CN113439745A - 一种新型植物免疫蛋白及其生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型植物免疫蛋白，按重量份计，植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白1‑20份，腐植酸4‑10份，磷酸钾缓冲液20‑30份，蛋白保护剂1‑4份。本发明从链格孢霉菌和炭疽菌中分离纯化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成植物免疫蛋白生物农药6％寡糖·链蛋白质可湿性粉剂，能够促进植物根系生长，增强植物免疫，达到防治病害的效果，对于提高茶树促进防御物质的产生，提高免疫力，减轻病害的发生，在抗病、增产、抗冻、提高品质方面具有良好效果。

Description

一种新型植物免疫蛋白及其生产工艺
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种新型植物免疫蛋白及其生产工艺。
背景技术
随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，社会对改善生态环境的要求越来越迫切，对食品安全问题的关注度越来越高；植物免疫蛋白是一种绿色安全的新型叶面肥，在蔬菜、水稻上使用可增产、提质，但在茶叶生产上的使用方法及其对茶叶产量和品质的影响程度尚未确定；因此，探索植物免疫蛋白对茶叶产量及主要品质成分的影响，对实现茶叶高效持续生产具有重要意义。
人类对植物免疫的认识来源于农业生产实践，农业生产者很早就发现植物像人和动物一样会生病，但并不了解植物为何生病；1846年，Mile Joseph提出病原微生物的侵染是引起植物病害的原因，开启了植物病理学的研究；至19世纪末，植物病理学家逐渐认识到，有些植物不易生病是因其具有抗病性；然而直到20世纪末，因植物中众多抗病基因的发现，才逐渐产生了植物先天免疫的概念，并促进了人们对植物抗病机制的了解。
前人研究进展植物免疫蛋白是从植物、酵母和微生物中提取的初生多肽复合蛋白(NAC)，在蔬菜、水稻上的使用已有研究报道，目前有关植物免疫蛋白对提高茶叶产量、改善茶叶品质的研究未见报道，并且免疫蛋白虽然具有普适性，但是对茶叶中常见的病害免疫效果不佳，而现有技术当中针对茶叶的病害主要使用农药，使得茶叶品质不佳。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种新型植物免疫蛋白及其生产工艺，能够提高茶叶抗病，促进茶叶健康生长。本发明采用的技术方案是：
一种新型植物免疫蛋白，其中：按重量份计，所述植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白1-20份，腐植酸4-10份，磷酸钾缓冲液20-30份，蛋白保护剂1-4份。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白，其中：所述免疫蛋白包括链格孢霉菌和炭疽菌，链格孢霉菌和炭疽菌质量比为2～4:1。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白，其中：所述蛋白保护剂包括40-45wt％氨基葡萄糖、30-35wt％硫酸软骨素、10-15wt％β-环糊精、5-20wt％十八烷基二甲基胺乙内酯。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白，其中：所述腐植酸为黄腐殖酸。
一种新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：包括以下步骤：
S1.将链格孢霉菌和炭疽菌在全营养性培养基条件下分别活化，富集培养48-72h，用于接种，将链格孢霉菌和炭疽菌的菌体于无菌操作条件下，接种于固态发酵培养基，进行一级发酵培养，培养过程中搅拌并通气，得到第一发酵液；
S2.将第一发酵液接种于固态发酵培养基，进行二级发酵培养24～36h，得到第二发酵液；
S3.将第二发酵液接种于固态发酵培养基，进行三级发酵培养8～16h，得到三级发酵培养；
