KR101476047B1 - 신규의 갈락토스 고대사균 및 이를 이용한 바이오매스 대사방법 - Google Patents

신규의 갈락토스 고대사균 및 이를 이용한 바이오매스 대사방법 Download PDF

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임현규
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Abstract

본 발명은, 갈락토스 고대사능을 갖는 신규 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)(수탁번호 KCTC12454BP), 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제, 및 이를 이용한 홍조류 기반의 바이오매스 대사방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 갈락토스 대사능이 뛰어난 신규의 대장균 균주를 이용하여 홍조류와 같은 바이오매스를 효율적으로 대사시킬 수 있기 때문에, 갈락토스를 특정 화합물이나 연료로 고수율 및 고생산성으로 전환할 수 있다. 뿐만 아니라, 신재생에너지를 효율적으로 얻을 수 있는 바 에너지 위기를 해소할 수 있고, 환경과 에너지 문제를 동시에 해결할 수 있다.

Description

신규의 갈락토스 고대사균 및 이를 이용한 바이오매스 대사방법{NOVEL GALACTOSE METABOLIZING BACTERIA AND METHODS FOR METABOLIZING BIOMASS USING THE SAME}
본 발명은, 갈락토스 고대사능을 갖는 신규 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)(수탁번호 KCTC12454BP), 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제, 및 이를 이용한 홍조류 기반의 바이오매스 대사방법에 관한 것이다.
최근, 대체에너지 개발, 특히 환경과 화석연료 고갈 문제를 동시에 해결할 바이오매스(Biomass) 기술에 관심이 집중되고 있다. 바이오매스를 이용하게 되면 지구온난화의 주범인 이산화탄소를 사용하면서 바이오디젤·바이오에탄올 같은 친환경 에너지를 생산할 수 있다.
바이오매스란 자연에 존재하는 광합성에 의존하는 식물류를 포함하며 통상 1, 2, 3세대로 나눌수 있다. 1세대인 사탕수수와 옥수수 등은 여러가지 문제점을 안고 있으며, 2세대인 목질계 또한 전처리의 어려움 때문에 실용화 전망이 아직도 불투명하다. 따라서, 현재는 3세대 바이오매스인 미세조류 연구에 연구력을 집중하고 있는 실정이다. 미세조류는 5-20 마이크론 크기의 미생물로서 지구상에는 약 만종이 존재하며 구성성분이 많이 달라 어떤 종류는 디젤의 원료가 되는 지질의 함량이 80% 달하는 것까지도 있다.
이와 같이, 지난 수십년 동안 미생물을 활용하여 육상 또는 해상 유래의 바이오매스를 화합물 및 연료로 전환시키고자 하는 노력이 지속되었다. 특히, 홍조류(red seaweeds)는 해양 유래 바이오매스로서 육상식물에 비하여 빠른 속도로 성장하기 때문에 바이오매스를 신속하게 얻을 수 있고, 따라서 이산화탄소 고정 능력도 높게 나타난다. 더욱이, 홍조류와 같은 해조류는 리그닌(lignin)이 없다는 장점이 있는데, 리그닌은 분해가 어렵고 분해가 되더라도 미생물의 성장을 저해하는 문제점을 갖고 있기 때문이다.
이러한 장점들로 인하여 홍조류는 차세대 바이오매스로서 각광을 받고 있지만, 바이오매스에는 glucose, galactose, xylose, arabinose, mannose, sucrose 등의 여러 종류의 탄소원이 혼재되어 있기 때문에 이들을 동시에 효과적으로 대사시킬 수 있는 균주(strain) 개발의 필요성이 제기되어 왔다.
