CN105802990B - 重组型酵母菌细胞及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种重组型酵母菌细胞及其制备方法与用途。本发明公开一种用于生成重组型酵母菌细胞的方法，其包括：提供可通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的亲代酵母菌细胞，以及对该亲代酵母菌细胞进行基因修饰处理，该基因修饰处理包括删除或破坏fps1基因或者使fps1基因失效、导入编码木糖醇脱氢酶的基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得木糖醇脱氢酶能够过量生成，以及依序地删除或破坏gpd1基因以及gpd2基因或者依序地使gpd1基因以及gpd2基因失效。由此所得到的该重组型酵母菌细胞具有优异的乙醇转化率以及较低的副产物生成率。

Description

重组型酵母菌细胞及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种用于生成一重组型酵母菌细胞的方法，特别是涉及一种将可通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的亲代酵母菌细胞进行基因修饰，借以提升其乙醇转化率及降低副产物生成率的方法。

背景技术

一般在微生物发酵的过程中，木糖主要是通过下列2种途径而被转化为乙醇：

(1)氧化-还原酶途径(oxido-reductase pathway)，其包含下列步骤：利用木糖还原酶(xylose reductase,XR)来将木糖还原为木糖醇(xylitol)，继而以木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)来将木糖醇磷酸化为木酮糖(xylulose)，然后以木酮糖激酶(xylulose kinase,XK)来将木酮糖转化为木酮糖-5-磷酸(xylulose-5-phosphate)，最后进入磷酸五碳糖途径(pentose phosphate pathway)而生成乙醇；或

(2)异构酶途径(isomerase pathway)，其包含下列步骤：利用木糖异构酶(xyloseisomerase)来将木糖转化为木酮糖，然后以木酮糖激酶来将木酮糖转化为木酮糖-5-磷酸，继而进入磷酸五碳糖途径而生成乙醇。

另外，葡萄糖则主要是通过下列步骤而被转化为乙醇：以己醣激酶(hexokinase)、磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase)以及磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)来将葡萄糖转化为果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate)，然后以果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)来将果糖-1,6-二磷酸转化为甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate)以及二羟丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)，其中DHAP会经由甘油-3-磷酸脱氢酶-1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase-1,GPD1)以及甘油-3-磷酸脱氢酶-2(glycerol-3-phosphate dehydrogenase-2,GPD2)的作用而被转化为甘油(glycerol)，而甘油醛-3-磷酸则进一步被转化为乙醇。

然而，在利用微生物发酵来将木糖以及葡萄糖转化为乙醇的过程中，会产生影响微生物的醣利用率(saccharide utilization rate)的副产物(例如，木糖醇及甘油)，进而降低乙醇的产量。因此，本领域的相关研究人员皆致力于开发在发酵过程中降低副产物生成的方法，从而提高乙醇的产量。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有将一纤维素水解液(cellulosichydrolysate)中的六碳糖(例如葡萄糖)转化为乙醇的代谢能力，因而已被广泛地利用于工业发酵产业上。但是，未经基因改质的酿酒酵母菌无法有效利用该纤维素水解液中所存在的大量五碳糖(例如木糖)，并且在发酵产乙醇的过程中也会生成甘油副产物而使得乙醇的产量被降低。因此，近年来有许多研究是通过遗传代谢工程(metabolic engineering)的方式来改善上述问题。例如，将木糖-发酵细菌(xylose-fermentation bacteria)中与木糖代谢路径有关联的基因导入至酿酒酵母菌中，由此所得到的木糖-发酵的酿酒酵母菌(xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae)可以有效地共发酵五碳糖与六碳糖，进而增加乙醇的产量(B.

et al.(2007),Appl.Microbiol.Biotechnol.,74:937-953)。

TW I450963B(对应申请案US 20140087438A1和CN 103695329A)揭示一被导入一编码XR的基因(也就是说xr基因)、一编码XDH的基因(也就是说xdh基因)以及一编码XK的基因(也就是说xk基因)的木糖-发酵的酿酒酵母菌菌株，它在木糖利用率以及乙醇产率上皆具有一优异的表现。该木糖-发酵的酿酒酵母菌菌株以寄存编号DSM 25508被寄存于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，以下简称DSMZ)，并且以寄存编号BCRC 920077被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(以下简称BCRC)。

在S.R.Kim et al.(2012),Metabolic Engineering,14:336-343中，S.R.Kim等人揭示2株分别带有xr基因、xdh基因以及xk基因，且该xdh基因被过量表达 的酿酒酵母菌菌株YSX3-tX2以及YSX3-pX2，而在与酿酒酵母菌菌株YSX3(它带有xr基因、xdh基因以及xk基因，但该xdh基因未被过量表达)相较下，该等酿酒酵母菌菌株YSX3-tX2以及YSX3-pX2能够发酵较多的木糖并且具有较高的乙醇产量。

此外，有研究将酿酒酵母菌中涉及甘油的形成与细胞内累积(intracellularaccumulation)的酶的基因和/或细胞膜运输蛋白(plasma membrane transporter)的基因删除，借此来降低发酵过程中甘油的形成，进而提升乙醇的产量。例如，在Zhang A.et al.(2007),Letters in Applied Microbiology,44:212-217中，Zhang A.等人将酿酒酵母菌中的一编码甘油信道蛋白(glycerin passage protein)的fps1基因删除而得到一Δfps1突变的酿酒酵母菌，且发现该Δfps1突变的酿酒酵母菌在与未经Δfps1突变的酿酒酵母菌相较下会具有较低的甘油产量以及较高的乙醇产量。

US 2011/0275130 A1揭示对酿酒酵母菌CEN.PK102-3A菌株进行gpd1基因以及gpd2基因的全长序列破坏而得到Δgpd1Δgpd2的酿酒酵母菌RWB0094菌株，接而将一编码β-异丙基苹果酸脱氢酶(β-isopropylmalate dehydrogenase)的LEU2基因转化至该酿酒酵母菌RWB0094菌株中而得到一酿酒酵母菌IMZ008菌株，然后将源自于大肠杆菌(Escherichia coli)的mhpF基因转化至该酿酒酵母菌IMZ008菌株中，而得到一会表达mhpF基因的Δgpd1Δgpd2重组型酿酒酵母菌。该重组型酿酒酵母菌在一具有葡萄糖与醋酸的厌氧培养条件下被拿来进行甘油与乙醇产量的测定。而实验结果发现：与一带有gpd1与gpd2基因的酿酒酵母菌IME076菌株相较下，该重组型酿酒酵母菌不会生成甘油并且具有较高的乙醇产量。惟，当葡萄糖是唯一碳源时，该重组型酿酒酵母菌无法进行厌氧生长(anaerobicgrowth)。

