KR20080012934A

KR20080012934A - 에탄올 생산을 위해 락테이트 디하이드로게나제 유전자가비활성화된 호열성 미생물

Info

Publication number: KR20080012934A
Application number: KR1020077028208A
Authority: KR
Inventors: 앤소니 에킨슨; 로저 크립스; 컬스틴 엘리; 브라이언 루드; 말틴 토드; 앤 톰슨
Original assignee: 티엠오 리뉴어블스 리미티드
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2008-02-12
Also published as: CA2607052A1; AU2006243052A1; NO20076123L; EP1880004A1; EA015794B1; AU2006243052B2; EA200702153A1; MX2007013673A; JP2008539710A; US20090042265A1; WO2006117536A1; NZ563043A; BRPI0610988A2; JP2012040016A

Abstract

야생형 미생물의 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 비활성화시키기 위해 개조하여, 돌연변이 호열성 미생물을 제조한다. 상기 돌연변이 미생물은 기질로서 C₃, C₅ 또는 C₆ 당을 사용하여 에탄올을 생산하는데 사용된다.

호열성 미생물, 에탄올, 락테이트 디하이드로게나제

Description

에탄올 생산을 위해 락테이트 디하이드로게나제 유전자가 비활성화된 호열성 미생물{THERMOPHILIC MICROORGANISMS WITH INACTIVATED LACTATE DEHYDROGENASE GENE(LDH) FOR ETHANOL PRODUCTION}

본 발명은 세균성 발효 생성물로서 에탄올의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 호열성 세균에 의한 에탄올 생산에 관한 것이다.

세균의 물질대사는 세균의 종과 환경 조건에 의존하여 다양한 다른 메커니즘을 통해 일어날 수 있다. 모든 병원균들을 포함하여 종속 영양 세균은 가장 일반적으로 산화되는 화합물인 탄수화물(특히 글루코스), 지방 및 단백질과 같은 유기 화합물의 산화로부터 에너지를 얻는다. 세균에 의한 이들 유기 화합물의 생물학적 산화는 화학 에너지원으로서 ATP 합성을 야기한다. 또한, 그러한 공정은 생합성 반응을 위해 세균성 세포에 의해 요구되는 보다 단순한 유기 화합물(전구체 분자)의 생성을 가능하게 한다. 세균이 적절한 기질들을 대사하는 일반적인 공정은 당분해로서, 글루코스를 피루베이트로 전환하여 ATP를 생성하는 연속 반응이다. 대사 에너지의 생성에서 피루베이트의 운명은 미생물과 환경 조건에 의존하여 다양하다. 피 루베이트의 원칙적인 반응에는 세 가지가 있다.

먼저, 호기성 조건하에서, 많은 미생물들은 시트르산 회로와, 피루베이트 디하이드로게나제(PDH)에 의해 촉매되는 피루베이트의 아세틸 코엔자임 A로의 전환을 이용하여 에너지를 생성할 것이다.

두번째로, 혐기성 조건하에서, 특정 에탄올 생산성 유기체들은 피루베이트 디카르복실라제(PDC)에 의해 촉매되어 피루베이트를 아세트알데히드로 탈카르복시화하고, 이어서 알코올 디하이드로게나제(ADH)에 의해 촉매되는, NADH에 의해 아세트알데히드를 에탄올로 환원하는 알코올성 발효를 수행할 수 있다.

세번째 공정은 락테이트 디하이드로게나제(LDH)에 의한 촉매 작용을 통해 일어나는 피루베이트의 락테이트로의 전환이다.

자연적으로 혐기성 발효를 거치는 미생물을 사용하거나, 또는 피루베이트 디카르복실라제와 알코올 디하이드로게나제 유전자를 병합한 재조합 미생물의 사용을 통해 에탄올을 생산하는데 관심이 집중되어 왔다. 이들 미생물을 사용함으로써 에탄올을 생산하는데 일부 성공했지만, 에탄올의 증가된 농도에 의해, 특히 미생물이 낮은 수준의 에탄올 내성을 가지므로 발효가 종종 손상되었다.

호열성 세균은 에탄올 생산을 위해 제안되어 왔고, 그것의 사용은 생산된 에탄올이 50℃를 초과한 온도에서 증기로서 제거될 수 있도록, 발효가 상승된 온도에서 수행될 수 있으며; 또한 높은 당 농도를 사용하여 발효가 수행될 수 있다는 장점을 가진다. 그러나, 에탄올을 효과적으로 생산할 수 있는 적합한 호열성 세균으로 발견된 것에는 문제점이 있다.

WO 01/49865는 에탄올 생산을 위해, 피루베이트 디카르복실라제가 인코딩된 이종 유전자로 형질전환되고, 선천적으로 알코올 디하이드로게나제 기능을 가지는 그람-양성 세균을 개시한다. 상기 세균은 호열성 간균이고, 트랜스포슨 삽입을 이용한 락테이트 디하이드로게나제 유전자의 비활성화에 의해 개조되었을 것이다. WO 01/49865에 개시된 세균은 모두 배양물에서 자연적으로 발생하는 포자 형성-결핍 균주인 간균 균주 LLD-R(Bacillus Strain LLD-R)에서 유래된 것이고, 여기서 ldh 유전자는 자연발생 돌연변이나 화학적 돌연변이 유발에 의해 비활성화되어 왔다. 균주 LN과 TN은 균주 LLD-R의 개선된 유도체로서 개시되었다. 그러나, 모든 균주들은 플라스미드 형질전환을 지연시키는 HaeIII 타입의 제한계를 포함하고 있어서, 메틸화되지 않은 DNA 내에서의 형질전환을 방해한다.

WO 01/85966은 제한 문제를 극복하기 위하여, 생체 내 메틸화에 의해 제조된 미생물을 개시한다. 이것은 HaeIII 메틸트랜스퍼라제로 해모필루스 이집티우스(Haemophilus aegyptius)로부터 균주 LLD-R, LN 및 TN으로의 형질전환이 요구된다. 그러나, 균주 LLD-R, LN 및 TN은 불안정한 돌연변이체이고, 자연적으로, 특히 낮은 pH와 높은 당 농도에서 락테이트를 생산하는 야생형 균주로 되돌아간다. 그 결과 에탄올 생산에 적합하지 않은 균주로 만들어, 발효 산물을 에탄올로부터 락테이트로 변화시킨다.

WO 02/29030은 ldh 유전자의 코딩 영역에 자연적으로 발생한 삽입 요소(IE)를 포함하는 균주 LLD-R과 그의 유도체를 개시한다. ldh 유전자 안으로(및 밖으로)의 이것의 전위와 이어지는 유전자 비활성화는 불안정하여 복귀를 야기한다. 이에 대해 제안된 해법은 IE 서열 내로 플라스미드 DNA를 통합하는 것이었다.

따라서, 종래에는 에탄올 생산을 위한 미생물의 생산이, 실험실에서 생산된 화학적으로 돌연변이시킨 간균 미생물을 개조하고, 이들을 생체 내에서 메틸화하는 과정으로 처리한 후, 플라스미드 DNA가 IE 서열에 통합되도록 미생물을 더욱 개조하는 것에 의존한다. 이 과정은 복잡하고, 불확실하며, 어떻게 균주들이 사용될 수 있느냐에 대해 조절 문제가 또한 있다.

따라서, 에탄올 생산을 위하여 개선된 미생물에 대한 요구가 있다.

본 발명의 첫 번째 관점에 따르면, 호열성 미생물은 에탄올의 생산을 증가시키기 위해 개조되고, 그러한 개조는 야생형 호열성 미생물의 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 비활성화시키는 것이다.

본 발명의 두 번째 관점에 따르면, 미생물은 NCIMB 등록번호 41275로 기탁된 것이다.

