EA017548B1 - Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, и способ получения этанола при его использовании - Google Patents

Abstract

Предложен термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, в котором первая модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы, а вторая модификация активирует ген пируватдегидрогеназы.

Description

Данное изобретение касается получения этанола как продукта бактериального брожения. В частности, изобретение касается продуцирования этанола термофильными бактериями.

Предшествующий уровень техники

Бактериальный метаболизм может протекать по различным механизмам, в зависимости от вида бактерий и от условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, к которым относятся все патогенные микроорганизмы, получают энергию за счет окисления органических соединений; как правило, в роли таких веществ выступают углеводы (особенно глюкоза), липиды и белки. Биологическое окисление этих органических соединений бактериями приводит к синтезу АТФ как источника химической энергии. Этот процесс допускает также продукцию более простых органических веществ (молекулпредшественников), которые требуются бактериальной клетке для биосинтетических реакций. Основной процесс, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие субстраты, - это гликолиз, представляющий собой последовательность реакций, в результате которой глюкоза превращается в пируват с одновременным синтезом АТФ. Судьба пирувата в процессе выработки метаболической энергии может быть различной, в зависимости от микроорганизмов и условий окружающей среды. Существуют три основные реакции с участием пирувата.

Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы получают энергию, используя цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетил-коэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой (ΡΌΗ).

Во-вторых, в анаэробных условиях определенные организмы, продуцирующие этанол, могут осуществлять спиртовое брожение путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, которое катализируется пируватдекарбоксилазой (РЭС). и последующего восстановления ацетальдегида до этанола с помощью НАДН, которое катализируется алкогольдегидрогеназой (ΑΌΗ).

Третий процесс представляет собой превращение пирувата в лактат, осуществляемое посредством катализа лактатдегидрогеназы (ЬЭН).

Большой интерес представляет собой применение микроорганизмов для получения этанола, с использованием как микроорганизмов, естественным образом способных осуществлять анаэробное брожение, так и рекомбинантных микроорганизмов, которые включают в себя гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Несмотря на то, что уже имеются некоторые успехи в получении этанола с использованием таких микроорганизмов, процесс брожения часто затрудняется при повышенных концентрациях этанола, особенно если микроорганизмы имеют низкий порог устойчивости к этанолу.

Было предложено использовать термофильные бактерии для получения этанола; их применение имеет то преимущество, что брожение можно проводить при повышенных температурах, что позволяет отгонять вырабатываемый этанол в виде пара при температурах свыше 50°С; это позволяет также проводить брожение при высоких концентрациях сахара. Тем не менее, поиск подходящих термофильных бактерий, которые могут эффективно вырабатывать этанол, проблематичен.

\νϋ 88/09309 раскрывает продукцию этанола с помощью термофильного штамма Вае111ик ББП-В. ББП-В - это неспорулирующий штамм, который возник спонтанно из культуры и в котором ген Ий был инактивирован путем спонтанной мутации или химического мутагенеза. Тем не менее, данный штамм нестабилен, как будет показано ниже.

νθ 01/49865 раскрывает грамположительную бактерию, которая была трансформирована гетерологичным геном, кодирующим пируватдекарбоксилазу, и которая имеет естественную алкогольдегидрогеназную функцию для выработки этанола. Эта бактерия является термофильной ВаеШик, и она может быть модифицирована путем инактивации гена лактатдегидрогеназы посредством вставки транспозона. Бактерии, раскрытые в νθ01/49865, выведены из штамма ВаеШик ББЭ-В. Штаммы Б-Ν и ΤΝ раскрыты как улучшенные производные штамма ББЭ-В. Однако все штаммы содержат систему рестрикции Нае III типа, которая препятствует трансформации плазмиды и, таким образом, препятствует трансформации в пределах неметилированной ДНК.

νθ 01/85966 раскрывает микроорганизмы, которые были получены с помощью метилирования ίη νίνο, чтобы преодолеть трудности с рестрикцией. Для этого потребовалась трансформация с метилтрансферазой Нае III, полученной из НаеторйЛик аедурйик, штаммов ЬЬП-В, ΕΝ, ΤΝ. Однако штаммы ЬЬО-К, ΕΝ и ΤΝ являются нестабильными мутантами и спонтанно возвращаются к лактатпродуцирующим штаммам дикого типа, особенно при низких рН и высоких концентрациях сахара. Это приводит к изменению продукта брожения с этанола на лактат, что делает данные штаммы непригодными для получения этанола.

νθ 02/29030 раскрывает, что штамм ЕБЭ-К. и его производные содержат встречающийся в природе элемент инсерции (ткейюп е1етеп1, ΣΕ) в кодирующем участке гена Ий. Его траспозиция в ген (или из гена) Ий и последующая инактивация гена нестабильны, что приводит к реверсии. Предложенное решение этой проблемы заключалось в интеграции плазмидной ДНК в последовательность ΣΕ.

Таким образом, успех получения микроорганизмов для выработки этанола зависит от модификации полученных в лабораторных условиях и химически мутированных микроорганизмов ВаеШик, проведения с ними процедуры метилирования ίη νίνο и дальнейшей модификации микроорганизмов с целью инте

- 1 017548 грации плазмидной ДНК в последовательность ΙΕ. Эта процедура сложна, ненадежна, а также имеется нормативное регулирование того, как эти штаммы могут быть использованы.

Таким образом, есть необходимость в получении микроорганизмов улучшенного типа, продуцирующих этанол.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, в котором первая модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы, а вторая модификация активирует ген пируватдегидрогеназы.

Микроорганизм по изобретению демонстрирует повышенную способность к выработке этанола, по сравнению с диким типом.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ продуцирования этанола, включающий культивирование микроорганизма согласно приведенному выше определению в подходящих условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахаров.

Краткое описание графических материалов

Настоящее изобретение описано со ссылками на сопроводительные графические материалы, где фиг. 1 схематично изображает метаболический путь гликолиза;

фиг. 2 изображает гены комплекса пируватдегидрогеназы (ΡΌΗ);

фиг. 3 представляет собой схему конструкции с замещенным промотором для целевой активации ΡΌΗ;

фиг. 4 представляет собой схему конструкции с замещенным промотором для мутантов двойного кроссовера с активированным геном ΡΌΗ;

фиг. 5 представляет собой схему нокаутной конструкции, предназначенной для получения стабильного РРЬ-негативного мутанта и, наконец, фиг. 6 является графическим изображением повышенного уровня продукции этанола, который достигается мутантным микроорганизмом по изобретению.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма с целью блокировки экспрессии гена лактатдегидрогеназы и активации гена ΡΌΗ.

Инактивация гена лактатдегидрогеназы позволяет предотвратить расщепление пирувата до лактата и потому способствует (при подходящих условиях) расщеплению пирувата до этанола с помощью пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, чтобы ген лактатдегидрогеназы был блокирован путем делеции внутри или вне гена.

Активация гена ΡΌΗ способствует превращению пирувата в ацетил-КоА, который далее при подходящих условиях может быть использован для продуцирования ацетальдегида и, в конечном счете, этанола с помощью ацетальдегиддегидрогеназы. Еще одно преимущество активации ΡΌΗ заключается в том, что уровень пирувата, способного оказывать ингибирующий эффект на захват глюкозы и гликолиз, оказывается сниженным. Это еще сильнее активирует выработку этанола.

Для описанной выше модификации можно использовать любой термофильный микроорганизм, но предпочтительно, чтобы он относился к ВасШик крр. Особенно желательно, чтобы это был микроорганизм дикого типа, принадлежащий к видам СеоЬасШик, а особенно СеоЬасШик ШеттодЫсойбайик.

В предпочтительном воплощении микроорганизмы, выбранные для модификации, называют микроорганизмами дикого типа, т.е. они не являются мутантами, полученными в лабораторных условиях. Микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, в которых ожидают присутствие термофилов. Выделенные микроорганизмы дикого типа будут способны продуцировать этанол, но в отсутствие модификации основным продуктом брожения, скорее всего, будет лактат. Такие микроорганизмы выбирают также из-за их способности расти на гексозах и/или пентозах, а также на состоящих из них олигомерах, при термофильных температурах.

Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению имел конкретные желаемые характеристики, которые позволили бы использовать его в процессе брожения. Микроорганизм желательно не должен иметь системы рестрикции, что устранило бы необходимость в метилировании ίη у1уо. Кроме того, микроорганизм должен быть устойчив по меньшей мере в 3% этаноле и должен быть способен усваивать С3, С5 и С6 сахара (или их олигомеры) как субстрат, включая целлобиозу и крахмал. Предпочтительно, чтобы микроорганизм можно было трансформировать с высокой частотой. Более того, микроорганизм должен иметь такую скорость роста в непрерывной культуре, чтобы обеспечивать скорости разбавления порядка 0,3 ч^-1 и выше (стандартно 0,3 ОП_6Оо).

Микроорганизм должен являться термофилом и быть способным к росту в диапазоне температур 4085°С. Предпочтительно, чтобы микроорганизм был способен к росту в температурном диапазоне 50-70°С. Кроме того, желательно, чтобы микроорганизм мог расти при рН 7,2 и ниже, в частности рН 6,9-рН 4,5.

Микроорганизм может быть спорообразующим или может не спорулировать. Успех процесса брожения не обязательно зависит от способности микроорганизма к споруляции, хотя при определенных обстоятельствах может оказаться предпочтительнее работать со спорообразующей бактерией, в случае

- 2 017548 если хотят использовать микроорганизмы как источник корма для животных по окончании процесса брожения. Это возможно благодаря способности спорулирующих организмов быть хорошими иммунными стимуляторами при их использовании в качестве источника корма для животных. Кроме того, спорообразующие микроорганизмы способны осаждаться в процессе брожения и потому могут быть отделены без помощи центрифугирования. Следовательно, такие микроорганизмы могут использоваться в качестве источника корма для животных, и при этом можно обойтись без сложных или дорогостоящих процедур выделения.

Нуклеотидная последовательность для лактатдегидрогеназы теперь известна. Используя эту последовательность, квалифицированный специалист может достичь инактивации гена лактатдегидрогеназы через различные механизмы. Желательно, чтобы ген лактатдегидрогеназы был инактивирован либо путем вставки транспозона, либо, что предпочтительнее, путем делеции последовательности гена или части последовательности гена. Делеция предпочтительнее, поскольку она позволяет избежать проблем с реактивацией последовательности гена, которая часто происходит при использовании инактивации с помощью транспозона. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируется путем интеграции температурочувствительной плазмиды (плазмида рИВ190-1бй, как описано в РСТ/СВ06/01586), что приводит к естественной гомологичной рекомбинации или интеграции между плазмидой и хромосомой микроорганизма. Хромосомные интегранты для этой цели могут быть выбраны на основании их устойчивости к антибактериальным агентам (например, канамицину). Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может произойти в результате единичной кроссоверной рекомбинации или двух (или более) кроссоверных рекомбинаций. Желательно, чтобы произошел двойной кроссовер, с тем, чтобы удалить ген ЬЭН (или его часть) и изначальный интегрант, т.е. температурочувствительную плазмиду. В этом случае мутантный микроорганизм не будет содержать какой-либо гетерологичной ДНК и потому не будет классифицирован как генетически модифицированный организм (ГМО), согласно положениям о ГМО.

