EA015794B1

EA015794B1 - Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола

Info

Publication number: EA015794B1
Application number: EA200702153A
Authority: EA
Inventors: Энтони Аткинсон; Роджер Криппс; Кирстин Элей; Брайан Рудд; Мартин Тодд; Энн Томпсон
Original assignee: Тмо Реньюаблз Лимитед
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2011-12-30
Also published as: BRPI0610988A2; JP2012040016A; JP2008539710A; EA200702153A1; CA2607052A1; MX2007013673A; AU2006243052A1; US20090042265A1; NZ563043A; NO20076123L; KR20080012934A; AU2006243052B2; WO2006117536A1; EP1880004A1

Abstract

Получен мутированный термофильный микроорганизм с модификацией, инактивирующей ген лактатдегидрогеназы микроорганизма дикого типа. Этот мутированный микроорганизм применяют при продуцировании этанола, используя С, Сили Ссахара в качестве субстрата.

Description

Данное изобретение относится к продуцированию этанола как продукта бактериальной ферментации. В частности, изобретение относится к продуцированию этанола термофильными бактериями.

Предшествующий уровень техники

Бактериальный метаболизм может осуществляться посредством ряда различных механизмов в зависимости от вида бактерий и условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, которые включают все патогены, получают энергию от окисления органических соединений, причем самыми распространенными окисляемыми соединениями являются углеводы (в частности, глюкоза), липиды и белок. Результатом биологического окисления этих органических соединений бактериями является синтез АТФ как химического источника энергии. Этот процесс также дает возможность образования более простых органических соединений (молекул-предшественников), которые требуются бактериальной клетке для реакций биосинтеза. Общим процессом, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие субстраты, является гликолиз, который представляет собой последовательность реакций, превращающих глюкозу в пируват с образованием АТФ. Судьба пирувата при генерировании метаболической энергии зависит от микроорганизма и условий окружающей среды. Существует три основных реакции пирувата.

Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы будут генерировать энергию, используя цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетилкоэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой (ΡΌΗ).

Во-вторых, в анаэробных условиях некоторые образующие этанол микроорганизмы могут осуществлять спиртовую ферментацию путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, катализируемого пируватдекарбоксилазой (ΓΌΟ), и последующего восстановления ацетальдегида до этанола посредством НАДФ (никотинамиддинуклеотидфосфата), катализируемого алкогольдегидрогеназой (ΆΌΗ).

Третьим процессом является превращение пирувата в лактат, которое происходит посредством катализа лактатдегидрогеназой (ΓΌΗ).

Существует большой интерес в использовании микроорганизмов для продуцирования этанола либо с использованием микроорганизмов, которые претерпевают анаэробную ферментацию естественным путем, либо посредством использования рекомбинантных микроорганизмов, которые включают гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Хотя достигнут некоторый успех в продуцировании этанола путем использования этих микроорганизмов, ферментация часто подвергается риску за счет повышенной концентрации этанола, в частности, когда микроорганизм обладает низким уровнем толерантности к этанолу.

Для продуцирования этанола предложены термофильные бактерии, их применение обладает тем преимуществом, что ферментацию можно проводить при повышенных температурах, которые дают возможность удаления продуцированного этанола в виде пара при температурах выше 50°С; это также дает возможность проведения ферментации с использованием высоких концентраций сахара. Однако поиск подходящих термофильных бактерий, которые могут эффективно продуцировать этанол, проблематичен.

В \УО 01/49865 раскрыта грамположительная бактерия, которая трансформирована гетерологичным геном, кодирующим пируватдекарбоксилазу, и которая обладает нативной функцией алкогольдегидрогеназы, для продуцирования этанола. Эта бактерия представляет собой термофильную Вас111ик, и эта бактерия может быть модифицирована инактивацией гена лактатдегидрогеназы с использованием вставки транспозона. Все бактерии, раскрытые в \УО 01/49865, имеют происхождение от штамма ВаеШик БЕО-Я штамма с дефицитом споруляции, который возник спонтанно из культуры и в котором ген 1бЬ инактивирован спонтанной мутацией или химическим мутагенезом. Штаммы Б-Ν и ΤΝ раскрыты в качестве улучшенных производных штамма ЬГО-К.. Однако все штаммы содержат рестрикционные системы типа Нае III, что затрудняет плазмидную трансформацию и, следовательно, предотвращает трансформацию неметилированной ДНК.

В \УО 01/85966 раскрыты микроорганизмы, которые получают путем метилирования ίη νίνο, чтобы преодолеть проблемы рестрикции. Это требует трансформации метилтрансферазы Нае III из НаешорНПик аедурБик в штаммы ΓΓΌ-Κ, ΌΝ и ΤΝ. Однако штаммы ЬГО-К, ΌΝ и ΤΝ являются нестабильными мутантами и спонтанно ревертируют к продуцирующим лактат штаммам дикого типа, в частности, при низком рН и при высоких концентрациях сахара.

Результатом этого являются изменения продукта ферментации с этанола на лактат, что делает эти штаммы непригодными для продуцирования этанола.

В \УО 02/29030 раскрыто, что штамм ЬГО-К. и его производные включают встречающийся в природе инсерционный элемент (БЕ) в кодирующей области гена ИН. Транскрипция этого элемента внутри гена ИН (и вне его) и последующая инактивация гена является нестабильной, приводя к реверсии. В качестве решения была предложена интеграция плазмидной ДНК в последовательность ГЕ.

Таким образом, на уровне техники получение микроорганизмов для продуцирования этанола основано на модификации полученных в лаборатории мутированных химическим путем микроорганизмов ВаеШик, их обработке ίη νίνο с помощью методик метилирования и последующей модификации этих микроорганизмов интеграцией плазмидной ДНК в последовательность БЕ. Эта процедура сложна, ненадежна, а также существуют спорные предписания по использованию этих штаммов.

- 1 015794

Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных микроорганизмах для продуцирования этанола.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно первому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм модифицирован таким образом, чтобы дать возможность повышенного продуцирования этанола, где эта модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения этот микроорганизм депонирован как Νί'ΊΜΒ. номер по каталогу 41275.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения способ продуцирования этанола включает культивирование микроорганизма в соответствии с приведенным выше определением в пригодных условиях в присутствии С₃, С₅ или С₆ сахара.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения плазмида является такой, как определено здесь как рИВ190-Ий (депонирована как Νί'ΊΜΒ. номер по каталогу 41276).

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм содержит плазмиду, определенную здесь как рИВ190 (фиг. 4).

Описание графических материалов

Настоящее изобретение описано со ссылкой на сопроводительные графические материалы, где фиг. 1 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по изобретению (Ий 35) с различными субстратами;

фиг. 2 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по изобретению (Ий 58) с различными субстратами;

фиг. 3 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола нокаут-мутантом по 1.11Н 11955;

фиг. 4 и 5 представляют собой схематические изображения плазмид рИВ, используемых в изобретении; фиг. 4 представляет собой мутант Ий согласно изобретению;

фиг. 6 представляет собой график, показывающий стабильность нокаут-мутанта ЙЭН в различных условиях культивирования.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма дикого типа, прерывающей экспрессию гена лактатдегидрогеназы.

Инактивация гена лактатдегидрогеназы способствует предотвращению расщепления пирувата до лактата и, следовательно, стимулирует (в подходящих условиях) расщепление пирувата до этанола с использованием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы прерывают путем делеции внутри гена или всего гена.

Микроорганизм дикого типа может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но предпочтительно, если этот микроорганизм представляет собой ВасШик крр. В частности, предпочтительно, если этот микроорганизм принадлежит к виду ОеойасШик, в частности ОеойасШик (йсгтодйюокИакищ.

Микроорганизмы, выбранные для модификации, указаны как микроорганизмы дикого типа, т.е. они не являются мутантами, полученными в лаборатории. Эти микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, которые, как ожидают, содержат термофилы. Изолированные микроорганизмы дикого типа будут обладать способностью к продуцированию этанола, но, если они не модифицированы, лактат, вероятно, является основным продуктом ферментации. Изоляты также отбирают на их способность к росту на сахарах гексозах и/или пентозах и их олигомерах при термофильных температурах.

Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению обладал некоторыми желательными характеристиками, которые дают возможность использования этого микроорганизма в процессе ферментации. Предпочтительно этот микроорганизм не должен иметь систему рестрикции, посредством чего избегают необходимости в метилировании ίη у1уо. Кроме того, микроорганизм должен быть стабильным по меньшей мере к 3% этанолу и должен обладать способностью к утилизации С₃, С₅ и С₆ сахаров (или их олигомеров) в качестве субстрата, включая целлобиозу и крахмал. Предпочтительно, если этот микроорганизм является трансформируемым при высокой частоте. Кроме того, этот микроорганизм должен иметь скорость роста в непрерывной культуре для поддержания степеней разбавления 0,3 ч^-1 и выше (типично 0,3 ОП₅₀₀).

Микроорганизм является термофилом и растет в температурном диапазоне 40-85°С. Предпочтительно этот микроорганизм растет в температурном диапазоне 50-70°С. Кроме того, желательно, чтобы этот микроорганизм рос в условиях рН 7,2 или ниже, в частности рН 6,9-4,5.

Микроорганизм может быть спорообразующим либо может не спорулировать. Успех процесса ферментации не обязательно зависит от способности микроорганизма к споруляции, хотя при некоторых обстоятельствах может быть предпочтительно иметь спорообразующий микроорганизм, когда желательно использовать микроорганизмы в качестве корма для животных по окончании процесса ферментации. Это является следствием способности спорообразующих микроорганизмов к обеспечению хорошей им

- 2 015794 муностимуляции при использовании в качестве корма для животных. Спорообразующие микроорганизмы также обладают способностью к осаждению во время ферментации, и, следовательно, их можно выделить без необходимости в центрифугировании. Соответственно эти микроорганизмы можно использовать в корме для животных без необходимости в сложных или дорогостоящих методиках выделения.

