CN104293692A - 生物工程菌株及其制备方法和用途 - Google Patents

生物工程菌株及其制备方法和用途 Download PDF

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CN104293692A CN201410333085.5A CN201410333085A CN104293692A CN 104293692 A CN104293692 A CN 104293692A CN 201410333085 A CN201410333085 A CN 201410333085A CN 104293692 A CN104293692 A CN 104293692A
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许煜泉
刘海明
周泉
周万平
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Abstract

本发明公开了生物工程菌株及其制备方法和用途，所述生物工程菌株衍生自假单胞菌株M18G，相对于所述假单胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因组缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非编码区。本发明的生物工程菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率高，发酵效价稳定，且不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适于大规模生产。

Description

生物工程菌株及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于微生物源农药生产技术领域，尤其涉及一种改进的用于生产新型微生物源杀菌剂的工程菌株的制备及其应用。具体地，本发明涉及生物工程菌株、制备生物工程菌株的方法、生物工程菌株在制备吩嗪-1羧酸中的用途以及制备吩嗪-1-羧酸的方法。
背景技术
生物农药促生拮抗菌M18，属于一种产荧光的假单胞菌，对植物病害具有高效、安全、广谱的杀菌作用，易于在环境中解体，与环境相容性好。该促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0462。生物农药促生拮抗菌M18的制备和应用，已经获得国家发明专利，专利号为00119857.2。但是，生物农药促生拮抗菌M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过M18活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌体本身的代谢调控机制和环境条件的影响。因而，对植物病害的防治效果具有不稳定性的缺陷，难以在农业生产中进行大规模的推广应用。
已经查明，属于假单胞菌的促生拮抗菌M18菌株，其防治植物病害的主要活性成分为之一为吩嗪-1-羧酸，从促生拮抗菌M18的发酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治同样具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征；同时，能克服利用促生拮抗菌M18防治病害效果不稳定的缺陷。但是，利用促生拮抗菌M18发酵合成吩嗪-1-羧酸的效价很低，仅为每升200毫克左右，如何提高发酵效价，降低使用成本，成为开发本产品的瓶颈所在。近年来，发明人运用基因工程手段，对促生拮抗菌M18基因组中的双组分调控基因gacA开展了定向失活突变，获得了M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的产量，使其发酵效价达到每升1500-1700毫克左右。该研究成果的技术方法已经于2004年在《微生物学报》44卷第761～765页公开，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。发明人利用M18衍生菌株M18G携带重组质粒pME6032Phz，构建的基因工程菌株M18G/pME6032Phz，发明高效生产吩嗪-1-羧酸的方法，大大提高了吩嗪-1-羧酸的发酵效价，使吩嗪-1-羧酸的产量达到每升5700～6600毫克的水平，获得了国家发明专利(申请号为CN200910198664.2)。但是，利用该技术生产吩嗪-1-羧酸需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，价格很高，提高了成本，不适宜大规模生产，同时，由于携带的重组质粒易于在发酵过程中丢失，会引起生产的不稳定性。
因而，目前的用于生产吩嗪-1-羧酸的生物工程菌株仍有待改进。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种改进的用于生产微生物源杀菌剂吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株及其应用技术。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物工程菌株，所述生物工程菌株衍生自假单胞菌株M18G。根据本发明的实施例，相对于所述假单胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因组缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非编码区。
需要说明的是，本发明所述的生物工程菌株，即一种改进的用于生产微生物源杀菌剂吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株M18GU，其是通过运用无缝拼接技术制备的。其中，本发明所采用的表达方式“无缝拼接技术”是指一种DNA片段缺失技术。通常缺失DNA片段的技术，都需要在缺失处插入一个编码抗生素抗性的标记基因作为筛选指标，表明该DNA区域已经缺失，以区别野生型的未缺失DNA片段的菌株，本发明构建的生物工程菌株M18GU，是通过缺失基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非编码区实现的。从理论上讲，在非编码区插入了诸如标记基因的其他序列后，将对基因表达产生难以预测的影响，因而，不允许插入诸如标记基因的其他序列。本发明采用的DNA片段缺失技术为一种无缝拼接法，即通过DNA序列之间的两次同源重组，所引起的抗药性改变和蔗糖致死性的改变筛选出突变菌株，在DNA片段缺失处不需要携带通常的选择标记，直接将缺失区两端的DNA连接，定向缺失M18衍生菌株M18G的基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phz1)上游的5’-非编码区，构建成基因突变菌株(M18GU)。由此，去除对吩嗪-1-羧酸合成基因簇phz1表达的抑制作用，从而，M18GU菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高。
