技術は、当該技術分野において既知である(Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001、Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology.Wiley,1987)。InvitrogenからのPurelink Genomic DNAミニキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、C.オートエタノゲナムDSM23693からのゲノムDNAを単離した。
上記または国際公開第WO2012/053905号に記載されるように、DNAを導入するための形質転換を実施した。
選択後、コロニーを、単一クロスオーバー統合(図2A)に対して、次いで二重クロスオーバー突然変異(図2B)に対してスクリーニングした。A3’クロスオーバー事象がクローン6において見られ(図2A)、ldh遺伝子のノックアウトが外側フランキングプライマーを用いてスクリーニングしたときに観察された(図2B)。二重クロスオーバー乳酸脱水素酵素欠失の識別のために、オリゴヌクレオチドOg21f(配列番号4)、Og24r(配列番号5)、Og35f(配列番号6、及びOg36r(配列番号7)を使用した。
同じ戦略及びプラスミドが、C.リュングダリイまたはC.ラグスダレイにおいても使用され得る。形質転換プロトコルは、当該技術分野において記載されてきた(国際公開第WO2012/053905号 Leang,Applied Environ Microbiol,79:1102−1109,2013)。
ClosTron:ClosTron(Heap,J Microbiol Methods,70:452−464,2007)、ClosTronウェブサイトをホストとしたイントロン設計ツールを使用して、344bp標的領域129s(配列番号8)を設計し、標的部位(配列番号9)を識別した。DNA2.0(Menlo Park)によるレトロトランスポジション活性化ermBマーカー(RAM)を含有するベクターpMTL007C−E2において、標的領域を化学合成した(配列番号12)。
国際公開第WO2012/053905号に記載されるように、ベクターをC.オートエタノゲナムに導入した。15μg/mLのチアンフェニコールを有するPETC MES上で増殖した単一コロニーを、5μg/mLのクラロスロマイシンを有するPETC MES上でストリ−クした。各標的からのコロニーを無作為に選択し、フランキングプライマー155F(配列番号4)及び939R(配列番号5)を使用した挿入に対してスクリーニングした。iNtron Maxime PCRプレミックスを使用して、増幅を実施した。100bpのPCR産物が野生型遺伝子を示す一方で、約1.9kbの産物サイズは、標的部位におけるグループIIイントロンの挿入を示唆する(図3)。プラスミドの損失を、耐性マーカー(catP)の増幅及びグラム陽性複製起点(pCB102)によって検査した(図4)。
同じ戦略及びプラスミドが、C.リュングダリイまたはC.ラグスダレイにおいても使用され得る。形質転換プロトコルは、当該技術分野において記載されてきた(国際公開第WO2012/053905号、Leang,Appl Environ Microbiol,79:1102−1109,2013)。
実施例3
本実施例は、未修飾C.オートエタノゲナムと不活性化乳酸脱水素酵素を有するC.オートエタノゲナムの生成物プロファイルを比較する増殖実験を記載する。
C.オートエタノゲナム及び不活性化乳酸脱水素酵素を有するC.オートエタノゲナム及び菌株を、血清ボトル中の10g/LのMES緩衝液を有するPETC培地中で増殖させた。接種材料は培地体積の10%であり、培地の体積は10mLであった。培養物に製鋼オフガス(44% CO、22% CO、2% H、32% N)30psiを供給し、37℃でインキュベートした。培地のpHは5.7であった。
増殖期中、試料をOD600の測定のために、かつHPLCによる分析のために採取した。瓶に30psi製鉄ガスを毎日供給した。実験を3系列で実施した。
未修飾C.オートエタノゲナ菌株が6日間の増殖後に0.263±0.041g/Lの乳酸塩を生成した一方で(図5A)、不活性化乳酸脱水素酵素を有するC.オートエタノゲナム菌株は、6日間の増殖後に乳酸塩を生成しなかった(図5B)。加えて、不活性化乳酸脱水素酵素を有するC.オートエタノゲナム菌株は、増加した量の酢酸塩、エタノール、及び2,3−ブタンジオールを生成した。その他の点では、2つの菌株は、同様の増殖プロファイルを有し、それぞれ2.69及び2.365の同様のOD600nmに達した。
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
本発明の記載との関連で(特に、以下の特許請求の範囲との関連で)、用語「a」及び「an」及び「the」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、及び「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語(すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する)と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語(例えば、「など」)の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈するべきではない。
本発明を実施するための本発明者らに既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物及び均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。

Claims (13)

  1. 乳酸脱水素酵素(LDH)中に妨害突然変異を含む、遺伝子組み換えカルボキシド栄養性酢酸生成細菌であって、前記細菌は、親細菌と比較して増加した量の生成物を生成し、前記生成物は、エタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの1つ以上であり、前記親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイからなる群より選択される、前記細菌。
  2. 前記突然変異は、前記酵素の発現または活性を低減または排除する、請求項1に記載の前記細菌。
  3. 前記細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、請求項1に記載の前記細菌。
  4. 前記細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない、請求項1に記載の前記細菌。
  5. 前記酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する、請求項1に記載の前記細菌。
  6. 前記親細菌は、DSMZ受託番号DSM23693下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項に記載の前記細菌。
  7. COを含む基質の存在下で請求項1に記載の前記細菌を培養することを含む、生成物を生成する方法であって、前記生成物は、エタノール、2,3−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、2−オキソグルタレート(oxogluterate)、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの1つ以上を含む、前記方法
  8. 前記突然変異は、前記酵素の発現または活性を低減または排除する、請求項に記載の前記方法。
  9. 前記細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、請求項に記載の前記方法。
  10. 前記細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない、請求項に記載の前記方法。
  11. 前記細菌は、親細菌と比較して増加した量の前記生成物を生成する、請求項に記載の前記方法。
  12. 前記酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する、請求項に記載の前記方法。
  13. 前記親細菌は、DSMZ受託番号DSM23693下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項に記載の前記方法。
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