Последовательность нуклеиновой кислоты для лактатдегидрогеназы сейчас известна. Используя эту последовательность, специалист в данной области техники имеет возможность использовать ген лактатдегидрогеназы в качестве мишени для достижения инактивации этого гена посредством различных механизмов. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы инактивируют либо путем инсерции транспозона, либо предпочтительно путем делеции последовательности этого гена или участка последовательности этого гена. Делеция является предпочтительной, поскольку позволяет избежать трудностей повторной активации последовательности гена, которая часто происходит при использовании транспозонной инактивации. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируют путем интеграции термочувствительной плазмиды (плазмиды рИВ190-1бй), которая достигается естественной гомологичной рекомбинацией или интеграцией между плазмидой и хромосомой микроорганизма. Хромосомные интегранты можно отобрать на основании их устойчивости к антибактериальному агенту (например к канамицину). Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может происходить посредством события рекомбинации по типу одиночного кроссинговера или посредством события рекомбинации по типу двойного (или более чем двойного) кроссинговера.

В предпочтительном воплощении микроорганизм содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы и гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы. Результатом экспрессии этих гетерологичных генов является продуцирование ферментов, которые меняют направление метаболизма таким образом, что этанол является основным продуктом ферментации. Эти гены могут быть получены из микроорганизмов, которые типично претерпевают анаэробную ферментацию, включая виды Ζν то шопах, включая Ζνηιοιηοηαχ тоЬШк.

Способы получения и включения этих генов в микроорганизмы известны, например, в 1пдтат с1 а1., Вю1есй & ВюЕпд, 1998; 58 (2+3): 204-214 и И8 5916787, где содержание каждой публикации включено здесь путем ссылки. Эти гены могут быть введены на плазмиде или интегрированы в хромосому, как должно быть известно специалистам в данной области техники.

Микроорганизмы по изобретению можно культивировать в общепринятых условиях культивирования в зависимости от выбранного термофильного микроорганизма. Выбор субстратов, температуры, рН и других условий роста можно произвести на основании известных требований к культивированию, например, см. XVО 01/49865 и ХУО 01/85966, где содержание каждой публикации включено здесь путем ссылки.

Теперь настоящее изобретение будет описано только путем примера со ссылкой на сопроводительные графические материалы в приведенных ниже примерах.

Инактивация гена ЬИН.

Пример 1. Мутация в результате одиночного кроссинговера.

Разработка нокаут-вектора ЬИН.

Частичный фрагмент гена Ий примерно 800 п.о. субклонировали в термочувствительном векторе доставки риВ190 (8ЕО ΙΌ N0: 1), используя ΗίηάΙΙΙ и ХЬа1, с получением в результате плазмиды 7,7 кб рИВ190-Ий (фиг. 4 и 8ЕО ΙΌ N0: 2). Плазмида рИВ190 депонирована в ΝΟΜΒ, как указано ниже. Десять предполагаемых трансформантов Е.еой 1Μ109 (рИВ190-Ий) проверяли с помощью рестрикционного анализа, и две культуры использовали для получения плазмидной ДНК для целей трансформации. В результате переваривания рИВ 190-Ий рестриктазами ΗίηάΙΙΙ и ХЬаГ высвобождается ожидаемый фрагмент Ий.

Трансформация СсоЬаеШих ИеттодИсокИакшк 11955 плазмидой рИВ190-Ий.

Трансформанты были получены со всеми тремя плазмидами, протестированы после 24-48 ч при 54°С селекцией канамицином. Трансформанты Ий очищали из СеоЬасШик ИеттодИсокИакшк (Οί) 11955 и проверяли с помощью рестрикционного анализа, используя ΗίηάΙΙΙ и ХЬаЕ

Нокаут гена ЬИН.

Нокаут гена осуществляли посредством интеграции термочувствительной плазмиды в ген Ий на хромосоме.

Плазмида рИВ 190-Ий реплицируется при 54°С в СП 1955, но не реплицируется при 65°С. Селекцию поддерживали канамицином (кап) (12 мкг/мл). Затем температуру роста повышали до 65°С (плазмида больше не является репликативной). Естественная рекомбинация или интеграция происходит между плазмидой и хромосомой. Хромосомные интегранты отбирали по их устойчивости к канамицину. Интеграция была направлена в сторону гена Ий, поскольку на плазмиде находится гомологичная последовательность. Направленная интеграция в ген Ий происходила посредством процесса, известного как рекомбинация по типу одиночного кроссинговера. Плазмида становится встроенной в ген Щй, результатом чего является неактивный ген Ий. Тандемные повторы могут встречаться, если интегрирует несколько копий плазмиды.

- 3 015794

Методология и результаты.

Для интеграции предпринимали два различных метода.

Метод 1. 4x50 мл культур ТОР (кап) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл ТОР. Эту суспензию высевали на чашки (5x200 мл) ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С. Интегранты собирали и высевали на 50-квадратную решетку на свежих чашках ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С.

Метод 2. 1x50 мл культуры ТОР (кап) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. 1 мл этой культуры использовали для инокуляции 50 мл свежих культур ТОР (кап), которые выращивали при 68°С в течение 12-18 ч. Эту культуру субкультивировали на следующие сутки в 50 мл свежих культур ТОР (кап) и выращивали при 68°С еще в течение 12-18 ч. Эту культуру высевали на чашки ТОР (кап) и инкубировали при 68°С в течение ночи. На чашках был получен конфлюентный рост. Отдельные колонии высевали на 50-квадратную решетку на свежие чашки ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С.

Скрининг.

Предполагаемые интегранты подвергали скринингу на нокаут гена Ий, используя приведенное ниже.

1) Скрининг на чашках.

Несколько сотен интегрантов перепечатывали на чашки 8ЛМ2 (с кап) при 68°С. Отрицательные по лактату клетки продуцируют меньше кислоты и могут обладать ростовым преимуществом по сравнению с диким типом на ферментационных средах без буферов.

2) Скрининг с помощью ПЦР.

ПЦР колоний использовали для определения того, интегрировали ли плазмида в ген Ий. Путем подбора праймеров, которые фланкируют сайт интеграции, возможно определить, произошла ли интеграция гена Ий (для вставок фрагмент ПЦР не амплифицируется).

3) Анализ на лактат.

Данный анализ определяет, продуцируют ли интегранты лактат при росте в течение ночи на 8АМ2 (кап) при 68°С. Надосадочную жидкость культуры тестировали на концентрацию лактата реагентом на лактат фирмы 81дша для определения лактата. Отрицательные по лактату интегранты дополнительно характеризовали с помощью ПЦР и оценивали в ферментере на стабильность.

Протокол электропорации для ОеойасШиз ИегтоцИсобИабШб Ν0ΙΜΒ 11955.

Замороженную исходную культуру ΝΟΙΜΒ 11955 получали путем выращивания ночной культуры в среде ТОР (250 об/мин при 55°С, объем 50 мл в конической колбе на 250 мл, ОП₆₀₀), добавления равного объема 20% глицерина и деления на аликвоты по 1 мл и хранения в пробирках для криоконсервации при -80°С. 1 мл этой исходной культуры использовали для инокуляции 50 мл ТОР в конической колбе на 250 мл, инкубация при 55°С, 250 об/мин, до достижения культурой ОП₆₀₀ 1,4.

Колбу охлаждали на льду в течение 10 мин, затем культуру центрифугировали в течение 20 мин при 4000 об/мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 50 мл охлажденной во льду среды для электропорации и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Проводили три дополнительных отмывки, 1x25мл и 2x10 мл, а затем осадок ресуспендировали в 1,5 мл охлажденной во льду среды для электропорации и делили на аликвоты по 60 мкл.

Для электропорации 1-2 мкл ДНК добавляли к 60 мкл электрокомпетентных клеток в пробирке типа Эппендорф, которую держали на льду, и мягко перемешивали. Эту суспензию переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации (щель 1 мм) и проводили электропорацию при 2500 В, емкости 10 мФ и сопротивлении 600 Ом.

Сразу после импульса добавляли 1 мл ТОР, перемешивали и суспензию переносили в пробирку с завинчивающейся крышкой, инкубировали при 52°С в течение 1 ч в водяной бане с качалкой. После инкубации суспензию либо высевали непосредственно (например, 2x0,5 мл), либо центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендировали в 200-500 мкл ТОР и высевали на агар ТОР, содержащий соответствующий антибиотик.

Среда для электропорации

Среда Т6Р

0,5 М сорбит

0,5 М маннит

10% глицерин

Триптон 17 г/л Соевый пептон 3 г/л

КсНРО, 2,5 г/л

МаС1 5 г/л рН до 7,3

Добавки после автоклавирования:

Пируват натрия 4 г/л Глицерин 4 мл/л

Инактивация гена ЬЭН.

Мутация в результате двойного кроссинговера.

Праймеры разрабатывали на основе доступной последовательности 11955 ЬЭН. Нокаут-стратегия была основана на создании внутренних делеций внутри гена ЬЭН путем двух подходов.

При стратегии 1 два существующих уникальных сайта рестрикции вблизи середины кодирующей последовательности ЬЭН использовали для образования делеций. Из геномной ДНК получали один

- 4 015794 большой продукт ПЦР, покрывающий большую часть доступной последовательности ЬБИ, и клонировали в сайте 8ша1 во множественном сайте клонирования в рИС19, Затем клон рИС19 последовательно переваривали ΒδΐΕΙΙ и ΒδτΘΙ и повторно лигировали после переваривания фрагментом Кленова с образованием внутренней делеций в гене ΕΌΗ между ΒδΐΕΙΙ и ΒδτΘΙ.