US 2011/0250664 A1揭示对酿酒酵母菌YC-DM菌株进行fps1基因与gpd2基因的全长序列删除，gpd1基因的启动子序列(promoter sequence)的截短(truncation)，以及谷氨酸合成酶1(glutamate synthase 1,GLT1)基因的过量表达，由此所得到的基因改变的酿酒酵母菌被接种于玉米胶(corn mash)中以进 行发酵，然后进行乙醇以及甘油产量的测定。而实验结果证实：与商业上可获得的酿酒酵母菌(商品名为BIOFERM XR以及ETHANOL

)相较下，该基因改变的酿酒酵母菌会生成较少的甘油并且具有较高的乙醇产量。

在Hubmann G.et al.(2011),Applied and Environmental Microbiology,77:5857-5867中，Hubmann G.等人对野生型酿酒酵母菌的gpd1基因进行破坏(disruption)，以及对gpd2基因的启动子进行置换(replacement)，而得到Δgpd1缺失的酿酒酵母菌、Δgpd2缺失的酿酒酵母菌以及Δgpd1Δgpd2双缺失(double deletion)的酿酒酵母菌。该等基因缺失的酿酒酵母菌接着在半-厌氧的发酵条件(quasi-anaerobic fermentationcondition)下被拿来进行乙醇以及甘油生成的评估。而实验结果发现：与野生型酿酒酵母菌相较下，该等基因缺失的酿酒酵母菌会生成较少的甘油并且具有较高的乙醇产量，其中该Δgpd1Δgpd2双缺失的酿酒酵母菌甚至不会生成甘油。惟，该Δgpd1Δgpd2双缺失的酿酒酵母菌在厌氧条件下无法完全地发酵醣类。

虽然已存在有上述文献报导，本技艺中仍然存在有一需要去发展出一能够耗用一包含有六碳糖(例如葡萄糖)以及五碳糖(例如木糖)的生物质并且具有高乙醇转化率以及低副产物生成率的重组型酵母菌细胞来供产业界所需。

发明内容

于是，在第一个方面，本发明提供一种用于生成重组型酵母菌细胞的方法，其包括：

提供亲代酵母菌细胞，其基因组DNA包括能够使该亲代酵母菌细胞通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的基因，其中该亲代酵母菌细胞的基因组DNA包括编码XR的基因、编码XDH的第一基因以及编码XK的基因，并且该等基因会被表达；以及

对该亲代酵母菌细胞进行基因修饰处理，该基因修饰处理包括删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因或者使该fps1基因失效、导入编码XDH的第二基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得XDH 能够过量生成，以及依序地删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd1基因以及gpd2基因或者依序地使该gpd1基因以及gpd2基因失效。

在第二个方面，本发明提供一种重组型酵母菌细胞，它是通过使用如上所述的方法而被生成。

在第三个方面，本发明提供一种从包含有六碳糖和/或五碳糖的生物质中来产生乙醇的方法，其包括以能够通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的重组型酵母菌细胞来对该生物质进行发酵，其中重组型酵母菌细胞是通过使用如上所述的方法而被生成。

附图说明

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可通过参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：

图1是本发明使用基因敲除技术(gene knock-out technology)来敲除一亲代酵母菌细胞中的目标基因的一流程示意图；

图2是重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX的一架构图；

图3是重组型载体yTA-GPD1-loxpKanMX的一架构图；

图4是重组型载体yTA-GPD2-loxpKanMX的一架构图；

图5是重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH的一架构图；以及

图6是重组型载体pFENC-Cre的一架构图。

具体实施方式

除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有熟悉本发明所属技艺的人士所共同了解的意义。一熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。为表清楚，下面的界定被使用于本文中。

如本文中所用的，术语“删除(delete)”意指删除一基因的全部或部分的编码区域。

如本文中所用的，术语“破坏(disrupt)”意指在一基因中进行核苷酸的删除、插入(insertion)或突变(mutation)。

如本文中所用的，术语“使失效(disable)”意指一基因或其所编码的蛋白质被去活化(inactive)，进而失去原有的活性或功能。

如本文中所用的，术语“过量生成(over-production)”与“过量表达(over-expression)”可被交替地使用，并且该术语被用来意指在一细胞中的一蛋白质或代谢物(metabolite)的一表达或生成位准超过该细胞的需求并且可能导致在该细胞中的累积与储存。

如本文中所用的，术语“亲代酵母菌细胞(parent yeast cell)”与“酵母菌母株(yeast mother strain)”可被交替地使用，并且意指一被使用来进行一或多个基因修饰处理的酵母菌细胞。适用于本发明的亲代酵母菌细胞可以是未转化的细胞(non-transformedcells)，或是已被至少一种其它重组型核酸序列转化的细胞(transformed cells)。

适用于本发明的亲代酵母菌细胞包括，但不限于，源自于下列的细胞：酵母菌属物种(Saccharomyces spp.)、毕赤酵母菌属物种(Pichia spp.)、假丝酵母菌属物种(Candidaspp.)以及管囊酵母属物种(Pachysolen spp.)。较佳地，该亲代酵母菌细胞是木糖-利用的酿酒酵母菌(xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae)、树干毕赤酵母菌(Pichiastipitis)、休哈塔假丝酵母菌(Candida shehatae)或嗜鞣管囊酵母菌(Pachysolentannophilus)。在本发明的一个较佳具体例中，该亲代酵母菌细胞是一木糖-利用的酿酒酵母菌。

如此处所用的，术语“木糖-利用的酿酒酵母菌”与“木糖-发酵的酿酒酵母菌(xylose-fermentation Saccharomyces cerevisiae)”可被交替地使用，其意欲涵盖具有木糖发酵能力的所有酿酒酵母菌菌株。

本发明提供一种用于生成一重组型酵母菌细胞的方法，其包括：

提供一亲代酵母菌细胞，其基因组DNA包括能够使该亲代酵母菌细胞通 过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的基因，其中该亲代酵母菌细胞的基因组DNA包括一编码XR的基因、一编码XDH的第一基因以及一编码XK的基因，并且该等基因会被表达；以及

对该亲代酵母菌细胞进行一基因修饰处理，该基因修饰处理包括删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因或者使该fps1基因失效、导入一编码XDH的第二基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得XDH能够过量生成，以及依序地删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd1基因以及gpd2基因或者依序地使该gpd1基因以及gpd2基因失效。

