BR112016017092B1 - Método para produzir um produto selecionado do grupo consistindo de etanol, 2,3-butanodiol e ácido acético - Google Patents
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Abstract
BACTÉRIA ACETOGÊNICA CARBOXIDOTRÓFICA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO. A presente invenção se refere a uma bactéria acetogênica carboxidotrófica que compreende uma mutação disruptiva em uma enzima de via de biossíntese de lactato e a um método para produzir um produto cultivando-se a bactéria na presença de um substrato que compreende monóxido de carbono. De preferência, a enzima de via de biossíntese de lactato é lactato desidrogenase (LDH) ou outra enzima que converte piruvato em lactato, em que a mutação disruptiva reduz ou elimina a expressão ou atividade da enzima, de modo que a bactéria produza uma quantidade reduzida de lactato ou nenhum lactato.
Description
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório no 61/933.815, depositado em 30 de janeiro de 2014, e do Pedido de Patente Provisório no 61/944.541, depositado em 25 de fevereiro de 2014, cujos conteúdos são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0002] O presente pedido inclui uma listagem de sequências de nucleotídeo/aminoácido concomitante com o presente documento e identificada de acordo com o seguinte: arquivo (texto) ASCII de 23.322 bytes nomeado “LT102WOl_ST25.txt”, criado em 29 de janeiro de 2015 cuja totalidade é incorporada ao presente documento a título de referência.
[0003] Um acetogênio é um micro-organismo que gera ou que tem capacidade para gerar acetato como um produto de respiração anaeróbica. Tipicamente, os acetogênios são bactérias obliquamente anaeróbicas que usam a via de Wood-Ljungdahl como o principal mecanismo das mesmas para conservação de energia e para síntese de acetil-CoA e de produtos derivados de acetil-CoA, tais como, acetato e etanol (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873 a 1898, 2008).
[0004] Muitos acetogênios produzem naturalmente pelo menos dois ou mais produtos. No entanto, isso não é necessariamente desejável em uma venda comercial, visto que a produção de múltiplos produtos é prejudicial à eficiência e rendimento de cada produto individual. Particularmente, subprodutos podem desviar carbono na direção contrária às vias biossintéticas de um produto-alvo, podem apresentar preocupação de toxicidade, podem impedir a recuperação e a separação de um produto-alvo, podem complicar o controle de condições de fermentação que favorecem um produto-alvo e podem servir como um substrato para contaminar micro-organismos.
[005] Por exemplo, acetogênios, tais como, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467 a 5475, 2011) e o Butyribacterium metilotrophicum (Heiskanen, enzima Microb Technol, 41 362 a 367, 2007) podem produzir lactato com um subproduto. Essa produção de lactato reduz a eficiência e rendimento de produtos-alvo, tais como, etanol, butanol ou 2,3- butanodiol. Adicionalmente, o lactato pode ser tóxico aos acetogênios, tais como, Clostridium autoethanogenumaté mesmo em baixas concentrações (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467 a 5475, 2011) e pode servir como um substrato para outras bactérias, o que aumenta a probabilidade de contaminação bacteriana quando o lactato é produzido. Além disso, a separação do lactato de outros produtos, tais como, etanol, pode exigir etapas de processamento inconvenientes.
[006] Consequentemente, há uma forte necessidade de microorganismos e de métodos que reduzam ou eliminam a produção de subprodutos, tais como, lactato.
[007] A invenção fornece uma bactéria acetogênica carboxidotrófica que compreende uma mutação disruptiva em uma enzima de via de biossíntese de lactato. Em uma modalidade, a mutação disruptiva reduz ou elimina a expressão ou atividade da enzima de via de biossíntese de lactato.
[008] A mutação disruptiva afeta a capacidade da bactéria para produzir lactato. Em uma modalidade, a bactéria da invenção produz uma quantidade reduzida de lactato em comparação a uma bactéria parental. Em uma modalidade, a bactéria da invenção produz substancialmente nenhum lactato.
[009] A bactéria da invenção pode produzir produtos, tais como, um ou mais dentre etanol, 2,3-butanodiol, formato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, malato, fumarato, 2-oxogluterato, citrato e citramalato. Em uma modalidade, a bactéria da invenção produz uma quantidade aumentada de um ou mais dentre etanol, 2,3-butanodiol, formato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, malato, fumarato, 2-oxogluterato, citrato, e citramalato em comparação a uma bactéria parental.
[0010] Em uma modalidade, a enzima de via de biossíntese de lactato é uma enzima que converte nativamente o piruvato em lactato. Em uma modalidade preferencial, a enzima de via de biossíntese de lactato é lactato desidrogenase (LDH).
[0011] A bactéria da invenção pode ser derivada de uma a bactéria parental, tal como, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade preferencial, a bactéria parental é Clostridium autoethanogenum depositada sobre o número de acesso de DSMZ DSM23693.
[0012] A invenção fornece adicionalmente um método para produzir um produto que compreende cultivar a bactéria da invenção na presença de um substrato que compreende CO através do qual a bactéria produz um produto.
[0013] A Figura 1 é um diagrama que mostra uma estratégia de knockout de LDH e os iniciadores usados para triagem.
[0014] A Figura 2 é um conjunto de imagens de gel. A primeira imagem de gel mostra a triagem para uma única integração de cruzamento de plasmídeo de knockout com o uso dos iniciadores Og24r/Og35f para cruzamento 5’ e Og21f/Og36r para cruzamento 3’ em um clone do tipo selvagem (w) e transconjugante 6 (6). A segunda imagem de gel mostra a triagem para cruzamento dupla com o uso de outros iniciadores de flanqueamento Og35f/ Og36r e Og21f/Og24r.
[0015] A Figura 3 é uma imagem de gel que mostra PCR de colônia para a ID de Gene: 126803 Alvo 129S com o uso dos iniciadores LdhAF/R. Um produto de PCR de 100 bp indicou um genótipo do tipo selvagem, enquanto um tamanho de produto de aproximadamente 1,9 kb confirmou a inserção do íntron de grupo II no sítio-alvo.
[0016] A Figura 4 é uma imagem de gel que mostra perda de plasmídeo com os iniciadores CatPR/RepHF. A perda de plasmídeo foi verificada através de amplificação do marcador de resistência (catP) e pela origem de gram-positivo da replicação (pCB102).
[0017] A Figura 5A é um gráfico que mostra uma análise por HPLC de C. autoethanogenumapós 6 dias de crescimento em frascos de soro com gás efluente de usina siderúrgica a 0,21 MPa (30 psi) (44% de CO, 22% de Co2, 2% de H2, 32% de N2) como substrato. A Figura 5B é um gráfico que mostra uma análise por HPLC de C. autoethanogenum com lactato desidrogenase inativada após 6 dias de crescimento nos frascos de soro com gás efluente de usina siderúrgica a 0,21 MPa (30 psi) (44% de CO, 22% de CO2, 2% de H2, 32% de N2) como substrato.
[0018] Os inventores descobriram que a disrupção da via de biossíntese de lactato em uma bactéria acetogênica resulta em uma produção aumentada ou mais eficiente de produtos, tais como, etanol, 2,3-butanodiol, formato, succinato, 2-oxogluterato, valina, leucina e isoleucina, em comparação a um micro-organismo parental e pode resultar também na produção aumentada ou mais eficiente de piruvato, malato, fumarato e citrato, que são precursores de succinato, 2-oxogluterato, valina, leucina e isoleucina. A produção de valina, leucina, formato e piruvato também obvia a necessidade de complementar meios de cultura com esses compostos, o que pode resultar em economias de custos adicionais. Além disso, a redução ou a eliminação de produção lactato por uma bactéria reduz ou elimina os efeitos tóxicos ou de um lactato na bactéria.
