CN105283554A

CN105283554A - 表现出提高的通过发酵途径的通量的重组微生物

Info

Publication number: CN105283554A
Application number: CN201480031665.7A
Authority: CN
Inventors: M·考普克; A·P·穆勒
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2016-01-27
Also published as: CA2914003C; JP2016520325A; AU2018204112A1; US20150079650A1; KR20160018568A; WO2014197746A1; EP3004362A1; EP3004362A4; BR112015030208A2; AU2014274838A1; CA2914003A1; EA201592169A1

Abstract

本发明提供了通过优化酶促反应提高通过发酵途径的通量来提高发酵产物的产生的方法。具体来说，本发明涉及鉴定参与发酵途径中的代谢瓶颈的酶和/或辅因子，以及使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出所述酶中的一种或多种的活性提高，或所述辅因子中的一种或多种的利用率提高。

Description

表现出提高的通过发酵途径的通量的重组微生物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年6月5日提交的临时申请号61/831,591的优先权，该临时申请的内容在此以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及通过优化酶促反应来提高通过发酵途径的通量的方法。更具体地说，本发明涉及鉴定和解决发酵途径中的反应瓶颈。

背景技术

产乙酸型微生物已知可用于通过使包括例如一氧化碳、二氧化碳以及氢气在内的基质发酵来产生燃料和其它化学品(例如乙醇、丁醇或丁二醇)。

迄今为止用于提高产物浓度和基质利用率的努力集中在菌株选择、发酵条件和参数的优化以及培养基配方或工艺条件的优化(Abubackar等,2012)。然而，天然生物体的代谢没有进化到实现高收率、速率以及滴度的商业目标(Nielsen,2011)。虽然在生物体中某些反应的速率可以通过优化工艺条件或菌株的选择来提高，但是通常存在不受影响并且将是限速的一些反应。

在过去十年中，已经研发出许多硅片上预测工具以研究基因组规模的代谢重建。这些基于约束条件的模型使用化学计量方法来研究通过代谢网络的通量，其中所有可能的净通量分布(可行的通量空间)均由所观测到的细胞输入和输出测量结果(外部通量)以及质量平衡和热力学方程的约束。通量平衡分析(FBA)探测这一解空间以鉴定优化某些目标(通常是使生长达到最大限度)的代谢通量分布。通量平衡分析需要非常少的关于系统中的酶动力学参数和代谢物浓度的信息。然而，这种方法的一个限制因素在于它不能鉴定限速反应(瓶颈)。

本发明的目的在于提供一种提高发酵反应的效率的方法，或至少为公众提供一个有用的选择。

发明内容

在第一个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)确定发酵途径中的限速途径反应；

b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；

c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属(Clostridia)微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高，以产生发酵产物。

在第二个方面，本发明提供了一种提高通过发酵途径的通量的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；

c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高。

在第三个方面，本发明提供了一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法包括：

a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；

c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高；

其中所述发酵途径能够由包含CO的基质产生一种或多种发酵产物。

在第四个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法包括使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵以产生发酵产物，其中所述重组微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：

i)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或

ii)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种或多种辅因子的利用率提高。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成：

i)过表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体；或

ii)表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种外源性酶；或

iii)i)和ii)这两者。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物已经经受酶工程化以提高酶的活性或提高一种或多种辅因子的利用率，所述酶和所述一种或多种辅因子被鉴定为参与催化限速途径反应。在一个具体的实施方案中，酶工程化的方法选自由以下各项组成的组：定向进化、基于知识的设计、随机诱变法、基因改组、密码子优化、使用位点特异性文库以及使用位点评价文库。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成相对于亲本微生物表现出所述发酵途径的效率的提高。优选地，所述效率提高包括发酵产物的产生速率的提高。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，通过分析构成发酵途径的两种或更多种途径反应的酶活性来确定所述限速途径反应。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述限速途径反应是具有最低的酶活性的途径反应。

在第一个方面、第三个方面或第四个方面的一个具体的实施方案中，所述一种或多种发酵产物是乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸或生物聚合物中的至少一种。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述发酵途径是伍德-扬达尔(Wood-Ljungdahl)发酵途径、乙醇发酵途径或2,3-丁二醇发酵途径。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的组：醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、醛脱氢酶(酰化)(EC1.2.1.10)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。优选地，这个实施方案的微生物被适配成表现出通过引起乙醇产生的发酵途径的通量提高。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的组：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(丙酮酸合酶)(EC1.2.7.1)、丙酮酸:甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)、乙酰乳酸合酶(EC2.2.1.6)、乙酰乳酸脱羧酶(EC4.1.1.5)、2,3-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.4)、伯醇:仲醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。优选地，这个实施方案的微生物被适配成表现出通过引起2,3-丁二醇产生的发酵途径的通量提高。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表达外源性核酸或过表达内源性核酸，所述核酸涉及参与催化限速途径反应的酶或辅因子的生物合成。在一个具体的实施方案中，所述内源性核酸或外源性核酸编码选自上述酶的酶。

在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表现出一种或多种辅因子的利用率提高。所述利用率提高可以由于内源性核酸的表达发生改变或外源性核酸的表达而出现，其中所述内源性核酸或外源性核酸涉及参与催化限速途径反应的辅因子的生物合成。

在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括四氢叶酸盐(THF)。在一个具体的实施方案中，所述重组微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：GTP环化水解酶I(EC3.5.4.16)、碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)、二氢新蝶呤醛缩酶(EC4.1.2.25)、2-氨基-4-羟基-6-羟基甲基二氢蝶啶二磷酸激酶(EC2.7.6.3)、二氢蝶酸合酶(2.5.1.15)、二氢蝶酸合酶(EC2.5.1.15)、二氢叶酸合酶(EC6.3.2.12)、叶酰聚谷氨酸合酶(6.3.2.17)、二氢叶酸还原酶(EC1.5.1.3)、胸苷酸合酶(EC2.1.1.45)、或二氢单蝶呤还原酶(dihydromonapterinreductase)(EC1.5.1.-)。

在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括钴胺素(B₁₂)。在一个具体的实施方案中，所述重组微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：5-氨基乙酰丙酸合酶(EC2.3.1.37)、5-氨基乙酰丙酸:丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.43)、腺苷钴啉醇酰胺激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶(EC2.7.1.156/2.7.7.62)、腺苷钴啉醇酰胺-GDP核唑转移酶(EC2.7.8.26)、腺苷钴啉醇酰胺-磷酸合酶(EC6.3.1.10)、腺苷钴啉胺酸合酶(EC6.3.5.10)、α-核唑磷酸酶(EC3.1.3.73)、钴(I)胺素腺苷转移酶(EC2.5.1.17)、钴(II)啉酸a,c-二酰胺还原酶(EC1.16.8.1)、钴-前咕啉5A水解酶(EC3.7.1.12)、钴-前咕啉-5B(C1)-甲基转移酶(EC2.1.1.195)、钴-前咕啉-7(C15)-甲基转移酶(EC2.1.1.196)、钴螯合酶CobN(EC6.6.1.2)、钴啉酸a,c-二酰胺合酶(EC6.3.5.9/6.3.5.11)、铁蛋白(EC1.16.3.1)、谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(EC5.4.3.8)、谷氨酰基-tRNA还原酶(EC1.2.1.70)、谷氨酰基-tRNA合成酶(EC6.1.1.17)、羟基甲基胆素合酶(EC2.5.1.61)、烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶(EC2.4.2.21)、非氧依赖性粪卟啉原III氧化酶(EC1.3.99.22)、胆色素原合酶(EC4.2.1.24)、前咕啉-2脱氢酶/西罗叶绿三酸(sirohydrochlorin)亚铁螯合酶(EC1.3.1.76/4.99.1.4)、前咕啉-2/钴因子-2C20-甲基转移酶(EC2.1.1.130/2.1.1.151)、前咕啉-3B合酶(EC1.14.13.83)、前咕啉-3BC17-甲基转移酶(EC2.1.1.131)、前咕啉-4C11-甲基转移酶(EC2.1.1.133)、前咕啉-6X还原酶(EC1.3.1.54)、前咕啉-6YC5,15-甲基转移酶(EC2.1.1.132)、前咕啉-8W脱羧酶(EC1.-.-.-)、前咕啉-8X甲基变位酶(EC5.4.1.2)、西罗叶绿三酸钴螯合酶(EC4.99.1.3)、苏氨酸-磷酸脱羧酶(EC4.1.1.81)、尿卟啉原脱羧酶(EC4.1.1.37)、或尿卟啉原III甲基转移酶/合酶(EC2.1.1.107/4.2.1.75)。

在第五个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物是通过第三个方面的方法所产生的。

在第六个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：

a)在与亲本微生物相比时，一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；

b)在与亲本微生物相比时，一种或多种辅因子的利用率提高；或

c)a)和b)这两者；

其中所述酶或辅因子已经被鉴定为参与催化限速途径反应。

在第七个方面，本发明提供了根据第五个方面或第六个方面的微生物用于提高通过反应途径的通量的用途。

在第八个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)确定伍德-扬达尔发酵途径、乙醇发酵途径或2,3-丁二醇发酵途径中的限速途径反应；

c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表达或过表达编码b)的一种或多种酶或辅因子的基因或其功能上等同的变体，以产生发酵产物。

在一个具体的实施方案中，第八个方面的酶是AOR1并且所述发酵产物是乙醇。

本发明还可以被宽泛地认为在于在本申请的说明书中单独或共同提及或指示的部分、元件以及特征、所述部分、元件或特征中两种或更多种的任何或所有组合，并且在本文提到具体的整体方案并且所述整体方案在与本发明相关的领域中具有已知的等同方案的情况下，这些已知的等同方案被认为并入到本文中，如同单独地阐述这些已知的等同方案一般。

附图说明

现在将参考附图仅以举例的方式对本发明的实施方案进行描述，其中：

图1示出了乙醇生物合成途径的通量图，该通量图详述了所测量的通过一氧化碳营养型细胞经由乙酰辅酶A形成乙醇的酶活性和通量，这允许鉴定限速途径反应。箭头的厚度与特定的途径反应的活性成比例；以及

图2示出了通量图，所述通量图详述了所测量的通过一氧化碳营养型细胞经由丙酮酸盐形成2,3-丁二醇的酶活性和通量，这允许鉴定限速途径反应。

图3示出了表达质粒pMTL83157-AOR1AOR1的插入序列和启动子的序列比对，确认AOR1的两个内部NdeI位点被成功地改变并且它们不含突变。

图4示出了在质粒对照和AOR1过表达菌株这两者中预期的576bp产物的存在，这说明成功的转化以产生重组微生物。

图5示出了在对来自pMTL83157-AOR1转化体的所拯救的质粒进行NdeI和KpnI消化之后预期片段的存在。

图6示出了相对于质粒对照，AOR1的过表达(十字形，在第10天时处于上方的线)提高了自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)DSM10061的自养生长。

图7A示出了相比于具有AOR1过表达的自产乙醇梭菌重组菌株(正方形，在第10天时处于上方的线)，自产乙醇梭菌野生型菌株(十字形，在第10天时处于下方的线)中乙醇的产生。

图7B示出了相比于具有AOR1过表达的自产乙醇梭菌重组菌株(正方形，在第10天时处于上方的线)，自产乙醇梭菌野生型菌株(十字形，在第10天时处于下方的线)中乙酸盐的产生。

具体实施方式

定义

如本文所提到的“发酵途径”是使基质，优选地气体基质转化成发酵产物的生物化学反应(在本文中被称为“途径反应”)的级联。所述途径反应通常涉及酶并且可能涉及辅因子，其中所述酶或辅因子促进或提高所述途径反应的速率。

