CN109561692A - 微生物产生的对植物具有刺激活性的组合物 - Google Patents

微生物产生的对植物具有刺激活性的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由微生物细胞培养物产生的组合物，其包括无微生物组合物以及包含灭活微生物的组合物。本发明还涉及获得由微生物细胞培养物产生的组合物和包含它们的农业组合物的方法。本发明还涉及本发明组合物作为植物生长促进剂的用途和促进对植物的刺激活性的方法，所述方法包括向植物施用这些组合物。

Description

微生物产生的对植物具有刺激活性的组合物
本申请要求于2016年4月4日提交的欧洲专利申请EP16382146.5的权益。
本发明涉及由微生物细胞培养物产生的组合物，其对植物具有刺激活性。本发明还涉及其制备方法，涉及包含其的农业组合物，以及其在促进植物生长和产量的方法中的用途。
背景技术
为了提高田间，特别是植物和作物的农业生产力，传统上使用合成化学成分，如肥料或植物生长调节剂或基因工程方法来改善植物生长，及植物相关产品的品质和产量。
然而，这些方法可能在长期中与一些问题相关或者非常昂贵。例如，外部化学品的过量施用可能导致环境污染和导致植物生长的土壤条件的恶化，这通常需要施加额外的合成物质以改善土壤条件。
植物的生长和发育受到在叶圈地上、根际地下和/或维管转运系统内的根内(endosphere)和非原质体空间中发生的微生物的影响。微生物合成多种物质，包括碳水化合物、蛋白质、脂质、氨基酸、激素等，它们可以直接或间接地起作用以激活植物免疫或调节植物生长和形态发生。
微生物还合成并释放出许多挥发性化合物(VOC，VC)，其分子量小于300Da，极性低，蒸气压高，可远离其原点扩散，并在土壤和空气环境中迁移，也可通过多孔木质材料迁移。
因此，VOC可以在种间通信中扮演化学信息素的潜在重要作用，参与地下和地上的植物和微生物之间的无数相互作用。
某些细菌和真菌释放的VOC会对植物生长产生抑制作用。反之，根据微生物培养条件，一些有益的根际细菌和真菌的挥发性排放可以促进植物生长。
例如Ryu等.(PNAS 2003，第100(8)卷，第4927-4932页)描述了拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗暴露于六种生长促进细菌菌株释放的空气传播化学物质对植物生长的影响：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)89B-61、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T4、巴氏芽孢杆菌(B.pasteurii)C-9、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)GB03、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)IN937a、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)90-166和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)JM22。然而，该文献中描述的方法不适合大规模生产。
此外，WO2011135121公开了来自从革兰氏阴性和革兰氏阳性菌到不同真菌的许多微生物的VOC促进多种植物物种的生长和开花。根据该文献，并非由微生物产生的所有挥发物都能够影响生物质的增加。该文献中引用的微生物包括真菌物种肉青霉菌(Penicilliumcharlesii)、黄灰青霉菌(Penicillium aurantiogriseum)、或链格孢菌(Alternariaalternata)，酵母物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和细菌物种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)。根据该文献，暴露于由这些微生物产生的VOC还促进了单子叶和双子叶植物叶中特别高水平的淀粉的积累。然而，对于某些应用，可能需要在不改变淀粉水平的情况下促进植物生长。此外，该文献仅提供关于适合于大规模生产或在开放领域中应用的组合物的制备的很少信息。
因此，需要开发替代的农业组合物和策略，以可持续和环境友好的方式增加植物，特别是大田作物或园艺作物的产量。
发明内容
本发明的发明人发现并开发了由微生物细胞培养物产生的新组合物，其对植物，特别是作物(包括大田作物和园艺作物)具有刺激活性，对植物无毒并且不会对其品质特性产生负面影响。如在本发明的实施例中所示，当与植物接触时，这些组合物促进植物生长。特别是例如，在处理过的植物中观察到净产量(可接受的原料)、商业产量、早期植物生长、早期植物发育的增加，枝条数量的增加，叶鲜重(FW)、枝条长度、枝条系统鲜重(FW)/干重(DW)、根长度、地上部分鲜重(FW)/干重(DW)、穗鲜重(FW)/干重(DW)、种子鲜重(FW)/干重(DW)、根鲜重(FW)/干重(DW)、穗数和叶绿素和蛋白质含量的增加。对于果实，还观察到果实大小和数量(比重、商业重量)的增加而没有对果实硬度、质地、pH或白利糖度的负面影响，以及过熟果实的量减少。实施例还表明经处理的植物显示出改善的出苗率和对非生物胁迫的抗性。
此外，在某些实施方式中，在不改变淀粉水平的情况下实现植物生长，这对于某些应用可能是有益的。在某些情况下，淀粉水平的变化可能继之以蛋白质含量的变化，这在某些情况下不具有商业利益，例如在饲料谷物的生产中。
此外，由本文公开的微生物细胞培养物产生的组合物可以通过易于扩展的方法获得，这使得它们适合于工业生产，原样或者配制成农业组合物。
由微生物细胞培养物产生的本发明组合物包括不含微生物或其片段的无微生物组合物，和包含灭活微生物的组合物。这些组合物可通过在特定生长培养基中培养微生物细胞培养物而获得，因此它们不存在于自然界中。
因此，发明的第一方面涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的无微生物组合物：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物，
其中，其中所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌(Alternaria alternata)菌株CECT 20912或其突变株、链格孢菌菌株CECT 2662或其突变株、链格孢菌菌株CECT20560或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20923或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20943或其突变株、链格孢菌菌株DSM-1102或其突变株、链格孢菌菌株DSM-12633或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62006或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62010或其突变株、链格孢菌菌株MTCC1779或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 3793或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 6572或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7202或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7959或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 8459或其突变株、黄灰青霉菌(Penicillium aurantiogriseum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、葱腐葡萄孢(Botrytisaclada)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、肉青霉菌(Penicillium charlesii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小薰长喙壳菌(Ophiostoma ips)、拟青霉(Paecilomyces clavisporus)、指状青霉菌(Penicilliumdigitatum)、发酵毕赤酵母发酵变种(Pichia fermentans var.fermentans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)、费氏剑菌(Ensifer fredii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)、气味沙雷菌(Serratiaodorifera)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