[0019] A invenção fornece uma bactéria acetogênica carboxidotrófica que compreende uma mutação disruptiva em uma enzima de via de biossíntese de lactato.
[0020] “Mutação” se refere a uma modificação em um ácido nucleico ou uma proteína na bactéria da invenção em comparação ao micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual a bactéria da invenção é derivada. O termo “modificação genética” abrange o termo “mutação”. Em uma modalidade, a mutação pode ser uma deleção, inserção ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um gene que codifica uma enzima. Em outra modalidade, a mutação pode ser uma deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos em uma enzima.
[0021] Tipicamente, a mutação é uma “mutação disruptiva” que reduz ou elimina (isto é, “rompe”) a expressão ou a atividade de uma enzima de via de biossíntese de lactato. A mutação disruptiva pode inativa parcialmente, inativa completamente ou apagar uma enzima de via de biossíntese de lactato ou um gene que codifica a enzima. A mutação disruptiva pode ser uma mutação knockout (KO). A mutação disruptiva pode ser qualquer mutação que reduz, impede ou bloqueia a biossíntese de lactato. A mutação disruptiva pode incluir, por exemplo, uma mutação em um gene que codifica uma enzima de via de biossíntese de lactato, uma mutação em um elemento regulatório genético envolvido na expressão de um gene que codifica uma enzima de via de biossíntese de lactato, a introdução de um ácido nucleico que produz uma proteína que reduz ou inibe a atividade de uma enzima de via de biossíntese de lactato ou a introdução de um ácido nucleico (por exemplo, RNA antissenso, siRNA, CRISPR) ou uma proteína que inibe a expressão de uma enzima de via de biossíntese de lactato.
[0022] A mutação disruptiva resulta em uma bactéria da invenção que produz nenhum lactato ou substancialmente nenhum lactato ou uma quantidade reduzida de lactato em comparação à bactéria parental da qual a bactéria é derivada. Por exemplo, a bactéria da invenção pode produzir nenhum lactato ou pelo menos cerca de 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% a menos de lactato do que a bactéria parental. Por exemplo, a bactéria da invenção pode produzir menos que cerca de 0,001, 0,01, 0,10, 0,30, 0,50 ou 1,0 g/L de lactato. Em contrapartida, dependendo das condições de fermentação, a C. autoethanogenum LZ1561 não modificada pode produzir até cerca de 2 g/L de lactato. Outras cepas bacterianas não modificadas podem produzir ainda mais lactato.
[0023] A mutação disruptiva pode ser introduzida com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Os métodos exemplificativos incluem expressão de gene heterólogo, inserção ou deleção de gene ou de promotor, expressão ou inativação de gene alterado, engenharia de enzima, evolução direcionada, projeto com base em conhecimento, métodos de mutagênese aleatória, embaralhamento de gene e otimização de códon. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611 a 617, 2011; e Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010. A mutação disruptiva pode ser introduzida com o uso de ácidos nucleicos, tais como, DNA, RNA, cDNA de filamento único ou de filamento duplo ou combinações dos mesmos, conforme apropriado. Os ácidos nucleicos podem ser denominados de construtos ou vetores e podem incluir um ou mais elementos regulatórios, origens de replicação, sítios de multiclonagens e/ou marcadores selecionáveis. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode ser adaptado para romper um gene que codifica uma enzima de via de biossíntese de lactato em uma bactéria parental. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode ser adaptado para permitir que a expressão de um ou mais genes codificados pelo ácido nucleico. Os construtos ou vetores podem incluir plasmídeos (por exemplo, pMTL, pIMP, pJIR), vírus (incluindo bacteriófagos), cosmídeos e cromossomos artificiais. Os construtos podem permanecer extracromossomiais mediante a transformação de uma bactéria parental ou podem ser adaptados para integração ao genoma da bactéria. Consequentemente, os construtos podem incluir sequências de ácido nucleico adaptadas para auxiliar a integração (por exemplo, uma região que permite recombinação homóloga e integração alvejada ao genoma hospedeiro) ou expressão e a replicação de um construto extracromossomial (por exemplo, origem de replicação, promotor e outras sequências regulatórias).
[0024] Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos com o uso de recombinação homóloga. Tais ácidos nucleicos podem incluir braços homólogos a uma região dentro do gene a ser rompido (“braços homólogos”) ou que flanqueia o mesmo. Esses braços homólogos permitem a recombinação homóloga e a introdução, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos dentro do gene a ser rompido. Embora seja preferencial que os braços homólogos tenham 100% de complementaridade à região-alvo no genoma, não é necessário 100% de complementaridade desde que a sequência seja complementar o bastante para permitir uma recombinação-alvejada com a região-alvo no genoma. Tipicamente, os braços homólogos terão um nível de homologia que permitem a hibridização a uma região-alvo sob condições rigorosas (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). O conhecimento das sequências-alvo de ácido nucleico em uma bactéria parental (isto é, a sequência de um gene-alvo ou uma região-alvo em uma bactéria parental) é geralmente suficiente para projetar braços homólogos apropriados. Por exemplo, a fim de romper a LDH, os braços homólogos de flanqueamento descritos no presente documento podem ser usados (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 2. Na C. ljungdahlii, os braços homólogos podem ser projetados com base em GenBank CP001666.1. Para outras cepas, os braços homólogos podem ser projetados com base em outras informações de sequência de ácido nucleico publicamente disponíveis.
[0025] A “via de biossíntese de lactato” é uma via de reações que resultam na produção de lactato. Em uma modalidade, a via de biossíntese de lactato compreende um ou mais enzimas que convertem piruvato em lactato. Em uma modalidade, a via de biossíntese de lactato compreende uma enzima de lactato desidrogenase. Dependendo da bactéria, várias enzimas diferentes podem ser envolvidas na via de biossíntese de lactato. Quando uma bactéria compreende duas ou mais enzimas na via de biossíntese de lactato, por exemplo, duas ou mais enzimas com capacidade para converter piruvato em lactato, o rompimento de mais que uma enzima pode ter o efeito de aumentar a produção de um produto acima do nível que pode ser alcançado rompendo- se uma única enzima. Em uma modalidade, a bactéria compreende mutações disruptivas em duas, três, quatro, cinco ou mais enzimas com capacidade para converter piruvato em lactato. Embora o rompimento da expressão e/ou da atividade de tais enzimas possa fornecer alguma vantagem em termos de produção de produto, em geral, não é necessário romper a expressão e/ou atividade de tais enzimas a fim de obter os benefícios da presente invenção, a saber, a produção aumentada de um ou mais produtos-alvo ou principais.
[0026] Em uma modalidade, a enzima de via de biossíntese de lactato converte nativamente (isto é, de maneira endógena ou natural) piruvato em lactato, de modo que a enzima tenha atividade de lactato desidrogenase. A enzima pode ter funções catalíticas adicionais desde que também converta piruvato em lactato. Por exemplo, a enzima pode ser qualquer desidrogenase que tenha atividade de lactato desidrogenase. A introdução de uma mutação disruptiva à enzima que converte piruvato em lactato reduz ou elimina (isto é, “rompe”) a expressão ou a atividade dessa enzima.
[0027] Em uma modalidade preferencial, a enzima de via de biossíntese de lactato é lactato desidrogenase (LDH). A introdução de uma mutação disruptiva à LDH reduz ou elimina (isto é, “rompe”) a expressão ou atividade de LDH.
