CN105624182A - 生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生产四氢叶酸的重组质粒和一种四氢叶酸高产基因工程菌。本申请还公开了上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本申请同时公开了上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产四氢叶酸的生物产品中的用途。使用本发明的重组质粒构建出来的基因工程菌的周期短、稳定性高、酶催化活力强，且培养条件简便、生产安全性高。在加入不同浓度IPTG诱导剂时，以及加入不同浓度葡萄糖时，发酵生产的四氢叶酸产量都有很大提高。因此，本发明可以作为一种高产四氢叶酸的方法，用于工业化生产，有效的满足了人体对四氢叶酸的需求。

Description

生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种用于生产四氢叶酸的重组质粒和一种高产四氢叶酸的基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备发酵生物质生产四氢叶酸的生物产品中的用途。
背景技术
叶酸(folicacid)也叫维生素B9，是一种水溶性维生素。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。
植物和微生物细胞能利用自身的喋呤、对氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸在叶酸合成酶的作用下从头合成叶酸，而人和其他高等哺乳动物缺乏完整的叶酸合成系统，只能通过食物摄取叶酸。随着科学技术的日益发展，采用一些方法来提高食物中叶酸含量具有很大的吸引力和极其重要的意义。
目前国内外主要依靠化学方法合成四氢叶酸。此过程中涉及到毒性物质，并且产品的分离纯化也有不便，整个生产流程对环境有一定的污染性，成本高。而近年来对叶酸合成代谢途径的研究较为清楚，这为通过生物工程手段进行改造以提高叶酸含量奠定了基础。相比而言，用生物方法生产四氢叶酸具有不可替代的优势，因为生物方法不像化学法一样，它对环境的污染可以减少到最低，而且对于生产工艺、反应条件、原料等方面的要求也较化学法更加简便，因此在未来有很广泛的发展前景。
目前通过代谢工程的方法已在植物中提高了多种维生素的含量，由于叶酸对人体健康的重要性及其代谢途径的明了，叶酸的生物强化进展相对比较大。所涉及到的植物包括：拟南芥、莴苣、番茄、谷类作物(水稻、玉米)、大豆。在拟南芥中Hossain等人通过大肠杆菌来源的GCHI基因folE转化拟南芥，使转基因植株的蝶呤和叶酸含量分别提高了1250倍、2-4倍(ProcNatlAcadSciUSA，2004，101：5158-5163，Hossainetal.)。在谷类作物(水稻、玉米)中Storozhenko等人考虑到植物来源的GCHI在植物体中会受到反馈抑制，为了避免pABA、蝶呤的过量积累，选择AtGCHI、AtADCS在水稻中进行胚乳特异性表达，大大提高了水稻胚乳中的叶酸含量。其中AtADCS水稻的叶酸含量降低了6倍；AtGCHI水稻的叶酸含量没有明显的变化；AtGCHI/AtADCS水稻的叶酸提高了15-100倍。与野生型中50％的叶酸被多聚谷氨酰化不同，AtGCHI/AtADCS转基因水稻中只有2.6％-14％的叶酸被谷氨酰化，说明转基因水稻中的叶酸生物利用率更高(ProcNatlAcadSciUSA，2007，101：5158-5163，Storozhenkoetal.)。
现有利用转大豆GTPCHI和ADCS基因协同增效作用提高植物叶酸含量的方法，如公布号CN201010249764.6中所述，公开的方法是构建大豆GTPCHI和ADCS基因串联的共表达载体，然后导入目的植物中共表达。转大豆GTPCHI和ADCS基因协同增效作用能够明显提高转基因植株中叶酸的含量，因此，它可以作为一种生产高含量叶酸转基因植物的方法，人类可通过饮食这类植物直接获得天然的叶酸，解决叶酸摄入缺乏的现象，并克服了长期服用叶酸片剂带来的不良副作用。
因此，在植物中构建基因表达用于高产四氢叶酸已经有了很大的进展，但是用植物作为载体有很多不足：(1)植物培养不如微生物那般快捷高效，生产周期较长。(2)对产品的实时监测也不如微生物那般便利。这导致植物中构建基因表达生产四氢叶酸很难在工业上广泛量产。