本发明的第二方面涉及包含通过包括以下步骤的方法能够获得的灭活微生物的组合物：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，将步骤a)的培养基中的微生物灭活，以获得包含灭活微生物的组合物，其中，其中所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、球孢白僵菌、葱腐葡萄孢、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、肉青霉菌、产黄青霉菌、指状青霉菌、黄灰青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、哈茨木霉、大丽轮枝菌、异常威克汉姆酵母、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
由上述微生物细胞培养物产生的组合物可以以农业组合物的形式配制，所述农业组合物还包含另外的组分。因此，本发明的第三方面涉及农业组合物，其包含无微生物组合物或含有如上定义的灭活微生物的组合物，以及一种或多种农业上可接受的载体。
本发明的另一方面涉及获得如上定义的无微生物组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物。
本发明的另一方面涉及获得包含如上定义的灭活微生物的组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，将步骤a)的培养基中的微生物灭活，以获得包含灭活微生物的组合物。
如前所述，包括由微生物细胞培养物产生的组合物以及含有它们的农业组合物的本发明组合物在植物生长和相关特征中是有用的。因此，本发明的另一方面涉及如上定义的任何组合物作为植物生长促进剂的用途。
此外，本发明的另一方面涉及促进对植物的刺激活性的方法，其包括向植物施用有效量的如上定义的任何组合物。
在最后一个方面，本发明提供了保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)中的保藏号为CECT 20912的链格孢菌菌株，或其突变株。
根据布达佩斯条约，申请人于2014年6月11日在位于巴伦西亚大学(Edificio deinvestigación，Campus de Burjassot，46100Burjassot，巴伦西亚，西班牙)的西班牙典型培养物保藏中心(CECT)中保藏本发明的链格孢菌菌株。在认为菌株既可存活又纯之后，菌株被赋予保藏号CECT 20912。
本发明还涉及链格孢菌菌株CECT 20912的突变株。术语“突变株”应理解为使用本发明的菌株CECT 20912作为起始材料获得的真菌，其特征在于保持所述保藏菌株的性质。根据本发明，链格孢菌CECT 20912的“突变株”也被理解为链格孢菌CECT20912的“变体”。本领域技术人员将理解，使用本发明的菌株作为起始材料，可以常规地例如通过自发诱变或定向突变获得突变株。获得特定微生物菌株的突变株的方法是本领域已知的。实例可以在Sambrook，J.和Russell，D.W."Molecular Cloning："Molecular Cloning:A LaboratoryManual",第13章,"Mutagenesis",Cold Spring Harbor,第3版,2001中找到。
附图说明
图1显示了与对照植物相比，由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄植物的枝条长度中的作用。
图2显示了与对照植物相比，通过大肠杆菌细胞培养产生的无微生物组合物在番茄植物根长度中的作用。
图3显示了与对照植物相比，通过链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在土壤基质中番茄植物的根长度中的作用。
图4显示了与对照植物(T1)相比，通过链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物对在田间条件下生长并用不同处理(T8-T16)处理的番茄植物获得的净产量(可接受的原料)的作用。
图5显示了与对照植物(11)相比，通过链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物对在田间条件下生长并用不同处理(1、2和5)处理的番茄植物获得的平均净产量(可接受的原料)的作用。
图6显示了由系统发育多样性微生物发出的VOC在指定微生物的相邻培养物不存在或连续存在下培养一周的拟南芥植物的鲜重(FW)(a)和花芽出现时间(b)中的作用。
图7显示了由链格孢菌释放的VOC在土壤生长的拟南芥植物中的鲜重(FW)(a)和分别在土壤生长的玉米和辣椒植物中的植物高度(b和c)中的影响。在不存在或连续存在相邻的链格孢菌培养物的情况下培养所有处理过的植物指定的时间。将处理过的植物(+VC)的作用与对照(-VC)进行比较。
图8显示了与对照植物相比，进行来自链格孢菌、黄灰青霉菌和产黄青霉的真菌挥发物处理7天的拟南芥植物的根结构测定。
具体实施方式
除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语应以其本领域已知的普通含义理解。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在统一地应用于说明书和权利要求书中，除非另有明确规定的定义提供了更宽泛的定义。
如上所述，本发明涉及由微生物细胞培养物产生的组合物，其中微生物已经生长和代谢。被认为是植物病原体的微生物也可用于生产本发明的组合物，只要它们产生对植物具有刺激活性的组合物即可。由于这样的微生物本身可能对植物有害，因此将其除去或灭活。当微生物例如通过离心和/或过滤从已经生长微生物的培养基中除去时，则获得无微生物的组合物。作为另一种选择，微生物不从其生长的培养基中除去或不完全除去，但是它被灭活，例如，通过裂解(即经灭活微生物或其部分存在于培养基中)时，则获得包含灭活微生物的组合物。在两种情况下，这些组合物可通过在特定生长培养基中和如本文公开的培养条件下培养微生物而获得。
本文使用通过该方法可获得的术语“无微生物组合物”或“包含灭活微生物的组合物”来通过其制备方法定义这些组合物，并且是指可通过包括本文所定义的所示步骤的制备方法获得的产物。出于本发明的目的，表述“能够获得的”，“获得的”和类似的等同表达可互换使用，并且在任何情况下，表述“能够获得的”包括表达“获得的”。
出于本发明的目的，术语“微生物”是指单细胞、多细胞和无细胞生物，例如细菌和真菌等。
如本文所用的术语“无微生物组合物”是指由微生物细胞培养物产生的组合物，其在从培养基中除去已用于本发明方法的微生物后获得，特别是在该方法的步骤a)中。无微生物组合物缺乏任何活细胞、菌丝体或内生孢子，如上所述，它们可能对植物有害。然而，它可以含有对植物无毒的其他非病原微生物。
如本文所用的术语“包含灭活微生物的组合物”是指由微生物细胞培养物产生的组合物，其是在已经生长微生物的培养基中灭活微生物后获得的。术语“灭活微生物”是指从其天然状态改变并且不再能够在培养物中形成集落的微生物。灭活微生物可具有完整或破裂的细胞膜。
在本发明的任何方面或实施方式中，无论何时提及特定菌株(即，具有保藏号)，应该理解它是指保藏菌株和可以衍生并且维持起始菌株作为植物生长促进剂的基本特征的任何突变株。任何菌株的“突变株”也被理解为这种菌株的“变体”。本领域技术人员将理解，使用本发明的菌株作为起始材料，可以常规地例如通过自发诱变或定向突变获得突变株。获得特定微生物菌株突变株的方法是本领域已知的。实例可以在Sambrook，J.和Russell，D.W."Molecular Cloning："Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第13章,"Mutagenesis",Cold Spring Harbor,第3版,2001中找到。
如本文所用的术语“植物生长促进剂”是指可以是由本发明中定义的微生物细胞培养物产生的任何组合物和含有它们的任何农业组合物的试剂，与阴性对照或未处理的植物(即在相同条件下生长但未用本发明组合物处理的植物)相比，其对植物具有刺激活性。本文所用的表述“植物生长促进”、“对植物的刺激活性”和等同表达旨在通常包括植物生长和产量的增加，以及一种或多种下列植物特征的增加和/或改善：生长、产量、商业产量、生长速度、植物生长、植物发育、生物质、高度、坚固性(robustness)、枝条鲜重/干重、枝条系统鲜重/干重、根鲜重/干重、植物鲜重/干重、叶鲜重/干重、穗鲜重/干重、种子鲜重/干重、地上部分鲜重/干重、枝条数、穗、叶、种子、花蕾、花、果实和/或分枝的数量、发芽率、叶片、茎和根的大小、枝条长度、根长度、根毛数量和长度、茎粗、类胡萝卜素含量、叶绿素含量、花诱导(包括花芽外观(floral bud apperance)时间减少)、光合作用、作物产量、果实重量、果实比重、商业果实重量、果实大小、果实成熟、果实硬度、果实质地、果实长度、蛋白质含量、白利糖度、pH、出苗率和对非生物胁迫的抗性(包括耐热性或耐寒性、耐旱性、耐盐性等)、等等。
出于本发明的目的，任何具有刺激植物生长能力的菌株(包括植物病原体)可用于制备本发明的组合物。
用于制备本发明组合物的菌株的非限制性实例列于下表中，并通过西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónde Cultivos TIPO，CECT)，美国耶鲁大学大肠杆菌菌株库(Coli Genetic Stock Center，CGSC)，美国芽孢杆菌菌种保藏中心(Bacillus GeneticStock Center，BSGC)，德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，微生物类型培养物保藏和基因库(MTCC；印度)鉴定：
