CN1369566A - 吩嗪－1－羧酸生产菌培养基及吩嗪－1－羧酸制备方法 - Google Patents
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Abstract
吩嗪－1－羧酸生产菌培养基及吩嗪－1－羧酸制备方法属于生物农药领域。本发明培养基配方重量百分比:葡萄糖1.8－2.2%、蛋白胨1.5－2.5%、硝酸钾0.5－1.5%、硫酸镁0.05－0.35%、余量为水及其他成分,pH5.5－7.5。吩嗪－1－羧酸制备方法为:1.培养程序:将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中,于26－30℃下震荡培养过夜,按3－8%的接种量转接于500毫升三角瓶中,继续置于26－30℃下震荡培养,以发酵生产吩嗪－1－羧酸;2.提取和粗制备:经40－80小时培养后,菌悬液经离心机4000rpm,20min离心,取上清液,经氯仿提取,取有机相,经旋转蒸发仪蒸去氯仿,提取物溶于苯中;3.纯化:硅胶柱层析,收集纯度为99%以上的纯品。
Description
技术领域：本发明涉及的是一种生产菌培养基及吩嗪制备方法，特别是一种吩嗪-1-羧酸生产菌培养基及吩嗪-1-羧酸制备方法，属于生物农药领域。
背景技术：随着农业生产种植结构的调整，瓜果蔬菜种植面积正在不断扩大。近几年来，大面积瓜果蔬菜的种植地区，由于受到轮作等条件的限制，连年重复种植，各种作物的枯萎性病害，其中包括：黄瓜和西瓜的枯萎病害、甜瓜和哈密瓜的蔓枯病害、甜椒的根腐病害以及种蔬菜的疫病、各种水稻、小麦等作物的纹枯病等给生产带来的损失日益严重。全世界每年由此造成的损失达数十亿美元，严重地块，遭到毁灭性破坏，对这些病害的有效防治已经成为调整农作物布局的“瓶颈因子”。目前国内外对这些病害无特效的农药可以防治，只能采用一般化学杀菌剂防治，但化学杀菌剂大多数对动物和人类有害，且长期使用化学农药会造成造成作物病原菌产生抗性，残留在环境中的农药还会严重破坏生态系统。另一方面，现有的化学杀菌剂对于防治各种作物的枯萎性根腐和茎腐病害并不完全有效。经文献检索发现，荧光假单胞菌能产生多种抗生素，对多种植物病害具有防治作用，但在所有国内外文献中均未发现与本发明主题相同的作为生物农药、用于农作物真菌性病害防治的报道。
发明内容和具体实施方式：本发明针对现有技术中的不足与缺陷，提供一种吩嗪-1-羧酸生产菌培养基及吩嗪-1-羧酸制备方法，并作为生物农药，消除和克服农作物因病原菌包括真菌、细菌和病毒等各种微生物造成的各种农作物病害如瓜类的枯萎病、蔓枯病，果树的黑星病、轮纹病，水稻纹枯病，小麦赤霉病等给农作物生产带来的严重的危害，达到保护环境，促进农业生产的可持续发展。
本发明吩嗪-1-羧酸生产菌培养基的配方重量百分比：葡萄糖1.8-2.2％、蛋白胨1.5-2.5％、硝酸钾0.5-1.5％、硫酸镁0.05-0.35％、余量为水及其他成分，pH5.5-7.5。
本发明吩嗪-1-羧酸制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量40-60毫升，于26-30℃下，震荡培养过夜，按3-8％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量130-200毫升，继续置于26-30℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经40-80小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：0.5-1.5∶18-20，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
经室内测定，吩嗪-1-羧酸对各种农作物真菌性病原菌具有广谱的抑菌作用。测定了吩嗪-1-羧酸对甜瓜蔓枯病菌、甜椒疫病和西瓜枯萎病菌的毒力回归方程，结果表明，吩嗪-1-羧酸(0.1％悬浮剂)对甜瓜蔓枯病菌、甜椒疫病和西瓜枯萎病菌的EC50分别为0.6、1.58、0.33ppm。
对甜瓜蔓枯病的盆栽接种试验表明，吩嗪-1-羧酸(0.1％悬浮剂)稀释100倍(吩嗪-1-羧酸含量为10ppm)的防治效果为80.8％，优于对照药剂多菌灵，差异显著。
本发明具有实质性特点和显著进步，利用本发明对黄瓜枯萎病、哈密瓜和甜瓜的蔓枯病、甜椒的根腐病等多种农作物病害开展了小区药效对比试验，防治效果达80％以上，优于多菌灵的防治效果，并且具有10％以上的增产效果。
以下进一步提供实施例：
实施例1
取吩嗪-1-羧酸生产菌培养基配方重量百分比：葡萄糖1.8％、蛋白胨1.5％、硝酸钾0.5％、硫酸镁0.05％、余量为水及其他成分，pH7.0。
吩嗪-1-羧酸的制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量40毫升，于26℃下，震荡培养过夜，按3％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量130毫升，继续置于26℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经48小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：0.5∶18，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
生物合成的吩嗪-1-羧酸(0.1％)悬浮剂对各种农作物病原菌具有较好的抑菌作用，对甜瓜枯萎病、甜椒疫病和西瓜枯萎病的EC50分别为0.6、1.58和0.33ppm。
实施例2
取吩嗪-1-羧酸生产菌培养基配方重量百分比：葡萄糖2.2％、蛋白胨2.5％、硝酸钾1.5％、硫酸镁0.35％、余量为水及其他成分，pH7.5。