Цель второй модификации - активировать РЭН. РЭН - это большой ферментный комплекс, содержащий три единицы: Е1 - пируватдекарбоксилаза (ЕС 1.2.4.1, не ЕС 4.1.1.1), Е2 - дигидролипоамидтрансацетилаза, и Е3 - дигидролипоамиддегидрогеназа. Для этого комплекса необходим ряд кофакторов, которые включают в себя НАД, ФАД, коэнзим А, липоевую кислоту и тиаминпирофосфат (ТПФ). Этот комплекс кодируется четырьмя генами (поскольку единица Е1 является гетеродимером, состоящим из субъединиц а и β, которые часто обозначаются как рбйА, рбйВ, рбйС и рб11Э (Ε1α, Ε1β, Е2 и Е3, соответственно). Единица Е1 пируватдегидрогеназы требует наличия кофермента ТПФ по той же причине, почему и пируватдекарбоксилаза ЕС 4.1.1.1 требует наличия ТПФ и катализирует аналогичную реакцию декарбоксилирования, но в присутствии коэнзима А и липоевой кислоты, переносимыми другими единицами фермента, продуктом является ацетил-КоА, а не ацетальдегид. Однако была зафиксирована пируватдекарбоксилазная активность единицы Е1, когда последняя была не в комплексе с остальными единицами РЭН (Ьеккагб & Регйаш; Т11С 1оита1 οί Вю1оДса1 СТетМгу; 1994, 269:14, 10378-10383; Тотаг е! а1; Аррйеб МюгоЬю1оду апб Вю1есйпо1оду; 2003, 62, 76-82; Егапк е! а1.; 8с1епсе; 2004, 306: Ос! 29, 872876, 8црр1етеп1агу ба!а). Соответственно, пируватдекарбоксилазная активность фермента ЕС 1.2.4.1 может быть повышена путем активации РЭН, с тем, чтобы ацетальдегид продуцировался в большей степени, чем ацетил-КоА. Повышенной пируватдегидрогеназной активности добиваются также с целью устранения узкого места производства, которым является пируват, чтобы обеспечить выработку большего количества этанола при меньшем количестве ацетата и формиата в качестве побочных продуктов.

С этой целью были выделены гены РЭН и окружающие последовательности с помощью стандартного метода прогулки по хромосоме. Было выделено и секвенировано примерно 8,8 кб ДНК. Было обнаружено, что там содержатся следующие гены, показанные на фиг. 2 и в табл. 1.

- 3 017548

Таблица 1

Ген	Позиция (π. 0.)	Предполагаемая функция	Рамка (а.к. на 5’ и З1)	Размер {а.к.)
ρύ!2	746-192	Пептидцеформилаза	-3 (ΜΙΤ - ΙΕΡ.)	184
огТ2	868-1497	Неизвестная — Гипотетический белок	+1 (МОК - М/К)	209
ρΟιΑ(α)	1Β75-2984	о-субъединица пируватдегидрогеназы	+3 (ΜΘΑ - ЕЗК)	369
ρύΠΑ(β)	3003-3965	/3-субъединица пируватдегидрогеназы	+3{ΜΙ0-ΙΝΡ)	320
ρϋΡΒ	4058-5368	Дигидролипоамидтрансацетилаза	+2 (УАР - МЕА)	436
Ιρϋ	5373-6785	Липоамиддегидрогеназа	+3 (МУУ - Ι3Κ)	470
οιΤ7	7432-6833	Неизвестная — Гипотетический белок	-1 (ΜΝΚ - СТЕ)	199
Ο(ί8	7964-8647	Транспозаза	+2 (МОЕ - ЗРР)	227

Гипотетические участки промотора показаны на фиг. 2 (стрелки) — один слева от начала рбйА и возможный второй промотор, расположенный перед рбйС. Предыдущий пример вторичного промотора в кластере рбй был описан для ВасШик киЫШк (Оао с1 а1.; 1оитпа1 о! Вас1етю1о§у, 2002, 184:10, 2780-2788), однако наиболее широко описанные кластеры гена рбй содержат только один промотор слева от кластера (Ыеуейпд с1 а1.; ВюсЫтса Лс1а; 1998 1385, 367-372). Активацию можно проводить с помощью методик, известных в данной области. В частности, активацию можно осуществить путем введения подходящей промоторной или энхансерной последовательности слева от комплекса рбй.

Известно, что ферментный комплекс работает как в аэробных, так и в анаэробных условиях (Саг1ккоп е1 а1.; 1пГес11оп апб 1штипйу; 1985, 49:3, 674-678), но в целом считается, что это аэробный фермент (С11 15; Рттс1р1е8 оГ Вюсйет181ту; Ьейп1пдег, Ие1коп & Сох; 2'¹ Еб, \Уог111 РиЬНкйегк, Иете Уотк, 1993, р447), при этом пиурват-формиат-лиаза (РЕЬ) является его анаэробным аналогом. Оба фермента превращают пируват, образовавшийся в ходе гликолиза, в ацетил-КоА, чтобы ввести его в цикл трикарбоновых кислот, но этот цикл работает полностью только в аэробных условиях. Тем не менее, поскольку желательно использовать анаэробные условия, в данном изобретении предпочтительно использовать промоторы, работающие в анаэробных условиях. Таким образом, промоторы для ферментов, которые, как полагают, работают в анаэробных условиях, могут быть промоторы 1611 (Р 1бй из О. 81еаго1йетторЫ1ш8 ИСА1503, Ό8Μ13240 и АТСС14579) и промоторы ферредоксина (Р ГеггА из О. 81еаго1йетторЫ1ш8 Ό8Μ13240), которые были идентифицированы, выделены и стабильно интегрированы в подходящий участок, левее и в непосредственной близи от начала рбйА. Использованные штаммы и встроенные в комплекс РИН промоторы показаны в табл. 2. В большинстве примеров промоторы дают десятикратное увеличение экспрессии РИН, возрастание захвата глюкозы, уменьшение концентрации пирувата до пренебрежимо малого уровня и ~50% возрастание продуцирования этанола. Интересно, что уровень ацетата остается прежним, и это приводит к возрастанию отношения этанол: ацетат в пользу продуцирования этанола.

- 4 017548

Таблица 2

Штамм	Промотор	Глюкоза, мМ	Этанол, мМ	Пируват, мМ	Ацетат, мМ
ТМ177	Р№(1503)	0,0	159,4	0,0	18,8
ТМ178	Р 146(1503)	0,0	164,0	0,0	21,1
ТМ216	РМЩ1503) димер	0,0	163,4	0,0	19,6
ТМ218	Р 1(ДЩ1503} димер	0,0	152,1	0,0	21,0
ТМ226	Р 146(13240)	0,0	155,8	0,0	20,9
ТМ227	Р 146(13240)	0,0	158,4	0,0	19,4
ТМ228	Р ρΐΙ1	0,0	152,1	0,0	22,3
ТМ229	ΡρίΙ1	0,0	146,0	0,0	19,9
ТМ230	Р рП2	0,0	150,6	0,0	17,8
ТМ231	Р р(12	0,0	148,6	0,0	19,5
ТМ180	Р 146(1503) ОСО	0,0	152,0	0,0	21,7
ТМ89	(контроль)	23,2	92,7	12,2	21,9

В предпочтительном воплощении третья модификация проводится с целью повышения активности РИС. Это может быть осуществлено путем инактивации Е2 (ЕС2.3.1.12). Инактивацию можно проводить таким же образом, как и инактивацию ЬИН, но в данном случае мишенью для блокировки выступает ген Е2.

В дальнейшем осуществлении микроорганизм по изобретению включает в себя дальнейшую модификацию, которая инактивирует ген пируват-фармиат-лиазы и таким образом исключает/уменьшает превращение пирувата в ацетил-КоА и формиат. Пируват-формиат-лиаза (РЕЬ) является анаэробным аналогом пируватдегидрогеназы (РИН) и превращает пируват в ацетил-КоА и формиат (см. фиг. 1). Ацетил-КоА может быть превращен в этанол с помощью ацетальдегиддегидрогеназы (АеНИ), в то время как формиат представляет собой нежелательный побочный продукт, способный ингибировать рост этанологенных организмов.

РЕЬ была выбрана как мишень для нокаутирования, чтобы стимулировать метаболический поток в сторону выработки этанола и улучшить окислительно-восстановительный баланс остального пути синтеза этанола. Дополнительным преимуществом является исключение продукции формиата. Функцию РЕЬ можно инактивировать, используя ту же методику, что и для нокаутирования ЬИН (описан ниже), при этом получается мутант, который не зависит от выбора антибиотика для поддержания видоизмененного фенотипа. В данном осуществлении, предпочтительно, чтобы микроорганизм претерпел как инактивирование лактатдегидрогеназы, так и активирование пируватдегидрогеназы, с тем чтобы при анаэробных условиях получить повышенную продукцию этанола.

Ген РЕЬ может быть инактивирован с использованием методики, описанной для инактивации ЬИН. Можно использовать инсерцию транспозона, а также генную делецию (или частичную генную делецию). Предпочтительнее использовать генную делецию (или частичную делецию).

В дальнейшем предпочтительном воплощении микроорганизм должен также включать в себя гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы. Экспрессия такого гетерологичного гена приводит к синтезу ферментов, которые переключают метаболизм таким образом, чтобы этанол был основным продуктом брожения. Этот ген может быть получен от микроорганизмов, естественным образом способных к осуществлению анаэробного брожения, включая виды хушошопа^ в т.ч. хушошопах тоЫ118.

Методы получения и внедрения гена в микроорганизмы известны, например, в 1пдгат с1 а1., Вю1есй & ВюЕпд, 1998; 58 (2+3): 204-214 и И8 5916787, содержание этих методов приведено здесь по ссылке. Ген может быть введен в плазмиду или встроен в хромосому по усмотрению квалифицированного специалиста.

Микроорганизмы по изобретению можно культивировать в обычных условиях для разведения культуры, в зависимости от выбранного термофильного организма. Выбор субстратов, температуры, рН и других условий роста могут быть выбраны на основании известных требований культуры, например, см. АО 01/49865 и АО 01/85966, содержание каждого из них включено сюда по ссылке.

- 5 017548

Теперь будет дано описание настоящего изобретения исключительно в виде примера, со ссылками на сопроводительные иллюстрации, в следующих примерах.

Инактивация гена лактатдегидрогеназы

Пример 1. Получение стабильного мутанта БОН

Была разработана стратегия для получения стабильного мутанта гена БОН в СеоЬасШик (НегтоДисобащщ ΝΕΊΜΕ 11955 путем замещения гена, на основании которой возникли два метода.

В методе 1 были использованы два существующих уникальных сайта рестрикции вблизи середины последовательности, кодирующей БОН, чтобы произвести делецию. Единственный продукт ПЦР с большой молекулярной массой был получен из геномной ДНК, покрывающей большую часть доступной последовательности БОН, и клонирован в сайт 8та1 в сайте поликлонирования рИС19 (№\ν Еид1аиб Βίο1аЬ§). Клон риС19 затем был последовательно разрезан с помощью ΒδίΕΙΙ и ВыСЕ а затем лигирован, после расщепления фрагментом Кленова, с образованием внутренней делеции в гене БОН между ΒδίΕΙΙ и В§гС1.

