CN107699535A - 一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用,所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因,并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过强化丙酮酸到草酰乙酸的反应,增加流向草酰乙酸的碳通量,增强了细胞膜对岩藻糖的运输,增加了胞内岩藻糖的浓度,促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单,便于使用,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程的技术领域,具体涉及一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
母乳中含有重要营养成分,生物活性物质,刺激肠道菌群生长的因子。其中,母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用,例如促进双歧杆菌生长,病原体感染的抑制作用,和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力,已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成,这就需要鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高,许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中,GDP-L-fucose以L-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料,由HBr、Ag2CO3、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体,可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,因此,一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径:补救途径和从头途径。
补救途径是在人类的代谢途径中发现的,外源的岩藻糖转移到胞内,由岩藻糖激酶消耗ATP磷酸化(EC2.7.1.52)形成岩藻糖-1-磷酸(Fuc-1-P)。Fuc-1-P结合鸟苷三磷酸(GTP)在岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase)(EC2.7.7.30)的催化下生成GDP-L-岩藻糖。从头合成途径普遍存在于原核生物和真核生物中,其中GDP-L-fucose是由GDP-甘露糖通过甘露糖脱氢酶(GMD,EC4.2.1.47)和GDP-岩藻糖合成酶(WCAG,EC1.1.1.271)催化合成的。其中有代表性的反应方案如下所示:
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主,其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。
因此,如何利用枯草芽孢杆菌,通过生物方法高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖,仍是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用,构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。
具体的,一方面,本发明提供了一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因,并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因是不表达的,通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因,并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因,提高了外源岩藻糖转移至胞内的效率,增加了胞内岩藻糖的浓度,促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。
其中,将枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因的启动子替换为诱导型启动子Pgrac,来诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因。诱导型启动子Pgrac强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应,增加流向草酰乙酸的碳通量,增强了细胞膜对岩藻糖的运输,提高了胞内岩藻糖浓度,促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累。
所述糖转运蛋白基因如NCBI中GeneID:936346所示。
优选的,所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为脆弱拟杆菌9343的fkp基因。所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。
第二方面,本发明还提供了一种所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,该构建方法包括以下步骤:
(1)构建包含糖转运蛋白基因的上下游序列、Pgrac启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框,将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168,通过验证,确认糖转运蛋白基因诱导表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIG;
(2)构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒,将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌BIG,通过验证,确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。
优选的,步骤(1)中,替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)中,重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面,本发明还提供了一种所述重组枯草芽孢杆菌的应用,使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成鸟苷二磷酸岩藻糖。
优选的,所述发酵是将重组芽孢杆菌种子液以OD值为0.1-0.3的接种量接入发酵培养基中,同时加入0.2mM IPTG,在35-40℃、200-250rpm条件下培养20-25h。
本发明的有益效果为:
本发明的重组枯草芽孢杆菌,是在枯草芽孢杆菌168的基础上诱导表达了糖转运蛋白基因,并在此基础上表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应,增加流向草酰乙酸的碳通量,增强了细胞膜对岩藻糖的运输,提高了胞内岩藻糖浓度,促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累,增加了胞内岩藻糖的浓度,促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单,便于使用,具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3得到的鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。
实施例1
诱导表达糖转运蛋白基因glcP
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)的糖转运蛋白基因glcP的上下游序列、Pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列,构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。
将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞,替换框添加量为100-300ng,电转化条件:电压2.5kV,电击试剂5ms,37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL博来霉素抗性的LB平板,37℃厌氧培养48h,挑选单克隆若干。
将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168,由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcP的上下游序列,与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源,通过同源重组,替换框中的博来霉素抗性基因zeo和Pgrac启动子游替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcP的启动子。
通过博来霉素抗性平板筛选,菌落PCR验证,测序后确认糖转运蛋白基因(glcP)是否强化表达成功,博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌,菌落PCR验证有特殊条带的,且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌,即糖转运蛋白基因(glcP)诱导表达成功的枯草芽孢杆菌。
确认糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功后,得到重组枯草芽孢杆菌BIG。
实施例2
外源表达脆弱拟杆菌外源基因
根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列,通过基因fkp和质粒pP43NMK的限制性酶切位点的酶切及连接,构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒pP43-Fkp。
将构建好的重组质粒电转化重组枯草芽孢杆菌BIG的感受态细胞,重组质粒的添加量为50-300ng,电转化条件:电压2.5kV,电击试剂5ms,37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板,37℃厌氧培养48h,挑选单克隆若干。