依据本发明，该基因修饰处理是依序地进行下列步骤：

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因或者使该fps1基因失效；

导入一编码XDH的第二基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得XDH能够过量生成；

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd1基因或者使该gpd1基因失效；以及

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd2基因或者使该gpd2基因失效。

依据本发明，当该亲代酵母菌细胞是一木糖-利用的酿酒酵母菌时，在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中，该编码XR的基因、该编码XDH的第一基因以及第二基因分别是外源性的，并且是衍生自下列任一种酵母菌的基因组DNA：树干毕赤酵母菌、休哈塔假丝酵母菌以及嗜鞣管囊酵母菌。在本发明的一个较佳具体例中，该编码XR的基因、该编码XDH的第一基因以及第二基因分别是衍生自树干毕赤酵母菌的基因组DNA。

依据本发明，该亲代酵母菌细胞的基因组DNA包括一编码甘油信道蛋白的fps1基因、一编码甘油-3-磷酸脱氢酶-1(GPD1)的gpd1基因以及一编码甘油-3-磷酸脱氢酶-2(GPD2)的gpd2基因。

在本发明的一个较佳具体例中，该亲代酵母菌细胞是一寄存编号为BCRC 920077或者DSM 25508的酿酒酵母菌。

在本发明的一个较佳具体例中，在进行该基因修饰处理的过程中，该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因的全长核酸序列、gpd1基因的至少80％的核酸序列以及gpd2基因的全长核酸序列分别是通过使用熟习此项技艺者所熟知且惯用的基因敲除技术(gene knock-out technology)而被删除。例如，同上述的Zhang A.et al.(2007)；HubmannG.et al.(2011)；US 2011/0275130 A1；以及US 2011/0250664 A1等。

依据本发明，可被该亲代酵母菌细胞消耗的六碳糖选自于下列所构成的群组：葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖以及它们的组合。依据本发明，可被该亲代酵母菌细胞消耗的五碳糖选自于下列所构成的群组：木糖、阿拉伯糖以及它们的组合。

在本发明的一个较佳具体例中，该亲代酵母菌细胞可以通过消耗葡萄糖以及木糖来生成乙醇。

本发明也提供一种重组型酵母菌细胞，它是通过使用一如上所述的方法而被生成。

在本发明的一个较佳具体例中，依据本发明的方法生成一寄存编号为BCRC920086(寄存于BCRC)或者DSM 28105(寄存于DSMZ)的重组型酵母菌细胞。

本发明也提供一种从一包含有六碳糖和/或五碳糖的生物质中来生成乙醇的方法，其包含以一能够通过消耗六碳糖以及五碳糖来生成乙醇的重组型酵母菌细胞来对该生物质进行发酵，其中该重组型酵母菌细胞是通过使用一如上所述的方法而被生成。

依据本发明，该生物质是一包含有六碳糖和/或五碳糖的混合糖液。在本发明的一个较佳具体例中，该生物质是一包含有葡萄糖以及木糖的混合糖液。

依据本发明，该生物质是一包含有六碳糖和/或五碳糖的植物性生物质。 较佳地，该生物质是一包含有葡萄糖以及木糖的植物纤维素水解液。在本发明的一个较佳具体例中，该生物质是一由稻秆的糖化所产生的稻秆纤维素水解液。

依据本发明，当使用本发明的重组型酵母菌细胞来对一含有葡萄糖以及木糖的混合糖液进行发酵时，可得到一至少约为0.75g/g的乙醇产量；较佳地，可得到一至少约为0.8g/g的乙醇产量；更佳地，可得到一约为0.833g/g的乙醇产量。

依据本发明，当使用本发明的重组型酵母菌细胞来对一稻秆纤维素水解液进行发酵时，可得到一至少约为0.9g/g的乙醇产量；较佳地，可得到一约为0.909g/g的乙醇产量。

本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

<实施例>

一般实验材料：

1.下面实施例中所使用的限制酶皆是购自于进阶生物科技股份有限公司(ThermoScientific FastDigest enzymes)。

2.下面实施例中被使用来进行聚合酶链反应的引物(primers)是委托明欣生物科技有限公司来代为合成。

3.下列实验材料购自于Yeastern Biotech：yT&A克隆载体套组(Cat.No.FYC001)以及UniversAll^TM组织萃取缓冲液(Cat.No.FYU002)，其中该yT&A克隆载体套组包含有一带有胺芐青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene)以及β-半乳糖酶(β-galactosidase)编码基因的yT&A克隆载体(2728bp)。

4.在下面的实施例中，所使用到的质粒分别如下所述：

(1)pUC19质粒(2686bp)带有胺芐青霉素抗性基因、β-半乳糖酶编码基因以及复制起点(origin of replication,ori)，并且购自于进阶生物科技股份有限公司(Cat.No.SD0061)。

(2)pFA6a-link-yEGFP-Kan质粒(4894bp)带有KanMX抗性基因(它的核苷 酸残基对应位置为962至2392)，并且购自于European Saccharomyces Cerevisiae Archive ForFunctional Analysis(下称EUROSCARF)。

(3)pFA6-hphMX6质粒(4157bp)带有潮霉素抗性基因(hygromycin resistancegene)(它的核苷酸残基位置对应为71至1720)，并且购自于EUROSCARF。

(4)pYD1质粒(5009bp)带有GALl启动子(GALl promotor)(它的核苷酸残基对应位置为1至451)，并且购自于Invitrogen(Cat.No.V835-01)。

(5)pSos质粒(11,259bp)带有2u ori片段(它的核苷酸残基对应位置为7901至8750)，并且购自于Agilent Technologies(Cat.No.217438)。

5.在下面的实施例中，所使用到的酵母菌分别如下所述：

(1)酿酒酵母菌BCRC 920077(寄存于BCRC，它另以寄存编号DSM 25508被寄存于DSMZ)。

(2)树干毕赤酵母菌BCRC 21775(购自BCRC)(对应于ATCC 58376)。

6.在下面的实施例中，用于高效能液相层析(high performance liquidchromatography，下称HPLC)分析的对照标准品皆是购自于Sigma，该等对照标准品包括：葡萄糖(1.25至24mg/mL)、木糖(1.25至24mg/mL)、木糖醇(0.25至6mg/mL)、甘油(0.375至8mg/mL)以及乙醇(0.93至20mg/mL)。