В методе 2 ген БОН был клонирован в виде двух продуктов ПЦР, с введением сайтов Νοΐ1 с показанными ниже олигопраймерами правее, с тем чтобы эти два продукта ПЦР могли соединиться в рИС19, с образованием делеции в середине последовательности 1ά1ι.

Гены БОН, полученные обоими способами, имеющие внутренние делеции, были субклонированы в три потенциальные системы доставки: рИВ190, ρΝ\ν.33Ν и ТМО19.

В табл. 3 представлены праймеры для ПЦР, использованные во втором способе делеции.

Таблица 3

	Последовательность		Подчеркнутый сайт рестрикции
Праймер 1 (прямой)	^ЙЙЙСССТТАТбААССААбСААТАССА	8ЕО Ю ΝΟ. 1	ЕсоЮ
Праймер 2 (обратный)	вШ&Йё®ЙАСССвСТСТТТСбСТААСССССТ	8ЕО Ю ΝΟ. 2	Λ/οίΙ
Праймер 3 (прямой)	вШЮСТТбСТААОТбААТАТТТТСААОТ	8Е0 Ю ΝΟ. 3	ΝοΆ
Праймер 4 (обратный)	СТеОАСССТСААТТССАТСАСТТСАССА	5Е0 ΙΟΝΟ 4	Рз(!

Закрашенные последовательности показывают основания, которые добавлены, чтобы дополнить сайт рестрикции.

В табл. 4 перечислены свойства векторов доставки.

Таблица 4

	ривюо	ρΝ№33Ν	РТМ019
Селективный маркер	Канамицин аденилтрансфераза. Рост и число жизнеспособных организмов снижались при 60°С, по сравнению с 52вС.Нет роста при 68°С.Обобщенно: жесткая селекция, нет сателлитов, относительно устойчивы к нагреванию, но обнаруживают спонтанную резистентность.	Хлорамфеникол ацетил трансфераза. Рост и число жизнеспособных организмов снижались при 60°С, по сравнению с 52°С. Нет роста при 65°С .Обобщенно: относительно температуролабильны, минимальные проблемы с сателлитами, но очень низкая генерация спонтанной резистентности.	рТМ019 была образована путем инсерции ПЦРпродукта кап (риВ190 в качестве матрицы) в сайт ЕсоК (, расположенный в рПУУЗЗМ, затем амплифицирована в культуре и повторно выделена из С. 1Ьетод1исозк1а&из. Таким образом, она должен иметь такие же селективные характеристики, как риВ190ирЮТЗЗМ.
Способность к трансформации	Хорошая (примерно 1000 в одном эксперименте).	Очень хорошая, >2000 на эксперимент, воспроизводимая.	Умеренная (~ 400 на эксперимент). Вероятно, это вызвано большим размером вектора.
Доступность сайтов для клонирования	Ограниченная, часть сайтов для множественного клонирования потеряна в конструкции.	Хорошая — сайты для множественного клонирования не затронуты.	Хорошая — сайты для множественного клонирования не затронуты.

Способ 1. Получение геномной ДНК

Геномная ДНК была получена из 11955 и использована в качестве матрицы для ПЦР. Клетки из 20 мл ночной культуры 11955 (среда ТСР, 52°С) были собраны с помощью центрифугирования (4000 об ./мин, 20 мин). Клеточный осадок был ресуспендирован в 5 мл буфера 8ТЕ (0,3 М сахароза, 25 мМ трис-НС1, 25 мл

- 6 017548

ЭДТА, рН 8), содержащем 2,5 мг лизоцима и 50 мкл рибонуклеазы А (1 мг/мл). Смесь инкубировали 1 ч при 30°С, после чего добавляли 5 мг протеиназы К и 50 мкл 10% 8Ό8 и снова инкубировали 1 ч при 37°С. Лизированную культуру затем последовательно экстрагировали равными объемами смеси фенол:хлороформ (1:1), затем хлороформом и, наконец, осаждали с помощью изопропилового спирта. Промывали дважды 70% ледяным спиртом, после чего осадок ДНК был перерастворен в 0,5 мл буфера ТЕ.

Способ 2. Получение конструкций с делецией ЬИН

Проводили ПЦР, используя ВоЬосус1ет СтаФеп! 96 (81та1адепе), условия реакции были следующими: цикл 1 - денатурация при 95°С 5 мин, отжиг при 47°С 1 мин, синтез при 72°С 2 мин, циклы 2-30 денатурация при 95°С 1 мин, отжиг при 47°С 1 мин, синтез при 72°С 2 мин и конечная инкубация при 72°С 5 мин. Использованные ферменты - равная смесь Р£и полимеразы (Рготеда) и Тад полимеразы (Ыете Епд1апб Вю1аЬ§, ΝΕΒ). Использованные буферные растворы и нуклеотид-трифосфаты были выбраны согласно инструкции производителя (Р£и, Рготеда). В качестве матрицы была использована геномная ДНК из 11955, приготовленная вышеуказанным способом, и полученные продукты ПЦР были очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, с последующей элюцией из геля, с использованием набора для экстракции из геля (О1Ас.|шск Се1 ехЕасОоп ΚίΙ. С|адеп). согласно инструкции производителя. Очищенные продукты ПЦР были встроены посредством лигирования в рИС19 (ΝΕΒ), предварительно разрезанную с помощью 8та1, и с помощью полученного лигирующего микса трансформировали ЕксйепсЫа со11 ΣΜ109 (81га1адепе) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, и содержавшиеся в них плазмиды были выделены и охарактеризованы посредством рестрикционного анализа.

Плазмида (рТМО02) с фрагментом 2, вставленным в рИС19 (с новым сайтом Р§11, введенным на 3'конце фрагмента, и сайтом №11 на 5'-конце, полученными с использованием праймеров 3 и 4), была разрезана посредством №11 и Рз(1. Полученный фрагмент (примерно 0,4 кб) был встроен лигированием в риС19 плазмиду (рТМО01), несущую фрагмент 1 (полученный с помощью пары праймеров 1 и 2), который также был разрезан с помощью №ίί и Рз11. Полученным лигирующим миксом трансформировали Е. сой ΣΜ109 (81га1адепе) по стандартной методике. Как и ранее, были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды были выделены и охарактеризованы посредством рестрикционного анализа, чтобы установить положение вставок.

Плазмида (рТМО03) с ожидаемым типом рестрикции для желаемой конструкции была идентифицирована и подтверждена с помощью секвенирования с использованием прямого и обратного праймеров М13тр18.

Мутированный фрагмент гена ЬИН был удален из рТМО03 посредством расщепления с помощью ΗίπάΙΙΙ и ЕсоР1 и очищен в ходе электрофореза на агарозном геле, как ранее. Фрагмент был обработан полимеразой Кленова (ΝΕΒ, согласно инструкциям производителя) с образованием тупых концов для лигирования в рИВ190, который был разрезан с помощью ХЬа1 и также обработан полимеразой Кленова. Полученным лигирующим миксом трансформировали Е. сой 8С8110 (81га1адепе) по стандартным протоколам. Как и ранее, были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды были выделены и охарактеризованы посредством рестрикционного анализа. Плазмида (рТМО14, основанная на скелете рИВ190) с ожидаемым типом рестрикции для желаемой конструкции была идентифицирована и использована для трансформации ΝΟΜΒ 11955 путем электропорации по описанной ниже методике.

Методика электропорации для СеоЬасШиз (Кегтоц1исом(1амих ΝΟΙΜΒ 11955

Замороженная исходная культура штамма 11955 была приготовлена путем выращивания ночной культуры в среде ТСР (встряхивание при 250 об/мин и 55°С, в объеме 50 мл в конической колбе на 250 мл, ОП₆₀₀ ~ 2), добавления равного объема 20% глицерина, деления на аликвоты по 1 мл и хранения в криопробирках при -80°С. 1 мл этой исходной культуры был использован, чтобы внести его в 50 мл предварительно нагретого ТСР в конической колбе на 250 мл, который инкубировали (55°С, 250 об./мин) до достижения значения ОП600, равного 1,4.

Колбу охлаждали на льду в течение 10 мин, затем культуру центрифугировали 20 мин при 4000 об./мин и 4°С в пробирках Еа1соп на 50 мл. Осадок был ресуспендирован в 50 мл ледяной среды для электропорации и центрифугирован (4000 об./мин, 20 мин). Далее делали три промывки следующим образом: 1 х 25 мл и 2 х 10 мл, после чего осадок ресуспендировали в 1,5 мл ледяной среды для электропорации, делили на аликвоты 60 мкл и хранили в пробирках Эппендорф на 0,5 мл при -80°С для дальнейшего использования (или использовали сразу).

Для электропорации 1-2 мкл ДНК в воде добавляли к 60 мкл электрокомпетентных клеток в пробирке Эппендорф на льду и осторожно перемешивали. Эту суспензию помещали в предварительно охлажденную кювету для электропорации (щель 1 мм) и элетропорировали при 2500 В, емкости 10 мкФ и сопротивлении 600 Ом. Сразу после импульса добавляли 1 мл предварительно нагретого ТСР, перемешивали, помещали суспензию в пробирку с завинчивающейся крышкой и инкубировали при 52°С 1 ч на водяной бане с шейкером. После инкубации суспензию либо непосредственно высевали на чашки (например, 2 х 0,5мл), либо центрифугировали (4000 об./мин, 20 мин), ресуспендировали в 200-500 мкл

- 7 017548

ТОР, наносили на ТСР-агар. содержащий подходящий антибиотик, и выращивали в течение ночи при 52°С. Трансформанты, устойчивые к антибиотику, были видны через 24 ч.

Среда для электропорации

0,5М сорбит

0,5М маннит

10% глицерин

Среда ТОР

Триптон 17 г/л

Соевый пептон 3 г/л К₂НРО₄ 2,5 г/л

МаС! 5 г/л рН до 7,3

Добавки после автоклавирования: Пируват натрия 4 г/л Глицерин 4 мл/л (из концентрата, стерилизованного фильтрацией)

Выбор первичных интегрантов для ЬВН-негативных мутантов единичного кроссовера

Плазмиды (например, рТМО14), использованные для интеграции в геном организма, были температурочувствительными. Основанные на рИВ190 нокаутные векторы способны к репликации в организме хозяина при 54°С, но не выше 65°С. Поэтому, чтобы быть способным к росту в присутствии канамицина при 68°С , хозяин должен включить плазмиду в геном.

Колония, устойчивая к канамицину, полученная в результате трансформации О. 1йегтод1исоба8Ш8 ΝΟΙΜΒ 11955 с помощью рТМО14, была получена путем посева штрихом отдельных колоний на ТОРагаре, содержащем 12 мкг/мл канамицина. Этот трансформант был использован для получения первичных интегранотов в 11955 с помощью стимуляции гомологичной рекомбинации с геномным аллелем ЬЭН. Это было достигнуто путем выращивания штамма в 50 мл среды ТОР в течение ночи в конической колбе на 250 мл при 52°С и 250 об./мин, центрифугирования культуры (4000 об./мин, 20 мин), ресуспендирования клеток в 1 мл ТОР и высевания на чашках с ТОР-агаром, содержащим 12 мкг/мл канамицина для последующей инкубации в течение ночи при 68°С. В таких условиях рИВ190 не может реплицироваться как автономная плазмида. Большинство колоний, полученных таким образом, при тестировании на продуцирование лактата обнаруживали ЬЭН-фенотип с повышенной способностью вырабатывать этанол, что свидетельствует об образовании ЬЭН-мутантов вследствие интеграции в локусе ЬЭН.