대부분의 미생물은 배지에 이러한 탄소원들이 복합적으로 함께 존재할 경우, 대사하기 쉬운 글루코스부터 먼저 소비하게 되고 이후 글루코스가 고갈된 후에 다른 탄소원을 사용하게 된다. 미생물은 이를 위해 여러 단계에 걸쳐 정교한 조절 기작을 가지고 있는데, 글루코스가 배지에 존재할 경우 다른 탄소원의 대사과정에 관여하는 유전자의 발현을 저해하는 것이 그 예이며, 이러한 현상을 CCR(carbon catabolite repression)이라고 한다. 또한, 산업적인 관점에서 보면, 바이오매스로부터 얻은 여러 가지 복합 탄소원들이 동시에 대사되지 않기 때문에 대사산물의 생산성이나 수율, 공정상 여러 문제점을 갖게 된다.
우뭇가사리와 같은 홍조류는 주로 셀룰로오스(cellulose)와 한천(agar)으로 구성되는데, 산 분해 또는 효소 분해를 이용하여 단량체(monomer)인 글루코스와 갈락토스를 얻을 수 있다. 이후, 글루코스는 해당과정(glycolysis)으로 바로 들어가는 반면, 갈락토스의 경우에는 "Leloir pathway"를 거쳐 해당과정의 초기 반응물인 글루코스-6-인산으로 전환되어야 한다(도 1 참조).
이와 같이 갈락토스는, 글루코스에 비하여 복잡한 효소반응을 필요로 하기 때문에, 미생물의 성장속도가 글루코스 배지에 비하여 느리다. 또한, 갈락토스는 글루코스에 의해 억제(repression)를 받는 CCR 현상을 보이기 때문에, 배지에 이들 탄소원이 동시에 존재할 경우 글루코스가 소비된 후 갈락토스가 대사되므로, 산업적으로 대사산물의 생산성 및 수율이 낮아지는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 갈락토스의 대사능을 높이고, 글루코스 등과 같은 선호 탄소원과 갈락토스가 함께 존재하더라도 이들의 동시 대사가 가능한 신규의 대장균(Escherichia coli) 균주를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규의 대장균 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제, 이를 이용한 바이오매스 대사방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 수탁번호 KCTC12454BP로 기탁된, 갈락토스 고대사능을 갖는 신규의 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 균주는 글루코스와 갈락토스를 동시에 대사할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은, 수탁번호 KCTC12454BP로 기탁된, 갈락토스 고대사능을 갖는 신규의 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은, 수탁번호 KCTC12454BP로 기탁된, 갈락토스 고대사능을 갖는 신규의 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)를 바이오매스에 처리하는 단계를 포함하는 바이오매스 대사방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 바이오매스는 홍조류인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의할 경우, 갈락토스 대사능이 뛰어난 신규의 대장균 균주를 이용하여 홍조류와 같은 바이오매스를 효율적으로 대사시킬 수 있기 때문에, 갈락토스를 특정 화합물이나 연료로 고수율 및 고생산성으로 전환할 수 있다.
또한, 본 발명에 의할 경우, 신재생에너지를 효율적으로 얻을 수 있기 때문에 에너지 위기를 해소할 수 있고, 환경과 에너지 문제를 동시에 해결할 수 있다.
도 1은, 미생물의 갈락토스 대사 과정을 나타낸 Leloir pathway이다.
도 2는, pACYCDuet 벡터(도 2a) 및 pACYCgalO 플라즈미드(도 2b)의 모식도이다.
도 3의 A 및 B는 각각 야생형 균주 W3110 및 본 발명의 GRTOP 균주를, 글루코스와 갈락토스가 함께 첨가된 M9 minimal 배지에 배양하였을 때, 시간에 따른 균주의 성장과 탄소원 소모 프로파일(profile)을 나타낸 그래프이다.
도 4는, GRTOP 균주에 특이적인 유전체의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 4에서 붉은색 부분은 J23100 서열을, 청색부분은 5'UTR 서열을, 노란색 하이라이트 부분은 구조 유전자(structure gene) 서열을, 녹색 하이라이트 부분은 종결자(terminator) 서열을 의미한다.