一般实验方法：

1.除非另有指明，在本发明中所采用的实验方法[包括DNA克隆(DNA cloning)]是使用本领域中熟悉此项技术人士所详知的技术或者依据制造商所提供的操作指引来进行。

2.在下面实施例中使用基因剔除技术来敲除一亲代酵母菌细胞中的目标基因，其流程示意图如图1所示，其中目标基因表示一所欲敲除的基因，上游以及下游分别表示该目标基因的上游片段以及下游片段，KanMX表示KanMX抗性基因，P1以及P2为用于扩增该目标基因的上游片段的引物对，P3以及P4为用于扩增该目标基因的下游片段的引物对，P5以及P6为用于扩增KanMX抗性基因的引物对(由此所扩增出的PCR产物为一含有KanMX抗性基 因的loxp-KanMX-loxp片段，其中loxp序列以黑色三角形来表示)，PCR表示聚合酶链反应，重迭PCR表示重迭聚合酶链反应，Cre表示Cre重组酶。

3.酵母菌培养物的制备：

在下面实施例中用于基因组DNA的萃取的酿酒酵母菌BCRC 920077的培养物、酿酒酵母菌转化株的培养物或树干毕赤酵母菌BCRC 21775的培养物是通过下列方式而被制备：将酵母菌菌株接种至一含有10mL YPD培养基[添加有1％的酵母菌萃取物(yeastextract)、2％的蛋白胨(peptone)以及2％的葡萄糖]的锥形瓶中，并在一恒温培养箱(30℃、150-200rpm)中进行培养历时24小时。

4.聚合酶链反应(PCR)：

在下面实施例中所使用的PCR或者重迭PCR(Overlap PCR)是通过使用KOD DNA聚合酶(KOD DNA polymerase)(台湾默克股份有限公司)并依照制造商所提供的操作指南来进行。

5.转化(transformation)：

在下面的实施例中，一所欲的DNA片段是通过使用电穿孔法(操作参数为：1,500V、25μF以及200Ω)而被转化至目标酵母菌中。接着，使用一含有适当抗生素浓度(300μg/mLG418或者500μg/mL Hygromycin)的YPD固态培养基进行筛选，借此而得到一经确认转化成功的酵母菌转化株。

6.目标基因敲除后的处理：

在下面实施例中，酿酒酵母菌在进行用于敲除目标基因的转化后需再经过孢子形成(Sporulation)处理，该处理方法被详述如下：将酿酒酵母菌转化株接种至10mL YPD液态培养基中并一恒温振荡培养箱(30℃、200rpm)内进行培养直到OD₆₀₀值达至1，继而离心收集菌株并以无菌水予以洗涤三次。接着，将所得到的菌株接种至50mL YPK培养基(含有20g/L的酵母菌萃取物、10g/L的蛋白胨以及10g/L的醋酸钾)中并于30℃以及200rpm下隔夜培养，继而离心收集菌株并以无菌水予以洗涤三次。接着，将由此所得到的菌株接种至50mL的孢子形成培养基(sporulation medium)[包含有10g/L的醋酸钾、1.0 g/L的酵母菌萃取物、0.5g/L的葡萄糖、0.05g/L的腺苷(adenosine)、0.05g/L的尿苷(uridine)、0.1g/L的色氨酸(tryptophan)、0.1g/L的亮氨酸(leucine)以及0.1g/L的组氨酸(histidine)]中并于30℃以及200rpm下进行培养历时6天，从而形成单倍体(haploid)的酿酒酵母菌转化株。

于完成上述孢子形成的处理后，取适量的菌液稀释并将其涂布于一含有300ug/mLG418的YPD固态培养基中进行培养，借此而获得一染色体套数被回复为双套(diploid)的酿酒酵母菌转化株。接着，通过使用PCR来确认酿酒酵母菌转化株中的目标基因已被敲除。

7.移除KanMX抗性基因：

有关移除KanMX抗性基因的方法被详述如下：将在下面实施例3当中所获得的重组型载体pFENC-Cre依据上面“一般实验方法”的第5项“转化”当中所述的方法而转化至一目标酵母菌转化株中，继而在一含有500ug/mL潮霉素(hygromycin)的YPD固态培养基下进行培养历时48小时，借此而得到一带有重组型载体pFENC-Cre的酵母菌转化株。接着，将所得到的酵母菌转化株接种至一半乳糖诱导液[含有20g/L的半乳糖、1.74g/L的酵母菌氮基(yeast nitrogen base)以及5g/L的硫酸铵]中并于30℃以及200rpm下进行培养历时48小时，继而取部分菌株于YPD固态培养基中进行培养历时24小时，而后挑选单一菌落并分别接种至一YPD固态培养基、一添加有300ug/mL G418的YPD固态培养基以及一添加有500ug/mL潮霉素的YPD固态培养基中进行培养历时24小时。最后，挑选仅可在YPD固态培养基中生长而无法在含有G418或潮霉素的YPD固态培养基中生长的菌株来供后续的实验使用。

8.HPLC分析：

在下面的实施例中，被拿来进行HPLC分析的待测样品中所含有的成分及其浓度(g/L)是通过使用一配备有一个折射率侦测器(refractive index detector,RIdetector)的HPLC仪器(DIONEX Ultimate 3000)来进行测定，其中所使用的管柱以及操作条件如下：分析管柱为Aminex HPX-87H管柱(BioRad)，温度设定为65℃；流动相：5mM硫酸(配于水中)；流速被控制为 0.6mL/分钟；样品注射体积为20μL；RI detector温度控制在45℃。

实施例1.重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX、yTA-GPD1-loxpKanMX以及yTA-GPD2-loxpKanMX的构筑

为了使用基因敲除技术来敲除(knock-out)酿酒酵母菌BCRC 920077(对应于DSM25508)的基因体内的目标基因(也就是说fps1基因、gpd1基因以及gpd2基因)，申请人于本实施例中分别构筑重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX、yTA-GPD1-loxpKanMX以及yTA-GPD2-loxpKanMX，而有关该等重组型载体的构筑过程被详细说明如下。

A、克隆目标基因的上游与下游片段：

首先，为了克隆出酿酒酵母菌BCRC 920077的fps1基因的上游片段(下称Fps1-F片段)与下游片段(下称Fps1-R片段)(分别对应于NCBI登录编号BK006945.2当中所示的核苷酸残基位置49513至49703处与52031至52180处)、gpd1基因的上游片段(下称Gpd1-F片段)与下游片段(下称Gpd1-R片段)(分别对应于NCBI登录编号BK006938.2当中所示的核苷酸残基位置411680至411900处与412863至413086处)以及gpd2基因的上游片段(下称Gpd2-F片段)与下游片段(下称Gpd2-R片段)(分别对应于NCBI登录编号BK006948.2当中所示的核苷酸残基位置216725至216880处与218513至218650处)，申请人分别设计出如下面表1中所示的6组引物对。