其中，本发明所述的“M18”菌株为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0462的一种生物农药促生拮抗菌。假单胞菌株“M18G”为M18(CGMCC NO.0462)的衍生菌株，其制备方法已为公知，例如可参考发表于2004年的《微生物学报》44卷第761～765页的《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。相比M18，M18G的吩嗪-1-羧酸的产量获得了很大的提升，而本发明在此基础上对假单胞菌株M18G进行进一步改进。
根据本发明的实施例，phz1基因簇上游5’-非编码区可以为完整的或是部分的5’-非编码区，所述的5’-非编码区在转录后形成的信使mRNA中，可形成一种二级结构阻止翻译的正常进行，从而抑制了吩嗪-1-羧酸的合成。优选地，phz1基因簇上游5’-非编码区含有翻译起始密码子上游第335位碱基始至其上游第31碱基至的多核苷酸片段。根据本发明的实施例，所述phz1基因簇为铜绿假单胞菌的phz1。优选的，所述的phz1基因簇5’-端非编码区来源于铜绿假单胞菌株PA01、PA7、LESB58、PA7、PUPa3、M18。更优选，所述phz1基因簇上游5’-端非编码区来源于假单胞菌株M18，其碱基序列如SEQ ID N0：1所示：
ACATCAGCGA CCAGGGATGC TGGCTATTTG AAACACTTCA CGGAATGACG CTGAAAGTCT  60
TCGCGACCTC GTCTGTCGCA CCTTAACGAA AGCATTGCGA ATCCATTACC GACAGGTTTC  120
CAAAAGAAAC CCGGGATGAA ACTCCTATTG CCTTTCGAAA ATTGGAAACG ACAGGCGAAC  180
ATATGTAACG CGAAATTTCA CCCTACGTAT AAACAATGCG CCCAGCGAAT ATCGCTCCCT  240
TACCGAGCGA CGAACTCCTG CGCGCCAGCG AATAACCGAT GCCGCGAGGG AAAAGTTTCT  300
CCGGC(SEQ ID N0：1)  305
从而，根据本发明的实施例，相对于所述假单胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因组缺失SEQ ID NO：1所示的核酸序列。由此，本发明的生物工程菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率高，发酵效价稳定，且不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适于大规模生产。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备生物工程菌株的方法。该方法即是基于前面所述的“无缝拼接技术”进行的。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物，其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
2)利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物，进行连接处理，以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
3)将所述连接产物经EcoRI and PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒pK18DU1；
4)将所述重组质粒导入E.coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株；
5)将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交，以便获得生物工程菌株M18GU。
发明人发现，利用本发明的方法制备获得的生物工程菌株能够有效用于吩嗪-1-羧酸的生产，且生产效率显著高于M18G/pME6032Phz菌株(M18G/pME6032Phz菌株的相关信息请参见专利申请：CN200910198664.2)，还能克服质粒不稳定性的问题，发酵效价稳定，不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适宜于大规模生产。
另外，根据本发明上述实施例的本发明的制备生物工程菌株的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述第一引物和第二引物分别具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分别具有SEQ ID NO：4-5所示核苷酸序列。由此，扩增效率高。
根据本发明的实施例将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，进一步包括：将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，并进一步变性和复性，并利用DNA聚合酶LA Taq进行第三PCR扩增，以便获得第三扩增产物；利用第一引物和第四引物进行第四PCR扩增，以便获得第四扩增产物；将所述第四扩增产物进行纯化回收，以便获得所述连接产物。由此，连接效率高，稳定性好。