본 발명자들은 갈락토스 대사 속도가 높은 신규의 균주를 얻기 위하여, 대장균 자체의 갈락토스 대사 회로인 "Leloir pathway"를 재설계하였다. 즉, 갈락토스 대사능이 높은 균주를 개발하기 위해서는, 갈락토스 대사과정과 관련된 효소들의 세포내 발현량을 높여 세포 구성성분이나 에너지원으로 효과적으로 전환될 수 있도록 해야 한다.
갈락토스의 대사경로인 "Leloir pathway" 자체 조절 기작을 제거하고, 회로의 플럭스(flux)를 증가시키기 위하여 세포내 효소 발현을 증가시켰다. 이를 위해, 대사 효소들을 코딩(coding)하고 있는 유전자들의 프로모터(promoter)를 고발현 항시성 프로모터(strong constitutive promoter)로 교체하고, 5' UTR(UnTranslated Region) 서열을 해당 유전자의 코딩서열에 맞도록 UTR designer(http://sbi.postech.ac.kr/rbs)를 통해 최적화하였으며, 각 유전자의 코딩서열 말단에 종결자 서열(terminator sequence)을 삽입하였다.
대장균(E.coli)의 경우, 갈락토스가 유일한 탄소원인 배지에서는 글루코스 배지에 비하여 성장 속도가 현저히 낮게 되는데, 이것은 해당과정(glycolysis)으로 들어가기 위하여 더 복잡한 효소들이 사용되기 때문이다. galR(Gal repressor)와 galS(Gal isorepressor) 유전자가 코딩하고 있는 단백질은, 갈락토스의 흡수(uptake)와 대사과정(metabolism)에 관련된 유전자들(galK, galT, galE)의 프로모터의 upstream에 결합하여 전사를 억제한다. 종래, 이들 전사억제자(repressor) galR과 galS를 삭제(deletion)할 경우, 갈락토스 대사과정에 관여하는 효소의 발현수준이 높아진다고 알려져 있기 때문에, 본 발명에서는 우선 유전자 조작할 기본균주를 선정하기 위한 전작업으로서 이들을 삭제하였다. galS가 삭제된 'GS 균주', galR이 삭제된 'GR 균주', galS와 galR이 모두 삭제된 'GSR 균주'를 각각 글루코스와 갈락토스를 유일 탄소원으로 하는 배지에서 배양하였다.
그 결과, 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이, 야생형 균주(W3110)의 경우 최대당흡수속도(Maximum specific sugar uptake rate)와 최대성장속도(Maximum specific growth rate)가 낮음을 알 수 있는데, 이는 갈락토스를 효과적으로 신속히 저분자 화합물로 전환하기 위하여는 갈락토스 대사 경로가 더 활성화되어야 한다는 것을 의미한다. 또한, 나머지 균주들에 대하여도, 글루코스 배지에서는 야생형과 성장속도가 비슷했지만, 갈락토스 배지에서는 GR 균주가 23.7%, GS 균주가 14.1% 증가된 성장속도를 나타냈다. 하지만, GSR 균주는 오히려 성장속도와 당흡수속도 모두 감소된 결과를 나타내었다. 이러한 결과를 기초로, 본 발명에서는 galR이 삭제된 'GR 균주'를 기본으로 유전자 조작할 균주로 선정하였다.
[표 1] 균주별 성장 지수기(exponential phase)에서의 생리 데이터
Figure 112013074367993-pat00001
a : biomass 수율로부터 계산되었음.
b : exponential phase의 biomass와 당농도 그래프의 기울기로부터 계산되었음. 1 OD600은 0.27g 세포 건조중량으로 계산하였음.
글루코스와 갈락토스를 효과적으로 동시 대사하기 위해서는, 각각의 탄소원의 대사속도가 빨라야 하고 CCR 현상이 없어야 한다. 따라서, 본 발명에서는, 갈락토스 대사를 높이기 위해서 세포질내로 갈락토스를 수송하기 위한 수송체(transporter)와 대사회로상의 효소를 코딩하는 유전자들을 과발현시키기 위해 다음과 같은 유전자 조작을 행하였다. 이때, E.coli의 갈락토스 대사에 관여하는 galETKM 오페론(operon)의 구성은 다음과 같다.
