KR20160113129A - 재조합 미생물 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락테이트 생합성 경로 효소에 손상 돌연변이를 포함하는 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리움 및 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재 하에 박테리움을 배양함으로써 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 락테이트 생합성 경로 효소는 락테이트 탈수소효소(LDH) 또는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 또 다른 효소이며, 여기서 상기 손상 돌연변이는 박테리움이 감소된 양의 락테이트를 생산하거나 락테이트를 생산하지 않도록 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거한다.

Description

재조합 미생물 및 이들의 사용 방법{RECOMBINANT MICROORGANISMS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 교차참조

본원은 2014 년 1 월 30 일에 출원된 미국 특허 가출원 61/933,815 및 2014 년 2 월 25 일에 출원된 미국 특허 가출원 61/944,541의 이점을 청구하며, 그 전문은 본원에 참고로 편입된다.

서열목록

본원에는 이와 동반 제출되고 하기와 같이 2015 년 1 월 29 일에 생성된 "LT102WO1_ST25.txt"로 명명된 23,322 바이트의 ASCII(텍스트) 파일로 확인된 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록이 포함되며, 그 전문은 본원에 참고로 편입된다.

아세트산생성체는 혐기성 호흡 생성물로서 아세테이트를 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 아세트산생성체는 에너지 보존을 위한 그리고 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA-유도된 생성물, 예컨대 아세테이트 및 에탄올의 합성을 위한 주요 기전으로서 우드-융달(Wood-Ljungdahl) 경로를 이용하는 절대 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008).

많은 아세트산생성체는 적어도 2 개 이상의 생성물을 천연 생산한다. 그러나 다중 생성물의 생산은 각각의 개별 생성물의 효율 및 수율에 해로우므로, 이것이 반드시 상업적 규모에서 바람직한 것은 아니다. 특히, 부산물은 탄소를 표적 생성물의 생합성 경로로부터 벗어나게 전용하고, 독성 우려를 도입하고, 표적 생성물의 회수 및 분리를 방해하고, 표적 생성물을 선호하는 발효 조건의 제어를 복잡하게 만들고, 오염 미생물에 대한 기질로서 작용할 수 있다.

예를 들면, 아세트산생성체, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 클로스트리듐 라그스달레이(Koepke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011), 및 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Heiskanen, Enzyme Microb Technol, 41 362-367, 2007)은 부산물로 락테이트를 생산할 수 있다. 상기 락테이트 생산은 표적 생성물, 예컨대 에탄올, 부탄올, 또는 2,3-부탄디올의 효율 및 수율을 감소시킨다. 추가로, 락테이트는 아세트산생성체, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게눔에 대해 저농도에서도 독성일 수 있고(Koepke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011) 다른 박테리아에 대한 기질로서 작용할 수 있어서 락테이트가 생산되면 박테리아 오염 가능성을 높인다. 더욱이, 다른 생성물, 예컨대 에탄올로부터 락테이트의 분리는 다루기 힘든 처리 단계를 필요로 할 수 있다.

따라서, 부산물, 예컨대 락테이트의 생산을 감소시키거나 제거하는 미생물 및 방법에 대한 강력한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 락테이트 생합성 경로 효소에 손상 돌연변이를 포함하는 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리움을 제공한다. 일 구현예에서, 손상 돌연변이는 락테이트 생합성 경로 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거한다.

손상 돌연변이는 박테리아가 락테이트를 생산하는 능력에 영향을 미친다. 일 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움에 비해 감소된 양의 락테이트를 생산한다. 일 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 실질적으로 락테이트를 생산하지 않는다.

본 발명의 박테리움은 생성물, 예컨대 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움에 비해 증가된 양의 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 생산한다.

일 구현예에서, 락테이트 생합성 경로 효소는 피루베이트를 락테이트로 자연 전환하는 효소이다. 바람직한 구현예에서, 락테이트 생합성 경로 효소는 락테이트 탈수소효소(LDH)이다.

본 발명의 박테리움은 친계 박테리움, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게 눔, 클로스트리듐 융달리, 및 클로스트리듐 라그스달레이에서 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 친계 박테리움은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔이다.

본 발명은 CO를 포함하는 기질의 존재 하에 본 발명의 박테리움을 배양함으로써 박테리움이 생성물을 생산하는 단계를 포함하는 생성물의 생산 방법을 추가로 제공한다.

도 1은 LDH 녹아웃 전략 및 스크리닝을 위해 사용된 프라이머를 나타내는 도식이다.
도 2는 겔 이미지 세트이다. 제1 겔 이미지는 야생형(w) 및 트랜스콘주게이트 클론 6(6)에서 5' 교차를 위한 프라이머 Og24r/Og35f 및 3' 교차를 위한 Og21f/Og36r을 사용하는 녹아웃 플라스미드의 단일 교차 통합용 스크리닝을 나타낸다. 제2 겔 이미지는 외부 측접 프라이머 Og35f/Og36r 및 Og21f/Og24r을 사용한 이중 교차를 위한 스크리닝을 나타낸다.
도 3은 프라이머 LdhAF/R을 사용한 유전자 식별번호: 126803 표적 129S에 대한 콜로니 PCR을 나타내는 겔 이미지이다. 100 bp의 PCR 생성물은 야생형 유전형을 시사한 반면, 대략 1.9 kb의 생성물 크기는 표적 부위 내 그룹 II 인트론의 삽입을 확인시켰다.
도 4는 프라이머 CatPR/RepHF를 사용한 플라스미드 손실을 나타내는 겔 이미지이다. 플라스미드 손실은 내성 마커(catP) 및 그람 양성 복제 기점(pCB102)의 증폭에 의해 확인되었다.
도 5a는 기질로서 30 psi 제강소 배기가스(44% CO, 22% CO₂, 2% H₂, 32% N₂)를 갖는 혈청 병에서 6 일 성장 후 C. 오토에타노게눔의 HPLC 분석을 나타내는 그래프이다. 도 5b는 기질로서 30 psi 제강소 배기가스(44% CO, 22% CO₂, 2% H₂, 32% N₂)를 갖는 혈청 병에서 6 일 성장 후 불활성화된 락테이트 탈수소효소를 갖는 C. 오토에타노게눔의 HPLC 분석을 나타내는 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 아세트산생성 박테리움에서 락테이트 생합성 경로의 손상이 친계 미생물에 비해 생성물, 예컨대 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 석시네이트, 2-옥소글루테레이트, 발린, 류신, 및 이소류신의 증가되거나 더 효율적인 생산을 일으키며, 또한 석시네이트, 2-옥소글루테레이트, 발린, 류신, 및 이소류신의 전구체인 피루베이트, 말레이트, 푸마레이트, 및 시트레이트의 증가되거나 더 효율적인 생산을 일으킬 수 있음을 발견하였다. 발린, 류신, 포르메이트, 및 피루베이트의 생산은 또한 이들 화합물로 배양 배지를 보충할 필요성을 배제하며, 이는 추가적인 비용 절감을 일으킬 수 있다. 더욱이, 박테리움에 의한 락테이트 생산의 감소 또는 제거는 박테리움 상에서 락테이트의 독성 효과를 감소시키거나 제거한다.

본 발명은 락테이트 생합성 경로 효소에 손상 돌연변이를 포함하는 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리움을 제공한다.

"돌연변이"는 본 발명의 박테리움이 유도된 야생형 또는 친계 미생물에 비해 본 발명의 박테리움에서 핵산 또는 단백질의 변형을 나타낸다. 용어 "유전자 변형"은 용어 "돌연변이"를 내포한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 또는 치환일 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 돌연변이는 효소에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 또는 치환일 수 있다.

전형적으로, 돌연변이는 락테이트 생합성 경로 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거하는(즉, "손상시키는") "손상 돌연변이"이다. 손상 돌연변이는 락테이트 생합성 경로 효소 또는 효소를 암호화하는 유전자를 부분적으로 불활성화하거나, 완전히 불활성화하거나, 또는 결실시킬 수 있다. 손상 돌연변이는 녹아웃(KO) 돌연변이일 수 있다. 손상 돌연변이는 락테이트의 생합성을 감소시키거나, 방지하거나, 차단하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 손상 돌연변이에는, 예를 들면 락테이트 생합성 경로 효소를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이, 락테이트 생합성 경로 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여된 유전적 조절 요소에서의 돌연변이, 락테이트 생합성 경로 효소 활성을 감소시키거나 저해하는 단백질을 생산하는 핵산의 도입, 또는 락테이트 생합성 경로 효소 발현을 저해하는 핵산(예를 들면, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입이 포함될 수 있다.