[0028] A bactéria da invenção pode compreender um ou mais outras modificações genéticas além de uma mutação disruptiva em uma enzima de via de biossíntese de lactato, incluindo modificações genéticas de um ou mais genes ou proteínas não associadas à via de biossíntese de lactato.
[0029] Em uma modalidade particular, a bactéria da invenção pode expressar um inibidor de uma enzima de via de biossíntese de lactato além ou vez de compreender uma mutação disruptiva em uma enzima de via de biossíntese de lactato.
[0030] A “enzima atividade” se refere amplamente à atividade enzimática, incluindo, porém sem limitação, a atividade de uma enzima, a quantidade de uma enzima ou a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. Consequentemente, “diminuir” ou “reduzir” a atividade de enzima inclui diminuir ou reduzir a atividade de uma enzima, a quantidade de uma enzima, ou a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. Uma enzima tem “capacidade para converter” um primeiro composto ou substrato em um segundo composto ou produto, caso possa catalisar uma reação na qual pelo menos a porção do primeiro composto seja convertida no segundo composto.
[0031] O termo “variantes” inclui ácidos nucleicos e proteínas cuja sequência varia da sequência de um ácido nucleico e proteína de referência, tal como, uma sequência de um ácido nucleico e proteína de referência revelada na técnica anterior ou exemplificada no presente documento. A invenção pode ser praticada com o uso de ácidos nucleicos ou proteínas variantes que realizam substancialmente a mesma função do ácido nucleico ou proteína de referência. Por exemplo, uma proteína variante pode realizar substancialmente a mesma função ou catalisar substancialmente a mesma reação de uma proteína de referência. Um gene variante pode codificar a mesma, ou substancialmente a mesma, proteína como um gene de referência. Um promotor variante pode ter substancialmente a mesma capacidade para promover a expressão de um ou mais genes como um promotor de referência.
[0032] Os ácidos nucleicos ou proteínas variantes com substancialmente o mesmo nível de atividade de um ácido nucleico ou proteína de referência pode denominado no presente documento de “variantes funcionalmente equivalentes”. A título de exemplos, as variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucleico podem incluir variantes alélicos, fragmentos de um gene, genes com mutação, polimorfismos e semelhantes. Os genes homólogos de outros micro-organismos também são exemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Os mesmos incluem genes homólogos em espécies, tais como, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii ou Clostridium ljungdahlii cujos detalhes são disponíveis publicamente em sites da web, tais como, Genbank ou NCBI. As variantes funcionalmente equivalentes incluem também ácidos nucleicos cuja sequência varia como um resultado de otimização de códon para um organismo particular. Uma variante funcionalmente equivalente de um ácido nucleico terá, de preferência, uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos aproximadamente 70%, 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% ou mais (homologia de porcentagem) com o ácido nucleico indicada. Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína terá, de preferência, pelo menos uma identidade de aminoácido de aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% ou mais (porcentagem em homologia) com a proteína indicada. A equivalência funcional de um ácido nucleico ou proteína variante pode ser avaliada com o uso de qualquer método conhecido na técnica.
[0033] No entanto, os ácidos nucleicos ou proteínas variantes podem ter também o nível reduzido de atividade em comparação a um ácido nucleico ou proteína de referência. Por exemplo, um ácido nucleico variante pode ter um nível reduzido de expressão ou uma enzima variante pode ter uma capacidade reduzida para catalisar uma reação particular em comparação a um ácido nucleico ou enzima indicado, respectivamente. Os ensaios e kits de enzima para avaliar a atividade de enzimas na via de biossíntese de lactato são conhecidos na técnica (Wang, J Bacteriol, 195: 4373 a 4386, 2013; Sigma- Aldrich (MAK066), Thermo (88953); Worthington Biochemical Corporation (LS002755)).
[0034] Os ácidos nucleicos podem ser entregues a uma bactéria da invenção com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser entregues como ácidos nucleicos purificados ou podem ser formados com um ou mais agentes (por exemplo, lipossomas). Os inibidores de restrição podem ser usados em determinadas modalidades (Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64: 412 a 434, 2000. A título de exemplo, a transformação (incluindo transdução ou transfecção) pode ser alcançada por eletroporação, ultrassonicação, transformação mediada por polietilenoglicol, competência química ou natural, transformação de protoplasto, indução de prófago, ou conjugação (consultar, por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). O uso de eletroporação foi relatado para diversos acetogênios carboxidotróficos, incluindo Clostridium ljungdahlii (Koepke, PNAS, 107: 13087 a 13092, 2010; WO/2012/053905), Clostridium autoethanogenum (WO/2012/053905), Clostridium aceticum (Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191 a 2198, 2012) e Acetobacterium woodii (Stratz, Appl Environ Microbiol, 60: 1033 a 1037, 1994. O uso de eletroporação também foi relatado em Clostridia, incluindo Clostridium acetobutylicum (Mermelstein, Biotechnol, 10: 190 a 195, 1992) e Clostridium cellulolyticum (Jennert, Microbiol, 146: 3071 a 3080, 2000. A indução de prófago foi demonstrada para acetogênios carboxidotróficos, incluindo Clostridium scatologenes (Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010) e uma conjugação foi descrita para muitas Clostridia, incluindo Clostridium difficile (Herbert, F EMS Microbiol Lett, 229: 103 a 110, 2003) e Clostridium acetobuylicum (Williams, J Gen Microbiol, 136: 819 a 826, 1990. Em determinadas modalidades que têm os sistemas de enzima de restrição ativo, pode ser necessário metilar um ácido nucleico antes da introdução do ácido nucleico na bactéria da invenção (WO 2012/105853).
[0035] O termo “recombinante” indica que um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo é o produto de modificação genética, mutação ou recombinação. De modo geral, o termo “recombinante” de refere a um ácido nucleico, a uma proteína ou a um micro-organismo que contém material genético derivado de múltiplas fontes, tais como, duas ou mais cepas ou espécies diferentes de micro-organismos ou é codificado pelo mesmo. Conforme usado no presente documento, o termo “recombinante” pode ser usado também para descrever um micro-organismo que compreende um ácido nucleico ou proteína com mutação, incluindo uma forma com mutação de um ácido nucleico ou proteína endógeno.
[0036] Uma “bactéria parental” é uma bactéria usada para gerar uma bactéria da invenção. A bactéria parental pode ser uma bactéria de ocorrência natural (isto é, uma bactéria do tipo selvagem) ou uma bactéria que foi modificada anteriormente (isto é, uma bactéria mutante ou recombinante). A bactéria da invenção pode ser modificada para expressar uma quantidade inferior de uma enzima em comparação à bactéria parental, ou a bactéria da invenção pode ser modificada não para expressar uma enzima que é expressa pela bactéria parental. Em uma modalidade, a bactéria parental é Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade preferencial, a bactéria parental é Clostridium autoethanogenum depositada sob o acesso de DSMZ DSM23693 (isto é, Clostridium autoethanogenum LZ1561).
[0037] O termo “derivado(a) de” indica que um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo é modificado ou adaptado a partir de um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo (por exemplo, parental ou do tipo selvagem), de modo a produzir um novo ácido nucleico, proteína ou microorganismo. Tais modificações ou adaptações incluem tipicamente, deleção, mutação ou substituição de ácidos nucleicos ou genes. De modo geral, a bactéria da invenção é derivada de uma bactéria parental. Em uma modalidade, a bactéria da invenção é derivada de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou de Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção é derivada de Clostridium autoethanogenum LZ1561, que é depositada sob o acesso de DSMZ DSM23693.