此外，还有众所周知的根癌土壤杆菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌株，它们也可用于制备本发明的组合物，如根癌土壤杆菌EHA105、根癌土壤杆菌GV2260、丁香假单胞菌1448A9、丁香假单胞菌9a/904、丁香假单胞菌PK2、肠道沙门氏菌LT2、解淀粉芽孢杆菌IN937a和枯草芽孢杆菌GB03。
如上所述，本发明的第一方面涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的无微生物组合物：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物，
其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、菌链格孢菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌、肉青霉菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、胶孢炭疽菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、指状青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、大丽轮枝菌、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
在本发明的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌、肉青霉菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、胶孢炭疽菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、指状青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、大丽轮枝菌、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
更特别的是，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC8459、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、球孢白僵菌菌株CECT2704、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、肉青霉菌菌株CECT 20937、产黄青霉菌菌株CECT 2277、哈茨木霉菌株CECT 2413和异常威克汉姆酵母菌株CECT 1114。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413和葱腐葡萄孢菌株CECT 2851。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413和葱腐葡萄孢菌株CECT 2851。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌、肉青霉菌菌株CECT 20937、泡盛曲霉、巴西曲霉、胶孢炭疽菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、指状青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、大丽轮枝菌、解淀粉芽孢杆菌菌株CECT 493、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、荧光假单胞菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌、肉青霉菌菌株CECT 20937、泡盛曲霉、巴西曲霉、胶孢炭疽菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、指状青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、大丽轮枝菌、解淀粉芽孢杆菌菌株CECT 493、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、荧光假单胞菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
如上所述，获得无微生物组合物的方法包括a)使微生物在适当的培养基中生长；和b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物。
在本发明的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，当微生物生长达到至少等于或高于对数生长期的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的值时，从步骤a)的培养基中除去微生物。更特别的是，在对数生长期开始后和死亡期开始之前，从步骤a)的培养基中除去微生物。在更具体的实施方式中，在对数生长期开始后和静止期开始之前，从步骤a)的培养基中除去微生物。
在另一个更具体的实施方式中，在静止期开始后从步骤a)的培养基中除去微生物。甚至更特别的是，当微生物生长达到至少等于或高于静止生长期的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的值时，从步骤a)的培养基中除去微生物。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，当每毫升菌落形成单位(CFU)等于或高于103、104、105、106或107时，进行步骤b)。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，在获得如上定义的无微生物组合物的方法中，步骤a)的培养基是缺乏氨基酸和蛋白质的培养基(例如，基本培养基)。
如本文所用的术语“微生物培养基”是指具有包括营养素、生长因子、矿物质等组分的培养基，其中接种微生物以用于其生长。
如本文所定义的术语“基本培养基”是指仅包含细胞在培养时存活和增殖所需的营养素的培养基，通常不存在氨基酸。通常含有作为Na、K、Ca、Mg、P、N和S的来源的无机盐，碳源和水。可选地，它可以含有一种或多种其他物质，如维生素。培养基组分的非限制性实例包括CoCl2.6H2O；CuSO4.5H2O；FeNaEDTA，H3BO3；KI；MnSO4.H2O；Na2MoO4.2H2O；ZnSO4.7H2O；CaCl2；KH2PO4；KNO3；MgSO4；NH4NO3；甘氨酸；肌醇；烟酸；吡哆醇HCl；硫胺素HCl；Na2HPO4；KH2PO4；NaCl NH4Cl；CaCl2；MgSO4。
这种基本培养基的非限制性实例是M9(95mM Na2HPO4/44mM KH2PO4/17mM NaCl/37mM NH4Cl/0.1mM CaCl2/2mM MgSO4，1.5％细菌琼脂)、MOPS、Murashige&Skoog(MS)等。
步骤a)中使用的培养基可以是液体或固体。在本发明的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，步骤a)的培养基是液体。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，合适的培养基还包含有机化合物作为碳源。这些化合物的非限制性实例包括蔗糖、葡萄糖、琥珀酸盐、淀粉、果糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、半乳糖或木糖。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，合适的培养基还包含化合物作为氮源。这些化合物的非限制性实例包括NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、KNO3。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，合适的培养基缺少氨基酸和/或蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，微生物在没有搅拌的情况下生长。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，微生物在搅拌下生长，特别是1rpm～300rpm，更特别是1rpm～180rpm，甚至更特别是1rpm～150rpm的搅拌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，所述微生物在3℃～70℃，更特别是15℃～50℃，更特别是20℃～40℃的温度生长。
可以在需氧、微需氧或厌氧环境中将微生物接种到生长培养基中。
微生物可以小规模培养(例如使用烧瓶或实验室发酵罐)或大规模培养(例如使用工业发酵罐)或在实验室或工业发酵罐中发酵(包括但不限于连续、分批、补料分批或固态培养或发酵)。可选地，含有微生物的培养基可以例如通过混合器均质化或液化。
除去培养基的微生物(步骤b)以获得无微生物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。通常，该步骤可以通过过滤(例如使用平均孔径为0.5μm～0.1μm的过滤器)、离心(例如以1000rpm～6000rpm)、沉降(例如通过重力)、沉淀、絮凝、电解-沉淀或萃取来进行。在一个实施方式中，步骤b)通过离心和/或过滤进行。取决于所使用的技术，无微生物组合物或渗出物采取滤液、上清液或提取物的形式。