目前，利用微生物生产四氢叶酸亦是一种高产四氢叶酸新思路。将大肠杆菌叶酸代谢途径中的关键酶5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因metF插入载体pET-22b，构建重组质粒pET-22b-metF，将其转化至E.coliBL21(DE3)中获得基因工程菌，结果显示，metF在大肠杆菌中的表达对大肠杆菌生物量基本没有影响，而L-5-甲基四氢叶酸的产量提高了28％(PharmaceuticalBiotechnology，2011，18(3)：201～205，liuetal.)。把编码MTHFR全长的DNA重组到表达载体pET-28a(+)中，导入宿主菌E.coliBL21(DE3)得到重组菌，实现利用基因工程方法生产L-5-甲基四氢叶，结果显示，重组菌生产的L-5-甲基四氢叶酸量约为原始菌的2.5倍(ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics，2012，33(3)：185～198，liuetal.)。尽管目前利用微生物生产四氢叶酸的产量并不高，但是微生物法有不可替代的优势：(1)它不仅较化学法生产更加环保安全高效，而且相比于利用植株生产四氢叶酸，微生物生产周期很快，可多次循环再利用。(2)微生物法中可对生产过程中的任何环节实时监测，且利用微生物灵活高效。因此，我们尝试一种可以更加高产四氢叶酸的基因工程菌的构建。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产四氢叶酸，并降低生产成本的重组质粒和一种高产四氢叶酸的基因工程菌。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的构建方法。
本发明所用菌株是本实验室保存的野生型大肠杆菌W3110。本发明提供的重组大肠杆菌BSW03，是含有一定拷贝数的携带完整的GTP环化水解酶I、二氢新蝶呤醛缩酶(DHNA)、羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)三个基因的重组质粒的基因工程菌株W3110。
综上，本发明的基本技术构思是：将GTP环化水解酶I、二氢新蝶呤醛缩酶(DHNA)、羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)这三个酶的基因插入到质粒载体pTrc99a上，再构建工程菌BSW03，通过提高三个基因的表达以促进代谢流向四氢叶酸积累的方向，从而提高大肠杆菌BSW03生产四氢叶酸的能力。
针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有GTP环化水解酶I基因的pMD19-T载体(pMD-GTP)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括GTP环化水解酶I基因编码序列的pMD19-T载体，该基因的序列如SEQIDNo.1所示。
另一方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有二氢新蝶呤醛缩酶(DHNA)基因的pMD19-T载体(pMD-DHNA)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括二氢新蝶呤醛缩酶(DHNA)基因编码序列的pMD19-T载体，该基因的序列如SEQIDNo.2所示。
另一方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)基因的pMD19-T载体(pMD-HPPK)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)基因编码序列的pMD19-T载体，该基因的序列如SEQIDNo.3所示
另一方面，本发明提供多种重组质粒，包括将前述的重组质粒pMD-GTP和大肠杆菌质粒pTrc99a分别用双切酶酶切，将切下的GTP基因片段连接的到质粒pTrc99a中而得到的pTrc99a-G；将前述的重组质粒pMD-DHNA和前述得到的pTrc99a-G分别用双切酶酶切，将切下的DHNA基因片段连接的到质粒pTrc99a-G中而得到的pTrc99a-GD；以及将前述的重组质粒pMD-HPPK和前述得到的pTrc99a-GD分别用双切酶酶切，将切下的HPPK基因片段连接的到质粒pTrc99a-GD中而得到的pTrc99a-GDH。
另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是将前述GTP、DHNA、HPPK三个基因置于一个质粒载体上，即前述得到的pTrc99a-GDH。
另一方面，本发明提供一种四氢叶酸高产基因工程菌，所述工程菌是通过将前述的pTrc99a-GDH重组质粒转入到原始菌株大肠杆菌W3110中而得到的。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-GTP的构建方法，所述方法包括：首先设计引物：GTPup：-5′AGGCCATGGATGCCATCACTCAGTAAAGA3′-，划线处为NcoI酶切位点，GTPdown：-5′AGGGGTACCTCAGTTGTGATGACGCACAG3-′，划线处为KpnI酶切位点；以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个669bp的片段，其具体序列如SEQIDNo.1所示，用于构建所述的重组质粒pMD-GTP和下述的重组质粒pTrc99a-G、pTrc99a-GD和pTrc99a-GDH，经测序证实为GTP基因的编码序列，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-GTP。