表1.被设计用于扩增目标基因的上游与下游片段的引物对

注：位于引物内的限制酶切割地址是如底线所标示者。

然后，取适量的酿酒酵母菌BCRC 920077的培养物并使用UniversAll^TM组织萃取缓冲液来进行基因组DNA的萃取。接着，以所得到的基因组DNA作为模版(template)，并且分别使用如上面表1所示的6组引物对并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行PCR，借此而分别扩增出带有该等DNA片段的PCR产物。

B、克隆Loxp-KanMX-Loxp片段：

有关Loxp-KanMX-Loxp片段的制备大体上是参照Brian Sauer(1987),Mol.Cell.Biol.,7:2087-2096当中所述的方法来进行。简单地说，以pFA6a-link-yEGFP-Kan载体作为模板，并且使用1组针对该载体中所含的KanMX抗性基因所设计出的具有如下所示的核苷酸序列的引物对(其中底线表示限制酶切割地址，斜体字表示loxp序列)并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行PCR，借此而扩增出一带有Loxp-KanMX-Loxp片段的PCR产物(1544bp)。

前向引物loxpKanMX-NdeI-F

5’-catatgcatatg

ttcga

I

gaactgctctgtttagcttgcctcg-3’(序列辨识编号：13)

反向引物loxpKanMX-SacI-R

5’-gagttcgagctc

gtttt

I

cgacactggatggcggcgttagtat-3’(序列辨识编号：14)

C、制备接合片段：

在上面第A以及B项中所得到的Fps1-F片段、Loxp-KanMX-Loxp片段以及Fps1-R片段是通过使用重迭PCR技术而被制备成一dF接合片段(下称dF片段)。简单地说，以一包含有Fps1-F片段、Loxp-KanMX-Loxp片段以及Fps1-R片段的混合物(它们的比例为2：1：2)作为模板，并且使用前向引物FPS1-F-BglII-F(序列辨识编号：1)以及反向引物FPS1-R-SalI-R(序列辨识编号：4)并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法 来进行PCR，借此而扩增出一大小约为1896bp且依序包含上述三种片段的的dF片段。

另外，dG1接合片段(下称dG1片段)(2001bp)以及dG2接合片段(下称dG2片段)(1850bp)大体上是参照dF片段来进行制备，不同处在于：在制备dG1片段时，以一包含有Gpd1-F片段、Loxp-KanMX-Loxp片段以及Gpd1-R片段的混合物作为模板，并使用前向引物GPD1-F-XhoI-F(序列辨识编号：5)以及反向引物GPD1-R-SalI-R(序列辨识编号：8)来进行PCR；而在制备dG2片段时，以一包含有Gpd2-F片段、Loxp-KanMX-Loxp片段以及Gpd2-R片段的混合物作为模板，并使用前向引物GPD2-F-BglII-F(序列辨识编号：9)以及反向引物GPD2-R-SalI-R(序列辨识编号：12)来进行PCR。

D、重组型载体的构筑：

将在上面第C项中所得到的dF片段、dG1片段以及dG2片段分别通过使用适当的限制酶(例如BglII/SalI或XhoI/SalI)而克隆至一yT&A克隆载体(2728bp)中，借此而分别得到重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX(4614bp，其架构如图2所示)、yTA-GPD1-loxpKanMX(4719bp，其架构如图3所示)以及yTA-GPD2-loxpKanMX(4568bp，其架构如图4所示)。

实施例2.带有树干毕赤酵母菌的xdh基因的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH的构筑

本实施例构筑一带有Delta序列(Delta sequence)、Loxp-KanMX-Loxp片段、ENO1启动子(ENO1promoter)、树干毕赤酵母菌的xdh基因(下称psXDH基因)以及ENO1终止子(ENO1terminator)的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH，从而用于转化酿酒酵母菌BCRC 920077以及过量表达psXDH基因，而其构筑过程被详细说明如下。

A、分别克隆psXDH基因、Delta序列、ENO1启动子以及ENO1终止子：

首先，为了克隆树干毕赤酵母菌BCRC 21775(对应于ATCC 58376)中的psXDH基因(对应于NCBI登录编号XM_001386945.1当中所示的核苷酸残基 位置51至1142处)，以及酿酒酵母菌BCRC 920077的逆转录转位子(retrotransposons)中的Delta序列(对应于NCBI登录编号BK006947.3当中所示的核苷酸残基位置96941至96614处)、ENO1启动子(对应于NCBI登录编号BK006941.2当中所示的核苷酸残基位置1000330至1000926处)与ENO1终止子(对应于NCBI登录编号BK006941.2当中所示的核苷酸残基位置1002241至1002725处)，申请人分别设计出如下面表2中所示的5组引物对。特别地，引物对Delta-BglII-F/Delta-NdeI-R以及Delta-BamHI-F/Delta-SalI-R皆是针对Delta序列而被设计者，这2组引物对的差异处在于：具有不同的限制酶切割地址。

表2.被设计用于扩增psXDH基因、Delta序列、ENO1启动子以及ENO1终止子的引物对

注：位于引物内的限制酶切割地址是如底线所标示者。

然后，以酿酒酵母菌BCRC 920077或树干毕赤酵母菌BCRC 21775的基因组DNA作为模板，分别使用上述的5组引物对并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行PCR，借此而扩增出一带有psXDH基因的PCR产物(1118bp，下称PCR产物A1)、一带有Delta序列以及BglII/NdeI切割地址的PCR产物(352bp，下称PCR产物A2)、一带有Delta序列以及BamHI/SalI切割地址的PCR产物(352bp，下称PCR产物A3)、一带有ENO1启动子的PCR产物(621bp，下称PCR产物A4)以及一带有ENO1终止子的PCR产物(517bp，下称PCR产物A5)。

B、重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH的构筑：

将在上面第A项中所得到的PCR产物A1至A5以及在上面实施例1的第B项中所得到的Loxp-KanMX-Loxp片段分别通过使用对应的限制酶(包括BglII、NdeI、SacI、AvrII、NotI、BamHI以及SalI)而并入至同一个pUC19载体(2686bp)中，借此而得到一重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH(6676bp，其架构如图5所示)。