通过卡那霉素抗性平板筛选,菌落PCR验证,测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功,卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌,菌落PCR验证有特殊条带的,且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌,即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。
确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。
实施例3
发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BIGF制成种子液,种子液培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L;种子液制作方法为:挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中,培养8-10h。
以OD值为0.1的接种量将种子液接入到发酵培养基中,发酵培养基的配方为:初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO46g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L;微量元素溶液按g/L计含有:MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO40.05,5MHCl,同时加入诱导剂0.2mM IPTG,于35℃、200rpm条件下培养20h。
发酵结束时,使用气质联用色谱仪测定发酵上清液中的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量,鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图如图1所示,测定的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量达到62mg/L。
实施例4
发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BIGF制成种子液,种子液培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L;种子液的制作方法为:挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中,培养8-10h。
以OD值为0.3的接种量将种子液接入到发酵培养基中,发酵培养基的配方为:初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO46g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L;微量元素溶液按g/L计含有:MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl,同时加入诱导剂0.2mM IPTG,于40℃、250rpm条件下培养25h。
发酵结束时,发酵上清液中鸟苷二磷酸岩藻糖含量达到60mg/L。
对比例1
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)的糖转运蛋白基因glcP的上下游序列、Pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列,构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。
将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168,由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcP的上下游序列,与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源,通过同源重组,替换框中的Pgrac启动子替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcP的启动子。
通过博来霉素抗性平板筛选,菌落PCR验证,测序后确认糖转运蛋白基因(glcP)是否强化表达成功,博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌,菌落PCR验证有特殊条带的,且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌,即糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。
确认糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功后,得到重组枯草芽孢杆菌BIG。
用重组枯草芽孢杆菌BIG发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖,发酵结束时,离心收集获得细胞,超声破碎获得胞内可溶性混合液,其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。
对比例2
根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列,构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒。
将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168。
通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证,测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功,卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌,菌落PCR验证有特殊条带的,且测序结果与理论结果一致的为替换框重组成功的枯草芽孢杆菌,即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。
确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIF。
用重组枯草芽孢杆菌BIF发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖,发酵结束时,离心收集获得细胞,超声破碎获得胞内可溶性混合液,其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 光明乳业股份有限公司
<120> 一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3022
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
ttgtgaaaac tttcggcggg aagtcatttg aaaacgtaga tgaactaatt gatgcctcag 60
aaggtttaat tgtagcatca ccaaactttt gccataaaga acatgctttg caagcattag 120
gaaaacataa gcatgtatta tgtgaaaagc ctatggctat ttctcttgaa gaagcaagca 180
taatgaaaga tactgctgaa aggttgagcg taagagccag tatgggattt aattatagat 240
atttatctta cgtaaatatc ttaaaaagct taattatcaa taatgaacta ggtaacatac 300
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accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600
gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660
tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720
atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780
aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840
cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900
ggaaaagtga gaccatggag agaaaagaaa atcgctaatg ttgattactt tgaacttctg 960
catattcttg aatttaaaaa ggctgaaaga gtaaaagatt gtgctgaaat attagagtat 1020
aaacaaaatc gtgaaacagg cgaaagaaag ttgtatcgag tgtggttttg taaatccagg 1080
ctttgtccaa tgtgcaactg gaggagagca atgaaacatg gcattcagtc acaaaaggtt 1140
gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200
aaaaatgttt atgatggcga agaattaaat aagagtttgt cagatatggc tcaaggattt 1260
cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320
gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380
gtggaaccaa cttattttaa gaatacagaa aactacgtga atcaaaaaca atggattcaa 1440
ttttggaaaa aggcaatgaa attagactat gatccaaatg taaaagttca aatgattcga 1500
ccgaaaaata aatataaatc ggatatacaa tcggcaattg acgaaactgc aaaatatcct 1560
gtaaaggata cggattttat gaccgatgat gaagaaaaga atttgaaacg tttgtctgat 1620
ttggaggaag gtttacaccg taaaaggtta atctcctatg gtggtttgtt aaaagaaata 1680
cataaaaaat taaaccttga tgacacagaa gaaggcgatt tgattcatac agatgatgac 1740
gaaaaagccg atgaagatgg attttctatt attgcaatgt ggaattggga acggaaaaat 1800
tattttatta aagagtagtt caacaaacgg gccagtttgt tgaagattag atgctataat 1860
tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920
ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980
agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040
attaaggaac gaatattgga taaatatggg gatgatgtta aggctattgg tgtttatggc 2100
tctcttggtc gtcagactga tgggccctat tcggatattg agatgatgtg tgtcatgtca 2160
acagaggaag cagagttcag ccatgaatgg acaaccggtg agtggaaggt ggaagtgaat 2220
tttgatagcg aagagattct actagattat gcatctcagg tggaatcaga ttggccgctt 2280
acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340
gtgtatcaaa ctgctaaatc ggtagaagcc caaacgttcc acgatgcgat ttgtgccctt 2400
atcgtagaag agctgtttga atatgcaggc aaatggcgta atattcgtgt gcaaggaccg 2460
acaacatttc taccatcctt gactgtacag gtagcaatgg caggtgccat gttgattggt 2520
ctgcatcatc gcatctgtta tacgacgagc gcttcggtct taactgaagc agttaagcaa 2580
tcagatcttc cttcaggtta tgaccatctg tgccagttcg taatgtctgg tcaactttcc 2640
gactctgaga aacttctgga atcgctagag aatttctgga atgggattca ggagtggaca 2700
gaacgacacg gatatatagt ggatgtgtca aaacgcatac cattttgaac gatgacctct 2760
aataattgtt aatcatgttg gttacgtatt tattaacttc tcctagtatt agtaattatc 2820
atggctgtca tggcgcatta acggaataaa gggtgtgctt aaatcgggcc attttgcgta 2880
ataagaaaaa ggattaatta tgagcgaatt gaattaataa taaggtaata gatttacatt 2940
agaaaatgaa aggggatttt atgcgtgaga atgttacagt ctatcccggc attgccagtc 3000
ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060
catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120
agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180
ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240
atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300
aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360
aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420
cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480
cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540
gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600
aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660
aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720
aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780
aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840
atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900
aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960
gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020
aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080
gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140
tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200
attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260
gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320
atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380
tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accgagctca 4440
aaggaggtga aatgtacaca tgcaaaagtt actgtctctc ccatctaact tagtccagag 4500
ctttcatgaa ttagaaagag taaatcggac tgactggttt tgcacatccg acccggtcgg 4560
aaaaaagctt ggcagtggcg gtggcacatc atggctgctc gaggaatgct ataatgaata 4620
ctctgacggc gcaactttcg gagagtggct cgaaaaagag aaaagaatac tgctccacgc 4680
cggtgggcag tcccgccgtt tgccgggtta cgctcctagt ggtaagatcc ttacgccggt 4740
cccagtattt cgctgggaaa gaggacagca cctgggccag aaccttttga gtttacagct 4800
tccactttat gagaaaataa tgagcttagc tcctgacaag cttcataccc ttatcgccag 4860
cggagatgtc tatatacgct ctgaaaaacc gttgcagtcc atacctgagg ccgacgttgt 4920
ttgttacggg ctgtgggtcg acccttcctt ggcgacgcac catggggtat tcgccagtga 4980
ccgcaaacat ccggagcagc tcgacttcat gctccagaag ccttctttgg cagaacttga 5040
aagtctctct aagactcatc ttttcctgat ggacataggg atttggttat tgtccgatcg 5100
cgcggtagag attttgatga agcggtccca taaggagtcc tctgaagaat tgaaatacta 5160
tgatctttac agcgactttg ggcttgccct gggcacccac ccacggatag aagatgagga 5220
agtgaatact ctctcagttg caattctgcc tctcccgggc ggggagtttt atcattacgg 5280
tactagcaaa gagctgattt cctccaccct gtcagtccag aataaggttt atgaccaacg 5340
ccggatcatg catagaaagg tcaaaccgaa ccctgccatg tttgtccaaa atgcggtagt 5400
acgtatccca ctgtgcgctg agaacgcaga cctctggatt gaaaactcac atataggtcc 5460
gaagtggaag atagcgagcc ggcatattat tactggggtg ccggagaacg actggagttt 5520
agcagtgcca gcaggggtat gtgtcgacgt tgtcccgatg ggtgataaag gttttgtggc 5580
acggccttac gggctggacg atgtatttaa aggagacctg agagattcaa aaaccacttt 5640
gaccggaatc ccattcggtg aatggatgtc caaacgggga ctctcctaca ctgatctgaa 5700
aggtcggact gacgaccttc aagccgtgag cgtgtttccg atggtcaatt ccgttgagga 5760
attgggcctc gtactccgct ggatgctttc agaacctgag ttggaagagg gtaagaacat 5820
ctggcttcgc tccgagcact tctctgcgga tgaaataagc gctggagcga acctgaagcg 5880
cctctatgct caacgggaag aattccggaa ggggaactgg aaagcattag ccgttaacca 5940
tgagaagtcc gtattttacc aactcgattt ggccgatgcg gcggaggatt tcgtacggtt 6000
gggactcgac atgcctgaat tactccctga ggacgccctg cagatgagtc gcatccataa 6060
tagaatgctt cgcgctcgca tcctcaagct cgacggcaaa gattaccggc ctgaggaaca 6120
ggcagcgttc gatctgctgc gcgacggttt gctcgatgga atctctaacc gtaaaagcac 6180
accaaagctg gacgtttatt ctgaccaaat agtgtggggc cggagcccag tacggattga 6240
tatggccggc ggctggaccg acaccccacc ttatagctta tattccggag gcaatgttgt 6300