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-DHNA的构建方法，所述方法包括：首先设计引物：DHNAup：-5′AGGCCCGGGATGACTGCGACCTACACGAT3′-，划线处为SmaI酶切位点，DHNAdown：-5′AGGGGATTCCTATTCGGCGACATGCTCGA3-′，划线处为BamHI酶切位点；以苜蓿中华根瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个372bp的片段，其具体序列如SEQIDNo.2所示，用于构建所述的重组质粒pMD-DHNA和下述的重组质粒pTrc99a-GD和pTrc99a-GDH，经测序证实为DHNA基因的编码序列，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-DHNA。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-HPPK的构建方法，所述方法包括：首先设计引物：HPPKup：-5′AGGCTGCAGATGGCGAGCGTGCTGATCGC3′-，划线处为PstI酶切位点，HPPKdown：-5′AGGAAGCTTTTAACCGGTATCCGGAAGCC3-′，划线处为HindIII酶切位点；以大豆慢生根瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个492bp的片段，其具体序列如SEQIDNo.3所示，用于构建所述的重组质粒pMD-HPPK和下述的重组质粒pTrc99a-GDH，经测序证实为HPPK基因的编码序列，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-HPPK。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pTrc99a-G的构建方法，所述方法包括：将前述方法得到的质粒pMD-GTP与大肠杆菌质粒pTrc99a分别用NcoI和KpnI双切酶，将GTP基因片段插入质粒pTrc99a的酶切位点，构建所述的重组质粒pTrc99a-G。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pTrc99a-GD的构建方法，所述方法包括：将前述方法得到的质粒pMD-DHNA与前述质粒pTrc99a-G分别用SmaI和BamHI双切酶，将DHNA基因片段插入质粒pTrc99a-G的酶切位点，构建所述的重组质粒pTrc99a-GD。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pTrc99a-GDH的构建方法，所述方法包括：将前述方法得到的质粒pMD-HPPK与前述质粒pTrc99a-GD分别用PstI和HindIII双切酶，将HPPK基因片段插入质粒pTrc99a-GD的酶切位点，构建所述的重组质粒pTrc99a-GDH。
另一方面，本发明提供一种所述的高产四氢叶酸基因工程菌的制备方法，将前述重组质粒pTrc99a-GDH转入大肠杆菌W3110中，即得到所述基因工程菌。
本发明产生如下的技术效果：
本发明采用大肠杆菌基因工程菌，生产成本低，环境污染少，所发明的重组基因工程菌能够高产四氢叶酸。通过实验对比证明，插入一个酶的基因后四氢叶酸产量是25.1mg/L，能略微提高生产效率，比野生菌提高了12倍，插入两个酶的基因后叶酸产量是256.6mg/L，已经可以大幅提高生产效率，大约比野生菌提高了120倍，而插入三个酶的基因后四氢叶酸产量则是1260.4mg/L，极大的提高了生产效率，大约比野生菌提高了600倍。表明这株工程菌存在一定的应用潜力。
实验中利用IPTG即异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂，比较IPTG不同浓度时的用量，当IPTG浓度在1mM时产量最大。在三个基因都插入的情况的下，不添加IPTG时四氢叶酸产量为25.2mg/L，而加入1mM的IPTG时，产量为1260.4mg/L，比不加IPTG提高了50倍。表明IPTG能高效诱导基因表达。
实验中葡萄糖的浓度影响最终四氢叶酸的产量，当葡萄糖浓度过低时，由于葡萄糖含量的限制，菌体生长虽然不受限制，但是最终产量不高，如葡萄糖浓度在20g/L时，四氢叶酸产量为384.2mg/L。当葡萄糖浓度过高时，由于初级代谢产物大量增加，抑制细胞生长，致使最终产量降低，如葡萄糖浓度在100g/L时，四氢叶酸产量为738.1mg/L。通过比较不同葡萄糖浓度下产量的变化，得到葡萄糖浓度在60g/L时，四氢叶酸产量最高，为1260.4mg/L。
附图说明
图1是GTP基因用PCR法得到的凝胶电泳图
图2是DHNA基因用PCR法得到的凝胶电泳图
图3是HPPK基因用PCR法得到的凝胶电泳图
图4是重组质粒pTrc99a-GDH和大肠杆菌质粒pTrc99a的凝胶电泳图
图5是基因工程菌BSW03生产四氢叶酸的产量对比图
图6是基因工程菌BSW03在不同浓度IPTG诱导下的四氢叶酸产量曲线图
