CN114875159A - 一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法，使用实时荧光定量PCR技术对输水系统中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检测，用于扩增所述淡水壳菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明使用实时荧光定量PCR法对水体中淡水壳菜DNA含量进行绝对定量的检测，该检测方法简单易操作，灵敏度稿，快速且有效，成本低廉，可广泛应用于水体中入侵物种淡水壳菜成分的量化鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法。
背景技术
淡水壳菜又名沼蛤，生物学上隶属于软体动物、双壳类和贻贝科。侧面像一个三角形；腹面较平坦，隆起的一面是背部；腹面有两个开口，有咬合齿和足丝，表面主要由浅绿色、棕色等混合而成，一般随着年龄的增长，外壳颜色较深。主要以浮游藻类，有机物和微生物为食，喜食浮游藻类(蓝藻和绿藻)的滤食性生物，幼虫约100-500um，成虫约8-30mm。高约10mm,外壳薄，但较硬。淡水壳菜在幼虫变态后具有丰富的足丝，以此固着水下砖石，船舶、码头的木桩、堤坝、管道上等，易堆积成块生活，且易生活在较干净的水质中。
淡水壳菜易随水流进入输水管道系统中，其存在对长距离地下箱涵输水系统是一种巨大的隐患，淡水壳菜分泌的足丝易产生酸液具有较强的腐蚀作用；较强的附着能力促使其很难移动，较低的水速使其易在管道拐角处形成堆积状态，减少管道过流面积，堵塞管道，增大管道输水能耗。并且极大的影响了水质，对人类的身体健康造成了隐患。但是地下输水系统取水口处无法进行排空以致无法对淡水壳菜进行密度和大小进行定量，所以，建立一套快速解析箱涵关键物种淡水壳菜含量的检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的不能快速有效地检测地下输水系统管道中淡水壳菜含量的问题，提供一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法，使用实时荧光定量PCR技术对输水系统中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检测，用于扩增所述淡水壳菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选地，包括以下步骤：
S1、以淡水壳菜DNA为模板进行PCR扩增，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物；PCR扩增产物连接pMD18-TVector获得重组质粒；
S2、测定S1中重组质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数；并对S1中的重组质粒进行10倍梯度稀释得到重组质粒稀释液，选择重组质粒的10-2～10-7倍稀释液作为标准品用于制备标准曲线；
S3、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，使用SYBR荧光定量PCR法检测标准品中淡水壳菜DNA的CT值，制得标准曲线；
S4、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，使用SYBR荧光定量PCR法检测待测样本中淡水壳菜DNA的CT值，将待测样本中淡水壳菜DNA的CT值带入S3制得的标准曲线中，计算获得待测样本中淡水壳菜的DNA绝对含量。
优选地，所述S1中获得的重组质粒的长度为2937bp，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述S4中待测样本来源于地下输水系统管道中的水体。
进一步优选，所述S1中PCR扩增的反应程序为：95℃保持3min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续35个循环。
进一步优选，所述S3和S4中PCR反应程序为：95℃保持5min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续40个循环。
Real-time qPCR(实时荧光定量PCR)就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。本发明主要使用实时荧光定量PCR技术对淡水壳菜在长距离地下箱涵输水系统中的大致数量进行快速有效的检测。
本发明所具有的有益效果：本发明使用实时荧光定量PCR法对水体中淡水壳菜DNA含量进行绝对定量的检测，该检测方法简单易操作，灵敏度稿，快速且有效，成本低廉，可广泛应用于水体中入侵物种淡水壳菜成分的量化鉴定。
附图说明
图1为实施例1中标准品的荧光PCR扩增曲线；
图2为实施例1中标准品的溶解曲线；
图3为实施例1中根据标准品制备的标准曲线；
图4为实施例2中待测样品的荧光PCR扩增曲线；
图5为实施例2中待测样品的溶解曲线；
图6为实施例1中淡水壳菜DNA片段的PCR扩增产物的电泳图；
图7为实施例1中重组质粒构建示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix(2X)试剂盒购自南京诺唯赞；大肠杆菌Top10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1
(1)引物设计：从NCBI下载淡水壳菜的DNA序列，并设计用于淡水壳菜PCR扩增的引物序列，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
(2)重组质粒制备：以淡水壳菜DNA为模板进行PCR扩增，淡水壳菜DNA为环境eDNA样品，通过对地下箱涵输水系统中采集水样，一般为2L，之后带回实验室使用0.45μm的滤膜对水样进行抽滤，将滤到滤膜中的DNA使用FAST DNA spin kit for soil试剂盒提取。扩增引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。PCR反应扩增体系为：dNTP Mix 4μL，Ex Taq(DNA聚合酶)0.5μL，上下游引物各0.25μL(浓度为10μmol/L)、模板DNA 1μL，用灭菌水补齐至25μL。PCR反应程序:加热变性95℃持续3min，在每一个循环中，先于95℃保持30s使模板变性，然后将温度降到复性温度56℃保持30s，最后在72℃保持40s持续35个循环，获得PCR扩增产物，扩增产物电泳图如附图6所示，PCR扩增片段长度为245bp，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。将PCR扩增产物连接pMD18-TVector获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞后测序鉴定并保存；重组质粒长度为2937bp，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，重组质粒构建示意图如附图7所示。
(3)标准曲线制备：将构建好的重组质粒用超微量可见光紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μl)，质粒起始拷贝数换算公式(copies/μl)＝浓度(ng/μl)*10-9*6.02*1023/(分子量*660)注：分子量指的是载体的大小加上目的基因的片段大小。
对重组质粒进行10倍梯度稀释得到重组质粒稀释液，选择重组质粒的10-2～10-7倍稀释液作为标准品用于制备标准曲线。以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，以标准品为模板，采用ChamQ SYBR Color qPCRMasterMix(2X)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测标准品中淡水壳菜DNA的CT值，并结合标准品的稀释浓度制得标准曲线。PCR反应程序为：95℃保持5min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续40个循环。标准品的荧光PCR扩增曲线如附图1所示；溶解曲线如附图2所示；标准曲线如附图3所示。扩增曲线中的各个时期稳定，溶解曲线没有杂峰，证明引物设计良好，扩增效果理想。
实施例2
在实施例1的基础上，对待测样品中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检测。