본 발명의 세 번째 관점에 따르면, 에탄올을 생산하는 방법은 C₃, C₅ 또는 C₆ 당이 존재하는 적합한 조건 위아래로 제공된 정의에 따라 미생물을 배양하는 것을 포함한다.

본 발명의 네 번째 관점에 따르면, 플라스미드는 여기에서 pUB 190-ldh(NCIMB 등록번호 41276)으로 정의된 것을 말한다.

본 발명의 다섯 번째 관점에 따르면, 호열성 미생물은 여기에서 pUB 190(도4)으로 정의된 플라스미드를 포함한다.

본 발명은 락테이트 디하이드로게나제 유전자의 발현을 방해하기 위한 야생형 호열성 미생물의 개조에 기초한다.

락테이트 디하이드로게나제 유전자를 비활성화하는 것은 피루베이트가 락테이트로 붕괴되는 것을 막고, 따라서, 피루베이트 디카르복실라제와 알코올 디하이드로게나제에 의해 피루베이트가 에탄올로 붕괴되는 것을 촉진한다(적절한 조건 하에서). 락테이트 디하이드로게나제 유전자는 그 유전자 내부 결손 또는 그 유전자의 결손에 의해 분열되는 것이 바람직하다.

야생형 미생물은 어떤 호열성 미생물일 것이지만, 그 미생물은 간균 spp.(Bacillus spp .)인 것이 바람직하다. 특히, 그 미생물이 지오바실러스(Geobacillus) 종, 특히, 지오바실러스 설모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)인 것이 바람직하다.

개조를 위해 선택된 미생물은 "야생형"이라 칭하며, 다시 말해 그들은 실험실에서 생산된 돌연변이체가 아니다. 그러한 미생물은 호열성 세균을 함유할 것으로 기대되는 환경 샘플로부터 분리할 수 있다. 분리된 야생형 미생물은 에탄올을 생산하는 능력을 가질 것이나, 개조되지 않았으므로, 락테이트가 1차(primary) 발효 산물일 것이다. 또한, 분리되는 것은 호열성 온도에서 6탄당 및/또는 5탄당과 그 올리고머에서 성장하는 능력에 따라 선택된다.

본 발명의 미생물은, 미생물이 발효 공정에 사용되도록 특정의 소망되는 특성을 가지는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 미생물은 어떠한 제한계도 가지지 않아, 생체 내에서의 메틸화 필요성이 없어야 한다. 또한, 미생물은 최소한 3%의 에탄올에서 안정적이어야 하며, 기질로서 셀로비오스와 녹말을 포함하여 C₃, C₅ 또는 C₆ 당(또는 그들의 올리고머)을 사용하는 능력을 가져야 한다. 미생물은 높은 빈도로 형질전환될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 미생물은 0.3h^-1이상의 희석율(전형적으로는 0.3 OD₆₀₀)을 유지할 수 있도록 연속 배양에서의 성장률을 가져야 한다.

미생물은 호열성일 것이며, 40℃~85℃의 온도 범위에서 성장할 것이다. 바람직하게는, 미생물은 50℃~70℃ 온도 범위 내에서 성장할 것이다. 또한, pH7.2 또는 그 이하, 특히 pH6.9~pH4.5의 조건에서 성장하는 것이 바람직하다.

미생물은 포자-형성체이거나, 포자를 형성하는 것이 아닐 수 있다. 발효 공정의 성공은 미생물이 포자를 형성하는 능력에 필수적으로 의존하지 않지만, 발효 공정의 마지막에 가축 사료로서 미생물을 사용하는 것이 소망되는 때와 같은 특정 상황에서는 포자형성체(sporulator)를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 가축 사료로서 사용될 때 양호한 면역 자극을 제공하는 포자형성체들의 능력 때문이다. 또한, 포자-형성 미생물은 발효되는 동안 침전능을 가지고, 따라서 원심 분리의 필요없이 분리될 수 있다. 따라서, 미생물은 복잡하거나 비용이 드는 분리 과정의 필요없이 가축 사료로 사용될 수 있다.

현재 락테이트 디하이드로게나제에 대한 핵산 서열이 알려져 있다. 상기 서열을 이용하여, 숙련된 자들은 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 표적화하여 다른 메커니즘들을 통해 상기 유전자를 비활성화시킬 수 있다. 락테이트 디하이드로게나제 유전자는 트랜스 포슨의 삽입 또는, 바람직하게는 유전자 서열의 결손이나 유전자 서열의 분할에 의해 비활성화되는 것이 바람직하다. 결손이 바람직한데, 이는 트랜스포슨 비활성화가 사용될 때 종종 일어나는 유전자 서열의 재활성화 곤란을 피할 수 있기 때문이다. 바람직한 실시예에서 락테이트 디하이드로게나제 유전자는 온도-감수성 플라스미드(플라스미드 pUB 190-ldh)의 통합에 의해 비활성화되며, 이는 플라스미드와 미생물 염색체 사이의 자연적인 상동 재조합 또는 통합에 의해 달성된다. 염색체 통합체들은 항균제(예를 들면, 카나마이신)에 대한 내성에 기초하여 선택할 수 있다. 락테이트 디하이드로게나제 유전자에의 통합은 단일 교차 재조합 사건이나 2중(또는 그 이상) 교차 재조합 사건에 의해 일어날 수 있다.

바람직한 실시예에서, 미생물은 이종 알코올 디하이드로게나제 유전자와 이종 피루베이트 디카르복실라제 유전자를 포함한다. 이들 이종 유전자의 발현은 물질대사의 방향을 바꾸는 효소의 생산을 야기하여, 에탄올이 1차 발효 산물이 된다. 이들 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)를 포함하는 자이모모나스(Zymomonas) 종을 포함하여, 전형적으로 혐기성 발효를 수행하는 미생물로부터 수득할 수 있다.

이들 유전자의 제조 및 미생물에의 병합 방법은, 예를 들면 여기에서 참조로서 첨부한 Ingram et al, Biotech & BioEng, 1998; 58(2+3): 204-214와 US 5916787 각각의 내용에 공지되어 있다. 유전자들은 플라스미드에 도입되거나 염색체에 통합될 것이며, 숙련된 자에 의해 식별될 수 있을 것이다.

본 발명의 미생물은, 선택된 호열성 미생물에 의존하여 종래의 배양 조건하에서 배양될 수 있다. 기질, 온도, pH 및 그 밖의 성장 조건의 선택은, 예를 들면 여기에서 참조로서 첨부한 WO 01/49865 및 WO 01/85966 각각의 내용에서 볼 수 있는 바와 같이, 공지된 배양 요구 사항에 근거하여 선택할 수 있다.

본 발명은 이하의 실시예에서 수반한 도면을 참조하여 오직 실시예에 의해서만 기술될 것이다.

본 발명은 첨부한 도면들을 참조하여 기술된다. 여기서,

도1은 본 발명의 미생물(ldh 35)이 다른 기질들을 이용하여 에탄올을 생산하는 것을 나타내는 그래프이다.

도2는 본 발명의 미생물(ldh58)이 다른 기질들을 이용하여 에탄올을 생산하는 것을 나타내는 그래프이다.

도3은 11955의 LDH 녹아웃(knockout) 돌연변이체에 의한 에탄올 생산을 나타내는 그래프이다.

도4 및 도5는 본 발명에서 사용된 pUB 플라스미드의 개략적인 도식이고, 도4는 본 발명에 따른 ldh 돌연변이체이며,

도6은 다른 배양 조건하에서 LDH 녹아웃 돌연변이체의 안정성을 나타내는 그래프이다.