图7是基因工程菌BSW03在不同葡萄糖浓度下的四氢叶酸产量曲线图
具体实施方法
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施方式中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：重组质粒pMD-GTP的构建。
一、配制培养基。
LB培养基成分为含有5g/L的YeastExtract，10g/L蛋白胨和10g/LNaCl。固体培养基为液体基中加入1.5％的琼脂粉。
二、利用试剂盒提取大肠杆菌DNA基因组。
取大肠杆菌W3110的培养物1-5mL，按照细菌DNA提取试剂盒说明书对大肠杆菌W3110的DNA组进行提取。所用菌种来源于TaKaRa公司所提供的细菌基因组DNA提取试剂盒。
三、重组质粒pMD-GTP的构建。
1)用PCR法获取目的基因GTP，PCR反应体系如下：
10×Buffer 5μl
dNTP(2.5mM) 4μl
GTP Sense Primer(10μm) 5μl
GTP Antisense Primer(10μm) 5μl
Taq酶 0.3μl
大肠杆菌DNA组模板 0.5μl
ddH2O 30.2μl
总体积 50μl
2)做凝胶电泳，结果见图1，说明PCR得到了所需目的基因GTP。切胶回收纯化目的基因GTP
3)将目的基因GTP连接到pMD19-T载体，体系如下：
16℃反应180分钟，全量(6μl)加入到60μl的DH5α感受态细胞。
4)通过蓝白斑法筛选出具有pMD-GTP重组质粒的DH5α大肠杆菌；
5)对筛选出的具有pMD-GTP重组质粒的DH5α大肠杆菌进行质粒提取(本步由购于TaKaRa公司的质粒提取试剂盒来完成)，获得重组质粒pMD-GTP。
实施例2：重组质粒pMD-DHNA的构建。
一、利用试剂盒提取苜蓿中华根瘤菌DNA基因组。
取苜蓿中华根瘤菌的培养物1-5mL，按照细菌DNA提取试剂盒说明书对苜蓿中华根瘤菌的DNA组进行提取。所用菌种来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
二、重组质粒pMD-DHNA的构建。
1)用PCR法获取目的基因DHNA，PCR反应体系如下：
10×Buffer 5μl
dNTP(2.5mM) 4μl
DHNA Sense Primer(10μm) 5μl
DHNA Antisense Primer(10μm) 5μl
Taq酶 0.3μl
苜蓿中华根瘤菌DNA组模板 0.5μl
ddH2O 30.2μl5 -->
总体积 50μl
2)做凝胶电泳，结果见图2，说明PCR得到了所需目的基因DHNA。切胶回收纯化目的基因DHNA
3)将目的基因DHNA连接到pMD19-T载体，体系如下：
16℃反应180分钟，全量(6μl)加入到60μl的DH5α感受态细胞。
4)通过蓝白斑法筛选出具有pMD-DHNA重组质粒的DH5α大肠杆菌；
5)对筛选出的具有pMD-DHNA重组质粒的DH5α大肠杆菌进行质粒提取(本步由购于TaKaRa公司的质粒提取试剂盒来完成)，获得重组质粒pMD-DHNA。
实施例3：重组质粒pMD-HPPK的构建。
一、利用试剂盒提取大豆慢生根瘤菌DNA基因组。
取大豆慢生根瘤菌的培养物1-5mL，按照细菌DNA提取试剂盒说明书对大豆慢生根瘤菌的DNA组进行提取。所用菌种来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
二、重组质粒pMD-HPPK的构建。
1)用PCR法获取目的基因HPPK，PCR反应体系如下：
2)做凝胶电泳，结果见图3，说明PCR得到了所需目的基因HPPK。切胶回收纯化目的基因HPPK
3)将目的基因HPPK连接到pMD19-T载体，体系如下：
16℃反应180分钟，全量(6μl)加入到60μl的DH5α感受态细胞。
4)通过蓝白斑法筛选出具有pMD-HPPK重组质粒的DH5α大肠杆菌；
5)对筛选出的具有pMD-HPPK重组质粒的DH5α大肠杆菌进行质粒提取(本步由购于TaKaRa公司的质粒提取试剂盒来完成)，获得重组质粒pMD-HPPK。
实施例4：重组质粒pTrc99a-G的构建和表达。
一、大肠杆菌质粒pTrc99a的酶切。
pTrc99a质粒的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应37℃进行3小时后，电泳检测酶切程度。用DNA回收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP(浓度0.01U/μl)进行脱末端去磷酸化。反应按如下配比组成：
以上成分混合后在37℃反应30分钟后，再加入0.01U/μl的CIAP5μl，继续在30℃反应30分钟后加入300μl的反应终止液。然后用酚、氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷pTrc99a质粒。
二、将GTP片段连接到大肠杆菌质粒pTrc99a。
取前述得到的pMD-GTP重组质粒，用NcoI和KpnI双酶切，反应体系如下：