实施例3.带有Cre重组酶基因的重组型载体pFENC-Cre的构筑

于本实施例中，有关一带有Cre重组酶基因的重组型载体pFENC-Cre的构筑大体上是参照Ulrich Güldener et al.(1996),Nucleic Acids Research,24:2519–2524当中所述的方法来进行。

A、最适化Cre重组酶基因的基因合成(gene synthesis)：

为了得到一可在酿酒酵母菌中表达的最适化Cre重组酶基因，申请人将肠杆菌噬菌体P1(Enterobacteria phage P1)中的Cre重组酶基因(NCBI登录编号：YP_006472.1)作碱基的最适化调整，借此而得到一如序列辨识编号：25所示的最适化Cre重组酶基因的核苷酸序列(1058bp)。然后，通过DNAWorks网站的分析而得到46种用于合成该最适化Cre重组酶基因的引物(它们分别如序列辨识编号：26至71所示)。

该最适化Cre重组酶基因的基因合成是通过依序地进行下面所述的2次PCR而被完成。首先，以一包含有序列辨识编号：26至71所示引物的混合溶 液(其中各单一引物的浓度为2μM)作为模版，并且依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行第1次PCR，借此而得到第1次PCR的产物。接着，以该第1次PCR的产物作为模板，通过使用序列辨识编号分别为26以及71的引物对并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行第2次PCR。于完成第2次PCR后，使用1％琼脂糖凝胶电泳来确认否有得到一大小约为1058bp的PCR产物B1(也就是说该最适化Cre重组酶基因)。

B、分别克隆潮霉素抗性基因、GALl启动子、KanMX片段以及2u ori片段：

首先，使用pFA6-hphMX6质粒、pYD1质粒、pFA6a-link-yEGFP-Kan载体或者pSos质粒作为模版，并且分别使用如下面表3所示的4组引物对并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行PCR，借此而分别扩增出一带有潮霉素抗性基因的PCR产物(1674bp，下称PCR产物B2)、一带有GALl启动子的PCR产物(475bp，下称PCR产物B3)、一带有KanMX片段的PCR产物(1476bp，下称PCR产物B4)以及一带有2u ori片段的PCR产物(874bp，下称PCR产物B5)。

表3.被设计用于扩增潮霉素抗性基因、GALl启动子、KanMX片段以及2u ori片段的引物对

注：位于引物内的限制酶切割地址是如底线所标示者。

C、重组型载体pFENC-Cre的构筑：

将在上面第A与B项中所得到的PCR产物B1至B5以及在上面实施例2的第A项中所得到的PCR产物A5分别通过使用相对应的限制酶(包括：BglII、NdeI、SacI、AvrII、NotI、BamHI以及SalI)而并入至同一个pUC19载体(2686bp)中，借此而得到一重组型载体pFENC-Cre(8246bp，其架构如图6所示)。

实施例4.酿酒酵母菌转化株的制备

为了了解不同的基因修饰(gene modification)对于酿酒酵母菌BCRC 920077的生长以及乙醇产量上的影响，申请人分别使用dF片段(来自于重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX)、dG1片段(来自于重组型载体yTA-GPD1-loxpKanMX)、dG2片段(来自于重组型载体yTA-GPD2-loxpKanMX)、重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH以及重组型载体pFENC-Cre来转化酿酒酵母菌BCRC 920077。

实验方法：

A、使用dF片段、dG1片段、dG2片段或重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH来转化酿酒酵母菌BCRC 920077：

首先，以在上面实施例1中所得到的重组型载体yTA-FPS-loxpKanMX、yTA-GPD1-loxpKanMX或者yTA-GPD2-loxpKanMX作为模板，并分别使用如上面表1所示的引物对FPS1-F-BglII-F/FPS1-R-SalI-R(序列辨识编号：1以及4)、GPD1-F-XhoI-F/GPD1-R-SalI-R(序列辨识编号：5以及8)以及GPD2-F-BglII-F/GPD2-R-SalI-R(序列辨识编号：9以及12)并依据上面“一般实验方法”的第4项“聚合酶链反应”当中所述的方法来进行PCR，借此而分别得到dF片段、dG1片段以及dG2片段。另外，以限制酶XhoI来切割在上面实施例2中所得到的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH，借此而得到一线形化(linearized)的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH。

接着，将待进行转化的酿酒酵母菌BCRC 920077分成10组(也就是说实验组1至10)，继而将上面所得到的DNA片段(包括：dF片段、dG1片段、dG2片段以及该线形化的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH)分别依据上面“一般实验方法”的第5项“转化”当中所述的方法并参照下面表4所示的转化顺序而依序地转化至各组的酿酒酵母菌中，借此而使得各组所得到的酿酒酵母菌转化株分别带有不同的DNA片段。在制备各组的酿酒酵母菌转化株的过程中，于每一次转化dF片段、dG1片段或dG2片段后，需再依据“一般实验方法”的第6项“目标基因敲除后的处理”当中所述的方法来进行处理；而于每一次转化该线形化的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH后，需再通过使用PCR来确认其已被并入基因组DNA中；此外，在进行转化后(无论为了敲除目标基因或过量表达XDH)，各个酿酒酵母菌转化株是依据“一般实验方法”的第7项“移除KanMX抗性基因”当中所述的方法来移除KanMX抗性基因。另外，各组的酿酒酵母菌转化株依据DNA片段的转化顺序而给予对应的转化株名称。

表4.各组的酿酒酵母菌转化株所含有的DNA片段以及它们的转化顺序

于完成所有的转化步骤后，各组的酿酒酵母菌转化株分别被接种至一YPD固态培养基中并于一恒温培养箱(30℃、200rpm)进行培养历时3至5天，继而分别观察它们的生长情形。

结果：

有关各组的酿酒酵母菌转化株的生长情形分别被显示于下面的表5中。

表5.各组的酿酒酵母菌转化株的生长情形

组别	转化株名称	生长情形
			实验组1	5dF	可生长
实验组2	5dFdG2	可生长
			实验组3	5dFdG2XDH	可生长
实验组4	5dFdG2dG1	完全无生长
			实验组5	5dFdG2XDHdG1	完全无生长
实验组6	5dFXDH	可生长
			实验组7	5dFXDHdG1	可生长
实验组8	5dFXDHdG2	可生长
			实验组9	5dFXDHdG1dG2	可生长
实验组10	5dFXDHdG2dG1	完全无生长

