CN105087455A - 用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以绿针假单胞菌为菌种生产用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途；敲除绿针假单胞菌基因组中的phzH基因，即可。本发明从一株能够天然分泌吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌HT66(Pseudomonas？chlororaphis？HT66)CCTCC？NO:M2013467及其衍生物出发，利用插入突变或无痕敲除的方法将该菌株基因组中的phzH基因删除后，使其次级代谢产物由吩嗪-1-甲酰胺变成吩嗪-1-羧酸，最终获得一株能够用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株。还公布了该杀菌剂的制备方法及检测方法。

Description

用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途。

背景技术

我国作为一个人口和粮食大国，近几十年来为了解决粮食问题，大量使用化学农药来预防和控制病虫害，但也对环境造成了极大的污染，危害人类健康。据统计，我国农田的平均农药使用量是世界平均水平的2～5倍(章建森.我国农药平均用量比世界高2.5至5倍.农药市场信息，2011(7)：7)。化学农药的大量使用使许多病虫产生了严重的抗药性，防治效果不断降低。与化学农药相比，生物农药具有一些明显的产业优势，主要表现为以下几点：(a)可采用农副产品为生产原料，原料来源丰富且价格低廉；(b)生产设备通用性较好，可生产多个品种；(c)产品具有较大的开发潜力，通过基因技术和生物工程技术实现产品的再开发；(d)投资风险相对较小。因此，生物农药在农药市场的地位和作用愈来愈重要，越来越受到世界各国政府的重视。

天然吩嗪化合物是一类典型的微生物次级代谢产生的抗生素。由于吩嗪环的存在，几乎所有的吩嗪类化合物都具有一定的氧化还原活性，能够与细胞内的活性成分发生作用，进而积累多种超氧化物和过氧化物，因此具有广谱的抑制植物病原真菌的作用，且不易产生耐药性。同时，吩嗪环上的不同取代基使得各种吩嗪类化合物呈现不同颜色，在稳定性和抗菌谱上也存在一定的差异，可以作为不同的农业杀菌剂使用。天然的吩嗪类化合物有包括吩嗪-1-甲酰胺、吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪等五十多种，在防治植物真菌性病害方面起着重要的作用，具有广泛的应用价值。其中，吩嗪-1-羧酸的结构式如下：

假单胞菌，作为一类广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌，是最早发现产吩嗪化合物的菌属。其中研究最多的是人类条件致病菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，其他还包括两个亚型的恶臭假单胞菌(P.putida)，四个亚型的荧光假单胞菌(P.fluorescens)，绿针假单胞菌(P.chlororaphis)等。

有研究人员率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药——吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid，简称PCA，CAS号为2538-68-3)(专利号为CN1369566、CN200610023459.9、CN200910198664.2)，定名为“申嗪霉素”，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证(农药登记号PD20110314和PD20110315)。在许多地区进行的防治西瓜枯萎病的田间药效实验结果表明，通过苗期的灌根和发病初期叶面的喷雾，申嗪霉素对西瓜枯萎病的防治达到75％-80％。在大田推广是应用试验，申嗪霉素防治效果明显优于国内外同类产品，可有效替代国外进口产品。目前在上海、江苏、江西和湖南等地推广应用达500万亩次以上，避免经济损失5亿元。申嗪霉素因其具有广谱抑制各种农作物病院真菌，较其他药剂高效、促进农作物高产、与环境相容性好等优点，已经成为一种广谱高效防止农作物病害的新型生物农药，被农业部全国农业技术推广中心列为2011～2015年全国重点农药推广品种。2013年，何亚文分离到一株铜绿假单胞菌PA120，可以同时合成两种吩嗪衍生物——吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS号为550-89-0，简称PCN)(专利号CN201310511796.2)。

此外，吩嗪-1-羧酸的合成还可以采用化学方法。2013年，李雨等报道了一种如下所示的申嗪霉素合成方法，反应条件条件苛刻，原料价格价格相对昂贵，反应后处理繁琐(专利号CN103373967)。2014年，朱红军等以1-甲基吩嗪为原料，通过三步合成了吩嗪-1-羧酸，反应副产物多，原料转化率不高，分离纯化困难且存在环境污染的问题(CN104045601A)。目前均未见到相关专利转化或者产业化的报道。