如果必要或需要，获得本发明的无微生物组合物的方法可包括另外的步骤。例如，在获得无微生物组合物后，可将其冻干、浓缩、超滤、造粒、灭菌、澄清、附聚、洗涤、吸收、吸附、结晶、沉淀、萃取、干燥、蒸馏、透析、精馏、色谱分离、喷雾干燥和去除热原，以及其他可能性。
在本发明的一个实施方式中，本发明涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的无微生物组合物：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物，
其中：
所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636；
步骤a)的培养基是缺乏氨基酸和蛋白质的培养基；特别是选自M9、MOPS和MS的液体培养基，可选地，其补充有维生素和有机化合物作为碳源；
当微生物生长达到至少等于或高于对数生长期的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％时，从步骤a)的培养基中除去微生物；并且
通过离心和/或过滤进行步骤b)。
在本发明的另一个实施方式中，本发明涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的无微生物组合物：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物，
其中：
所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851；
步骤a)的培养基是缺乏氨基酸和蛋白质的培养基；特别是选自M9、MOPS和MS的液体培养基，可选地，其补充有维生素和有机化合物作为碳源；
当微生物生长达到至少等于或高于对数生长期的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％时，从步骤a)的培养基中除去微生物；并且
通过离心和/或过滤进行步骤b)。
更特别的是，在以上实施方式中，微生物在15℃～50℃，更特别的是20℃～40℃的温度生长。
用于获得如上定义的无微生物组合物的方法也形成本发明的一部分，所述方法包括以下步骤：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的微生物培养基中除去微生物，以获得无微生物组合物。
对于无微生物组合物提及的上述实施方式也适用于如上所述的其制备方法。
本发明的另一方面涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的包含灭活微生物的组合物：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中灭活微生物，以获得包含灭活微生物的组合物，
其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、球孢白僵菌、葱腐葡萄孢、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、肉青霉菌、产黄青霉菌、指状青霉菌、黄灰青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、哈茨木霉、大丽轮枝菌、异常威克汉姆酵母、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
在本发明的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、球孢白僵菌、葱腐葡萄孢、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、肉青霉菌、指状青霉菌、黄灰青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、哈茨木霉、大丽轮枝菌、异常威克汉姆酵母、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
更特别的是，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC8459、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、球孢白僵菌菌株CECT2704、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、肉青霉菌菌株CECT 20937、产黄青霉菌菌株CECT 2277、哈茨木霉菌株CECT 2413和异常威克汉姆酵母菌株CECT 1114。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912和黄灰青霉菌菌株CECT 20226。
在获得包含如上定义的灭活微生物的组合物的方法中，使微生物在适当培养物中生长的步骤a)可以在获得无微生物组合物的方法中的前述步骤a)所述的条件下进行。
所述微生物可以通过本领域技术人员已知的任何方法灭活，例如通过细胞裂解。在这种情况下，获得的组合物是裂解物。用于灭活微生物的其他合适方法包括热休克(例如在高压灭菌器中)、辐射、渗透性休克、添加抗微生物剂等。
如本文所用，“裂解物”是指在通过细胞裂解破坏或溶解生物细胞后获得的组合物，这导致微生物细胞中包含的细胞内生物成分的释放。细胞裂解可以通过各种技术完成，例如渗透性休克、热休克、经由超声波处理，或者在离心型机械应力下。
如果必要或需要，获得本发明的包含灭活微生物的组合物的方法可以包括另外的步骤。例如，在获得本发明的包含灭活微生物的组合物后，可将其冻干、浓缩、超滤、造粒、灭菌、澄清、附聚、洗涤、吸收、吸附、结晶、沉淀、萃取、干燥、蒸馏、透析、精馏、色谱分离、分馏、喷雾干燥和去除热原，以及其他可能性。
在本发明的一个实施方式中，本发明涉及通过包括以下步骤的方法能够获得的包含灭活微生物的组合物：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中灭活微生物，以获得包含灭活微生物的组合物，
其中：
所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851；更特别的是，所述微生物是链格孢菌菌株CECT 20912或黄灰青霉菌菌株CECT 20226；
步骤a)的培养基是缺乏氨基酸和蛋白质的培养基；特别是选自M9、MOPS和MS的液体培养基，可选地，其补充有维生素和有机化合物作为碳源；
当微生物生长达到至少等于或高于对数生长期的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％时，从步骤a)的培养基中除去微生物；并且
通过热休克进行步骤b)。
更特别的是，在以上实施方式中，微生物在15℃～50℃，更特别的是20℃～40℃的温度生长。
用于获得包含如上定义的灭活微生物的组合物的方法也形成本发明的一部分，所述方法包括以下步骤：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中灭活微生物，以获得包含灭活微生物的组合物。
对于包含灭活微生物的组合物提及的上述实施方式也适用于如上所述的其制备方法。
作为上述组合物和方法的另一种选择，本发明的发明人已经发现，当植物在存在释放VOC的某些微生物培养物下在封闭的气氛中培养时，即使植物与微生物之间不存在物理接触，也可以实现植物生长的效果。在该实施方式中，微生物在不同于植物培养位置的位置处培养，但优选足够接近植物，使得微生物释放的VOC可以接触植物并对其发挥作用。由于当使用该方法时微生物和植物不接触，因此病原微生物也可用于产生VOC。
因此，本发明还涉及增加植物生长的方法，包括在产生VOC的微生物培养物存在下(植物和微生物之间没有任何接触)或者在微生物释放的挥发物存在下向植物施用，，其中微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌CECT 2662、肉青霉菌菌株CECT 20937、黄灰青霉菌菌株CECT 20226和解淀粉芽孢杆菌菌株CECT 493，或者作为另一种选择，所述微生物选自由以下组成的组：泡盛曲霉、巴西曲霉、球孢白僵菌、葱腐葡萄孢、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、产黄青霉菌、指状青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、哈茨木霉、大丽轮枝菌、异常威克汉姆酵母、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、荧光假单胞菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。在此方面的一个实施方式中，该方法在温室中进行。
更特别的是，在以上方面中，产生VOC的微生物培养物的微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC 7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌、大肠杆菌、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