손상 돌연변이는 박테리움이 유도된 친계 박테리움에 비해 락테이트를 생산하지 않거나 락테이트를 실질적으로 생산하지 않거나 감소된 양의 락테이트를 생산하는 본 발명의 박테리움을 생성한다. 예를 들면, 본 발명의 박테리움은 락테이트를 생산하지 않거나 친계 박테리움에 비해 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 더 적은 락테이트를 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 박테리움은 약 0.001, 0.01, 0.10, 0.30, 0.50, 또는 1.0 g/L 미만의 락테이트를 생산할 수 있다. 그에 반해서 발효 조건에 따라, 변형되지 않은 C. 오토에타노게눔 LZ1561은 최대 약 2 g/L의 락테이트를 생산할 수 있다. 다른 변형되지 않은 박테리움 균주는 더 많은 락테이트를 생산할 수도 있다.

손상 돌연변이는 당해분야에 공지된 임의의 방법을 이용해서 도입될 수 있다. 예시적인 방법에는 이종성 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 엔지니어링, 유도된 진화, 지식-기반 설계, 랜덤 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화가 포함된다. 그와 같은 방법은, 예를 들면 [Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611-617, 2011; 및 Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010]에 기재된다. 손상 돌연변이는 적절한 바에 따라 핵산, 예컨대 단일가닥 또는 이중-가닥 DNA, RNA, cDNA, 또는 이들의 조합을 사용해서 도입될 수 있다. 핵산은 작제물 또는 벡터로 불릴 수 있고, 조절 요소, 복제 기점, 다중클로닝 부위, 및/또는 선별 마커 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산은 친계 박테리움에서 락테이트 생합성 경로 효소를 암호화하는 유전자를 손상시키도록 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산은 핵산에 의해 암호화된 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 채택될 수 있다. 작제물 또는 벡터에는 플라스미드(예를 들면, pMTL, pIMP, pJIR), 바이러스(박테리오파아지 포함), 코스미드, 및 인공 염색체가 포함될 수 있다. 작제물은 친계 박테리움의 형질전환 시 염색체외로 유지될 수 있거나 박테리움의 게놈 내로의 통합을 위해 채택될 수 있다. 따라서, 작제물에는 염색체외 작제물의 통합(예를 들면, 숙주 게놈 내로의 상동성 재조합 및 표적화된 통합을 허용하는 영역) 또는 발현 및 복제(예를 들면, 복제 기점, 프로모터, 및 다른 조절 서열)를 위해 채택된 핵산 서열이 포함될 수 있다.

핵산은 상동성 재조합을 이용해서 도입될 수 있다. 그와 같은 핵산에는 손상될 유전자 내이거나 측접하는 영역에 대해 상동성인 아암("상동 아암")이 포함될 수 있다. 이들 상동 아암은 손상시킬 유전자 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 도입, 결실, 또는 치환 및 상동성 재조합을 허용한다. 상동 아암이 게놈에서 표적 영역과 100% 상보성을 갖는 것이 바람직하지만, 서열이 게놈에서 표적 영역과의 표적화된 재조합을 허용하기 충분히 상보적인 한 100% 상보성은 필요하지 않다. 전형적으로, 상동 아암은 엄격한 조건 하에 표적 영역과의 하이브리드화를 허용할 상동성 수준을 가질 것이다(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 친계 박테리움에서 표적 핵산 서열(즉, 친계 박테리움에서 표적 유전자 또는 표적 영역의 서열)에 대한 지식은 일반적으로 적절한 상동 아암을 설계하기 충분하다. 예를 들면, LDH를 손상시키기 위해, 본원에 기재된 측접 상동 아암이 사용될 수 있다(예를 들면, 서열식별번호: 1-2). C.　융달리에서, 상동 아암은 유전자은행 CP001666.1에 기반하여 설계될 수 있다. 다른 균주에 있어서, 상동 아암은 다른 공공 이용가능한 핵산 서열 정보에 기반하여 설계될 수 있다.

"락테이트 생합성 경로"는 락테이트의 생산을 일으키는 반응 경로이다. 일 구현예에서, 락테이트 생합성 경로는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 하나 이상의 효소를 포함한다. 일 구현예에서, 락테이트 생합성 경로는 락테이트 탈수소효소 효소를 포함한다. 박테리움에 따라, 수많은 상이한 효소가 락테이트 생합성 경로에 관여될 수 있다. 박테리움이 락테이트 생합성 경로에서 2 개 이상의 효소, 예를 들면 피루베이트를 락테이트로 전환할 수 있는 2 개 이상의 효소를 포함하는 경우, 하나를 초과하는 그와 같은 효소의 손상은 단일 효소를 손상시켜 달성될 수 있는 수준을 초과하여 생성물의 생산을 증가시키는 효과를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 박테리움은 피루베이트를 락테이트로 전환할 수 있는 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 이상의 효소에 손상 돌연변이를 포함한다. 모든 그와 같은 효소의 발현 및/또는 활성의 손상이 생성물 생산에 관해 일부 이점을 제공할 수 있지만, 일반적으로 본 발명의 이점, 즉 하나 이상의 주요 또는 표적 생성물의 증가된 생산을 획득하기 위해 모든 그와 같은 효소의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 것이 필요하지는 않다.

일 구현예에서, 락테이트 생합성 경로 효소는 효소가 락테이트 탈수소효소 활성을 갖도록 자연적으로(즉, 내인성으로 또는 천연으로) 피루베이트를 락테이트로 전환한다. 효소는 이것이 또한 피루베이트를 락테이트로 전환하는 한, 추가적인 촉매 기능을 가질 수 있다. 예를 들면, 효소는 락테이트 탈수소효소 활성을 갖는 임의의 탈수소효소일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소에 대한 손상 돌연변이의 도입은 그 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거한다(즉, "손상시킨다").

바람직한 구현예에서, 락테이트 생합성 경로 효소는 락테이트 탈수소효소(LDH)이다. LDH로의 손상 돌연변이의 도입은 LDH의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거한다(즉, "손상시킨다").

본 발명의 박테리움은 락테이트 생합성 경로에 관련되지 않은 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 유전적 변형을 포함하는, 락테이트 생합성 경로 효소에서의 손상 돌연변이에 부가하여 하나 이상의 다른 유전적 변형을 포함할 수 있다.

하나의 특정한 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 락테이트 생합성 경로 효소에 손상 돌연변이를 포함하는 것에 부가하여 또는 그 대신, 락테이트 생합성 경로 효소의 저해제를 발현할 수 있다.

"효소 활성"은 비제한적으로 효소의 활성, 효소의 양, 또는 반응을 촉매하기 위한 효소의 이용가능성을 포함하는, 효소적 활성을 광범위하게 나타낸다. 따라서, 효소 활성의 "저감" 또는 "감소"에는 효소의 활성, 효소의 양, 또는 반응을 촉매하기 위한 효소의 이용가능성의 저감 또는 감소가 포함된다. 효소는 이것이 제1 화합물의 적어도 일부를 제2 화합물로 전환하는 반응을 촉매할 수 있는 경우, 제1 화합물 또는 기질을 제2 화합물 또는 생성물로 "전환할 수 있다".

용어 "변이체"에는 그 서열이 참조 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행기술에 개시되거나 본원에 예시된 참조 핵산 및 단백질의 서열과 다른 핵산 및 단백질이 포함된다. 본 발명은 참조 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용해서 실시될 수 있다. 예를 들면, 변이체 단백질은 참조 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응을 촉매할 수 있다. 변이체 유전자는 참조 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 변이체 프로모터는 참조 프로모터와 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.

참조 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 활성 수준을 갖는 변이체 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 불릴 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체에는 대립유전자 변이체, 유전자 단편, 돌연변이된 유전자, 다형성 등이 포함될 수 있다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자도 기능적으로 동등한 변이체의 예이다. 이들에는 클로스트리듐　 아세토 부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이 , 또는 클로스트리듐 융달리와 같은 종에서의 상동성 유전자가 포함되며, 그 세부사항은 웹사이트, 예컨대 유전자은행 또는 NCBI에서 공공 이용가능하다. 기능적으로 동등한 변이체에는 또한 그 서열이 특정한 유기체에 대한 코돈 최적화 결과로 변하는 핵산이 포함된다. 핵산의 기능적으로 동등한 변종은 참조된 핵산과 바람직하게는 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98%, 또는 그 초과의 핵산 서열 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 동등한 변이체는 참조된 단백질과 바람직하게는 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98%, 또는 그 초과의 아미노산 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 동등성은 당해분야에 공지된 임의의 방법을 이용해서 평가될 수 있다.