Получение мутанта с замещенным геном ЬБИ путем двойного кроссовера

Предполагаемый первичный интегрант (ТМ15) для рТМО14 был идентифицирован из приведенной выше трансформации и использован для получения двойных рекомбинантов. Это было достигнуто посредством пяти последовательных пересеваний культуры ТМ15 в среде ТОР (5 мл в пробирке Га1соп на 50 мл, 250 об./мин, 1% пересадка между пересеваемыми культурами) без канамицина, с чередованием условий: 8 ч при 54°С и 16 ч при 52°С. После пяти таких пассажей проводили серийное разведение полученной культуры, и образцы объемом 100 мкл наносили на чашки с ТОР и выращивали в течение ночи. Перепечатывание полученных колоний на ТОР-агар, содержащий 12 мкг/мл канамицина, было использовано для идентификации колоний, чувствительных к канамицину. После нанесения штрихом отдельных колоний на агар с целью очистки, эти канамицин-чувствительные производные тестировались на продуцирование лактата, и, согласно ожиданиям, они оказались смесью БЭН+ и ЬЭН-. Одна ЬЭН- производная, ТМ89, была далее охарактеризована с помощью ПЦР и Саузерн-блоттинга.

Доказательство замены гена ЬБИ

Геномная ДНК была получена из ТМ15 (первичный интегрант) и ТМ89 (предположительный двойной рекомбинант ЬЭН-) и использована как матрица в ПЦР с использованием праймеров 1 и 4, в описанных выше условиях. Геномная ДНК из 11955 использовалась в качестве контроля. Продукты ПЦР (цепи длиной примерно 0,8 кб были получены из всех трех матриц) были очищены, как описано выше, и образцы были разрезаны с помощью Νοίΐ, после чего их анализировали с помощью электрофореза на 0,7% агарозном геле. ПЦР-продукт из 11955 не обнаруживал никаких признаков рестрикции Νοΐ1, как и ожидалось, тогда как ПЦР-продукт из ТМ89 давал 2 полосы примерно в 0,4 кб, что указывало на замещение гена дикого типа мутантным аллелем. Рестрикция Νοί1 ПЦР-продукта из ТМ15, первичного интегранта, давало 2 линии, видимые и у ТМ89, со следами неразрезанной (0,8 кб) цепи. Это можно объяснить результатами, полученными при Саузерн-блоттинге геномной ДНК ТМ15.

Геномную ДНК из 11955, ТМ15 и ТМ89 разрезали с помощью Νοΐ1, РЧ1 и Νοί1, а также НтбШ и Νοΐ, и анализировали с помощью электрофореза на агарозном геле. ДНК помещали на положительно заряженную нейлоновую мембрану (ВнсЬе) и гибридизировали с зондом, полученным в ходе ПЦР из гена ЬЭН 11955 с помощью праймеров 1 и 4 (табл. 3), который был помечен Э1С (Э1О-1аЬе1шд кй, Κ^^), согласно инструкциям производителя. Полосы, давшие положительный сигнал после гибридизации с меченым зондом, были выявлены с помощью приложенного набора для детекции (Клсйе). Результаты Саузерн-блоттинга показали наличие сильно амплифицированной полосы, соответствующей примерно 7,5 кб в ТМ15, разрезанной посредством Νοίί, с аналогично амплифицированными полосами около 7,0 и 0,4 кб в ТМ15, разрезанной посредством НтбШ/№!1 и Р8ΐί/Nοΐ1, соответственно, что свидетель

- 8 017548 ствует о встраивании множества последовательных копий рТМО14, интегрированного в локус ЬИН в этом первичном интегранте. Среди всех трех смесей продуктов расщепления, ТМ89 продемонстрировал отличный от других тип рестрикции, поскольку давал дополнительную полосу гибридизации, по сравнению с 11955, что согласуется с произошедшим замещением гена.

Пример 2. Получение стабильного активированного мутанта ΡΌΗ

a) Клонирование и секвенирование кластера ΡΌΗ

Праймеры 5'-А¥СССССТТТАААТСВТССАТТТСАТС-3' (прямой; 8 ЕС) ГО N0. 31) и 5'ССААСТСССТСССААТТТСССТТ-3' (обратный; 8Е0 ΙΌ N0. 32) были разработаны на основании гомологии в последовательности между известными последовательностями ΡΌΗ ВасШик и СеоЬасШик и были использованы для амплификации фрагмента длиной 1,8 кб с использованием геномной ДНК из С. ШегтоДисомбаклщ 11955 в качестве матрицы. ПЦР проводили, как описано ранее, а очищенные продукты ПЦР были лигированы в рИС19 (ΝΕΒ). Полученным лигирующим миксом трансформировали Е. сой 1М109 (81та1адепе) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы с помощью рестрикционного анализа и секвенированы. Первый фрагмент был далее использован как зонд для скрининга последующих библиотек.

Геномная ДНК из С. ФегтоДисомбамщ 11955 была расщеплена с помощью 10 различных рестрикционных ферментов по стандартным протоколам. Рестрикционные ферменты ВдШ, ЕсоВУ, ΗίηάΙΙΙ и МГе1 давали фрагменты ДНК размером в пределах 2,5-5 кб, которые были клонированы для формирования нескольких библиотек колоний (рЬ1ТМи828, №\ν Епд1апб Вю1аЬ§, согласно инструкциям производителя). Эти библиотеки были подвергнуты скринингу с помощью меченого зонда ДНК (01С-1аЬе1шд кй, Воске, согласно инструкциям производителя).

Фрагменты ДНК во всех колониях, которые гибридизовались с зондом, были выделены и секвенированы. Был идентифицирован один клон, который содержал фрагмент геномной ДНК ЕсоВУ длиной 3,6 кб, охватывающий ранее выявленный регион рбй длиной 1,8 кб и продолжающийся ниже от этого региона примерно еще на 1,8 кб. Этот фрагмент кодировал три полных гена, начиная на 5'-конце с пептидной деформилазы 2 (рбГ2). Как установлено, правее от рбГ2 расположена открытая рамка считывания, кодирующая гипотетический ген (который обнаруживает гомологию с теоретическим белком укаА (В8И14570) из В. киЫйй), тогда как лежащая правее следующая открытая рамка считывания имеет размер 1110 п.о. и, как полагают, кодирует α-субъединицу пируватдегидрогеназы А (рбйА(а)). Непосредственно примыкает к гену рбйА(а) и тянется вплоть до 3'-конца фрагмента ЕсоВУ та часть гена, которая, как полагают, кодирует β-субъединицу рбйА (рбйАф)). Последовательное расположение генов рбйА а и β соответствует известным кластерам гена рбй, выявленным у родственных видов.

Способ, использованный для идентификации этого фрагмента ЕсоВУ, использовали еще раз для того, чтобы выделить остальную последовательность ДНК. С помощью прямого праймера 5'АСААССААААСААСАТАТТАААСАС-3' (8Е0 ΙΌ N0. 5) и обратного праймера 5'ТТТААСТССТСТАССААААТААСАС-3' (8Е0 ΙΌ N0. 6), которые связываются на 3'-конце фрагмента ЕсоВУ, был получен новый зонд, СТ-0Ю2, как и ранее, в ходе ПЦР. Ряд рестрикционных ферментов, некоторые из которых, как было показано, разрезают цепь сразу левее от участка СТЭЮ-2, были использованы для расщепления геномной ДНК, выделенной из С. ФегтоДисомбаклщ.

Фрагменты, полученные при расщеплении посредством №о1, были выделены и клонированы, как ранее (рЫТМи828, №\ν Епд1апб Вю1аЬ§, согласно инструкциям производителя). В ходе скрининга с помощью зонда СТ-ЭЮ2 был идентифицирован клон, содержащий фрагмент ДНК №о1, состоящий из ДНК длиной ~ 6 кб, расположенный правее фрагмента ЕсоВУ. Последовательности фрагментов №о1 и ЕсоВУ образовывали единую непрерывную последовательность (контиг) длиной 8884 п.о. Анализ последовательности выявил, что этот контиг вмещает кластер гена рб1т состоящий из четырех смежных генов, зажатых с обеих сторон между двумя гипотетическими генами. Организация генов, закодированных внутри контига, показана на фиг. 2.

b) Мутанты ΡΌΗ единичного кроссовера - доказательство концепции

Стратегия, примененная для получения активированных мутантных генов ΡΌΗ в ΕΌΗ- мутантах С. [НегтоДисомбаклщ 11955, включала использование ранее идентифицированной последовательности рбНА для разработки и получения кассеты с кодирующей последовательностью рбНА с предшествующим ей сайтом рестрикции, который обеспечивает легкость вставки гетерологичных промоторов, и последующую их вставку в подходящий вектор интеграции. Требовался сильный промотор, такой как ΕΌΗпромотор из С. ФегтоДисомбамщ или С. йеатеоШетторШш. Суть метода отображена на фиг. 3.

Требуемые мутанты были получены путем трансформации интегрирующего вектора в штамм хозяина и отбора интегрантов, устойчивых к канамицину. Подобные мутанты единичного кроссовера неустойчивы в отсутствие антибиотика, так как процесс интеграции легко обратим.

ί) Разработка векторов для проведения активации

Для того чтобы описанная выше стратегия работала, нужно было сконструировать новые векторы доставки, чтобы могли быть использованы №е1-сайты рестрикции внутри сайтов поликлонирования

- 9 017548 (тек). На следующей табл. 3 приведено описание и сравнение векторов, разработанных с помощью рИВ190.

Таблица 5. Векторы, разработанные для проведения активации

	Размер (кб)	Маркеры	тез	Ν&Ι	Происхождение
рив190	6,7	атр, кап	Нет	3	ρϋΒ190, лигированная с р11С19
рТМО019	5.4	са1, кап	Да	0	Ген КапК из риВ190, вставленный в сайт ΕοοΡΙ в ркМ/ЗЗЫ
РТМО023	2,7	атр	Да	0	риС19 с удаленным сайтом
рТМООЗ!	5,1	атр, кап	Да	0	Фрагмент ЕсоР!/5паВ1 рВВИО, вставленный в риС19

ίί) фрагмент скелета рбйЛ

Описанная ранее последовательность рбйк. полученная из исходного продукта ПЦР размером 1,8 кб и клонированная в рИС19, была использована для разработки прямого праймера 5'ААТСТАСАСАТАТСССТСССААААСАТССАСАТТ-3' (81Т) ГО N0. 7), содержащего сайты ХЬа1/Ыбе1, так что концевой фрагмент АТС в сайте Νώ;1 предположительно представлял собой стартовый кодон АТС гена рбйА. Этот стартовый кодон был определен при выверке расположения остальных генов рбйА и тестировании возможных рамок считывания.