S4.将三级发酵培养液中加入磷酸钾缓冲液和蛋白保护剂混合搅拌0.5～1h，得到第一混合液；
S5.将混合液中进行胶体磨细胞破碎，然后添加腐殖酸，混合搅拌1～3h，得到第二混合液；
S6.将第二混合液进行喷雾干燥，得到新型植物免疫蛋白。
植物免疫蛋白是从上千个真菌微生物筛选，最后选择了性能最好、成本最低的链格孢霉菌和炭疽菌，将这个菌的蛋白喷到水稻、番茄、辣椒、玉米、草莓等等这些作物上，研究发现蛋白会诱导植物产生水杨酸、茉莉酸，最终产生苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶、植保素、病程相关蛋白等的变化，以此起到提高植物抗病、促进植物健康生长的作用。
通过诱导植物产生HR、ROS、NO和SA等免疫信号传导途径，引起抗性基因和蛋白上调表达使植物产生系统抗病性，植物免疫增产蛋白施用在植物上后，首先与植物细胞膜上的受体蛋白结合，植物的受体蛋白在接受免疫增产蛋白的信号传导后，迅速诱导了植物的一系列代谢反应；首先激活植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，提高植物对CO2的利用率，增加植物叶绿素含量12％—15％，从而提高植物的光合作用；促进植物体内的水杨酸和茉莉酸的合成，再经水杨酸或茉莉酸途径合成植保素、抗病相关蛋白、蛋白酶抑制剂和乙烯等从而使植物植株健壮，从而达到增产抗病的作用。
在此基础上，研究结果还表明诱导植物产生HR、ROS、NO和SA等免疫信号传导途径，引起抗性基因和蛋白上调表达使植物产生系统抗病性，植物蛋白可通过不同的代谢途径实现信号传导，通过诱导植物自身防御系统和生长系统，提高植物自身免疫力，调节植物生长代谢系统，促进植物生长，提高作物产量和产品品质，减少肥料使用量可达20％。
链格孢霉菌具有高效稳定诱导植物抗病性和促进植物生长可产业化的新蛋白，残留农药的类型主要是有机磷类和有机氯类，而植物免疫增产蛋白施用在植物上后，首先与植物细胞膜上的受体蛋白结合，植物的受体蛋白在接受免疫增产蛋白的信号传导后，迅速诱导了植物的一系列代谢反应，并且植物免疫增产蛋白是一类信号传导分子，可通过不同的代谢途径实现信号传导，通过诱导植物自身防御系统和生长系统，提高植物自身免疫力，调节植物生长代谢系统，促进植物生长，提高作物产量和产品品质，减少肥料使用量可达20％。
残留农药的类型主要是有机磷类和有机氯类。而植物免疫增产蛋白施用在植物上后，首先与植物细胞膜上的受体蛋白结合，植物的受体蛋白在接受免疫增产蛋白的信号传导后，迅速诱导了植物的一系列代谢反应。链格孢霉菌中分离纯化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成植物免疫蛋白生物农药6％寡糖·链蛋白质可湿性粉剂，能够促进植物根系生长，增强植物免疫，达到防治病害的效果；研究表明，能使碧螺春茶、白茶、阡苔茶等茶类作物以增产5％～10％，并且对茶云纹叶枯病、茶轮斑病、茶炭疽病、茶褐色叶斑病等具有明显的防治效果，对于提高茶树促进防御物质的产生，提高免疫力，减轻病害的发生，在抗病、增产、抗冻、提高品质等方面具有良好效果。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：所述步骤S1菌体的接种量为6％～10％，一级发酵培养的温度为25℃～35℃。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：所述步骤S1一级发酵培养搅拌速度为100rpm，通气量为200L/h，pH6.8-7.0，培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定30％～35％，培养过程中每隔30min测定发酵液的OD600值。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：所述步骤S2二级发酵培养接种量为5-10％，搅拌速度为150rpm,通气量为1.8m3/h，pH6.8-7.0，35～37℃培养。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：所述步骤S3三级发酵培养接种量为3-7％，搅拌速度为200rpm,通气量为1.0m3/h，pH6.8-7.0，35～37℃培养。