그러나 변이체 핵산 또는 단백질은 또한 참조 핵산 또는 단백질에 비해 감소된 활성 수준을 가질 수 있다. 예를 들면, 변이체 핵산은 각각 참조 핵산 또는 효소에 비해 감소된 발현 수준을 가질 수 있거나 변이체 효소는 특정한 반응을 촉매하는 감소된 능력을 가질 수 있다. 락테이트 생합성 경로에서 효소 활성을 평가하기 위한 효소 검정 및 키트는 당해분야에 공지되어 있다(Wang, J Bacteriol, 195: 4373-4386, 2013; Sigma-Aldrich(MAK066), Thermo(88953); Worthington Biochemical Corporation(LS002755)).

핵산은 당해분야에 공지된 임의의 방법을 이용해서 본 발명의 박테리움에 전달될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 네이키드 핵산으로 전달될 수도 있고 또는 하나 이상의 제제(예를 들면, 리포좀)와 제형화될 수도 있다. 제한 저해제가 어떤 구현예에서 사용될 수 있다(Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64: 412-434, 2000). 예로써, 형질전환(형질도입 또는 형질감염 포함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개된 형질전환, 화학적 또는 자연적 반응능, 원형질 형질전환, 프로파아지 유도, 또는 콘주게이션에 의해 달성될 수 있다(예를 들면, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참고). 전기천공의 이용이 클로스트리듐　 융달리(Koepke, PNAS, 107:13087-13092, 2010; WO/2012/053905), 클로스트리듐　 오토에타노게눔(WO/2012/053905), 클로스트리듐　 아세티쿰(Schiel-Bengeldorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012), 및 아세토박테리움 　 우디이(Straetz, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994)를 포함하는 몇 개의 일산화탄소영양 아세트산생성체에 대해 보고되었다. 전기천공의 이용이 또한 클로스트리듐　 아세토부틸리쿰(Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992), 및 클로스트리듐　 셀룰롤라이티쿰(Jennert, Microbiol, 146: 3071-3080, 2000)을 포함하는 클로스트리듐에서 보고되었다. 프로파아지 유도가 클로스트리듐 스카톨로게네스(Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010)를 포함하는 일산화탄소영양 아세트산생성체에 대해 실증되었고, 콘주게이션이 클로스트리듐 디피실레(Herbert, FEMS Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990)을 포함하는 많은 클로스트리듐에 대해 기재되었다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 어떤 구현예에서, 본 발명의 박테리움 내로의 핵산 도입 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다(WO　2012/105853).

용어 "재조합"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 유전적 변형, 돌연변이, 또는 재조합의 생성물임을 시사한다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 다중 공급원, 예컨대 2 개 이상의 상이한 균주 또는 종의 미생물로부터 유도된 유전 물질을 함유하거나 암호화된 핵산, 단백질, 또는 미생물을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 또한 내인성 핵산 또는 단백질의 돌연변이된 형태를 포함하는 돌연변이된 핵산 또는 단백질을 포함하는 미생물을 설명하기 위해 사용될 수 있다.

"친계 박테리움"은 본 발명의 박테리움을 생성하기 위해 사용된 박테리움이다. 친계 박테리움은 천연 발생 박테리움(즉, 야생형 박테리움) 또는 이전에 변형된 박테리움(즉, 돌연변이체 또는 재조합 박테리움)일 수 있다. 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움에 비해 더 적은 양의 효소를 발현하도록 변형될 수도 있고, 또는 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움에 의해 발현되는 효소를 발현하지 않도록 변형될 수도 있다. 일 구현예에서, 친계 박테리움은 클로스트리듐　오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 또는 클로스트리듐 라그스달레이이다. 바람직한 구현예에서, 친계 박테리움은 DSMZ 수납 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(즉, 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561)이다.

용어 "에서 유도된"은 신규 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생산하기 위해 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예를 들면, 친계 또는 야생형) 핵산, 단백질, 또는 미생물로부터 변형되거나 채택됨을 시사한다. 그와 같은 변형 또는 채택에는 전형적으로 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이, 또는 치환이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움으로부터 유도된다. 일 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 클로스트리듐　오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유도된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 클로스트리듐　 오토 에타노게눔 LZ1561로부터 유도되며, 이는 DSMZ 수납 DSM23693 하에 기탁된다.

일 구현예에서, 친계 박테리움은 클로스트리듐 오토에타노게눔 , 클로스트리듐 융달리 , 클로스트리듐 라그스달레이 , 클로스트리듐 코스카티이 , 클로스트 리듐 카복시디보란스 , 클로스트리듐 드라케이 , 클로스트리듐 스카톨로게네스 , 클로스트리듐 아세티쿰 , 클로스트리듐 포르미코아세티쿰 , 클로스트리듐 매그넘, 아세토박테리움 우디이 , 알칼리바컬럼 바치이 , 무렐라 써모아세티카, 스포로무사 오베이트 , 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 , 블라우티아 프로덕타 , 유박테리움 리모섬 , 및 써아나에로박터 키우비 종을 포함하는 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아 군으로부터 선택된다. 이들 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리아는 가스성 1-탄소 공급원, 예컨대 일산화탄소(CO) 및 이산화탄소(CO₂) 상에서 화학독립영양으로 성장하고, 혐기성 조건 하에 에너지 공급원으로서 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H₂)를 사용하고, 아세틸-CoA, 아세테이트, 및 다른 생성물을 생산하는 이들의 능력에 의해 정의된다. 이들은 동일한 발효, 우드-융달 또는 환원적 아세틸-CoA 경로 방식을 공유하며, 일산화탄소 탈수소효소(CODH), 하이드로게나제, 포르메이트 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라제, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 환원효소, 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소(CODH/ACS)로 구성된 효소 세트의 존재에 의해 정의되며, 그 조합은 이러한 유형의 박테리아에 대해 특징적이고 독특하다(Drake, The Prokaryotes, 354-420, Springer, New York, NY, 2006). 기질을 그로부터 생성물이 직접적으로 또는 아세틸-CoA를 통해 형성되는 바이오매스, 2차 대사물, 및 피루베이트로 전환하는 당-발효 박테리아의 화학종속영양 성장과는 대조적으로, 아세트산생성체는 기질을 그로부터 생성물, 바이오매스, 및 2차 대사물이 형성되는 아세틸-coA로 직접적으로 채널링한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 락테이트 탈수소효소를 포함하는 친계 미생물에서 유도되며, 여기서 본 발명의 박테리움은 락테이트 탈수소효소에 손상 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 친계 미생물은 유전자은행 AEI90736.1을 포함하는 핵산 서열 또는 유전자은행 CP006763.1, KEGG CAETHG_1147, 또는 유전자은행 HQ876025.1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 C.　 오토에타노게눔일 수 있다. 친계 미생물은 유전자은행 YP_003781368.1을 포함하는 핵산 서열 또는 유전자은행 CP001666.1 또는 KEGG CLJU_c32190을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 C.　융달리일 수 있다. 친계 미생물은 유전자은행 AEI90737.1을 포함하는 핵산 서열 또는 유전자은행 HQ876026.1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 C.　 라그스달레이일 수 있다. 다른 친계 박테리아는 다른 핵산 및 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"일산화탄소영양체"는 고농도의 일산화탄소(CO)를 관용할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 박테리움은 일산화탄소영양체이다.

본 발명의 박테리움은 비제한적으로, 균주 클로스트리듐 오토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), 클로스트리듐 오토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(WO　2009/064200), 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561(DSM23693), 클로스트리듐 융달리 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), 클로스트리듐 융달리 ERI-2(ATCC 55380)(U.S. 특허 5,593,886), 클로스트리듐 융달리 C-01(ATCC 55988)(U.S. 특허 6,368,819), 클로스트리듐 융달리 O-52(ATCC 55989)(U.S. 특허 6,368,819), 클로스트리듐 라그스달레이 P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055), 관련된 단리체, 예컨대 "클로스트리듐 코스카티이"(U.S. 공보 2011/0229947), 또는 돌연변이된 균주, 예컨대 클로스트리듐 융달리 OTA-1(Tirado-Acevedo, Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljingdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함하는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 클로스트리듐 라그스달레이 종, 및 관련된 단리체를 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리듐 클러스터로부터 유도될 수 있다.