Figure 112013074367993-pat00002
우선, 수송체 유전자인 galP(D-galactose transporter)에, 고발현 항시성 프로모터(strong constitutive promoter)인 J23100 프로모터와 과발현에 최적화되어 있는 5' UTR을 연결하여 galP를 과발현시켰다. 5' UTR 서열은 번역개시 단계에서 특정한 RNA 2차 구조를 형성하여 리보솜이 RNA에 결합하는데 영향을 주며, 이러한 RNA 2차 구조는 서열에 의해 변경되기 때문에 원하는 서열을 적용하여 번역개시 속도를 조절할 수 있다.
또한, native regulation을 모두 없앤 'GRT 균주'는 갈락토스 흡수속도에서 7.2% 증가된 결과를 보였으나, 최대성장속도는 오히려 GR균주보다 작게 나타났다(표 1 참조). 이러한 현상은 세포내의 갈락토스 대사와 관련된 효소들의 발현량이 충분하지 못하여, 증가된 갈락토스 flux를 전환시키지 못한 것으로 생각되었기 때문에, 갈락토스 대사에 관여하는 효소들을 상기 방법으로 과발현시켰다.
즉, 세포내의 β-D-갈락토스를 α-D-갈락토스로 전환시키는 galM(galactose-1-epimerase), α-D-갈락토스를 α-D-글루코스-1P로 전환시키는 galK(galactose kinase) 등 갈락토스 오페론을 구성하는 효소와, α-D-글루코스-1P를 α-D-글루코스-6P로 전환하는 포스포글루코뮤타아제(phosphoglucomutase: pgm) 효소를 과발현시켰다. 이 때, 갈락토스 오페론의 경우 야생형은 오페론 전체가 하나의 프로모터에 의해 발현조절되는 형태이지만, 보다 확실한 과발현을 위하여 각 유전자의 upstream에 프로모터와 5'UTR이 각각 존재하도록 설계하였다. 특히, pgm 유전자의 경우 코딩서열의 구조적인 특성으로 인해 최적화된 5' UTR 설계에 곤란한 점이 있기 때문에 코돈 최적화(codon optimization)를 진행하였다. 또한, 이러한 유전인자의 발현과 유지의 안전성을 위하여 플라즈미드 기반의 과발현 대신, 염색체 상에서 원래의 유전자를 대체(replace)하기 위해 재조합시켰다.
이러한 유전자 조작이 모두 완료된 본원발명의 균주를 'GRTOP 균주'로 명명하였다. 이 GRTOP 균주를 글루코스와 갈락토스가 포함된 M9 배지에서 배양하였으며, 야생형 균주를 대조군으로 하여 함께 배양하였다. 그 결과, 상기 [표 1]에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 GRTOP 균주는 갈락토스 최대흡수속도가 야생형 균주 대비 53.1%, 최대성장속도가 44.8% 증가됨을 확인하였다. 그러나, 글루코스 배지에서는 야생형 균주와 거의 비슷한 생리활성을 보였는데, 이는 본원발명의 GRTOP 균주를 얻기 위해 도입한 합성 유전인자들이 갈락토스 외에 글루코스 대사에는 별다른 영향을 주지 않음을 의미하는 것이다.
또한, 야생형 균주(W3110)의 경우 글루코스와 갈락토스가 동시에 배지에 존재할 경우 글루코스가 먼저 소비된 후에 갈락토스가 소비되는 CCR 현상을 보이게 되나(도 3의 A 참조), 본 발명의 GRTOP 균주를 우뭇가사리(홍조류)의 일종인 Gelidium amansii을 구성하고 있는 글루코스와 갈락토스 비율과 동일한 배지에서 배양한 결과 글루코스와 갈락토스를 동시에 소비함을 관찰할 수 있었다(도 3의 B 참조).