gaaccttgcg attgaattaa atggtcaacc tccattgcag gtatacgtta agccgtgtaa 6360
ggacttccat atcgtcctgc ggtccattga catgggggct atggagatag tctcaacttt 6420
tgacgagctg caagactaca aaaagatcgg ttccccgttt tccataccaa aagccgctct 6480
ctctcttgct ggattcgccc cggcatttag cgctgtgtca tatgcatcat tggaggaaca 6540
gttgaaagat tttggagctg gtattgaggt tacgttatta gccgccattc cggctggttc 6600
tggtcttggt acatcatcaa tactggcttc cacagtgctc ggggcaatta atgatttttg 6660
tggactcgca tgggacaaaa atgaaatttg tcagagaaca ttagttttag agcaactgct 6720
gactacggga ggaggctggc aggaccagta cggcggggtc ttgcaaggtg ttaagcttct 6780
gcagaccgag gccgggttcg cgcaatcccc attagttaga tggctgccag accacctctt 6840
tacgcaccct gaatacaagg actgccattt gttatattac acaggaatta cgcgtacggc 6900
aaagggaata ctggcggaga tcgtctctag catgtttctc aatagtagcc tgcacctgaa 6960
tttactctca gaaatgaaag cgcatgccct cgacatgaac gaggctatac agcgcggctc 7020
ctttgttgag ttcggtcgcc ttgtcggaaa gacatgggag caaaacaagg cactcgacag 7080
tggtaccaac ccaccagcag tcgaagccat aatcgactta attaaggatt atacattagg 7140
gtataaactc ccaggggctg gaggaggcgg gtacctctac atggttgcta aagatccgca 7200
ggcagcagtg cgcatccgca aaattttaac agagaacgcg ccaaaccctc gtgcccggtt 7260
tgtggaaatg actctgtccg acaaaggctt tcaagtaagt cggtcctaaa ctagtgattg 7320
ctagctctag actgcagaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 7380
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 7440
ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 7500
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 7560
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 7620
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 7680
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7740
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 7800
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 7860
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 7920
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 7980
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 8040
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 8100
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 8160
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 8220
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 8280
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8340
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 8400
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 8460
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 8520
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 8580
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 8640
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 8700
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 8760
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 8820
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 8880
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 8940
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 9000
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 9060
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 9120
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 9180
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 9240
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 9300
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 9360
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 9420
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 9480
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 9540
acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 9577
Claims (10)
1.一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因,并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
2.根据权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,将枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因的启动子替换为诱导型启动子Pgrac,来诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述糖转运蛋白基因如NCBI中Gene ID:936346所示。
4.根据权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为来源于脆弱拟杆菌9343的fkp基因。
5.根据权利要求4所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。
6.一种权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,该构建方法包括以下步骤:
(1)构建包含糖转运蛋白基因的上下游序列、Pgrac启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框,将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168,通过验证,确认糖转运蛋白基因诱导表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIG;
(2)构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒,将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌BIG,通过验证,确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功,得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。
7.根据权利要求6所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求6所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。
9.权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于,使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成鸟苷二磷酸岩藻糖。
10.根据权利要求9所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于,所述发酵是将重组芽孢杆菌种子液以OD值为0.1-0.3的接种量接入发酵培养基中,同时加入0.2mM IPTG,在35-40℃、200-250rpm条件下培养20-25h。
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