优选的是，所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：按重量份计，所述固态发酵培养基包括以下组分：
酵母蛋白胨50～60份、大豆蛋白胨5～7份、葡萄糖2～4份、L-半胱氨酸0.5～2份、磷酸二氢钾0.5～1份、碳酸氢钠0.5～1份、氯化钠0.2～0.4份、氯化钙0.3～0.5份、硫酸镁0.1～0.3份、琼脂0.2～0.4份。
本发明的优点：
(1)本发明从链格孢霉菌和炭疽菌中分离纯化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成植物免疫蛋白生物农药6％寡糖·链蛋白质可湿性粉剂，能够促进植物根系生长，增强植物免疫，达到防治病害的效果，对于提高茶树促进防御物质的产生，提高免疫力，减轻病害的发生，在抗病、增产、抗冻、提高品质等方面具有良好效果。
(2)本发明的新型植物免疫蛋白使茶具有整体免疫性，一因多效，能够快速抵抗和预防细菌、真菌、病毒多种病害，增加抗病率达到60-80％；增产15-30％，使茶既速长，但不疯长，生长快速但不会导致茶生长节律的紊乱；苗期应用生根、生长和抗病效果特别好，根生长活跃，吸收力强，叶绿素含量高；抗冻、抗旱、解药害，降低农药残留，大大缓解肥料烧苗现象；平均出牙期提早10-15天，可提高明前茶的产量。
(3)本发明的新型植物免疫蛋白及其生产工艺，系统研究了规模化蛋白发酵新技术，建立了分级发酵、提取、后处理和剂型加工新工艺，解决了蛋白产量低、成本高的技术难题，蛋白产量提高4倍以上，生产成本降低了60％；确定了高效保护和稳定蛋白的缓冲系统，有效解决了制剂加工及贮存过程中蛋白不稳定的瓶颈技术，使蛋白制剂的货架期由原来的6个月提高到2年以上。
(4)本发明的新型植物免疫蛋白及其生产工艺，创立了蛋白高效制剂生产新工艺，突破了制约蛋白产业化的技术瓶颈，实现了规模化生产，自主研发了一条高效低成本的免疫诱导蛋白规模化生产线；开创了免疫诱导蛋白生物农药新产业；提出了基于植物免疫诱导机理创制生物农药的新思路，建立了配套技术规程；实现了大规模推广应用，引领了蛋白质生物农药产业发展。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种新型植物免疫蛋白，其中：按重量份计，所述植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白1份，腐植酸4份，磷酸钾缓冲液20份，蛋白保护剂1份。
免疫蛋白包括链格孢霉菌和炭疽菌，链格孢霉菌和炭疽菌质量比为2:1，蛋白保护剂包括40wt％氨基葡萄糖、30wt％硫酸软骨素、10wt％β-环糊精、20wt％十八烷基二甲基胺乙内酯；腐植酸为黄腐殖酸。
一种新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：包括以下步骤：
S1.将链格孢霉菌和炭疽菌在全营养性培养基条件下分别活化，富集培养48h，用于接种，将链格孢霉菌和炭疽菌的菌体于无菌操作条件下，接种于固态发酵培养基，进行一级发酵培养，培养过程中搅拌并通气，得到第一发酵液；菌体的接种量为6％，一级发酵培养的温度为25℃，一级发酵培养搅拌速度为100rpm,通气量为200L/h，pH6.8-7.0,培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定30％；
S2.将第一发酵液接种于固态发酵培养基，进行二级发酵培养24h，得到第二发酵液，二级发酵培养接种量为5％，搅拌速度为150rpm，通气量为1.8m3/h，pH6.8-7.0，36℃培养；
S3.将第二发酵液接种于固态发酵培养基，进行三级发酵培养8h，得到三级发酵培养，三级发酵培养接种量为3％，搅拌速度为200rpm，通气量为1.0m3/h，pH6.8-7.0，35℃培养；
S4.将三级发酵培养液中加入磷酸钾缓冲液和蛋白保护剂混合搅拌0.5～1h，得到第一混合液；
S5.将混合液中进行胶体磨细胞破碎，然后添加腐殖酸，混合搅拌1～3h，得到第二混合液；
S6.将第二混合液进行喷雾干燥，得到新型植物免疫蛋白。