따라서, 본 발명자들에 의해 개발된 균주는, 탄소원을 대사하는 속도가 증가되어 저분자 화합물 생산에 높은 수율을 보이는 것으로 예상되는 바, 결과적으로 홍조류 등과 같은 바이오매스의 갈락토스 성분을 효과적으로 대사할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. pACYCgalO 플라즈미드의 제작
야생형 E.coli 균주를 형질전환시키기 위하여, pACYCDuet 벡터(도 2a 참조)를 백본으로 하여 다음과 같은 방법으로 pACYCgalO 플라즈미드(도 2b 참조)를 제작하였다.
본 실시예에서 사용한 Phusion　 DNA Polymerase와 제한효소들은 각각 TaKaRa, New England Biolabs에서, 배양액 제조를 위한 재료들은 모두 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 또한, 본 실시예에서 PCR 증폭시 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 하기 [표 2]에 나타내었으며, 이때 -F는 정방향(Forward) 프라이머를, -R은 역방향(Reverse) 프라이머를 의미한다.
[표 2] 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열
Figure 112013074367993-pat00003
Figure 112013074367993-pat00004

본 실시예에서 사용한 균주 및 플라즈미드 정보는 하기 [표 3]에 나타내었다.
[표 3] 균주 및 플라즈미드의 특성
Figure 112013074367993-pat00005

우선, 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistance gene)인 KanR을 주형으로 하고, V-KanR-F와 V-KanR_R 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편을, pACYCDuet 벡터의 kpnI과 SacI 제한효소 자리에 삽입하였다. 이후, galE와 galT 유전자를 삽입하기 위하여 프라이머쌍 V-galE-F/V-galE-R 및 V-galT-F/V-galT-R를 이용하여 galE-galT 단편을 PCR 증폭한 후, NotI과 bamHI 제한효소 자리에 삽입하였다.
마지막으로, galK와 galM 유전자를 삽입하기 위하여 프라이머쌍 V-galK-F/V-galK-R 및 V-galM-F/V-galM-R을 이용하여 PCR 증폭된 galK-galM 단편을 NdeI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하였다. 이때, galE, galT, galK, galM 모두 야생형 균주(W3110)에서 추출한 게놈을 주형으로 사용하였다.
실시예 2. 대장균( E.coli ) GRTOP 균주의 제작
2-1. 형질전환
실시예 1에서 제조한 pACYCgalO 플라즈미드를 야생형 W3110 대장균(E.coli)에 transfection시켜 형질전환하였으며, 구체적인 방법은 다음과 같다.
형질전환 방법으로는 전기충격법을 사용하였다. 먼저, 항생제가 포함된 플레이트에서 단일 colony를 얻어 LB배지에서 37℃ overnight 배양하였다. 이 것을 1/100 정도 희석하여 새로운 배지에 접종하고, 이때 600nm의 파장 흡광도가 0.4~0.6 정도가 되면, 원심분리기를 이용하여 4℃, 13,000rpm으로 원심분리하여, cell pellet을 확보하였다. 이 pellet을 차가운 멸균 초정제수를 이용하여 세정한 뒤, 다시 마찬가지의 조건으로 원심분리하여 pellet을 얻는 과정을 3번 반복하였다. 마지막으로, 보관을 위하여 차가운 10% 글리세롤으로 증류수 세정과정과 동일하게 1번 진행한 후, 상층액을 약 100ul 남기고 모두 버렸다. 남은 상층액을 피펫팅하여 pellet을 재현탁시킨후, 원하는 플라스미드가 들어있는 벡터를 넣은 후, electroporator를 이용하여 1.8kV의 전기 충격을 약 4.0ms 정도 가하였다. 이후 LB 배지를 1ml 첨가하여 37℃ shaker에서 1시간 recovery과정을 거친 후, 항생제가 들어있는 플레이트에 도말하였다.
이후, pKD46, pcp20 벡터를 이용한 Red recombination 방법을 이용하여, 대장균의 염색체 재조합을 진행하였으며, 이러한 유전자 조작을 통하여 GRTOP 균주를 제조하였다.
2-2. GS 균주, GR 균주, GSR 균주, GRT 균주의 제작
우선, 비교실험군으로서 GS 균주, GR 균주, GSR 균주, GRT 균주를 제작하였다.