根据本发明的实施例，所述第三PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，10个循环；72℃1min；所述第四PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃1min。由此，连接准确、效率高。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的生物工程菌株在制备吩嗪-1羧酸中的用途。发明人发现，本发明的生物工程菌株能够有效用于制备吩嗪-1羧酸，且生产效率高，发酵效价稳定，不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适宜于大规模生产。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备吩嗪-1-羧酸的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的生物工程菌株进行活化，其中，所述生物工程菌株是通过前面所述的制备生物工程菌株的方法制备获得的；以及将活化的生物工程菌株进行种子扩大培养，以便获得吩嗪-1-羧酸发酵液。发明人发现，该方法操作简单、适于大规模生产，吩嗪-1-羧酸生产效率高，发酵效价稳定，不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低。
根据本发明的实施例，所述活化进一步包括：将所述生物工程菌株接种于甘油培养基平板，在26-30℃下，活化生长20-24小时；以及在所述甘油培养基平板上划菌块，于26-30℃下活化10-12小时，其中，所述甘油培养基中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％，甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、琼脂1.2-1.5％、余量为水，pH6.8-7.2。由此，活化效果好，有利于后续生物工程菌株的扩大培养。
根据本发明的实施例，所述种子扩大培养进一步包括：将所述活化的生物工程菌株，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26-28℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为160-180转/分；以及然后，转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时。其中，所述甘油培养液中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％、甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、余量为水，pH6.8-7.2；所述产素培养液中各组分的重量百分比为：黄豆粉6.5-8.0％、玉米浆1.0-2.0％、甘油1.0-2.0％、葡萄糖0.5-1.5％、硝酸钾0.8-1.8％、余量为水，pH7.5-8.0。由此，有利于生物工程菌株的扩大培养，从而有利于目的产物吩嗪-1-羧酸的产出。
需要说明的是，本发明提供的生物工程菌株及其构建方法，以及利用该生物工程菌株高效生产吩嗪-1羧酸的方法，具有以下的优点：
1、生产成本低。生产过程中，吩嗪-1羧酸基因的表达不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，发酵效价能达到每升发酵液中吩嗪-1-羧酸含量为6700-7000毫克，生产成本低，适宜于大规模生产。
2、发酵效价稳定。本发明提供的生物工程菌株，是通过缺失染色体中的吩嗪-1羧酸合成基因簇中的非编码区获得的，与传统的通过质粒携带基因相比，在遗传上具有稳定性，因而，发酵效价也稳定。
3、宿主可以改造为细胞工厂。通常的对DNA片段缺失，在缺失处，都需要插入一个编码抗生素抗性的标记基因作为筛选指标，表明该DNA区域已经缺失，以区别野生型细胞，但是，由于选择标记有限，不能无限制的进行多轮缺失。本发明的方法采用的DNA片段缺失技术为一种无缝拼接法，缺失处不需要携带通常的选择标记，可以直接将缺失区的两端的DNA连接，这样，可以克服选择标记有限性的缺陷，能对染色体基因组进行无限制的多次缺失，从而能够按生产的需要构建理想的细胞工厂。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明实施例的制备生物工程菌株M18GU的方法的流程示意图，其中，
图1A显示了构建重组质粒pK18DU1的流程示意图；
图1B、C显示了重组质粒pK18DU1与菌株M18G通过两轮DNA同源重组交换制备工程菌株M18GU的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
一般方法：
本发明实施例中的制备生物工程菌株M18GU的方法的一般过程为：
设计两对引物，第一引物(UA)和第二引物(UB)，第三引物(UC)和第四引物(UD)；然后以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，分别扩增phz1基因簇5’-非编码区两侧的片段。利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段变性和复性连接成为长片段。运用常规技术，将回收的长度为1114bp的DNA片段经限制性内切酶EcoRI和PstI处理后，插入质粒pK18mobsac中，形成重组质粒pK18DU1(如图1A所示)。
然后，如图1B和图1C所示，将重组质粒pK18DU1导入E.coli S17-1(λpir)，再转入M18G中，运用双亲杂交交换技术，通过两轮DNA之间的同源重组交换，制备并筛选获得工程菌株M18GU。其中，筛选过程为：在含有壮观霉素和卡那霉素的平板中选出单交换的菌落，然后在含有壮观霉素和5％蔗糖的平板中选出双交换的菌落，最后，所获得的菌落为M18GU菌株。
实施例1
根据上述一般方法，构建生物工程菌株M18GU，具体步骤为：
1、扩增phz1基因簇5’-非编码区两侧的片段
设计两对引物，引物的核苷酸序列如下：
正向(UA)：5’-AAGAATTCCAGCAGGCGCATCAGTC-3’(SEQ ID NO:2)
反向(UB)：5’-CCAGGTATGGATTGCATAAAACACAGAA-3’(SEQ ID NO:3)
正向(UC)：5’-TATGCAATCCATACCTGGAGAGCCCTCT-3’(SEQ ID NO:4)
反向(UD)：5’-ATCTGCAGTGCTCCTTGGCGGTAGAT-3’(SEQ ID NO:5)
序列中下划线为限制性内切酶EcoRI和PstI的酶切位点。上述引物均委托上海生工生物有限公司合成。