LDH 유전자의 비활성화

실시예1 - 단일 교차 돌연변이체

LDH 녹아웃 벡터 개발

HindIII와 XbaI을 사용하여 약 800bp의 부분적인 ldh 유전자 단편을 온도 감수성 운반 벡터 pUB 190(서열번호 1)에 서브클론(subcloned)시켜, 7.7kb의 플라스미드 pUB 190-ldh(도4 및 서열번호 2)를 제조하였다. 플라스미드 pUB 190은 이하에 나타낸 바와 같이 NCIMB에 기탁하였다. 10개의 추정 E.coli JM109(pUB 190-ldh) 형질전환체를 제한 분석에 의해 확인하였고, 형질전환 목적을 위한 플라스미드 DNA 생산을 위해 두 개의 배양물을 사용하였다. HindIII와 XbaI에 의한 pUB 190-ldh 분해는 기대되는 ldh 단편을 방출시킨다.

pUB 190- ldh 에 의한 지오바실러스 설모글루코시다시우스( Geobacillus thermoglucosidasius ) 11955의 형질전환

54℃에서 24~48시간 후 카나마이신 선택에 의해 테스트된 모든 세 개의 플라스미드를 가진 형질전환체를 수득하였다. ldh 형질전환체는 지오바실러스 설모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius, Gt)로부터 정제하였고, HindIII와 XbaI을 사용한 제한 분석으로 확인하였다.

LDH 유전자 녹아웃

유전자 녹아웃은 온도 감수성 플라스미드를 염색체 상의 ldh 유전자에 통합시키는 것에 의해 수행되었다.

플라스미드 pUB 190-ldh는 Gt11955 내에서 54℃에서 복제되지만, 65℃에서는 그렇지 않다. 선택은 카나마이신(kan, 12㎍/㎖)으로 유지하였다. 그 후, 성장 온도를 65℃로 상승시켰다(플라스미드는 더 이상 복제되지 않는다). 자연적인 재조합이나 통합이 플라스미드와 염색체 사이에 일어난다. 염색체 통합체들은 카나마이신에 대한 내성으로 선택하였다. 상동 서열이 플라스미드 상에 존재하기 때문에 통합은 ldh 유전자에 대해 일어난다. ldh 유전자로 표적화된 통합은 단일 교차 재조합으로 알려진 공정에 의해 일어난다. 플라스미드는 ldh 유전자로 병합되어 ldh 유전자 비활성화를 야기한다. 수개의 플라스미드 복사체가 통합되면 직렬(tandem) 반복이 일어날 수 있다.

방법론 및 결과

통합을 위해 두 가지의 다른 방법이 시도되었다.

방법 1: 4×50㎖ TGP(kan) 배양물을 54℃에서 12~18시간 성장시켰다. 세포들을 원심 분리하여 펠렛 형태로 하고, TGP 1㎖에 재현탁시켰다. 재현탁액을 TGP(kan) 플레이트에 도포하고(5×200㎖), 68℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 통합체들을 가려내어 새로운 TGP(kan) 플레이트의 50-정사각형 눈금 위에 도포하고 68℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

방법2: 1×50㎖ TGP(km) 배양물을 54℃에서 12~18시간 성장시켰다. 배양물 1㎖를 68℃에서 12~18시간 성장시킨 새로운 TGP(kan) 배양물 50㎖에 접종시켰다. 다음날 이것을 50㎖의 새로운 TGP(kan) 배양물에서 2차 배양하고, 또다시 12~18시간 동안 68℃에서 성장시켰다. 배양물을 TGP(km) 플레이트 위에 도포하고, 하룻밤 동 안 68℃에서 배양하였다. 플레이트 위에서 전면 성장을 수득하였다. 단일의 콜로니를 새로운 TGP(kan) 플레이트 상의 50-정사각형 눈금 상에 도포하고 68℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

선별

이하를 사용하여 추정 통합체들에 대해 ldh 유전자 녹아웃을 선별하였다.

1) 플레이트 선별

68℃에서 SAM2 플레이트(kan 존재) 상으로의 수백 통합체의 레플리카 플레이팅(replica plating). 락테이트 음성 세포들은 보다 적은 산을 생산하고, 버퍼가 없는 발효성 배지에서 야생형보다 성장 이점을 가질 수 있다.

2) PCR 선별

콜로니 PCR은 플라스미드가 ldh 유전자 내로 통합되었는지 여부를 결정하기 위해 사용되었다. 통합 부위 측면에 나열하는 프라이머를 선택함으로써, ldh 유전자 통합이 일어났는지 여부를 결정할 수 있었다(어떤 PCR 단편도 삽입을 위해 증폭되지 않았다).

3) 락테이트 분석

이 분석은 68℃, SAM2(kan)에서 하룻밤 동안 성장시켰을 때 통합체가 락테이트를 생산하는지 여부를 결정한다. 락테이트 측정을 위해 시그마(Sigma) 사의 락테이트 시약을 사용하여 배양물 상청액의 락테이트 농도를 테스트하였다. 락테이트 음성 통합체들은 PCR로 더욱 특성화하고 발효 안정성을 평가하였다.

지오바실러스 설모글루코시다시우스 ( Geobasillus thermoglucosidasius ) NCIMB 11955에 대한 전기천공 프로토콜

TGP 배지(55℃에서 250rpm, 250㎖ 원뿔 플라스크에 50㎖ 용량, OD₆₀₀)에서 하룻밤 배양으로 성장시키고, 20% 글리세롤을 동일한 용량으로 첨가한 후, 1㎖ 분취량으로 나누고, -80℃에서 크리오튜브 내에 저장하여 NCIMB 11955 냉동 군체를 제조하였다. 이 군체의 1㎖를 250㎖ 원뿔 플라스크 내의 50㎖ TGP에 접종시키고, 배양물이 OD₆₀₀ 1.4에 이르기까지 55℃, 250rpm으로 배양하였다.

상기 플라스크를 얼음 위에서 10분간 냉각시킨 후, 배양물을 4℃에서 4000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 펠렛을 얼음같이 찬 50㎖의 전기천공 배지에 재현탁하고, 20분간 4000rpm으로 원심분리하였다. 세 번의 세척을 수행한 후(1×25㎖ 및 2×10㎖), 상기 펠렛을 얼음같이 찬 1.5㎖의 전기천공 배지에 재현탁하고 60㎕ 분취량으로 나누었다.

전기천공을 위해 1~2㎕의 DNA를, 얼음 위에 보존된 에펜도르프 튜브 내의 60㎕ 전기적합 세포(electrocompetent cells)에 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다. 이 현탁액을 미리 냉각시킨 전기천공 큐벳(1mm 간격)으로 옮기고, 2500V, 10㎌ 전기용량 및 600Ω 전기저항에서 전기천공 하였다.

펄스 이후 즉시, 1㎖의 TGP를 첨가하여 혼합하고, 그 현탁액을 스크루 탑 튜브에 옮긴 후, 진탕 항온 수조에서 1시간 동안 52℃에서 배양하였다. 배양 후 상기 현탁액을 곧바로 도포하거나(예를 들면 2×0.5㎖), 또는 20분 동안 4000rpm에서 원심분리하고 200㎕~500㎕ TGP에 재현탁한 후 적절한 항생제를 함유하는 TGP 한천 상 에 도포하였다.

전기천공 배지 TGP 배지

0.5M 소르비톨 트립톤 17g/L

0.5M 만니톨 콩 펩톤 3g/L

10% 글리세롤 K₂HPO₄ 2.5g/L

NaCl 5g/L

pH 7.3까지

고압 처리(autoclaving) 후 첨가물;

소디움 피루베이트 4g/L

글리세롤 4㎖/L

LDH 유전자 비활성화

2중 교차 돌연변이체

사용될 11955 LDH 서열에 기초하여 프라이머를 디자인하였다. 녹아웃 전략은 두 가지 접근 방법에 따라 LDH 유전자 내에 내부 결손을 생성하는 것에 기반을 두었다.

