CN111485009A - 一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基 - Google Patents

一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基，将原材料加工处理后按培养基配方加水调配均匀置于发酵罐中，121℃高压灭菌15～25分钟后冷却；将申嗪霉素发酵菌种无菌条件下加入到发酵罐中，26～28℃、200～300r/min条件下培养68～72h后，提纯即可得到高产量的申嗪霉素；其中，培养基配方为：黄豆粉5～10g/L，玉米浆5～16g/L，植物饼粕水解氨基酸液20～30g/L，葡萄糖10～15g/L，甘油20～25g/L，谷氨酸钠5～15g/L，溶剂为水。本发明发酵培养基申嗪霉素产能提高2.4～2.75倍，申嗪霉素回收率达到78％～80％。

Description

一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基
技术领域
本发明属于农药技术领域技术领域，具体涉及到一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法和发酵培养基。
背景技术
申嗪霉素是一种新型的微生物源农药(农用抗生素)，具有高效、安全、广谱及环境友好等特点，其主要成分是吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)，申嗪霉素能有效控制多种稻麦果蔬等作物真菌性、细菌性和线虫病害，并同时具有促进植物的生长作用，通过苗期的灌根和发病初期叶面的喷雾，申嗪霉素对西瓜枯萎病的防治达到75％～80％，对甜椒疫病的防治达到73％～80％，得到全国农技推广服务中心和有关省市农业植保部门的充分肯定，在当前“农药使用量零增长行动”的大趋势大背景下，应用前景非常广阔。
微生物发酵是目前农用抗生素生产的常用方法，有效且环保，但国际上工业化生产申嗪霉素的效价还很低(约3000mg/L)，成本相对较高，不利于产业化发展。
因此，开发高效、低成本、环境友好的高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，包括，将原材料加工处理后按培养基配方加水调配均匀置于发酵罐中，121℃高压灭菌15～25分钟后冷却；将申嗪霉素发酵菌种无菌条件下加入到发酵罐中，26～28℃、200～300r/min条件下培养68～72h后，提纯即可得到高产量的申嗪霉素；其中，培养基配方为：黄豆粉5～10g/L，玉米浆5～16g/L，植物饼粕脱氯水解氨基酸液20～30g/L，葡萄糖10～15g/L，甘油20～25g/L，谷氨酸钠5～15g/L，溶剂为水。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述氨基酸液还包括动物毛发水解氨基酸液。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述申嗪霉素发酵菌种为荧光假单胞菌菌株M18。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述培养基配方中，黄豆粉为10g/L，玉米浆为16g/L，植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液为30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述黄豆粉，为黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛制得的黄豆粉。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液，其制备方法为将植物饼粕或动物毛发经过6mol/L盐酸在110℃水解24h，即得到水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液；其中，减压蒸馏步骤为：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物饼粕包括，大豆饼粕、菜籽饼粕、花生饼粕、火麻饼粕中的一种或几种。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述动物毛发包括人体头发、动物羽毛中的一种。
作为本发明所述高产申嗪霉素发酵培养基的制备方法的一种优选方案，其中：所述将申嗪霉素发酵菌种无菌条件下加入到发酵罐中，其中，发酵罐中发酵菌种接入量占培养基配方总质量的3％～6％。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法制得的发酵培养基，其中：所述发酵培养基申嗪霉素产能提高2.4～2.75倍，申嗪霉素回收率达到78％～80％。
本发明有益效果：
(1)本发明发酵培养基配方中使用了植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液作为发酵氮源之一，植物饼粕是植物蛋白经压榨提取油后产生的渣粕，该副产物富含蛋白，以此粕作为原料进行发酵，既提高了植物蛋白资源利用率，又能为发酵提供良好氮源来源；动物毛发是一种来源广泛的蛋白资源，因不能直接利用而往往被废弃，将其作为发酵氮源，在减少废弃物的同时，得到廉价、安全易得的原料，也充分合理的开发了其潜在的价值。
(2)本发明中是将植物饼粕或动物毛发经酸水解得到的水解氨基酸液再经减压蒸馏脱氯得到脱氯水解氨基酸液，在补充氮源、矿物元素、生长因子的基础上减少盐分的摄入量，过多的盐分介入对氮源的利用有拮抗作用，从而造成发酵过程中氧源利用不完整，经脱氯后的水解氨基酸液能消除发酵过程中的拮抗作用。
(3)本发明培养基中使用速效碳源和迟效碳源、速效氮源和迟效氮源相结合的方式，培养基中植物饼粕或动物毛发氨基酸水解液和玉米浆为速效氮源，黄豆粉为迟效氮源；葡萄糖为速效碳源，甘油为速中效碳源。在培养过程中，过多的速效碳源会加快菌体呼吸，消耗过多氧气而不利于菌体生长，同时代谢快使细菌后续生长缺乏营养，需要适当速中效碳源进行补充；而速效氮源小分子营养(快速利用)多，大分子营养(慢速利用)少，利用更慢的大颗粒也较少，迟效氮源与之相反。本发明通过速效和迟效相结合的方式一是控制培养基中可溶性营养的浓度，供给和控制初期菌种生长，二是当培养基中菌体丰富后，分解利用迟效营养，使菌体随着发酵时间的延长形成持续性生长，促进申嗪霉素的分泌，从而得到高申嗪霉素发酵效价。培养基中脱氯水解氨基酸液、玉米浆与黄豆粉作为速效氮源与迟效氮源协同发挥作用，在合适的培养基配比下，氨基酸组成比例合理，分子量分布合理，通过控制培养基中可溶性营养的浓度，供给和控制菌种初期生长，使菌体随着发酵时间的延长形成持续性生长，促进申嗪霉素的分泌，得到高申嗪霉素的发酵效价。