由表5可见，实验组1至3以及6至9的酿酒酵母菌转化株(也就是说酿酒酵母菌转化株5dF、5dFdG2、5dFdG2XDH、5dFXDH、5dFXDHdG1、5dFXDHdG2以及5dFXDHdG1dG2)可以维持良好的生长情形，而实验组4、5以及10的酿酒酵母菌转化株(也就是说酿酒酵母菌转化株5dFdG2dG1、5dFdG2XDHdG1以及5dFXDHdG2dG1)则完全无法生长。由此显见，不论删除fps1基因以及并入该线形化的重组型载体puc-d-loxpKanMX-ENO1-psXDH的顺序为何，只要先敲除gpd2基因，而后再敲除gpd1基因，都会致使酿酒酵母菌转化株无法存活。申请人据此而推论：gpd1基因以及gpd2基因的敲除顺序对于酿酒酵母菌转化株的生长会有重大的影响。

实施例5.各种不同的酿酒酵母菌转化株在生成木糖醇、甘油以及乙醇的产 量(yield)上的比较

为了寻找不会产生大量非所欲的副产物(也就是说木糖醇以及甘油)并且可有效提升乙醇产量的酿酒酵母菌转化株，申请人将在上面实施例4中可生长的实验组1至3以及6至9的酿酒酵母菌转化株拿来进行下面的实验。

A、制备酿酒酵母菌的接种源(inoculum)：

首先，将酿酒酵母菌BCRC 920077以及在上面实施例4当中所得到的实验组1至3以及6至9的酿酒酵母菌转化株的单一菌落(colony)分别接种至一含有10mL YPD60培养基(添加有1％酵母菌萃取物、2％蛋白胨以及6％葡萄糖)的50mL试管中，并在30℃以及150-200rpm下进行培养历时24小时。然后，取4mL的菌液接种至一含有100mL种子培养基(seedmedium)[含有6％(w/v)玉米浸液(corn steep liquor)以及3％(w/v)蔗糖蜜(canemolasses)]的500mL有沟锥形瓶(baffled flask)中，继而在30℃以及150-200rpm下进行培养历时16至20小时。然后，于5000g下进行离心历时10分钟，移除上清液，所得到的菌体被使用作为下面第B项实验中的酿酒酵母菌的接种源。

B、酿酒酵母菌转化株5dF、5dFdG2、5dFdG2XDH、5dFXDH、5dFXDHdG1、5dFXDHdG2以及5dFXDHdG1dG2在生成木糖醇、甘油以及乙醇的产量上的比较：

在本实施例中，在上面第A项中所得到的实验组1至3以及6至9的酿酒酵母菌转化株的接种源被拿来进行下面的实验。另外，酿酒酵母菌BCRC920077的接种源被使用作为对照组。首先，对各组接种源分别各取适量并分别接种至一含有100mL混合糖液[含有7％(w/v)葡萄糖、4％(w/v)木糖以及0.1％(w/v)尿素(urea)]的500mL锥形瓶中，接着以6N的NaOH将各组混合物的pH值调整至5.0。然后，依据上面“一般实验方法”的第8项“HPLC分析”当中所述的方法来对各组的混合物进行HPLC分析，而得到各组混合物中的葡萄糖以及木糖的含量(g/L)。接着，于一厌氧条件下以及在一恒温培养箱(30℃、200rpm)中对各组的混合物进行发酵培养历时72小时。

然后，所得到的各组的发酵培养物(fermented culture)通过离心来收集上 清液，继而依据上面“一般实验方法”的第8项“HPLC分析”当中所述的方法来进行HPLC分析，而得到各组发酵培养物中的木糖醇、甘油以及乙醇的含量(g/L)。

有关各组发酵培养物的木糖醇产量(g/g)是通过将发酵后所测得的木糖醇含量以及发酵前所测得的木糖含量代入下列公式(I)而被计算出：

A＝B/C (I)

其中：A＝木糖醇产量(g/g)

B＝发酵后所测得的木糖醇含量(g/L)

C＝发酵前所测得的木糖含量(g/L)

有关各组发酵培养物的甘油产量(g/g)是通过将发酵后所测得的甘油含量以及发酵前所测得的葡萄糖与木糖的含量代入下列公式(II)而被计算出：

D＝E/(F+G) (II)

其中：D＝甘油产量(g/g)

E＝发酵后所测得的甘油含量(g/L)

F＝发酵前所测得的葡萄糖的含量(g/L)

G＝发酵前所测得的木糖的含量(g/L)

有关各组发酵培养物的乙醇产量(g/g)是通过将发酵后所测得的乙醇含量以及发酵前所测得的葡萄糖与木糖的含量代入下列公式(III)而被计算出：

H＝I/(J×0.51+K×0.48) (III)

其中：H＝乙醇产量(g/g)

I＝发酵后所测得的乙醇含量(g/L)

J＝发酵前所测得的葡萄糖的含量(g/L)

K＝发酵前所测得的木糖的含量(g/L)

(注：葡萄糖的理论乙醇转化率为0.51g乙醇/g葡萄糖，而木糖的理论乙醇转化率为0.48g乙醇/g木糖。)

表6显示各组的混合物在进行发酵前所测得的葡萄糖与木糖的含量(g/L)以及在经过发酵后所获得的发酵培养物中被测得的木糖醇、甘油以及乙醇的 含量(g/L)，而表7显示各组的发酵培养物中所测得的木糖醇产量、甘油产量以及乙醇产量(g/g)。

表6.各组的混合物在进行发酵前所测得的葡萄糖与木糖的含量以及在经过发酵后所获得的发酵培养物中被测得的木糖醇、甘油以及乙醇的含量

表7.各组的发酵培养物中所测得的木糖醇产量、甘油产量以及乙醇产量

从表7可见，就木糖醇产量而言，与对照组相较下，实验组1至3以及 6至9的发酵培养物中所测得的木糖醇产量皆有显著的降低，其中实验组6的发酵培养物中所测得的木糖醇产量是最低的。就甘油产量而言，与对照组相较下，实验组1至3以及6至9的发酵培养物中所测得的甘油产量皆有显著的降低，其中实验组9的发酵培养物中所测得的甘油产量是最低的。就乙醇产量而言，与对照组相较下，实验组1至3以及6至9的发酵培养物中所测得的乙醇产量皆有显著的增加，其中实验组9的发酵培养物中所测得的乙醇产量是最高的。

这个实验结果显示，实验组1至3以及6至9的酿酒酵母菌转化株皆可以增加乙醇产量以及降低非所欲的副产物(也就是说木糖醇与甘油)的产量。特别地，实验组9的酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2具有一最为优异的乙醇产量，并且可显著地降低甘油的产量。由此可见，依序地敲除酿酒酵母菌中的fps1基因、过量生成psXDH基因、敲除gpd1基因以及敲除gpd2基因，会使得酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2在发酵的过程中可有效地减少生成木糖醇与甘油，并且增加乙醇的生成。