Этот праймер был использован для конъюгации с обратным праймером 5'ССААССТТТСТТТААТАТСТТСТТТТССТТС-3' (81Т) ГО N0. 8) (включающим сайт ΗίηάΙΙΙ) для амплификации передней части гена рбйА(а), по описанной выше методике проведения ПЦР. Был получен продукт ПЦР размером около 1 кб, который затем очищали и встраивали с помощью лигирования в рИС19 (ΝΕΒ). Данным лигирующим миксом трансформировали Е. сой 1М109 (81га1адепе) по стандартной методике. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы с помощью рестрикционного анализа, а затем фрагмент рбйА был разрезан с помощью Νώ;1 и ΗίηάΙΙΙ и субклонирован в рТМО31 по стандартной методике. Конечная конструкция в рТМО31 была подтверждена путем секвенирования и была обозначена как рТМО46.

ϊϊΐ) Фрагменты промоторов и получение конечной конструкции доставки

Фрагменты промоторов были затем клонированы в конструкцию рТМО46 - предшествующую гену рб11А - как фрагменты Крп1^бе1. Для исходных конструкций были выбраны следующие фрагменты промоторов.

- 10 017548

Таблица 6. Промоторы, использованные для активации ΡΌΗ, и их источники

Промотор	Источник	Олигонуклеотиды, использованные для ПЦР
Р 1811(1195 5) (302 п. о.)	6. Итегтод1исоз1даз!из ΝΟΙΜΒ 11955 промотор лактатдегидрогеназы	Прямой ССеСТАССАААвАбСбСААТСТеАААССААС (5ЕО ГО ΝΟ. 9) Обратный ббСАТАТеТОТСТОТСАТССТТТССААА (8ЕО ГО ΝΟ. 10)
Р_1бЬ(1195 5зЬоП) (172 п. о.)	6. Итегтод1исоз1с1аз1из ΝΟΙΜΒ 11955 промотор лактатдегидрогеназы	Прямой ССССТАССТСАТ6ТААТТССАТСТ6АТСАТ (ЗЕО ГО ΝΟ. 11) Обратный СССАТАТСТОТСТСТСАТССТТТССААА 13ЕО ГО ΝΟ. 12)
Р №(ЫСА 1503) (171 п. о.)	0.з1еагои1егторЫИиз ИСА1503 промотор лактатдегидрогеназы	Прямой сссотАСсесессАсссесАсстеАотбст С (ЗЕО ГО ΝΟ. 13) Обратный СС САТАТСАТТС АТССТСССТСААТАТААТС (8ЕО ГО ΝΟ. 14)
Р 1с1П(08М 13240) (165 п. о.)	в.&еагоМегторЪШиз штамм 10 (Ο3Μ13240) промотор лакгатдегидрогеназы	Прямой ссеетАсссссссАссеесАестАесссс С(8Е(2ЮМО. 15) Обратный СССАТАТСТАТТСАССТСТТСТТССТТТТТ (8Е0 ГО ΝΟ. 16)
Р_ату (356 п. о.)	<3.8(еаго(йегтор11йиз ИСА1503 промотор аамилаэы	Прямой ССОСТАСССАТСАТСССССССТСССТТСТСС (3ΕΩ ГО ΝΟ. 17) Обратный ААСАТАТСССССТТСССССТТААТСАААТС (ЗЕО ΙΟ N0.18)
РДеггА (156 п. о.)	<3. з(еаго11)егторйй'из штамм 10 (О8М13240) промотор ферредоксина	Прямой ССССТАССТАТСТСТАААААТАСААСАСАС (ЗЕОЮИО. 19) Обратный СССАТАТСААТССААССТССССААСТТТАТ (8ЕО ГО N0. 20)
Р_ГеггВ (183 п. о.)	в. 5(еаго1Ьегтор№иа штамм 10 (ЭЗМ13240) промотор ферредоксина	Прямой СССеТАССТАТСАТААСААААСТАААТААСАТ ΘΘΑΤΑΤΘΤΟΤΑΑΑΑΑΤ (ЗЕО ГО N0. 21) Обратный СССАТАТ6ААТССААССТССССААСТТТАТ (ЗЕО ГО N0. 22)
Ρ.ίρΙΧ (168 п о.)	В. сегеиз АТСС14579 промотор пируват- формиат-лиазы	Прямой ССССТАССАСТТААСАСТАТАТАТАТАСТА (ЗЕО ГО N0. 23) Обратный СССАТАТСААТСТССТССАТТТТТСАТТАС (8Е0 ГО N0. 24)

Были разработаны праймеры для получения этих промотрных участков из геномной ДНК (выделенной из 6. 1йегтод1исо81ба8Ш8 11955, 6. 8!еаго!йегторЫ1и8 ЫСА1503, 6. 8!еаго1йегторЫ1и8 Ό8Μ13240 и В. сегеиз АТСС14579, как описано ранее), как фрагментов Крп1/Ыбе1, и были получены продукты ПЦР с использованием описанных ранее компонентов и методик. Очищенные продукты ПЦР были встроены с помощью лигирования в рТМО23 (рИС19 с исключенным сайтом Ыбе1), и данным лигирующим миксом трансформировали Е. соШ 1Μ109 (§!га!адеие) по стандартной методике. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы с помощью рестрикционного анализа, а затем фрагменты промоторов были разрезаны с помощью Ыбе1 и ΗίηάΙΙΙ и субклонированы в рТМО46 по стандартной методике. Конечные конструкции в рТМО46 были подтверждены путем секвенирования и были обозначены как плазмиды в табл. 7.

- 11 017548

Таблица 7. Конструкции одинарного кроссовера для активации ΡΌΗ

Вектор	Родитель	промотор	Селекция .
рТМО58	РТМО46	Р МЩ11955)	амп, кан
рТМО59	РТМО46	Р 160(1503)	амп, кан
рТМО83, 84	РТМО46	РД6Ь(8ЬоП11955)	амп, кан
рТМОЭЗ, 94	рТМО46	Р 160(1503 <Ятег)	амп, кан
рТМО97, 98	рТМО46	Р 160(13240)	амп, кан
рТМОЮЗ, 104	РТМО46	Р ТеггА	амп, кан
рТМО99, 100	рТМО46	Р рИХ	амп, кан
РТМО101,102	рТМО46	Ρ ρίΙΥ	амп, кан

ίν) Интеграция конечных конструкций в геномную ДНК С. 1йегтод1исо81ба8Ш8

ТМ89 были трансформированы приведенными выше плазмидами по стандартной методике электропорации, описанной ранее. Предполагаемые интегранты были отобраны, как описано ранее, и протестированы на предмет продуцирования этанола и органических кислот в глюкозной Л8УЕ среде (анаэробной), а также на пируватдегидрогеназную активность. Результаты показаны в табл. 8.

Таблица 8. Анализ на предмет ΡΌΗ новых промоторных интегрантов на 8-часовых культурах в среде Л8УЕ (0,5%) + 2% глюкоза

			Концентрация/ мМ	Ед/мл	мг/мл	Ед/мг белка
штамм	Промотор	ΟΠ	пир	глюкоза	форм	ацет	этанол	ΡϋΗ	Белок	? ί 1 з а © 2 ? с 2 Ь О о а
ТМ226	РД6П(13240)	6,74	1,7	17,3	1,2	14,8	136,2	2,1	8,89	0,236
ТМ227	Р_16Ь(13240)	6,31	0,7	26,2	1,0	12,6	130,7	3,5	10,32	0,339
ТМ228	Ρ_ρίΙΧ	6,64	2,9	29,8	3,2	9,8	118,5	2,65	10,42	0,254
ТМ229	Р_рЯХ	5,02	4,8	“24,4	0,7	12,2	119,6	0,95	7,99	0,119
ТМ230	Ρ_ρίΙΥ	5,02	5,7	24,3	0,3	13,3	121,1	1,2	8,3	0,145
ТМ231	Ρ_ρί1Υ	5,74	2,6	21,5	1.1	12,0	125,6	1,85	10,18	0,182
ТМ216	Ρ_Ι60(1503 димер)	4,99	1,8	12,7	0,6	15,6	141,6	1.5	8,25	0,182
ТМ218	Р_16Ь(1503 димер)	5,57	3.3	14,7	1.6	13,1	135,4	1.6	9,42	0,170
ТМ177	Ρ_Ι60(1503)	5,45	2,9	15,2	2,9	12,6	136,9	2	9,34	0,214
ТМ89	(контроль)	‘2,2	15,2	22,4	3,0	10,0	111,0	0,09	3,39	0,027

Как оказалось, новые промоторы давали сравнительно высокие уровни активности ΡΌΗ, значительно выше, чем ТМ89 в данной точке времени (однако низкий уровень белка, полученный для ТМ89, свидетельствует, что ТМ89, возможно, миновал свою точку пика продукции). Слабое соответствие между этими двумя интегрантами каждого промотора делает затруднительным сравнение относительной силы этих промоторов.

Те же штаммы, что тестировались на уровень ΡΌΗ, были также протестированы на продуцирование этанола при повышенном уровне глюкозы и низкой аэрации, в дальнейшей попытке установить, имеют ли хотя бы некоторые из новых промоторов какие-либо преимущества перед оригинальными промоторами. Результаты представлены ниже в табл. 9.

- 12 017548

Таблица 9. Исследование эффективности новых промоторов в 3% глюкозе при двух условиях кислородного голодания

			Концентрация/ мМ
	Объем	Промотор	Глюкоза	Этанол	Пируват	Формиат	Ацетат
ТМ226	Умеренный О2	Р_Й1э(13240)	Нет роста
ТМ227	Умеренный О2	Р_16Ь(13240)	Нет роста
ТМ228	Умеренный О2	Ρ„ρΐΙΧ	46,2	154,2	0,3	0,0	19,4
ТМ229	Умеренный О2	Ρ_ρίΙΧ	55,9	133,1	0,6	0,0	21,9
ТМ230	Умеренный О2	Ρ_ρίΙΥ	56,3	133,4	0,7	0,0	21,2
ТМ231	Умеренный О2	Ρ_ρΐΙΥ	Нет роста
ТМ216	Умеренный О2	Р_И11(15ОЗ димер)	52,9	134,2	0,4	0,0	23,9
ТМ218	Умеренный О2	Ρ_Ιάίι{1503 димер)	Нет роста
ТМ177	Умеренный О2	Р_1СЪ(1503)	58,2	130,8	0,6	0,0	24,2
ТМ89	Умеренный О2	контроль	88,9	85,4	12,2	0,0	19,8
ТМ226	Низкий О2	Р_|<1Ь(13240)	68,8	126,5	0,9	13,8	15,3
ТМ227	Низкий О2	Ρ_Ιάίι(13240)	104,3	54,9	23,8	19,1	4,6
ТМ228	Низкий О2	Р_рЯХ	73,7	117,3	1,4	15,8	15,1
ТМ229	Низкий О2	Р_рПХ	94,0	80,8	13,1	19,0	9,2
ТМ230	Низкий О2	Ρ,ρίΙΥ	106,6	52,0	26,0	19,6	9,2
ТМ231	Низкий О?	Ρ^ρίΙΥ	106,5	53,8	24,0	20,0	4,9
ТМ216	Низкий О2	Р_ЙИ(1503 димер)	76,4	115,4	0,9	14,9	16,3
ТМ218	Низкий О2	Р_ИМ(1503 димер)	74,6	120,2	2,2	15,5	15,0
ТМ177	Низкий О2	Р_йб(1603)	64,9	133,6	0,7	13,1	16,3
ТМ89	Низкий О2	контроль	109,5	51,1	25,6	20,6	2,9

Стало понятным, что для полной характеристики и сравнения этих промоторов было необходимо получить двойные рекомбинанты, поскольку неустойчивость замещений промоторов приводила к несостоятельности вышеприведенных анализов. Стабильная мутация, активирующая ΡΌΗ, также требовалась для конечного организма.

