CN112195144B - 绿针假单胞菌qohphz-3作为1-羟基-吩嗪生产工程菌株的应用 - Google Patents

绿针假单胞菌qohphz-3作为1-羟基-吩嗪生产工程菌株的应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及绿针假单胞菌作为1‑羟基吩嗪生产工程菌株的应用。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu‑1是一株筛选自潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌，经测序得知该菌株含有吩嗪合成典型基因簇phzABCDEFG，以及吩嗪类的修饰基因phzO，可以产生吩嗪‑1‑羧酸以及2‑羟基吩嗪。在前期的研究中，本发明利用来自铜绿假单胞菌中的phzS替换phzO获得的QOHPHZ‑1，检测得知获得了1‑OH‑PHZ的积累，最高产量在20mg/L左右，为了进一步提高菌株的产能，本发明针对该菌株QOHPHZ‑1进一步进行了优化，获得的1‑OH‑PHZ高产菌株，有望作为工程菌株进行应用。

Description

绿针假单胞菌QOHPHZ-3作为1-羟基-吩嗪生产工程菌株的 应用
技术领域
本发明属于微生物工程菌株构建技术领域，具体涉及一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-2、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3，以及上述菌株作为工程菌株在农业生产领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
生物农药是指利用生物产生的天然活性物质、衍生物或生物活体本身制备的农药。随着社会的生态意识加强，化学农药带来的环境污染问题得到了更加广泛的关注，生物农药由于具有环境友好等特点得到快速发展，有望成为未来农药生产领域的重要发展方向。
目前研究最为广泛的生物农药主要是微生物农药(以微生物活菌制剂为主体)和农用抗生素；微生物农药按照所利用的微生物资源可分为细菌类、真菌类和病毒类等。用作微生物农药的细菌主要有芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属等，已有很多具有优异生防性能的细菌菌株被分离出来，例如采用放射农杆菌K84防治植物冠瘿病。目前也有芽抱杆菌被制作成商品制剂，例如AgraQuest公司利用短小芽孢杆菌QST2808生产了活菌制剂SONATA，它能有效控制链格孢属及葡萄孢属等真菌引起的植物疾病；还有利用解淀粉芽抱杆菌QST713菌株制备的菌剂SerenadeOpti，以及Novozymes公司的产品Taegro(含枯草芽抱杆菌，用于防治由镰刀菌属和丝核菌属引起的根腐病和枯萎病)。另外，国内的研究人员也对具有生物防治潜力的芽抱杆菌进行了广泛研究，如，韩艳霞与童蕴慧等人成功的实现了应用蜡状芽孢杆菌B3-7和地衣芽抱杆菌W10防治小麦全蚀病和西红柿灰霉病。陈志谊等利用枯草芽抱杆菌B-916开发了生物农药“纹曲宁”用于防治水稻纹枯病及伪黑穗病等。另外，许多假单胞菌因能产生多种抗菌物质也常用作微生物农药，这些抗菌物质包括嗜铁素、硝毗咯菌素、申嗪霉素、绿脓菌素、1-羟基吩嗪(1-OH-PHZ)等。其中，1-OH-PHZ具有较好的生防功能，而且在田间可降解，有比较好的应用前景。
基于发明人以往的研究结果，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)含有吩嗪类物质合成的核心基因部件及吩嗪类相关修饰基因，并且绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)本身致病性低，使用安全。由于1-OH-PHZ化学合成途径较少，基于微生物获得一种高产1-OH-PHZ的工程菌株具有重要意义。
发明内容
基于上述背景技术中的记载，本发明首先通过筛选获得了一株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1，该菌株具有用于吩嗪合成的典型基因簇phzABCBEFG，并且可以生产PCA和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)。但是天然的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1不能分泌1-OH-PHZ。本发明首先通过将Qlu-1中的吩嗪修饰基因phzO替换为吩嗪修饰基因phzS获得了绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Q-OH-PHZ-1，使得该菌株能够表达1-OH-PHZ，经发酵得知，1-OH-PHZ的最高产量在20mg/L左右，远远达不到推广应用的水平。本发明进一步的，针对Q1-OH-PHZ-1进行基因改造得到绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Q-OH-PHZ-3，大大提高了1-OH-PHZ的产量，有望作为一种工程菌株进行利用。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-1，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-1以绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1作为出发菌株，采用外源phzS基因取代Qlu-1中的基因phzO得到；所述出发菌株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已于2020年05月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCCNO：M 2020108。
基于第一方面所记载的方法，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1经改造后能够表达1-OH-PHZ，实现了从无到有的变化。基于此时菌株的1-OH-PHZ产量较低，本发明针对该菌株进行了后续的优化工作。
因此，本发明第二方面，提供又一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-1以第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1作为出发菌株，并且具有tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE基因片段。