При стратегии 2 (см. пример 2) ген ΕΌΗ клонировали в виде 2 продуктов ПЦР, вводя сайты ΝοΐΙ на олигопраймерах, чтобы образовать 2 продукта ПЦР для совместного лигирования в рИС19 с образованием делеций в середине последовательности ΕΌΗ. Два гена ΕΌΗ с внутренними делециями субклонировали в трех потенциальных системах доставки для ОеоЬасШиз.

Плазмида	Подробное описание
рси1	4,94 кб, челночный вектор на основе рС194, несет са! и Ыа
рВТ2	6,97 кб, челночный вектор, полученный из термочувствительного мутанта рЕ194, несет са! и Ыа
рТУОтсз	4,392 кб, получен из рЕ1941з, несет са( (без грамотрицательного репликона).

Векторы доставки трансформировали в 11955 путем электропорации.

Информация по генетической стратегии: разработка систем доставки для гомологичной рекомбинации.

Для создания нокаутов необходима эффективная система для доставки мутированного гена в организм-мишень и отбора на интеграцию в геном в результате гомологичной рекомбинации с геноммишенью дикого типа. В принципе, это может быть достигнуто путем введения ДНК на векторе Е.со11 без грамположительного репликона, но который несет грамположительный селективный маркер. Для этого необходима высокая эффективность трансформации. Метод электропорации, разработанный для ОеоЬасШиз 11955, создает 3х10⁴ трансформантов на 1 мкг ДНК с ρΝ^33Ν. Грамположительный репликон выделен из рВС1 по каталогу ВО8С и из рТНТ15 по базе данных последовательностей.

Ген са! на ρΝ^33Ν используют для селекции как в Е.со11, так и в ОеоЬасШиз. Термочувствительные мутанты ρΝ^33Ν были получены с помощью пассажей плазмиды через штамм-мутатор ВКДадепе ХЬ1г еб.

Пример 2. Получение мутанта ΕΌΗ путем замещения гена.

Для получения стабильной мутации гена ΕΌΗ в ОеоЬасШиз Шегшо§1исо81ба8Ш8 ΝίΊΜΒ 11955 была разработана дополнительная стратегия путем замещения гена. В эту стратегию вовлечено создание делеции 42 п.о. вблизи середины кодирующей последовательности и инсерции 7 п.о. в данном положении, вводящей новый сайт рестрикции ^ΐΙ. Эта последовательность вставки была предназначена для того, чтобы вызвать мутацию сдвига рамки считывания правее. В данную стратегию вовлечено создание делеции с использованием 2 фрагментов ПЦР, используя олигопраймеры, вводящие сайт рестрикции ^ΐΙ. Праймеры были разработаны на основании частичной последовательности кодирующей области ΕΌΗ из 11955. Последовательность использованных праймеров показана ниже.

Фрагмент 1:

Праймер 1 (прямой): ^ССАМТСССТТАТСААССААССААТАССА Ц) ]уо_: 3· затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ЕсоВЦ.

Праймер 2 (обратный): ^СС^С(ЭССССАССС6СТСТТТС6СТААСССССТ _{ш ΝΟ; 4}_ _{затененная после}_ довательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ^П).

Фрагмент 2:

Праймер 3 (прямой): ли (§Ер ΙΌ ΝΟ: 5; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ^П).

Праймер 4 (обратный): СТОСАСССТСААТТССАТСАСТТСАСбА ^_Е(^ _{ш Ν}θ. ₆_ _{затененная} последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ΡδΐΙ).

Получение препарата геномной ДНК.

Препарат геномной ДНК, который служит матрицей для ПЦР, получали из 11955. Клетки из 20 мл ночной культуры 11955, выращенной в среде ΤΘΡ при 52°С, собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл буфера 8ΤΕ 0,3 М сахароза, 25 мМ Трис 11С1 и 25 мМ ЭДТА, доведенного до рН 8,0, содержащего 2,5 мг лизоцима и 50 мкл 1 мг/мл рибонуклеазы А. Эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 30°С, затем добавляли 5 мл протеиназы К и 50 мкл 10% ДСН с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. Затем лизированную культуру последовательно экстрагировали равными объемами фенола/хлороформа, а затем хлороформом, после чего осаждали изопропанолом. После отмывки дважды охлажденным во льду 70% этанолом осадок ДНК снова растворяли в 0,5 мл буфера ТЭ.

- 5 015794

Создание конструкции с делецией БЭН.

ПЦР проводили, используя ВоЬосус1ет СтаФеп! 96 (8!та!адепе), и условия реакции были следующими: цикл 1: денатурация при 95°С в течение 5 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин, элонгация при 72°С в течение 2 мин; циклы 2-30: денатурация при 95°С в течение 1 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин, элонгация при 72°С в течение 2 мин, последующая инкубация при 72°С в течение 5 мин. Используемые ферменты представляли собой равную смесь полимеразы РГи (Рготеда) и полимеразы Тад (Иете Епд1аиб Вю1аЬ§, ΝΕΒ). Используемые буфер, состав и концентрация 6ΝΤΡ были такими, как рекомендовано для РГи поставщиками. Продукты ПЦР, полученные с использованием геномной ДНК из Νί'ΊΜΒ 11955 в качестве матрицы, очищали путем электрофореза в агарозном геле и элюировали из агарозного геля с использованием набора О1Ас.|шск Се1 ЕхйасДоп Κίΐ (01адеп). Очищенные продукты ПЦР лигировали с риС19 (Νονν ЕпДапб Вю1аЬ§), предварительно переваренной 8та1, и лигазную смесь использовали для трансформации ЕксйепсЫа сой ΌΗ10Β Цпуйтодеп). Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом и устанавливали ориентацию вставок.

Плазмиду (рТМ002) с фрагментом 2, встроенным в рИС19 (с новым сайтом РШ, введенным на праймере 4 ближе всего к сайту РбН в сайте поликлонирования (тс§) рИС19), переваривали №ΐΙ и РШ. Полученный в результате фрагмент (примерно 0,4 кб) лигировали в плазмиду рИС19 (рТМ001), несущую фрагмент 1 (с новым сайтом ЕсоШ, введенным на праймере 1 ближе всего к сайту ЕсоР1 в тс§ рИС19), переваренную и РШ для линеаризации плазмиды. Лигазную смесь использовали для трансформации

Е.сой ΌΗ10Β. Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ003) с ожидаемым паттерном рестрикции для желаемой конструкции (кодирующая область ЬОН, несущая делецию и введенный сайт идентифицировали и проверяли секвенированием, используя прямой и обратный праймеры М13тр18.

Мутированный ген ЬОН вырезали из рТМ003 путем переваривания ΗίηάΙΙΙ и ЕсоР1 и очищали путем электрофореза в агарозном геле с последующей элюцией из агарозного геля с использованием набора р^цшск Се1 Ех1тасйоп Κίΐ (в виде фрагмента примерно 0,8 кб). Этот фрагмент обрабатывали полимеразой Кленова ЩЕВ, согласно инструкциям изготовителей) с образованием тупых концов и вводили в вектор риВ190. Это было достигнуто путем лигирования по тупым концам с рИВ190, линеаризованной перевариванием ХЬа!, а затем обработанной фрагментом Кленова с последующей очисткой из геля, как описано выше. Лигазную смесь использовали для трансформации Е.сой 8С8110 (81та!адепе). Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ014) с ожидаемым паттерном рестрикции для желаемой конструкции идентифицировали и использовали для трансформации NСIМΒ 11955 путем электропорации, используя протокол электропорации, как описано в примере 1.

Получение и характеристика мутанта ЬОН с замещением гена посредством двойного кроссинговера.

Предполагаемый первичный интегрант рТМ014, полученный таким способом (штамм ТМ15), использовали для получения двойных рекомбинантов (замещения гена). Это было достигнуто с помощью серийной субкультуры ТМ15 в среде ТСР без канамицина. Использовали пять последовательных культур при качании, чередуя 8 ч при 54°С и 16 ч при 52С°, используя 5 мл ТСР в пробирках на 50 мл (Еа1соп) при 250 об/мин, 1% пересев на каждой стадии. После этих 5 пассажей полученную в результате культуру серийно разводили в ТСР и высевали пробы по 100 мкл на чашки с агаром ТСР для инкубации при 54°С. Перепечатку полученных в результате колоний на агар ТСР, содержащий 12 мкг/мл канамицина, использовали для идентификации колоний, чувствительных к канамицину. После рассева истощающим штрихом на агаре до отдельных колоний для очистки эти производные, чувствительные к канамицину, тестировали на продуцирование лактата, и, как ожидали, оказалось, что они представляют собой смесь БЭН' и БЭН^-. Одно производное ЬОН^-, ТМ89, было дополнительно охарактеризовано с помощью ПЦР и Саузерн-блоттингов.

Геномную ДНК получали из ТМ15 (первичный интегрант) и ТМ89 (предполагаемый двойной рекомбинант ЬОН^-) и использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием праймеров 1 и 4 и условий, описанных выше. Геномную ДНК из 11955 использовали в качестве контроля. Продукты ПЦР (полосы примерно 0,8 кб получены для всех 3 матриц) очищали электрофорезом в агарозном геле и элюировали из агарозного геля, используя набор р1Адшск Се1 Ех!тас1юп Κίΐ. Образцы переваривали №П и разгоняли на 0,7% агарозном геле для визуализации продуктов. Продукт ПЦР 11955 не показал данных рестрикции №1Е как ожидали, тогда как продукт ПЦР ТМ89 дал 2 полосы примерно по 0,4 кб, что указывает на замещение гена дикого типа мутированным аллелем. Переваривание продукта ПЦР ТМ15, первичного интегранта, дало преимущественно 2 полосы, наблюдаемые для ТМ89, со следом нерестрицированной (0,8 кб) полосы. Это можно объяснить результатом, полученным Саузерн-блоттингом геномной ДНК ТМ15.