이들 균주는 클로스트리듐 rRNA 클러스터 I 내에 서브클러스터를 형성하며 이들의 16S rRNA 유전자는 30% 가량의 유사한 낮은 GC 함량과 함께 99%를 초과하여 동일하다. 그러나 DNA-DNA 재회합 및 DNA 지문 실험은 이들 균주가 구별되는 종에 속함을 나타내었다(WO　2008/028055). 상기 클러스터의 균주는 유사한 유전형 및 표현형을 둘 다 갖는 공통 특성에 의해 정의되며, 이들 모두는 동일한 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 공유한다. 더욱이, 상기 클러스터의 균주에는 사이토크롬이 없으며, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 상기 클러스터의 모든 종은 유사한 형태 및 크기를 가지며(지수 성장 세포는 0.5-0.7 x 3-5 ㎛임), 중온균이고(최적 성장 온도는 30-37℃임), 엄격히 혐기성이다(Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993; 및 WO 2008/028055). 게다가, 이들 모두는 동일한 주요 계통발생적 형질, 예컨대 동일한 pH 범위(pH 4-7.5, 최적 초기 pH는 5.5-6), 유사한 성장률을 갖는 CO-함유 가스 상에서의 강력한 독립영양 성장, 및 주요 발효 최종 생성물로 에탄올 및 아세트산을 갖는 유사한 대사 프로파일, 그리고 어떤 조건 하에 형성된 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산(Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Koepke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993; 및 WO　2008/028055)을 공유한다. 인돌 생산도 모든 3 개 종에서 관측된다.

그러나 종은 다양한 당류(예를 들면, 람노오스, 아라비노오스), 산(예를 들면, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들면, 아르기닌, 히스티딘), 또는 다른 기질(예를 들면, 베타인, 부탄올)의 기질 사용을 차별화한다. 게다가 일부 종은 어떤 비타민(예를 들면, 티아민, 바이오틴)에 대해 영양요구성인 반면 다른 것은 그렇지 않은 것으로 나타났다. 가스 섭취에 관여하는 우드-융달 경로 유전자의 조직 및 수는 핵산 및 아미노산 서열에서의 차이에도 불구하고 모든 종에서 동일한 것으로 나타났다(Koepke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011). 또한, 카복실산의 그것의 상응하는 알코올로의 환원이 이들 미생물 범위에서 나타났다(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 따라서 이들 형질은 하나의 미생물, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 융달리에 특이적이기 보다는 일산화탄소영양, 에탄올-합성 클로스트리듐에 대해 일반적인 형질이며, 성능에 차이가 있을 수 있지만 기전은 이들 균주에 걸쳐 기전이 유사하게 작용하는 것으로 이해될 수 있다.

"아세트산생성체"는 혐기성 호흡의 생성물로서 아세테이트를 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 아세트산생성체는 에너지 보존을 위한 그리고 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA-유도된 생성물, 예컨대 아세테이트의 합성을 위한 이들의 주요 기전으로 우드-융달 경로를 이용하는 절대 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). 바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 아세트산생성체이다.

본 발명은 CO를 포함하는 기질의 존재 하에 본 발명의 박테리움을 배양함으로써 본 발명의 박테리움이 생성물을 생산하는 단계를 포함하는 생성물의 생산 방법을 추가로 제공한다.

용어 "기질"은 본 발명의 박테리움에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 나타낸다. 전형적으로, 기질은 일산화탄소(CO)를 포함하는 가스성 기질이다. 기질은 상당한 비율의 CO, 예컨대 약 20% 내지 100%, 20% 내지 70%, 30% 내지 60%, 또는 40% 내지 55% 용적의 CO를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 기질은 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 용적의 CO를 포함한다. 본 발명의 박테리움은 일반적으로 기질에서 적어도 일부 CO를 생성물로 전환한다.

기질이 임의의 수소(H₂)를 함유할 필요는 없지만, H₂의 존재가 생성물 형성에 해로워서는 안 되며 향상된 전반적 효율을 일으킬 수도 있다. 예를 들면 특정 구현예에서, 기질은 2:1, 1:1, 또는 1:2의 H₂:CO의 근사 비를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 약 30%, 20%, 15%, 또는 10% 미만 용적의 H₂를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 저농도의 H₂, 예를 들면, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 H₂를 포함한다. 추가 구현예에서, 기질은 실질적으로 H₂를 함유하지 않는다.

기질은 또한 이산화탄소(CO₂), 예를 들면 약 1% 내지 80% 또는 1% 내지 30% 용적의 CO₂를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 약 20% 미만 용적의 CO₂를 포함한다. 추가 구현예에서, 기질은 약 15%, 10%, 또는 5% 미만 용적의 CO₂를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 기질은 실질적으로 CO₂를 함유하지 않는다.

기질은 전형적으로 가스성이지만, 기질이 또한 대안적인 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 기질은 마이크로거품 분산 발생제를 사용해서 CO-함유 가스로 포화된 액체 중에 용해될 수 있다(Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol, 101: 211-227, 2002). 추가 예로서, 기질은 고형 지지체 상으로 흡착될 수 있다.

기질은 산업용 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원으로부터, 예컨대 자동차 배기 증기 또는 바이오매스 가스화로부터 수득된 폐기 가스일 수 있다. 어떤 구현예에서, 산업용 공정은 철 금속 생성물 제조, 예컨대 제강소 제조, 비-철 생성물 제조, 석유 정제 공정, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 및 코크 제조로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, CO-함유 가스는 임의의 편리한 방법을 이용해서 대기 내로 방출되기 전에 산업용 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스, 즉 일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스의 성분일 수 있다. 산업용 공정으로부터 생산된 CO는 보통 격발되어 CO₂를 생산하고, 따라서 본 발명은 CO₂ 온실 가스 방출의 감소에서 특정한 유용성을 갖는다. 기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 산소(O₂)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 기질을 처리하거나 문지르거나 여과하여 임의의 원하지 않는 불순물, 예컨대 독소, 원하지 않는 성분, 또는 먼지 입자를 제거하고/하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 박테리움을 배양하여 하나 이상의 생성물을 생산할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 박테리움은 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생성물을 생산한다. 본 발명의 박테리움은 또한 다른 생성물, 예컨대 아세토락테이트 또는 아세토인 말레이트를 생산할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리움은 친계 박테리움에 비해 증가된 양의 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 생산한다. 예를 들면, 본 발명의 박테리움은 본 발명의 박테리움이 유도된 친계 박테리움에 비해 약 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 500% 초과의 하나 이상의 생성물을 생산할 수 있다. 생성물 생산의 상기 증가는, 적어도 부분적으로 탄소 및 에너지를 락테이트 생산으로부터 다른 생성물의 생산 쪽으로 돌리는, 락테이트 생합성 경로 효소에서의 손상 돌연변이에 기인할 수 있다.

용어 "주요 생성물"은 최고 농도 및/또는 수율로 생산된 단일 생성물을 나타낸다. 일 구현예에서, 주요 생성물은 에탄올 또는 2,3-부탄디올이다.

추가로, 본 발명의 박테리움을 하나 이상의 다른 생성물에 비해 하나 이상의 생성물의 생산을 선호하도록 조작하는 것이 가능하다. 예를 들면, 피루베이트의 락테이트로의 전환 손상은 발린, 류신 및 이소류신의 생산에 비해 2,3-부탄디올, 포르메이트, 말레이트, 푸마레이트, 시트레이트, 석시네이트 및 2-옥소글루테레이트의 생산을 선호할 수 있다.

본원에서, 생성물(예를 들면, 시트레이트)의 언급에는 생성물의 염(예를 들면, 시트레이트) 및 산(예를 들면, 시트르산) 형태가 모두 포함된다. 종종, 생성물의 염 및 산 형태의 혼합물이 액체배지의 pH에 따라 변하는 비로, 발효 액체배지 중에 존재할 것이다. 추가 예로서, 용어 "아세테이트"는 아세테이트 및 아세트산을 내포하며, 용어 "포르메이트"는 포르메이트 및 포름산을 내포하고, 용어 "말레이트"는 말레이트 및 말산을 내포하고, 용어 "락테이트"는 락테이트 및 락트산을 내포한다.