所述tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE基因片段为莽草酸途径的相关关键基因。根据本领域目前的研究结果，吩嗪类物质的合成是以分支酸为起点的合成的，分支酸是细胞内一个重要的代谢中间产物，通过分支酸还可以合成芳香族氨基酸等。莽草酸途径以胞内的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)以及4-磷酸赤藓糖(E4P)为底物进行合成，上述串联基因分别参与了绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)中吩嗪物质合成的相关途径。经本发明筛选，将上述基因片段串联导入菌株QOHPHZ-1，能够显著提升1-OH-PHZ的表达量，相比出发菌株产量提升了四倍之多。
本发明第三方面，提供又一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-3，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-3以第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2为出发菌株，其pykF基因缺失。
丙酮酸激酶基因(pykF)主要用于催化菌株内丙酮酸的生产，经本发明验证，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2中的pykF基因，有助于1-OH-PHZ的进一步生成。
本发明第四方面，提供第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOH-PHZ2或第三方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3作为1-羟基-吩嗪生产工程菌株的应用。
本发明第五方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-2、第三方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3中的一种或几种的混合菌株，或其培养物。
本发明第六方面，提供第五方面所述菌剂在制备农业生产制品中的应用。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、目前1-OH-PHZ的化工合成方法条件苛刻，且环境危害性较大。本发明提供的高产1-OH-PHZ菌株提供了一种环境友好、安全高效的1-OH-PHZ的合成方式。
2、绿针假单胞菌中吩嗪类物质的合成途径中，同一靶点通常与多种生理活动相关，同时改变多个靶点时，其导致的结果可能是预料之外的。本发明提供了一种切实可行的基因编辑方式，制备得到的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3性状稳定，有望作为一种工程菌株应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述突变质粒pK18-phzO-ud构建电泳图；
其中，图1(A)为phzO上下游同源臂的扩增：1，DNA Ladder；2，phzO上游同源臂扩增；3，phzO下游游同源臂扩增；
图1(B)为phzO上游同源臂融合片段扩增：1，DNA Ladder；2，3phzO基因上下游臂融合片段。
图2为实施例1中phzO基因双亲杂交双抗性平板筛选。
图3为实施例1中所述影印法筛选phzO基因双交换阳性单克隆；
其中，图3A为KB无抗性平板，图3B为KB硫酸卡那抗性平板。
图4为实施例1中phzO敲除株PCR验证；
其中，图4A为外部引物检测结果条带图：1，空白对照；2，DNA Ladder；3，野生株基因组为模板扩增片段；4，phzO敲除株基因组为模板扩增片段；
图4B为内部引物检测结果条带图：1，野生株基因组为模板扩增片段；2，DNALadder；3，phzO敲除株基因组为模板扩增片段；4，空白对照。
图5为实施例1中所述菌株QOHPHZ-1产1-OH-PHZ检测结果色谱图；
其中，图5a为QOHPHZ-1菌株HPLC检测图；图5b为1-OH-PHZ标品HPLC检测结果图。
图6为实施例1中所述菌株QOHPHZ-1产1-OH-PHZ物质LC-MS检测结果图。
图7为实施例2中所述pBbB8K模块质粒组装原理图。
图8为实施例2中所述串联基因pBbB8K-tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE融合图。
图9为实施例1-3中所述菌株1-OH-PHZ产量图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中1-羟基-吩嗪化学合成途径较为匮乏，本发明筛选得到了一株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1，具有吩嗪相关合成基因，针对该菌株进行优化得到一种高产1-羟基-吩嗪的工程菌株具有重要意义。
本发明第一方面，提供一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-1，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-1以绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1作为出发菌株，采用外源phzS基因取代Qlu-1中的基因phzO得到；所述出发菌株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已于2020年05月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCCNO：M 2020108。
本发明第一至第三方面提供的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株中相关基因片段的编辑均可通过本领域常用的基因编辑手段对相关基因进行剪辑，所述基因phzO敲除或外源phzS基因导入的方式包括但不限于通过siRNA基因沉默机制、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、CRISPER-Cas9系统、慢病毒载体或质粒转染方式进行基因编辑。