Геномную ДНК 11955, ТМ15 и ТМ89 переваривали №ΐΙ, Рб!! и №11 и НшбШ и №11 и подвергали электрофорезу в агарозном геле. ДНК переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Восйе) и гибридизовали с меченым Э1С зондом, полученным с помощью ПЦР гена БЭН 11955, исполь

- 6 015794 зуя праймеры 1 и 4, с мечеными ИЮ 6ΝΤΡ, следуя инструкциям поставщиков (Коейе Мо1еси1аг ВюсйепйсаЕ ИЮ аррйсайоп тапиа1). Гибридизовавшиеся полосы визуализировали, используя поставляемый набор для обнаружения (Косйе). Данные Саузерн-блоттинга показали наличие множественно амплифицированной полосы примерно 7,5 кб в переваре №Й ТМ15 с так же амплифицированными полосами примерно 7 и 0,4 кб в переварах Нтй111/№11 и РШ/ШЙ ТМ15, что указывает на интеграцию множественных тандемных копий рТМ014, интегрированных при локусе ЬИН в данном первичном интегранте. Со всеми 3 рестрикционными переварами ТМ89 показала наличие другого паттерна рестрикции, показывающего дополнительную полосу гибридизации по сравнению с11955, соответствующую замещению гена. ТМ89 депонирована в NСIМΒ под номером по каталогу 41275, как указано ниже.

Пример 3. Продуцирование этанола термофилом дикого типа.

Воспроизводимый рост и образование продукта было достигнуто в культурах с подпиткой и непрерывных культурах для термофила дикого типа. В табл. 1, 2 и 3 показаны условия, используемые для процесса ферментации.

Таблица 1

Хи м и чес кие веще ства	об/л	Конечная концентрация
МаН₂РО₄.2Н₂О		25 мМ
К₂ЗО₄		10 мМ
Лимонная кислота.Н;О		2мМ
МдЗО₄7Н₂О		1,25 мМ
СаС1₂2Н₂О		0,02 мМ
Сульфатный раствор микроэлементов	5 мл	См. ниже
№₂МоО₄.2Н₂О		1,65 мкМ
Дрожжевой экстракт	10 г
Пеногаситель	0,5 мл

Добавки после автоклавирования:
4 М мочевина	25 мл	100 мМ
1% биотин	300 мкл	12 мкМ

20% глюкоза²	50 мл	1%

Таблица 2

Сульфатный концентрированный раствор микроэлементов

Химические вещества	гл¹ (мл)	Концентрация в среде
Конц. Н₂5О₄	5 мл
ΖηδΟ₄.7Η₂Ο	1,44	25 мкМ
Ее5О₄.7Н₂О	5,56	100 МКМ
МпЗО₄.Н₂0	1,69	50 мкМ
Си5О₄.5Н₂О	0,25	5 мкМ
Со5О₄.7Н₂О	0,562	10 мкМ
Νί3Ο₄.6Η₂Ο	0,886	16,85 мкМ
Н₃ВО₃	0,08
Деионизованная Н₂О (конечный об.)	1000 мл

Таблица 3

Условия ферментера

Инокулят	10% об/об
Объем	1000 мл
Температура	60°С
РН	7,0 регулируется Ν3ΟΗ
Аэрация	0,4 об^г/мин
Ν, скорость потока	0,05 л/мин
Перемешивание	400 об/мин
Среда	Мочевина сульфаты для ферментеров
Подача сахара	100 мл 50% глюкозы

- 7 015794

Таблица 4

Суммирование улучшений р в пеоиодическс	эста Вас Й КУЛЬТ'	\|\|\|119 дикого типа /ое
Среда	Суммарный добавленный сахар, мМ	ОП600	мМ
пир	пакт	форм	ацет	этанол
Ксилоза	603	8,5	9	187	5	75	22
Глюкоза 1	504	4	2	295	36	28	39
Глюкоза 2	504	3,7	19	322	111	55	123

Пример 4. Повышение продуцирования этанола термофилами.

С целью достижения целевых выходов этанола и производительности термофила продуцирование молочной кислоты было минимизировано посредством нокаута активности Ь-лактатдегидрогеназы (БЭН) путем инактивации гена 1Й11. Имело место два подхода, предпринятых для инактивации гена Ιάΐι: рекомбинация ДНК-маркера по типу одиночного кроссинговера в области 1Й11 хромосомы, предотвращающая ее транскрипцию, или рекомбинация по типу двойного кроссинговера гомологичных областей ДНК в гене 1Й11 с образованием мутации внутри области этого гена, делающая его нефункциональным.

В результате метода одиночного кроссинговера были быстро получены ЬИН-отрицательные мутанты, которые проявляли повышение продуцирования этанола по сравнению со штаммом дикого типа (ΝΟΙΜΒ 11955).

Улучшения продуцирования этанола мутантами БЭН.

ЬИН-отрицательные мутанты выращивали в культурах с подпиткой в разработанной минимальной среде для изверения повышения продуцирования этанола в результате нокаута активности БЭН. Изменения профиля метаболитов мутантов БЭН показано в табл. 5 в сравнении с оптимальным продуцированием этанола из штамма дикого типа. Профили продуцирования метаболитов двух мутантов БЭН показаны на фиг. 1 и 2. В табл. 6 показано повышение продуцирования этанола, вызванное нокаутом активности БЭН.

Таблица 5

Суммирование повышения продуцирования этанола, достигнутого мутантами по лактату

Организм	Источник углерода	Суммарный сахар	опвоо	мМ
пир	пакт	форм	ацет	этанол
Дикий тип	Глюкоза	603	3,7	19	322	111	55	123
1сНп35	Глюкоза	336	4,7	82	22	128	37	220
Ι8Π 58	Глюкоза	336	5,2	57	3	40	23	215

Таблица 6

Повышенное продуцирование этанола мутантами 1_ОН в культуре с подпиткой
Организм	Источник углерода	ОП600	Глюкоза в подпитке, г	Остаточная глюкоза, г	Лактат, г	Лактат, г/г клеток	Лактат, г/г глюкозы	Этанол, г	Этанол, г/г клеток	Этанол, г/г глюкоз ы
Дикий	Глюкоза	3.7	60.48	1.62	37.89	48.89	0.64	4.05	5.22	0.07
1с!Ь35	Глюкоза	4.7	60.48	17.80	1.98	1.36	0.05	10.12	6.95	0.24
ИН 58	Глюкоза	5.2	60,48	28,26	0,27	0,17	0.01	9,89	6,14	0,31

Мутанты БЭН продуцировали значительно более высокие выходы этанола, чем термофил дикого типа, демонстрируя успешное переключение пути метаболизма этих термофилов. Дополнительная оптимизация условий культивирования и состава сред для мутантных штаммов ЬИН будет приводить к повышенным выходам этанола.

Продуцирование этанола мутантами ЬИН в непрерывной культуре.

Наиболее стабильный из мутантов по лактату в результате одиночного кроссинговера выращивали в непрерывной культуре, чтобы оценить его долговременную стабильность в качестве продуцента этанола. Этот штамм культивировали в минимальной среде с глюкозой в качестве источника углерода. Стабильное состояние культуры наблюдали в течение примерно 290 ч до появления реверсии к продуцированию лактата.

Пример 5.

Мутант ТМ89, представляющий собой двойной кроссовер (пример 2), оценивали на продуцирование этанола, как изложено в примере 4. Результаты представлены в табл. 8, и они показывают, что этот мутант достигал значительных уровней продуцирования этанола (выше чем 200 мМ). Этот мутант также оценивали на продуцирование этанола с утилизацией глюкозы или ксилозы в качестве источника углерода. Результаты представлены в табл. 7.

- 8 015794

Таблица 7

Организм	Источник углерода	Суммарный сахар/мМ	Остаток сахара/ мМ	ОПеоо	Концентра ция/мМ
этанол	лактат	пируват	ацетат	формиат
ДТ	Глюкоза	794	130	5,3	46	279	7	69	9
ДТ	Ксилоза	953	122	8,5	22	187	9	75	5
ТМ89	Глюкоза	862	53	6,5	214	5	109	10	88
ТМ89	Ксилоза	1045	142	4,9	130	14*	24	36	39

Было показано, что глюкоза является лучшим источником углерода, но результаты четко показывают, что организмы способны к ферментации ксилозы без дополнительной модификации.

Стабильность мутанта, отрицательного по лактатдегидрогеназе, также тестировали при ряде условий в непрерывной культуре в течение периода 1500 ч. Результаты показаны на фиг. 6 и демонстрируют, что отрицательный фенотип по лактатдегидрогеназе остается стабильным, несмотря на значительное заражение культуры, и не основан на сохранении отбора по антибиотику. В процессе непрерывного культивирования степень разведения варьировала между 0,1 и 0,5 ч^-1, и культуру переключали с кислородных условий (подача воздуха) на бескислородные (подача Ν₂) условия без изменений в концентрации лактата. Более значимо варьировал рН культуры и падал до рН 4,4, что находится вне нормального интервала рН для роста организма дикого типа. Однако культура быстро восстанавливалась без изменения фенотипа, а именно концентрация лактата не менялась.

Микроорганизм, определенный здесь как ТМ89, и плазмида рИВ 190-Ий депонированы под номером по каталогу ΝΟΙΜΒ 41275 и 41276 соответственно. Хранилище представляет собой ΝΟΙΜΒ ЬИ, Регщ.15оп ВшИшд, СгаИйоие Е§1а1е, ВисккЬиш, АЬеИееи, АВ21 9ΥΑ, Ипйеб Кшдбош.