C、不同的酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2的分离株在生成木糖醇、甘油以及乙醇的产量上的比较：

首先，从上面实施例4当中所得到的实验组9的酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2中挑选出5个单一菌落(它们分别被命名为5dFXDHdG1dG2-1、5dFXDHdG1dG2-2、5dFXDHdG1dG2-3、5dFXDHdG1dG2-4以及5dFXDHdG1dG2-5)并分别参照上面第A项当中所述方法来制备成酿酒酵母菌转化株的接种源，由此所得到的5种分离株的接种源即为实验组9-1至9-5。另外，酿酒酵母菌BCRC 920077的接种源被使用作为对照组。

接着，各组接种源是参照上面第B项当中所述方法来进行发酵培养以及测定各组发酵培养物中的木糖醇、甘油以及乙醇的产量。所得到的结果被显示于下面表8中。

表8.各组发酵培养物中所测得的木糖醇产量、甘油产量以及乙醇产量

从表8可见，就木糖醇产量而言，与对照组相较下，实验组9-1至9-5的发酵培养物中所测得的木糖醇产量皆有显著的降低。就甘油产量而言，与对照组相较下，实验组9-1至9-5的发酵培养物中所测得的甘油产量皆有显著的降低。就乙醇产量而言，与对照组相较下，实验组9-1至9-5的发酵培养物中所测得的乙醇产量皆有显著的升高。

这个实验结果显示，本发明的酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2的不同分离株皆能够有效地降低非所欲的副产物(也就是说甘油以及木糖醇)的生成并且可有效地增加乙醇的产量。

依据上述实验结果，申请人挑选酿酒酵母菌转化株5dFXDHdG1dG2-5来作为寄存菌株，并将其命名为“酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Sc 206dG2”。本发明的酿酒酵母菌Sc 206dG2已于公元2013年11月12日以寄存编号BCRC 920086被寄存于财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(FIRDI的BCRC)(300新竹市食品路331号，台湾)，并且已于公元2013年11月28日以寄存编号DSM 28105被寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

实施例6.使用一经稀酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液作为基质对于本发明的酿酒酵母菌转化株BCRC 920086(对应于DSM 28105)在发酵生成木糖醇、甘油以及乙醇上的影响

于本实施例中，申请人使用一依据Keikhosro Karimi et al.(2006),Biomassand Bioenergy,30:247–253当中所述的方法而制备出的经稀酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液来作为基质，并探讨本发明的酿酒酵母菌转化株BCRC 920086利用该基质来发酵生成木醣醇、甘油以及乙醇的情形。

实验方法：

首先，使用酿酒酵母菌转化株BCRC 920086的接种源作为实验组，以及使用酿酒酵母菌BCRC 920077的接种源作为对照组。然后，各组大体上是依照上面实施例5的第B项当中所述的方法来进行厌氧发酵培养以及测定各组发酵培养物中的木糖醇、甘油以及乙醇的产量，不同的地方在于：以一经稀酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液(100mL)[水解液组成含有7％(w/v)葡萄糖、4％(w/v)木糖以及额外添加的0.1％(w/v)尿素]来取代100mL的混合糖液，以及以6N的NaOH将各组混合物的pH值调整至5.2。

结果：

本实验所测得的结果被显示于下面表9中。

表9.各组发酵培养物中所测得的木糖醇产量、甘油产量以及乙醇产量

从表9实验结果显示，在使用该经稀酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液作为基质下，本发明的酿酒酵母菌转化株BCRC 920086能够有效地降低木糖醇与甘油的产量，以及提高乙醇的产量。由此结果显示，本发明的酿酒 酵母菌转化株BCRC 920086不论使用混合糖液来进行发酵，或使用一包含有可发酵糖的纤维素水解液(例如稻杆纤维素水解液)来进行发酵时，均可具有一优异的乙醇产量并且有效地减少非所欲的副产物(也就是说木糖醇与甘油)的产量。

于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，以本案详细说明(包含界定在内)为准。

虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

本申请中，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)DSM 25508于2011年12月20日被保藏于地址位于银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克的德国微生物菌种保藏中心GmbH。

重组型酵母菌DSM 28105于2013年11月28日被保藏于地址位于银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克的德国微生物菌种保藏中心GmbH。

Claims (7)

1.一种用于生成重组型酵母菌细胞的方法，其特征在于，该方法包括：

提供亲代酵母菌细胞，其基因组DNA包括能够使该亲代酵母菌细胞通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的基因，其中该亲代酵母菌细胞的基因组DNA包括编码木糖还原酶的基因、编码木糖醇脱氢酶的第一基因以及编码木酮糖激酶的基因，并且所述基因会被表达；该亲代酵母菌细胞是寄存编号为DSM 25508的酿酒酵母菌，以及

对该亲代酵母菌细胞进行基因修饰处理，该基因修饰处理包括删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因或者使该fps1基因失效、导入编码木糖醇脱氢酶的第二基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得木糖醇脱氢酶能够过量生成，以及依序地删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd1基因以及gpd2基因或者依序地使该gpd1基因以及gpd2基因失效。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因修饰处理是依序地进行下列步骤：

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的fps1基因或者使该fps1基因失效；

导入编码木糖醇脱氢酶的第二基因至该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中以使得木糖醇脱氢酶能够过量生成；

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd1基因或者使该gpd1基因失效；以及

删除或破坏在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中的gpd2基因或者使该gpd2基因失效。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在该亲代酵母菌细胞的基因组DNA中，该编码木糖还原酶的基因以及该编码木糖醇脱氢酶的第一基因是外源性的，并且是衍生自树干毕赤酵母菌的基因组DNA。

4.一种重组型酵母菌细胞，它是通过使用根据权利要求1至3中任一项所述的方法而被生成。

5.根据权利要求4所述的重组型酵母菌细胞，其特征在于，它以寄存编号DSM 28105被寄存于德国微生物菌种保藏中心。

6.一种从包含有六碳糖和/或五碳糖的生物质中来产生乙醇的方法，其包含以能够通过消耗六碳糖以及五碳糖来产生乙醇的重组型酵母菌细胞来对该生物质进行发酵，其中该重组型酵母菌细胞是通过使用根据权利要求1至3中任一项所述的方法而被生成。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该生物质是稻秆纤维素水解液。

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