然后，以假单孢菌株M18G基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，分别扩增phz1基因簇5’-非编码区两端的片段，扩增产物通过1％琼脂糖电泳检测，分别回收长度为572bp和560bp的片段，基因片段经核苷酸测序验证为准确。具体地，回收的扩增产物序列如下：
572bp的扩增产物：
AAGAATTCCA GCAGGCGCAT CAGTCGATGG ATGCGCTCGG CATCGGAACC GACCGCGGCG  60
GCCAGCGTCT CGTCGCTGTC GATCCCGCTC TCGATCAGAT CGGCCAGCCC GAGGCGCGTA  120
GCGACGTAGA CGCAACGGGA CTTCCATTCC CCGGTAACAA CTTGTATCAA ATTACGCGCA  180
GCAGCAAGAT TCGAATTATT CATCTTTTAT TCTCTCTCGT TACACATTTC CGTAACCCGA  240
GAAGTACCCA AGCGCTCTAT TTCGCACTTC TTGCCCGCTC GGCGAGAAAT ACCGCAGAAC  300
ACCCCGGTTC ATTCGGAACT TTGAGAAAAA ATACGCTCAT CCCCCGGATC AGCGCTCCCT  360
GGATCTCGTT GCGGAAACAA CCCTGGAACT TTCCAACTGC CTGTTCCAGA GCCTTTTCCT  420
GCGTACCGAA AGAATAAAAT TACAACTTGG CTACAACCTC CGGCATTGCA GGAAGCATCA  480
GCTTAGCAAT CCCGCATACC CTGTCTGGCA CCTACCAGAT CTTGTAGTTG AGCCGGTACG  540
AGCGTTCTGT GTTTTATGCA ATCCATACCT GG(SEQ ID NO:6)  572
560bp的扩增产物：
TATGCAATCC ATACCTGGAG AGCCCTCTCG GAGGCGGCGC ATGAACGGTC AGCGGTACAG  60
GGAAACACCC CTCGACATCG AGCGTCTGCG GCGCCTGAAT CGCGCCACGG TGGAGCGCTA  120
CATGGCAATG AAGGGGGCCG AACGGTTACA GCGGCACAGC CTGTTCGTCG AGGACGGCTG  180
CGCCGGCAAC TGGACCACGG AAAGCGGCGA ACCCCTGGTT TTCCGGGGCC ATGAGAGCCT  240
CAGGCGGCTC GCCGAGTGGC TCGAGCGCTG CTTCCCCGAC TGGGAGTGGC ACAACGTGCG  300
GATCTTCGAG ACCGAGGATC CGAACCACTT CTGGGTCGAG TGCGACGGGC GCGGCAAGGC  360
GCTGGTCCCG GGGTATCCGC AGGGCTATTG CGAGAACCAC TACATCCATT CCTTCGAACT  420
CGAGAACGGC CGGATAAAAC GTAATCGCGA GTTCATGAAC CCGATACAGA AACTGCGTGC  480
ATTGGGAATA GCCGTTCCGC AAATAAAACG TGACGGTATT CCCACTTGAA TGACATCTAC  540
CGCCAAGGAG CACTGCAGAT(SEQ ID NO:7)  560
其中，所述假单胞菌M18G基因组DNA的制备利用AxyPrep细菌基因组DNA试剂盒进行，基因片段的回收利用Axygene DNA凝胶回收试剂盒进行，均由爱思进生物技术(杭州)有限公司提供，产品目录号分别为AP-MN-BT-GDNA-4和AP-GX-50；所述基因扩增反应的条件以及琼脂糖电泳，分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第8章第611～618页和第5章第387～400页中所述的方法进行。其中，所使用的DNA聚合酶LA Taq和基因扩增试剂盒，购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号：DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段(phzH及其5’端的非编码区)的核苷酸测序验证委托上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果证实基因片段分别含SEQ ID NO:1的两侧序列。
2、利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段连接成长度为1114bp的长片段
重叠基因扩增分两步进行：
第一步，将上述片段SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7混合。因为两个片段的末端有18bp序列完全相同，在变性后退火时有一定几率配对，可以互为引物和模板，利用DNA聚合酶LA Taq，将两个片段连接。反应体系如下：
反应程序为：
第二步，上述进行10个循环反应后，添加上述引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5各1μl，再进行25个循环反应，扩增连接的长片段，反应程序同第一步。得到的无标记phz1基因簇5’-非编码区目标片段缺失的长片段，产物通过琼脂糖电泳检测。
所述基因扩增反应的条件以及琼脂糖电泳，分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第8章第611～618页和第5章第387～400页中所述的方法进行。其中，所使用的DNA聚合酶LA Taq和基因扩增试剂盒，购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号：DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段5’端的非编码区)的核苷酸测序验证委托上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果证实基因片段的长度为1114bp，具有SEQ ID NO:8所示的序列：
AAGAATTCCA GCAGGCGCAT CAGTCGATGG ATGCGCTCGG CATCGGAACC GACCGCGGCG  60