전략 1에서는, 결손 생성을 위하여 LDH 코딩 서열의 중심부에 근접하여 존재하는 2개의 독특한 제한 부위를 활용하였다. 사용될 LDH 서열의 대부분을 아우르는 게놈 DNA로부터 단일의 큰 PCR 산물을 생성하고, pUC19의 다중 클로닝 부위 내의 SmaI 부위로 클론하였다. 이어서 상기 pUC19 클론을 BstEII와 BsrGI으로 순차적으로 소화하고 클레노우 소화(Klenow digestion) 후 재결찰시켜, BstEII와 BsrGI 사이의 LDH 유전자 내에 내부 결손을 생성하였다.

전략 2에서는(실시예2 참조), LDH 유전자를 2개의 PCR 산물로 클론하고, 이는 상기 2개의 PCR 산물이, LDH 서열의 중심부에 결손을 갖는, pUC19 내에서 함께 결찰되도록 올리고 프라이머 상에 NotI 부위를 도입하게 하였다. 내부 결손을 가진 두 개의 LDH 유전자는 지오바실러스에 대한 세 개의 잠재적인 운반 시스템으로 서브클론되었다.

플라스미드	상세설명
pCU1	4.94kb, 셔틀 벡터는 pC194에 기초함, cat&bla를 지님
pBT2	6.97kb, 셔틀 벡터는 온도 감수성 돌연변이체인 pE194로부터 유래됨, cat과 bla를 지님
pTVOmcs	4.392kb, pE194ts로부터 유래됨, cat을 지님(그람 음성 레플리콘이 아님)

전기천공법에 의해 상기 운반 벡터로 11955를 형질전환시켰다.

유전학적 전략 정보: 상동 재조합을 위한 운반 시스템의 개발

녹아웃을 생성하기 위해서는, 돌연변이된 유전자를 표적 유기체로 운반하고, 표적 "야생형" 유전자와의 상동 재조합에 의한 게놈으로의 통합을 선택하는 효과적인 시스템이 요구된다. 원칙적으로, 이는 그람-양성 선택 마커를 운반하지만 그람-양성 레플리콘은 가지지 않는 E.coli 벡터 상에 DNA를 도입함으로써 달성할 수 있다. 이것은 높은 형질전환 효율을 요구한다. 지오바실러스 11955에 대해 개발된 전기천공 방법은 pNW33N을 가진 DNA ㎍당 3×10⁴ 형질전환체를 생성한다. 그람-양성 레플리콘은 BGSC 카탈로그 내의 pBC1과, 서열 데이터베이스 내의 pTHT15로부터 유래한다.

pNW33N 상의 cat 유전자는 E.coli과 지오바실러스균에서의 선택을 위해 사용된다. pNW33N의 온도-감수성 돌연변이체는 플라스미드를 스트라타진사(Stratagene)의 XL1red 돌연변이 유발 유전자 균주를 통과시킴으로써 생성하였다.

실시예2

유전자 치환에 의한 LDH 돌연변이체 생성

유전자 치환에 의해 지오바실러스 설모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) NCIMB 11955 내의 LDH 유전자의 안정적인 돌연변이를 생성하기 위하여 또 다른 전략을 계획하였다. 이 전략은 코딩 서열의 중심부 가까이에 42bp의 결손의 생성과, 이 부위에 신규의 NotI 제한 부위를 도입하는 7bp의 삽입을 포함한다. 상기 삽입된 서열은 프레임 시프트 돌연변이 하향 흐름을 야기하기 위한 것이다.

상기 전략은 신규의 NotI 부위를 도입한 올리고 프라이머를 사용한 2개의 PCR 단편을 사용하여 결손을 생성하는 것을 포함한다. 프라이머는 11955로부터의 LDH 코딩 영역의 부분적인 서열에 근거하여 디자인되었다. 사용된 프라이머의 서열은 하기와 같다.

단편1:

프라이머1(정방향); GGAATTCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA (서열번호 3; 음영처리 된 서열은 신규의 EcoRI 부위를 생성하기 위해 도입된 염기를 나타낸다)

프라이머2(역방향); GCGGCCGCACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT (서열번호 4; 음영처리된 서열은 신규의 NotI 부위를 생성하기 위해 도입된 염기를 나타낸다)

단편2:

프라이머 3(정방향); GCGGCCGCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT (서열번호 5; 음영처리된 서열은 신규의 NotI 부위를 생성하기 위해 도입된 서열을 나타낸다)

프라이머 4(역방향); CTGCAGCGTCAATTCCATCACTTCACGA (서열번호 6; 음영처리된 서열은 신규의 PstI 부위를 생성하기 위해 도입된 염기를 나타낸다).

게놈 DNA 제조

PCR을 위한 주형으로 제공하기 위해 11955로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 20분 동안 4000rpm으로 원심분리함으로써, 52℃의 TGP 배지에서 성장시킨 11955의 하룻밤 배양물 20㎖로부터 세포를 수집하였다. 상기 세포 펠렛을 2.5mg의 리소자임과 50㎕의 1mg/ml 리보뉴클레아제 A를 함유하고 pH가 8.0으로 조정된, 0.3M 수크로오스, 25mM Tris HCl 및 25mM EDTA의 STE 버퍼 5㎖에 재현탁시켰다. 이것을 30℃에서 1시간 동안 배양하고, 5mg의 프로테아제 K를 첨가한 후, 50㎕의 10% SDS를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 이소프로판올에 의한 침전 이전에, 용해된 배양물을 동일한 용량의 페놀/클로로포름에 이어 클로로포름으로 순차적으로 추출하였다. 얼음같이 찬 70%의 에탄올로 두 번 세척한 후, DNA 펠렛을 0.5ml의 TE 버퍼에 재용해시켰다.

LDH 결손 구성체의 생성

Robocycler Gradient 96(Stratagene사 제)를 사용하여 PCR을 수행하였고, 반응 조건은 다음과 같다; 95℃에서 5분간 변성, 47℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장, 2~30회; 95℃에서 1분간 변성, 47℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장 및 72℃에서 5분간 배양. 사용된 효소는 Pfu 폴리머라제(Promega 사)와 Taq 폴리머라제(New England Biolabs, NEB 사)의 균등 혼합물이다. 사용된 버퍼와 dNTPs의 구성 및 농도는 첨부 문서의 Pfu에 대한 권장 사항에 따랐다. 주형으로서 NCIMB 11955로부터의 게놈 DNA를 사용하여 수득한 PCR 산물은, 아가로스 겔 전기영동법을 이용하여 정제하였고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen 사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 용출해내었다. 정제된 PCR 산물을 SmaI로 미리 소화해 둔 pUC19(New England Biolabs 사)에 결찰시키고, 상기 결찰 혼합체로 E.coli DH10B(Invitrogen 사)를 형질전환시켰다. 암피실린 내성 콜로니를 선택하고, 함유된 플라스미드를 분리하여 제한 분석에 의해 특성화한 후, 삽입체의 배향을 수립하였다.

pUC19에 삽입된 단편 2(pUC19의 다중 클로닝 부위(mcs) 내의 PstI 부위와 가장 가까운 프라이머 4 상에 도입된 신규의 PstI 부위를 가지고)를 가진 플라스미드(pTM002)를 NotI와 PstI로 소화하였다. 결과물인 단편(약 0.4kb)을, 플라스미드를 선형화하기 위해 NotI와 PstI로 소화된 단편 1(pUC19의 mcs 내의 EcoRI 부위와 가장 가까운 프라이머 1 상에 도입된 신규의 EcoRI 부위를 가지고)을 포함하는 pUC19 플라스미드(pTM001)로 결찰시켰다. 결찰 혼합체로 E.coli DH10B를 형질전환시켰다. 암피실린 내성 콜로니를 선택하고, 함유된 플라스미드를 분리하여, 제한 분석에 의해 특성화하였다. 소망되는 구성체(결손 부위와 도입된 NotI 부위를 운반하는 LDH 코딩 영역)에 대해서 기대되는 제한 패턴을 가지는 플라스미드(pTM003)를 식별하고, M13mp18 역방향 및 정방향 프라이머를 사용하여 서열분석함으로써 확인하였다.