[0038] Em uma modalidade, a bactéria parental é selecionada a partir do grupo de bactérias acetogênicas carboxidotróficas que compreendem as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovate, Butyribacterium metilotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum e Thermoanaerobacter kiuvi. Essas bactérias acetogênicas carboxidotróficas são definidas pela capacidade de as mesmas crescerem quimoautotroficamente em fontes gasosas de um carbono, tais como, monóxido de carbono (CO) e dióxido de carbono (CO2), para usar monóxido de carbono (CO) e/ou hidrogênio (H2) como fontes de energia sob condições anaeróbicas e para produzir acetil-CoA, acetato e outros produtos. As mesmas compartilham o mesmo modo fermentação, a via de Wood-Ljungdahl ou acetil-CoA redutivo e são definidas pela presença do conjunto de enzimas que consiste em monóxido de carbono desidrogenase (CODH), hidrogenase, formato desidrogenase, formil-tetraidrofolato sintetase, metileno- tetraidrofolato desidrogenase, formil-tetraidrofolato cicloidrolase, metileno- tetraidrofolate redutase e monóxido de carbono desidrogenase/acetil-CoA sintase (CODH/ ACS), em que a combinação é uma característica exclusiva a esses tipos de bactérias (Drake, The Prokaryotes, 354 a 420, Springer, Nova Iorque, NY, 2006). Em contrapartida ao crescimento quimo-heterotrófico de bactérias de fermentação de açúcar que convertem um substrato em biomassa, em metabólitos secundários e em piruvato, a partir dos quais os produtos são formados diretamente ou por meio de acetil-CoA, os acetogênios canalizam um substrato diretamente no acetil-CoA, a partir do qual os produtos, a biomassa e os metabólitos secundários são formados.
[0039] Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção é derivada a partir de um micro-organismo parental que compreende um lactato desidrogenase, em que a bactéria da invenção compreende uma mutação disruptiva na lactato desidrogenase. Por exemplo, o micro-organismo parental pode ser C autoethanogenum que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende GenBank AEI90736.1 ou uma sequência de aminoácido que compreende GenBank CP006763.1, KEGG CAETHG_1147 ou GenBank HQ876025.1. O micro-organismo parental pode ser C. ljungdahlii que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende GenBank YP 003781368.1 ou uma sequência de aminoácido que compreende GenBank CP001666.1 ou KEGG CLJU_c32190. O microorganismo parental pode ser C. ragsdalei que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende GenBank AEI90737.1 ou uma sequência de aminoácido que compreende GenBank HQ876026.1. Outras bactérias parentais podem ter outras sequências de ácido nucleico e aminoácido.
[0040] Um “carboxidotrófico” é um micro-organismo com capacidade para tolerar uma alta concentração de monóxido de carbono (CO). Tipicamente, a bactéria da invenção é um carboxidotrófico.
[0041] A bactéria da invenção pode ser derivada do agrupamento de Clostridiacarboxidotrófica que compreende as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei e isolados relacionados, incluindo, porém sem limitação, cepas Clostridium autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345 a 351, 1994), Clostridium autoethanogenum LBS 1560 (DSM 19630) (WO 2009/064200), Clostridium autoethanogenum LZ1561 (DSM23693), Clostridium ljungdahlii PETCT (DSM 13528 = ATCC 55383) (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232 a 236, 1993), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (Patente no U.S. 5.593.886), Clostridium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) (Patente no U.S. 6.368.819), Clostridium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989) (Patente no U.S. 6.368.819), Clostridium ragsdalei PI IT (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), isolados relacionados, tais como, “Clostridium coskatii” (Publicação no U.S. 2011/0229947) ou cepas com mutação, tais como, Clostridium ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo, production of Bioetanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010).
[0042] Essas cepas formam um subagrupamento dentro do agrupamento de rRNA Clostridial I e seu gene de 16S rRNA é mais do que 99% idêntico a um baixo teor de GC semelhante de cerca de 30%. No entanto, a reassociação de DNA a DNA e experimentos de mapeamento genético de DNA mostraram que essas cepas pertencem a espécies distintas (WO 2008/028055). As cepas desse agrupamento são definidas pelas características comuns, em que têm tanto um genótipo quanto um fenótipo semelhante, e todas compartilham o mesmo modo de conservação de energia e metabolismo fermentativo. Além disso, as cepas desse agrupamento carecem de citocromos e conservam energia por meio de um complexo Rnf. Todas as espécies desse agrupamento têm uma morfologia e tamanho semelhantes (células de crescimento logarítmico estão entre 0,5 a 0,7 x 3 a 5 µm), são mesofílicas (temperatura de crescimento ideal entre 30 a 37 °C) e estritamente anaeróbicas (Abrini, Arch Microbiol, 161: páginas 345 a 351, 1994; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: páginas 232 a 236, 1993; e WO 2008/028055). Além disso, todas compartilham os mesmos traços filogenéticos, tais como, a mesma faixa de pH (pH 4 a 7,5, com um pH inicial ideal de 5,5 a 6), crescimento autotrófico intenso em gases que contêm CO com taxas de crescimento semelhantes e um perfil metabólico semelhante com etanol e ácido acético como produto final de fermentação principal e quantidades pequenas de 2,3-butanodiol e ácido lático formado sob determinadas condições (Abrini, Arch páginas 345 a 351, 1994; Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: páginas 345 a 351, 2011; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: páginas 232 a 236, 1993; e WO 2008/028055). A produção de indol foi observada com todas as três espécies também.
[0043] No entanto, as espécies diferenciam em utilização de substrato de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por exemplo, arginina, histidina) ou outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Ademais, constatou-se que algumas das espécies eram auxotróficas para determinadas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina) embora outras não tenham sido. Constatou-se que a organização e o número de genes de via de Wood-Ljungdahl, responsáveis pela absorção de gás, eram iguais em todas as espécies, apesar das diferenças em sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: páginas 320 a 325, 2011. Além disso a redução de ácidos carboxílicos em seus álcoois correspondentes foi mostrada em uma faixa desses micro-organismos (Perez, Biotechnol Bioeng, 110: páginas 1.066 a 1.077, 2012). Esses traços são, portanto, não específicos para um organismo como C autoethanogenum ou C ljungdahlii, porém, de preferência, traços gerais para Clostridiacarboxidotrófica que sintetiza etanol, e pode-se esperar que mecanismos funcionem semelhantemente através dessas cepas, embora possa haver diferenças no desempenho (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:
[0044] Um "acetogênio" é um micro-organismo que gera ou que tem capacidade para gerar acetato como um produto de respiração anaeróbica. Tipicamente, os acetogênios são bactérias obliquamente anaeróbicas que usam a via de Wood-Ljungdahl como o principal mecanismo das mesmas para conservação de energia e para síntese de acetil-CoA e de produtos derivados de acetil-CoA, tais como, acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1.784: 1.873 a 1.898, 2008). Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção é um acetogênio.
[0045] A invenção fornece adicionalmente um método para produzir um produto que compreende cultivar a bactéria da invenção na presença de um substrato que compreende CO através do qual a bactéria da invenção produz um produto.