с) Мутанты ΡΌΗ двойного кроссинговера

ί) Получение конечной конструкции доставки

Устойчивые интегранты двойного кроссинговера были получены с использованием дополнительного ряда векторов, основанного на серии рТМО58, приведенной в табл. 7, в котором последовательность левее гена рбНЛ была расположена перед фрагментом промотора, как обозначено на фиг. 4. Это позволило удалить последовательности векторов в процессе рекомбинации и сделать устойчивой вставку промотора замещения перед геном рбН.

Например, часть последовательности, предшествующей кластеру рб11 С. Шегтод1исо81ба8Ш8 11955, была амплифицирована с помощью ПЦР, как описано ранее, с целью введения сайтов Крп1 на обоих концах. Эта последовательность (1072 п.о.) включала в себя 326 п.о. гена рбГ2 и открытую рамку считывания, целиком находящуюся в интроне, гомолог укаА, но не включала последовательность между укаА и началом трансляции рбНА. Очищенные продукты ПЦР были встроены с помощью лигирования в риС19, и данным лигирующим миксом трансформировали Ε. со11 ΙΜ109 (§1га1адепе) по стандартной методике. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы с помощью рестрикционного анализа, а затем левее лежащие фрагменты были разрезаны с помощью Крп1 и субклонированы в рТМО59 по стандартной методике. Конечная конструкция была подтверждена путем рестрикционного анализа - для установления ориентации вставок - и с помощью секвенирования, и была обозначена как рТМО70.

- 13 017548 ίί) Интеграция конечных конструкций в геномную ДНК С. 1йегтод1исо81ба8Ш8

ТМ89 был трансформирован с помощью рТМО70 по стандартной методике электропорации, описанной ранее. Предполагаемые интегранты были отобраны, как описано ранее, и протестированы на продуцирование этанола и органических кислот в среде ΑδΥΕ-глюкоза (анаэробной), а также на активность РИН.

ίίί) Получение двойного кроссинговера Р Ι61ι(Νί.Ά1503) в ТМ89

Два первичных интегранта из трансформации с помощью рТМ070 были выбраны для серийного пересевания культуры в жидкой среде при встряхивании в отсутствие канамицина, как описано ранее. Через 3 пересевания образцы были разбавлены и нанесены на ТСР-агар. Чашки с подходящим числом колоний были перепечатаны на чашки с ТСР+канамицин, и колонии, чувствительные к канамицину, были изъяты и очищены. Эти штаммы были протестированы на продуцирование этанола в среде Α8ΥΕ(0,5%)+2% глюкоза. Из шестнадцати протестированных предполагаемых двойных рекомбинантов пять (ТМ179 - ТМ183) давали желаемый фенотип (остальные оказались идентичными родительскому штамму ТМ89). Результаты приведены в табл. 10.

Таблица 10. Образование метаболитов в предполагаемых мутантах двойного кроссинговера

Штамм	Остаточная глюкоза	Этанол	Пируват	Ацетат
ТМ179	0,0	150,5	0,0	25,8
ТМ180	0,0	152,0	0,0	21,7
ТМ181	0,0	152,8	0,0	24,3
ТМ182	0,0	149,5	0,0	23,0
ТМ183	0,0	146,1	0,0	24,9
ТМ89	17,4	99,0	10,7	25,3

б) Проверка присутствия гена Кап^к из вектора в двойных рекомбинантах

Для проверки того, что ген кап^к из векторов, использованных в конструкции, больше не присутствует в штаммах двойных рекомбинантов ТМ89 и ТМ180, проводили реакции ПЦР с использованием праймеров, разработанных для гена кап^к, как показано на фиг. 3. В контрольных реакциях ПЦР использовались праймеры для гена рб11 и предшествующего участка, наличие которых в виде единичной копии можно было ожидать в ТМ89 и ТМ180. Геномные ДНК от пяти штаммов (ТМ15 и БС12.1. интегранты единичного кроссинговера, среди которых ТМ89 и ТМ180, и ТМ177) были выделены и использованы как матрицы. Все три штамма ТМ15, БС12.1 и ТМ177 проявляют устойчивость к канамицину, и можно ожидать, что они несут векторную ДНК, содержащую ген кап^к. ПЦР проводили в условиях и с использованием компонентов, описанных ранее, а детали эксперимента представлены на фиг. 5.

Результаты показывают, что все штаммы единичного кроссинговера дают продукт ПЦР ожидаемого размера (около 0,6 кб) с праймерами кап, как и ожидалось, но нет продукта ПЦР с праймерами кап от ТМ89 или ТМ180. Это свидетельствует о том, что ген кап^к не присутствует в этих двойных рекомбинантах, как и предполагалось. Однако праймеры участка рб11 давали продукты ожидаемого размера со всеми пятью геномными ДНК. Геномные ДНК БС12.1 и ТМ180 дают продукт примерно на 0,2 кб меньше, чем остальные 3 штамма, поскольку замещающая вставка Ρ_161ι(Νί.Ά1503) меньше, чем последовательность дикого типа.

Пример 3. Получение стабильного РРЬ-негативного мутанта

РРЬ-нокаутирующий вектор был сконструирован таким же самым образом, как и при нокауте ЬИН в методе 2 и обозначен на фиг. 5.

а) Конструкция РРЬ-нокаутного вектора

Вырожденные праймеры 5'-ССТСААААССС\УССССТУСТТСАТАТССАТАСА-3' (прямой 8ΕΟ ГО ΝΟ. 25) и 5'-ТТС6САССТ66№6САААУ66ТТСТСС-3' (обратный 8ΕΟ ГО ΝΟ. 26), разработанные на основе гомологии в последовательности между известными последовательностями РРЬ Вас111и8, были использованы для амплификации фрагмента размером 1,7 кб, с использованием геномной ДНК из С. 111егтод1исо51ба5Ц15 11955 в качестве матрицы. ПЦР проводили, как описано ранее, а очищенные продукты ПЦР были встроены с помощью лигирования в рИС19 (ΝΕΒ). Данным лигирующим миксом трансформировали Е. сой ΣΜ109 (§1га1адепе) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы посредством рестрикционного анализа и секвенированы. Полученная плазмида была обозначена как рТМО95.

Следующую серию ПЦР проводили с праймерами для введения сайтов №11 на 3'-конце фрагмента 3 и 5'-конце фрагмента 4. В ПЦР1 праймеры 5'-СС66ААТТТСАСТТСССАС66АССА66ТТА-3' (прямой 8ΕΕ) ГО ΝΟ. 27) и 5'-АА6С66СС6СТАТССАА6АА66Т66АААС6С-3' (обратный 8ΕΟ ГО ΝΟ. 28) были объединены с рТМО95 в условиях и в присутствии компонентов, описанных ранее, и очищенные продукты ПЦР были встроены с помощью лигирования в рИС19 (ΝΕΒ). Данным лигирующим миксом трансформировали Е. соБ 1Μ109 (§1га1адепе) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, ус

- 14 017548 тойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы посредством рестрикционного анализа и секвенированы. Полученная плазмида была обозначена как рТМО105.

В ПЦР2 праймеры 5'-АА6С66СС6СТ6С6С6ТС6ААТТТ66С6АТ6А-3' (прямой БЕф ГО N0. 29) и 5'-ССАА6СТТСС6ТАТАСААС6ТТА6АС6ТАА-3' (обратный БЕС) ГО N0. 30) были объединены с рТМО95 в условиях и в присутствии компонентов, описанных ранее, и очищенные продукты ПЦР были встроены с помощью лигирования в рИС19 (ΝΕΒ). Данным лигирующим миксом трансформировали Е. οοΐί 1М109 (§1га!адеие) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы посредством рестрикционного анализа и секвенированы. Полученная плазмида была обозначена рТМО107.

Плазмида рТМО107, содержащая фрагмент 4, была разрезана с помощью Νοΐΐ и ΗίηάΙΙΙ. Полученный фрагмент (622 п.о.) был встроен посредством лигирования в рТМ0105, несущую фрагмент 3, предварительно разрезанный с помощью Νοΐΐ и ΗίηάΙΙΙ. Данным лигирующим миксом трансформировали Е. οοΐί 1М109 (§!га!адепе) по стандартным протоколам. Как и ранее, были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы посредством рестрикционного анализа для установления положения вставок. Плазмида (рТМО110) с ожидаемым типом рестрикции для желаемой конструкции была идентифицирована и подтверждена путем секвенирования с использованием прямого и обратного праймеров М13тр18.

Мутантный фрагмент гена РЕБ был удален из рТМО110 путем разрезания с помощью ΕοοΡΙ и ΗίηάΙΙΙ, и очищенные фрагменты были встроены посредством лигирования в рТМО31, которая была предварительно разрезана с помощью ΕοοΡΙ и ΗίηάΙΙΙ. Данным лигирующим миксом трансформировали Е. οοΐί 1М109 (§!та!адепе) по стандартным протоколам. Были отобраны колонии, устойчивые к ампициллину, содержащиеся в них плазмиды были выделены, охарактеризованы посредством рестрикционного анализа, для установления ориентации вставок. Полученная плазмида была обозначена как рТМО111.

Ь) РЕЬ-негативные мутанты единичного кроссинговера

Плазмида рТМО111 была введена путем электропорации в ТМ89 и ТМ180, как описано ранее. Трансформанты обоих штаммов выращивали в жидкой культуре (2ТУ+каг1 12 мг/мл) и наносили при очень высоких концентрациях клеток на агар с ТСР+ каη 12 мг/мл при 68°С с целью отбора для интеграции, как описано ранее.

Колонии были очищены посредством нанесения штрихом на агар с ТСР+кам 12 мг/мл при 68°С и использованы для внесения в культуры, засеянные в 2ТΥ+каη 12 мг/мл, для тестов на продуцирование, используя 10 мл среды Λ8ΥΕ (0,5%) + 2% глюкозы в пробирках Εαΐοοη на 15 мл (т.е. в низкокислородных условиях), в условиях, в которых, как было показано ранее, наблюдались измеримые уровни продукции формиата линиями ТМ89 и ТМ180. Выработка формиата обычно не наблюдается при более высоких уровнях кислорода (см. табл. 9). Результаты тестирования предполагаемых интегрантов рТМО111 в ТМ89 и ТМ180 показаны ниже в табл. 11.