HindIII와 EcoRI으로 소화하여 pTM003으로부터 돌연변이된 LDH 유전자를 잘라내고, 아가로스 겔 전기영동법에 의해 정제한 후, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔로부터 용출하였다(약 0.8kb 단편). 단편을 클레노우 폴리머라제(NEB, 제조자 지시에 따름)로 처리하여 평활성 말단을 생성하고, pUB 190 벡터에 도입하였다. 이것은 이전과 같이, XbaI에 의한 소화와 클레노우-처리에 이은 겔-정제법에 의해 선형화된 pUB190과의 평활성 말단 결찰에 의해 달성되었다. 결찰 혼합체는 E.coli SCS110(Stratagene 사)을 형질전환시키는데 사용하였다. 암피실린-내성 콜로니를 선택하고, 함유된 플라스미드를 분리한 후, 제한 분석으로 특성화하였다. 소망되는 구성체에 대해 기대되는 제한 패턴을 가진 플라스미드(pTM014)를 식별한 후, 실시예 1에서 설명한 바와 같은 전기천공 프로토콜을 이용하여 전기천공함으로써 NCIMB 11955를 형질전환시켰다.

이중 교차에 의한 유전자-치환 LDH 돌연변이체의 생성 및 특성화

상기 방식으로 수득한 pTM014의 추정 1차 통합체를(TM15 균주), 2중 재조합체(유전자 치환) 수득을 위해 사용하였다. 이것은 카나마이신이 없는 TGP 배지 내에서 TM15를 일련의 2차 배양함으로써 달성되었다. 54℃에서의 8시간과 52℃에서의 16시간을 번갈아서, 250rpm, 각 단계마다 1% 전달(transfer)로 50ml의 튜브(Falcon 사) 내 5ml TGP를 사용하는 5번의 연속 진탕 배양물이 사용되었다. 5번의 계대(passages) 이후, 결과 배양물을 TGP 내에서 연속적으로 희석시키고, 54℃에서의 배양을 위해 100㎕의 샘플을 TGP 한천 플레이트 위에 도포하였다. 12㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 TGP 한천 상의 결과물 콜로니의 레플리카 플레이팅을 사용하여 카나마이신-감수성 콜로니를 식별하였다. 정제를 위해 한천 상에 단일 콜로니로 획선 배양(streaking)한 후, 이들 카나마이신 감수성 유도체들이 락테이트를 생산하는지 시행되고, 기대된 바와 같이, LDH⁺ 와 LDH^-의 혼합물인지 확인되었다. 하나의 LDH^- 유도체, TM89는 PCR과 서던 블랏으로 더욱 특성화하였다.

TM15(1차 통합체)와 TM89(추정 이중 재조합체 LDH^-)로부터 게놈 DNA를 제조하고, 이를 프라이머 1과 4를 이용한 PCR을 위해 주형으로 사용하였으며, 조건은 상기에서 설명한 바와 같다. 11955로부터의 게놈 DNA는 대조군으로서 사용하였다. PCR 산물(모든 3개의 주형으로부터 약 0.8kb의 밴드를 수득하였다)을 아가로스 겔 전기영동법으로 정제하고, QIAquick Gel Extraction Kit을 사용하여 아가로스 겔로부터 용출해내었다. 샘플들을 NotI으로 소화하고, 산물들이 시각화되도록 0.7% 아가로스 겔 상에 흘러내렸다. 11955의 PCR 산물은 NotI 소화의 어떤 증거도 나타내지 않은 반면에, 기대한 바와 같이, TM89의 PCR 산물은 0.4kb 부근에서 2개의 밴드를 나타내었고, 이는 야생형 유전자가 돌연변이된 대립 유전자와 치환되었음을 나타낸다. 1차 통합체인 TM15의 PCR 산물의 NotI 소화는 TM89가 나타낸 2개의 밴드를 보다 두드러지게 나타내었고, 잘리지 않은(0.8kb) 밴드의 흔적을 가진다. 이것은 TM15 게놈 DNA의 서던 블랏에 의해 얻어진 결과로 설명될 수 있다.

11955, TM15 및 TM89의 게놈 DNA를 NotI, PstI과 NotI 및 HindIII과 NotI으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동하였다. 상기 DNA를 + 전기를 띄는 나일론막(Roche 사)으로 옮기고, 첨부 문서의 지시 사항(Roche Molecular Biochemicals DIG 이용 매뉴얼)에 따라 DIG-표지 dNTPs를 가진 프라이머 1과 4를 사용하여 11955 LDH 유전자를 PCR함으로써 생성한 DIG-표지 탐침자와 혼성화시켰다. 혼성화(hybridizing) 밴드는 제공된 검출 키트(Roche 사)를 사용하여 시각화하였다. 서던 블랏은 TM15의 NotI 소화에서 약 7.5kb의 매우 증폭된 밴드와, TM15의 HindIII/NotI 및 PstI/NotI 소화에서 비슷하게 증폭된 약 7 및 0.4kb 밴드의 증거를 보여주는데, 이는 이 1차 통합체 내의 LDH 위치에 통합된 pTM014의 다중 직렬 복사체의 통합을 나타낸다. 모든 세 가지의 제한 소화에서, TM89는 11955에 비해 추가의 혼성화 밴드를 보여줌으로써, 유전자 치환과 일치하는, 다른 제한 패턴의 증거를 보여준다. TM89는 하기에서 나타내는 바와 같이 등록번호 41275로 NCIMB에 기탁되었다.

실시예3

야생형 호열성 세균에 의한 에탄올의 생산

재생산 가능한 성장과 산물 생성은 야생형 호열성 세균에 대한 유가 배양과 연속 배양을 통해 달성되었다. 표1, 2 및 3은 발효 공정에서 사용된 조건을 나타낸다.

화학제품	Vol ./L	최종 농도
NaH₂PO₄ㆍ2H₂O		25mM
K₂SO₄		10mM
시트르산ㆍH₂O		2mM
MgSO₄ㆍ7H₂O		1.25mM
CaCl₂ㆍ2H₂O		0.02mM
황산염 TE 용액	5ml	이하 참조
Na₂MoO₄ㆍ2H₂O		1.65μM
효모 추출물	10g
소포제	0.5ml

고압 처리 후 첨가물 ( post - auto addns ):
4M 요소	25ml	100mM
1% 바이오틴	300㎕	12μM
20% 글루코오스²	50ml	1%

황산염 미량 원소 저장 용액

화학제품	gl ^-1 ( ml )	배지 농도
농축 H₂SO₄	5ml
ZnSO₄ㆍ7H₂O	1.44	25μM
FeSO₄ㆍ7H₂O	5.56	100μM
MnSO₄ㆍH₂O	1.69	50μM
CuSO₄ㆍ5H₂O	0.25	5μM
CoSO₄ㆍ7H₂O	0.562	10μM
NiSO₄ㆍ6H₂O	0.886	16.85μM
H₃BO₃	0.08
탈이온수(최종 용량)	1000ml