甚至更特别的是，产生VOC的微生物培养物的微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912、链格孢菌菌株CECT 2662、链格孢菌菌株CECT 20560、链格孢菌菌株CECT 20923、链格孢菌菌株CECT 20943、链格孢菌菌株DSM-1102、链格孢菌菌株DSM-12633、链格孢菌菌株DSM-62006、链格孢菌菌株DSM-62010、链格孢菌菌株MTCC 1779、链格孢菌菌株MTCC 3793、链格孢菌菌株MTCC 6572、链格孢菌菌株MTCC 7202、链格孢菌菌株MTCC7959、链格孢菌菌株MTCC 8459、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、大肠杆菌BW25113菌株CGSC7636、球孢白僵菌菌株CECT 2704、葱腐葡萄孢菌株CECT 2851、尖孢镰刀菌菌株CECT20420、肉青霉菌菌株CECT 20937、产黄青霉菌菌株CECT 2277、哈茨木霉菌株CECT 2413和异常威克汉姆酵母菌株CECT 1114。
在本发明更具体的实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，产生VOC的微生物培养物的微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277和大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636。
在本发明另一个更具体的实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，产生VOC的微生物培养物的微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413和葱腐葡萄孢菌株CECT2851。
由微生物细胞培养物产生的本发明组合物(包括如上定义的无微生物组合物和包含灭活微生物的组合物)可直接施用于植物上。即，不添加任何其他组分，或可配制成农业组合物。当直接施用由微生物细胞培养物生产的本发明的组合物时，可以在施用前稀释它们。例如，可以使用在水中的稀释度：1:2、1:4和1:8。
本领域技术人员将知道如何根据植物的类型、待处理的部分和/或所需的效果调节本发明组合物的最合适的浓度或剂量。
本发明的农业组合物包含有效量的由如上定义的微生物细胞培养物产生的本发明组合物与一种或多种农业上可接受的载体。
如本文所用的术语“有效量”是指由如上定义的微生物细胞培养物产生的组合物的量，其在施用后足以对植物提供有益效果，即增强或增加或改善一种或多种以下植物特征：生长、产量、商业产量、生长速度、植物生长、植物发育、生物质、高度、坚固性、枝条鲜重/干重、枝条系统鲜重/干重、根鲜重/干重、植物鲜重/干重、叶鲜重/干重、穗鲜重/干重、种子鲜重/干重、地上部分鲜重/干重、枝条数量、穗、叶、种子、花蕾、花、果实和/或分枝的数量、发芽率、叶、茎和根的大小、枝条长度、根长度、根毛数量和长度、茎粗、类胡萝卜素含量、叶绿素含量、花诱导(包括花芽外观减少时间)、光合作用、作物产量、果实重量、果实比重、商业果实重量、果实大小、果实成熟、果实硬度、果实质地、果实长度、蛋白质含量、白利糖度、pH、出苗率和对非生物胁迫的抗性(包括耐热或耐寒性、耐旱性、耐盐性等)等。
如本文所用的术语“农业上可接受的载体”是指可用于改善由微生物细胞培养物产生的组合物向植物或植物的一部分(例如种子、叶或根)的递送、储存和应用而对土壤等没有不利影响的材料。农业上可接受的载体必须与由微生物细胞培养物产生的组合物在不损害这些组合物的有效性的意义上相容，并且其本身对土壤、设备、所需植物或农艺环境没有显着的不利影响。农业上可接受的载体的实例包括但不限于佐剂、稀释剂、表面活性剂、调理剂、防冻剂、消泡剂、增稠剂、润湿剂、铺展剂、分散剂、乳化剂、抗微生物剂等。
农业组合物可以是颗粒固体、溶液、分散体、悬浮液或乳液的形式。
在本发明的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，本发明涉及农业组合物，其还包含一种或多种选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂和肥料的添加剂。
包括由微生物细胞培养物产生的组合物以及含有它们的农业组合物的本发明的组合物可用作植物生长促进剂。因此，促进植物刺激活性的方法也形成了本发明的一部分，该方法包括向植物施用有效量的如上定义的组合物。在该方法中，植物与处理组合物物理接触。
在该方法的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，促进对植物的刺激活性包括增加或改善一种或多种选自下组的植物特征：生长、产量、商业产量、生长速度、植物生长、植物发育、生物质、高度、坚固性、枝条鲜重/干重、枝条系统鲜重/干重、根鲜重/干重、植物鲜重/干重、叶鲜重/干重、穗鲜重/干重、种子鲜重/干重、地上部分鲜重/干重、枝条数量、穗、叶、种子、花蕾、花、果实和/或分枝的数量、发芽率、叶子、茎和根的大小、枝条长度、根长度、根毛数量和长度、茎粗、类胡萝卜素含量、叶绿素含量、花诱导(包括花芽出现时间的减少)、光合作用、作物产量、果实重量、果实比重、商业果实重量、果实大小、果实成熟、果实硬度、果实质地、果实长度、蛋白质含量、白利糖度、pH、出苗率和对非生物胁迫的抗性(包括耐热或耐寒性、耐旱性、耐盐性等)等。更特别的是，上文定义的一种或多种植物特征的增强或增加是相对于未接受本发明组合物处理的对照植物。
更特别的是，促进对植物的刺激活性包括增加一种或多种选自由以下组成的组中的植物特征：产量、商业产量、植物生长、植物发育、枝条数量、叶鲜重、枝条长度、根长度、枝条鲜重/干重、枝条系统鲜重/干重、根鲜重/干重、地上部分鲜重/干重、穗鲜重/干重、种子鲜重/干重、根鲜重/干重、穗数量、叶绿素和蛋白质含量、出苗率和对非生物胁迫的抗性。
在本发明方法的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，所述植物是被子植物或裸子植物，单子叶植物或双子叶植物。所述植物的非限制性实例包括马铃薯植物、玉米植物、辣椒植物、烟草植物、拟南芥植物、黄瓜植物、番茄植物、卷心菜植物、小麦植物、大麦植物、大豆植物、谷物植物(corn plant)、棉花植物、水稻植物、油菜植物、油菜籽植物、向日葵植物、苜蓿植物、甘蔗植物、草植物、黑莓植物、蓝莓植物、草莓植物、覆盆子植物、胡萝卜植物、花椰菜植物、咖啡植物、甜瓜植物、茄子、莴苣植物、洋葱植物、豌豆植物、菠菜植物、西瓜植物、薄荷植物、西兰花植物、青葱植物、布鲁塞尔芽菜植物、大头菜植物、醋栗植物、朝鲜蓟植物、莴苣植物、韭菜植物、木薯植物、芜青植物、萝卜植物、山药植物、甘薯植物、豆科植物、南瓜植物、大蒜植物、黑麦植物、小米植物、高粱植物、油菜籽植物、葛根植物、三叶草植物、笋瓜(squash)植物、香蕉树、柚树、芒果树、木瓜树、菠萝树、苹果树、桃树、梨树、樱桃树、李子树、鳄梨树、橘子树、柠檬树、红桔树、杏仁树、核桃树、开心果树、花生树、榛子树、板栗树、澳洲坚果(macadamia)树、腰果树、椰子树、棕榈树、桉树、橡树、榆树、枫树、山毛榉树、白杨树、白蜡树、山核桃树、白桦树、枞树、杜松树、紫杉树、雪松树、柏树、红杉树等。
在本发明方法的一个具体实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，所述植物选自由以下组成的组：拟南芥植物、如玉米植物、小麦植物或玉米植物等谷类植物、大豆植物、油菜籽植物、棉花植物、向日葵植物、苜蓿植物、甘蔗植物、高粱植物、番茄植物、辣椒植物、马铃薯植物、草植物和水稻植物。
在该方法的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，在体外或在土壤中培养植物。
本发明的组合物可以应用于植物的任何部分，包括任何“地上”部分或枝条系统，或植物的任何“地下”部分或根系统。“地上”部分或枝条系统包括存在于植物生长的土壤或培养基上方的植物部分。植物地上部分的非限制性实例包括植物的叶、花、种子、果实、芽、茎、枝、花序或携带种子的结构。“地下”部分或根系统包括存在于植物生长的土壤或培养基下方的那些部分。植物地下部分的非限制性实例包括根、根毛、块茎和根茎。
在该方法的一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，将本发明的组合物施用于植物的地上部分。
在该方法的另一个实施方式中，可选地，与上文或下文所述的一个或多个实施方式组合，将本发明的组合物施用于植物的地下部分。通常，组合物可以连续地或在一个或多个特定的发育阶段施用于植物，这取决于待实现的所需效果。例如，组合物可以在生长的任何阶段施用，例如发芽、幼苗、生长、繁殖或种子阶段，开花前期，开花开始或成熟开始。或者，它们可以在植物生长的一个或多个阶段中应用。本领域技术人员将知道在确定的植物生长阶段使用的最合适的施用模式和根据所需效果应用本发明组合物的植物的最合适的部分。
包括由微生物培养物产生的组合物和含有它们的农业组合物的本发明组合物的应用实例包括但不限于灌溉、熏蒸、土壤或根施用或注射、树干或树枝注射、或施用于叶、茎、芽、花序、花、种子或果实的喷雾。这些组合物也可以在温室中施用。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词语的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包括”包括“由......组成”的情况。通过阅读说明书，本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。通过举例说明的方式提供以下实施例和附图，并且它们不旨在限制本发明。与附图相关并放在权利要求中的括号中的附图标记仅用于试图增加权利要求的可理解性，并且不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文所述的特定和优选实施方式的所有可能组合。