如本文所提到的“限速途径反应”是如下的反应，所述反应是发酵途径的一部分，并且是所述途径中的“瓶颈”，因此，通过所述整个途径的通量被减慢并且由所述限速途径反应的反应速率决定。在所有其它因素恒定的情况下，提高所述限速途径反应的反应速率对总体发酵途径的速率以及潜在的一种或多种发酵产物的产生具有连锁作用。在本文提到“一种”或“所述”(单数)限速途径反应的情况下，应当了解的是，多种(例如2种或更多种)限速途径反应也被包括在本发明的范围内并且这样的多种反应也可以根据本文所述的方法来确定和改变。

如本文所提到的反应“通量”指的是代谢物通过发酵途径中的一种或多种反应的流量。通过单独的途径反应的通量具有上限和下限，因此可以通过调整影响酶活性的条件或因素来使通量发生变化。调整通过一种途径反应的通量可以改变发酵途径的总通量。可以根据本领域技术人员已知的方法来测量通量。举例来说，可以使用通量平衡分析(FBA)来测量通量(Gianchandani等,2010)。在一个具体的实施方案中，使所述通量提高了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％。还可以通过代谢物和产物的水平(代谢组学)(Patti等,2012)和/或标记实验(如C13)(通量组学)(Niittylae等,2009；Tang等,2009)来测量通过所述途径的通量。

术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”(NADH)指的是NAD+(氧化形式)、NADH+H+(还原形式)或NAD+和NADH+H+这两者的氧化还原电对。

术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸”(NADPH)指的是NADP+(氧化形式)、NADPH+H+(还原形式)或NADP+和NADPH+H+这两者的氧化还原电对。

如本文所提到的“酶辅因子”或简称“辅因子”是与酶结合以促进所述酶的生物功能并且因此促进反应催化的非蛋白化合物。辅因子的非限制性实例包括NAD+、NADP+、钴胺素、四氢叶酸盐以及铁氧还蛋白。辅因子的总利用率的提高可以提高途径反应的速率。可以影响辅因子的产生的因素包括辅因子生物合成基因的表达，所述表达可以被改变以实现所述辅因子的利用率的提高。还可以使用本领域技术人员已知的其它因素来实现所述辅因子的利用率的提高。缺乏对辅因子的利用可能对途径反应具有限速影响。用于确定辅因子的利用率的方法将是本领域技术人员已知的。

术语“被适配成”在本文可以用于描述本发明的重组微生物的功能；例如，所述微生物“被适配成”表达特定的酶。在关于酶的表达使用时，所述术语并不表示所述酶被连续地表达，它意图涵盖其中所述酶可以被表达并且这样的表达可以是组成型表达或诱导型表达的情形。

如本文所提到的“发酵液”是至少包含营养素和微生物细胞的培养基。

术语“提高效率”、“提高的效率”等在关于发酵途径或发酵过程使用时包括但不限于以下各项中的至少一项：实现发酵的微生物的生长速率提高；在升高的产物浓度下生长速率或产物产生速率提高；发酵液中发酵产物的浓度提高；每单位体积的所消耗的基质所产生的发酵产物的体积提高；发酵产物的产生速率或产生水平提高。效率的提高是相对于如在使用亲本微生物时所测量的相应变量来测量的。

“酶活性”、“一种或多种酶的活性”以及类似短语应当被宽泛地认为指的是酶活性，包括但不限于单独的酶的活性、酶的量、或酶的利用率。因此，在提到“提高”酶活性的情况下，它应当被认为包括单独的酶的活性提高、酶的量提高、或酶的利用率提高以催化特定的反应。

短语“参与催化”意图涵盖直接催化反应(即促进或提高所述反应的速率)的酶以及没有直接催化反应，但是促进相关酶的生物功能的辅因子。

短语“包含一氧化碳的基质”和类似术语应当被理解为包括例如其中一氧化碳可供一种或多种细菌菌株使用以进行生长和/或发酵的任何基质。

短语“包含一氧化碳的气体基质”以及类似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，所述基质含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO、以及40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述基质包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。

虽然所述基质未必含有任何氢气，但H₂的存在不应当会对根据本发明的方法的产物形成有害。在具体实施方案中，氢气的存在使得产生醇的总效率提高。举例来说，在具体实施方案中，所述基质可以包含约2:1、或1:1、或1:2比率的H₂:CO。在一个实施方案中，所述基质包含约30体积％或更少的H₂、20体积％或更少的H₂、约15体积％或更少的H₂、或约10体积％或更少的H₂。在其它实施方案中，所述基质流包含低浓度的H₂，例如少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％、或少于1％，或基本上不含氢气。所述基质还可以含有一定的CO₂，例如像约1体积％至约80体积％的CO₂、或1体积％至约30体积％的CO₂。在一个实施方案中，所述基质包含少于或等于约20体积％的CO₂。在具体实施方案中，所述基质包含少于或等于约15体积％的CO₂、少于或等于约10体积％的CO₂、少于或等于约5体积％的CO₂或基本上不含CO₂。

在随后的说明中，在对“含有CO的气体基质”进行输送和发酵方面对本发明的实施方案进行描述。然而，应当了解的是，所述气体基质可以替代的形式提供。举例来说，所述含有CO的气体基质可以溶解于液体中的形式提供。基本上，使用含有一氧化碳的气体使液体饱和，然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说，可以使用微泡分散发生器(Hensirisak等,用于需氧发酵的微泡分散发生器的按比例放大(Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation)；AppliedBiochemistryandBiotechnology,第101卷,第3期/2002年10月)。再举例来说，可以使所述含有CO的气体基质吸附到固体载体上。这些替代方法由术语“含有CO的基质”等的使用所涵盖。

在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气体基质是工业尾气或废气。“工业废气或尾气”应当被宽泛地认为包括由工业过程产生的任何包含CO的气体并且包括由于铁金属产品制造、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产以及焦炭制造所产生的气体。另外的实例可能提供于本文其它地方。

除非上下文另有要求，否则如本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意图涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段这两者。如还将在本文所描述，在一些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，向发酵反应物中添加金属或组合物应当被理解为包括向这些反应器中的任一个或这两个中添加。

术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，它包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、或适用于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，在提到向生物反应器或发酵反应物中添加基质时，在适当时应当被理解为包括向这些反应器中的任一个或这两个中添加。

如本文所提到的“穿梭微生物”是表达甲基转移酶并且不同于目的微生物的微生物。

如本文所提到的“目的微生物”是表达被包括在表达构建体/载体上的基因并且不同于穿梭微生物的微生物。

“外源性核酸”是如下的核酸，所述核酸源于它们被引入的微生物的外部。外源性核酸可以来源于任何适当的来源，包括但不限于它们欲被引入的微生物(例如在产生重组微生物的亲本微生物中)、不同于它们要被引入的生物体的微生物的菌株或菌种，或者它们可以人工或重组方式形成。在一个实施方案中，所述外源性核酸表示在它们欲被引入的微生物内天然存在的核酸序列，并且它们被引入以提高特定基因的表达或过表达特定基因(例如通过增加所述序列(例如基因)的拷贝数，或引入强启动子或组成型启动子以提高表达)。在另一个实施方案中，所述外源性核酸表示在它们欲被引入的微生物内并非天然存在的核酸序列并且允许在所述微生物内并非天然存在的产物表达或提高所述微生物原生的基因的表达(例如在引入诸如启动子之类的调节元件的情况下)。所述外源性核酸可以被适配成整合到它欲被引入的微生物的基因组中或保持在染色体外的状态。

“外源性”也可以被用于指蛋白质。这指的是在产生重组微生物的亲本微生物中不存在的蛋白质。

如本文关于重组微生物和核酸或蛋白质所用的术语“内源性”指的是产生重组微生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白质。

氧化还原酶(或脱氢酶、氧化酶)包括催化电子从一种分子，即还原剂(也被称为电子供体)转移到另一种分子，即氧化剂(也被称为电子受体)的酶。氧化还原酶在酶的EC号分类中被分类为EC1。

应当了解的是，本发明可以使用如下的核酸来实施，所述核酸的序列不同于本文所具体举例说明的序列，前体条件是它们发挥基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列来说，这意味着所编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列，变体序列将能够促进一种或多种基因表达。这些核酸在本文可以被称为“功能上等同的变体”。举例来说，核酸的功能上等同的变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、插入、核苷酸取代等)和/或多态性的基因等。来自其它微生物的同源基因也可以被认为是本文所具体举例说明的序列的功能上等同的变体的实例。这些包括诸如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、杨氏梭菌(C.ljungdahli)之类的菌种中的同源基因，关于这些基因的详情可在诸如基因库(Genbank)或NCBI等网站上公开获得。短语“功能上等同的变体”还应当被认为包括序列由于针对特定的生物体进行密码子优化而发生改变的核酸。本文的核酸的“功能上等同的变体”优选地将与所鉴定出的核酸具有至少约70％，优选地约80％，更优选地约85％，优选地约90％，优选地约95％或更大的核酸序列同一性。

还应当了解的是，本发明可以使用如下的多肽来实施，所述多肽的序列不同于本文所具体提到或举例说明的多肽的氨基酸序列。这些变体在本文可以被称为“功能上等同的变体”。蛋白质或肽的功能上等同的变体包括与所鉴定出的蛋白质或肽共有至少40％，优选地50％，优选地60％，优选地70％，优选地75％，优选地80％，优选地85％，优选地90％，优选地95％或更大的氨基酸同一性的那些蛋白质或肽并且与所关注的肽或蛋白质具有基本上相同的功能。这些变体在它们的范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包含多肽的截短形式，在所述截短形式中，缺失可以是1至5个、1至10个、1至15个、1至20个、1至25个氨基酸，并且可以在多肽的任何一个末端处从残基1延伸到残基25，并且其中缺失可以具有所述范围内的任何长度；或可以位于内部位置。本文的特定多肽的功能上等同的变体还应当被认为包括由例如如前一段落中所举例说明的其它细菌菌种中的同源基因表达的多肽。

如本文所用的“基本上相同的功能”意图意指作为变体的核酸或多肽能够发挥产生它的核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变体将能够与该酶催化相同的反应。然而，它不应当被认为意指所述变体与产生所述变体的多肽或核酸具有相同的活性水平。

可以使用本领域技术人员已知的方法来评估功能上等同的变体与产生所述变体的核酸或多肽是否具有基本上相同的功能。然而，举例来说，测试氢化酶、甲酸脱氢酶或亚甲基-THF脱氢酶活性的测定描述于Huang等(2012)中。

“过表达(over-express)”、“过表达(overexpression)”以及类似术语和短语在关于本发明使用时应当被宽泛地认为包括在相同条件下一种或多种蛋白质的表达(包括编码其的一种或多种核酸的表达)与亲本微生物的所述蛋白质(包括核酸)的表达水平相比的任何提高。它不应当被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何特定的水平表达。

“重组微生物”是在与亲本微生物相比时已经经受有意的遗传修饰的微生物。“遗传修饰”应当被宽泛地理解并且包括例如核酸的插入、缺失或取代。

“亲本微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是在自然界中存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经经过修饰的微生物(即它是重组微生物)。本发明的重组微生物可以被修饰以表达或过表达在亲本微生物中没有表达或没有过表达到所需水平的一种或多种酶，或可以被修饰以表现出一种或多种辅因子的利用率提高。

术语核酸“构建体”或“载体”和类似术语应当被宽泛地认为包括适于用作运载体将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)。所述术语应当被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒以及人工染色体。构建体或载体可以包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体的实施方案中，构建体或载体被适配成允许由所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸核酸，以及使用一种或多种试剂配制以促进向细胞中的递送的核酸(例如与脂质体缀合的核酸、含有所述核酸的生物体)。所述载体可以用于克隆或表达核酸以及用于使微生物转化以产生重组微生物。