固态发酵培养基包括以下组分：酵母蛋白胨50份、大豆蛋白胨5份、葡萄糖2份、L-半胱氨酸0.5份、磷酸二氢钾0.5份、碳酸氢钠0.5份、氯化钠0.2份、氯化钙0.3份、硫酸镁0.1份、琼脂0.2份。
实施例2
一种新型植物免疫蛋白，其中：按重量份计，所述植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白10份，腐植酸6份，磷酸钾缓冲液25份，蛋白保护剂3份。
免疫蛋白包括链格孢霉菌和炭疽菌，链格孢霉菌和炭疽菌质量比为3:1，蛋白保护剂包括42wt％氨基葡萄糖、34wt％硫酸软骨素、12wt％β-环糊精、12wt％十八烷基二甲基胺乙内酯，腐植酸为黄腐殖酸。
一种新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：包括以下步骤：
S1.将链格孢霉菌和炭疽菌在全营养性培养基条件下分别活化，富集培养48-72h，用于接种，将链格孢霉菌和炭疽菌的菌体于无菌操作条件下，接种于固态发酵培养基，进行一级发酵培养，培养过程中搅拌并通气，得到第一发酵液，菌体的接种量为8％，一级发酵培养的温度为30℃，发酵培养时间为60h，一级发酵培养搅拌速度为100rpm，通气量为200L/h，pH6.8-7.0,培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定32％；
S2.将第一发酵液接种于固态发酵培养基，进行二级发酵培养30h，得到第二发酵液，二级发酵培养接种量为8％，搅拌速度为150rpm，通气量为1.8m3/h，pH6.8-7.0，36℃培养；
S3.将第二发酵液接种于固态发酵培养基，进行三级发酵培养12h，得到三级发酵培养；
S4.将三级发酵培养液中加入磷酸钾缓冲液和蛋白保护剂混合搅拌0.6h，得到第一混合液，三级发酵培养接种量为5％，搅拌速度为200rpm，通气量为1.0m3/h，pH6.8-7.0，36℃培养；
S5.将混合液中进行胶体磨细胞破碎，然后添加腐殖酸，混合搅拌2h，得到第二混合液；
S6.将第二混合液进行喷雾干燥，得到新型植物免疫蛋白。
按重量份计，所述固态发酵培养基包括以下组分：酵母蛋白胨55份、大豆蛋白胨6份、葡萄糖3份、L-半胱氨酸1份、磷酸二氢钾0.7份、碳酸氢钠0.6份、氯化钠0.3份、氯化钙0.4份、硫酸镁0.2份、琼脂0.3份。
实施例3
一种新型植物免疫蛋白，其中：按重量份计，所述植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白20份，腐植酸10份，磷酸钾缓冲液30份，蛋白保护剂4份。
免疫蛋白包括链格孢霉菌和炭疽菌，链格孢霉菌和炭疽菌质量比为4:1，蛋白保护剂包括45wt％氨基葡萄糖、35wt％硫酸软骨素、15wt％β-环糊精、5wt％十八烷基二甲基胺乙内酯，腐植酸为黄腐殖酸。
一种新型植物免疫蛋白的生产工艺，其中：包括以下步骤：
S1.将链格孢霉菌和炭疽菌在全营养性培养基条件下分别活化，富集培养72h，用于接种，将链格孢霉菌和炭疽菌的菌体于无菌操作条件下，接种于固态发酵培养基，进行一级发酵培养，培养过程中搅拌并通气，得到第一发酵液，步骤S1菌体的接种量为10％，一级发酵培养的温度为35℃，发酵培养时间为72h，一级发酵培养搅拌速度为100rpm，通气量为200L/h，pH6.8-7.0，培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定35％；
S2.将第一发酵液接种于固态发酵培养基，进行二级发酵培养36h，得到第二发酵液，二级发酵培养接种量为10％，搅拌速度为150rpm，通气量为1.8m3/h，pH6.8-7.0，37℃培养；
S3.将第二发酵液接种于固态发酵培养基，进行三级发酵培养16h，得到三级发酵培养，三级发酵培养接种量为7％，搅拌速度为200rpm，通气量为1.0m3/h，pH6.8-7.0，37℃培养；
S4.将三级发酵培养液中加入磷酸钾缓冲液和蛋白保护剂混合搅拌1h，得到第一混合液；
S5.将混合液中进行胶体磨细胞破碎，然后添加腐殖酸，混合搅拌1～3h，得到第二混合液；
S6.将第二混合液进行喷雾干燥，得到新型植物免疫蛋白。