因此，吩嗪-1-羧酸的工业化生产方法仍然是微生物合成，比如上海农乐公司的申嗪霉素系列产品。但是，目前生物合成吩嗪-1-羧酸的专利菌株均为铜绿假单胞菌，该菌属于人类的条件致病菌；此外，在这类细菌中，吩嗪-1-羧酸仅是一系列吩嗪衍生物的中间产物，因此其代谢产物多，代谢调控复杂，阻碍了其菌种改造及吩嗪-1-羧酸产量的进一步提升。

发明内容

本发明目的在于克服上述技术中利用铜绿假单胞菌生产吩嗪-1-羧酸过程中菌种致病性、代谢产物复杂、菌种改造困难等问题，提供一种利用绿针假单胞菌生产吩嗪-1-羧酸的方法。

本发明以绿针假单胞菌HT66为出发菌株，通过基因工程技术将HT66菌株中吩嗪-1-羧酸的修饰基因phzH敲除，构建HT66ΔphzH基因工程菌株，使得其次级代谢产物从吩嗪-1-甲酰胺转变成吩嗪-1-羧酸，可以用于生产申嗪霉素。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，由敲除绿针假单胞菌HT66(PseudomonaschlororaphisHT66)CCTCCNO:M2013467基因组中的phzH基因得到。

作为优选方案，所述phzH基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。

作为优选方案，所述phzH基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

作为优选方案，敲除所述phzH基因的方法包括插入突变法和无痕法。

作为优选方案，所述插入突变法敲除phzH基因包括如下步骤：

A、扩增phzH基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；

B、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入phzH基因中间，使phzH基因发生插入突变；

C、将突变后的phzH基因与HT66基因组中的phzH基因发生同源重组，根据抗性筛选出阳性克隆，即可。

作为优选方案，所述无痕法敲除phzH基因包括如下步骤：

i、扩增phzH基因片段的上下游同源臂；

ii、融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中(该质粒为假单胞菌和大肠杆菌的穿梭质粒)；

iii、使重组质粒上的phzH基因的上下游同源臂片段与HT66基因组中的phzH基因发生同源重组，筛选阳性克隆，即可。

第二方面，本发明提供一种用于制备上述的基因工程菌株的培养基，由按质量分数计的如下原料组成：

胰蛋白胨或大豆蛋白胨2.0～4.5％、甘油1.9～3.8％、硫酸镁.0.02～0.1％、.磷酸二氢钾0.01～0.1％、余量为水，PH6.8～7.5

该培养基还可以用于利用本发明的基因工程菌株发酵制备吩嗪-1-羧酸。

第三方面，本发明提供了所述的基因工程菌株在防治真菌性病害的微生物农药中的用途。

作为有选方案，所述微生物农药以吩嗪-1-羧酸为活性成分。

第四方面，本发明提供了一种利用本发明所述的基因工程菌株发酵制备吩嗪-1-羧酸的方法，包括如下步骤：

将基因工程菌株在培养基中，于20～40℃下发酵20～50h后，将培养基的pH调节至4以下，用有机溶剂进行萃取，纯化，得到吩嗪-1-羧酸。

本发明利用一株不同类型的绿针假单胞菌HT66(PseudomonaschlororaphisHT66)CCTCCNO:M2013467出发，敲除其phzH基因后，该菌只能合成吩嗪-1-羧酸，而不能将其进一步转化为吩嗪-1-甲酰胺。该菌属于植物根际促生细菌，无任何致病性报道；其发酵水平高，野生株中吩嗪衍生物的量为420mg/L，大大高于其它的绿针假单胞菌或者铜绿假单胞菌中的吩嗪合成水平；而且其原料简单易得，发酵周期短，24h就产生大量吩嗪-1-羧酸，36h可达到最高吩嗪产量；副产物少，不仅易于进行代谢工程改造，而且经过有机溶剂抽提后，产物纯度达到95％以上。因此它是吩嗪类化合物生产的理想菌种，适合大规模的开发和应用。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、用于生产吩嗪-1-羧酸的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；

2、绿针假单胞菌的代谢产物种类少，代谢调控机制相对简单，易于进行代谢工程改造；

3、本方法生产成本低：本菌株营养要求简单，原料便宜易得，且发酵液中副产物少，易于分离提取，生产工艺简单易行。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为绿针假单胞菌HT66和phzH敲除突变株中以PCR法分别扩增phzH基因及其上下游片段的电泳图。其中，从左到右依次为marker，HT66，HT66ΔphzH；