进一步优选的，本发明的一种具体实施方式中，基因敲除或导入通过质粒转染方式实现。
本发明第二方面，提供又一种生产1-羟基吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-2，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-1以第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1作为出发菌株，并且具有tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE基因片段。
本发明第三方面，提供又一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-3，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-3以第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2为出发菌株，其pykF基因缺失。
本发明第四方面，提供第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2或第三方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3作为1-羟基吩嗪生产工程菌株的应用。
本发明第五方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、第二方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-2、第三方面所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3中的一种或几种的混合菌株，或其培养物。
优选的，所述培养物包括但不限于菌株发酵物，或菌株发酵后分离得到的代谢物。
优选的，所述菌剂剂型为包括但不限于液体剂、粉剂、颗粒剂或片剂。
进一步优选的，所述菌剂剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂。
优选的，所述菌剂中还包括所必需的辅料。
本发明第六方面，提供第五方面所述菌剂在制备农业生产制品中的应用。
优选的，所述农业生产制品包括但不限于农药、肥料、培养基等。
进一步优选的，所述农药以第六方面所述菌剂为活性成分，或与其他农药、微生物农药等联合应用。
进一步优选的，所述肥料包括但不限于为一种磷酸铵类肥料、大量元素水溶性肥料、中量元素肥料、生物肥料、有机肥料或多维场能浓缩有机肥。
进一步优选的，所述培养基为温室育苗培养基。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所涉及的试剂，除特别限定外，均为市售产品。
实施例1
本实施例中，提供一种针对基于绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1制备绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1的方法，所述制备方法步骤如下：
1、将绿针假单胞菌Qlu-1接种进KB(A+)培养基，30℃摇床180rpm提取荡培养过夜，利用基因组提取试剂盒提取qlu-1的基因组，-20℃下保藏备用。
2、在已经测序的Qlu-1基因组数据中搜索phzO基因及其基因上下游序列，利用Qlu-1菌株基因组为模板，以phzO-F1/phzO-R1，phzO-F2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U及线下游片段phzO-D；以phzO-U及phzO-D为模板，phzO-F1/phzO-R2为模板扩增phzO上下游融合片段phzO-UD。将融合片段phzO-UD通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzO-UD。
通过热击转化将pk18-phzO-UD导入大肠杆菌S17-1(λ)，将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-phzO-UD导入假单胞菌Qlu-1。将绿针假单胞菌Qlu-1与大肠杆菌S17-1(λ)共同培养后涂布于KB(A+K+)双抗平板后挑选单菌落。通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选Qlu-1的phzO敲除株，发酵后经HPLC检测，发酵液中只积累吩嗪-1-羧酸，将菌株命名为QPCA。
以Qlu-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2，phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2，以合成的phzS基因为模板，phzS-F1/phzS-R1为引物扩增片段phzS-2，以phzO-U2、phzO-D2、phzS-2为模板，以phzO-F1/phzO-R2为模板，扩增融合phzO基因上下游的phzS导入片段phzS-IN。将融合片段phzS-IN通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzS-IN，将重组质粒pk18-phzS-IN通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-phzS-IN导入假单胞菌QPCA-1。
通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选Qlu-1phzS插入菌株，发酵后经HPLC检测，发酵液中48h后只积累1-OH-PHZ，将菌株命名为QOHPHZ-1。QOHPHZ-1发酵后，利用乙酸乙酯提取后HPLC检测，发现QOHPHZ-1在96h时可以产生20.4mg/L 1-OH-PHZ。
实施例2
本实施例中，提供一种基于实施例1中所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-1制备绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2的方法，所述制备方法包括以下步骤：