발효기 조건

접종물	10% v/v
용량	1000ml
온도	60℃
pH	7.0 (NaOH로 조절)
폭기	0.4 vvm
N₂ 유량	0.05 lpm
교반	400 rpm
배지	발효기를 위한 요소 황산염
당 공급	50% 글루코스 100ml

회분식 배양에서 야생형 간균의 성장에 대한 개선점의 개요
배지	첨가된 총 당 mM	OD ₆₀₀	mM
배지	첨가된 총 당 mM	OD ₆₀₀	피루베이트	락테이트	포르메이트	아세테이트	에탄올
자일로스	603	8.5	9	187	5	75	22
글루코스1	504	4	2	295	36	28	39
글루코스2	504	3.7	19	322	111	55	123

실시예4

호열성 세균에 의한 에탄올 생산의 증가

호열성 세균으로부터 표적 에탄올의 수율과 생산성을 달성하기 위하여, ldh 유전자 비활성화에 의한 L-락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 녹아웃을 통해 락테이트의 생산을 최소화하였다. ldh 유전자를 비활성화하기 위한 두 가지의 접근법이 있다: 염색체상의 ldh 영역으로 마커 DNA를 단일 교차 재조합시켜 그것의 전사를 막거나, 유전자 영역 내에 돌연변이를 만들기 위해 ldh 유전자로 DNA의 상동 영역을 이중 재조합시켜 기능을 상실하게 하는 것이다.

단일 교차 접근법은, 야생형 균주(NCIMB 11955)과 비교했을 때 에탄올 생산의 증가를 보여주는 LDH-음성 돌연변이체를 신속하게 생성하였다.

LDH 돌연변이체에 의한 에탄올 생산의 개선

LDH-음성 돌연변이체들을 유가 배양에서 성장시켰고, 이는 LDH 활성의 녹아웃으로부터 야기되는 에탄올 생산의 증가를 측정하기 위해 최소 배지로 수립하였다. LDH 돌연변이체의 대사산물 프로파일에서의 변화를, 야생형 균주의 최적 에탄올 생산량과 비교하여 표5에 나타내었다. 두 LDH 돌연변이체의 대사산물 생성 프로파일은 도1과 2에 도시하였다. 표6은 LDH 활성의 녹아웃에 의해 야기된 에탄올 생산의 증가를 보여준다.

락테이트 돌연변이체에 의해 달성된 에탄올 생산에서 증가량의 개요
유기체	탄소원	총 당	OD ₆₀₀	mM
유기체	탄소원	총 당	OD ₆₀₀	피루베이트	락테이트	포르메이트	아세테이트	에탄올
야생형	글루코스	603	3.7	19	322	111	55	123
ldh 35	글루코스	336	4.7	82	22	128	37	220
ldh 58	글루코스	336	5.2	57	3	40	23	215

유가 배양에서 LDH 돌연변이체에 의한 증가된 에탄올 생산
유기체	탄소원	OD ₆₀₀	배양물 내의 글루 코스 g	잔여 글루 코스 g	락테 이트 g	락테 이트 g/g 세포	락테 이트 g/g 글루 코스	에탄올 g	에탄올 g/g/ 세포	에탄올 g/g 글루 코스
야생형	글루코스	3.7	60.48	1.62	37.89	48.89	0.64	4.05	5.22	0.07
ldh 35	글루코스	4.7	60.48	17.80	1.98	1.36	0.05	10.12	6.95	0.24
ldh 58	글루코스	5.2	60.48	28.26	0.27	0.17	0.01	9.89	6.14	0.31

LDH 돌연변이체는 야생형 호열성 세균에 비해 현저하게 높은 에탄올 수율을 생산하였고, 이는 이들 호열성 세균의 물질대사가 성공적인 다른 경로를 통해 이루어지고 있음을 증명한다. 또한, LDH 돌연변이체 균주에 대한 배양 조건과 배지 구성 성분의 최적화는 에탄올 수율을 증가시킬 것이다.

연속 배양에서 LDH 돌연변이체에 의한 에탄올의 생산

에탄올 생산자로서 긴 기간의 안정성을 부여하기 위해, 가장 안정한 단일 교차 락테이트 돌연변이체를 연속 배양으로 성장시켰다. 상기 균주는 탄소원으로서 글루코스를 가진 최소 배지에서 배양하였다. 락테이트 생산으로 전환되기 전에 약 290시간 동안 정상 상태 배양물이 관찰되었다.

실시예5

실시예4에서 수행한 바와 같이, 이중 교차 돌연변이체 TM89(실시예2)가 에탄올을 생산하는지를 분석하였다. 그 결과를 표8에 나타내며, 상기 돌연변이체는 에탄올 생산에 있어 현저한 수준을 달성하였음을 보여준다(200mM 초과). 또한, 상기 돌연변이체가 탄소원으로서 글루코스나 자일로스를 사용하여 에탄올을 생산하는지도 분석하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.

유기체	탄소원	총 당/mM	당 잔류물/mM	OD₆₀₀	농도/mM
유기체	탄소원	총 당/mM	당 잔류물/mM	OD₆₀₀	에탄올	락테이트	피루베이트	아세테이트	포르메이트
야생형	글루코스	794	130	5.3	46	279	7	69	9
야생형	자일로스	953	122	8.5	22	187	9	75	5
TM 89	글루코스	862	53	6.5	214	5^*	109	10	88
TM 89	자일로스	1045	142	4.9	130	14^*	24	36	39

글루코스가 최고의 탄소원으로 보여지나, 결과 수치는 유기체들이 더 개조없이도 자일로스를 발효시킬 수 있음을 명백하게 보여준다.

락테이트 디하이드로게나제-음성 돌연변이체의 안정성을 또한, 1500 시간 동안의 연속 배양의 다양한 조건 하에서 테스트하였다. 그 결과를 도6에 나타내었고, 락테이트 디하이드로게나제-음성 표현형은 배양물에 대한 현저한 도전(challenges)에도 불구하고 안정성을 유지하며, 항생제 선택에 의존하지 않고 유지됨을 증명한다. 연속 실행 동안, 희석률을 0.1hr^-1과 0.5hr^-1사이로 다양하게 하였고, 배양물은 락테이트 농도의 변화없이 산소 조건(공기 존재)과 무산소 조건(N₂ 존재) 사이에 번갈아 두었다. 배양물의 pH를 보다 현저하게 다양화하고, 야생형 유기체가 성장하기 위한 정상 pH 범위를 벗어난 pH 4.4까지 떨어뜨렸다. 그러나, 배양물은 표현형의 변화없이, 다시 말해 락테이트 농도의 변화없이 신속하게 회복되었다.

본 발명에서 미생물은 TM89로 정의하였고, 플라스미드 pUB 190-ldh는 각각 NCIMB 등록번호 41275와 41276로 기탁하였다. 기탁기관은 영국 AB21 9YA, 애버딘, 벅스번, 크랩스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩, NCIMB Ltd이다.