图2为绿针假单胞菌诱变高产P3株和phzH敲除突变株P3ΔphzH发酵液的对比。其中，左边为P3ΔphzH株，右边为P3株；

图3为诱变高产株P3发酵液抽提物的HPLC检测图；

图4为基因工程菌株P3ΔphzH发酵液抽提物的HPLC检测图；

图5为诱变高产株P3株的生长曲线及吩嗪产物曲线示意图；

图6为基因工程菌株P3ΔphzH的生长曲线及吩嗪产物示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的绿针假单胞菌HT66(PseudomonascholoraphisHT66)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCCNO∶M2013467。

实施例1phzH基因体外突变体的构建-插入突变

以pBS(kan)质粒为模板，PCR扩增得到卡那抗性基因kan。根据绿针假单胞菌HT66基因组中的phzH基因序列设计引物，

5’-TTAAGCTTACCCAGCCGATGGTCTATCGCTTTG-3’(HindIII,如SEQIDNO.3)和

5’-AAGAGCTCCGCGATAGCCGTGAGGGTGGTGGAGT(SacI,如SEQIDNO.4)。以HT66基因为模板，PCR扩增得到phzH基因，使用HindIII和SacI酶切后，克隆至pEX18Tc质粒的相同位点，得到重组质粒pEX18Tc-phzH。转入E.coliDH5α感受态细胞，使其具有四环素抗性。

将重组质粒pEX18Tc-phzH和卡那抗性基因kan分别用SphI酶切，回收后使用T4连接酶连接。连接产物直接42℃热激转化E.coliDH5α感受态细胞，于37℃，180转/分摇床复苏1h后，5000转/分离心5min，去除上清后用100μLLB培养基重悬，涂布于含有四环素20mg/L和卡那霉素50mg/L的抗性LB平板上，筛选阳性重组质粒pEX18Tc-phzH-kan。将重组质粒通过热激转入E.coliSM10感受态细胞中，通过含有四环素20mg/L的抗性平板筛选得到含有pEX18Tc-phzH-kan质粒的E.coliSM10细胞。

充分活化HT66菌株，并接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。将导入重组质粒pEX18Tc-phzH-kan的E.coliSM10大肠杆菌细胞接种于卡那霉素50mg/L,四环素20mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。分别取1mL绿针假单胞菌HT66菌液和2mL含pEX18Tc-phzH-kan质粒的E.coliSM10细胞液，5000转/分离心5min,用LB培养基洗涤菌体3次。分别用100μLLB培养基重悬，将HT66菌液和含pEX18Tc-phzH-kan质粒的E.coliSM10细胞菌体混合，37℃静置培养1h。取灭过菌的滤纸片于LB平板上，将混合菌液均与涂布与滤纸片上，37℃培养24h，完成质粒从SM10菌株到HT66菌株的转移。刮取滤纸片上的混合菌体，重悬与100μLLB培养基中，将混合菌液涂布于含15％蔗糖，卡那霉素50mg/L，壮观霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养3d。用无菌牙签将单克隆分别对应点在含四环素150mg/L，壮观霉素100mg/L的LB平板和含卡那霉素50mg/L，壮观霉素100mg/L的LB平板上，筛选在第一个平板上不能生长但在第二个平板上能够正常生长的单克隆即为同源重组成功的单菌落。通过PCR并测序验证重组菌株的phzH基因中插入了卡那抗性基因，将其命名为HT66ΔphzH,而野生型中则无此基因。

实施例2、phzH基因体外突变体的构建-无痕敲除

根据绿针假单胞菌HT66基因组中phzH及上下游序列设计引物，上游

CGGGATCCCGACGGGGGACCATCGTTCTAT-3’(BamHI,如SEQIDNO.5)和

5’-ATTCATTGAGGCACGCCAAG-3’(如SEQIDNO.6)，下游

5’-CTTGGCGTGCCTCAATGAATTTGGATCTCCTGCCGCTTTT-3’(如SEQIDNO.7)和5’-CCCAAGCTTGACCTTGCAGGTCGGTGCGATA-3’(HindIII，如SEQIDNO.8)，以该基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。将上下游PCR产物通过融合PCR连接，并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用BamHI和HindIII酶切，过柱回收，使用T4连接酶连接，获得体外突变质粒并转化大肠杆菌S17。

将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以HT66：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点。