酶切反应在37℃进行3小时后，凝胶电泳并回收约为669bp的条带，此即为GTP插入片段。该片段与处理好的pTrc99a载体按如下方法混合后进行连接反应。
连接产物命为pTrc99a-G。
连接反应在16℃进行4小时后用于转化。
三、DNA连接产物的转化反应与阳性克隆的筛选。
感受态细胞用CaCl2法制备。选取大肠杆菌W3110制成感受态细胞，用热击法进行转化反应，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后加入800μl的LB培养基，37℃活化45分钟后涂于含100μl/ml氨苄的LB平板上37℃过夜培养。即用W3110为宿主菌得到了阳性克隆。克隆所选用的方法是双酶切，这样克隆方向确定，保证了克隆基因的读码框方向正确。
四、重组菌的生长特征和生长速率。
原始菌W3110不具有氨苄抗性，但是载体质粒pTrc99a-G上有抗氨苄的基因。因此本工程菌BSW01如果能在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上生长，就说明重组质粒pTrc99a-G已经转入到原始工程菌W3110中。将本工程菌BSW01接种于含有100μg/ml的氨苄的平板上，不能在该平板上生长的菌株说明重组质粒pTrc99a-G没有转入其中。经过24h的培养，平板上长出了25个菌落，说明该菌株在没有任何选择性压力的条件下仍十分稳定，高达87％以上。
在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上挑取BSW01单菌落，接入到20ml的并且加有氨苄1mg的LB培养基中。30℃，150转/分钟培养，12h后，按1％的接种量接入500ml并且加有氨苄25mg的LB培养基，30℃，150转/分钟培养，培养1.5h后加入IPTG0.2mM。同时设立相似培养条件下的原始工程菌W3110(培养基中不加氨苄)作为对照。每隔1h分别取样，测定菌株W3110和菌株BSW01的OD值，可以看出在加入IPTG6h后，重组菌体BSW01的生长速率开始加快了，并且指数生长末期的生物量与W3110比较有所增长。当然，当加入IPTG诱导后的4h内，因为菌体要过量表达GTP基因确定的蛋白，导致了菌体的生长速率有所下降。
五、工程菌BSW01产生的四氢叶酸产量
当菌体生长OD值为0.3时，加入IPTG诱导剂，使诱导物的终浓度为0.1mM-2mM。此时的培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为60g/L。完全厌氧的条件下发酵40小时，采用HPLC的方法检测最终四氢叶酸的产量。可以看出，BSW01生产的四氢叶酸产量为25.1mg/L，是野生型的近12倍。
实施例5：重组质粒pTrc99a-GD的构建和表达。
一、重组质粒pTrc99a-G的酶切。
pTrc99a-G质粒的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应37℃进行3小时后，电泳检测酶切程度。用DNA回收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP(浓度0.01U/μl)进行脱末端去磷酸化。反应按如下配比组成：
以上成分混合后在37℃反应30分钟后，再加入0.01U/μl的CLAP5μl，继续在30℃反应30分钟后加入300μl的反应终止液。然后用酚、氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷的pTrc99a-G质粒。
二、将DHNA片段连接到重组质粒pTrc99a-G。
取前述得到的pMD-DHNA重组质粒，用SmaI和BamHI双酶切，反应体系如下：
酶切反应在37℃进行3小时后，凝胶电泳并回收约为372bp的条带，此即为DHNA插入片段。该片段与前述pTrc99a-G载体按如下方法混合后进行连接反应。
连接产物命为pTrc99a-GD。
连接反应在16℃进行4小时后用于转化。
三、重组菌的生长。
用W3110为宿主菌得到了阳性克隆。在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上挑取BSW02单菌落，接入到20ml的并且加有氨苄1mg的LB培养基中。同前述培养，同时设立相似培养条件下的原始工程菌W3110(培养基中不加氨苄)和前述得到的BSW01作为对照。同前述方法进行，最终生产四氢叶酸。检测最终四氢叶酸的产量，可以看出，BSW02生产的四氢叶酸产量为256.6mg/L，是前述菌株BSW01的10倍多，是野生型的120多倍。
实施例6：重组质粒pTrc99a-GDH的构建和表达。
一、重组质粒pTrc99a-GD的酶切。
pTrc99a-GD质粒的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应37℃进行3小时后，电泳检测酶切程度。用DNA回收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP(浓度0.01U/μl)进行脱末端去磷酸化。反应按如下配比组成：