[0046] O termo “substrato” se refere a uma fonte de carbono e/ou de energia para a bactéria da invenção. Tipicamente, o substrato é um substrato gasoso que compreende monóxido de carbono (CO). O substrato pode compreender uma proporção grande de CO, tal como, cerca de 20% a 100%), 20% a 70%, 30% a 60% ou 40% a 55% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou 60% de CO em volume. A bactéria da invenção converte, em geral, pelo menos uma porção do CO no substrato em um produto.
[0047] Embora não seja necessário que o substrato contenha qualquer hidrogênio (H2), a presença de H2 não deve ser prejudicial à formação de produto e pode resultar em eficiência geral aprimorada. Por exemplo, em modalidades particulares, o substrato pode compreender uma razão aproximada entre H2:CO de 2: 1, e 1: 1, ou 1:2 Em uma modalidade, o substrato compreende menos que cerca de 30%, 20%, 15 ou 10% de H2 em volume. Em outras modalidades, o substrato compreende baixas concentrações de H2, por exemplo, menos que 5%, menos que 4%, menos que 3%, menos que 2% ou menos que 1% de H2. Em modalidades adicionais, o substrato contém substancialmente nenhum H2.
[0048] O substrato também pode conter dióxido de carbono (CO2), por exemplo, cerca de 1% a 80% ou 1% a 30% CO2 em volume. Em uma modalidade, o substrato compreende menos que cerca de 20% de CO2 em volume. Nas modalidades adicionais, o substrato compreende menos que cerca de 15%, 10% ou 5% de CO2 em volume. Em outra modalidade, o substrato contém substancialmente nenhum CO2.
[0049] Embora o substrato seja tipicamente gasoso, o substrato pode ser fornecido também em formas alternativas. Por exemplo, o substrato pode ser dissolvido em um líquido saturado com um gás que contém CO com o uso de um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol, 101: 211 a 227, 2002. A título de exemplo adicional, o substrato pode ser absorvido em um suporte sólido.
[0050] O substrato pode ser um gás residual obtido como um subproduto de um processo industrial ou a partir de alguma outra fonte, tal como, a partir de vapores de escape de automóveis ou gaseificação de biomassa. Em determinadas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste na fabricação de produtos de metal ferroso, tais como, uma fabricação em usina siderúrgica, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinação de petróleo, gaseificação de carvão, produção de potência elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Nessas modalidades, o gás que contém carbono pode ser capturado a partir do processo industrial antes de ser emitido à atmosfera, com o uso de qualquer método conveniente. O CO pode ser um componente de gás de síntese, isto é, um gás que compreende monóxido de carbono e [hidrogênio. O CO produzido a partir de processos industriais é normalmente chamejado para produzir CO2, portanto, a invenção tem utilidade particular na redução de emissões de gás de efeito estufa de CO2. A composição do substrato pode ter um impacto significante na eficiência e/ou custo da reação. Por exemplo, a presença de oxigênio (O2) pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbico. Dependendo da composição do substrato, pode ser desejável tratar, limpar ou filtrar o substrato para remover quaisquer impurezas indesejada, tais como, toxinas, componentes indesejados ou partículas de pó e/ou aumenta a concentração de componentes desejáveis.
[0051] A bactéria da invenção pode ser cultivada para produzir um ou mais produtos. De modo geral, a bactéria da invenção produz um ou mais produtos selecionados a partir do grupo que consiste em etanol, 2,3- butanodiol, formato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, malato, fumarato, 2-oxogluterato, citrato e citramalato. A bactéria da invenção pode produzir também outros produtos, tais como, acetolactato ou malato de acetoína.
[0052] Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção produz uma quantidade aumentada de um ou mais dentre etanol, 2,3- butanodiol, formato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, malato, fumarato, 2-oxogluterato, citrato, e citramalato em comparação a uma bactéria parental. Por exemplo, a bactéria da invenção pode produzir cerca de 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500% ou mais de um ou mais produtos em comparação à bactéria parental da qual a bactéria da invenção é derivada. Esse aumento em produção de produto pode ser devido, pelo menos parcialmente, à mutação disruptiva na enzima de via de biossíntese de lactato, o que desvia carbono e energia na direção contrária à produção de lactato e em direção à produção de outros produtos.
[0053] O termo “produto principal” se refere ao único produto produzido na maior concentração e/ou rendimento. Em uma modalidade, o produto principal é etanol ou 2,3-butanodiol.
[0054] Adicionalmente, é possível modificar a bactéria da invenção a fim de favorecer a produção de um ou mais produtos sobe um ou mais outros produtos. Por exemplo, o rompimento da conversão de piruvato em lactato pode favorecer a produção de 2,3-butanodiol, formato, malato, fumarato, citrato, succinato e 2-oxogluterato sobre a produção de valina, leucina e isoleucina.
[0055] No presente documento, a recitação de um produto (por exemplo, citrato) incluiu tanto a forma de sal (por exemplo, citrato) quanto a forma de ácido (por exemplo, ácido cítrico) do produto. Muitas vezes, uma mistura das formas de sal e de ácido do produto estão presentes em um caldo de fermentação, em uma razão que varia dependendo do pH do caldo. Como exemplos adicionais, o termo “acetato” abrange acetato e ácido acético, o termo “formato” abrange formato e ácido fórmico, o termo “malato” abrange malato e ácido málico e o termo “lactato abrange lactato e ácido láctico.
[0056] A menos que o contexto declare o contrário, a referência a qualquer composto no presente documento que pode haver em uma ou mais formas isoméricas (por exemplo, formas D, L, meso, S, R, cis ou trans) devem ser interpretadas, em geral, como abrangentes de qualquer um ou mais desses isômeros do composto. Por exemplo, a referência a “lactato” abrange, em geral, ambos os isômeros D e L de lactato.
[0057] Tipicamente, a cultura é realizada em um biorreator. O termo “biorreator” inclui um dispositivo de cultura/fermentação que consiste em um ou mais vasos, torres ou disposições de encanamento, tais como, um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), reator com células imobilizadas (ICR), reator de leito gotejante (TBR), coluna de bolhas, fermentador do tipo gas lift, misturador estático ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contato gás-líquido. Em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de cultura/fermentação. O substrato pode ser fornecido a um ou a ambos esses reatores. Conforme usado no presente documento, os termos "culturas" e "fermentação" são usados de maneira intercambiável. Esses termos abrangem tanto a fase de crescimento quanto a fase de fase de biossíntese de produto do processo de cultura/fermentação.
[0058] A cultura é mantida, em geral, em um meio de cultura aquoso que contém nutrientes, vitaminas e/ou minerais suficientes para permitir o crescimento da bactéria. De preferência, o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Os meios adequados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na Patente no U.S. 5.173.429, na Patente no U.S. 5.593.886 e no documento no WO 2002/008438.
[0059] A cultura/fermentação deve ser realizada de maneira desejável sob as condições apropriadas para a produção do produto-alvo. As condições de reação a serem consideradas incluem pressão (ou pressão parcial de CO), temperatura, taxa de fluxo de gás, pH de meio, potencial de oxirredução de meio, taxa de agitação (caso seja usado um reator de tanque agitado contínuo), nível de inóculo concentrações de substrato de gás máximo a fim de garantir que o CO na fase líquida não se torne limitante e concentrações máximas de produto a fim de evitar a inibição. Em particular, a taxa de introdução do substrato que contém CO pode ser controlada para garantir que a concentração de CO na fase líquida não se torne limitante, visto que os produtos possam ser consumidos pela cultura sob condições limitadas por CO.