Таблица 8

Организм	Непрерывная	Воздух	Сахар	Биомасса	Использованный сахар	г/л	г/г сахара	г/г биомассы	г/л/ч
	Скорость подачи	тем		г/л	г/л	пакт	этанол	биомасса	лакт	этанол	лакт	этанол	лакт	этанол
Дикий тип	Ц=0,04	0,06	глюк 2%	0,68	20,00	11,25	1,56	0,03	0,56	0,08	16,50	2,29	0.45	0,06
Дикий тип	Ц=0,09	0,06	глюк 2%	1,02	20,00	7,29	1,79	0,05	0,36	0,09	7.13	1,75	0,66	0,16
1.6(1-21	Б=0,1	0,02	глюк 2%	0,51	10,00	0	3,15	0,05	0,00	0,32	0,00	6,18	0,00	0,32

- 9 015794

Перечень последовательностей <110> тмо ВтоТес йппГед <120? тНегторЫ 1Ή с μι сгоогдапт 5ΙΊ5 Тог ЕТКапо1 ргойцсттоп <130> 1Μ01150ΝΟ <150> 6В0511603.3 <151? 2005-06-07 <150> СВ0509068.3 <151> 2005-05-04 <160> 6 <170> ратептш νβΓ5ΐοη 3.3 <210> 1 <211> 6744 <212> ДНК <213> 6еоЬасП1и5 ТНегтодТисоБтОазтиь <400> 1

даа£Ссд£аа	СсаТддТсаТ	адсхдхххсс	гдХдХдаааг	ТдигаТссдс	ТсасааТТсс	60
асасаасаТа	сдадссддаа	дсаХааадгд	хааадссгдд	ддгдссТаас	дадТдадсТа	120
асТсасасга	аТгдсдТТдс	дсХсасхдсс	сдсхХХссад	гсдддааасс	ТдТсдгдсса	180
дсТдсабТаа	СдааТсддсс	аасдсдсддд	дададдсддт	ндсдгаТТд	ддсдсгсТТс	240
сдсЬТссссд	стсастдаст	сдсТдсдсгс	ддхсдххсдд	стдсддсдад	сддсатсадс	300
тсасгсааад	дсддтаатас	ддххахссас	адаахсаддд	датаасдсад	дааадаасат	360
дтдадсаааа	ддссадсааа	аддссаддаа	ссдхааааад	дссдсдггдс	тддсдтстгг	420
ссатаддстс	сдсссссстд	асдадсахса	сааааахсда	сдсТсаадбс	ададдТддсд	480
ааасссдаса	ддасТаТааа	даХассаддс	дхххсссссх	ддаадстссс	£сд£дсдс£с	540
ТссТдстссд	асссТдссдс	ххассддаха	ссХдХссдсс	1«с1ссс«	сдддаадсдТ	600
ддсдсс-стст	саТадсТсас	дсхдхаддха	хсхсадххсд	дТдГаддтсд	сссдсгссаа	660
дстдддсгдт	дТдсасдаас	сссссдтхса	дсссдассдс	тдсдсспат	ссдд(:аас1:а	720
гсдссстдад	гссаасссдд	хаадасасда	схгахсдсса	стддсадсад	ссассддтаа	780
саддатсадс	ададсдаддг	ахдхаддсдд	Хдехасадад	СТсТТдаадГ	ддгддссТаа	840
сТасддсТас	асТадаадда	садхахххдд	хахсхдсдсх	сТдсТдаадс	садТгассТТ	900
сддааааада	дтгддтадст	схгдагссдд	сааасааасс	ассдсгддта	дсддгддгхт	960
ггггдгггдс	аадсадсада	ХХасдсдсад	ааааааадда	ТсТсаадаад	атссмгдат	1020
сТТТТсгасд	дддТсТдасд	схсадхддаа	сдаааасХса	сдгтааддда	££££дд£са£	1080
дадатгатса	ааааддаТсТ	ХсассХадаХ	ссххххааах	ТаааааТдаа	дТТТгаааТс	1140
аа£с1ааадт	а£ата£дадт	ааасххддхс	хдасадххас	сааТдсТТаа	ТсадТдаддс	1200
ассТабссса	дсдасстдсс	хагххсдххс	аХссаХадХХ	дссТдасГсс	ссдГсдТдТа	1260

- 10 015794

дахаасхасд	ахасдддадд	дсххассахс	хддссссадх	дсхдсаахда	Хассдсдада	1320
сссасдсЕса	ссддсЕссад	аЕЕЕаЕсадс	ааХааассад	ссадссддаа	дддссдадсд	1380
садаадхддх	ссЕдсаасЕЕ	ЕаЕссдссЕс	сахссадхсх	аххааххдхх	дссдддаадс	1440
ХададХаадХ	адЕЕсдссад	ЕЕааЕадЕЕЕ	дсдсаасдхх	дхгдссаХЕд	сХасаддсаХ	1500
сдгддхдхса	сдсЕсдЕсдЕ	ХХддХаХддс	ХХсаХХсадс	ХссддХХссс	аасдахсаад	1560
дсдадгхаса	ЕдаЕссссса	хдххдхдсаа	аааадсддхх	адсхссххсд	дхссхссдах	1620
сдххдхсада	адхаадххдд	ссдсадхдхх	ахсасхсахд	дххахддсад	сасхдсахаа	1680
ХХсХсХХасХ	дХсаЕдссаЕ	ссдхаадахд	схгххсхдхд	асХддХдадХ	асХсаассаа	1740
дХсаЕХсХда	дааЕадЕдЕа	Хдсддсдасс	дадххдсхсх	ХдсссддсдХ	сааХасддда	1800
хаахассдсд	ссасаЕадса	даасХХХааа	адХдсХсаХс	аХХддаааас	дХХсХХсддд	1860
дсдаааасЕс	ЕсааддаЕсЕ	хассдсхдхг	дадаХссадЕ	хсдахдхаас	ссасЕсдхдс	1920
асссаасЕда	ЕсЕЕсадсаЕ	сххххасххх	сассадсдХХ	хсгдддхдад	сааааасадд	1980
ааддсааааЕ	дссдсааааа	адддаахаад	ддсдасасдд	ааахдххдаа	хасхсахасх	2040
СХХССХХХХХ	саахаххахх	даадсаххха	хсадддххах	хдхсхсахда	дсддахасах	2100
ахххдаахдх	аЕЕЕадаааа	ахааасааах	аддддххссд	сдсасаХХХс	сссдаааадх	2160
дссассЕдас	дЕсЕаадааа	ссаххаххах	саЕдасахха	ассХаХаааа	аХаддсдХаХ	2220
сасдаддссс	ХХХсдХсХсд	сдсдХХЕсдд	ЕдасдасддХ	даааассХсХ	дасасаХдса	2280
дсЕсссддад	асддЕсасад	сххдхсхдха	адсддахдсс	дддадсадас	аадсссдхса	2340
дддсдсдхса	дсдддХдХХд	дсдддХдХсд	дддсХддсХХ	аасХаХдсдд	саХсададса	2400
даххдхасхд	ададЕдсасс	аХаХдсддХд	ХдаааХассд	сасадахдсд	Хааддадааа	2460
аХассдсагс	аддсдссаЕЕ	сдссаХХсад	дсхдсдсаас	ХдХХдддаад	ддсдахсддх	2520
дсдддссХсХ	ХсдсХаХХас	дссадсХддс	даааддддда	ХдХдсХдсаа	ддсдаХХаад	2580
ххдддгаасд	ссадддЕЕЕЕ	сссадХсасд	асдххдхааа	асдасддсса	дЕдссаадсх	2640
ХдсаХдссЕд	саддЕсдасЕ	схадаааахс	аахсхсххгх	хссааадххх	дххххххааа	2700
ХЕЕадсхдхс	ЕсааЕаЕдЕЕ	ХасддХсада	дссасдХХса	ссасдсХХса	асХсаааасс	2760
СЕдХЕХХХХС	аЕаЕдсЕсдд	ддаахххахс	ХХдХадссаХ	аасадххсхх	дасдаххааа	2820
сасаЕЕЕЕЕЕ	ссЕЕдсадЕЕ	ХЕссаЕсасд	сахаддсаса	асассхааах	дсахдхдадд	2880
ддЕЕЕдсЕса	хсаххахдаа	схдххдсаха	адсаахаххх	ХдсХХдссаХ	ахсдххсдда	2940
аааЕааЕЕЕа	ЕаасЕЕЕссЕ	сааааааХсд	ЕЕХХЕдХХСХ	ссхддахсса	дххдсхсааа	3000
ааааЕстсдд	хсадахдхха	схадсаасхс	ахххасаада	асадсахсхс	Ессхсдхххх	3060
ЕсЕЕдЕассЕ	дЕЕЕЕЕЕдЕд	аХХсааХааХ	ХЕсХХХдаса	сдЕЕсдХХдХ	аахсаахахх	3120
ЕЕЕаЕсаЕЕЕ	ХХсаааХсаХ	ааХХХЕсасд	хдххсдсхса	ХддХсааХаЕ	сахсаххсдх	3180
ХсХасХХХХХ	сдсХсХсХХХ	даххахдааа	ххдсахдссх	хххадхссад	схдахххсас	3240