发酵途径的效率可以通过提高通过所述途径的反应通量来提高。通量提高会引起以下各项中的一项或多项：实现发酵的微生物的生长速率提高；在升高的产物浓度下生长速率和/或产物产生速率提高；发酵液中发酵产物的浓度提高；每单位体积的所消耗的基质所产生的发酵产物的体积提高；发酵产物的产生速率或产生水平提高。优选地，效率提高使得发酵产物的产生速率提高。

本申请的发明人已经证实了鉴定发酵途径中的限速途径反应的方法，其中特定的途径反应影响通过所述整个途径的通量。在一些情况下，这些限速途径反应没有进行到它们的最大限度并且可能期望提高它们单独的速率。如本文所述的本发明使得能够鉴定发酵途径中的限速途径反应(即瓶颈)以及使用策略来提高参与所述限速途径反应的酶的活性和/或辅因子的利用率。本发明因此有助于鉴定所述瓶颈以及调整所述限速途径反应的速率以对通过所述途径的反应通量具有随之而来的影响。这是首次鉴定出限速途径反应并且使用重组一氧化碳营养型微生物来解决。

鉴定限速反应(瓶颈)的一种方法在于测量涉及从基质到产物的发酵途径的所有反应的酶活性。这可以通过分析在工艺条件下生长的细胞中的反应的酶活性以鉴定出具有最低速率的反应来进行。然后可以对这些反应进行调整以使得它们不具有限速性，从而提高整个系统中的通量。这种途径分析和瓶颈去除还从未在梭菌属菌种中被实施过。

本文所述的方法和重组微生物使得能够对另外的生物化学途径进行研究并且产生理想的发酵产物。所述方法对于其中亲本微生物中的产物收率可能没有达到欲作为可行目标的产物收率或所述收率低到不可检出的途径具有特别的效用。

本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)确定发酵途径中的限速途径反应；

c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提高，以产生发酵产物。

本发明还提供了一种提高通过发酵途径的通量的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；

本申请的发明人已经分析了参与发酵途径的酶的活性并且发现一些途径反应与同一途径中的其它反应相比表现出显著更低的酶活性。这表明所述途径反应限制了通过发酵途径的总通量并且提供了一种鉴定限速途径反应的方法。

可以通过本领域技术人员已知的方法来测量酶活性。在一个具体的实施方案中，酶活性是通过Huang等(2012)中所述的方法来测量的并且在实施例1中被提到。

适合进行酶活性分析的发酵途径的实例包括伍德-扬达尔途径；产生乙醇、2,3-丁二醇或其前体，如乙酰辅酶A和丙酮酸盐的发酵途径；以及在发酵途径中可能需要的辅因子四氢叶酸盐和钴胺素(B₁₂)的生物合成途径。

伍德-扬达尔途径由许多由如图1和图2中所述的酶催化的反应构成。在伍德-扬达尔途径之后使得理想的发酵产物产生的步骤也被认为是发酵途径的一部分。

在一个具体的实施方案中，所述发酵途径使得选自由以下各项组成的组的发酵产物产生：乙醇、丁醇、丙酮、异丙醇、异丁醇、2,3-丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸、以及生物聚合物。

在一个实施方案中，为了确定所述途径反应中的一种或多种是否限制了通过发酵途径的通量率，对催化至少两种或更多种单独的途径反应的酶的酶活性进行比较。如果在比较时发现一种或多种酶与同一反应途径中的其它酶相比表现出更小的活性，那么这表明所述反应没有进行到最大限度。在一个具体的实施方案中，所述酶的活性比所述途径中其它酶的活性小了5％、10％或20％。在一个具体的实施方案中，所述活性小了69％。在另一个实施方案中，所述活性小了86％。在另一个实施方案中，所述活性小了90％，或活性的差异大于90％。

因而，在一个具体的实施方案中，通过分析构成发酵途径的两种或更多种途径反应的酶活性，然后将具有更低的/最低的活性的酶指定为限速途径反应来确定限速途径反应。

酶活性的缺乏可能由许多因素所引起，包括：缺乏游离酶来催化反应；竞争性基质对酶的抑制或使酶失活；缺乏辅因子来促进反应或缺乏酶底物。

本发明还提供了解决限速途径反应的问题的方法。限速途径反应中酶活性的不足可以通过提供重组梭菌属微生物来解决，所述微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：i)参与所述限速途径反应的酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)参与所述限速途径反应的辅因子的利用率提高。这使得通过所述途径的通量总体提高。

因此，本发明提供了一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法包括：

a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；

在本发明的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成进行以下各项中的至少一项：

i)过表达参与催化限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体；

ii)表达参与催化限速途径反应的一种或多种外源性酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体；或

iii)具有参与催化限速途径反应的一种或多种辅因子的提高的利用率。

以这种方式，本申请的发明人已经证实一种以如下的方式克服以下各项中的至少一项的方法：i)酶活性低或缺乏；或ii)辅因子的利用率低或缺乏，所述方式提高通过发酵途径的通量并且最终提高发酵的效率。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的组：醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、醛脱氢酶(酰化)(EC1.2.1.10)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。优选地，这个实施方案的微生物被适配成表现出通过引起乙醇产生的发酵途径的通量提高。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的组：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(丙酮酸合酶)(EC1.2.7.1)、丙酮酸:甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)、乙酰乳酸合酶(EC2.2.1.6)、乙酰乳酸脱羧酶(EC4.1.1.5)、2,3-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.4)、伯醇:仲醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。优选地，这个实施方案的微生物被适配成表现出通过引起2,3-丁二醇产生的发酵途径的通量提高。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表达外源性核酸或过表达内源性核酸，其中所述核酸编码酶或其功能上等同的变体，或涉及辅因子的生物合成，其中所述酶或辅因子参与催化限速途径反应。

产生用于本发明中的重组微生物的方法描述于下文中。

编码上文所述的酶的核酸将是本领域技术人员已知的并且可以容易地使用基因信息数据库，如NCBI、KEGG、UniProt来鉴定。

本申请的发明人还已经惊人地发现提高辅因子利用率对通过发酵途径的总通量有影响。在这些情况下，发酵途径或这种发酵途径内的反应依赖于某种辅因子并且可能受该辅因子的利用率限制。可供用于反应中的辅因子的池可以通过改变涉及这种辅因子的生物合成途径的蛋白质和基因的表达来增加。由于辅因子利用率提高，因此依赖于这种辅因子的反应不再受到限制。

在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括四氢叶酸盐。如上文所指出，可以使参与这种辅因子的生物合成的酶过表达，优选地通过使编码所述酶的相应基因表达或过表达来实现。参与四氢叶酸盐的生物合成的酶详述于下文中。因此，在一个具体的实施方案中，所述重组微生物表现出以下各项的表达增加：GTP环化水解酶I(EC3.5.4.16)、碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)、二氢新蝶呤醛缩酶(EC4.1.2.25)、2-氨基-4-羟基-6-羟基甲基二氢蝶啶二磷酸激酶(EC2.7.6.3)、二氢蝶酸合酶(2.5.1.15)、二氢蝶酸合酶(EC2.5.1.15)、二氢叶酸合酶(EC6.3.2.12)、叶酰聚谷氨酸合酶(6.3.2.17)、二氢叶酸还原酶(EC1.5.1.3)、胸苷酸合酶(EC2.1.1.45)、二氢单蝶呤还原酶(EC1.5.1.-)。所有均涉及thf。

在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括钴胺素(B₁₂)。参与钴胺素的生物合成的酶详述于下文中。因此，在一个具体的实施方案中，所述重组微生物表现出以下各项的表达增加：5-氨基乙酰丙酸合酶(EC2.3.1.37)、5-氨基乙酰丙酸:丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.43)、腺苷钴啉醇酰胺激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶(EC2.7.1.156/2.7.7.62)、腺苷钴啉醇酰胺-GDP核唑转移酶(EC2.7.8.26)、腺苷钴啉醇酰胺-磷酸合酶(EC6.3.1.10)、腺苷钴啉胺酸合酶(EC6.3.5.10)、α-核唑磷酸酶(EC3.1.3.73)、钴(I)胺素腺苷转移酶(EC2.5.1.17)、钴(II)啉酸a,c-二酰胺还原酶(EC1.16.8.1)、钴-前咕啉5A水解酶(EC3.7.1.12)、钴-前咕啉-5B(C1)-甲基转移酶(EC2.1.1.195)、钴-前咕啉-7(C15)-甲基转移酶(EC2.1.1.196)、钴螯合酶CobN(EC6.6.1.2)、钴啉酸a,c-二酰胺合酶(EC6.3.5.9/6.3.5.11)、铁蛋白(EC1.16.3.1)、谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(EC5.4.3.8)、谷氨酰基-tRNA还原酶(EC1.2.1.70)、谷氨酰基-tRNA合成酶(EC6.1.1.17)、羟基甲基胆素合酶(EC2.5.1.61)、烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶(EC2.4.2.21)、非氧依赖性粪卟啉原III氧化酶(EC1.3.99.22)、胆色素原合酶(EC4.2.1.24)、前咕啉-2脱氢酶/西罗叶绿三酸亚铁螯合酶(EC1.3.1.76/4.99.1.4)、前咕啉-2/钴因子-2C20-甲基转移酶(EC2.1.1.130/2.1.1.151)、前咕啉-3B合酶(EC1.14.13.83)、前咕啉-3BC17-甲基转移酶(EC2.1.1.131)、前咕啉-4C11-甲基转移酶(EC2.1.1.133)、前咕啉-6X还原酶(EC1.3.1.54)、前咕啉-6YC5,15-甲基转移酶(EC2.1.1.132)、前咕啉-8W脱羧酶(EC1.-.-.-)、前咕啉-8X甲基变位酶(EC5.4.1.2)、西罗叶绿三酸钴螯合酶(EC4.99.1.3)、苏氨酸-磷酸脱羧酶(EC4.1.1.81)、尿卟啉原脱羧酶(EC4.1.1.37)、尿卟啉原III甲基转移酶/合酶(EC2.1.1.107/4.2.1.75)。

编码上述蛋白质的生物合成基因将是本领域技术人员已知的或可以容易地使用基因信息数据库来鉴定。

不希望受理论所束缚，认为辅因子的利用率的提高是经由参与所述辅因子的生物合成途径的酶或基因的过表达来实现的。因此，依赖于这种辅因子的反应不再具有限制性。

对酶进行修饰以实现更高的活性

在本发明的一个具体的实施方案中，重组微生物已经经受酶工程化以提高能够催化限速途径反应的酶的酶活性。酶工程化可以包括本领域技术人员已知的任何遗传修饰，包括但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入以及取代。实现提高的酶活性的合适的方法将是本领域技术人员已知的，但是举例来说，酶工程化的方法可以选自由以下各项组成的组：定向进化、基于知识的设计、随机诱变法、基因改组、密码子优化、使用位点特异性文库以及使用位点评价文库。

重组微生物

在另一个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物由如上文所述的方法产生，其中所述重组微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量。

在具体实施方案中，酶的表达提高和/或辅因子的利用率提高是通过编码所述酶或涉及所述辅因子的生物合成的核酸的表达和/或过表达来实现的。

在另一个方面，本发明提供了本发明的微生物用于提高通过反应途径的通量的用途。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养型梭菌的组，该组包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridiumdrakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、马氏梭菌(Clostridiummagnum)。