GCCAGCGTCT CGTCGCTGTC GATCCCGCTC TCGATCAGAT CGGCCAGCCC GAGGCGCGTA  120
GCGACGTAGA CGCAACGGGA CTTCCATTCC CCGGTAACAA CTTGTATCAA ATTACGCGCA  180
GCAGCAAGAT TCGAATTATT CATCTTTTAT TCTCTCTCGT TACACATTTC CGTAACCCGA  240
GAAGTACCCA AGCGCTCTAT TTCGCACTTC TTGCCCGCTC GGCGAGAAAT ACCGCAGAAC  300
ACCCCGGTTC ATTCGGAACT TTGAGAAAAA ATACGCTCAT CCCCCGGATC AGCGCTCCCT  360
GGATCTCGTT GCGGAAACAA CCCTGGAACT TTCCAACTGC CTGTTCCAGA GCCTTTTCCT  420
GCGTACCGAA AGAATAAAAT TACAACTTGG CTACAACCTC CGGCATTGCA GGAAGCATCA  480
GCTTAGCAAT CCCGCATACC CTGTCTGGCA CCTACCAGAT CTTGTAGTTG AGCCGGTACG  540
AGCGTTCTGT GTTTTATGCA ATCCATACCT GGAGAGCCCT CTCGGAGGCG GCGCATGAAC  600
GGTCAGCGGT ACAGGGAAAC ACCCCTCGAC ATCGAGCGTC TGCGGCGCCT GAATCGCGCC  660
ACGGTGGAGC GCTACATGGC AATGAAGGGG GCCGAACGGT TACAGCGGCA CAGCCTGTTC  720
GTCGAGGACG GCTGCGCCGG CAACTGGACC ACGGAAAGCG GCGAACCCCT GGTTTTCCGG  780
GGCCATGAGA GCCTCAGGCG GCTCGCCGAG TGGCTCGAGC GCTGCTTCCC CGACTGGGAG  840
TGGCACAACG TGCGGATCTT CGAGACCGAG GATCCGAACC ACTTCTGGGT CGAGTGCGAC  900
GGGCGCGGCA AGGCGCTGGT CCCGGGGTAT CCGCAGGGCT ATTGCGAGAA CCACTACATC  960
CATTCCTTCG AACTCGAGAA CGGCCGGATA AAACGTAATC GCGAGTTCAT GAACCCGATA  1020
CAGAAACTGC GTGCATTGGG AATAGCCGTT CCGCAAATAA AACGTGACGG TATTCCCACT  1080
TGAATGACAT CTACCGCCAA GGAGCACTGC AGAT(SEQ ID NO:8)。  1114
重叠基因扩增技术的产物通过琼脂糖电泳检测，回收，经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒pK18DU1并测序验证片段的准确性。将重组质粒pKU转化导入E.coli S17-1(λpir)，构建成工程菌株S17-1(λpir)/pK18DU1。
所述的酶切、琼脂糖电泳以及基因转化方法，均按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第8章第611～618页和第5章第387～400页中所述的方法进行。其中，所使用的限制性酶EcoRI和PstI购自Fermentas公司，产品目录号：ERO271和ERO611。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段5’端的非编码区的核苷酸测序验证委托上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果证实基因片段为1114bp的片段，即SEQ ID NO:8所示序列。。
3、构建基因工程菌株M18GU
取过夜培养的M18G菌液和S17-1(λpir)/pK18DU1菌液各100ul，充分混合后涂于无抗生素的平板上，28℃过夜培养。进行双亲杂交，刮取上述菌苔再悬浮后，涂于含有100μgml-1壮观霉素和50μg ml-1卡那霉素的平板上，28℃培养48h。48h后长出少量单菌落即为单交换菌株。分别挑取该单交换菌落，分别涂布在含有100μg ml-1壮观霉素和50μg ml-1卡那霉素的平板上，28℃过夜培养后，接种环再分别刮取单交换菌株，重悬浮，104倍稀释后涂于含有100μg ml-1壮观霉素和5％蔗糖的平板，培养48h后，长出单菌落即为双交换的菌落。最后运用基因扩增技术和DNA测序验证所获得的菌落为M18GU菌株。
所述的大肠杆菌S17-1(λpir)购自北京乐博生物科技有限公司，产品目录号：BS-3234。质粒pK18mobsacB购自上海北诺生物科技有限公司。所述的基因扩增技术和DNA测序验证所获得的菌落M18GU菌株，按步骤2的方法进行。
4、基因工程菌株M18GU的培养
将基因工程菌株M18GU接种在甘油培养基的平板上，在26℃下，活化生长24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化10小时，然后将活化的M18GU菌块，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为160转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，得到吩嗪-1-羧酸的产量为每升6700毫克。
所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8、甘油1.3、硫酸镁0.05、磷酸二氢钾0.01、余量为水，pH6.8。
所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8、甘油1.3、硫酸镁0.05、磷酸二氢钾0.01、琼脂1.2、余量为水，pH6.8。
所述的产素培养液的组分重量百分比为：黄豆粉7.0、玉米浆1.5、甘油1.3、葡萄糖0.5、硝酸钾0.8、余量为水，pH7.5。
较佳的，工程菌株的活化条件为：将工程菌接入甘油培养基平板，在26℃下，活化生长20小时；而后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26℃下活化10小时。
实施例2