GS 균주는, 야생형 W3110 균주에서 galS 유전자를 제거하여 얻었으며, 이때에는 D-galS-F/D-galS-R 프라이머쌍으로 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편을 이용하여 재조합하였다.
GR 균주는, 야생형 W3110 균주에서 galR 유전자를 제거한 것으로, 이때에는 D-galR-F/D-galR-R 프라이머쌍으로 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편을 이용하여 재조합하였다.
GSR 균주는, 야생형 W3110 균주에 galS와 galR 유전자를 제거한 것으로 상기 방법을 이용하여 유사하게 제작하였다.
GRT 균주는, 세포질내로의 갈락토스 수송을 증대시키기 위하여 갈락토스 수송체인 galP 유전자가 과발현되도록 GR 균주의 galP 유전자를 조작하여 얻은 것이다. 구체적으로, 야생형 galP 유전자의 프로모터와 5' UTR을 제거하고, 항시성 프로모터(constitutive promoter)인 J23100과 과발현에 코돈 최적화된 5' UTR 서열을 삽입하였으며, 이들의 구체적인 염기서열을 하기 [표 4]에 나타내었다.
[표 4] J23100과 5' UTR의 염기서열
Figure 112013074367993-pat00006
이때에는 O-galP-F, O-galP-R1, O-galP-R2 프라이머쌍을 사용하여 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편이 이용되었다.
2-3. GRTOP 균주의 제작
다음으로, 본 발명의 GRTOP 균주를 제작하였다. GRTOP 균주는 GRT 균주에서 갈락토스를 해당과정의 중간체인 글루코스-6-포스페이트로 전환시키기 위한 갈락토스 오페론(galETKM)과 pgm 유전자를 과발현시킨 균주이다. 야생형 균주의 경우 갈락토스 오페론이 하나의 프로모터에서 발현되는 polycistronic한 구조를 가지고 있으나, GRTOP 균주의 경우 galE, galT, galK, galM 유전자 각각의 상류 및 하류에 J23100 프로모터, 5' UTR, terminator를 삽입하여 synthetic single operon cluster가 되도록한 것이다.
galETKM의 경우, pACYCGalO를 주형으로 하여 O-galETKM-F와 O-galETKM-R 프라이머쌍으로 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편을 이용하여 Red recombination하였다.
pgm 유전자의 경우 같은 방법으로 과발현시켰으나, 코돈 최적화된 5'UTR 디자인을 위하여 pgm 코딩 서열의 초기 35bp를 코돈 최적화하였다. 또한, pgm의 uptream에 위치한 seqA 유전자의 발현 영향을 최소화하기 위하여 pgm 유전자의 자체 종결자를 삽입하였다. O-pgm-F과 O-pgm-R 프라이머쌍으로 증폭된 FRT-Kan R-FRT 단편을 이용하여 Red recombination하였다.
결과적으로, GRTOP 균주는 galP, pgm, galE, galT, galK, galM 각각이 고발현 항시성 프로모터인 BBa_J23100 프로모터와, UTR designer에 의해 최대발현을 하도록 생성된 5'UTR 서열을 가지고 있다. galP와 pgm, galM은 자체 종결자(terminator)를 그대로 두어 사용하였으나, galE, galT, galK의 경우에는 각 유전자 사이에 종결자를 삽입하여 synthetic single operon 구조를 갖도록 설계하였다.
본 발명의 GRTOP 균주에 특이적인 유전체 "GRT galETKM:: PBBa_J23100-SynUTRgalE-galE-PBBa_J23100-SynUTRgalT-galT -PBBa_J23100-SynUTRgalK-galK -PBBa_J23100-SynUTRgalM-galMPpgm-UTRpgm::PBBa_J23100-SynUTRpgm"의 염기서열을 도 4a 내지 도 4e에 나타내었다.
이렇게 제작된 GRTOP 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC12454BP로 기탁하였다.