在LB平板中，28℃培养24h；刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2-3d后挑取单克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培养1-2d；挑取蔗糖平板上的单克隆，分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上，培养12h-24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌株的phzH基因被敲除，并命名为HT66ΔphzH，电泳图见图1。图1中，左边基因工程菌HT66ΔphzH因为被敲除了phzH基因，因此PCR扩增产物比绿针假单胞菌HT66的片段要小2000bp左右。

实施例3、基因工程菌P3ΔphzH中吩嗪-1-羧酸的生物合成

以绿针假单胞菌HT66为对象，分别以紫外线和亚硝基胍诱变后，筛选到一株高产PCN的绿针假单胞菌P3株。将活化后的P3株以及其工程菌株P3ΔphzH，分别接种于KMB培养基(蛋白胨20.0g，甘油15.0ml，K₂HPO₄0.514g和MgSO₄0.732g每升)中，置于28℃的恒温摇床上(180转/分)培养至光密度(OD600)为0.5～2.0之间时，将上述菌液以1～10：100的体积比，加入到新配制的KMB培养基中，24～30℃进行振荡培养，摇床转速100～300转/分，培养时间为24～72h后收获菌液。取发酵液0.5mL,加入3mL乙酸乙酯，充分振荡混匀，6000转/分离心5min,取0.2mL有机相，蒸发后用甲醇溶解。使用HPLC检测发酵液中吩嗪-1-甲酰胺和吩嗪-1-羧酸。图2为P3株和P3ΔphzH发酵液的对比图。其中，左边呈黄色的为基因工程菌P3ΔphzH发酵液，主要产物为吩嗪-1-羧酸；右边呈绿色的为绿针假单胞菌P3发酵液，主要产物为吩嗪-1-甲酰胺。

HPLC检测条件：

流动相为乙腈-25mM乙酸铵，色谱柱为WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm；4.6X250mm,Shimadzu,Japan)，检测波长为254nm,检测条件：0-2min，8％乙腈-92％25mM乙酸铵，2-20min，乙腈浓度从8％升至60％，乙酸铵浓度从92％下降至40％，20-21min，8％乙腈-92％25mM乙酸铵，检测图见图3和图4。图3为绿针假单胞菌P3的发酵产物HPLC检测图，产物为吩嗪-1-甲酰胺，其保留时间为17.416min；图4为基因工程菌P3ΔphzH的发酵产物HPLC检测图，产物为吩嗪-1-羧酸，其保留时间为9.607min。

图5为P3株生长曲线及其吩嗪产量示意图，吩嗪-1-甲酰胺产量为1800ppm左右，并含产生少量吩嗪-1-羧酸；图6为P3ΔphzH生长曲线及其分嗪产量示意图，敲除phzH基因后，其发酵产物为吩嗪-1-羧酸，产量为1700ppm左右，无吩嗪-1-甲酰胺产生。敲除phzH基因，对P3株的生长情况影响不大。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，敲除绿针假单胞菌HT66(PseudomonaschlororaphisHT66)CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的phzH基因。

2.如权利要求1所述的用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，所述phzH基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，所述phzH基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.如权利要求1、2或3所述的用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，其特征在于，敲除所述phzH基因的方法包括插入突变法和无痕法。

5.如权利要求4所述的用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述插入突变法敲除phzH基因包括如下步骤：

A、扩增phzH基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；

B、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入phzH基因中间，使phzH基因发生插入突变；

C、将突变后的phzH基因与HT66基因组中的phzH基因发生同源重组，根据抗性筛选出阳性克隆，即可；

所述无痕法敲除phzH基因包括如下步骤：

i、扩增phzH基因片段的上下游同源臂；

ii、融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中；

iii、使重组质粒上的phzH基因的上下游同源臂片段与HT66基因组中的phzH基因发生同源重组，筛选阳性克隆，即可。

6.一种用于权利要求1、2或3所述的基因工程菌株的培养基，其特征在于，由按重量百分数计的如下原料组成：胰蛋白胨或大豆蛋白胨2.0～4.5％、甘油1.9～3.8％、硫酸镁.0.02～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.1％、余量为水，PH6.8～7.5。

7.一种如权利要求1所述的基因工程菌株在防治真菌性病害的微生物农药中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述微生物农药以吩嗪-1-羧酸为活性成分。

9.一种利用权利要求1、2或3所述的基因工程菌株发酵制备吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将基因工程菌株在培养基中，于20～40℃下发酵20～50h后，将培养基的pH调节至4以下，用有机溶剂进行萃取，纯化，得到吩嗪-1-羧酸。