- 11 015794

бббббдсабб	сбасааасгд	сабаасбсаб	абдбааабсд	сбссббббба	ддбддсасаа	3300
абдбдаддса	ббббсдсбсб	ббссддсаас	сасббссаад	бааадбабаа	сасасбабас	3360
бббабаббса	бааадбдбдб	дсбсбдсдад	дсбдбсддса	дбдссдасса	ааассабааа	3420
ассбббаада	ссбббсбббб	ббббасдада	ааааадааас	ааааааассб	дсссбсбдсс	3480
ассбсадсаа	аддддддббб	бдсбсбсдбд	сбсдбббааа	аабсадсаад	ддасаддбад	3540
баббббббда	даадабсасб	саааааагсг	ссассбббаа	асссббдсса	абббббаббб	3600
бдбссдбббб	дбсбадсбба	ссдааадсса	дасбсадсаа	даабаааабб	бббаббдбсб	3660
ббсддббббс	бадбдбаасд	дасаааасса	сбсаааабаа	аааадабаса	адададдбсб	3720
сбсдбабсбб	ббаббсадса	агсдсдсссд	аббдсбдаас	адаббаабаа	бадаббббад	3780
сбббббаббб	дббдаааааа	дсбаабсааа	ббдббдбсдд	дабсааббас	бдсааадбсб	3840
сдббсабссс	ассасбдабс	ббббаабдаб	дбапддддб	дсаааабдсс	саааддсбба	3900
абабдббдаб	абааббсабс	ааббсссбсб	асббсаабдс	ддсаасбадс	адбассадса	3960
абааасдасб	ссдсассбдб	асааассддб	даабсаббас	басдададсд	ссадссббса	4020
бсасббдссб	сссабадабд	аабссдаасс	бсаббасаса	ббадаасбдс	даабссабсб	4080
бсабддбдаа	ссааадбдаа	ассбадббба	бсдсаабааа	аассбабасб	сбббббааба	4140
бссссдасбд	дсаабдссдд	дагадасбдб	аасаббсбса	сдсабааааб	ссссбббсаб	4200
бббсбаабдб	ааабсбабба	ссббаббабб	ааббсааббс	дсбсабаабб	ΗΗΐεεΐΐΐΐΐ	4260
сббаббасдс	аааабддссс	дабббаадса	сасссбббаб	бссдббаабд	сдссабдаса	4320
дссабдабаа	ббасбаабас	баддадаадб	баабааагас	дбаассааса	гдаббаасаа	4380
ббаббададд	бсабсдббса	ааабддбабд	сдббббдаса	сабссасбаб	абабссдбдб	4440
сдббсбдбсс	асбссбдааб	сссаббссад	аааббсбсба	дсдаббссад	аадбббсбса	4500
дадбсддааа	дббдассада	саббасдаас	бддсасадат	ддбсабаасс	бдааддаада	4560
бсбдаббдсб	баасбдсббс	адббаадасе	даадсдсбсд	бсдбабааса	дабдсдабда	4620
бдсадассаа	бсаасабддс	ассбдссабб	дсбассбдба	садбсаадда	бддбадаааб	4680
дггдгсддбс	сббдсасасд	аабаббасдс	сабббдссбд	сабаббсааа	садсбсббст	4740
асдабааддд	сасааабсдс	абсдбддаас	дбббдддсбб	сбассдаббб	адсадбббда	4800
гасасбббсх	сбаадгагсс	ассгдаабса	гааагсддса	ааагададаа	аааббдасса	4860
бдбдбаадсд	дссаабсбда	ббссассбда	дабдсабааб	сбадбадааб	сбсббсдсба	4920
бсааааббса	сббссассбб	ссасбсассд	дббдбссабб	сабддсбдаа	сбсбдсббсс	4980
бсбдббдаса	бдасасасаб	сабсбсааба	бссдаабадд	дсссабсадб	сбдасдасса	5040
адададссаб	ааасассааб	адссббааса	бсабссссаб	абббахссаа	баббсдбЕсс	5100
ббаабббсаб	даасаабсбб	саббсбббсб	бсбсбадбса	ббаббаббдд	бссаббсасб	5160
аббсбсаббс	ссббббсада	бааббббада	бббдсббббс	бааабаадаа	бабггддада	5220

- 12 015794

дсассдНсб	1а£±садс£а	ХГааТаасСс	дтстгсскаа	дсагссггса	агсстнгаа	5280
1аасаа11а1	адсабсгаа!	сНсаасааа	с1ддсссд«	1д££даасса	стстааг.а	5340
ааа£ааГ1:Г£	1ссд1гссса	анссасан	дсаа1аа!ад	аааагссабс	Нсагсддсг	5400
ГТТГсдГсаГ	сагс1д£агд	аа£сааа£сд	ссНсНсТд	ТдГсаГсаад	дИТГааНП	5460
пагдганг	с66£1аасаа	ассассаГад	даданаасс	«ггасддгд	гааасстгсс	5520
тссааагсад	асааасдттг	салаг 1. с г τι:	гснсатсаг	сддссасааа	атссдтаксс	5580
ГНасаддаГ	а£££1дсад£	«сдгсаан	дссдагтдба	гагссда£1г	агаггкатгг	5640
иссддбсдаа	гсантдаас	шгасаииг	дда£са1:адг	стаангсаг	гдссппгс	5700
сааааНдаа	гссандш	ггдаГГсасд	гадтлнггд	та1..1с1.1.ааа	атааднддс	5760
СссасасаГа	ссааГасаСд	са£д£дс£да	тгагаадаа!	та-ссгиап	а££1аНд£с	5820
аснссдггд	сасдсаГааа	ассаасаада	ггкггагсаа	£Г«1МаГа	НдсатсаГГ	5880
сддсдааагс	с£Гдадсса£	аТсГдасааа	«сИаШа	аГ1:с1:1.сдсс	аТсаГаааса	5940
тггаасгд	Т1аа£д£дад	ааасаассаа	сдаасСдПд	дсННдШ	аа£аас£1са	6000
дсаасаассГ	ГГГдГдасГд	аа£дсса1дг	г (.саПдстс	1сс1.ссадгг	дсасандда	6060
сааадсс£дд	агггасаааа	ссасасГсда	гасааснгс	гсгсдссгд!	КГсасдагн	6120
тдгггатасг	стаанагггс	адсасаа1с1:	ггга.сг.сгтг	садссИИ!	ааансаада	6180
абагдсадаа	дггсааадга	агсаасана	дсдаННСГ	гтгсгстсса	Еддтстсас!:	6240
ШссасШ	игдисндгс	сасГаааасс	сггд,н ι.ττι	сатс£даа£а	аа£дсгас!а	6300
1гаддасаса	баагаггааа	адааассссс	аГсХаНТад	Г1а1«дг£1	адГсасСГаГ	6360
аастмааса	дагддддГгг	ггсгдгдсаа	ссааНзНаа	дддГТНхаа	1асб«аааа	6420
сасагасага	ссаасасггс	аасдсассИТ	ТсадсаасТа	аааТаааааГ	дасдмант	6480
сиа1а£д£а£	саадатаада	аадаасаадх	Гсаааасса!	сааааааада	сассггггса	6540
ддгдсМГИ	иг а. г. г. Нага	аасгсаггсс	ссдагсгсда	с£1сдг£с££	£11г1асс£с	6600
£сдд£6а£да	дМадгксаа	аг1сдггс1£	Г£Тадд£ГС£	аааТсдгдгг	ГНсГГддаа	6660
Нд£дс£дН	ИаПсШа	ссНд-ЕсЬас	ааассссгга	аааасдШб	1аааддсГ1Г	6720
£аадссд£сг	д£асдГ£сс£	Саад				6744

<210> 2 <211> 7673 <212> ДНК <213> СеоЬаст11и5 1Негтод1исо514а51и5 дааМсдбаа <400>

гааадсссдд

бсаиддтса!