在一个实施方案中，所述微生物选自一群一氧化碳营养型梭菌，包括菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”以及相关的分离株。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1^T(DSM10061)(Abrini等,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌、杨氏梭菌PETC^T(DSM13528＝ATCC55383)(Tanner等,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC55989)(美国专利6,368,819)、或“拉氏梭菌P11^T”(ATCCBAA-622)(WO2008/028055)、以及相关的分离株，如“科斯卡塔梭菌(C.coskatii)”(美国专利2011/0229947)或“梭菌属菌种MT351”(Tyurin和Kiriukhin,2012)、以及其突变株，如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-AcevedoO.,使用杨氏梭菌由合成气产生生物乙醇(ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridiumljungdahlii),北卡罗莱纳州立大学的博士论文(PhDthesis,NorthCarolinaStateUniversity),2010)。

这些菌株形成了梭菌rRNA集群I(ClostridialrRNAclusterI)内的一个子集群(Collins等,1994)，在16SrRNA基因水平上具有至少99％同一性，尽管仍是独特的菌种，如由DNA-DNA复性和DNA指纹图谱实验(WO2008/028055、美国专利2011/0229947)所确定。

这个集群中的菌株由共同的特征限定，即具有相似的基因型和表型这两者，并且它们都共有相同的能量保存和发酵代谢的模式。这个集群中的菌株缺少细胞色素并且经由Rnf复合体来保存能量。

这个集群中的所有菌株均具有约4.2MBp的基因组尺寸(等,2010)以及约32摩尔％的GC组成(Tanner等,1993；Abrini等,1994；等,2010)(WO2008/028055；美国专利2011/0229947)，以及编码以下酶的保守的必要的关键基因操纵子：伍德-扬达尔途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶、以及一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(等,2010,2011)。已经发现在所有菌种中负责气体吸收的伍德-扬达尔途径基因的组织和数量是相同的，尽管在核酸序列和氨基酸序列方面存在差异(等,2011)。

这些菌株均具有相似的形态和尺寸(对数生长期的细胞是0.5-0.7×3-5μm)，是嗜温的(最佳生长温度是30℃-37℃)并且是严格厌氧菌(Tanner等,1993；Abrini等,1994)(WO2008/028055)。此外，它们均共有相同的主要系统发育性状，如相同的pH值范围(pH4-7.5，最佳的初始pH值是5.5-6)、以相似的生长速率依赖含CO的气体进行强自养生长、以及代谢谱，其中乙醇和乙酸是主要的发酵最终产物，在一定条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸(Tanner等,1993；Abrini等,1994；等,2011)(WO在对各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、或其它基质(例如甜菜碱、丁醇)的基质利用率方面有所不同。发现这些菌种中的一些对某些维生素(例如硫胺素、生物素)是营养缺陷型菌种，而其它则不是。已经证实在这些生物体中的多种生物体中将羧酸还原成它们相应的醇(Perez等,2012)。

因此，所述的性状并非是如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一种生物体所特有的，而是合成乙醇的一氧化碳营养型梭菌的一般性状。因此，预期本发明可以跨越这些菌株起作用，尽管在性能方面可能存在差异。

在某些实施方案中，亲本微生物选自包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌以及拉氏梭菌的组。在一个实施方案中，该组还包括科斯卡塔梭菌。在一个具体的实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌。

在一个实施方案中，本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物被适配成表达酶或提高辅因子的利用率，其中所述酶的表达或辅因子的利用率取决于核酸的表达。所述重组微生物还可以表达被适配成使得酶的表达和/或辅因子的利用率提高的核酸构建体或载体。在一个具体的实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而其它构建体和载体，如用于克隆的那些构建体和载体也由本发明所涵盖。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。

应当了解的是，除了启动子之外，本发明的表达构建体/载体还可以含有多种调节元件并且如果需要的话，还可以含有适用于表达另外的蛋白质的另外的基因。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括两个或更多个启动子。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个用于所欲表达的每一种基因的启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选地用于所欲表达的每一种基因的核糖体结合位点。

本领域技术人员应当了解的是，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可以含有标准的接头核苷酸，如核糖体结合位点和/或限制性酶切位点所需的那些接头核苷酸。这些接头序列不应当被解释为是必要的并且不对所限定的序列构成限制。

本发明的核酸和核酸构建体(包括表达构建体/载体)可以使用本领域中的许多标准技术来构建。举例来说，可以使用化学合成或重组技术。这些技术描述于例如Sambrook等(《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:Alaboratorymanual),纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY),1989)中。基本上，单个基因和调节元件将彼此可操作地连接以使得这些基因可以被表达以形成所需的蛋白质。用于本发明中的合适的载体将由本领域的普通技术人员所了解。然而，举例来说，以下载体可以是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750以及本文在下文的实施例部分中所举例说明的质粒。

应当了解的是，如本文所述的核酸可以呈任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。

产生重组微生物的方法

对亲本微生物进行遗传修饰的方法包括分子方法，如异源基因表达、基因组插入或缺失、改变的基因表达或基因的失活、或如本文所述的酶工程化方法。这些技术描述于例如Sambrook等(《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:Alaboratorymanual),纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社,2001)、Pleiss(2011)、Park,S.和Crochan,J.R.(2010,《蛋白质工程化和设计》(Proteinengineeringanddesign),CRC出版社(CRCPress),ISBN1420076582)中。

一种或多种外源性核酸可以裸核酸形式被递送到亲本微生物中或可以使用一种或多种试剂配制以促进转化过程(例如与脂质体缀合的核酸、含有所述核酸的生物体)。所述一种或多种核酸在适当时可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中，可以使用限制性内切酶抑制剂；参见例如Murray,N.E.等(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412。

本发明的微生物可以使用本领域已知用于产生重组微生物的多种技术用亲本微生物和一种或多种外源性核酸来制备。仅举例来说，可以通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或缀合来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术描述于例如SambrookJ,FritschEF,ManiatisT:《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:AlaboratoryManual),冷泉港的冷泉港实验室出版社,1989中。

电穿孔已经被描述用于多种一氧化碳营养型产乙酸菌，如杨氏梭菌(等,2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；(Leang等,2011)PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)(Straetz等,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1033-37)或热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)(Kita等,2012)，并且是用于许多梭菌的标准方法，如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein等,1992,Biotechnology,10,190-195)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)(Jennert等,2000,Microbiology,146:3071-3080)或热纤梭菌(C.thermocellum)(Tyurin等,2004,Appl.Environ.Microbiol.70:883-890)。原噬菌体诱导已被证实用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及粪味梭菌的情况下(PrasannaTamarapuParthasarathy,2010,在粪味梭菌ATCC25775中用于产生突变株的遗传修饰系统的研发(DevelopmentofaGeneticModificationSysteminClostridiumscatologenesATCC25775forGenerationofMutants),西肯塔基大学的硕士项目(MastersProjectWesternKentuckyUniversity))，而缀合已被描述为选用于许多梭菌的方法，包括艰难梭菌(Clostridiumdifficile)(Herbert等,2003,FEMSMicrobiol.Lett.229:103-110)或丙酮丁醇梭菌(Williams等,1990,J.Gen.Microbiol.136:819-826)，并且可以类似的方式用于一氧化碳营养型产乙酸菌。

在某些实施方案中，由于在所欲转化的微生物中具有活性的限制性内切酶系统，需要将所欲被引入到所述微生物中的核酸甲基化。这可以使用多种技术来进行，包括下文所述的那些技术。

举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物由包括以下步骤的方法来产生：

将(i)包含如本文所述的核酸的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物中；

使所述甲基转移酶基因表达；将一种或多种构建体/载体从所述穿梭微生物中分离；以及将所述一种或多种构建体/载体引入到目的微生物中。

在一个实施方案中，使步骤B的甲基转移酶基因进行组成型表达。在另一个实施方案中，诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。

穿梭微生物是促进构成表达构建体/载体的核酸序列甲基化的微生物，优选地限制性内切酶阴性微生物。在一个具体的实施方案中，穿梭微生物是限制性内切酶阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。

在将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物中之后，诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以是通过任何合适的启动子系统来实现的，尽管在本发明的一个具体的实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子并且通过添加乳糖或其类似物，更优选地异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。

在一个具体的实施方案中，甲基化构建体/载体具有复制起点，所述复制起点对穿梭微生物的身份具有特异性以使得甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表达。优选地，所述表达构建体/载体具有复制起点，所述复制起点对目的微生物的身份具有特异性以使得所述表达构建体/载体上存在的任何基因在所述目的微生物中表达。

甲基转移酶的表达使得表达构建体/载体上存在的基因甲基化。然后可以根据多种已知方法中的任一种将表达构建体/载体从穿梭微生物中分离。仅举例来说，可以使用下文所述的实施例部分中所述的方法来分离表达构建体/载体。

在一个具体的实施方案中，同时分离这两种构建体/载体。

可以使用多种已知方法将表达构建体/载体引入到目的微生物中。然而，举例来说，可以使用下文实施例部分中所述的方法。由于表达构建体/载体被甲基化，因此所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被并入到目的微生物中并且成功地表达。

可以设想的是，可以将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物中并且使其过表达。因此，在一个实施方案中，可以使用已知的方法收集所得的甲基转移酶并且将其在体外用于使表达质粒甲基化。然后可以将表达构建体/载体引入到目的微生物中以进行表达。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物的基因组中，继而将表达构建体/载体引入到所述穿梭微生物中，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体，然后将表达构建体/载体引入到目的微生物中。

可以设想的是，可以将如上文所限定的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体组合以提供物质组合物。这种组合物具有规避限制性内切酶屏障机制以产生本发明的重组微生物的特别效用。

在一个具体的实施方案中，表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。

本领域普通技术人员将了解用于产生本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可以使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和本文在下文的实施例中所述的甲基转移酶。在一个实施方案中，甲基转移酶已经描述于WO/2012/053905中。

可以使用被适配成允许甲基转移酶基因表达的多种构建体/载体以产生甲基化构建体/载体。然而，举例来说，可以使用下文实施例部分中所述的质粒。

产生方法

如本文之前所提到，本发明还提供了通过使包含CO的基质发酵产生一种或多种产物的方法。

在一个具体的实施方案中，所述包含CO的基质是包含CO的气体基质。在先前方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述基质通常将含有主要比例的CO，如至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO、以及40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述基质包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。

所述气体基质可以是作为工业过程的副产物或从某种其它来源，如从汽车尾气获得的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自由以下各项组成的组：铁金属产品制造(如钢厂)、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施方案中，可以在将含CO的气体排放到大气中之前，使用任何简便的方法从工业过程对它进行捕集。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢气的气体)的组分。由工业过程产生的CO通常被放空燃烧掉而产生CO₂，因此，本发明具有减少CO₂温室气体排放和生产生物燃料的特别效用。根据含CO的气体基质的组成，也可能期望在将它引入到发酵中之前对它进行处理以去除任何不希望有的杂质，如尘粒。举例来说，可以使用已知的方法对气体基质进行过滤或洗涤。

将了解的是，为了使细菌生长并且进行产物的产生，除了含CO的基质气体之外，还将需要将合适的液体营养培养基供给到生物反应器中。

在方法方面的具体实施方案中，所述发酵在水性培养基中进行。在方法方面的具体实施方案中，使所述基质在生物反应器中进行发酵。

可以连续、分批或分批补料方式将基质和培养基供给到生物反应器中。营养培养基将含有足以允许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适用于使用CO的发酵的厌氧培养基是本领域已知的。举例来说，合适的培养基描述于Biebel(2001)中。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如本文在下文的实施例部分中所述。