(4)本培养基中的脱氯水解氨基酸液作为氮源代替蛋白胨、酵母膏等相对贵的发酵氮源试剂，而且脱氯水解氨基酸液中含有多种微量元素及生长因子，所以培养基中不需额外添加生长因子，资源利用率大，生产成本低，易于工业化生产。
(5)本发明得到的申嗪霉素的产能相对优化前提高2.4～2.75倍，回收率达到78％～80％，市场前景好。本发明原料来源广泛且在已有菌株的基础上通过优化培养基配方显著提高申嗪霉素的发酵效价，大大降低了生产成本，适合工业化大量生产，显著提高产业利润。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中申嗪霉素的发酵培养基配方制备方法流程图。
图2为本发明实施例中200mg/L申嗪霉素标样色谱图。
图3为本发明实施例2中制得的申嗪霉素色谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明中用到的原料：黄豆粉购自东宁北域良人山珍食品有限公司；玉米浆购自上海方畦仪器有限公司；植物饼粕购自荣丰(淮北)食品有限公司；动物毛发购自江苏汉菱肥业有限责任公司；火麻粕购自安国杰明食品有限公司；葡萄糖、甘油、谷氨酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司。本发明申嗪霉素发酵菌种为荧光假单胞菌菌株M18，北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0462。(与专利CN1340609A中保藏微生物一致)
实施例1
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉5g/L，玉米浆5g/L，豆粕脱氯水解氨基酸液20g/L，葡萄糖10g/L，甘油20g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌15分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种3％，28℃，200r/min，培养68h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.4倍，回收率达到78％。
实施例2
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；再将豆粕水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的豆粕脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉8g/L，玉米浆11g/L，豆粕脱氯水解氨基酸液25g/L，葡萄糖13g/L，甘油22g/L，谷氨酸钠10g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种4％，28℃，200r/min，培养70h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.44倍，回收率达到79％。
图1为本发明实施例中申嗪霉素的发酵培养基配方制备方法流程图。申嗪霉素浓度的测定方法是通过高效液相色谱进行测定，标样和样品色谱图2和图3所示，由图2和图3可知，在液相色谱条件下，申嗪霉素的保留时间为14.9min，申嗪霉素浓度的计算方式如下：将申嗪霉素标样稀释成不同浓度梯度的标样进行上机检测，形成申嗪霉素浓度-峰面积的方程式，然后将待测样品的峰面积代入方程中即可得到待测样品的申嗪霉素浓度。
实施例3
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；再将豆粕水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆16g/L，豆粕脱氯水解氨基酸液30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌25分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.53倍，回收率达到80％。
实施例4
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕脱氯氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯氨基酸水解液比例为1:1)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.7倍，回收率达到79％。
实施例5
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯水解氨基酸液比例为2:1)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.75倍，回收率达到80％。
实施例6
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯水解氨基酸液比例为1:2)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.61倍，回收率达到79％。
实施例7
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯水解氨基酸液比例为3:2)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.7倍，回收率达到80％。
实施例8
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯水解氨基酸液比例为4:3)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.7倍，回收率达到80％。
对比例1
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、羽毛氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；羽毛经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆16g/L，羽毛脱氯水解氨基酸液30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.48倍，回收率达到78％。