实施例
实施例1.通过微生物细胞培养物产生的无微生物组合物和含有灭活微生物的组 合物在植物中的作用
微生物培养和生长条件
本研究中使用的微生物和培养条件如下：
真菌：链格孢菌菌株CECT 20912、黄灰青霉菌菌株CECT 20226、产黄青霉菌菌株CECT 2277、尖孢镰刀菌菌株CECT 20420、哈茨木霉菌株CECT 2413、葱腐葡萄孢菌株CECT2851。
培养基：补充有维生素和蔗糖的液体MS。(高压灭菌前培养基的pH为5.8)。
方法1：将具有600mL液体MS培养基的1000mL烧瓶用4mL浓缩的菌丝体样品接种，并使其在28℃下生长7天，同时以130rpm振荡。然后将该“种子材料”接种到5L发酵罐中，并在最大通气(1vvm)(vvm＝每分钟每单位液体体积的气体体积流量(每分钟每体积的体积))下再培养3天。在发酵结束时，将含有微生物的培养液以4000rpm离心30分钟以分离微生物细胞。然后将上清液通过0.2μm过滤装置过滤，以产生最终未稀释的无菌组合物。
还进行了方法1的变化，其中微生物生长进行更多的种子材料温育步骤，和/或其中振荡在150rpm下进行和/或其中在发酵结束时培养液是通过吸水棉纱布过滤而不是离心。黄灰青霉菌、尖孢镰刀菌和葱腐葡萄孢的生长温度为24℃。
方法2：与方法1相同，但具有以下特定参数：
-将具有300mL液体MS培养基的500mL烧瓶+作为种子材料的2mL浓缩的菌丝体样品接种到3L发酵罐中。
方法3：与方法1相同，但具有以下特定参数：
-将具有100mL液体MS培养基的250mL烧瓶+作为种子材料的1mL浓缩的菌丝体样品接种到具有1L MS的3L烧瓶(150rpm)中。
方法4：与方法1相同，但具有以下特定参数：
-在含有298mL MS+2mL浓缩菌丝体样品的500mL锥形瓶中制备160mL接种物
-用300mL+2700mL MS培养基的上述接种物，在5L发酵罐中制备3L发酵物。
-用上述接种物3L+25L MS培养基，在40L发酵罐中制备28L发酵物。
方法5：与方法1相同，但具有以下特定参数：
-在含有298mL MS+2mL浓缩菌丝体样品的500mL锥形瓶中制备160ml的接种物(一式两份)。
-用160ml+1440mL MS培养基的上述接种物，在2L发酵罐中制备1.6L发酵物(一式两份)。
-用上述接种物14.4L+1.6L MS培养基，在20L发酵罐中制备16L发酵物(一式两份)。通过上述发酵(32L接种物)+128L MS培养基，在200L发酵罐中制备160L发酵液。
方法6：与方法1类似，但包括用家用混合器而不是离心步骤的液化步骤。
方法7：与方法1类似，但包括高压灭菌步骤(121℃，20分钟)，而不是0.2μm过滤。
方法8：蒸馏法
在以下条件下使用ROTARY真空蒸发器(STUART RE 300)，水浴(STUART RE300OB)和真空泵(ILMVAC，ref：LVS 105T-10ef)进行蒸馏：水浴温度：60℃，初始真空压力：200mbar。当蒸馏一半初始体积时停止该过程。剩余的体积被称为“浓缩液”。
方法9：用2mL浓缩的菌丝体样品接种具有300mL液体MS培养基并补充有90mM蔗糖的1000mL烧瓶，并使其在28℃下以180rpm振荡生长一周。然后将该“种子材料”接种在具有补充有90mM蔗糖的1000mL液体MS培养基的2000mL烧瓶中，在28℃下温育3天。之后，通过微孔布(miracloth)过滤培养基。然后将部分滤液通过0.2μm过滤装置过滤，以产生最终未稀释的过滤组合物。使用R3000(BUCHI)旋转蒸发仪在50℃蒸馏部分经微孔布过滤的培养基以产生最终未稀释的蒸馏组合物。
温室：用在水中稀释(1:3)的组合物灌溉植物6周，每周一次，体积递增(5mL、10mL、20mL、40mL、60mL和80mL/盆)。
田间：2次施用：播种后1个月和2个月。每次施用2L选择的处理(1x溶液)(总共4L；417L/ha)。
方法10：类似于方法1，但使用以下培养基代替MS培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：切块马铃薯300g，葡萄糖(葡萄糖)20g，蒸馏水1L。
细菌：大肠杆菌BW25113CGSC 7636.Yale
培养基：M9。
方法11：向每两个50mL离心无菌管中加入11mL LB液体培养基。将来自大肠杆菌储液的250μL接种物加入到每个管中，将其在37℃，150rpm下温育6小时。此后，每管用5mL LB生长的大肠杆菌接种物接种两个具有95mL M9的250mL烧瓶，并在37℃，150rpm温育约18小时。之后，将两个具有900mL M9的2L锥形烧瓶各自用每一个都是80mL的M9生长的大肠杆菌接种，在37℃，150rpm，一个烧瓶中培养24小时，另一个培养48小时。完成发酵时间后，将培养基过滤并包装在无菌瓶中。
还进行了方法11的变化，其中微生物生长在第一步中进行3.5小时，在第二步中进行21小时。
植物培养和生长条件
在这些实验中使用的植物在以下条件下培养和生长：
自动化平台中的植物生长条件：
-将玉米种子播种在带有土壤具有80％含水量(正常条件)或25％聚乙二醇(干旱 条件)的盆中(一粒种子/盆)8天(22℃/20℃，16/8小时光/暗循环，光子辐照度为120μmol光 子的PAR m-2s-1，相对湿度为60％)。每2小时，系统(PlantScreenTM系统(Photon Systems Instruments，Brno，Czech Republic))拍摄盆的照片，并且图像处理软件检测并识别出新 出现在土壤上方的幼苗的第一绿色像素。出苗率和出苗总数由内部软件(在MatLab R2015 中实施)提供，其与作为时间函数发现的出苗的比例不同。
实施例1.1由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物对拟南芥的作用
将灭菌的拟南芥WT-Col-0种子播种在含有MS琼脂和维生素的培养板中，并在4℃下在黑暗中储存3天，然后转移到生长室中一周。之后，将植物移植到带有土壤的小盆中，并在相同的生长条件下保持两周。组合物的施用：将由黄灰青霉菌产生的165μL经过滤的培养基(如上文在方法3中所述获得)和495μL H2O施用于每种植物，直接施用于靠近根的土壤。在光周期(第5期)开始时施用组合物一次。对于生物质测定，在施用组合物一周后收获除子叶外的所有叶子。与对照未处理的植物相比，观察到用由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物处理的植物的莲座叶(rossete leaves)鲜重(FW)增加9.8％。
实施例1.2由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄种子中的作用
将灭菌的番茄种子播种在12孔平底细胞培养板中，其中各孔中填充有6mL无菌湿珍珠岩+约400μLH2O。将由黄灰青霉菌产生的经过滤的培养基(如上文在方法3中所述获得)以26.6μL的剂量施用于种子上。将板在24℃下在黑暗中储存7天，然后在具有上述光周期的生长室中储存7天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。与对照未处理的植物相比，用由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物处理的植物的枝条长度的增加显示在图1中。
实施例1.3由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物在玉米种子中的作用
将灭菌的玉米种子播种在6孔平底细胞培养板中，其中各孔中填充有12mL无菌湿珍珠岩12mL/孔+约800μLH2O。将由黄灰青霉菌产生的经过滤的培养基(如上文在方法3中所述获得)以53.2μL的剂量施用于种子上。将板在24℃下在黑暗中储存3天，然后在具有上述光周期的生长室中储存7天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。观察到在试验第四天发芽率增加12％。与对照未处理的植物相比，观察到用由黄灰青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物处理的植物的地上部分鲜重(FW)增加83.7％且地上部分干重(DW)增加63.8％。
实施例1.4由产黄青霉菌细胞培养物产生的无微生物组合物在拟南芥中的作用
将灭菌的拟南芥WT-Col-0种子播种在具有MS琼脂和维生素的平板中，并在4℃下在黑暗中储存3天，然后将其转移到生长室中一周。之后，将植物移植到带有土壤的小盆中，并在相同的生长条件下保持两周。组合物的应用：将由产黄青霉菌产生的165μL经过滤的培养基(如上文在方法3中获得)和495μL H2O施用于每株植物，直接施用于靠近根的土壤。在光周期开始时以适当的速率施用组合物一次。对于生物质测定，在施用产品一周后收获除子叶外的所有叶子。
实施例1.5由产黄青霉菌培养物产生的无微生物组合物在玉米种子中的作用
将灭菌的玉米种子播种在6孔平底细胞培养板中，其中各孔填充有12mL湿珍珠岩12mL/孔+约800μLH2O。将由产黄青霉菌产生的经过滤的培养基(如上文在方法3中所述获得)以53.2μL的剂量施用于种子上。将板在24℃下在黑暗中储存3天，然后在具有上述光周期的生长室中储存7天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。
实施例1.6由大肠杆菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄种子中的作用