所述发酵应当理想地在用于使发酵产物进行产生的适当的发酵条件下进行。反应条件应当被认为包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH值、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜式反应器的话)、接种物水平、确保液相中的CO不会变得具有限制性的最高气体基质浓度、以及避免产物抑制的最高产物浓度。

此外，常常期望提高基质流的CO浓度(或气体基质中的CO分压)并且因此提高以CO作为基质的发酵反应的效率。在升高的压力下进行操作允许CO从气相向液相的转移速率显著提高，在所述液相中CO可以由微生物吸收作为用于产生发酵的碳源。这进而意味着在将生物反应器维持在高压而非大气压时可以缩短保留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳的反应条件将部分地取决于所使用的本发明的具体微生物。然而，一般来说，优选的是，在高于环境压力的压力下进行发酵。此外，由于给定的CO转化率部分地随基质保留时间而变化，并且实现所需的保留时间进而要求生物反应器具有所需的体积，因此使用加压系统可以大大地减小所需的生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。根据美国专利号5,593,886中所给出的实施例，可以线性比例减小反应器的体积以提高反应器的操作压力，即在10个大气压的压力下操作的生物反应器仅需要是在1个大气压的压力下操作的那些生物反应器的体积的十分之一。

举例来说，在高压下进行气体向乙醇的发酵的益处已经有所描述。举例来说，WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行的气体向乙醇的发酵，分别得到150克/升/天和369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵每天每升产生1/20至1/10的乙醇。

还期望引入含CO的气体基质的速率确保液相中CO的浓度不会成为限制性的。这是因为CO受限的条件的后果可能是一种或多种产物被培养物消耗。

用于向发酵反应中进料的气流的组成可能对该反应的效率和/或成本具有显著的影响。举例来说，O₂可能会降低厌氧发酵工艺的效率。在发酵之前或之后在发酵工艺的阶段中对不需要的或不必要的气体进行处理可能会增加这些阶段上的负担(例如在将气流在进入生物反应器中之前进行压缩的情况下，可能使用不必要的能量来压缩在发酵中不需要的气体)。因此，可能期望处理基质流，特别是来源于工业来源的基质流以去除不需要的组分并且提高合意的组分的浓度。

在某些实施方案中，将本发明的细菌的培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是厌氧微生物生长基本培养基。合适的培养基是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号5,173,429和5,593,886以及WO02/08438中，并且如本文在下文的实施例部分中所述。

此外，如果如上文所述对发酵液的pH值进行调整以增强乙酸对活性炭的吸附，那么应当在放回生物反应器中之前，将pH值重新调整到与发酵生物反应器中的发酵液的pH值类似的pH值。

实施例

实施例1-对瓶颈的鉴定

使用酶测定针对瓶颈对一氧化碳营养型细菌，如自产乙醇梭菌、杨氏梭菌或拉氏梭菌的产生乙醇和2,3-丁二醇的发酵途径进行分析。对于这一点，氧化还原酶反应是特别合适的，这是因为它们与还原或氧化可以被测量的一种或多种辅因子相关。也可以使用合成氧化还原染料，如甲基紫精或苄基紫精来实现这一目的。

测定伍德-扬达尔途径以及产生乙醇和2,3-丁二醇的发酵途径的氧化还原酶步骤以确定它们的活性。这些途径中的酶参与自养生长(包括CO、CO₂以及H₂气体的吸收和利用)以及产物的形成。

所测定的酶以及它们的活性详述于图1中。使用合成氧化还原染料作为对照来测试所进行的所有测定，所述合成氧化还原染料是甲基紫精(MV)或苄基紫精(BV)。如下文所述测试辅因子铁氧还蛋白(Fd)、NADH以及NADPH或其组合。使用来自如下文所述依赖CO和氢气进行自养生长的发酵物的粗提取物进行酶测定：

发酵

在1.5L生物反应器中在37℃和作为唯一的能量和碳源的含有CO的钢厂气体下使用自产乙醇梭菌进行发酵，如下文所述。使用发酵培养基使培养物生长，该发酵培养基每升含有：MgCl、CaCl₂(0.5mM)、KCl(2mM)、H₃PO₄(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)。将培养基转移到生物反应器中并且在121℃高压消毒45分钟。在高压消毒之后，将培养基补充以硫胺素、泛酸盐(0.05mg)、生物素(0.02mg)并且用3mM半胱氨酸-HCl还原。为了实现无氧环境，经由0.2μm过滤器将反应容器用氮气吹扫。在接种之前，将气体转变成含有CO的钢厂气体，将该气体连续地向反应器供给。进料气组成是2％H₂、42％CO、20％CO₂以及36％N₂。培养物的pH值维持在5至5.2。

收集细胞

在收集细胞(每升发酵液3.9克细胞的生物质)时，气体消耗量是5摩尔CO/升/天以及10毫摩尔H₂/升/天，产生以下代谢物：14克/升/天的乙酸盐和19.5克/升/天的乙醇。使用K₂CO₃将培养物的pH值调整到pH6并且将反应器在冰水浴中冷却。在冰上收集约1.2L的培养物。将培养物分到两个1L离心瓶中(这个步骤以及所有后续步骤是在无氧室中进行的以确保缺氧条件而避免酶的失活)并且以5000rpm使细胞沉淀10分钟。倾析出上清液，并且去除残余液体。将每一种沉淀物重悬在约30mL的含10mMDTT的50mMKPO₄(pH7.0)中。将重悬液转移到预先称重的50mLFalcon管中并且以最大速度(5000g)使细胞重新沉淀15分钟。在测定之前，将管从无氧室中取出并且立即冷冻在液氮上。

粗细胞提取物的制备和酶测定

在缺氧条件下从连续反应器中收集细胞。通过三次穿过法式压机(Frenchpress)使它们破碎，如由Huang等(2012)所述。通过在20,000×g和4℃下离心30分钟来去除未破裂的细胞和细胞碎片。使用上清液进行酶测定。除非另有说明，否则所有测定均是在37℃在被填充以0.8ml反应混合物和0.7mlN₂或H₂或CO的用橡胶塞封闭的1.5ml无氧比色皿中在1.2×10⁵Pa进行的，如由Huang等(2012)所述。如下文或Huang等(2012)所述对酶进行测定。在与酶开始反应之后，用分光光度测定法在340nm(ε＝6.2mM^-1cm^-1)或380nm(ε＝1.2mM^-1cm^-1)监测NAD(P)⁺或NAD⁺的还原，在430nm(ε_Δox-red≈13.1mM^-1cm^-1)监测巴氏梭菌(C.pasteurianum)铁氧还蛋白的还原、在578nm(ε＝9.8mM^-1cm^-1)监测甲基紫精的还原以及在578nm(ε＝8.6mM^-1cm^-1)监测苄基紫精的还原。

使用含有100mMTris/HCl(pH7.5)、2mMDTT以及约30μM铁氧还蛋白和/或1mMNAD⁺或1mMNADP⁺的测定混合物来测量CO脱氢酶。气相是100％CO。

使用100mMTris/HCl(pH7.5)或100mM磷酸钾、2mMDTT以及25μM铁氧还蛋白和/或1mMNADP⁺和/或10mM甲基紫精的测定混合物测量氢化酶活性。气相是100％H₂。

使用含有100mM磷酸钾、2mMDTT以及30mM[¹⁴C]K₂CO₃(24,000dpm/μmol)的测定混合物测量用H₂使CO₂还原成甲酸盐的甲酸-氢裂解酶活性。气相是100％H₂。将血清瓶以200rpm连续振荡以确保气相与液相的平衡。在与酶开始反应之后，每1.5分钟抽取100μl液体样品并且将其添加到容纳100μl的150mM乙酸的1.5ml安全密封微量管中以通过酸化停止反应。然后将200μl混合物在40℃孵育10分钟，同时在热混合器(Thermomixer)中以1,400rpm振荡以去除所有的¹⁴CO₂，留下所形成的¹⁴C-甲酸盐。随后，将100μl混合物添加到5ml的QuicksaveA闪烁流体(德国法兰克福的金瑟分析公司(ZinsserAnalytic,Frankfurt,Germany))中并且在BeckmanLS6500液体闪烁计数器(加利福尼亚州的富勒顿(Fullerton,CA))中分析¹⁴C放射性。

使用含有100mMTris/HCl(pH7.5)或100mM磷酸钾、2mMDTT、20mM甲酸盐以及在注明时，25μM铁氧还蛋白、1mMNADP⁺、1mMNAD⁺和/或10mM甲基紫精的测定混合物进行甲酸脱氢酶测量。气相是100％N₂。

使用含有100mMMOPS/KOH(pH6.5)、50mM2-巯基乙醇、0.4mM四氢叶酸盐、10mM甲醛以及0.5mMNADP⁺或0.5mMNAD⁺的测定混合物测量亚甲基-H₄F脱氢酶。气相是100％N₂。

在以下条件下测定亚甲基-H4F还原酶。测定混合物含有100mMTris/HCl(pH7.5)、20mM抗坏血酸盐、10μMFAD、20mM苄基紫精以及1mM甲基-H4F。在与酶开始反应之前，使用连二亚硫酸钠将苄基紫精还原到0.3的ΔA555。

使用含有100mMTris/HCl(pH7.5)、2mMDTT、1.1mM乙醛、以及约25μM铁氧还蛋白的混合物测定醛:铁氧还蛋白氧化还原酶。气相是100％N₂。

使用含有100mMTris/HCl(pH7.5)、2mMDTT、1.1mM乙醛、1mM辅酶A以及1mMNADP+或1mMNAD+的混合物测量辅酶A乙酰化乙醛脱氢酶。气相是100％N₂。

在测定中使用100mM磷酸钾(pH6)、2mMDTT、分别1.1mM的乙醛或乙偶姻以及1mMNADPH或1mMNADH来测量醇脱氢酶和丁二醇脱氢酶。气相是100％N₂。

如以及Thauer(1978)所述，将铁氧还蛋白从巴氏梭菌中纯化。

结果

测定并且成功地检测了一氧化碳营养型细菌自产乙醇梭菌的产生乙醇和2,3-丁二醇的途径中所有的氧化还原酶反应，除了本申请的发明人认为需要迄今未知的偶合位点的亚甲基-THF还原酶(等,2010；Poehlein等,2012)以外，并且这种酶的活性先前在其它生物体中不能被检测出。结果提供于图1和图2中。使用这一数据分析和确定通常将在发酵过程期间出现的这些途径中的瓶颈。

实施例2：乙醇产生的瓶颈

如在图1中所描绘的乙醇发酵途径中所看到的那样，乙醇产生的瓶颈是醇脱氢酶反应。虽然所有其它所测量的反应均至少显示出1.1U/mg的活性，但是醇脱氢酶反应步骤仅具有0.35U/mg(或31％)的总活性，即0.2U/mg(18％)用NADH并且0.15U/mg(13％)用NADPH。这比所述途径中的所有其它反应小了69％。以类似的方式，醛脱氢酶反应仅具有0.16U/mg(14％)的总活性，即0.08U/mg(7％)用NADH并且0.08U/mg(7％)用NADPH。这比所述途径中的所有其它反应小了86％。然而，这种反应可以经由乙酸盐和醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)被绕过，所述醛:铁氧还蛋白氧化还原酶具有1.9U/mg的活性并且具有经由乙酸激酶反应中的底物水平磷酸化产生ATP，从而为细胞提供更多的能量的优势。为了至少在某种程度上有助于克服这种瓶颈以及提高发酵反应的效率，可以使内源性醇脱氢酶和/或醛脱氢酶在重组微生物中过表达，或可以引入外源性醇脱氢酶和/或醛脱氢酶并且使其表达。