吩嗪-1-羧酸的制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量60毫升，于30℃下，震荡培养过夜，按8％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量200毫升，继续置于30℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经80小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm， 20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：1.5∶20，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
生物合成的吩嗪-1-羧酸(0.1％)悬浮剂的使用浓度为10ppm时，对甜瓜蔓枯病菌接种感染的防治效果达80％，优于目前生产上使用的化学农药多菌灵。
实施例3
取吩嗪-1-羧酸生产菌培养基的配方重量百分比：葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、硝酸钾1.0％、硫酸镁0.2％、余量为水及其他成分，pH6。
吩嗪-1-羧酸的制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量50毫升，于28℃下，震荡培养过夜，按5％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量160毫升，继续置于28℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经60小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：1∶19，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
0.1％吩嗪-1-羧酸悬浮剂稀释100、200倍，使用浓度分别为10、5ppm，对甜瓜蔓枯病有较好的防效，防效分别达87.3％和83.13％，具有10％的增产效益。对照药剂50％多菌灵WP800倍的为防效61.8％，与对照药剂相比，存在显著差异。
实施例4
取吩嗪-1-羧酸生产菌培养基的配方重量百分比：葡萄糖1.8％、蛋白胨1.5％、硝酸钾0.5％、硫酸镁0.05％、余量为水及其他成分，pH7.0。
吩嗪-1-羧酸的制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量40毫升，于26℃下，震荡培养过夜，按3％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量130毫升，继续置于26℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经40小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：0.5∶18，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
0.1％吩嗪-1-羧酸悬浮剂稀释100、200倍，使用浓度分别为10、5ppm，对黄瓜枯萎病有较好的防效，防效分别达89.0％和83.4％，显著高于对照药剂50％多菌灵WP500倍69.6％的防效，经方差分析，吩嗪-1-羧酸(0.1％悬浮剂)稀释100、200倍之间差异不显著，但与对照药剂50％多菌灵WP500倍之间存在显著差异；0.1％吩嗪-1-羧酸悬浮剂稀释300倍对黄瓜枯萎病也有76.2％的防效，与0.1％吩嗪-1-羧酸悬浮剂稀释100、200倍之间存在显著差异，与对照药剂50％多菌灵WP500倍69.6％差异不显著。
实施例5
取吩嗪-1-羧酸生产菌培养基的配方重量百分比：葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、硝酸钾1.0％、硫酸镁0.2％、余量为水及其他成分，pH6。
吩嗪-1-羧酸的制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量50毫升，于28℃下，震荡培养过夜，按5％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量160毫升，继续置于28℃下，震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经60小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：1∶19，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
0.1％吩嗪-1-羧酸悬浮剂稀释100、200倍，使用浓度分别为10、5ppm，对春椒根腐病具有较好的防治效果，防效分别达到89.47％和84.32％，显著高于对照药剂50％多菌灵WP500倍73.73％的防效
Claims (2)
1、一种吩嗪-1-羧酸生产菌培养基，其特征在于配方重量百分比为：葡萄糖1.8-2.2％、蛋白胨1.5-2.5％、硝酸钾0.5-1.5％、硫酸镁0.05-0.35％、余量为水及其他成分，pH5.5-7.5。
2、一种吩嗪-1-羧酸的制备方法，其特征是制备方法具体为：1.培养程序：将斜面菌种接种于150毫升三角瓶中，培养基瓶装量40-60毫升，于26-30℃下，震荡培养过夜，按3-8％的接种量，转接于500毫升三角瓶中，培养基瓶装量130-200毫升，继续置于26-30℃下震荡培养，以发酵生产吩嗪-1-羧酸；2.吩嗪-1-羧酸的提取和粗制备：经40-80小时扩大培养后，吩嗪-1-羧酸菌悬液经离心机4000rpm，20min离心，弃去菌体沉淀物，取上清液，经等体积的氯仿提取，分层后，取有机相，经旋转蒸发仪蒸去氯仿，提取物溶于有机苯中；3.吩嗪-1-羧酸的纯化：经硅胶柱吸附分配层析，流动相为水和苯，体积比为：0.5-1.5∶18-20，分部收集，获得纯度为99％以上的吩嗪-1-羧酸纯品。
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