将灭菌的番茄种子播种在填充有MS固体培养基的12孔平底细胞培养板中，并将由大肠杆菌产生的经过滤的培养基(如上所述获得)以26.6μL的剂量施用于种子上。将板在24℃下在黑暗中储存7天，然后在具有上述光周期的生长室中储存7天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。与对照未处理植物相比，用由大肠杆菌细胞培养物产生的无微生物组合物处理的植物的根长度的增加显示在图2中。
实施例1.7由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在小麦种子中的作用
将灭菌的小麦种子播种在12孔平底细胞培养板中，其中各孔填充有6mL无菌湿珍珠岩+约400μLH2O，并将由链格孢菌产生的经过滤的培养基(如上文在方法1中所述获得)以26.6μL的剂量施用于种子上。将板在生长室中温育17天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。与对照未处理植物相比，观察到经处理的植物根鲜重(FW)增加16.3％并且根干重(DW)增加15.2％。
实施例1.8由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄种子中的作用
将灭菌的番茄种子播种在12孔平底细胞培养板中，其中各孔填充有约6mL无菌湿珍珠岩+约400μLH2O或6mL湿土壤基质，并且由链格孢菌产生的经过滤的培养基(如上文在方法1中所述获得)以26.6μL的剂量施用于种子上。将板在24℃下在黑暗中储存7天，然后在具有上述光周期的生长室中储存7天。评估发芽率。然后收获材料并测量枝条和根生物质和长度。与对照未处理的植物相比，观察到经处理的番茄植物的枝条长度增加10.7％且根长度增加23.1％。与对照未处理的植物相比，经处理的番茄植物在土壤基质中的根长度的增加显示在图3中。
实施例1.9由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄植物中的作用 (田间试验)
将由链格孢菌产生的经过滤培养基(如上文方法2中所述获得)在水中的2个稀释液(1:2和1:4)从6月到10月在开花前、开花时和连续(灌溉)以漫灌的形式施用至于开放田间种植的270棵番茄植物。植物之间的距离为行间90cm，每行植物之间30cm，总面积为100m2。将典型的植物检疫和施肥处理(50UF/ha，两次)施用于对照植物和用经过滤的培养基处理的植物。收获后，取决于剂量和处理，总产量增加超过20％，并且观察到成熟果实产量增加超过50％。当在开花之前或开花时进行施用时获得更高的产量。果实大小增加，没有观察到果实硬度或白利糖度的负面影响。与对照未处理植物相比，处理过的番茄植物的净产量(可接受的原料)的增加显示在图4中。不同的应用处理如下：
实施例1.10由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在番茄植物中的作用 (田间试验)
将在烧瓶(方法3)或40L体积的发酵罐(方法4)中产生的、由链格孢菌产生的经过滤培养基的1:4稀释液(蔗糖浓度为15g/L或30gl/L)，在生长周期中，在5月至9月以滴灌的形式两次施用于开放田间种植的总数为150棵番茄植物。将典型的植物检疫和施肥处理应用于对照植物和用经过滤的培养基处理的植物。在链格孢菌于烧瓶或发酵罐中生长的的处理中均观察到与对照植物相比，总产量(收获的果实总数)、净产量(成熟果实)、成熟果实的百分比和平均净产量(可接受的原料)的增加。另外的数据表明，与对照相比，在所有处理中过熟果实的量较少(并且主要是由于小的绿色果实而不是腐烂的果实)。此外，没有观察到pH和白利糖度值的相关变化，尽管在一些应用的处理中观察到果实硬度的小增量。与对照未处理植物相比，处理过的番茄植物的净产量(可接受的原料)的增加显示在图5中，其中不同的处理如下进行：
实施例1.11由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在水稻植物中的作用 (田间试验)
将由链格孢菌产生的经过滤培养基(如上文方法5中所述获得)在水中的1:4稀释液通过在两个水稻品种中单次施用而进行喷雾施用(700L/ha)。对品种1(Puntal)进行的施用在开花前并且对品种2(Hispamar)进行的施用在开花期间。该试验在开放田间中的总的水稻种植面积为90m2。结果显示总产量(kg/ha)增加，全谷物百分比增加(2％)。未观察到FW单位的淀粉含量变化。与对照未处理的植物相比，对于品种1(Puntal)，处理过的水稻植物实现了超过100kg/ha的增加，而对于品种2，增加超过240Kg/ha。
实施例1.12由链格孢菌细胞培养物产生的无微生物组合物在玉米植物中的作用 (田间试验)
通过用3-5cm深度的气动机器处理将玉米种子种植在28m2的面积中，之后当植物具有6至7片叶子时，将由链格孢菌产生的经过滤的培养基(如上文方法2中所述获得)以浓度为700L/ha(处理1)和350L/ha(处理2)的喷雾形式施用。种植8个月后，收获所有谷物。在处理2中观察到谷物中可溶性蛋白质的量增加1-8％。结果显示淀粉含量没有显著变化。
实施例1.13-1.37
实施例2.由培养在植物附近但不接触植物的各种微生物释放的VOC的作用
植物和微生物培养和生长条件
在该实施例中，使用以下植物：拟南芥(Heynh)、玉米(Zea mays，cv.HiII)和辣椒(Capsicum annuum，cv.Sweet Italian)植物。
本研究中使用的微生物如下：
真菌：链格孢菌(CECT 20912)、泡盛曲霉(CECT 2907)、巴西曲霉(CECT 2091)、球孢白僵菌(CECT 2704)、葱腐葡萄孢(CECT 2851)、胶孢炭疽菌(CECT 20249)、尖孢镰刀菌(CECT 20420)、小薰长喙壳菌(CECT 20676)、拟青霉(CECT 20454)、产黄青霉菌(CECT2277)、指状青霉菌(CECT 20796)、黄灰青霉菌(CECT 20226)、发酵毕赤酵母发酵变种(CECT10064)、哈茨木霉(CECT 2413)、大丽轮枝菌(CECT 2694)、异常威克汉姆酵母(CECT 1114)
细菌：解淀粉芽孢杆菌(CECT 493)、地衣芽孢杆菌(CECT 20)、短小芽孢杆菌(CECT29)、洋葱伯克霍尔德菌(CECT 322)、微黄棒杆菌(CECT 536)、费氏剑菌(CECT 4369)、大肠杆菌BW25113(Keio collection(Baba等，2006))、荧光假单胞菌(CECT 378)、液化沙雷菌(CECT 483)、气味沙雷菌(CECT 867)、嗜麦芽寡养单胞菌(CECT 7853)。
除非另有说明，拟南芥植物用16小时光照(90μmol光子sec–1m-2)/8小时黑暗的光周期(在光照周期22℃且黑暗周期18℃)在生长室中在含有无蔗糖固体MS(DuchefaBiochemie M0222)培养基的培养皿中培养。在含有固体M9最小(95mM Na2HPO4/44mMKH2PO4/17mM NaCl/37mM NH4Cl/0.1mM CaCl2/2mM MgSO4，1.5％细菌琼脂)培养基的培养皿中培养细菌，所述培养基补充有50mM葡萄糖。用于枯草芽孢杆菌培养的M9培养基1补充有各7μM的MnSO4、FeSO4和ZnSO4及1μM硫胺素。在含有补充有90mM蔗糖的固体MS培养基的培养皿中培养真菌。
为了研究微生物VOC对在MS培养基中培养的拟南芥植物的影响，将没有盖子的微生物和植物培养物没有物理接触地放置在无菌塑料盒中(IT200N Instrument Try 200x150x 50mm，AWGregory，UK)并用塑料膜密封。通过将没有盖子的微生物培养物和植物置于密封的微型温室中来研究微生物VOC对土壤上培养的植物的影响。作为阴性对照，将植物与含有无菌微生物培养基的相邻培养皿一起培养。除非另有说明，微生物VOC处理在植物播种(DAS)生长阶段后14天开始。
拟南芥植物在不存在或连续存在有益和非有益真菌和细菌的系统发育不同菌株的相邻培养物的情况下在不含蔗糖的固体MS培养基上培养。这些实验在无菌生长箱中进行，植物与微生物培养物之间没有物理接触。相对于对照，由所有测试的微生物(包括植物病原体)释放的VOC诱导拟南芥植物鲜重(FW)增加2至5倍(图6a)。来自大多数微生物的VOC也诱导早期开花(图6b)。在图6a和6b中，值表示在每个实验中使用12株植物从四次独立实验确定的平均值±SE。星号表示根据Student's t-检验，经微生物VOC处理的植物和对照(未处理的植物)之间的显著差异(p<0.05)。
还评估了土壤生长的拟南芥、甜椒和玉米植物中微生物VOC的响应。暴露于微生物VOC的拟南芥植物在处理后4天内具有显著高于对照的FW，并且在另外7天后具有两倍高的FW(图7a)。此外，从处理的第22天到第47天的实验结束，暴露的玉米和辣椒植物几乎是对照的两倍(图7b、c)。图7显示链格孢菌的结果，但使用来自其他细菌和真菌物种的培养物(未显示)获得了基本相同的结果。在图7中，值表示在每个实验中使用12株植物从四次独立实验确定的平均值±SE。星号表示根据Student's t-检验，经VOC处理的植物和未处理的植物之间的显著差异(p<0.05)。
根架构确定
使用立体显微镜Olympus MVX10(日本)对来自用链格孢菌、黄灰青霉菌和产黄青霉菌的真菌挥发物处理7天的21日龄的拟南芥植物的根进行显微照相。使用Olympus DP72视频相机和具有1.25X变焦的Cell D软件(Olympus)拍摄显微照片。图8。
实施例2.1-2.2