对比例2
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵培养基的制备：蛋白粉15g/L，玉米浆25g/L，葡萄糖6g/L，甘油15g/L，谷氨酸钠20g/L，溶剂为水。
(2)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(3)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种5％，28℃，200r/min，培养70h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高1.22倍，回收率达到73％。
对比例3
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉3g/L，玉米浆25g/L，大米蛋白肽5g/L，葡萄糖6g/L，甘油15g/L，谷氨酸钠20g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高1.75倍，回收率达到76％。
对比例4
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉5g/L，玉米浆5g/L，豆粕脱氯水解氨基酸液20g/L，葡萄糖10g/L，甘油20g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种8％，28℃，200r/min，培养68h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高1.90倍，回收率达到76％。
对比例5
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕、火麻粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕、火麻粕水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉5g/L，玉米浆15g/L，脱氯水解氨基酸液30g/L(豆粕与火麻粕的脱氯水解氨基酸液比例为1:1)，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.44倍，回收率达到78％。
对比例6
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；水解氨基酸液后续不经减压蒸馏步骤，此时氯离子含量在50％(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆16g/L，豆粕水解氨基酸液30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌25分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.03倍，回收率达到77％。
对比例7
一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)黄豆粉、豆粕氨基酸液的制备：黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛，现磨现用；豆粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h后得到豆粕水解氨基酸液；再将豆粕水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液。减压蒸馏步骤如下：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在20％的脱氯水解氨基酸液(剩余物料干基)。
(2)发酵培养基的制备：黄豆粉10g/L，玉米浆16g/L，豆粕脱氯水解氨基酸液30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
(3)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌25分钟后冷却；
(4)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，28℃，200r/min，培养72h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(5)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的产能相对优化前提高2.24倍，回收率达到77％。
对比例8
一种申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵培养基的制备：蛋白胨25g/L，黄豆粉5g/L，葡萄糖6g/L，甘油15g/L，谷氨酸钠20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁2g/L，溶剂为水。
(2)将上述培养基配方加水调配成一定容积置于发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后冷却；
(3)往冷却后的发酵罐中接入发酵菌种6％，30℃，200r/min，培养70h后提纯即可得到高产量的申嗪霉素。
(4)对申嗪霉素进行浓度测定，申嗪霉素的浓度为3000mg/L。本发明申嗪霉素的提纯步骤如下：将发酵液稀释4倍，调pH8.5，6000r/min分散1min，升温至30℃，加入1.5％(v/v)PAC溶液(现配)(浓度为10％)和1.5％(m/v)硅藻土，200r/min搅拌60s,500r/min搅拌10min，4500r/min离心5min，收集离心上清液调至3.5(6mol/L盐酸)，离心，干燥，即得高纯度申嗪霉素。
将实施例1～8和对比例1～6制备过程中得到的申嗪霉素进行浓度检测，申嗪霉素浓度及回收率如表1所示。
表1
Figure BDA0002446236530000131
由表1可知，本发明所提供的一种高产申嗪霉素的发酵培养基配方及制备方法，使用廉价、安全易得的原料，也充分合理的开发了其潜在的价值，同时使申嗪霉素的产能相对培养基优化前发酵培养基申嗪霉素产能提高2.4～2.75倍，申嗪霉素回收率达到78％～80％，降低发酵成本的同时，提高企业利润。