1、扩增phz1基因簇5’-非编码区两侧的片段，利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段连接成长度为1114bp的长片段，以及构建基因工程菌株M18GU，具体方法同实施例1。
2、基因工程菌株M18GU的培养
将基因工程菌株M18GU接种在甘油培养基的平板上，在28℃下，活化生长24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，28℃下活化10小时，然后将活化的M18GU菌块，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，得到吩嗪-1-羧酸的产量为每升6850毫克。
所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.0、甘油1.5、硫酸镁0.07、磷酸二氢钾0.02、余量为水，pH6.8。
所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.0、甘油1.5、硫酸镁0.07、磷酸二氢钾0.02、琼脂1.2、余量为水，pH6.8。
所述的产素培养液的组分重量百分比为：黄豆粉8.0、玉米浆1.0、甘油1.0、葡萄糖1.0、硝酸钾1.2、余量为水，pH7.6。
较佳的，工程菌株的活化条件为：将工程菌接入甘油培养基平板，在26℃下，活化生长20小时；而后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26℃下活化10小时。
实施例3
1、扩增phz1基因簇5’-非编码区两侧的片段，利用重叠基因扩增技术，将上述两个片段连接成长度为1114bp的长片段，以及构建基因工程菌株M18GU，具体方法同实施例1。
2、基因工程菌株M18GU的培养。
将基因工程菌株M18GU接种在甘油培养基的平板上，在30℃下，活化生长24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化10小时，然后将活化的M18GU菌块，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在28℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为220转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，得到吩嗪-1-羧酸的产量为每升7000毫克。
所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2、甘油1.7、硫酸镁0.10、磷酸二氢钾0.05、余量为水，pH7.2。
所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2、甘油1.7、硫酸镁0.10、磷酸二氢钾0.05、琼脂1.2、余量为水，pH7.2。
所述的产素培养液的组分重量百分比为：黄豆粉7.5％、玉米浆2.0、甘油1.5、葡萄糖1.8、硝酸钾1.2、余量为水，pH8.0。
较佳的，工程菌株的活化条件为：将工程菌接入甘油培养基平板，在30℃下，活化生长24小时；而后再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化12小时。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种生物工程菌株，所述生物工程菌株衍生自假单胞菌株M18G，其特征在于，相对于所述假单胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因组缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非编码区。
2.根据权利要求1所述的生物工程菌株，其特征在于，相对于所述假单胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因组缺失SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
3.一种制备生物工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物，其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
2)利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
3)将所述连接产物经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒pK18DU1；
4)将所述重组质粒导入E.coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株；
5)将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交，以便获得生物工程菌株M18GU。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物分别具有SEQ IDNO：2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分别具有SEQ ID NO：4-5所示核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，进一步包括：
将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，并利用DNA聚合酶LA Taq进行第三PCR扩增，以便获得第三扩增产物；
利用第一引物和第四引物进行第四PCR扩增，以便获得第四扩增产物；
将所述第四扩增产物进行纯化回收，以便获得所述连接产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第三PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，10个循环；72℃1min，
所述第四PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃1min。
7.权利要求1或2所述的生物工程菌株在制备吩嗪-1羧酸中的用途。
8.一种制备吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述的生物工程菌株进行活化，其中，所述生物工程菌株是通过权利要求3-6任一项所述的方法制备获得的；以及