按重量份计，所述固态发酵培养基包括以下组分：
酵母蛋白胨60份、大豆蛋白胨7份、葡萄糖4份、L-半胱氨酸2份、磷酸二氢钾1份、碳酸氢钠1份、氯化钠0.4份、氯化钙0.5份、硫酸镁0.3份、琼脂0.4份。
实施例1的新型植物免疫蛋白使用方法：
苗期用新型植物免疫蛋白1000倍稀释液喷施；茶树新梢的生长发育：移栽前用新型植物免疫蛋白800-1000倍稀释液喷施；茶树的开花结实：用新型植物免疫蛋白800倍稀释液喷施。
为较好地反映茶树新梢的萌发程度，在苏州市西山区碧螺春试验基地进行调查，茶树发芽密度调查主要在茶叶第一次开采前(第一批)进行，表1为喷施植物免疫蛋白的茶树发芽密度情况，由表1可知，喷施实施例1的植物免疫蛋白能有效增加茶树的发芽密度，3个处理平均增加14.89％，其中，以1200倍液处理的总发芽密度最高，达1588个/m2，比CK增加16.59％；1000倍液处理的总发芽密度为1571个/m2，比CK增加15.42％；800倍液处理的总发芽密度为1538个/m2，比CK增加12.92％。方差分析结果表明，各处理间的发芽密度、发芽密度差异亦不显著。
表1喷施植物免疫蛋白的茶树发芽密度情况
Figure BDA0003089547360000061
表2喷施植物免疫蛋白对茶叶主要品质成分的影响
Figure BDA0003089547360000062
Figure BDA0003089547360000071
由表2可知，喷施植物免疫蛋白能有效提高茶叶水浸出物、茶多酚、咖啡碱和表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG)的含量，3个处理的平均值分别比CK提高3.9％、6.9％、2.7％和5.7％。其中，以1000倍液处理的水浸出物、茶多酚和EGCG含量最高，分别为43.0％、32.1％和7.1％，分别比CK提高7.7％、9.6％和12.7％。方差分析结果表明，各处理间的茶多酚、氨基酸及咖啡碱含量差异不显著；但1000倍液处理的水浸出物含量与CK、800倍液和1200倍液处理差异显著(P＜0.05，下同)，EGCG含量与CK、1200倍液处理差异显著。
实施例4
福鼎白茶福建省福鼎市特产，中国国家地理标志产品，茶炭疽病和茶轮斑病是茶叶的2种主要病害，在我国茶区时有发生，严重影响茶叶的产量与品质。目前，国内对这2种病害的防治仍主要采用化学防治手段，然而化学防治方法又存在农残问题，严重制约茶叶的出口；虽然有报道蛇床子素等拮抗菌制作的生物农药对植物病菌也有防治效果，但针对茶叶真菌病害的生物制剂的筛选及其推广范围仍相对有限；2019年福建白茶产业为提高茶叶产量选用本发明的新型植物免疫蛋白，一年以来茶叶产量效果显著据数据显示2019年福鼎市白茶产量为21533吨，较2018年增加了3829吨，同比增长21.63％。
实施例5
将实施例2的新型植物免疫蛋白茶倍健与蛇床子素对比，表3显示，施药后7d，T2和T4的防治效果相当，分别为27.34％和26.53％，均高于T1(10.2％)和T3(20％)，各个处理间无显著性差异；用药后14d,T2(26.48％)的防治效果分别高于T1(21.87％)、T3(13.88％)和T4(19.86％)，防治效果明显，处理间无显著性差异。试验结果表明“茶倍健”的防治效果优于蛇床子素，300倍稀释液处理区的防效最佳。
表3
Figure BDA0003089547360000072
本发明的新型植物免疫蛋白预防各类病害的发生，对于茶炭疽病、茶轮斑病茶云斑叶枯病、茶白星病有预防效果，提高茶叶品质，净度以及色泽，延长采摘期,合理使用可明显提高产量。
本发明从链格孢霉菌和炭疽菌中分离纯化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成植物免疫蛋白生物农药6％寡糖·链蛋白质可湿性粉剂，能够促进植物根系生长，增强植物免疫，达到防治病害的效果，对于提高茶树促进防御物质的产生，提高免疫力，减轻病害的发生，在抗病、增产、抗冻、提高品质等方面具有良好效果。