[0060] Os termos “que aumenta a eficiência”, “eficiência aumentada” e semelhantes, quando usados em relação a um processo de fermentação, incluem, porém sem limitação, aumentar um ou mais dentre a taxa de crescimento de micro-organismos que catalisam a fermentação, a taxa de crescimento e/ou de produção de produto, o volume de produto desejado (tal como, álcoois) produzido por volume de substrato consumido, a taxa de produção ou o nível de produção do produto desejado e a proporção relativo do produto desejado produzido em comparação a outros subprodutos da fermentação.
[0061] A operação de um biorreator em pressões elevadas permite uma taxa aumentada de transferência de massa de CO da fase gasosa para a fase líquida. Consequentemente, é geralmente preferencial realizar a cultura/fermentação em pressões maiores que a pressão atmosférica. Além disso, visto que uma dada taxa de conversão de CO é, parcialmente, uma função do tempo de retenção de substrato e que o tempo de retenção dita o volume exigido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir consideravelmente o volume do biorreator exigido, consequentemente, o custo de capital do equipamento de cultura/fermentação. De acordo com os exemplos na Patente U.S. no 5.593.886, o volume de reator pode ser reduzido em proporção linear aos aumentos na pressão de operação de reator. Em outras palavras, um biorreator operado a 1,01 MPa (10 atmosferas) de pressão precisa ser apenas um décimo do volume de um biorreator a 0,1 MPa (1 atmosfera) de pressão. Adicionalmente, o documento no WO 2002/08438 descreve fermentações de gás para etanol realizadas sob pressões de 3,04 MPa e 7,6 MPa (30 psig e 75 psig), o que fornece produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia, respectivamente. Em contrapartida, constatou-se que as fermentações realizadas com o uso de meios semelhantes e composições de gás de entrada à pressão atmosférica produzem entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.
[0062] O método da invenção pode compreender adicionalmente recuperar ou purificar um ou mais produtos. Por exemplo, o etanol ou uma corrente de álcool misturada que contém etanol e/ou outros produtos pode ser recuperado de um caldo de fermentação por qualquer método conhecido na técnica, incluindo destilação fracionária, evaporação, pervaporação ou fermentação extrativa (por exemplo, extração de líquido-líquido). Os subprodutos, tais como, acetato ou ácidos, podem ser também recuperados a partir de um caldo de fermentação com o uso de qualquer método conhecido na técnica, incluindo sistemas de absorção de carvão vegetal ativados, eletrodiálise ou arraste com gás contínuo. Em uma modalidade, um produto pode ser recuperado de um caldo de fermentação removendo-se continuamente uma porção do caldo do biorreator, separando-se células microbianas do caldo (convenientemente por filtração) e recuperando-se o produto do caldo. As células microbianas separadas podem ser retornadas ao biorreator. Adicionalmente, um permeado livre de células também pode ser retornado ao biorreator após o produto ter sido removido, opcionalmente com complementação de nutrientes, tais como, vitaminas B.
[0063] O succinato pode ser recuperado a partir de um caldo de fermentação com o uso de, por exemplo, acidificação, eletrodiálise acoplada à cromatografia de troca iônica (Song, Ezyme Microb Technol, 39: 352 a 361, 2006), precipitação com Ca(OH) acoplada à filtração e adição de ácido sulfúrico (Lee, Appl Microbiol Biotechnol, 79: 11 a 22, 2008), ou extração reativa com extratantes à base de amina, tais como, tri-n-octilamina (Huhet, Proc Biochem 41: 1461 a 1465, 2006. Para todos os métodos, é crucial ter a forma de ácido livre, não o sal. No entanto, a maioria dos processos de produção biotecnológicos para ácido succínico operam em um pH acídico ou levemente neutro de 6 a 7. Dado o pKa do ácido succínico (pKa = 4,16 e 5,61), a maioria do ácido succínico está presente como sal e não tão livre como ácido livre sob essas condições. No entanto, a C. autoethanogenum e outros acetogênios carboxidotróficos são conhecidos por tolerar e crescer em um pH de maneira desejada baixo de 4 a 6.
[0064] Os aminoácidos de cadeia ramificada, tais como, valina, leucina e isoleucina, podem ser recuperados de um caldo de fermentação com o uso de concentração (por exemplo, por meio de osmose reversa), cristalização ou remoção da biomassa (por exemplo, por meio de ultrafiltração ou centrifugação) ou cromatografia de troca iônica (Ikeda, Microbial Production of L-Amino Acids, 1 a 35, 2003).
[0065] O 2,3-butanodiol, o formato, o 2-oxogluterato e outros produtos podem ser recuperados de um caldo de fermentação com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, baixas concentrações de 2,3-butanodiol podem ser recuperadas com o uso de técnicas de membrana, tais como, eletrodiálise, o que envolve a aplicação de um potencial adequado através de uma membrana permeável iônica seletiva. Outras técnicas adequadas incluem nanofiltração, em que os íons monovalentes passam seletivamente através de uma membrana sob pressão.
[0066] Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção, porém, evidentemente, não devem ser interpretados de maneira alguma como limitativos do escopo da mesma.
[0067] Esse exemplo descreve os materiais e métodos gerais.
[0068] C. autoethanogenum DSM10061 e DSM23693 (um derivado de DSM10061) e C. ljungdahlii DSM 13528 foram originados de DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Alemanha). C. ragsdalei ATCC BAA-622 foi originado de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, E.U.A). E. coli DH5a foi originado de Invitrogen (Carlsbad, CA 92008, E.U.A.).
[0069] E. coli se desenvolveu aerobicamente a 37 °C em um meio LB (Luria-Bertani). O meio sólido conteve 1,5% de ágar.
[0070] As cepas de Clostridium se desenvolveram a 37 °C em um meio PETC em um pH de 5,6 com o uso de técnicas anaeróbicas padrões (Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117 a 132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107 a 146, 1971. A Frutose (crescimento heterotrófico) ou 0,21 MPa (30 psi) de gás de usina siderúrgica que contém CO (coletados do sítio de Aço da Nova Zelândia em Glenbrook, NZ; composição: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) no espaço livre (crescimento autotrófico) foram usados como substrato. Para os meios sólidos, 1,2 % de bacto ágar (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, E.U.A.) foi adicionado.
[0071] As fermentações com C. autoethanogenum DSM23693 foram realizadas em biorreatores de 1,5 l a 37 °C com o uso de gás de usina siderúrgica que contém CO como única energia e fonte de carbono. Foi preparado um meio definido que contém: MgCl, CaCl2 (0,5 mM), KCl (2 mM), H3PO4 (5 mM), Fe (100 µM), Ni, Zn (5 µM), Mn, B, W, Mo, Se (2 µM). O meio foi transferido ao biorreator e esterilizado em autoclave a 121 °C por 45 minutos. Após a autoclavagem, o meio foi complementado com tiamina, pantotenato (0,05 mg/l) e biotina (0,02 mg/l) e reduzido com 3 mM de HCL de cisteína. A fim de alcançar as condições anaeróbicas, o vaso de reator foi borrifado com nitrogênio através de um filtro de 0,2 µm. Antes da inoculação, o gás foi alterado para gás de usina siderúrgica que contém CO, em alimentação contínua ao reator. O fluxo de gás foi definido inicialmente como 80 ml/min e aumentado para 200 ml/min durante a fase intermediária exponencial, ao passo que a agitação foi aumentada de 200 rpm a 350 rmp. O Na2S foi dosado no biorreator a 0,25 ml/h. Uma vez que o OD600 tenha atingido 0,5, o biorreator foi alterado para o modo contínuo em uma taxa de 1,0 ml/min (taxa de diluição de 0,96 d-1). Foram tiradas amostras para medir a biomassa e os metabólitos. Adicionalmente, a análise de espaço livre do gás que flui para dentro e para fora foi realizada regularmente.