以上成分混合后在37℃反应30分钟后，再加入0.01U/μl的CIAP5μl，继续在30℃反应30分钟后加入300μl的反应终止液。然后用酚、氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷的pTrc99a-GD质粒。
二、将HPPK片段连接到重组质粒pTrc99a-GD。
取前述得到的pMD-HPPK重组质粒，用PstI和HindIII双酶切，反应体系如下：
酶切反应在37℃进行3小时后，凝胶电泳并回收约为492bp的条带，此即为HPPK插入片段。该片段与前述pTrc99a-GD载体按如下方法混合后进行连接反应。
连接产物命为pTrc99a-GDH，做凝胶电泳，结果见图4，其中1是插入GTP、DHNA、HPPK三个基因后的重组质粒pTrc99a-GDH的条带，2是大肠杆菌质粒pTrc99a的条带。
连接反应在16℃进行4小时后用于转化。
三、重组菌的生长
用W3110为宿主菌得到了阳性克隆。在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上挑取BSW03单菌落，接入到20ml的并且加有氨苄1mg的LB培养基中。同前述培养，同时设立相同培养条件下的原始工程菌W3110(培养基中不加氨苄)和前述得到的BSW01、BSW02作为对照。同前述方法进行，最终生产四氢叶酸。检测最终四氢叶酸的产量，可以看出，BSW03生产的四氢叶酸产量为1260.4mg/L，是前述菌株BSW1802的近5倍，是前述菌株BSW01的50多倍，是野生型的600倍。绘制四氢叶酸产量对比图，见图5。
实施例7：工程菌BSW03在不同浓度的IPTG下的四氢叶酸产量。
为了找出工程菌BSW03产四氢叶酸最适的IPTG浓度，在不同浓度的IPTG下测工程菌BSW03的四氢叶酸产量。当菌体生长OD值为0.3时，加入IPTG诱导剂，使诱导物的终浓度为0.1mM-2mM。此时的培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为60g/L。完全厌氧的条件下发酵40小时，采用HPLC的方法检测最终四氢叶酸的产量。图6显示的是分别用0.1mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mMIPTG诱导BSW03发酵40h的四氢叶酸产量，由该图得到最适的IPTG浓度为1mM，因此接下来的实验IPTG浓度均在1mM浓度下进行。
实施例8：工程菌BSW03在不同的葡萄糖浓度下的四氢叶酸产量。
为了找出工程菌BSW031产四氢叶酸最适的葡萄糖浓度，在不同葡萄糖浓度下测工程菌BSW03的四氢叶酸产量。当菌体生长OD值为0.3时，加入IPTG诱导剂1mM，此时的培养基为LB培养基。使葡萄糖浓度为20g/L-100g/L。完全厌氧的条件下发酵40小时，采用HPLC的方法检测最终四氢叶酸的产量。图7显示的是分别用20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L葡萄糖发酵40h的四氢叶酸产量，由该图得到最适的葡萄糖浓度为60g/L，因此接下来的实验葡萄糖浓度均在60g/L浓度下进行。

Claims (15)

1.一种重组质粒pMD-GTP，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQIDNo.1所示的DNA片段的pMD19-T载体。
2.一种重组质粒pMD-DHNA，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQIDNo.2所示的DNA片段的pMD19-T载体。
3.一种重组质粒pMD-HPPK，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQIDNo.3所示的DNA片段的pMD19-T载体。
4.一种重组质粒pTrc99a-G，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求1中的重组质粒pMD-GTP与大肠杆菌质粒pTrc99a分别用NcoI和KpnI双酶切，将切下的序列表SEQIDNo.1所示的DNA片段连接到质粒pTrc99a中得到的。
5.一种重组质粒pTrc99a-GD，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求2中的重组质粒pMD-DHNA与权利要求4中的重组质粒pTrc99a-G分别用SmaI和BamHI双酶切，将切下的序列表SEQIDNo.2所示的DNA片段连接到重组质粒pTrc99a-G中得到的。
6.一种重组质粒pTrc99a-GDH，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求3中的重组质粒pMD-HPPK与权利要求5中重组质粒的pTrc99a-GD分别用PstI和HindIII双酶切，将切下的序列表SEQIDNo.3所示的DNA片段连接到重组质粒pTrc99a-GD中得到的。
7.一株高产四氢叶酸基因工程菌，其特征在于：所述工程菌是通过将权利要求6的重组质粒pTrc99a-GDH转入原始菌株大肠杆菌W3110中得到的。