将活化的生物工程菌株进行种子扩大培养，以便获得含吩嗪-1-羧酸的发酵液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活化进一步包括：
将所述生物工程菌株接种于甘油培养基平板，在26-30℃下，活化生长20-24小时；以及
在所述甘油培养基平板上划菌块，于26-30℃下活化10-12小时，
其中，所述甘油培养基中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％，甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、琼脂1.2-1.5％、余量为水，pH6.8-7.2。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子扩大培养进一步包括：
将所述活化的生物工程菌株，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26-28℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为160-180转/分；以及
然后，转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，
其中，所述甘油培养液中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％、甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、余量为水，pH6.8-7.2，
所述产素培养液中各组分的重量百分比为：黄豆粉6.5-8.0％、玉米浆1.0-2.0％、甘油1.0-2.0％、葡萄糖0.5-1.5％、硝酸钾0.8-1.8％、余量为水，pH7.5-8.0。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087455A (zh) * 2015-03-27 2015-11-25 上海交通大学 用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途
CN106467922A (zh) * 2016-08-26 2017-03-01 上海交通大学 一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法
CN109468244A (zh) * 2018-11-15 2019-03-15 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN111485009A (zh) * 2020-04-10 2020-08-04 上海农乐生物制品股份有限公司 一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1340609A (zh) * 2000-08-31 2002-03-20 上海交通大学 生物农药促生拮抗菌m18及其制备方法
CN1539959A (zh) * 2003-10-30 2004-10-27 上海交通大学 荧光假单胞菌m18的基因插入突变菌株m18g的方法
CN101705265A (zh) * 2009-11-12 2010-05-12 上海交通大学 利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1340609A (zh) * 2000-08-31 2002-03-20 上海交通大学 生物农药促生拮抗菌m18及其制备方法
CN1539959A (zh) * 2003-10-30 2004-10-27 上海交通大学 荧光假单胞菌m18的基因插入突变菌株m18g的方法
CN101705265A (zh) * 2009-11-12 2010-05-12 上海交通大学 利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIN REN, ET AL.: "The phzA2-G2 Transcript Exhibits Direct RsmA-Mediated Activation in Pseudomonas aeruginosa M18", 《PLOS ONE》 *
XILIN DU, ET AL.: "Phenazine-1-carboxylic acid production in a chromosomally non-scar triple-deleted mutant Pseudomonas aeruginosa using statistical experimental designs to optimize yield", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
葛宜和等: "假单胞菌gacA 插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控", 《微生物学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087455A (zh) * 2015-03-27 2015-11-25 上海交通大学 用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用途
CN106467922A (zh) * 2016-08-26 2017-03-01 上海交通大学 一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法
CN109468244A (zh) * 2018-11-15 2019-03-15 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN109468244B (zh) * 2018-11-15 2021-10-22 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN111485009A (zh) * 2020-04-10 2020-08-04 上海农乐生物制品股份有限公司 一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基

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