асасаасаТа

дс£сас£дсс

1д££а£ссдс тсасааНсс

120 асГсасаШа

ГдааГсддсс сдсгггссад

180

1ГдсдСаГ£д ддсдсиспс дсСдса££аа аасдсдсддд дададдсддб

240

- 13 015794

сдсххссхсд	сХсасХдасХ	сдсхдсдсхс	ддГсдгссдд	схдсддсдад	сддХаХсадс	300
хсасхсааад	дсддхаахас	ддххахссас	адааюаддд	дахаасдсад	дааадаасах	360
дхдадсаааа	ддссадсааа	аддссаддаа	ссдХааааад	дссдсдХХдс	хддедххххх	420
ссаХаддсХс	сдссссссХд	асдадсаХса	сааааагсда	сдсХсаадХс	ададдХддсд	480
ааасссдаса	ддасхахааа	даХассаддс	дГГХсссссГ	ддаадсХссс	ХсдХдсдсХс	540
ХссХдХХссд	асссхдссдс	ХХассддаха	ссгдхссдсс	ХХХСХСССХХ	едддаадедх	600
ддсдсхххсх	саХадсХсас	деХдХаддХа	Ис1:сад1:1сд	дхдхаддхсд	ххсдсхссаа	660
дсхдддсхдх	дХдсасдаас	сссссдххса	дсссдассдс	хдсдссххах	ссддхаасха	720
ХсдХсХХдад	Хссаасссдд	хаадасасда	сгхатхдсса	схддсадсад	ссасхддхаа	780
саддаххадс	ададсдаддх	ахдхаддедд	тдсгасадад	ххеххдаадх	ддхддссхаа	840
схасддсхас	асхадаадда	садХаХХХдд	ГаГсгдсдс!	сХдсХдаадс	садХХассХХ	900
сддааааада	дххддхадсх	сХХдаХссдд	сааасааасс	ассдсХддХа	деддХддХХХ	960
ххххдхххдс	аадсадсада	ХХасдсдсад	ааааааадда	ХсХсаадаад	аХссХХХдаХ	1020
сХХХХсХасд	дддХсХдасд	сХсадХддаа	сдаааасгса	едХХааддда	ххххддхсах	1080
дадаХХаХса	ааааддаХсХ	ХсассХадах	ссг^ааах	хааааахдаа	дххххааахс	1140
аахсхааадх	аХаХаХдадХ	аааеХХддХе	тдасад^гас	сааХдсХХаа	хсадхдаддс	1200
НСС иЗ и С иСа	деда ис ид и с	хахххедххе	а иССЗиад и и	дссидасисс	ссдисд ид иа	1 1 ел и νν
даГаасГасд	аХаедддадд	дсХХассаХс	хддссссадх	дсТдсааТда	Хассдсдада	1320
сссасдсТса	ссддсХссад	аХХХаХсадс	ааХааассад	ссадссддаа	дддссдадсд	1380
садаадГддГ	ссХдсаасХХ	ХаХссдссХс	сахссадхсх	атгааггдгг	дссдддаадс	1440
•СададГаадГ	адХХсдссад	ххаахадххх	дсдсаасдхх	дгидссаегд	схасаддсах	1500
сдгддхд^са	сдсХсдХсдХ	ХХддХаХддс	ХХсаХХсадс	тссддгиссс	аасдаХсаад	1560
дсдадТТаса	ХдаХссссса	хдххдхдсаа	аааадеддхх	адсгссггсд	дхссхссдах	1620
сдътдгсада	адХаадХХдд	ссдсадхдхх	аХсасХсаХд	дТГаГддсад	сасхдсахаа	1680
ГГстситасХ	дХсаХдссаХ	ссдХаадаХд	еХХХХеХдХд	аехддгдадг	асХсаассаа	1740
д1сагхсхда	даахадхдха	хдсддсдасс	дадххдехех	гдсссддсдг	саахасддда	1800
Гаа1:ассдсд	ссасахадса	дааеХХХааа	адХдсХсаХс	аххддаааас	дХХеХХеддд	1860
дсдаааасТс	ХсааддаХсХ	хассдсхдхх	дадахссадх	ТсдаТдЕаас	ссасхсдхдс	1920
асссаасЕда	хсххсадсах	еххххаеххх	сассадсдХХ	гегдддгдад	сааааасадд	1980
ааддсааааг	дссдсааааа	адддаахаад	ддсдасасдд	ааа1дТ:Г:даа	хасхсахасх	2040
σιχαζΐΐΐΐΐ	саахаххахх	даадсаххха	ХсадддХХаХ	гдгсгсагда	дсддаХасаХ	2100
аШдааГдГ	ахххадаааа	аХааасаааХ	аддддТзИссд	сдсасатс	сссдаааадх	2160
дссасс1:дас	дхсхаадааа	ссаххаххах	сагдасахга	ассгаиаааа	ахаддедхах	2220

- 14 015794

сасдаддссс	хххсдхсхсд	сдсдхххсдд	хдахдасддх	даааассхсх	дасасахдса	2280
дсХсссддад	асддхсасад	сххдхсхдха	адсддахдсс	дддадсадас	аадсссдхса	2340
дддсдсдхса	дсдддхдххд	дсдддхдхсд	дддсхддсхх	аасХаХдсдд	саХсададса	2400
даххдхасхд	ададХдсасс	ахахдсддхд	хдаааХассд	сасадаХдсд	Хааддадааа	2460
ахассдсахс	аддсдссахх	сдссаххсад	дсхдсдсаас	хдххдддаад	ддсдахсддх	2520
дсдддссХсХ	ХсдсХаНас	дссадсхддс	даааддддда	ХдгдсХдсаа	ддсдаХХаад	2580
ххдддхаасд	ссадддхххх	сссадхсасд	асдххдхааа	асдасддсса	дхдссаадсх	2640
ХддХассдад	схсасхадхс	асддссдсса	дХдХдсХдда	аххсдсссхх	ддахссхххд	2700
сссххахдаа	ссааддааха	дсадаХдад!	хадхаххдах	хдахдхааах	аадаахаадд	2760
сададддсда	хдхдахддах	ХХаааХсасд	даааадХаХХ	сдсдссдаад	ссдахдааха	2820
хххддсххдд	адаххахсаа	дандссаад	асдссдаххх	ддхддТдаХХ	хдтдсадддд	2880
схаассаааа	дссдддадаа	асаадасхдд	ахсххдххда	сааааахахх	аахахсххса	2940
ааасдаХХдХ	сдаХХсХдХд	аХдаааХссд	даХХХдаХдд	сдхххххсхх	дХддсаасда	3000
асссадХдда	хаххххаасд	ХаХдсХасХХ	ддаааТГГад	сдддххассд	ааададсддд	3060
хаахсддсхс	аддаасдахх	сххдахасад	саадаххссд	сххсххдсха	адхдаахахх	3120
ххсаадхддс	хссдассаах	дхасахдсдх	аХаХХаХХдд	сдадсахддд	дахасададс	3180
ХдссхдХХХд	дадссахдсд	даааххддаа	дсаХХссадХ	хдадсаааха	ХХдахдсааа	3240
асдахаасха	хадаааадад	дахххадаса	аХаХсХХХдХ	хаахдххсдх	дахдсддсах	3300
ахсааахсах	хдадаааааа	ддддсаасдх	аххасддсах	хдсаахддда	ххадхссдха	3360
ХсасХсдХдс	ХаХХХХдсас	ааХдааааХд	ссаХсХХаас	сдхххсхдсх	сахххддасд	3420
дссааХаХдд	сдаасдааах	дхххахаххд	дсдхдссхдс	саХХаХсаас	сдааасддха	3480
ХХсдХдаадХ	даХддааХХд	асдсХаааХд	ааасадааса	адддсдаахх	сХдсадаХаХ	3540
ссахсасасх	ддсддссдсх	сдадсаХдса	дсахдссхдс	аддХсдасХс	ХадааааХса	3600
ахсхсххххх	ссааадХХХд	ХХХХХХаааХ	ХХадсХдХсХ	сааХаХдХХХ	асддХсадад	3660
ссасдххсас	сасдсххсаа	сХсаааассс	ХдХХНХХСа	хахдсхсддд	даахххатсх	3720
ХдХадссаХа	асадххсххд	асдаХХааас	асаххххххс	сххдсадххх	Хссахсасдс	3780
аХаддсасаа	сассХаааХд	саХдХдаддд	дхххдсхсах	саХХаХдаас	хдххдсахаа	3840
дсаахахххх	дсххдссаха	ХсдХХсддаа	ааХааХХХаХ	аасхххссхс	ааааааХсдХ	3900
1Хххд1Лс.х<.	схддахссад	ххдсхсаааа	ааахсхсддх	садахдххас	хадсаасхса	3960
хххасаадаа	садсаХсХХХ	ссхсдхххгх	с1Лдтасс1:д	ХХХХХХдХда	«саахаахх	4020
ХсХХХдасас	дххсдххдха	ахсаахаххх	ххахсахххх	хсааахсаха	аХХХХсасдХ	4080
дХХсдсХса!	ддХсааХаХс	аХсаХХсдХХ	схасхххххс	дсХсХсХХХд	аххахдааах	4140
ХдсаХдссСХ	ХХадХссадс	ХдаХХХсасХ	ХХХХдсаХХс	ХасааасХдс	аХаасХсаХа	4200