[0072] A composição de gás do espaço livre foi medida em um Varian CP-4900 micro GC com dois canais instalados. O canal 1 foi uma coluna de peneira molecular de 10 m que funciona a 70 °C, 200 kPa de argônio e um tempo de fluxo reverso de 4,2 s, ao passo que o canal 2 foi uma coluna PPQ de 10 m que funciona a 90 °C, 150 kPa de hélio e sem fluxo reverso. A temperatura de injetor para ambos os canais foi de 70 °C. Os tempos de execução foram definidos como 120 s, porém, todos os picos de interesse eluem frequentemente antes de 100 s.
[0073] A análise por HPLC de produtos finais metabólicos foi realizada com o uso de um sistema Agilent 1100 Series HPLC equipado com um RID (Detector de Índice Refrativo) operado a 35 °C e uma coluna de ácido orgânico Alltech 10A-2000 (150 x 6,5 mm, tamanho de partícula de 5 µm) mantido a 60 °C. Água levemente acidificada foi usada (0,005 M H2SO4) como fase móvel com uma taxa de fluxo de 0,7 ml/min. A fim de remover as proteínas e outros resíduos de células, as amostras de 400 µl foram misturadas com 100 µl de um ácido 5-sulfossalicílico a 2 % (p/v) e centrifugado a 14.000 x g por 3 minutos para separar resíduos precipitados. 10 µl do sobrenadante foram, em seguida, injetados no HPLC para análises.
[0074] A análise por GC de produtos finais metabólicos foi realizada com o uso de uma GC de espaço livre com Agilent 6890N equipado com uma fibra de 1 cm de Supelco PDMS 100, uma coluna Alltech EC- 1000 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e um detector de ionização de chama (FID). 5 ml de amostras foram transferidos a um tubo Hungate, aquecido a 40 °C em um banho de água e exposta à fibra por exatamente 5 minutos. O injetor foi mantido a 250 °C, e o hélio com um fluxo constante de 1 ml/min foi usado como gás carreador. O programa de forno foi 40 °C por 5 minutos, seguido por um aumento de 10 °C/min até 200 °C. Em seguida, a temperatura foi aumentada adicionalmente até 220 °C com uma taxa de 50 °C/min seguida por uma retenção de 5 minutos nessa temperatura, antes de a temperatura ter sido diminuída a 40 °C com uma taxa de 50 °C/min e uma retenção final de 1 minuto. O FID foi mantido a 250 °C com 40 ml/min de hidrogênio, 450 ml/min de ar e 15 ml/min de nitrogênio como gás de compensação.
[0075] Durante o experimento de transformação completo, C. autoethanogenum DSM23693 cresceu no meio YTF na presença de agentes de redução e com gás residual de usina siderúrgica a 0,21 MPa (30 psi) (coletados do sítio de Aço da Nova Zelândia em Glenbrook, NZ; composição: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) a 37 °C com o uso de técnicas anaeróbicas padrões (Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117 a 132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107 a 146, 1971.
[0076] A fim de produzir células componentes, uma cultura a 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693 foi subcultivada a meios YTF frescos por 5 dias consecutivos. Essas células foram usadas para inocular meios YTF a 50 ml que contêm 40 mM de DL-treonina em um OD600nm de 0,05. Quando a cultura atingiu um OD600nm de 0,5, as células foram incubadas no gelo por 30 minutos e, em seguida, transferidas em uma câmara anaeróbica e colhidas a 4,700 x g e 4 °C. A cultura foi lavada duas vezes com tampão de eletroporação fria (270 mM de sacarose, 1 mM de MgCl2, 7 mM de fosfato sódico, pH de 7,4) e, por fim, suspensas em um volume de 600 µl de tampão de eletroporação fresco. Essa mistura foi transferida em um cadinho de eletroporação pré-resfriado com um vão de eletrodo de 0,4 cm que contém 2 µg da mistura de plasmídeo metilado e inibidor de restrição 1 do tipo 1 µl (Epicentre Biotechnologies) e pulsada imediatamente com o uso do sistema de eletroporação Gene pulser Xcell (Bio-Rad) com as seguintes configurações: 2,5 kV, 600 Q e 25 µP. Foram alcançadas constantes de tempo de 3,7 a 4,0 ms. A cultura foi transferida a um meio YTF fresco de 5 ml. A regeneração das células foi monitorada em um comprimento de onda de 600 nm com o uso de um Espectrofotômetro Spectronic Helios Epsilon (Termo) equipado com um retentor de tubo. Após uma queda inicial em biomassa, as células começaram a crescer novamente. Uma vez que a biomassa tenha dobrado a partir desse ponto, cerca de 200 µl de cultura foram espalhados em placas de YTF-ágar e em placas de PETC ágar que contêm 5 g/l de frutose (em que ambas contêm 1,2 % de bacto ágar e 15 µg/ml de tianfenicol). Após 3 a 4 duas de incubação com gás de usina siderúrgica a 0,21 MPa (30 psi) a 37 °C, 500 colônias por placa ficaram claramente visíveis.
[0077] C. autoethanogenum: A fim de verificar a identidade dos seis clones e a transferência de DNA, o DNA genômico foi isolado de todas as 6 colônias/clones em meios líquidos PETC com o uso do minikit de DNA genômico PURELINK™ (Invitrogen) de acordo com a instruções do fabricante. Esses DNAs genômicos junto daqueles da C. autoethanogenum DSM23693 do tipo selvagem foram usados como um modelo em PCR. A PCR foi realizada com iniciadores específicos de DNA Polimerase de Alta Fidelidade iproof (Bio-Rad Labratories), conforme descrito nos exemplos abaixo e com o seguinte programa: desnaturação inicial a 98 °C por 2 minutos, seguido por 25 ciclos de desnaturação (98 °C por 10 s), recozimento (61 °C por 15 s) e alongamento (72 °C por 90 s), antes de uma etapa de extensão final (72 °C por 7 minutos). O DNA genômico da C. autoethanogenum DSM23693 do tipo selvagem foi usada com modelo na PCR de controle.
[0078] A fim de confirmar a identidade dos clones, a PCR também foi realizada contra o gene de 16s rRNA com o uso dos iniciadores fD1(SEQ ID NO: 10); e TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 11) e com o uso das condições de PCR, conforme descrito acima. Os produtos de PCR foram purificados com o uso do kit Zymo CLEAN AND CONCENTRATOR™ e sequenciados com o uso do iniciador rP2.
[0079] Esse exemplo demostra a modificação genética da C. autoethanogenum para eliminar a atividade de lactato desidrogenase.
[0080] A demonstração da Idh de gene (HQ876025.1) de lactato desidrogenase (AEI90736.1) identificado (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77:5467 a 5475, 2011) da C. autoethanogenum foi demonstrada com o uso de duas metodologias: recombinação homóloga e ClosTron.
[0081] Recombinação homóloga: A fim de criar uma cepa de C. autoethanogenum que não pode mais produzir lactato, um construto de knockout foi projetado para romper a Idhatravés de recombinação homóloga dupla. Aproximadamente 1 kb de braços homólogos (SEQ ID NOs: 1 a 2) que flanqueiam o gene de idh foi clonado no plasmídeo pMTL85151 (Figura 1) e no plasmídeo resultante pMTL85151-ldh-ko (SEQ ID NO: 3). O DNA recombinante padrão e as técnicas de clonagem moleculares são conhecidas na técnica (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, 1987). O DNA genômico da C. autoethanogenum DSM23693 foi isolado com o uso do minikit de DNA genômico Purelink da Invitrogen, de acordo com a instrução do fabricante.