本发明的新型植物免疫蛋白使茶具有整体免疫性，一因多效，能够快速抵抗和预防细菌、真菌、病毒多种病害，增加抗病率达到60-80％；增产15-30％，使茶既速长，但不疯长，生长快速但不会导致茶生长节律的紊乱；苗期应用生根、生长和抗病效果特别好，根生长活跃，吸收力强，叶绿素含量高；抗冻、抗旱、解药害，降低农药残留，大大缓解肥料烧苗现象；平均出牙期提早10-15天，可提高明前茶的产量。
本发明的新型植物免疫蛋白及其生产工艺，系统研究了规模化蛋白发酵新技术，建立了分级发酵、提取、后处理和剂型加工新工艺，解决了蛋白产量低、成本高的技术难题，蛋白产量提高4倍以上，生产成本降低了60％；确定了高效保护和稳定蛋白的缓冲系统，有效解决了制剂加工及贮存过程中蛋白不稳定的瓶颈技术，使蛋白制剂的货架期由原来的6个月提高到2年以上。
本发明的新型植物免疫蛋白及其生产工艺，创立了蛋白高效制剂生产新工艺，突破了制约蛋白产业化的技术瓶颈，实现了规模化生产，自主研发了一条高效低成本的免疫诱导蛋白规模化生产线。开创了免疫诱导蛋白生物农药新产业；提出了基于植物免疫诱导机理创制生物农药的新思路，建立了配套技术规程；实现了大规模推广应用，引领了蛋白质生物农药产业发展。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种新型植物免疫蛋白，其特征在于：按重量份计，所述植物免疫蛋白包括以下组分：免疫蛋白1-20份，腐植酸4-10份，磷酸钾缓冲液20-30份，蛋白保护剂1-4份。
2.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白，其特征在于：所述免疫蛋白包括链格孢霉菌和炭疽菌，链格孢霉菌和炭疽菌质量比为2～4:1。
3.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白，其特征在于：所述蛋白保护剂包括40-45wt％氨基葡萄糖、30-35wt％硫酸软骨素、10-15wt％β-环糊精、5-20wt％十八烷基二甲基胺乙内酯。
4.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白，其特征在于：所述腐植酸为黄腐殖酸。
5.一种新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将链格孢霉菌和炭疽菌在全营养性培养基条件下分别活化，富集培养48-72h，用于接种，将链格孢霉菌和炭疽菌的菌体于无菌操作条件下，接种于固态发酵培养基，进行一级发酵培养，培养过程中搅拌并通气，得到第一发酵液；
S2.将第一发酵液接种于固态发酵培养基，进行二级发酵培养24～36h，得到第二发酵液；
S3.将第二发酵液接种于固态发酵培养基，进行三级发酵培养8～16h，得到三级发酵培养；
S4.将三级发酵培养液中加入磷酸钾缓冲液和蛋白保护剂混合搅拌0.5～1h，得到第一混合液；
S5.将第一混合液中进行胶体磨细胞破碎，然后添加腐殖酸，混合搅拌1～3h，得到第二混合液；
S6.将第二混合液进行喷雾干燥，得到新型植物免疫蛋白。
6.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：所述步骤S1菌体的接种量为6％～10％，一级发酵培养的温度为25℃～35℃。
7.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：所述步骤S1一级发酵培养搅拌速度为100rpm,通气量为200L/h，pH6.8-7.0，培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定30％～35％。
8.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：所述步骤S2二级发酵培养接种量为5-10％，搅拌速度为150rpm，通气量为1.8m3/h，pH6.8-7.0，35～37℃培养。
9.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：所述步骤S3三级发酵培养接种量为3-7％，搅拌速度为200rpm，通气量为1.0m3/h，pH6.8-7.0，35～37℃培养。
10.根据权利要求1所述的新型植物免疫蛋白的生产工艺，其特征在于：按重量份计，所述固态发酵培养基包括以下组分：