맥락 상 다르게 요구되지 않는 한, 하나 이상의 이성질체 형태(예를 들면, D, L, 메조, S, R, 시스, 또는 트랜스 형태)로 존재할 수 있는 본원에서의 임의의 화합물에 대한 언급은 일반적으로 화합물의 임의의 하나 이상의 그와 같은 이성질체를 내포하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들면, "락테이트"에 대한 언급은 일반적으로 락테이트의 D 및 L 이성질체를 모두 내포한다.

전형적으로, 배양은 생물반응기에서 수행된다. 용어 "생물반응기"에는 용기, 타워, 또는 튜브 배열, 예컨대 연속식 교반 탱크 반응기(CSTR), 고정된 세포 반응기(ICR), 세류 층 반응기(TBR), 거품 탑, 가스 리프트 발효기, 정적 혼합기, 또는 기체-액체 접촉을 위해 적절한 다른 용기 또는 다른 디바이스 중 하나 이상으로 구성된 배양/발효 디바이스가 포함된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기의 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어들은 배양/발효 공정의 성장상 및 생성물 생합성상을 모두 내포한다.

배양은 일반적으로 박테리움의 성장을 허용하기 충분한 영양소, 비타민, 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지 중에 유지된다. 바람직하게는 수성 배양 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적절한 배지는 당해분야에 공지되어 있고, 예를 들면 U.S. 특허 5,173,429, U.S. 특허 5,593,886, 및 WO 2002/008438에 기재된다.

배양/발효는 바람직하게는 표적 생성물의 생산을 위해 적합한 조건 하에 수행되어야 한다. 고려해야 하는 반응 조건에는 압력(또는 CO 분압), 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 진탕 속도(연속식 교반 탱크 반응기를 이용하는 경우), 접종 수준, 액체상에서 CO가 제한 수준이 되지 않도록 하는 최대 가스 기질 농도 및 생성물 저해를 배제하기 위한 최대 생성물 농도가 포함된다. 특히, 생성물이 CO-제한된 조건 하에서 배양에 의해 소비될 수 있으므로, CO-함유 기질의 도입 속도는 액체상에서 CO의 농도가 제한 수준이 되지 않도록 제어될 수 있다.

용어들 "효율 증가", "증가된 효율" 등이 발효 공정에 관해 사용될 때에는 비제한적으로, 발효를 촉매하는 미생물의 성장 속도, 성장 및/또는 생성물 생산 속도, 소비된 기질 용적 당 생산된 원하는 생성물(예컨대 알코올)의 용적, 원하는 생성물의 생산 속도 또는 생산 수준 및 다른 발효 부산물에 비해 생산된 원하는 생성물의 상대적인 비율 중 하나 이상의 증가가 포함된다.

고압에서의 생물반응기의 작동은 기상으로부터 액상으로 증가된 속도의 CO 물질 전달을 허용한다. 따라서, 일반적으로 대기압보다 높은 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 CO 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고 체류 시간은 생물반응기의 필요 용적을 좌우하므로, 가압 시스템의 이용은 필요한 생물반응기의 용적, 그리고 결과적으로 배양/발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. U.S. 특허 5,593,886에서의 예에 따르면, 반응기 용적은 반응기 작동 압력을 증가시켜서 선형 비율로 감소될 수 있다. 환언하면, 10 대기압에서 작동된 생물반응기는 1 대기압에서 작동된 생물반응기 용적의 1/10만을 필요로 한다. 추가로, WO　2002/008438은 30 psig 및 75 psig의 압력 하에 수행된 가스에서-에탄올로의 발효를 기재하며, 각각 에탄올 생산성 150 g/L/1일 및 369 g/L/1일을 제공한다. 그에 반해서, 유사한 배지 및 입력 가스 조성을 이용해서 대기압에서 수행된 발효는 하루에 1 리터 당 10 내지 20 배 더 적은 에탄올을 생산하는 것으로 나타났다.

본 발명의 방법은 하나 이상의 생성물의 회수 또는 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 에탄올 또는 에탄올 및/또는 다른 생성물을 함유하는 혼합된 알코올 스트림은 분별 증류, 증발, 투석증발, 또는 추출성 발효(예를 들면, 액체-액체 추출)를 포함하는 당해분야에 공지된 임의의 방법에 의해 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다. 부산물, 예컨대 아세테이트 또는 아세트산은 또한 활성탄 흡착 시스템, 전기투석, 또는 연속적 가스 스트리핑을 포함하는 당해분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다. 일 구현예에서, 생성물은 생물반응기로부터 액체배지의 일부를 연속적으로 제거하고, 미생물 세포를 액체배지로부터 분리하고(편리하게는 여과에 의해), 생성물을 액체배지로부터 회수함으로써 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 생물반응기로 복귀될 수 있다. 추가로, 무세포 투과물도 생성물이 제거된 후, 임의로 영양소, 예컨대 B 비타민의 보충을 포함하여, 생물반응기로 복귀될 수 있다.

석시네이트는, 예를 들면 산성화, 이온교환 크로마토그래피와 커플링된 전기투석(Song, Enzyme Microb Technol, 39: 352-361, 2006), 여과 및 황산 첨가와 커플링된 Ca(OH)를 사용한 침전(Lee, Appl Microbiol Biotechnol, 79: 11-22, 2008), 또는 아민-기반 추출제, 예컨대 트리-n-옥틸아민을 사용한 반응성 추출(Huhet, Proc Biochem 41: 1461-1465, 2006)을 이용하여 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다. 모든 방법에 있어서, 염이 아니라 유리 산 형태를 갖는 것이 결정적이다. 그러나 석신산에 대한 대부분의 생물공학적 생산 공정은 6-7의 중성 또는 약산성 pH에서 작동한다. 석신산의 pKa(pKa = 4.16 및 5.61)에 있어서, 대부분의 석신산은 이들 조건 하에 유리산이 아니라 염으로서 존재한다. 그러나 C.　 오토에타노게눔 및 다른 일산화탄소영양 아세트산생성체는 바람직하게는 4-6의 낮은 pH를 관용하고 자라는 것으로 공지되어 있다.

분지쇄 아미노산, 예컨대 발린, 류신, 및 이소류신은 농축(예를 들면, 역삼투법을 통해), 바이오매스의 결정화 또는 제거(예를 들면, 한외여과 또는 원심분리를 통해), 또는 이온 교환 크로마토그래피(Ikeda, Microbial Production of L-Amino Acids, 1-35, 2003)를 이용해서 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다.

2,3-부탄디올, 포르메이트, 2-옥소글루테레이트, 및 다른 생성물은 당해분야에 공지된 임의의 방법을 이용해서 발효 액체배지로부터 회수될 수 있다. 예를 들면, 저농도의 2,3-부탄디올은 막 기술, 예컨대 선택적 이온 투과성 막을 통한 적합한 전위의 적용이 관여되는 전기투석을 이용해서 회수될 수 있다. 다른 적합한 기술에는 나노여과가 포함되며, 여기서 1가 이온은 압력 하에 선택적으로 막을 통과한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 당연히 그것의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1

본 실시예는 일반적인 물질 및 방법을 기재한다.

C. 오토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693(DSM10061의 유도체) 및 C.　융달리 DSM13528은 DSMZ(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)에서 입수하였다. C.　라그스달레이 ATCC BAA-622는 ATCC(미국 종균 협회, Manassas, VA 20108, USA)에서 입수하였다. E . 콜리 DH5α는 Invitrogen(Carlsbad, CA 92008, USA)에서 입수하였다.

E.　 콜리를 LB(Luria-Bertani) 배지 중 37℃에서 호기성으로 성장시켰다. 고체 배지는 1.5% 한천을 함유하였다.

클로스트리듐 균주를 표준 혐기성 기술(Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971)을 이용해서 pH　5.6에서 PETC 배지 중 37℃에서 성장시켰다. 푸룩토오스(종속영양 성장) 또는 상부공간 내 30 psi CO-함유 제강소 가스(New Zealand Steel 사이트, Glenbrook, NZ에서 수집; 조성: 44% CO, 32% N₂, 22% CO₂, 2% H₂)(독립영양 성장)를 기질로 사용하였다. 고체 배지에 있어서, 1.2% 박토 한천(BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA)을 첨가했다.