Таблица 11. Предполагаемые интегранты рТМО111 (68°С) в ТМ89 и ТМ180

	Концентрация/ мМ
	глюкоза	этанол	пируват	формиат	ацетат
рТМО111/ТМ89/1.1	95,4	13,0	11,6	5,3	отр
рТМО111/ТМ89/1.2	69,5	44,6	23,9	19,9	отр
ΡΤΜΟ111/ΤΜ89/1.3	89,1	17,9	15,0	7,5	отр
рТМ0111/ТМ89/2.1	63,0	52,8	26,0	21,3	отр
рТМ0111/ТМ89/2.2	66,2	48,5	26,1	19,3	отр
рТМ0111/ТМ89/2.3	64,4	45,9	28,1	22,2	отр
ТМ89	64,7	48,2	26,4	24,7	отр
ТМ89	63,1	51,2	27,8	26,0	отр
рТМ0111/ТМ180/1.1	13,9	177,8	0,0	0,0	0,5
рТМО111/ТМ180/1.2	9,2	174,3	0,0	0,0	6,1
РТМ0111/ТМ180/1.3	0,0	188,6	0,0	0,0	5,8
рТМО111/ТМ180/1.4	0,0	191,7	0,0	0,0	5,1
рТМ0111/ТМ180/2.1	5,5	184,3	0,0	0,0	4,8
рТМ0111/ТМ180/2.2	0,0	194,4	0,0	0,0	3,9
рТМО111/ТМ180/2.3	8,9	186,6	0,0	0,0	4,1
рТМ0111/ТМ 180/2.4	11,9	170,6	0,0	0,0	3,8
ТМ180	48,7	94,6	1,2	15,0	11,0
ТМ180	50,2	92,6	1,2	16,1	10,7

Метаболический профиль предположительных интегрантов ТМ89 (табл. 11) во всех случаях был

- 15 017548 сходным с ТМ89 в этом тесте. За исключением рТМО111/ТМ89/1.1 и рТМО111ТМ89/1.3, которые плохо росли, они продуцировали формиат на том же уровне, что и ТМ89 (приблизительно 20 мМ) и имели сходные уровни других метаболитов и сходные уровни остаточной глюкозы. Однако предполагаемые интегранты ТМ89 могли не являться истинными интегрантами в локусе рНВ. С другой стороны, могло быть так, что мутанты ТМ89 не стабильны в этих условиях и что наблюдаемые результаты отражают селекцию ревертантов (потеря плазмиды), возможно, тем самым показывая более высокую нестабильность интегрантов при более низкой аэрации.

Предполагаемые интегранты ТМ180 проявляют себя по-разному. Они все демонстрировали отсутствие продукции формиата, низкую продукцию ацетата и очень низкий уровень остаточной глюкозы при сравнении с контролем ТМ180. Предположительно, они являются истинными интегрантами в локусе рДВ и потому неспособны продуцировать РРЬ.

с) Стабильные РРЬ-негативные мутанты с заменой гена

Первичные интегранты обоих штаммов (рТМО111 в ТМ180 и ТМ89) были использованы для получения предполагаемых двойных кроссоверов для замещения гена. Несколько первичных интегрантов каждого штамма последовательно пересевали в жидкой среде при встряхивании в отсутствие канамицина, затем культуральные среды были последовательно разбавлены, нанесены на ТОР и перепечатаны на ТОР, содержащий кап (12 мкг/мл) для идентификации Кап⁸ колоний, как описано ранее.

Когда эти Кап⁸ колонии были исследованы на продукцию формиата, четыре колонии для каждого реципиента демонстрировали уменьшение продукции формиата. Метаболические профили этих отдельных колоний приведены в табл. 12.

Таблица 12. Предполагаемые стабильные РРЬ-негативные мутанты в ТМ89 и ТМ180

			Концентрация / мМ
Штамм	Родитель		глюкоза	этанол	пируват	формиат	ацетат
ТМ236	ТМ89	Умеренный Ог	42,9	75,9	19,1	0,0	8,3
ТМ237	ТМ89	Умеренный Ог	40,7	75,9	15,4	0,0	11,6
ТМ89	11955	Умеренный Ог	73,4	43,7	22,1	22,5	1,8
Штамм	Родитель		глюкоза	этанол	пируват	формиат	ацетат
ТМ236	ТМ89	Низкий Ог	99,3	5,5	12,8	0,0	0,0
ТМ237	ТМ89	Низкий 02	100,0	5,1	12,1	0,0	0,0
ТМ244	ТМ89	Низкий Ог	99,8 .	4,1	10,6	0,0	0,0
ТМ245	ТМ89	Низкий 0?	101,4	3,9	10,1	0,0	0.0
ТМ89	11955	Низкий Ог	73,4	43,7	22,1	22,5	1.8
ТМ240	ТМ180	Низкий О2	5,9	173,0	0.2	0,0	5,8
ТМ241	ТМ180	Низкий О2	2,7	174,1	0,0	0,0	5,4
ТМ242	ТМ180	Низкий О2	0,0	175,2	0.0	0,0	8,0
ТМ243	ТМ180	Низкий О2	0,7	175,4	0,0	0,0	5,8
ТМ180	ТМ89	Низкий 02	48,3	85,9	1,0	18,0	12,1

Основанные на ТМ89 мутанты РРЬ ТМ236 и ТМ237 были протестированы как в умеренном, так и низком кислородном режиме. При низком уровне кислорода эти два штамма росли очень плохо. Они утилизировали очень небольшое количество глюкозы и продуцировали следовые количества (примерно 5 мМ) этанола. Единственный наблюдаемый значимый продукт был пируват (приблизительно 12 мМ), при отсутствии измеримых количеств формиата или ацетата. Однако при повышении содержания кислорода их метаболический профиль становился больше похожим на профиль ТМ89. Этот фенотип, повидимому, соответствует нокауту РРЬ, где экспрессия РБН слишком низка в низкокислородных/анаэробных условиях для эффективного замещения функции РРЬ, и объясняет фенотип, продемонстрированный первичными интегрантами в табл. 12, где предполагаемые первичные интегранты рТМО111 в ТМ89 оказались подобными ТМ89. Это и объясняет плохой рост мутантов РРЬ в таких условиях и обеспечивает строгую селекцию в направлении реверсии к дикому типу путем гомологичной рекомбинации. Другие предполагаемые РРЬ-негативные мутанты ТМ89 - ТМ244 и ТМ245 - были выделены из различных первичных интегрантов, но имели такие же профили, как у ТМ36 и ТМ37.

Основанные на ТМ180 мутанты РРЬ ТМ240, ТМ241, ТМ242 и ТМ243 (ТМ243 происходил от иного первичного интегранта, чем остальные три) демонстрируют фенотип, сходный с тем, что наблюдался у основанных на ТМ180 первичных интегрантов в табл. 11 (отсутствие измеримой продукции формиата, повышенной продукции этанола и сниженной продукции ацетата по сравнению с ТМ180). Поэтому было предположено, что они являлись стабильными мутантами РРЬ в результате замены гена.

б) Доказательство замещения гена РРЬ

Для проверки того, являлись ли предполагаемые мутанты РРЬ, описанные выше, истинными мутантами с замещенным геном, был поставлен ПЦР-эксперимент. Была получена геномная ДНК у ТМ236, ТМ241, ТМ242 и ТМ243. Были использованы праймеры 8ЕЭ ΙΌ N0. 25 и 8ЕЭ ΙΌ N0. 26, применявшиеся и для получения продуктов ПЦР оригинальной РРЬ из 11955, чья последовательность РРЬ была взята для нокаутного дизайна. Последовательность РРЬ, использованная в РРЬ-нокаутной конструкции рТМО111, целиком располагалась внутри последовательностей праймеров 8ЕЭ ΙΌ N0. 25 и 26, и это

- 16 017548 означает, что такая последовательность не содержится в рТМО111. Поэтому эта нокаутная конструкция не должна давать продукт ПЦР с данными праймерами, а штаммы с замещенным геном и штаммы дикого типа, наоборот, должны давать такой продукт.

Геномная ДНК из РРЬ-негативного мутанта с замещенным геном должна давать единственный продукт ПЦР, на 0,4 кб меньший, чем продукт дикого типа, и содержать новый сайт Νοΐ1.

Используя эти праймеры и геномные ДНК, с геномными ДНК 11955 и плазмидными ДНК рТМО111 в качестве контроля, было показано, что все четыре мутанта давали единственный продукт ПЦР размером приблизительно 1,3 кб (теоретически 1342 п.о.), по сравнению с приблизительно 1,7 кб продуктом из 11955 (теоретически 1694 п.о.). Как и ожидалось, никакой продукт не был получен с рТМО111. Продукты ПЦР от этих пяти штаммов были очищены в геле, разрезаны с помощью Νοΐ1 и анализированы методом электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР от всех четырех РРЬ-негативных мутантов были расщеплены полностью с образованием двух продуктов размером около 0,6-0,7 кб (теоретически: 650 п.о. и 691 п.о.), тогда как продукт 11955 не был разрезан под действием Νοΐ1. Этот тест следует считать определяющим, поскольку из него можно заключить, что эти четыре штамма являются истинными РРЬ мутантами, в которых нативный ген рД был замещен (в ходе гомологичной рекомбинации) геном рД, содержащим делецию размером 0,4 кб и новый сайт Νοΐί.

Сбраживание ксилана

Быстрые и простые эксперименты на пробирочной культуре были проведены с ТМ242 в коммерчески доступном ксилане (81дта), который был автоклавирован и обработан рядом гемицеллюлаз. Мы наблюдали исчезновение пиков сахаридов при анализе методом ВЭЖХ, а в дальнейших опытах мы наблюдали продуцирование этанола, что свидетельствовало не только о потенциальной способности данного организма сбраживать ферментативно обработанную гемицеллюлозу (высшая цель коммерческого лигноцеллюлозного получения этанола), но и о способности этого организма утилизировать димеры, целлобиозу и ксилобиозу, что требует наибольшего количества фермента и времени для их расщепления до глюкозы и целлобиозы. Это является значительным продвижением вперед и преимуществом перед существующей технологией. Результаты получения этанола из гемицеллюлозы показаны в табл. 13.

Таблица 13. Результаты продуцирования этанола

	Гемицеллюлаза	24 ч	48 ч Этанол (ι	% возрастание 24-48ч иМ)
94	95	96	97
1	+	+	-	-	12,84	14,82	15,4%
2	+	+	-	+	17,5	18,83	7,6%
3	-	+	+	+	45,63	49,04	7,5%
4	+	-	+	+	31,18	32,28	3,5%
5		-	-	+	10,07	10,43	3,6%
6		4-		-	16,71	33,65	101,4%
7		4-	-	-	13,4	19,09	42,5%
8			4-	-	15,6	34,18	119,1%
9			-	4-	25,98	31,12	19,8%
10	+		+ .	-	14,63	24,29	66,0%
11	+		-	-	11,14	11,82	6,1%
12	-		-	-	4,14	4,18	1,0%
13	+		+	-	13,78	22,25	61,5%
14	-		+	+	42,01	46,68	11,1%
15	+		-		13,26	15,03	13,3%
16	+	+	+		38,27	37,19	-2,8%

Арабинофуранозидаза

Арабинофуранозидаза

Эндо-ксиланаза

Ксилобиаза (бета-ксилоксидаза)

Мутанты 11955 и ТМ242 также были протестированы на предмет анаэробного брожения с использованием различных углеводов как источника углерода. Результаты представлены в табл. 14.