8.权利要求1的重组质粒pMD-GTP的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计引物：GTPup：-5′AGGCCATGGATGCCATCACTCAGTAAAGA3′-，划线处为NcoI酶切位点，GTPdown：-5′AGGGGTACCTCAGTTGTGATGACGCACAG3-′，划线处为KpnI酶切位点；以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个669bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQIDNo.1的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-GTP。
9.权利要求2的重组质粒pMD-DHNA的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计引物：DHNAup：-5′AGGCCCGGGATGACTGCGACCTACACGAT3′-，划线处为SmaI酶切位点，DHNAdown：-5′AGGGGATTCCTATTCGGCGACATGCTCGA3-′，划线处为BamHI酶切位点；以苜蓿中华根瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个372bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQIDNo.2的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-DHNA。
10.权利要求3的重组质粒pMD-HPPK的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计引物：HPPKup：-5′AGGCTGCAGATGGCGAGCGTGCTGATCGC3′-，划线处为PstI酶切位点，HPPKdown：-5′AGGAAGCTTTTAACCGGTATCCGGAAGCC3-′，划线处为HindIII酶切位点；以大豆慢生根瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个492bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQIDNo.3的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-HPPK。
11.权利要求4的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求8的方法得到的重组质粒pMD-GTP与大肠杆菌质粒pTrc99a分别用NcoI和KpnI双酶切，将序列表SEQIDNo.1所示的DNA片段插入质粒pTrc99a的酶切位点处，构建出所述重组质粒pTrc99a-G。
12.权利要求5的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求9的方法得到的重组质粒pMD-DHNA与权利要求11的方法得到的重组质粒pTrc99a-G分别用SmaI和BamHI双酶切，将序列表SEQIDNo.2所示的DNA片段插入重组质粒pTrc99a-G的酶切位点处，构建出所述重组质粒pTrc99a-GD。
13.权利要求6的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求10的方法得到的重组质粒pMD-HPPK与权利要求12的方法得到的重组质粒pTrc99a-GD分别用PstI和HindIII双酶切，将序列表SEQIDNo.3所示的DNA片段插入重组质粒pTrc99a-GD的酶切位点处，构建出所述重组质粒pTrc99a-GDH。
14.权利要求7的高产四氢叶酸基因工程菌的制备方法，其特征在于：权利要求6的重组质粒pTrc99a-GDH转入原始菌株大肠杆菌W3110中，即得到所述基因工程菌。
15.使用权利要求7的基因工程菌来发酵生产四氢叶酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生长过程中加入不同浓度的诱导剂时，以及加入不同碳源浓度时，培养生产四氢叶酸。优选的，所述碳源为葡萄糖，所述诱导剂为IPTG。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235169A (zh) * 2020-02-03 2020-06-05 昆明理工大学 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用
CN115997894A (zh) * 2022-12-06 2023-04-25 苏州金记食品有限公司 一种富含叶酸的萌芽大豆、制备方法以及应用该萌芽大豆制备的蛋白乳