C.　 오토에타노게눔 DSM23693을 이용한 발효를 단독 에너지 및 탄소 공급원으로서 CO-함유 제강소 가스를 사용하여 37℃에서 1.5　L 생물반응기에서 수행하였다. 하기를 함유하는 한정 배지를 제조하였다: MgCl, CaCl₂(0.5 mM), KCl(2 mM), H₃PO₄(5 mM), Fe(100 μM), Ni, Zn(5 μM), Mn, B, W, Mo, Se(2 μM). 배지를 생물반응기 내로 옮기고, 45 분 동안 121℃에서 오토클레이브하였다. 오토클레이브 후, 배지에 티아민, 판토테네이트(0.05　mg/l), 및 바이오틴(0.02　mg/l)을 보충하고, 3　mM 시스테인-HCl로 환원시켰다. 혐기성 조건을 달성하기 위해, 반응기 용기에 0.2 μm 필터를 통해 질소를 살포하였다. 접종 전에, 가스를 CO-함유 제강소 가스로 스위칭하고, 연속적으로 반응기로 공급하였다. 진탕을 200 rpm에서 350 rpm으로 증가시키면서 가스 흐름을 초기에는 80 ml/분으로 설정하고, 중간-지수상 동안 200 ml/분으로 증가시켰다. Na₂S를 생물반응기 내로 0.25　ml/hr로 공급하였다. OD600이 0.5에 도달하면, 생물반응기를 1.0 ml/분(희석 속도 0.96 d^{- 1})의 연속 방식으로 스위칭하였다. 샘플을 채취하여 바이오매스 및 대사물을 측정하였다. 추가로, 유입- 및 유출-유동 가스의 상부공간 분석을 규칙적 기준으로 수행하였다.

상부공간의 가스 조성을 2 개 채널이 설치된 Varian CP-4900 마이크로 GC 상에서 측정하였다. 채널 1은 70℃, 200 kPa 아르곤에서 4.2 s의 백플러시 시간으로 수행되는 10m Mol-체 칼럼인 반면, 채널 2는 90℃, 150 kPa 헬륨에서 백플러시 시간 없이 수행되는 10　m PPQ 칼럼이었다. 두 채널 모두에 대한 주사기 온도는 70℃였다. 런타임은 120　s로 설정했으나, 모든 관심 피크는 보통 100 s 전에 용출되었을 것이다.

대사 최종 생성물의 HPLC 분석을 35℃에서 작동하는 RID(굴절률 검출기) 및 60℃에서 유지된 Alltech IOA-2000 유기산 칼럼(150 x 6.5 mm, 입자 크기 5 μm)이 구비된 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템을 이용해서 수행하였다. 약간 산성화된 물(0.005 M H₂SO₄)을 이동상으로 0.7　ml/분의 유속으로 사용하였다. 단백질 및 다른 세포 잔여물을 제거하기 위해, 400　㎕ 샘플을 100　㎕의 2%(w/v) 5-설포살리실산과 혼합하고, 3 분 동안 14,000　x　g에서 원심분리하여 침전된 잔여물을 분리하였다. 이어서 10　㎕의 상청액을 분석용 HPLC 내로 주사하였다.

대사 최종 생성물의 GC 분석을 Supelco PDMS 100 1 cm 섬유, Alltech EC-1000(30　m x 0.25　mm x 0.25　㎛) 칼럼, 및 불꽃 이온화 검출기(FID)가 구비된 Agilent 6890N 상부공간 GC를 이용하여 수행하였다. 5　ml 샘플을 Hungate 튜브 내로 옮기고, 수조에서 40℃로 가열하고, 정확하게 5 분 동안 섬유에 노출시켰다. 주사기를 250℃에서 유지하고, 1　ml/분의 일정한 유속을 갖는 헬륨을 운반 가스로 사용하였다. 오븐 프로그램은 5 분 동안 40℃, 그 다음 최대 200℃까지 10℃/분씩 증가시켰다. 이어서 온도를 50℃/분의 속도로 220℃까지 추가 증가시킨 다음, 이 온도에서 5 분 동안 유지한 후, 온도를 50℃/분의 속도로 40℃까지 감소시키고 최종 1 분 유지하였다. FID를 메이크업 가스로서 40　ml/분 수소, 450 ml/분 공기 및 15　ml/분 질소를 이용해서 250℃에서 유지하였다.

전체 형질전환 실험 동안, C. 오토에타노게눔 DSM23693을 표준 혐기성 기술(Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971)을 이용해서 37℃에서 환원제의 존재 하에 30 psi 제강소 폐기 가스(New Zealand Steel 사이트, Glenbrook, NZ에서 수집; 조성: 44% CO, 32% N₂, 22% CO₂, 2% H₂)와 함께 YTF 배지 중에 성장시켰다.

반응능 세포를 제조하기 위해, C. 오토에타노게눔 DSM23693의 50　ml 배양을 연속 5 일 동안 신선한 YTF 배지로 하위배양하였다. 이들 세포를 사용하여 0.05의 OD_600nm에서 40　mM DL-트레오닌을 함유하는 50　ml YTF 배지를 접종하였다. 배양이 OD_600nm 0.5에 도달하면, 세포를 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 혐기성 챔버 내로 옮기고 4,700　x　g 및 4℃에서 수확하였다. 배양물을 빙랭 전기천공 버퍼(270　mM 수크로오스, 1　mM MgCl₂, 7　mM 나트륨 포스페이트, pH　7.4)로 2 회 세정하고 마지막으로 용적 600　㎕의 신선한 전기천공 버퍼 중에 현탁하였다. 상기 혼합물을 2　㎍의 메틸화된 플라스미드 믹스 및 1　㎕의 1 형 제한 저해제(Epicentre Biotechnologies)를 함유하는 0.4 cm 전극 갭을 갖는 사전-냉각된 전기천공 큐벳 내로 옮기고, 하기 설정을 이용하여 Gene pulser Xcell 전기천공 시스템(Bio-Rad)을 이용해서 즉시 펄스를 가하였다: 2.5　kV, 600　Ω, 및 25　μF. 시간 상수 3.7-4.0　ms가 달성되었다. 배양물을 5　ml의 신선한 YTF 배지 내로 옮겼다. 세포 재생을 튜브 홀더가 구비된 Spectronic Helios Epsilon 분광측정기(Thermo)를 이용하여 파장 600 nm에서 모니터링하였다. 바이오매스의 초기 저감 후, 세포가 다시 성장하기 시작하였다. 그 시점부터 바이오매스가 2 배가 되면, 약 200　㎕의 배양물을 5 g/l 푸룩토오스(둘 다 1.2% 박토 한천 및 15 ㎍/ml 티암페니콜 함유)를 함유하는 YTF-한천 평판 및 PETC 한천 평판 상에 도말하였다. 37℃에서 30　psi 제강소 가스와 3-4 일 인큐베이션 후, 평판 당 500 개 콜로니를 명확히 볼 수 있었다.

C. 오토에타노게눔 : 6 개 클론의 정체성 및 DNA 전달을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 제조자의 설명에 따라 PURELINK™ 게놈 DNA 미니 키트(Invitrogen)를 이용해서 PETC 액체 배지 중에서 모든 6 개 콜로니/클론으로부터 단리하였다. 야생형 C. 오토에타노게눔 DSM23693의 DNA와 함께 이들 게놈 DNA를 PCR에서 주형으로 사용하였다. PCR을 iproof High Fidelity DNA 폴리머라제(Bio-Rad Labratories), 아래 실시예에 기재된 바와 같은 특이적 프라이머 및 하기 프로그램을 이용하여 수행하였다: 2 분 동안 98℃에서 초기 변성, 그 다음 25 사이클의 변성(10 s 동안 98℃), 어닐링(15 s 동안 61℃) 및 연신(90 s 동안 72℃), 이어서 최종 연장 단계(7 분 동안 72℃). 야생형 C.　 오토에타노게눔 DSM23693으로부터의 게놈 DNA를 대조군 PCR에서 주형으로 사용하였다.

클론의 정체성을 확인하기 위해, PCR을 또한 상기에서 기재된 바와 같은 PCR 조건을 이용해서 그리고 프라이머 fD1(서열식별번호: 10) 및 rP2(서열식별번호: 11)를 이용해서 16s rRNA 유전자에 대해 수행하였다. PCR 생성물을 Zymo CLEAN AND CONCENTRATION™ 키트를 이용해서 정제하고 프라이머 rP2를 이용해서 서열분석하였다.