通过将对比例1与实施例2、实施例3对比发现，适当提高氨基酸水解液与黄豆粉添加量能提高申嗪霉素产量，且同等条件下豆粕氨基酸水解液发酵效果优于羽毛氨基酸水解液，这可能是植物水解液(豆粕氨基酸水解液)中氨基酸的组成中谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸含量显著高于动物来源(羽毛氨基酸水解液)的氨基酸含量。对比例4与实施例1对比发现，单纯提高种子液的接种量并不能提高申嗪霉素的发酵效价，这是因为接种量过大会引起溶氧不足，影响申嗪霉素合成；对比例2和对比例3与实施例相比发现，培养基中不加氨基酸水解液或者氨基酸水解液被替代，申嗪霉素的发酵效价相对偏低，这可能与氨基酸水解液的氨基酸组成比例有关。
实施例4～8中添加复合氨基酸水解液后申嗪霉素的发酵效价提高可能与复合的水解液氨基酸组成更加平衡，有利于申嗪霉素的分泌。实施例5和6分别与实施例4对于发现，提高复合氨基酸水解液中豆粕氨基酸水解液有利于申嗪霉素的分泌，而提高火麻粕氨基酸水解液的比例则申嗪霉素的产量下降，这可能是由于火麻粕氨基酸水解液中溶于水的分子比较多(快速氮源)，培养基中慢速氮源没有与其形成平衡，菌种前期生长稍快，使申嗪霉素发酵效价降低。
对比例5与实施例4对比发现，降低黄豆粉的添加量申嗪霉素的发酵效价显著降低，这说明发酵培养基中速效氮源与迟效氮源要形成一定平衡，才能使菌体随着发酵时间的延长形成持续性生长，促进申嗪霉素的分泌，从而得到高申嗪霉素发酵效价。
对比例6、对比例7与实施例3对比发现，水解氨基酸未经减压蒸馏脱氯(50％氯离子)、经减压蒸馏特定含量(20％氯离子)的发酵效果均不如减压蒸馏至8％氯离子含量的发酵效果；这说明培养基中脱氯得到的水解氨基酸液，能在补充氮源、矿物元素、生长因子的基础上减少盐分的摄入量，过多的盐分介入对氮源的利用有拮抗作用，从而造成发酵过程中氧源利用不完整，经脱氯后的水解氨基酸液能消除发酵过程中的拮抗作用。
本培养基中植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液使用植物饼粕或动物毛发为原料，不仅提高蛋白资源的利用率，变废为宝，氨基酸组成丰富；黄豆粉和玉米浆中也含有丰富的营养物质，玉米浆含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、生长因子和一些前体物质，能促进申嗪霉素的生物合成。
目前市场上发酵用培养基包括蛋白胨、酵母膏等氮源，磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠等生长因子，而本培养基中的氮源代替蛋白胨、酵母膏等比较贵的发酵氮源试剂，而且不需额外添加生长因子，资源利用率大，生产成本低，易于工业化生产；在优化发酵培养基的同时，以速效和迟效的氮源、碳源相结合为原则，使菌体随着发酵时间的延长形成持续性生长，促进申嗪霉素的分泌，从而得到高申嗪霉素发酵效价。
培养基中玉米浆和植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液为速效氮源，黄豆粉为迟效氮源，速效氮源小分子营养(快速利用多)多，大分子营养(慢速利用)少，利用更慢的的大颗粒也较少，迟效氮源与之相反，这样速效氮源与迟效氮源搭配一是可以控制培养基中可溶性营养的浓度，供给和控制初期生长，二是当菌体丰富后，菌体开始分解利用慢效营养，随着发酵时间的延长形成持续性生长。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：包括，
将原材料加工处理后按培养基配方加水调配均匀置于发酵罐中，121℃高压灭菌15～25分钟后冷却；
将申嗪霉素发酵菌种无菌条件下加入到发酵罐中，26～28℃、200～300r/min条件下培养68～72h后，提纯即可得到高产量的申嗪霉素；其中，
培养基配方为：黄豆粉5～10g/L，玉米浆5～16g/L，植物饼粕脱氯水解氨基酸液20～30g/L，葡萄糖10～15g/L，甘油20～25g/L，谷氨酸钠5～15g/L，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述氨基酸液还包括动物毛发脱氯水解氨基酸液。
3.根据权利要求1或2所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述申嗪霉素发酵菌种为荧光假单胞菌菌株M18。
4.根据权利要求1或2所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述培养基配方中，黄豆粉为10g/L，玉米浆为16g/L，植物饼粕或动物毛发脱氯水解氨基酸液为30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水。
5.根据权利要求1所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述黄豆粉，为黄豆经粉碎机粉碎30s，过100目筛制得的黄豆粉。
6.根据权利要求1所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述植物饼粕或动物毛发水解氨基酸液，其制备方法为将植物饼粕或动物毛发经过6mol/L盐酸在110℃水解24h，即得到水解氨基酸液；再将水解氨基酸液经减压蒸馏得到脱氯水解氨基酸液，其中，减压蒸馏步骤为：真空度开到0.1MPa，110℃蒸馏至盐酸蒸出速度变慢，回收后即得到氯离子含量在8％的脱氯水解氨基酸液。
7.根据权利要求1或6所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述植物饼粕包括，大豆饼粕、菜籽饼粕、花生饼粕、火麻饼粕中的一种或几种。
8.根据权利要求1或6所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述动物毛发包括人体头发、动物羽毛中的一种。
9.根据权利要求1所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述将申嗪霉素发酵菌种无菌条件下加入到发酵罐中，其中，发酵罐中发酵菌种接入量占培养基配方总质量的3％～6％。
10.根据权利要求1、2、5、6、9中任一所述高产申嗪霉素的发酵培养基的制备方法制得的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基申嗪霉素产能提高2.4～2.75倍，申嗪霉素回收率达到78％～80％。
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