酵母蛋白胨50～60份、大豆蛋白胨5～7份、葡萄糖2～4份、L-半胱氨酸0.5～2份、磷酸二氢钾0.5～1份、碳酸氢钠0.5～1份、氯化钠0.2～0.4份、氯化钙0.3～0.5份、硫酸镁0.1～0.3份、琼脂0.2～0.4份。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115067335A (zh) * 2022-05-12 2022-09-20 山东省农业科学院 硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用
CN115340425A (zh) * 2022-08-17 2022-11-15 河南柏裕植物免疫科技有限公司 一种激活植物次生代谢的免疫蛋白

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104920469A (zh) * 2015-05-21 2015-09-23 杭州市农业科学研究院 一种植物免疫诱抗剂在防治葡萄霜霉病和炭疽病中的应用
CN105875651A (zh) * 2014-10-17 2016-08-24 中国农科院植保所廊坊农药中试厂 一种经微生物发酵制得的极细链格孢激活蛋白在农药制剂中的应用
CN109561692A (zh) * 2016-04-04 2019-04-02 艾登生物技术公司 微生物产生的对植物具有刺激活性的组合物
CN110122482A (zh) * 2019-05-08 2019-08-16 北京普绿通生物肥料厂 一种极细链格孢PeaT1植物免疫蛋白可溶性粉剂的制备工艺
CN112088885A (zh) * 2020-10-26 2020-12-18 潍坊华诺生物科技有限公司 一种含氨基寡糖素的植物免疫诱抗剂及其在黄瓜幼苗期中的应用
CN112194523A (zh) * 2020-09-24 2021-01-08 石家庄农信生物科技集团有限公司 一种含黄腐酸和壳聚寡糖的植物免疫制剂

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105875651A (zh) * 2014-10-17 2016-08-24 中国农科院植保所廊坊农药中试厂 一种经微生物发酵制得的极细链格孢激活蛋白在农药制剂中的应用
CN104920469A (zh) * 2015-05-21 2015-09-23 杭州市农业科学研究院 一种植物免疫诱抗剂在防治葡萄霜霉病和炭疽病中的应用
CN109561692A (zh) * 2016-04-04 2019-04-02 艾登生物技术公司 微生物产生的对植物具有刺激活性的组合物
CN110122482A (zh) * 2019-05-08 2019-08-16 北京普绿通生物肥料厂 一种极细链格孢PeaT1植物免疫蛋白可溶性粉剂的制备工艺
CN112194523A (zh) * 2020-09-24 2021-01-08 石家庄农信生物科技集团有限公司 一种含黄腐酸和壳聚寡糖的植物免疫制剂
CN112088885A (zh) * 2020-10-26 2020-12-18 潍坊华诺生物科技有限公司 一种含氨基寡糖素的植物免疫诱抗剂及其在黄瓜幼苗期中的应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115067335A (zh) * 2022-05-12 2022-09-20 山东省农业科学院 硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用
CN115067335B (zh) * 2022-05-12 2023-11-03 山东省农业科学院 硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用
CN115340425A (zh) * 2022-08-17 2022-11-15 河南柏裕植物免疫科技有限公司 一种激活植物次生代谢的免疫蛋白

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