유기체	연속	공기	당	바이오 매스	사용된 당	g/L		g/g 당			g/g 바이오 매스		g/L/h
유기체	공급률	WM	당	g/L	g/L	락테이트	에탄올	바이오 매스	락테이트	에탄올	락테이트	에탄올	락테이트	에탄올
야생형	D=0.04	0.06	2% 글루코스	0.68	20.00	11.25	1.56	0.03	0.56	0.08	16.50	2.29	0.45	0.06
야생형	D=0.09	0.06	2% 글루코스	1.02	20.00	7.29	1.79	0.05	0.36	0.09	7.13	1.75	0.66	0.16
Ldh-21	D=0.1	0.02	2% 글루코스	0.51	10.00	0	3.15	0.05	0.00	0.32	0.00	6.18	0.00	0.32

SEQUENCE LISTING <110> TMO Biotec Limited <120> Thermophillic Microorganisms for Ethanol Production <130> JWJ01150WO <150> GB0511603.3 <151> 2005-06-07 <150> GB0509068.3 <151> 2005-05-04 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6744 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <400> 1 gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 180 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 600 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ccgcacctgt acaaaccggt gaatcattac tacgagagcg ccagccttca 4020 tcacttgcct cccatagatg aatccgaacc tcattacaca ttagaactgc gaatccatct 4080 tcatggtgaa ccaaagtgaa acctagttta tcgcaataaa aacctatact ctttttaata 4140 tccccgactg gcaatgccgg gatagactgt aacattctca cgcataaaat cccctttcat 4200 tttctaatgt aaatctatta ccttattatt aattcaattc gctcataatt aatccttttt 4260 cttattacgc aaaatggccc gatttaagca caccctttat tccgttaatg cgccatgaca 4320 gccatgataa ttactaatac taggagaagt taataaatac gtaaccaaca tgattaacaa 4380 ttattagagg tcatcgttca aaatggtatg cgttttgaca catccactat atatccgtgt 4440 cgttctgtcc actcctgaat cccattccag aaattctcta gcgattccag aagtttctca 4500 gagtcggaaa gttgaccaga cattacgaac tggcacagat ggtcataacc tgaaggaaga 4560 tctgattgct taactgcttc agttaagacc gaagcgctcg tcgtataaca gatgcgatga 4620 tgcagaccaa tcaacatggc acctgccatt gctacctgta cagtcaagga tggtagaaat 4680 gttgtcggtc cttgcacacg aatattacgc catttgcctg catattcaaa cagctcttct 4740 acgataaggg cacaaatcgc atcgtggaac gtttgggctt ctaccgattt agcagtttga 4800 tacactttct ctaagtatcc acctgaatca taaatcggca aaatagagaa aaattgacca 4860 tgtgtaagcg gccaatctga ttccacctga gatgcataat ctagtagaat ctcttcgcta 4920 tcaaaattca cttccacctt ccactcaccg gttgtccatt catggctgaa ctctgcttcc 4980 tctgttgaca tgacacacat catctcaata tccgaatagg gcccatcagt ctgacgacca 5040 agagagccat aaacaccaat agccttaaca tcatccccat atttatccaa tattcgttcc 5100 ttaatttcat gaacaatctt cattctttct tctctagtca ttattattgg tccattcact 5160 attctcattc ccttttcaga taattttaga tttgcttttc taaataagaa tatttggaga 5220 gcaccgttct tattcagcta ttaataactc gtcttcctaa gcatccttca atccttttaa 5280 taacaattat agcatctaat cttcaacaaa ctggcccgtt tgttgaacta ctctttaata 5340 aaataatttt tccgttccca attccacatt gcaataatag aaaatccatc ttcatcggct 5400 ttttcgtcat catctgtatg aatcaaatcg ccttcttctg tgtcatcaag gtttaatttt 5460 ttatgtattt cttttaacaa accaccatag gagattaacc ttttacggtg taaaccttcc 5520 tccaaatcag acaaacgttt caaattcttt tcttcatcat cggtcataaa atccgtatcc 5580 tttacaggat attttgcagt ttcgtcaatt gccgattgta tatccgattt atatttattt 5640 ttcggtcgaa tcatttgaac ttttacattt ggatcatagt ctaatttcat tgcctttttc 5700 caaaattgaa tccattgttt ttgattcacg tagttttctg tattcttaaa ataagttggt 5760 tccacacata ccaatacatg catgtgctga ttataagaat tatctttatt atttattgtc 5820 acttccgttg cacgcataaa accaacaaga tttttattaa tttttttata ttgcatcatt 5880 cggcgaaatc cttgagccat atctgacaaa ctcttattta attcttcgcc atcataaaca 5940 tttttaactg ttaatgtgag aaacaaccaa cgaactgttg gcttttgttt aataacttca 6000 gcaacaacct tttgtgactg aatgccatgt ttcattgctc tcctccagtt gcacattgga 6060 caaagcctgg atttacaaaa ccacactcga tacaactttc tttcgcctgt ttcacgattt 6120 tgtttatact ctaatatttc agcacaatct tttactcttt cagccttttt aaattcaaga 6180 atatgcagaa gttcaaagta atcaacatta gcgattttct tttctctcca tggtctcact 6240 tttccacttt ttgtcttgtc cactaaaacc cttgattttt catctgaata aatgctacta 6300 ttaggacaca taatattaaa agaaaccccc atctatttag ttatttgttt agtcacttat 6360 aactttaaca gatggggttt ttctgtgcaa ccaattttaa gggttttcaa tactttaaaa 6420 cacatacata ccaacacttc aacgcacctt tcagcaacta aaataaaaat gacgttattt 6480 ctatatgtat caagataaga aagaacaagt tcaaaaccat caaaaaaaga caccttttca 6540 ggtgcttttt ttattttata aactcattcc ctgatctcga cttcgttctt tttttacctc 6600 tcggttatga gttagttcaa attcgttctt tttaggttct aaatcgtgtt tttcttggaa 6660 ttgtgctgtt ttatccttta ccttgtctac aaacccctta aaaacgtttt taaaggcttt 6720 taagccgtct gtacgttcct taag 6744 <210> 2 <211> 7673 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <400> 2 gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 180 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 600 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 660 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 720 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 780 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 840 ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 900 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 960 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 1020 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 1080 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 1140 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 1200 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1260 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 1320 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 1380 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 1440 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 1500 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 1560 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 1620 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 1680 ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 1740 gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 1800 taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 1860 gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 1920 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 1980 aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 2040 cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2100 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 2160 gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 2220 cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 2280 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 2340 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 2400 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2460 ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 2520 gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 2580 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct 2640 tggtaccgag ctcactagtc acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt ggatcctttg 2700 cccttatgaa ccaaggaata gcagatgagt tagtattgat tgatgtaaat aagaataagg 2760 cagagggcga tgtgatggat ttaaatcacg gaaaagtatt cgcgccgaag ccgatgaata 2820 tttggtttgg agattatcaa gattgccaag acgccgattt ggtggtgatt tgtgcagggg 2880 ctaaccaaaa gccgggagaa acaagactgg atcttgttga caaaaatatt aatatcttca 2940 aaacgattgt cgattctgtg atgaaatccg gatttgatgg cgtttttctt gtggcaacga 3000 acccagtgga tattttaacg tatgctactt ggaaatttag cgggttaccg aaagagcggg 3060 taatcggctc aggaacgatt cttgatacag caagattccg cttcttgcta agtgaatatt 3120 ttcaagtggc tccgaccaat gtacatgcgt atattattgg cgagcatggg gatacagagc 3180 tgcctgtttg gagccatgcg gaaattggaa gcattccagt tgagcaaata ttgatgcaaa 3240 acgataacta tagaaaagag gatttagaca atatctttgt taatgttcgt gatgcggcat 3300 atcaaatcat tgagaaaaaa ggggcaacgt attacggcat tgcaatggga ttagtccgta 3360 tcactcgtgc tattttgcac aatgaaaatg ccatcttaac cgtttctgct catttggacg 3420 gccaatatgg cgaacgaaat gtttatattg gcgtgcctgc cattatcaac cgaaacggta 3480 ttcgtgaagt gatggaattg acgctaaatg aaacagaaca agggcgaatt ctgcagatat 3540 ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca gcatgcctgc aggtcgactc tagaaaatca 3600 atctcttttt ccaaagtttg ttttttaaat ttagctgtct caatatgttt acggtcagag 3660 ccacgttcac cacgcttcaa ctcaaaaccc tgttttttca tatgctcggg gaatttatct 3720 tgtagccata acagttcttg acgattaaac acattttttc cttgcagttt tccatcacgc 3780 ataggcacaa cacctaaatg catgtgaggg gtttgctcat cattatgaac tgttgcataa 3840 gcaatatttt gcttgccata tcgttcggaa aataatttat aactttcctc aaaaaatcgt 3900 ttttgttctc ctggatccag ttgctcaaaa aaatctcggt cagatgttac tagcaactca 3960 tttacaagaa cagcatcttt cctcgttttt cttgtacctg ttttttgtga ttcaataatt 4020 tctttgacac gttcgttgta atcaatattt ttatcatttt tcaaatcata attttcacgt 4080 gttcgctcat ggtcaatatc atcattcgtt ctactttttc gctctctttg attatgaaat 4140 tgcatgcctt ttagtccagc tgatttcact ttttgcattc tacaaactgc ataactcata 4200 tgtaaatcgc tcctttttag gtggcacaaa tgtgaggcat tttcgctctt tccggcaacc 4260 acttccaagt aaagtataac acactatact ttatattcat aaagtgtgtg ctctgcgagg 4320 ctgtcggcag tgccgaccaa aaccataaaa cctttaagac ctttcttttt tttacgagaa 4380 aaaagaaaca aaaaaacctg ccctctgcca cctcagcaaa ggggggtttt gctctcgtgc 4440 tcgtttaaaa atcagcaagg gacaggtagt attttttgag aagatcactc aaaaaatctc 4500 cacctttaaa cccttgccaa tttttatttt gtccgttttg tctagcttac cgaaagccag 4560 actcagcaag aataaaattt ttattgtctt tcggttttct agtgtaacgg acaaaaccac 4620 tcaaaataaa aaagatacaa gagaggtctc tcgtatcttt tattcagcaa tcgcgcccga 4680 ttgctgaaca gattaataat agattttagc tttttatttg ttgaaaaaag ctaatcaaat 4740 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ctacctgtac agtcaaggat ggtagaaatg ttgtcggtcc ttgcacacga atattacgcc 5640 atttgcctgc atattcaaac agctcttcta cgataagggc acaaatcgca tcgtggaacg 5700 tttgggcttc taccgattta gcagtttgat acactttctc taagtatcca cctgaatcat 5760 aaatcggcaa aatagagaaa aattgaccat gtgtaagcgg ccaatctgat tccacctgag 5820 atgcataatc tagtagaatc tcttcgctat caaaattcac ttccaccttc cactcaccgg 5880 ttgtccattc atggctgaac tctgcttcct ctgttgacat gacacacatc atctcaatat 5940 ccgaataggg cccatcagtc tgacgaccaa gagagccata aacaccaata gccttaacat 6000 catccccata tttatccaat attcgttcct taatttcatg aacaatcttc attctttctt 6060 ctctagtcat tattattggt ccattcacta ttctcattcc cttttcagat aattttagat 6120 ttgcttttct aaataagaat atttggagag caccgttctt attcagctat taataactcg 6180 tcttcctaag catccttcaa tccttttaat aacaattata gcatctaatc ttcaacaaac 6240 tggcccgttt gttgaactac tctttaataa aataattttt ccgttcccaa ttccacattg 6300 caataataga aaatccatct tcatcggctt tttcgtcatc atctgtatga atcaaatcgc 6360 cttcttctgt gtcatcaagg tttaattttt tatgtatttc ttttaacaaa ccaccatagg 6420 agattaacct tttacggtgt aaaccttcct ccaaatcaga caaacgtttc aaattctttt 6480 cttcatcatc ggtcataaaa tccgtatcct ttacaggata ttttgcagtt tcgtcaattg 6540 ccgattgtat atccgattta tatttatttt tcggtcgaat catttgaact tttacatttg 6600 gatcatagtc taatttcatt gcctttttcc aaaattgaat ccattgtttt tgattcacgt 6660 agttttctgt attcttaaaa taagttggtt ccacacatac caatacatgc atgtgctgat 6720 tataagaatt atctttatta tttattgtca cttccgttgc acgcataaaa ccaacaagat 6780 ttttattaat ttttttatat tgcatcattc ggcgaaatcc ttgagccata tctgacaaac 6840 tcttatttaa ttcttcgcca tcataaacat ttttaactgt taatgtgaga aacaaccaac 6900 gaactgttgg cttttgttta ataacttcag caacaacctt ttgtgactga atgccatgtt 6960 tcattgctct cctccagttg cacattggac aaagcctgga tttacaaaac cacactcgat 7020 acaactttct ttcgcctgtt tcacgatttt gtttatactc taatatttca gcacaatctt 7080 ttactctttc agccttttta aattcaagaa tatgcagaag ttcaaagtaa tcaacattag 7140 cgattttctt ttctctccat ggtctcactt ttccactttt tgtcttgtcc actaaaaccc 7200 ttgatttttc atctgaataa atgctactat taggacacat aatattaaaa gaaaccccca 7260 tctatttagt tatttgttta gtcacttata actttaacag atggggtttt tctgtgcaac 7320 caattttaag ggttttcaat actttaaaac acatacatac caacacttca acgcaccttt 7380 cagcaactaa aataaaaatg acgttatttc tatatgtatc aagataagaa agaacaagtt 7440 caaaaccatc aaaaaaagac accttttcag gtgctttttt tattttataa actcattccc 7500 tgatctcgac ttcgttcttt ttttacctct cggttatgag ttagttcaaa ttcgttcttt 7560 ttaggttcta aatcgtgttt ttcttggaat tgtgctgttt tatcctttac cttgtctaca 7620 aaccccttaa aaacgttttt aaaggctttt aagccgtctg tacgttcctt aag 7673 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 3 ggaattccct tatgaaccaa ggaatagca 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 4 gcggccgcac ccgctctttc ggtaacccgc t 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 5 gcggccgctt gctaagtgaa tattttcaag t 31 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 6 ctgcagcgtc aattccatca cttcacga 28