- 15 015794

ЕдЕаааЕсдс	гссгш.тад	дЕддсасааа	ЕдЕдаддсаЕ	ЕЕЕСдсЕСЕЕ	Ессддсаасс	4260
асЕЕссаадЕ	ааадЕаЕаас	асасЕаЕасЕ	ЕЕаЕаЕЕсаЕ	ааадЕдЕдЕд	СЕсЕдсдадд	4320
сЕдЕсддсад	Едссдассаа	аассагаааа	ссЕЕЕаадас	СЕЕЕСЕЕЕЕЕ	ЕЕЕасдадаа	4380
аааадаааса	аааааассЕд	сссЕсЕдсса	ссЕсадсааа	ддддддич	дсЕсЕсдЕдс	4440
ЕсдЕЕЕаааа	аЕсадсаадд	дасаддЕадЕ	аЕЕЕЕЕЕдад	аадагсасЕс	ааааааЕсЕс	4500
сассЕЕЕааа	сссЕЕдссаа	ЕЕЕСЕаЕЕЕЕ	дЕссдЕЕЕЕд	ЕсЕадсЕЕас	сдааадссад	4560
асЕсадсаад	ааЕааааЕЕЕ	ЕЕаЕЕдЕсЕЕ	ЕсддЕЕЕЕсЕ	адЕдЕаасдд	асаааассас	4620
ЕсааааЕааа	ааадаЕасаа	дададдЕсЕс	ЕсдЕаЕсЕЕЕ	ЕаЕЕсадсаа	Есдсдсссда	4680
ЕЕдсЕдааса	даЕЕааЕааЕ	адаЕЕЕЕадс	ЕЕЕЕЕЭЕЕЕд	ЕЕдаааааад	сЕааЕсаааЕ	4740
ЕдЕЕдЕсддд	аЕсааЕЕасЕ	дсааадЕсЕс	дЕЕсаЕссса	ссасЕдаЕсЕ	ЕЕЕааЕдаЕд	4800
ЕаЕЕддддЕд	сааааЕдссс	аааддсЕЕаа	ЕаЕдЕгдаЕа	ЕааЕЕсаЕса	аЕЕсссЕсЕа	4860
сЕЕсааЕдсд	дсаасЕадса	дЕассадсаа	ЕааасдасЕс	сдсассЕдЕа	сааассддЕд	4920
ааЕсаЕЕасЕ	асдададсдс	садссЕЕсаЕ	сасЕЕдссЕс	ссаЕадаЕда	аЕссдаассЕ	4980
саЕЕасаса!	ЕадаасЕдсд	ааЕссаЕсЕЕ	саЕддЕдаас	сааадЕдааа	ссЕадЕЕЕаЕ	5040
сдсааЕаааа	ассЕаЕасЕс	ЕЕСЕЕааЕаЕ	ссссдасЕдд	сааЕдссддд	аЕадасЕдЕа	5100
асаЕЕСЕсас	дсаЕааааЕс	сссЕЕЕсаЕЕ	ЕЕсЕааЕдЕа	ааЕсЕаЕЕас	сЕЕаЕЕаЕЕа	5160
4-4-4--. -4-4-4-4.						гээл
агЕсааЕЕсд	СΐΟαΐααιΐα	ЗЕССЕЕЕЕЕС	ЕЕЗЕЕасдса	ЗаасууСССу	а***аауСаС	Л. 4,ν
асссЕЕЕаЕЕ	ссдЕЕааЕдс	дссаЕдасад	ссаЕдаЕааЕ	ЕасЕааЕасЕ	аддадаадЕЕ	5280
ааЕаааеасд	ЕаассаасаЕ	даггаасааг	ЕаЕЕададдЕ	саЕсдЕЕсаа	ааЕддЕаЕдс	5340
дЕЕЕЕдасас	аСссасЕаЕа	ЕаЕссдЕдЕс	дЕЕсЕдЕсса	сЕссЕдааЕс	ссаЕЕссада	5400
ааЕЕсЕсЕад	сдаеЕссада	адЕЕЕсЕсад	адЕсддааад	ЕЕдассадас	аЕЕасдаасЕ	5460
ддсасадагд	дЕсаЕаассЕ	дааддаадаЕ	сЕдаЕЕдсЕЕ	аасЕдсЕЕса	дЕЕаадассд	5520
аадсдсЕсдЕ	сдЕаЕаасад	аЕдсдаЕдаЕ	дсадассааЕ	саасаЕддса	ссЕдссаЕЕд	5580
сгассЕдЕас	адгсааддаЕ	ддЕадаааЕд	ЕЕдЕсддгсс	ЕЕдсасасда	аЕаЕЕасдсс	5640
аЕЕЕдссЕдс	аЕаЕЕсааас	адсЕСЕЕсЕа	сдаЕаадддс	асаааЕсдса	ЕсдЕддаасд	5700
ЕЕЕдддсЕЕс	ЕассдаЕЕЕа	дсадЕЕЕдаЕ	асасЕЕЕсЕс	ЕаадЕаЕсса	ссЕдааЕсаЕ	5760
аааЕсддсаа	ааЕададааа	ааЕЕдассаЕ	дЕдЕаадсдд	ссааЕсЕдаЕ	ЕссассЕдад	5820
аЕдсаЕааЕс	ЕадЕадааЕс	ЕсЕЕсдсЕаЕ	сааааЕЕсас	ЕЕССЭССЕЕС	сасЕсассдд	5880
ЕЕдЕссаЕЕс	аЕддсЕдаас	ЕсЕдсЕЕссЕ	сЕдЕЕдасаЕ	дасасасаЕс	аЕсЕсааЕаЕ	5940
ссдаатаддд	сссатсадЕс	Едасдассаа	дададссага	аасассааЕа	дссЕЕаасаЕ	6000
саЕссссаЕа	ЕЕЕаЕссааЕ	аЕЕсдЕЕссЕ	ЕааЕЕЕсаЕд	аасааЕСЕЕС	ЭЕЕсЕЕЕСЕЕ	6060
сЕсЕадЕсаЕ	ЕаЕЕаЕЕддЕ	ссаЕЕсасЕа	ЕЕсЕсаЕЕсс	сЕЕЕЕсадаЕ	ааЕЕЕЕадаЕ	6120
ЕЕдсЕЕЕЕсЕ	аааЕаадааЕ	аЕЕЕддадад	сассдЕЕсЕЕ	аЕЕсадсЕаЕ	ЕааЕаасЕсд	6180

- 16 015794

1сисс1аад	сагссисаа	Гсстл-ссаа!	аасааНата	дса1с1аа1с	Исаасааас	6240
гддсссдш	дХТдаасгас	гсХ11аа1аа	аагааТТИТ	ссдИсссаа	ПссасаГТд	6300
саатаагада	ааатссагст	ТсаГсддсИ	111:сд1са1с	а1с1д1атда	аисааатсдс	6360
сгтсггсгдг	дгсагсаадд	ΐΐΐββΐϊΐΐΐ	татдтатггс	гтгтаасааа	ссасса1адд	6420
адаттаасст	ггтасддтдт	ааассТТссТ	ссаааГсада	сааасдТТТс	аааггснт	6480
сС1:са1са1с	ддгсагаааа	Гссд1а1:сс1	ттасаддата	гтидсадн	Ьсдтсааттд	6540
ссдагтдта!	аГссдаПГа	ΓθϊΙΐαΐΐΐΐ	1сдд1сдааг	саИтдаасг	£гтаса1£тд	6600
датсатадгс	таатсатт	дссСГТГТсс	ааааТГдаа!	ссамдгш	ГдаТГСасдГ	6660
адтггтсгдг	аТ1сГ1аааа	гаадГ£дд1:1	ссасаса!ас	сааТасабдс	аГдТдсЕдаГ	6720
1а1аадаа11:	акхпана	Шатгдюа	сттссддтдс	асдсатаааа	ссаасаада!	6780
ттттахгаат	«инатат	т.дсатсаТ1с	ддсдаааГсс	ТТдадссаГа	1с£дасааас	6840
Гс11аГ11аа	Пстгсдсса	ссагаааса!	ииаасгд!	1аа1д1дада	аасаассаас	6900
даастдттдд	сттттдттта	а1аас61сад	саасаасс«	ттдтдастда	агдссагдгг	6960
1са11дс1с1	сс!ссадГ1д	сасаИддас	ааадсстдда	Шасаааас	сасасгсдат	7020
асаасТГГсГ	гтсдсстдтг	гсасдаг«т	дГ.СГаГасГс	г.аагагггса	дсасаатси	7080
гтасгстттс	адссттттта	ааггсаадаа	гатдсадаад	(ГсааадГаа	гсаасаттад	7140
сдаттттстт	ГтсСсгссат	ддгстсастт	ттссасгстг	тдтсхсдгсс	асгаааассс	7200
гтдапггтс	атс£даа1аа	атдстастат	1аддасаса1	аатахтаааа	дааассссса	7260
тсгагсгадг	гашдгиа	дтсасгтата	асШаасад	а£ддддг«1	Тс’ЬдГдсаас	7320
сааттттаад	ддттттсаат	астттаааас	аса!асатас	саасасттса	асдсассттг	7380
садсаас!аа	ааТаааааТд	асдггаиггс	1а1а1д1:а1с	аадатаадаа	адаасаадтт	7440
саааассагс	ааааааадас	ассттттсад	д1дст1««	1ат11га1аа	астсаттссс	7500
1да1сСсдас	11сдГ1с(«	1Шасс1ст	сддтгатдад	1тадттсааа	Т1сд11с1г1	7560
ттаддггеса	аатсдсдгт!	Г1ст1ддаат	гдгдстдиг	татссттгас	стгдгс±аса	7620
аасссссгаа	ааасдштг	аааддсгт	аадссдгсгд	гасдтгссиг	аад	7673

<210> 3 <211> 29 <212> ДНК <213? искусственная <220?

<223> олигонуклеотидный лраймер <400>3 ддааггссст гагдаассаа ддаа£адса <2104 <211>31 <212> ДНК <213> искусственная <22О>

<223? олигонуклеотидный праймер <400>4 дсддссдсас ссдсисгтгс ддгаасссдс ΐ <210>5 <211>31 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> олигонуклеотидный праймер <400> 5

дсддссдс!Т дс!аад£даа 1а£тсаад т	31
<210 6 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная <220> <223> олигонуклеотидный праймер <400 6 сгдсадсд1с ааП.ссаТса сИсасда	28

- 17 015794

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Термофильный микроорганизм, модифицированный для возможности повышенного продуцирования этанола, где модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа, где нативный ген лактатдегидрогеназы или его участок делетирован и где этот микроорганизм представляет собой вид ОеоЬасШик.
2. Микроорганизм по п.1, где этот микроорганизм не содержит систему рестрикции.
3. Микроорганизм по любому из пп.1, 2, где этот микроорганизм представляет собой ОеоЬасШик 1йегтод1исо81ба8Ш8.
4. Микроорганизм по любому из пп.1-3, где этот микроорганизм представляет собой спорообразующий микроорганизм.
5. Микроорганизм по любому из пп.1-4, где этот микроорганизм способен к метаболизму целлобиозы, и/или крахмала, или их олигомера.
6. Микроорганизм по любому из пп.1-5, где этот микроорганизм растет при температуре 40-85°С, предпочтительно 50-70°С.
7. Микроорганизм по любому из пп.1-6, где этот микроорганизм содержит ненативный ген пируватдекарбоксилазы.
8. Микроорганизм по любому из пп.1-7, где этот микроорганизм содержит ненативный ген алкогольдегидрогеназы.
9. Микроорганизм по любому из пп.1-8, где этот микроорганизм не содержит интегративный элемент в гене лактатдегидрогеназы.
10. ОеоЬасШш 1йегтод1исо81ба8Ш8, обеспечивающий повышенное продуцирование этанола, депонированный в ΝΟΙΜΒ под номером 41275.
11. Способ продуцирования этанола, при котором культивируют микроорганизм по любому из пп.1-10 в подходящих условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахара или его олигомера.
12. Способ по п.11, где этот способ осуществляют при температуре между 40 и 70°С.
13. Способ по п.11, где температура составляет от 52 до 65°С.
14. Способ по любому из пп.11-13, где микроорганизм поддерживают в культуре при рН между 4 и 7,5.
15. Плазмида для делетирования нативного гена лактатдегидрогеназы, определенная здесь как 8ЕО ΙΌ N0: 2.
16. Термофильный микроорганизм, содержащий плазмиду по п.15.
17. Корм для животных, содержащий микроорганизм по любому из пп.1-10.