실시예 2

본 실시예는 락테이트 탈수소효소 활성을 제거하기 위한 C.　 오토에타노게 눔의 유전적 변형을 실증한다.

C.　 오토에타노게눔의 확인된(Koepke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011) 락테이트 탈수소효소(AEI90736.1) 유전자 ldh(HQ876025.1)의 불활성화 실증은 2 가지 방법론: 상동성 재조합 및 ClosTron을 이용하여 실증되었다.

상동성 재조합: 더 이상 락테이트를 생산할 수 없는 C.　 오토에타노게눔 균주를 생성하기 위해, 녹 아웃 작제물을 설계하여 이중 상동성 재조합에 의해 ldh를 손상시켰다. ldh 유전자에 측접하는 대략 1kb의 상동 아암(서열식별번호: 1-2)을 pMTL85151 플라스미드(도 1) 내로 클로닝하여 플라스미드 pMTL85151-ldh-ko(서열식별번호: 3)를 수득하였다. 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해분야에 공지되어 있다(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, 1987). C.　 오토에타노게눔 DSM23693으로부터의 게놈 DNA를 제조자의 설명에 따라 Invitrogen으로부터 Purelink 게놈 DNA 미니 키트를 이용하여 단리하였다.

DNA를 도입하기 위한 형질전환을 상기 또는 WO　2012/053905에 기재된 바와 같이 수행하였다.

선택 후, 콜로니를 단일 교차 통합에 대해(도 2a), 이어서 이중-교차 돌연변이체(도 2b)에 대해 스크리닝하였다. 클론 6에서 3' 교차 이벤트가 나타났고(도 2a) 외부 측접 프라이머로 스크리닝되었을 때 ldh 유전자의 녹아웃이 관측되었다(도 2b). 올리고뉴클레오타이드 Og21f(서열식별번호: 4), Og24r(서열식별번호: 5), Og35f(서열식별번호: 6, 및 Og36r(서열식별번호: 7)을 이중-교차 락테이트 탈수소효소 결실의 확인을 위해 사용하였다.

동일한 전략 및 플라스미드가 또한, 예를 들면 C.　 융달리 또는 C.　 라그스달레이에서 사용될 수 있다. 형질전환 프로토콜은 당해분야에 기재되어 있다(WO　2012/053905 Leang, Applied Environ Microbiol, 79: 1102-1109, 2013).

ClosTron: ClosTron 웹사이트에서 호스팅되는 인트론 설계 도구인 ClosTron(Heap, J Microbiol Methods, 70: 452-464, 2007)을 사용하여 344 bp의 표적화 영역 129s(서열식별번호: 8)를 설계하고 표적 부위(서열식별번호: 9)를 확인하였다. 표적화 영역을 DNA2.0(Menlo Park)에 의해 역-전위 활성화된 ermB 마커(RAM)를 함유하는 벡터 pMTL007C-E2 내에서 화학적으로 합성하였다(서열식별번호: 12).

벡터를 WO　2012/053905에 기재된 바와 같이 C.　 오토에타노게눔 내로 도입하였다. 15 ㎍/ml 티암페니콜을 함유하는 PETC MES 상에서 성장시킨 단일 콜로니를 5 ㎍/ml 클라로트로마이신을 함유하는 PETC MES 상에 스트리킹하였다. 각각의 표적으로부터의 콜로니를 무작위로 피킹하고 측접 프라이머 155F(서열식별번호: 4), 및 939R(서열식별번호: 5)을 이용하여 삽입에 대해 스크리닝하였다. 증폭은 iNtron Maxime PCR 프리믹스를 이용하여 수행되었다. 100 bp의 PCR 생성물이 야생형 유전형에 대해 시사되는 반면, 대략 1.9 kb의 생성물 크기는 표적 부위 내 그룹 II 인트론의 삽입을 제시한다(도 3). 플라스미드의 손실은 내성 마커(catP) 및 그람 양성 복제 기점(pCB102)의 증폭에 의해 확인되었다(도 4).

동일한 전략 및 플라스미드가 또한 C.　 융달리 또는 C.　 라그스달레이에서 사용될 수 있다. 형질전환 프로토콜은 당해분야에 기재되어 있다(WO　2012/053905; Leang, Appl Environ Microbiol, 79: 1102-1109, 2013).

실시예 3

본 실시예는 불활성화된 락테이트 탈수소효소를 갖는 C.　 오토에타노게눔 균주의 생성물 프로파일을 변형되지 않은 C.　 오토에타노게눔과 비교하는 성장 실험을 기재한다.

C.　 오토에타노게눔 및 불활성화된 락테이트 탈수소효소를 갖는 C.　 오토에 타노게눔 균주의 배양물을 혈청 병에서 10 g/L MES 버퍼를 함유하는 PETC 배지 중에 성장시켰다. 접종물은 배지 용적의 10%였고, 배지의 용적은 10　ml이었다. 배양물을 제강소 배기 가스(44% CO, 22% CO₂, 2% H₂, 32% N₂) 30　psi로 가스처리하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지의 pH는 5.7이었다.

성장상 동안, OD600의 측정 및 HPLC에 의한 분석을 위해 샘플을 채취하였다. 병을 매일 30 psi 제강소 가스로 가스처리하였다. 실험은 3 회씩 수행하였다.

변형되지 않은 C.　 오토에타노게눔 균주는 6 일 성장 후 0.263　±　0.041　g/L 락테이트를 생산한 반면(도 5a), 불활성화된 락테이트 탈수소효소를 갖는 C.　 오토에타노게눔 균주는 6 일 성장 후 락테이트를 생산하지 않았다(도 5b). 추가적으로, 불활성화된 락테이트 탈수소효소를 갖는 C.　 오토에타노게눔 균주는 증가된 양의 아세테이트, 에탄올, 및 2,3-부탄디올을 생산하였다. 2 개 균주는 다른 경우에는 유사한 성장 프로파일을 가졌고, 각각 2.69 및 2.365의 유사한 OD600nm에 도달하였다.

본원에서 언급된 공보, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은 각각의 참조문헌이 참고로 편입됨이 개별적이고 구체적으로 명시되고 그 전문을 본원에 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 편입된다. 본 명세서에서 임의의 선행기술에 대한 언급은 그 선행기술이 임의의 국가에서 시도하는 분야에서의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 인정이 아니며 이렇게 해석되어서도 안 된다.

본 발명의 기재의 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 단수 용어들 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에서 다르게 명시되거나 맥락 상 명확히 금기되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 용어들 "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"은 다르게 지적되지 않는 한, 개방형 용어들(즉, "비제한적으로 포함되는"의 의미)로 해석되어야 한다. 본원에서의 값 범위의 언급은 본원에서 다르게 명시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 나타내는 약식 방법으로서 작용하려는 것이며, 각각의 개별 값은 그것이 본원에서 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로 명세서 내에 편입된다. 본원에서 기재된 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 다르게는 맥락 상 명확히 금기되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 그리고 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들면, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 다르게 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 부과하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 명시하는 것으로 해석되지 않는다.

본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최적 양태를 포함하는 본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재된다. 이들 바람직한 구현예의 변화는 상기 기재의 판독 시 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련가가 적합한 바에 따라 그와 같은 변화를 채용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명에는 준거법에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구범위에서 언급되는 요지의 모든 변형 및 균등부가 포함된다. 게다가, 이들의 모든 가능한 변화에서의 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 명시되지 않거나 다르게는 맥락 상 명확히 금기되지 않는 한, 본 발명에 의해 내포된다.

SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech New Zealand Limited Nagaraju, Shilpa Al-Sinawi, Bakir De Tissera, Sashini Koepke, Michael <120> RECOMBINANT MICROORGANISMS AND METHODS OF USE THEREOF <130> LT102WO1 <150> 61/933,815 <151> 2014-01-30 <150> 61/944,541 <151> 2014-02-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 tggtattcta gcttgaaatt tgaacttata catgaaatat aatgacaaaa ttgaaatcac 60 atttaaaaac ttttttaaat aagtcttagc ttggtatttt agaaaacctt aggaacttag 120 atatgtttga ggtacgagtt gatctaagtt cctttaggtt ttcaaaatac caagctttag 180 acttattaaa agtttttata gtgatgaaat ttgtcattat atgatattgt ataagtgaac 240 tttcaaccta gaaatatcta aatgtctaaa attatatctt ctaaacttct ttttggtaca 300 tgatggactt tattctcgtc tctccagtac ttcacatcat tatttgaatc catagcttct 360 ataaccactt gttcctttgg ctttccaaga gctactacca atataatttc atatttttca 420 tccaaattaa gatttgattt taattctttt ttattcacat ttcccagcat acatccgcca 480 aatccttttt ctacagctcc tagtaaaata gtttgagctg ctattccagg 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cttggagcga acgacctaca 4320 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 4380 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 4440 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 4500 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 4560 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 4620 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 4680 gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 4740 gggccc 4746 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 attcatcctg caggttaaga gcaacactgt acgtggtat 39 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gactggcgcg ccatttaatc cctctggtcc cagaact 37 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 tgaactaaaa agtttcgtac gatgt 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 tcctttatcc 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aactcttcct gtcgtcatat 60 ctacaagcca tccccccaca gatacgggcg cgccgccatt atttttttga acaattgaca 120 attcatttct tattttttat taagtgatag tcaaaaggca taacagtgct gaatagaaag 180 aaatttacag aaaagaaaat tatagaattt agtatgatta attatactca tttatgaatg 240 tttaattgaa tacaaaaaaa aatacttgtt atgtattcaa ttacgggtta aaatatagac 300 aagttgaaaa atttaataaa aaaataagtc ctcagctctt atatattaag ctaccaactt 360 agtatataag ccaaaactta aatgtgctac caacacatca agccgttaga gaactctatc 420 tatagcaata tttcaaatgt accgacatac aagagaaaca ttaactatat atattcaatt 480 tatgagatta tcttaacaga tataaatgta aattgcaata agtaagattt agaagtttat 540 agcctttgtg tattggaagc agtacgcaaa ggctttttta tttgataaaa attagaagta 600 tatttatttt ttcataatta atttatgaaa atgaaagggg gtgagcaaag tgacagagga 660 aagcagtatc ttatcaaata acaaggtatt agcaatatca ttattgactt tagcagtaaa 720 cattatgact tttatagtgc ttgtagctaa gtagtacgaa agggggagct ttaaaaagct 780 ccttggaata catagaattc ataaattaat ttatgaaaag aagggcgtat atgaaaactt 840 gtaaaaattg caaagagttt attaaagata ctgaaatatg caaaatacat tcgttgatga 900 ttcatgataa aacagtagca acctattgca gtaaatacaa tgagtcaaga tgtttacata 960 aagggaaagt ccaatgtatt aattgttcaa agatgaaccg atatggatgg tgtgccataa 1020 aaatgagatg ttttacagag gaagaacaga aaaaagaacg tacatgcatt aaatattatg 1080 caaggagctt taaaaaagct catgtaaaga agagtaaaaa gaaaaaataa tttatttatt 1140 aatttaatat tgagagtgcc gacacagtat gcactaaaaa atatatctgt ggtgtagtga 1200 gccgatacaa aaggatagtc actcgcattt tcataataca tcttatgtta tgattatgtg 1260 tcggtgggac ttcacgacga aaacccacaa taaaaaaaga gttcggggta gggttaagca 1320 tagttgaggc aactaaacaa tcaagctagg atatgcagta gcagaccgta aggtcgttgt 1380 ttaggtgtgt tgtaatacat acgctattaa gatgtaaaaa tacggatacc aatgaaggga 1440 aaagtataat ttttggatgt agtttgtttg ttcatctatg ggcaaactac gtccaaagcc 1500 gtttccaaat ctgctaaaaa gtatatcctt tctaaaatca aagtcaagta tgaaatcata 1560 aataaagttt aattttgaag ttattatgat attatgtttt tctattaaaa taaattaagt 1620 atatagaata gtttaataat agtatatact taatgtgata agtgtctgac agtgtcacag 1680 aaaggatgat tgttatggat tataagcggc cggccagtgg gcaagttgaa aaattcacaa 1740 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ttcggtatat ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga 3480 ctttccttgg tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc 3540 gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc 3600 tgctctgcga ggctggccgg ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga 3660 tgaaaccaag ccaaccagga agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga 3720 acgaagagcg attgaggaaa aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct 3780 ggccgtcggc cagggctaca aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct 3840 ggcccgcatc aatggcgacc tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga 3900 cgacccgcgc acggcgcggt tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga 3960 agagaagcag gacgagcttg gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc 4020 atgacttttt tagccgctaa aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca 4080 tgcgctccat caagaagagc gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag 4140 gcaagaccga tcgggccccc tgcagggtgt agtagcctgt gaaataagta aggaaaaaaa 4200 agaagtaagt gttatatatg atgattattt tgtagatgta gataggataa tagaatccat 4260 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gtagtctgag aagggtaacg ccctttacat ggcaaagggg tacagttatt gtgtactaaa 6840 attaaaaatt gattagggag gaaaacctca aaatgaaacc aacaatggca attttagaaa 6900 gaatcagtaa aaattcacaa gaaaatatag acgaagtttt tacaagactt tatcgttatc 6960 ttttacgtcc agatatttat tacgtggcgt atcaaaattt atattccaat aaaggagctt 7020 ccacaaaagg aatattagat gatacagcgg atggctttag tgaagaaaaa ataaaaaaga 7080 ttattcaatc tttaaaagac ggaacttact atcctcaacc tgtacgaaga atgtatattg 7140 caaaaaagaa ttctaaaaag atgagacctt taggaattcc aactttcaca gataaattga 7200 tccaagaagc tgtgagaata attcttgaat ctatctatga accggtattc gaagatgtgt 7260 ctcacggttt tagacctcaa cgaagctgtc acacagcttt gaaaacaatc aaaagagagt 7320 ttggcggcgc aagatggttt gtggagggag atataaaagg ctgcttcgat aatatagacc 7380 acgttacact cattggactc atcaatctta aaatcaaaga tatgaaaatg agccaattga 7440 tttataaatt tctaaaagca ggttatctgg aaaactggca gtatcacaaa acttacagcg 7500 gaacacctca aggtggaatt ctatctcctc ttttggccaa catctatctt catgaattgg 7560 ataagtttgt tttacaactc aaaatgaagt ttgaccgaga aagtccagaa agaataacac 7620 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Claims (20)

1. 락테이트 생합성 경로 효소에 손상 돌연변이를 포함하는, 일산화탄소영양 아세트산생성 박테리움(carboxydotrophic acetogenic bacterium).
2. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거하는, 박테리움.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리움이 친계 박테리움에 비해 감소된 양의 락테이트를 생산하는, 박테리움.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리움이 실질적으로 락테이트를 생산하지 않는, 박테리움.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리움이 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 생산하는, 박테리움.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리움이 친계 박테리움에 비해 증가된 양의 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 생산하는, 박테리움.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 효소가 자연적으로 피루베이트를 락테이트로 전환하는, 박테리움.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 효소가 락테이트 탈수소효소(LDH)인, 박테리움.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리움이 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 및 클로스트리듐 라그스달레이로 구성된 군으로부터 선택된 친계 박테리움으로부터 유도되는, 박테리움.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 친계 박테리움이 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔인 박테리움.
11. CO를 포함하는 기질의 존재 하에 청구항 1의 박테리움을 배양함으로써 상기 박테리움이 생성물을 생산하는 단계를 포함하는, 생성물의 생산 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 돌연변이가 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거하는, 방법.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 박테리움이 친계 박테리움에 비해 감소된 양의 락테이트를 생산하는, 방법.
14. 청구항 11에 있어서, 상기 박테리움이 실질적으로 락테이트를 생산하지 않는, 방법.
15. 청구항 11에 있어서, 상기 생성물이 에탄올, 2,3-부탄디올, 포르메이트, 피루베이트, 석시네이트, 발린, 류신, 이소류신, 말레이트, 푸마레이트, 2-옥소글루테레이트, 시트레이트, 및 시트라말레이트 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
16. 청구항 11에 있어서, 상기 박테리움이 친계 박테리움에 비해 증가된 양의 생성물을 생산하는, 방법.
17. 청구항 11에 있어서, 상기 효소가 자연적으로 피루베이트를 락테이트로 전환하는, 방법.
18. 청구항 11에 있어서, 상기 효소가 락테이트 탈수소효소(LDH)인, 방법.
19. 청구항 11에 있어서, 상기 박테리움이 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리, 및 클로스트리듐 라그스달레이로 구성된 군으로부터 선택된 친계 박테리움으로부터 유도되는, 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 상기 친계 박테리움이 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔인, 방법.
    

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