实施例3：通过去除瓶颈提高通过乙醇产生途径的通量

催化乙酰辅酶A向乙醛的转化以及乙醛向乙醇的转化的反应已经被鉴定为自产乙醇梭菌、杨氏梭菌或拉氏梭菌中乙醇形成中的限速步骤。这可以通过以下方式来克服：

i.使天然双功能醇/醛脱氢酶过表达，

ii.使异源性双功能醇/醛脱氢酶表达，或

iii.使异源性醛脱氢酶和醇脱氢酶表达。

这些结果可以通过使用下文所述的方法来实现。

使天然的双功能醇/醛脱氢酶在自产乙醇梭菌中过表达

选择在自产乙醇梭菌中使自产乙醇梭菌的天然双功能醇/醛脱氢酶基因(序列标识号：1)过表达以及使丙酮丁醇梭菌的异源性双功能醇/醛脱氢酶基因(基因库核酸标识号：CP002661.1以及氨基酸序列标识号：AEI34903.1)表达。

使用在Not1与Nde1限制性内切酶位点之间含有自产乙醇梭菌的自产乙醇梭菌磷酸乙酰转移酶基因的487bp启动子序列的质粒pMTL83155进行遗传修饰(如WO2012053905中所述)。在体内使用新型甲基转移酶将这种质粒甲基化，然后转化到自产乙醇梭菌中。

密码子改变的自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因的设计、合成以及克隆

使自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因的核酸序列发生密码子改变以适合于其它梭菌(序列标识号：2)并且加以合成。这样做以降低基因的染色体拷贝与游离型拷贝之间同源重组的概率。密码子改变的自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因与没有发生改变的自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因共有81％的序列同一性。使用Nde1和Nhe1限制性内切酶分离所述密码子改变的基因。使用ZYMO凝胶提取试剂盒对2613bp片段进行凝胶提取。还将质粒pMTL83155用Nde1和Nhe1限制性内切酶处理，继而用FASTAP碱性磷酸酶(富酶泰斯公司(Fermentas))处理。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁经过切割和磷酸酶处理的质粒。在16℃使用T4DNA连接酶(富酶泰斯公司)用所切割的插入序列和载体进行连接1小时，之后，使用连接混合物来转化大肠杆菌TOP10(生命科技公司(LifeTechnologies))。通过质粒分离(ZYMO质粒制备试剂盒)，用Nde1/Nhe1酶进行限制性酶切消化并且最终通过测序来针对具有正确的插入序列的质粒对TOP10集落进行筛选。

将正确的质粒pMTL83155-cod.alt.naBiAADH引入到已经含有具有甲基转移酶基因的质粒pGS20m的大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株中。

克隆丙酮丁醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因

使用来自生命科技公司的Purelink基因组DNA小型试剂盒，根据制造商的说明书来分离来自丙酮丁醇梭菌的基因组DNA。使用引物caBiAADH-F(序列标识号：7)和caBiAADH-R(序列标识号：8)以及iProofDNA聚合酶(伯乐公司(BioRad))对丙酮丁醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因进行PCR扩增。所述引物含有Nde1和Nhe1限制性内切酶位点。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁2589bpPCR产物。将PCR产物和质粒pMTL83155用Nde1和Nhe1限制性内切酶(富酶泰斯公司)处理。还将质粒用FASTAP碱性磷酸酶(富酶泰斯公司)处理。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁经过切割和磷酸酶处理的质粒和所切割的PCR产物。在16℃使用T4DNA连接酶(富酶泰斯公司)用所切割的插入序列和载体进行连接1小时，之后，使用连接混合物来转化大肠杆菌TOP10(生命科技公司)。通过质粒分离(ZYMO质粒制备试剂盒)，用Nde1/Nhe1酶进行限制性酶切消化并且最终通过测序来针对具有正确的插入序列的质粒对TOP10集落进行筛选。

将正确的质粒pMTL83155-caBiAADH引入到已经含有具有甲基转移酶基因的质粒pGS20m的大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株中。

自产乙醇梭菌的转化：

DNA的甲基化：

通过比对来自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌以及拉氏梭菌的甲基转移酶基因来设计与诱导型lac启动子(来自WO2012053905的SEQIDNo.27)融合的杂合甲基转移酶基因，如美国专利申请13/049,263中所述。甲基转移酶的表达产生具有来自WO2012053905的序列SEQIDNo.28的蛋白质。将杂合甲基转移酶基因进行化学合成并且使用EcoRI克隆到载体pGS20(德国梅尔茨豪森的ATG:biosynthetics有限公司(ATG:biosyntheticsGmbH,Merzhausen,Germany)；来自WO2012053905的SEQIDNo.29)中。将所得的甲基化质粒pGS20-甲基转移酶引入到大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株(Stratagene公司)中并且再次使用质粒pMTL83155-cod.alt.naBiAADH和pMTL83155-caBiAADH使这种转化体转化。通过添加1mMIPTG诱导体内甲基化，并且将甲基化的质粒分离(Qiagen小型制备试剂盒(Qiagenminprepkit))并且用于对自产乙醇梭菌进行电穿孔。

电穿孔：

在完全转化实验期间，使用由Hungate(1969)和Wolfe(1971)所述的标准厌氧技术，在YTF培养基(表2)中在还原剂存在下并且使用30psi钢厂废气(从位于新西兰格兰布鲁克(Glenbrook,NZ)的新西兰钢厂(NewZealandSteel)捕集；组成：44％CO、32％N₂、22％CO₂、2％H₂)在37℃培养自产乙醇梭菌。

表2：YTF培养基

培养基组分	每升原液
		酵母提取物	10g
胰蛋白胨	16g
		氯化钠	0.2g
果糖	10g
		蒸馏水	到1L

还原剂原液	每100mL原液
		NaOH	0.9g
半胱氨酸-HCl	4g
		Na₂S	4g
蒸馏水	到100mL

为了产生感受态细胞，将自产乙醇梭菌的50ml培养物传代培养到新鲜的YTF培养基中，持续连续5天。以0.05的OD_600nm使用这些细胞对50ml含有40mMDL-苏氨酸的YTF培养基进行接种。在培养物达到0.5的OD_600nm时，将细胞在冰上孵育30分钟，然后转移到无氧室中并且在4,700×g和4℃下收集。将培养物用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mMMgCl₂、7mM磷酸钠，pH7.4)洗涤两次并且最终悬浮在600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将这一混合物转移到预先冷却的容纳2μg甲基化的质粒混合物和1μl的1型限制性内切酶抑制剂(EpicentreBiotechnologies公司)的电穿孔杯(具有0.4cm电极间距)中并且立即使用基因脉冲器Xcell电穿孔系统(伯乐公司)以如下设置产生脉冲：2.5kV、600Ω以及25μF。实现3.7毫秒-4.0毫秒的时间常数。将培养物转移到5ml新鲜YTF培养基中。使用装备有管夹持器的SpectronicHeliosEpsilon分光光度计(赛默公司(Thermo))在600nm的波长下监测细胞的再生。在生物质最初下降之后，细胞再次开始生长。在相对于该点生物质加倍之后，将约200μl的培养物涂铺在含有5g/l果糖的YTF琼脂平板和PETC琼脂平板(表3)(这两者均含有1.2％Bacto^TM琼脂(碧迪公司(BD))和15μg/ml甲砜霉素(Thiamphenicol))上。在37℃在与30psi钢厂气体一起孵育3天-4天之后看到集落。

表3：PETC培养基(ATCC培养基1754；atcc.org/Attachments/2940.pdf)

沃尔夫维生素溶液	每升原液
		生物素	2mg
叶酸	2mg
		盐酸吡哆醇	10mg
盐酸硫胺素	5mg
		核黄素	5mg
烟酸	5mg
		D-(+)-泛酸钙	5mg
维生素B₁₂	0.1mg
		对氨基苯甲酸	5mg
硫辛酸	5mg
		蒸馏水	到1L

痕量金属溶液	每升原液
		次氮基三乙酸	2g
MnSO₄.H₂O	1g
		Fe(SO₄)₂(NH₄)₂.6H₂O	0.8g
CoCl₂.6H₂O	0.2g
		ZnSO₄.7H₂O	0.2mg
CuCl₂.2H₂O	0.02g
		NaMoO₄.2H₂O	0.02g
Na₂SeO₃	0.02g

NiCl₂.6H₂O	0.02g
		Na₂WO₄.2H₂O	0.02g
蒸馏水	到1L
		还原剂原液	每100mL原液
NaOH	0.9g
		半胱氨酸-HCl	4g
Na₂S	4g
		蒸馏水	到100mL

将集落划线接种在还含有5g/L果糖和15μg/ml甲砜霉素的新鲜PETC琼脂平板上。在37℃与30psi钢厂气体一起孵育2天之后，将单个集落挑取到含有5g/l果糖和15μg/ml甲砜霉素的2mlPETC液体培养基中。在进行生长时，将培养物体积连续按比例扩大到5ml、25ml，然后按比例扩大到50ml含有5g/l果糖、15μg/ml甲砜霉素以及作为碳源的30psi钢厂气体的PETC培养基。

通过分别使用以下引物进行PCR来确认转化体中质粒的身份和存在：引物fD1(序列标识号：3)和rP2(序列标识号：4)；对于质粒pMTL83155-cod.alt.naBiAADH，使用引物naBi-f(序列标识号：5)和naBi-r(序列标识号：6)，以及对于pMTL83155-caBiAADH，使用引物caBiAADH-F(序列标识号：7)和caBiAADH-R(序列标识号：8)。

使用含有pMTL83155-cod.alt.naBiAADH和pMTL83155-caBiAADH的自产乙醇梭菌进行的发酵实验

在1.5L生物反应器中在37℃和作为唯一的能量和碳源的含有CO的钢厂气体下进行发酵，如下文所述。使用确定成分培养基使培养物生长，该培养基每升含有：MgCl、CaCl₂(0.5mM)、KCl(2mM)、H₃PO₄(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)。将培养基转移到生物反应器中并且在121℃高压消毒45分钟。在高压消毒之后，将培养基补充以硫胺素、泛酸盐(0.05mg)、生物素(0.02mg)并且用3mM半胱氨酸-HCl还原。为了实现无氧环境，经由0.2μm过滤器将反应容器用氮气吹扫。在接种之前，将气体转变成含有CO的钢厂气体，将该气体连续地向反应器供给。进料气组成是2％H₂、42％CO、20％CO₂、36％N₂。培养物的pH值维持在5至5.2。将气体流量最初设定在80毫升/分钟，在中期指数生长期期间增加到200毫升/分钟，同时将搅拌从200rpm提高到350rpm。以0.25毫升/小时向生物反应器中给予Na₂S。在OD600达到0.5之后，以1.0毫升/分钟的速率(稀释率：0.96d^-1)将生物反应器转换成连续模式。当生长保持稳定时，将反应器掺杂以10g/L的乙偶姻外消旋混合物。获取培养基样品以通过HPLC测量生物质和代谢物。

通过使用装备有在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在32℃的AlltechIOA-2000有机酸柱(150×6.5mm，粒度5μm)的Agilent1100系列HPLC系统进行HPLC来对代谢物进行分析。以0.25毫升/分钟的流速使用略微酸化的水(0.005MH₂SO₄)作为流动相。为了去除蛋白质和其它细胞残余物，将400μl样品与100μl的2％(w/v)5-磺基水杨酸混合并且以14,000×g离心3分钟以分离沉淀的残余物。然后将10μl的上清液注入到HPLC中以分析关键的代谢物，如乙醇、乙酸盐、2,3-丁二醇以及乳酸盐。