실시예 3. 성장속도 측정 및 탄소원 소모 프로파일 분석
대조군(control)으로서 W3110 균주와 실시예 2에서 얻은 GRTOP 균주에 대하여, 세포 성장속도를 측정하고, 탄소원 소모 프로파일을 분석하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
3-1. 세포 배양
먼저, LB 플레이트에서 콜로니를 얻은 후, 3ml의 글루코스 및 갈락토스 M9 최소배지(minimal medium)에서 밤새 배양을 진행하였다. 이때 사용한 세포 성장 배지는, M9 salt solutions, 5mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 항생제가 첨가된 M9 배지이며, 글루코스와 갈락토스를 각각 2g/L의 양으로 첨가하였다. 특히, 글루코스와 갈락토스의 양은 우뭇가사리의 일종인 Gelidium amansii을 구성하고 있는 글루코스와 갈락토스 비율과 동일하게 하였다.
씨드(seed)는 같은 배지에 접종하였고, 세포농도(OD600)가 0.8∼0.9에 이르면 멸균수로 두번 세정과정을 거쳐 25ml의 배지에 초기농도(OD600) 0.05로 접종하였다. 모든 실험은 두번씩(duplicate) 진행되었다.
3-2. 대장균의 성장속도 측정
상기 배양된 W3110 균주 및 GRTOP 균주에 대하여, OD600을 측정하여 성장속도를 측정하였다. 즉, 접종후부터 세포성장이 정체기(stationary phase)에 이를 때까지 매 시간 OD600nm의 흡광도를 측정하여 성장 속도를 계산하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 있어서 A의 ○ 표시부분이 W3110 야생형 균주의 성장곡선이고, B의 ● 표시부분이 W3110 야생형 균주의 성장곡선이다. 그래프의 왼쪽 y축은 OD600을 log단위로 나타낸 것이며, x축은 배양 시간을 의미한다. 오차막대는 2반복 실험의 표준편차를 나타낸 것이다.
3-3. 탄소원 소모 프로파일 분석
상기 배양된 W3110 균주 및 GRTOP 균주에 대하여, 배지에 존재하는 글루코스와 갈락토스 탄소원의 양을 시간에 따라 측정하였다. 이때, 배지에 존재하는 탄소원은 Aminex HPX-87H 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 방법으로 측정하였다. 이동상으로 5mM H2SO4을 사용하였으며, 유속은 0.6ml/min, 오븐의 온도는 65℃로 설정하였다. 탄소원의 시그널은 Shodex RI-101 refractive index detector(Shodex, Klokkerfaldet, Denmark)를 이용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, W3110 야생형 균주와 GRTOP 균주를 글루코스와 갈락토스가 같이 첨가된 M9 minimal 배지에 배양하였을 때, W3110 야생형 균주의 경우 글루코스(도 3의 A에서 □ 표시부분)가 소비되고 나서야 갈락토스(도 3의 B에서 △ 표시부분)가 소비되기 시작하는 전형적인 CCR 현상을 보였으나, GRTOP 균주는 글루코스(도 3의 B에서 ■ 표시부분)와 갈락토스(도 3의 B에서 ▲ 표시부분)를 동시에 대사할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 탄소원을 대사하는 속도 또한 증가되었다. 그래프의 오른쪽 y축은 탄소원 소비량을 g/L의 단위로 나타낸 것이고, x축은 배양 시간을 의미한다. 오차막대는 2반복 실험의 표준편차를 나타낸 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC12454BP 20130725

Claims (5)

  1. 갈락토스 고대사능을 가지는 신규의 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)(수탁번호 KCTC12454BP).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 글루코스와 갈락토스를 동시에 대사할 수 있는 것을 특징으로 하는, 대장균 균주 GRTOP(Escherichia coli GRTOP)(수탁번호 KCTC12454BP).
  3. 제 1 항의 대장균 균주 GRTOP(수탁번호 KCTC12454BP)를 유효성분으로 함유하는, 글루코스와 갈락토스의 동시 대사용 미생물 제제.
  4. 삭제
  5. 삭제
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