与实施例2类似，但按照以下方法，进行实施例2.1-2.2：将6小片菌丝体(一周龄)接种在补充有90mM蔗糖的固体MS培养基中，并使其在30℃下生长一周。
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Claims (16)

1.一种通过包括以下步骤的方法能够获得的无微生物组合物：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当所述微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的培养基中除去所述微生物，以获得无微生物组合物，
其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌(Alternaria alternata)菌株CECT20912或其突变株、链格孢菌菌株CECT 2662或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20560或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20923或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20943或其突变株、链格孢菌菌株DSM-1102或其突变株、链格孢菌菌株DSM-12633或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62006或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62010或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 1779或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 3793或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 6572或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7202或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7959或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 8459或其突变株、黄灰青霉菌(Penicillium aurantiogriseum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、葱腐葡萄孢(Botrytis aclada)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、肉青霉菌(Penicilliumcharlesii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小薰长喙壳菌(Ophiostoma ips)、拟青霉(Paecilomyces clavisporus)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、发酵毕赤酵母发酵变种(Pichia fermentans var.fermentans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)、费氏剑菌(Ensifer fredii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、气味沙雷菌(Serratia odorifera)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
2.如权利要求1所述的无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912或其突变株、链格孢菌菌株CECT 2662或其突变株、链格孢菌菌株CECT20560或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20923或其突变株、链格孢菌菌株CECT 20943或其突变株、链格孢菌菌株DSM-1102或其突变株、链格孢菌菌株DSM-12633或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62006或其突变株、链格孢菌菌株DSM-62010或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 1779或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 3793或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 6572或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7202或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 7959或其突变株、链格孢菌菌株MTCC 8459或其突变株、黄灰青霉菌、大肠杆菌、产黄青霉菌、尖孢镰刀菌、异常威克汉姆酵母、葱腐葡萄孢、哈茨木霉、球孢白僵菌和肉青霉菌。
3.如权利要求2所述的无微生物组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912或其突变株、黄灰青霉菌菌株CECT 20226或其突变株、产黄青霉菌菌株2277或其突变株、大肠杆菌BW25113菌株CGSC 7636或其突变株、尖孢镰刀菌菌株CECT20420或其突变株、哈茨木霉菌株CECT 2413或其突变株和葱腐葡萄孢菌株CECT 2851或其突变株。
4.一种通过包括以下步骤的方法能够获得的包含灭活微生物的组合物：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当所述微生物生长开始对数生长期时，将步骤a)的培养基中的所述微生物灭活，以获得包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌、泡盛曲霉、巴西曲霉、球孢白僵菌、葱腐葡萄孢、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、小薰长喙壳菌、拟青霉、肉青霉菌、产黄青霉菌、指状青霉菌、黄灰青霉菌、发酵毕赤酵母发酵变种、酿酒酵母、哈茨木霉、大丽轮枝菌、异常威克汉姆酵母、根癌土壤杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、微黄棒杆菌、费氏剑菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、肠道沙门氏菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
5.如权利要求4所述的包含灭活微生物的组合物，其中，所述微生物选自由以下组成的组：链格孢菌菌株CECT 20912或其突变株和黄灰青霉菌菌株CECT 20226或其突变株。
6.一种农业组合物，其包含权利要求1～3中任一项所定义的无微生物组合物或包含权利要求4～5中任一项所定义的包含灭活微生物的组合物，以及一种或多种农业上可接受的载体。
7.一种获得权利要求1～3中任一项所定义的无微生物组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使微生物在适当的培养基中生长；和
(b)当所述微生物生长开始对数生长期时，从步骤a)的微生物培养基中除去所述微生物，以获得无微生物组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中，步骤b)通过离心和/或过滤进行。
9.一种获得权利要求4～5中任一项所定义的包含灭活微生物的组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使微生物细胞培养物在适当的培养基中生长；和
(b)当所述微生物生长开始对数生长期时，将步骤a)的培养基中的所述微生物灭活，以获得包含灭活微生物的组合物。
10.如权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，当每毫升菌落形成单位(CFU)等于或高于103时，进行步骤b)。
11.如权利要求7～10中任一项所述的方法，其中，步骤a)的培养基缺少氨基酸和/或蛋白质。
12.如权利要求7～11中任一项所述的方法，其中，步骤a)的培养基选自由M9、MOPS和MS组成的组，可选地，其补充有维生素。
13.如权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，步骤a)的培养基还包含选自由下述组成的组中的有机化合物作为碳源：蔗糖、葡萄糖、琥珀酸盐、淀粉、果糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、半乳糖和木糖。
14.如权利要求7～13中任一项所述的方法，其中，步骤a)的所述适当的培养基是液体培养基。
15.权利要求1～6中任一项所定义的组合物作为植物生长促进剂的用途。
16.一种促进对植物的刺激活性的方法，其包括向所述植物施用有效量的权利要求1～6中任一项所定义的组合物。
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