自产乙醇梭菌中使乙酰辅酶A转向乙醇的限速反应由于自产乙醇梭菌的密码子改变的天然双功能醇/醛脱氢酶基因的过表达或由于异源性丙酮丁醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因的表达而得以解除。因此，预期产生乙醇的产生通量将增强并且在这些遗传修饰的自产乙醇梭菌菌株中产生更高的乙醇滴度。

异源性醛脱氢酶和醇脱氢酶在自产乙醇梭菌中的表达

为此，我们选择使来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的异源性NAD/NADH依赖性醛脱氢酶基因(基因库核酸序列标识号：NC_006526.2以及氨基酸序列标识号：YP_163331.1)和来自拜氏梭菌的NAD/NADH依赖性醇脱氢酶(基因库核酸序列标识号：CP000721.1以及氨基酸序列标识号：ABR35947.1)在自产乙醇梭菌中过表达。

密码子优化的运动发酵单胞菌醛脱氢酶基因的设计、合成以及克隆对运动发酵单胞菌醛脱氢酶基因的核酸序列进行密码子优化以在梭菌中达到最高的表达。密码子改变的自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因与没有发生改变的自产乙醇梭菌双功能醇/醛脱氢酶基因共有81％的序列同一性。使用Nde1(由富酶泰斯公司供应)和Nhe1(由富酶泰斯公司供应)限制性内切酶分离密码子优化的基因。使用ZYMO凝胶提取试剂盒对1152bp片段进行凝胶提取。还将质粒pMTL83155用Nde1和Nhe1限制性内切酶处理，继而用FASTAP碱性磷酸酶(富酶泰斯公司)处理。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁经过切割和磷酸酶处理的质粒。使用T4DNA连接酶(富酶泰斯公司)用所切割的插入序列和载体进行连接，之后，使用连接混合物来转化大肠杆菌TOP10(生命科技公司)。通过质粒分离(ZYMO质粒制备试剂盒)，用Nde1/Nhe1酶进行限制性酶切消化并且最终通过测序来针对具有正确的插入序列的质粒对TOP10集落进行筛选。

将正确的质粒pMTL83155-zmAld引入到已经含有具有甲基转移酶基因的质粒pGS20m的大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株中，如上文所阐明。

克隆拜氏梭菌醇脱氢酶基因

使用来自生命科技公司的Purelink基因组DNA小型试剂盒，根据制造商的说明书来分离来自拜氏梭菌的基因组DNA。使用引物cbAdh-F(序列标识号：9)和cbAdh-R(序列标识号：10)以及iProofDNA聚合酶(伯乐公司)对拜氏梭菌醇脱氢酶基因进行PCR扩增。所述引物含有Nde1和Nhe1限制性内切酶位点。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁2589bpPCR产物。将PCR产物和质粒pMTL83155用Nde1和Nhe1限制性内切酶(富酶泰斯公司)处理。还将质粒用FASTAP碱性磷酸酶(富酶泰斯公司)处理。使用ZYMO清洁和浓缩试剂盒清洁经过切割和磷酸酶处理的质粒和所切割的PCR产物。在16℃使用T4DNA连接酶(富酶泰斯公司)用所切割的插入序列和载体进行连接1小时，之后，使用连接混合物来转化大肠杆菌TOP10(生命科技公司)。通过质粒分离(ZYMO质粒制备试剂盒)，用Nde1/Nhe1酶进行限制性酶切消化并且最终通过测序来针对具有正确的插入序列的质粒对TOP10集落进行筛选。

将正确的质粒pMTL83155-cbAdh引入到已经含有具有甲基转移酶基因的质粒pGS20m的大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株中。

将密码子优化的运动发酵单胞菌醛脱氢酶和拜氏梭菌醇脱氢酶基因克隆到一种质粒中

将密码子优化的运动发酵单胞菌醛脱氢酶和拜氏梭菌醇脱氢酶基因在如先前所阐明的合适的限制性酶切位点之间组装在pMTL85155质粒上以在自产乙醇梭菌的磷酸乙酰转移酶启动子下形成操纵子。将所得的质粒pMTL83155-zmAld-cbAdh引入到已经含有具有甲基转移酶基因的质粒pGS20m的大肠杆菌XL1-BlueMRF'Kan菌株中。

自产乙醇梭菌的转化

通过电穿孔将质粒pMTL83155-zmAld、pMTL83155-cbAdh以及pMTL83155-zmAld-cbAdh均引入到自产乙醇梭菌中，并且对所得的集落进行筛选，如上文所阐明。

使用含有pMTL83155-zmAld、pMTL83155-cbAdh以及

pMTL83155-zmAld-cbAdh的自产乙醇梭菌转化体进行的发酵实验

如实施例1中所阐明来进行发酵。通过HPLC针对乙醇、乙酸盐、2,3-丁二醇以及乳酸盐分析发酵的不同阶段的代谢物。

类似于双功能醇/醛脱氢酶的表达，在自产乙醇梭菌中使乙酰辅酶A转向乙醇的限速步骤由于在操纵子中密码子优化的运动发酵单胞菌醛脱氢酶基因和拜氏梭菌醇脱氢酶单独或共同的表达而得以解除。因此，预期产生乙醇的产生通量将增强并且在这些遗传修饰的自产乙醇梭菌菌株中产生更高的乙醇滴度。

实施例4：2,3-丁二醇产生的瓶颈

如在图2中所看到的那样，2,3-丁二醇产生的瓶颈是由丙酮酸:铁氧还蛋白还原酶(PFOR)催化的从乙酰辅酶A到丙酮酸盐的反应。虽然所有其它所测量的反应均至少显示出1.1U/mg的活性，但是这一限速反应在铁氧还蛋白存在下仅表现出0.11U/mg(10％)的酶活性。这比所述途径中的所有其它反应小了90％。为了至少在某种程度上有助于克服这种瓶颈以及提高发酵的产物收率，可以使内源性PFOR酶过表达，或可以引入外源性PFOR酶并且使其表达。

实施例5：通过去除瓶颈提高通过2,3-丁二醇产生途径的通量

催化乙酰辅酶A向丙酮酸盐的转化的反应已经在图2中被鉴定为自产乙醇梭菌、杨氏梭菌或拉氏梭菌中2,3-丁二醇形成中的限速步骤。这可以通过使编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)的基因在自产乙醇梭菌中过表达来克服。使用密码子合成所述基因以使具有在自产乙醇梭菌中天然存在的氨基酸序列(SEQIDNO:11)的蛋白质表达。

对所述基因进行密码子优化和合成以降低与天然基因的同源性并且避免不必要的整合事件并且使有关表达的问题减到最低限度(SEQIDNO:12)。所述基因由限制性内切酶切位点XbaI(3'末端)和NheI(5'末端)侧接以亚克隆到pMTL83155中。使用XbaI和NheI(富酶泰斯公司)消化所合成的构建体和pMTL83155，并且使用T4DNA连接酶(富酶泰斯公司)将丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶基因连接到pMTL83155中。使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10(生命科技公司的英杰公司(Invitrogen,LifeTechnologies))并且通过质粒微量制备(Zymo研究公司(ZymoResearch))和限制性酶切消化(富酶泰斯公司)来鉴定含有所需质粒的集落。将所需质粒甲基化并且在自产乙醇梭菌中转化，如实施例3中所述。通过甲砜霉素抗性以及使用引物repHF(SEQIDNO:13)和CatR(SEQIDNO:14)进行PCR分析来鉴定成功的转化体，当所述质粒存在时，所述PCR分析将产生具有1584个碱基对的产物。

在容纳PETC-MES培养基的血清瓶中在钢厂气体存在下培养被鉴定为含有所需质粒的转化体，并且将通过HPLC分析测量的它们的代谢物的产生与不带有所述质粒的亲本生物体相比较。还在粗提取物中测量转化的菌株中PFOR的活性(如实施例1中所述)以确认在亲本菌株中所观测到的瓶颈被缓和。PFOR的过表达提高了细胞内的总活性，从而缓和了所述途径中的瓶颈，并且使得通过丙酮酸盐的通量提高以及2,3-丁二醇产量提高。

实施例6：增加乙酰辅酶A前体以提高总产物收率的瓶颈

如在图1和图2中所看到的那样，气体CO和H₂容易由一氧化碳营养型细菌经由分别具有2.7U/mg和2.4U/mg活性的一氧化碳脱氢酶、氢化酶和/或甲酸:氢裂解酶加以利用。然而，伍德-扬达尔途径的甲基支路的所测量的酶(甲酸脱氢酶、亚甲基-THF脱氢酶)仅显示出约1.1U/mg的活性。为了提高乙酰辅酶A(所有下游产物的前体)的水平，可以使伍德-扬达尔途径的甲基支路的内源性酶(甲酸脱氢酶、甲酰基-THF合成酶、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶、亚甲基-THF还原酶、乙酰辅酶A合酶)过表达或可以引入具有基本上相同功能的外源性酶并且使其表达。另一种策略将是通过提高所需的辅因子四氢叶酸盐和钴胺素的生物合成基因的表达来提高它们的利用率。

实施例7：解除经过优化的系统的最后的瓶颈以实现更好的产生和生长速率

先前的实施例描述了如何优化通过包括伍德-扬达尔途径以及乙醇和2,3-丁二醇发酵途径在内的系统的通量以匹配分别具有2.7U/mg和2.4U/mg的活性的一氧化碳脱氢酶、氢化酶和/或甲酸:氢裂解酶的活性。

在已经解决了这些先前的瓶颈的情况下，本申请的发明人现在转向另一种限速途径反应，即醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)反应(参见图1)。这一反应具有1.9U/mg的活性，这比一氧化碳脱氢酶的活性低了约30％。由于醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)和一氧化碳脱氢酶这两者是使用铁氧还蛋白作为辅因子的少数酶之一，因此特别重要的是，匹配这两者的活性。这是因为存在有限的铁氧还蛋白池，因此使它循环的氧化反应和还原反应应当平衡以确保所述循环的最高效率。本申请的发明人已经发现这可以通过使醛:铁氧还蛋白氧化还原酶基因(AOR1；SEQIDNo.16)过表达来实现。过表达使乙醇的产生提高了31％。解除这一瓶颈不仅提高了通过发酵实现的乙醇产生，而且还提高了生物体的生长速率，这是因为铁氧还蛋白池被更好地平衡。结果详细描述于下文中。

AOR1表达质粒的构建

通过使用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))用表4中的寡核苷酸进行PCR来从自产乙醇梭菌DSM10061的基因组DNA扩增伍德-扬达尔启动子(P_WL)(Seq.ID.15)和醛::铁氧还蛋白氧化还原酶1基因(AOR1)(Seq,ID.16)的DNA序列。使用Bertram和Dürre(1989)的修改的方法分离基因组DNA。收集100ml过夜培养物(6,000×g，15分钟，4℃)，用磷酸钾缓冲液(10mM，pH7.5)洗涤并且悬浮在1.9mlSTE缓冲液(50mMTris-HCl、1mMEDTA、200mM蔗糖；pH8.0)中。添加300μl溶菌酶(约100,000U)并且将混合物在37℃孵育30分钟，继而添加280μl的10％(w/v)SDS溶液并且再孵育10分钟。在室温下通过添加240μl的EDTA溶液(0.5M，pH8)、20μlTris-HCl(1M，pH7.5)以及10μlRNA酶A(富酶泰斯公司)来消化RNA。然后，添加100μl蛋白酶K(0.5U)并且在37℃进行蛋白水解，持续1-3小时。最终，添加600μl的高氯酸钠(5M)，继而进行苯酚-氯仿提取和异丙醇沉淀。用分光光度测定法对DNA的量和质量进行检验。使用NotI和NdeI限制性酶切位点以及大肠杆菌菌株DH5α-T1^R(英杰公司)将扩增的573bp启动子P_WL克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL83151(基因库登录号：FJ797647；Heap等,2009)中，从而产生质粒pMTL83157。由于AOR1的编码序列含有两个内部NdeI位点，因此使用拼接重叠(SOE)PCR(Warrens等,1997)去除这些NdeI位点而使密码子不发生改变。将AOR1的1849bpPCR产物和质粒pMTL83157这两者使用NdeI和EcoR1消化，并且连接以产生质粒pMTL83157-AOR1(Seq.ID.17)。使用表4中给出的寡核苷酸对表达质粒pMTL83157-AOR1的插入序列和启动子进行完全测序，并且结果确认AOR1的两个内部NdeI位点被成功地改变并且它们不含突变(图3)。