[0082] A transformação para introduzir o DNA foi realizada conforme descrito acima ou no documento no WO 2012/053905.
[0083] Em seguida da seleção, as colônias foram triadas para integração de cruzamento única (Figura 2A) e, em seguida, para mutantes de cruzamento duplo (Figura 2B). Um evento de cruzamento 3’ foi visto no clone 6 (Figura 2A) e o knockout do gene de idh foi observado quando triado com iniciadores de flanqueamento externos (Figura 2B). Os oligonucleotídeos Og21f (SEQ ID NO: 4), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) e 53C (SEQ ID NO: 7) foram usados para identificação da deleção de lactato desidrogenase de cruzamento duplo.
[0084] A mesma estratégia e o mesmo plasmídeo podem ser usados também, por exemplo, em C. ljungdahlii ou C. ragsdalei. Os protocolos de transformação foram descritos na técnica (WO 2012/053905 Leang, Applied Environ Microbiol, 79: 1102 a 1109, 2013.
[0085] ClosTron: ClosTron (Heap, J Microbiol Methods, 70: 452 a 464, 2007), uma ferramenta de projeto íntron hospedada no site da web da ClosTron foi usada para projetar uma região-alvo de 344 bp 129s (SEQ ID NO: 8) e identificar um sítio-alvo (SEQ ID NO: 9). Uma região-alvo foi sintetizada quimicamente no vector pMTL007C-E2 que contém um marcador ermB ativado por retrotransposição (RAM) pelo DNA2.0 (Menlo Park) (SEQ ID NO: 12).
[0086] Os vetores formam introduzidos na C. autoethanogenum conforme descrito no documento no WO 2012/053905. As colônias únicas crescidas em PETC MES com 15 µg/ml de tianfenicol foram listradas em PETC MES com 5 µg/ml de clarotromicina. As colônias a partir de cada alvo foram escolhidas e triadas aleatoriamente para inserção com o uso de iniciadores de flanqueamento 155F (SEQ ID NO: 4); e TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 5). A amplificação foi realizada com o uso da pré-mistura iNtron Maxime PCR. Um produto de PCR de 100 bp indicou um genótipo do tipo selvagem, ao passo que um tamanho de produto de aproximadamente 1,9 kb sugere a inserção do íntron de grupo II no sítio-alvo (Figura). A perda do plasmídeo foi verificada por amplificação do marcador de resistência (catP) e pela origem de gram-positivo de replicação (pCB102) (Figura 4).
[0087] A mesma estratégia e o mesmo plasmídeo podem ser usados também na C. Ijungdahlii ou na C. ragsdalei. Os protocolos de transformação foram descritos na técnica (WO 2012/053905 Leang, Appl. Environ Microbiol, 79: 1102 a 1109, 2013.
[0088] Esse exemplo descrito os exemplos de crescimento em comparação do perfil de produto das cepas de C. autoethanogenum com lactato desidrogenase inativada à C. autoethanogenumnão modificada.
[0089] As culturas de C. autoethanogenum e uma cepa de C. autoethanogenum com uma lactato desidrogenase inativada cresceram nos meios PETC com um tampão de 10 g/l MES em frascos de soro. O inóculo foi 10% do volume dos meios e o volume dos meios foi 10 ml. As culturas foram poluídas de gás efluente de usina siderúrgica (44% de CO, 22% de CO2, 2% de H2, 32% de N2) a 0,21 MPa (30 psi) e incubadas a 37 °C. O pH dos meios era 5,7.
[0090] Durante o período de crescimento, as amostras foram tomadas para a medição de OD600 e para a análise por HPLC. Os fracos foram poluídos de gás todos os dias com gás de usina a 0,21 MPa (30 psi). O experimento foi realizado em triplicatas.
[0091] Embora a cepa de C. autoethanogenumnão modificada tenha produzido 0,263 ± 0,041 g/l de lactato após 6 dias de crescimento (Figura 5A), a cepa de C. autoethanogenum com lactato desidrogenase inativada não produziu lactato após 6 dias de crescimento (Figura 5B). Adicionalmente, a cepa de C. autoethanogenum com lactato desidrogenase inativada produziu quantidades aumentadas de acetato, etanol e 2,3-butanodiol. De outro modo, as duas cepas tiveram um perfil de crescimento semelhante e atingiram um OD600nm semelhante de 2,69 e 2,365, respectivamente.
[0092] Todas as referências, incluindo as Publicações, Pedidos de Patente e Patentes mencionadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência até o ponto como se cada referência estivesse indicada individual e especificamente como incorporada a título de referência e fosse estabelecida no presente documento em sua totalidade. A referência a qualquer técnica anterior no presente relatório descritivo não é e não deve ser interpretada como um reconhecimento de que a técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum no campo de esforço em qualquer país.
[0093] O uso dos termos "um”, “uma", "o" e "a" e referentes semelhantes no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado como abrangente tanto do singular quanto do plural, a menos que indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "que compreende(em)", "que tem(têm)", "que inclui(em)" e "que contém(contêm)"devem ser interpretados como termos abertos (isto é, significando "que inclui(em), porém sem limitação") a menos que especificado de outro modo. A recitação das faixas de valores no presente documento se destina meramente a servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado que está da faixa, a menos que indicado de outro modo no presente documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse recitado individualmente no presente documento. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequado, a menos que indicado de outro modo no presente documento ou contraindicado de outro modo claramente pelo contexto. O uso de qualquer e de todos os exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecidos no presente documento é destinado apenas a melhor esclarecer a invenção e não constitui uma limitação no escopo da invenção a menos que reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicativa de qualquer elemento não reivindicado elemento como essencial à prática da invenção.
[0094] As modalidades preferenciais da presente invenção são descritas no presente documento, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. As variações dessas modalidades preferenciais podem ficar evidentes para as pessoas versadas na técnica mediante a leitura da descrição mencionada acima. Os inventores esperam que as pessoas versadas na técnica empreguem tais variações conforme for adequado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo conforme descrito especificamente no presente documento. Consequentemente, a presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria recitada nas reivindicações anexadas à mesma, conforme permitido pela lei vigente. Ademais, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção a menos que indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito de outro modo pelo contexto.
Claims (8)
1. Método para produzir um produto selecionado do grupo consistindo de etanol, 2,3-butanodiol e ácido acético, caracterizadopelo fato de que compreende cultivar uma bactéria acetogênica carboxidotrófica selecionada do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei compreendendo uma mutação disruptiva que reduz ou elimina a expressão ou atividade da enzima lactato desidrogenase em relação à bactéria parental, em um gene que codifica uma enzima de lactato desidrogenase na presença de um substrato que compreende CO.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a bactéria: (a) produz uma quantidade reduzida de lactato em comparação a uma bactéria parental; ou (b) produz nenhum lactato.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a bactéria ainda produz um ou mais dentre etanol, 2,3-butanodiol, formato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, malato, fumarato, 2- oxogluterato, citrato e citramalato.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a bactéria produz uma quantidade aumentada do produto em comparação a uma bactéria parental.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o produto é etanol.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o produto é 2,3-butanodiol.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a bactéria produz menos do que 1,0 g/L de lactato.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a bactéria produz menos do que 0,10 g/L de lactato.
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