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014559A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Millennium Pharmaceuticals Inc. High throughput screen for inhibitors of the folate biosynthetic pathway in bacteria
CN1513056A (zh) * 2001-05-28 2004-07-14 ��Ƥ�ɹ�˾ 生物可利用叶酸的生产
CN101381740A (zh) * 2007-09-05 2009-03-11 中国科学院过程工程研究所 用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途
CN101802203A (zh) * 2007-06-22 2010-08-11 根特大学 通过代谢工程用叶酸强化植物
CN101939441A (zh) * 2007-12-06 2011-01-05 食品和营养托浦研究所基金会 增加乳杆菌发酵瓜类汁液中的叶酸盐产生水平
CN102373185A (zh) * 2010-08-10 2012-03-14 中国农业科学院生物技术研究所 大豆叶酸合成关键酶gtpchi及其基因和应用
WO2014197746A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
CN104293817A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 重庆大学 生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014559A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Millennium Pharmaceuticals Inc. High throughput screen for inhibitors of the folate biosynthetic pathway in bacteria
CN1513056A (zh) * 2001-05-28 2004-07-14 ��Ƥ�ɹ�˾ 生物可利用叶酸的生产
CN101802203A (zh) * 2007-06-22 2010-08-11 根特大学 通过代谢工程用叶酸强化植物
CN101381740A (zh) * 2007-09-05 2009-03-11 中国科学院过程工程研究所 用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途
CN101939441A (zh) * 2007-12-06 2011-01-05 食品和营养托浦研究所基金会 增加乳杆菌发酵瓜类汁液中的叶酸盐产生水平
CN102373185A (zh) * 2010-08-10 2012-03-14 中国农业科学院生物技术研究所 大豆叶酸合成关键酶gtpchi及其基因和应用
WO2014197746A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
CN104293817A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 重庆大学 生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NONE: ""Bradyrhizobium japonicum USDA 110 DNA, complete genome"", 《GENBANK DATABASE》 *
NONE: ""Sinorhizobium meliloti 2011, complete genome"", 《GENBANK DATABASE》 *
WEI DONG等: ""Overexpression of Folate Biosynthesis Genes in Rice (Oryza sativa L.) and Evaluation of Their Impact on Seed Folate Content"", 《PLANT FOODS FOR HUMAN NUTRITION》 *
张嗣良 等: "《多尺度微生物过程优化》", 30 September 2003 *
阚静 等: ""叶酸的生物合成及其代谢工程研究进展"", 《中国生化药物杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235169A (zh) * 2020-02-03 2020-06-05 昆明理工大学 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用
CN115997894A (zh) * 2022-12-06 2023-04-25 苏州金记食品有限公司 一种富含叶酸的萌芽大豆、制备方法以及应用该萌芽大豆制备的蛋白乳

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