待测样品为南水北调天津干线中西黑山、外环河、王庆坨、霸州的地下箱涵输水管道中的水体。
以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，提取待测样品的总DNA为模板，采用ChamQ SYBR ColorqPCRMasterMix(2X)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测待测样本中淡水壳菜DNA的CT值。PCR反应程序为：95℃保持5min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续40个循环。得到待测样品的荧光PCR扩增曲线如附图4所示；溶解曲线如附图5所示。根据扩增曲线，霸州、外环河、王庆坨、西黑山的平均Ct值分别为27.44、29.78、27.46、29.87。将上述CT值带入实施例1中制得的标准曲线中，具体公式如下：
计算获得各样本中淡水壳菜的DNA绝对含量分别为霸州56.788、外环河11.304、王庆坨55.870、西黑山12.062。
综上，本发明使用实时荧光定量PCR法对水体中淡水壳菜DNA含量进行绝对定量的检测，该检测方法简单易操作，灵敏度稿，快速且有效，成本低廉，可广泛应用于水体中入侵物种淡水壳菜成分的量化鉴定。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南开大学 中国南水北调集团中线有限公司天津分公司
<120> 一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ccatccaaaa tactctgaaa tggtcggtaa agctattgga gcactgaaag agaggggagg 120
tagttccaga caggctattt taaagtatat catggccaac tttaatgttg gcaaggatgc 180
caagccagta aatgctcact tgaagttagc cttgaaggcc ggagtaaaga acaagagcct 240
gaaac 245
Claims (6)
1.一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法，其特征在于，使用实时荧光定量PCR技术对输水系统中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检测，用于扩增所述淡水壳菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以淡水壳菜DNA为模板进行PCR扩增，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物；PCR扩增产物连接pMD18-TVector获得重组质粒；
S2、测定S1中重组质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数；并对S1中的重组质粒进行10倍梯度稀释得到重组质粒稀释液，选择重组质粒的10-2～10-7倍稀释液作为标准品用于制备标准曲线；
S3、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，使用SYBR荧光定量PCR法检测标准品中淡水壳菜DNA的CT值，制得标准曲线；
S4、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物，使用SYBR荧光定量PCR法检测待测样本中淡水壳菜DNA的CT值，将待测样本中淡水壳菜DNA的CT值带入S3制得的标准曲线中，计算获得待测样本中淡水壳菜的DNA绝对含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1中获得的重组质粒的长度为2937bp，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S4中待测样本来源于地下输水系统管道中的水体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1中PCR扩增的反应程序为：95℃保持3min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续35个循环。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S3和S4中PCR反应程序为：95℃保持5min之后，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持续40个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210625123.9A CN114875159A (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210625123.9A CN114875159A (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114875159A true CN114875159A (zh) | 2022-08-09 |
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| CN202210625123.9A Pending CN114875159A (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010130977A (ja) * | 2008-12-08 | 2010-06-17 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | カワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法 |
| JP2011097922A (ja) * | 2009-10-05 | 2011-05-19 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | 海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法 |
| CN111926090A (zh) * | 2020-09-09 | 2020-11-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒 |
-
2022
- 2022-06-02 CN CN202210625123.9A patent/CN114875159A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2010130977A (ja) * | 2008-12-08 | 2010-06-17 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | カワヒバリガイ検出用プライマーセットとこれを利用したカワヒバリガイ幼生の検出・定量方法 |
| JP2011097922A (ja) * | 2009-10-05 | 2011-05-19 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | 海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法 |
| CN111926090A (zh) * | 2020-09-09 | 2020-11-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RUONAN WANG等: "Study on the Law of Harmful Gas Release from Limnoperna fortunei (Dunker 1857) during Maintenance Period ofWater Tunnel Based on K-Means Outlier Treatment", 《APPLIED SCIENCE》, vol. 11, 16 December 2021 (2021-12-16) * |
| 刘信勇等: "南水北调中线工程天津干线段淡水壳菜的风险评估", 《中国水利学会2019学术年会论文集第四分册》, 22 October 2019 (2019-10-22) * |
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