在QOHP-1基础上将吩嗪合成前导途径相关基因phzC,aroB,aroD,aroE及中心代谢相关基因tktA,ppsA分别扩增。并通过Bglbric模块质粒pBbB8k作为中介质粒，分别构建单个模块质粒，利用模块原理将基因整合成串联基因pBbB8K-tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE。
从pBbB8K-tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE上切下串联基因，连接到整合质粒pUC18-mini-Tn7T-Gm上，在辅助质粒pTNS2协助下，通过pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒整合进QOHPHZ-1，获得绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2发酵后发现，菌株QOHPHZ-2在96h内1-OH-PHZ产量达到83.8mg/L。
本实施例还通过质粒表达的方式表达相关基因，首先将基因分别构建进pBbB8K-GFP质粒，再通过Bglbric模块质粒操作规则，将单基因质粒整合成串联基因pBbB8K-tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE，再通过电击转化的方式将重组质粒导入菌株QOHPHZ-1，获得菌株QOHPHZ-2-2，在额外添加有Kan抗生素的KB中发酵发现QOHPHZ-2-2也有1-OH-PHZ的产生，其产量为52.6mg/L，相对于质粒表达，基因组整合表达不但稳定，效率也更高。
实施例3
本实施例中，提供一种基于实施例2中所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)QOHPHZ-2的制备绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3的方法，所述制备方法包括以下步骤：
在已经测序的Qlu-1基因组序列中搜索pykF基因及其序列上下游序列，并通过PCR钓取并连接pykF基因的上下游片段:pykF-ud。通过无缝克隆技术将pykF-ud片段连接质粒pk18moBsacB构建pykF敲除质粒pK18-pykF-ud。通过热击转化将pK18-pykF-ud导入大肠杆菌S17-1，将菌株QOHPHZ-2与大肠杆菌S17-1共同培养后涂布于KB(A+K+)双抗平板后挑选单菌落。
将单菌落涂布于含氨苄霉素的15％蔗糖KB平板，通过PCR筛选并验证QOHP-2敲除pykF基因获得绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3，发酵后，利用乙酸乙酯提取后HPLC检测，发现QOHPHZ-3在96h时可以产生163.5mg/L 1-OH-PHZ。
实施例1-3中制备的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-1、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-2、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)QOHPHZ-3的1-OH-PHZ的产量如图9所示，从图9中可以看出，出发菌株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1的1-OH-PHZ产量始终为0，该菌株自身并不能合成1-OH-PHZ。菌株QOHPHZ-1、QOHPHZ-2、QOHPHZ-3培养的前48h内1-OH-PHZ产量差异并不显著，48h后QOHPHZ-3产1-OH-PHZ显著提升，在96h即可达到产量的顶峰。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种生产1-羟基吩嗪的绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-2，其特征在于，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-2以绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-1作为出发菌株，并且具有tktA-ppsA-phzC-aroB-aroD-aroE基因片段；
所述绿针假单胞菌QOHPHZ-1以绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）Qlu-1作为出发菌株，采用外源 phzS基因取代Qlu-1中的基因phzO得到；所述出发菌株绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）Qlu-1已于2020年05月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCCNO：M2020108。
2.一种生产1-羟基-吩嗪的绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-3，其特征在于，所述绿针假单胞菌QOHPHZ-3以权利要求1所述绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-2为出发菌株，其pykF基因缺失。
3.权利要求1所述绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-2或权利要求2所述绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-3作为1-羟基-吩嗪生产工程菌株的应用。
4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-2或权利要求2所述绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）QOHPHZ-3中的一种或几种的混合菌株。
5.如权利要求4所述菌剂，其特征在于所述菌剂中还包括所必需的辅料。
6.如权利要求4所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液体剂、粉剂、颗粒剂或片剂。
7.如权利要求4所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂或水悬浮剂。
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