Claims

에탄올 생산을 증가시키기 위해 개조된 호열성 미생물로,

상기 개조는 야생형 호열성 미생물의 락테이트 디하이드로게나제의 유전자를 비활성화하는 것인 호열성 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 제한계를 포함하지 않는 것인 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 지오바실러스(Geobacillus) 종인 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 지오바실러스 설모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)인 미생물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 포자-형성체인 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 에탄올을 30%(w/v)까지 포함하는 배양 배지에서 안정한 것인 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 셀로비오스 및/또는 녹말이나, 그들의 올리고머를 대사할 수 있는 것인 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 높은 빈도로 형질전환될 수 있는 것인 미생물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 40℃~85℃, 바람직하게는 50℃~70℃의 온도에서 성장하는 것인 미생물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 비-선천적 pdc 유전자를 포함하는 것인 미생물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 비-선천적 adh 유전자를 포함하는 것인 미생물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 선천적인 락테이트 디하이드로게나제 유전자 또는 그 일부가 결손된 것인 미생물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 락테이트 디하이드로게나제 유전자 내에 통합 요소를 포함하지 않는 것인 미생물.
NCIMB 등록번호 41275로 기탁된 미생물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 C₃, C₅ 또는 C₆ 당, 또는 그들의 올리고머가 존재하는 적절한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 에탄올 생산 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 40℃~70℃ 사이의 온도에서 수행하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 온도는 52℃~65℃인 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물을 pH 4 내지 7.5의 배양물에 유지시키는 방법.
pUB 190-ldh로 정의되는 플라스미드.
제19항의 플라스미드를 포함하는 호열성 미생물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포함하는 가축 사료.