表4：用于克隆的寡核苷酸

表5：用于测序的寡核苷酸

AOR1在自产乙醇梭菌DSM10061中的过表达：

如上文所述将质粒pMTL83157和pMTL83157-AOR1引入到自产乙醇梭菌DSM10061中。使用7.5μg/mL的甲砜霉素选择自产乙醇梭菌转化体。在孵育3天之后观测集落并且将它们重新划线接种到相同的选择性琼脂培养基上以进行纯化。为了检验转化结合子的身份，进行PCR以使用引物adhE1-F(Seq.ID.No.28；ATGTGGACAAAGTTACAAAAGTTCTTGAGGAAC)和adhE1-R(Seq.ID.No.29；GTAAATATTCAAATATCAACTTTACTGCTTCAAGGGC)检测自产乙醇梭菌DSM10061的adhE1(CAETHG_3747)。图4示出了在质粒对照和AOR1过表达菌株这两者中预期的576bp产物的存在。此外，将质粒DNA从自产乙醇梭菌转化体中提取出并且转化回到大肠杆菌XL1-BlueMRF'(Stratagene公司)中，之后进行质粒限制性酶切消化分析。这通常被称为‘质粒拯救’，这是因为从梭菌中分离的质粒对于限制性酶切消化分析来说没有足够的质量。图5示出了在对来自pMTL83157-AOR1转化体的所拯救的质粒进行NdeI和KpnI消化之后预期片段的存在。

AOR1的过表达提高了生长速率：

在一式三份的250mL血清瓶中对自产乙醇梭菌质粒对照(pMTL83157)和AOR1过表达菌株(pMTL83157-AOR1)在100％CO中自养生长的能力进行测试，所述血清瓶容纳50mL的PETC培养基(表3)并且用30psiCO加压。对于这两种带有质粒的菌株，补充甲砜霉素达到7.5μg/mL的最终浓度。将400μL的活性培养物接种到每一个血清瓶中并且收集液相样品以在600nm的波长下测量OD并且通过HPLC分析代谢物。

图6示出了相对于质粒对照，催化限速途径反应的酶AOR1的过表达提高了自产乙醇梭菌DSM10061在100％CO条件下的自养生长。举例来说，AOR1过表达菌株在第13天达到1.73的峰值OD₆₀₀，而质粒对照仅在第22天实现0.78的峰值OD₆₀₀。

AOR1的过表达提高了自产乙醇梭菌的乙醇产生

此外，在100％CO中，自产乙醇梭菌的AOR1过表达菌株达到与自产乙醇梭菌野生型菌株非常类似的1.7-1.8的OD₆₀₀，但是自产乙醇梭菌的AOR1过表达菌株产生比野生型(十字形，在第10天时处于下方的线)多31％的乙醇(图7A，正方形，在第10天时处于上方的线)。乙酸盐的产生在重组微生物(图7B，正方形，在第10天时处于下方的线)与野生型微生物(图7B，十字形，在第10天时处于上方的线)之间是相似的，因此AOR过表达菌株产生高出约30％的总产物滴度。

综上所述，上述实施例表明了本申请的发明人如何已经成功地证实了如何首先鉴定限速途径反应以及参与该反应的相关酶/辅因子。其次，本申请的发明人已经产生一种重组微生物，其中所述酶表现出提高的活性，从而大大地提高了通过所述发酵途径的通量率(并且因此提高总效率)。

已经在本文中参考某些优选的实施方案对本发明进行描述以使得读者能够实施本发明而无需过多的实验。然而，本领域的普通技术人员将容易认识到，可以在某种程度上对许多组分和参数进行改变或改动或用已知的等同物替代而不脱离本发明的范围。应当了解的是，这些改动和等同物被并入本文中，如同单独地对它们进行阐述一般。提供题目、标题等以促进读者对这份文件的理解，并且不应当被视作限制本发明的范围。

在上文和下文所引用的所有申请、专利以及出版物(如果有的话)的全部公开内容在此以引用方式并入本文。然而，在本说明书中对任何申请、专利以及出版物的提及不是并且不应当被视作承认或以任何形式表明它们构成了有效的现有技术或形成世界任何国家的公知常识的一部分。

在整个本说明书以及所附的任一项权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等将被解释成具有包括性的含义而不是排他性的含义，也就是说具有“包括但不限于”的含义。

Claims

1.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括：

a)确定发酵途径中的限速途径反应；

b)鉴定参与催化所述限速途径反应的至少一种酶、辅因子或这两者；

c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属(Clostridia)微生物使包含CO的基质发酵，所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)(b)的所述至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)(b)的所述至少一种辅因子的利用率提高，以产生发酵产物。

2.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含CO的基质发酵以产生发酵产物，其中所述重组微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：

a)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或

b)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的至少一种辅因子的利用率提高。

3.一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法包括：

a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；

c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)(b)的所述至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)(b)的所述至少一种辅因子的利用率提高；

其中所述发酵途径能够由包含CO的基质产生至少一种发酵产物。

4.一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物是由如权利要求3所述的方法产生的。

5.一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生物被适配成表现出以下各项中的至少一项：

a)在与亲本微生物相比时，至少一种酶或其功能上等同的变体的活性提高；

b)在与亲本微生物相比时，至少一种辅因子的利用率提高；或

c)a)和b)这两者；

其中所述至少一种酶或辅因子已经被鉴定为参与催化限速途径反应。

6.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述限速途径反应是通过比较所述发酵途径中的两种或更多种途径反应的酶活性并且选择具有最低酶活性的途径反应来鉴定的。

7.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物被适配成：

i)过表达所述被鉴定为参与催化限速途径反应的至少一种酶或其功能上等同的变体；

ii)表达被鉴定为参与催化限速途径反应的至少一种外源性酶；或

iii)i)和ii)这两者。

8.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物已经经受酶工程化以提高所述至少一种酶的活性或提高所述至少一种辅因子的利用率。

9.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物被适配成相对于所述亲本微生物表现出所述发酵途径的效率提高。

10.如权利要求9所述的重组微生物，其中所述效率提高包括发酵产物的产生速率提高。

11.如权利要求10所述的重组微生物，其中所述发酵产物选自由以下各项组成的组：乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸、生物聚合物、以及其混合物。

12.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述限速途径反应存在于伍德-扬达尔发酵途径、乙醇发酵途径或2,3-丁二醇发酵途径中。

13.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述至少一种酶选自由以下各项组成的组：醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、醛脱氢酶(酰化)(EC1.2.1.10)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.5)、磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。

14.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述至少一种酶选自由以下各项组成的组：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(丙酮酸合酶)(EC1.2.7.1)、丙酮酸:甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)、乙酰乳酸合酶(EC2.2.1.6)、乙酰乳酸脱羧酶(EC4.1.1.5)、2,3-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.4)、伯醇:仲醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)、甲酰基-THF合成酶(EC6.3.2.17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶(EC:6.3.4.3)、亚甲基-THF还原酶(EC1.1,1.58)、CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.169)、CO脱氢酶(EC1.2.99.2)、以及氢化酶(EC1.12.7.2)。

15.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物被适配成表达外源性核酸或过表达内源性核酸，所述核酸涉及所述参与催化所述限速途径反应的至少一种酶或辅因子的生物合成。

16.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述重组微生物被适配成表现出所述至少一种辅因子的利用率提高。

17.如权利要求16所述的重组微生物，其中所述至少一种辅因子是四氢叶酸盐(THF)。

18.如权利要求17所述的重组微生物，其中所述微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：GTP环化水解酶I(EC3.5.4.16)、碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)、二氢新蝶呤醛缩酶(EC4.1.2.25)、2-氨基-4-羟基-6-羟基甲基二氢蝶啶二磷酸激酶(EC2.7.6.3)、二氢蝶酸合酶(2.5.1.15)、二氢蝶酸合酶(EC2.5.1.15)、二氢叶酸合酶(EC6.3.2.12)、叶酰聚谷氨酸合酶(6.3.2.17)、二氢叶酸还原酶(EC1.5.1.3)、胸苷酸合酶(EC2.1.1.45)、或二氢单蝶呤还原酶(EC1.5.1.-)。

19.如权利要求16所述的重组微生物，其中所述至少一种辅因子是钴胺素(B₁₂)。

20.如权利要求19所述的重组微生物，其中所述重组微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：5-氨基乙酰丙酸合酶(EC2.3.1.37)、5-氨基乙酰丙酸:丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.43)、腺苷钴啉醇酰胺激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶(EC2.7.1.156/2.7.7.62)、腺苷钴啉醇酰胺-GDP核唑转移酶(EC2.7.8.26)、腺苷钴啉醇酰胺-磷酸合酶(EC6.3.1.10)、腺苷钴啉胺酸合酶(EC6.3.5.10)、α-核唑磷酸酶(EC3.1.3.73)、钴(I)胺素腺苷转移酶(EC2.5.1.17)、钴(II)啉酸a,c-二酰胺还原酶(EC1.16.8.1)、钴-前咕啉5A水解酶(EC3.7.1.12)、钴-前咕啉-5B(C1)-甲基转移酶(EC2.1.1.195)、钴-前咕啉-7(C15)-甲基转移酶(EC2.1.1.196)、钴螯合酶CobN(EC6.6.1.2)、钴啉酸a,c-二酰胺合酶(EC6.3.5.9/6.3.5.11)、铁蛋白(EC1.16.3.1)、谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(EC5.4.3.8)、谷氨酰基-tRNA还原酶(EC1.2.1.70)、谷氨酰基-tRNA合成酶(EC6.1.1.17)、羟基甲基胆素合酶(EC2.5.1.61)、烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶(EC2.4.2.21)、非氧依赖性粪卟啉原III氧化酶(EC1.3.99.22)、胆色素原合酶(EC4.2.1.24)、前咕啉-2脱氢酶/西罗叶绿三酸亚铁螯合酶(EC1.3.1.76/4.99.1.4)、前咕啉-2/钴因子-2C20-甲基转移酶(EC2.1.1.130/2.1.1.151)、前咕啉-3B合酶(EC1.14.13.83)、前咕啉-3BC17-甲基转移酶(EC2.1.1.131)、前咕啉-4C11-甲基转移酶(EC2.1.1.133)、前咕啉-6X还原酶(EC1.3.1.54)、前咕啉-6YC5,15-甲基转移酶(EC2.1.1.132)、前咕啉-8W脱羧酶(EC1.-.-.-)、前咕啉-8X甲基变位酶(EC5.4.1.2)、西罗叶绿三酸钴螯合酶(EC4.99.1.3)、苏氨酸-磷酸脱羧酶(EC4.1.1.81)、尿卟啉原脱羧酶(EC4.1.1.37)、以及尿卟啉原III甲基转移酶/合酶(EC2.1.1.107/4.2.1.75)。