Таблица14

Анаэробное брожение 11955 и ТМ242 на различных углеводах
		Выработка кислот
	Углевод	11955	ТМ242	Комментарии
0	Контроль (-νβ)	-	-
1	Глицерин	±	+

- 17 017548

2	Эритриол			Эритриол (бутан-1,2,3,4-тетраол) является натуральным сахарным спиртом
3	Э-арабиноза	-	-
4	1-арабиноза	+	+	С5 — присутствует в гемицеллюлозе
5	Рибоза		+	Альдопентоза, присутствующая в РНК
6	О- ксилоза	+	+	С5 — присутствует в гемицеллюлозе
7	Ьксилоза	-	-
8	Адонитол			Рибитол, или адонитол, является кристаллическим пентозным спиртом, получаемый восстановлением рибозы
9	β-метил-Оксилозил	-	-	Производится из биомассы — индуктор выработки ксиланазы
10	Галактоза	-	-	С6 — присутствует в гемицеллюлозе
11	Глюкоза	+	+	Может подавлять ксиланазы (вместе со всем остальным)
12	Фруктоза	+	+
13	Манноза	+	+	С6 — присутствует в гемицеллюлозе
14	Сорбоза			Сорбоза — кетоза, принадлежащая к группе сахаров, известных как моносахариды. Промышленное производство витамина С (аскорбиновая кислота) часто начинается с получения сорбозы
15	Рамноза			Может быть классифицирована и как метилпентоза, и как 6-дезоксигексоза. Рамноза встречается в природе в 1_форме как Ь-рамноза (6-дезокси4_манноза)
16	Дульцитол	-	-	Входит в группу сахаров манит-сорбитдульцитол; изомер С6Н8(ОН)6 сорбита
17	Инозитол			Инозитол, или цис-1,2,3,5-транс-4,6циклогексангексол; является циклическим многоатомным спиртом и играет важную роль как вторичный мессенджер в клетках, в форме инозитолфосфатов. Присутствует в большинстве пищевых продуктов, особенно в злаках с высоким содержанием отрубей
18	Маннит	+	+	В химическом отношении маннит — это спирт и сахар, или полиол; является изомером сорбита,
19	Сорбит	+	+·	Входит в группу сахаров манит-сорбитдульцитол; изомер С6Н8(ОН)6 дульцитола
20	а-метил-Оманнозид	-	-
21	а-метил-Оглюкозид	+	+
22	Ν- ацетилглюкозамин		+	Глюкозамин + уксусная кислота, часть пептидогликана клеточной стенки

- 18 017548

				бактерий
23	Амигдалин		-к	Гликозид, выделенный из горького миндаля — считается средством против рака
24	Арбутин	+	+	Гликозилированный бензохинон, выделенный из растения медвежье ушко рода Агс1оз(арйу1о5
25	Эскулин	+	+	Гликозид, состоящий из глюкозы й дигидрокумарина — присутствует в экстрактах древесной коры
26	Салицин	+	+	2-(гидроксиметил)фенил-бета-Оглюкопиранозид — близок по структуре к аспирину
27	Целлобиоза	+	+	Дисахаридная единица целлобиозы, состоящая из двух молекул глюкозы, соединенных β(1—>4)связью
28	Мальтоза	+	4-	Дисахарид, состоящий из двух молекул глюкозы, соединенных ₽(1->4)связью — продукт деструкции крахмала/декстринов
29	Лактоза			Дисахарид, состоящий из молекул β-ϋгалактозы и β-Ο-глюкозы, объединенных посредством β(1—>4) гликозидной связи — присутствует в молоке
30	Мелибиоза	-	-	(биомасса)
31	Сахароза	+
32	Трегалоза	4-	+	Альфа-связанный дисахарид, обнаруживаемый в природе повсеместно, но не в больших количествах — 2 молекулы глюкозы, соединенные 1-1альфа связью
33	Инулин			Инулины — полимеры, в основном состоящие из фруктозы, и обычно имеющие концевую молекулу глюкозы — главная форма запасания углеводов у растений
34	Мелезитоза			Невосстанавливающий трисахарид, который можно выделить из сока различных деревьев
35	Раффиноза			Раффиноза — сложный углевод, трисахарид, состоящий из галактозы, фруктозы и глюкозы. Она присутствует в бобах, белокочанной капусте, брюссельской капусте, брокколи, спарже, других овощах и в цельном зерне
36	Крахмал	+	+
37	Гликоген	-	-
38	Ксилит			Ксилит, называемый также древесный сахар, является пятиуглеродным сахарным спиртом, который используется как сахарозаменитель
39	Гентибиоза	+	+

Микроорганизм, обозначенный здесь как ТМ89, и плазмида рИВ 190-Ий были депонированы в Νί,ΊΜΒ под номерами доступа 41275 и 41276, соответственно. Депозитарий: Νί,ΊΜΒ ЬИ, Регдикоп ВшИ1пд, СгаФкЮпе Ек1а1е, ВисккЬигп, АЬеИееп, АВ21 9УА, ИпИей Кшдйот.

- 19 017548

Перечень последовательностей <110> ТМО НепеиаЬ1еэ ΤίιηίΤθά <120> ТкегторЬШс Мхсгоогдапазтз Тог Е№апо1 РгоДисСЗоп <13о> дидо1298ио <160> 32 <170> РаЬепТ1п νθΕ3ίοη 3.3 <210> 1 <211> 29 <212> ОНА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>1 ддааЬТссс! 1а1даассаа ддааЕадса29 <210> 2 <211>31 <212> ЭМА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>2 дсддссдсас ссдсСсРССс ддГаасссдс 131 <210>3 <211> 31' <212> ОМА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>3 дсддссдсТТ дсЬаадЗдаа РаЫГЬсаад С31 <210>4 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400> 4 ссдсадсдес ааТЬссаТса сЫсасда 28

- 20 017548 <210> 5 <211> 25 <212> ОНА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>5 асаадсаааа даадаЪаИа аадад25 <210>5 <211>25 <212> ОМА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>6

ЬСбаадСдсС. сбаддаааа! аасад <210>7 <211>34 <212> ОМА <213> Искусственная <220 <223> Последовательность праймера <400>7 аа0с1адаса Са^дддОдсд аааасаОсса даН34 <210 8 <211>31 <212> ϋΗΑ <213> Искусственная <220 <223> Последовательность праймера <400>8 ссаадсПЬс ЮааЬаРс! 1с1ШдсС1 д31 <210>9 <211>31 <212> ΟΝΑ <213> СеоЬасШиз РЪегшодТисоатсЗазгиз <400 <4009 ссддСассаа ададддсааЕ сТдаааддаа д <210>

<210 <212>

ОМА

- 21 017548 <213> ЕеоЬасШиз £Ьегтод1исоз1(Заз1из <400>10 ддсабаЬдЬд Ьс£д£са£сс ЬССссааа28 <210> 11 <211>30 <212> ЭКА <213> СеоЬасШиз Ы1егтод1исоз1<1аз1из <400>11 ссддГассЪд аЕдГааЬЬдд агдсдасда!:30 <210> 12 <211> 28 <212> ОНА <213> СеоЬасШиз £ЬегП1од1исоз10ае1из <400>12 ддсаЬабдбд ьсЬдЬсаСсс Шссааа28 <210>13 <211>31 <212> 0ΝΑ <213> СеоЬасШиз зЬеагоЬЬегторкНиз <400>13 ссддЬассдс дддасдддда дсЬдадЬдсЬ с31 <210>14 <211>31 <212> ΌΝΑ <213> СеоЬасШиз зСеагоЬЬегторАНиз <400>14 ддса£аСдаГ Ьса£сс£ссс ЬсааЬаСааЬ д31 <210>15 <211>30 <212> ОН.А <213> СеоЬасйНиз зЬеагоЪНегторЬИиз <400>15 ссддЬассдс дддасдддда дсбаддсдсс30 <210> 16 <211>30 <212> ОКА <213> СеоЬасШиз зЬеаго£кегтор1111из <400>16 ддсаЬаЬдЬа ЬКсассКсЫ. с I. Осс 01. ί: I. £30

- 22 017548

<210>	23
<211>	30
<212>	ϋΝΑ
<213>	ВасШиг сегеиз
<400>	23

- 23 017548 ссддЕассад ЕЕаасасЕаЕ аЕаЕаЕадЕа <210>24 <211>30 <212> ЭМА <213> ВасШиз сегеиз <400>24 ддсаЕаЕдаа ЕсЕссЕссаЕ ЕЕЕЕдаЕЕад30 <210>25 <211>33 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная <220>

<22 3> Последовательность праймера <400> 25 сдЕдаааасд диддсдЕусЕ ЕдаЕаЕддаЕ аса <210> 26 <211> 26 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>26

ЕЕсдсассЕд дидсаааудд ЕЕсЕсс26 <2Ю>27 <211>30 <212> ΌΜΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>27 ссддааЕЕЕс асЕЕсссасд дассаддЕЕа30 <210>23 <211>31 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400> 28 аадсддссдс ЕаЕссаадаа ддЕддааасд с

- 24 017548 <210> 29 <211> 32 <212> ОМА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <4О0> 29 аадсддссдс ЕдсдсдЕсда аЕЕЕддсдаГ да32 <210>30 <211>30 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>30 ссаадсЕЕсс дЕаРасаасд СЕадасдЕаа30 <210>31 <211>27 < 212 > ОНА <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400>31 аудсссдЕЕЕ аааЕдгЕсда ЕНесаЕд21 <210>32 <211>23 <212> ΌΜΑ <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность праймера <400> 32 сдаадСддсЕ ддсааЕРСдд οϊΐ.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, в котором первая модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы, а вторая модификация активирует ген пируватдегидрогеназы.
2. 2. Микроорганизм согласно п.1, в котором вторая модификация представляет собой вставку промотора гена левее гена пируватдегидрогеназы, причем промотор работает в анаэробных условиях.
3. 3. Микроорганизм согласно п.1 или 2, дополнительно модифицированный с целью инактивации гена дигидролипоамид-трансацетилазы.
4. 4. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, дополнительно модифицированный с целью инактивации гена пируватформиатлиазы.
5. 5. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, не содержащий системы рестрикции.
6. 6. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который является спорообразующим.
7. 7. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который относится к виду СеоЬасП1ик.
8. 8. Микроорганизм по п.7, который представляет собой СеоЬасШик 111еппод1исок1бакшк.
9. 9. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который стабилен в культуральной среде с содержанием этанола вплоть до 30% (вес./об.).
10. 10. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который способен метаболизировать

    - 25 017548 целлобиозу, ксилобиозу и/или крахмал, а также их олигомеры.
11. 11. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который способен к росту при температуре 40-85°С, предпочтительно 50-70°С.
12. 12. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который содержит ненативный ген пируватдекарбоксилазы.
13. 13. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, который содержит ненативный ген алкогольдегидрогеназы.
14. 14. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, в котором в гене лактатдегидрогеназы не содержится элемента интеграции.
15. 15. Микроорганизм согласно любому из предыдущих пунктов, в котором нативный ген лактатдегидрогеназы или его часть были удалены.
16. 16. Способ получения этанола, включающий культивирование микроорганизма согласно любому из предыдущих пунктов в подходящих условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахаров или состоящих из них олигомеров.
17. 17. Способ согласно п.16, который осуществляют при температуре в пределах 40-70°С.
18. 18. Способ согласно п.17, который осуществляют при температуре в пределах от 52 до 65°С.
19. 19. Способ согласно любому из пп.16-18, согласно которому рН культуральной среды находится в пределах от 4 до 7,5.
20. 20. Источник корма для животных, включающий микроорганизм согласно любому из пп.1-15.