CN1340609A - 生物农药促生拮抗菌m18及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明设计并应用了新的高效筛选、培养程序,从植物根际土壤中制备出同时具有促进植物生长和广谱性抑制植物真菌性病害的生物农药促生拮抗菌M18。与现有技术相比,本发明产品能有效地抑制甜瓜蔓枯病菌、水稻纹枯病菌和黄瓜枯萎病菌等多种植物病菌的生长,并对植物幼苗的生长具有明显的促进作用。

Description

生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法。

一般认为，植物病原菌对农作物造成的减产幅度约占总产量25-75％，这是一项巨大的经济损失。目前，生产上控制农作物病害除了选用良种和科学的栽培措施外，主要手段是使用化学杀菌剂。大多杀菌剂对动物和人类有害，化学农药造成的食物中毒时有发生，残留在可食部分的有毒成份对人体的潜在危害，已引起社会各方面的关注；农药会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于农业生产的可持续发展。同时，在许多情况下，化学农药并不完全有效。因此，在发展与环境相容的高效低毒新一代化学农药的同时，进一步开发微生物制剂和生物源农药显得更为必要。

1992年，世界环境与发展大会提出新世纪前生物农药要达到农药总使用量60％的目标，但是，美国至今只有15％左右，中国约为2％。目前，在生产上已经推广的生物农药品种数量较少，使用范围也有较大的局限性，具有治疗效果的生物抗菌剂农药更为少见。有些品种则已使用年久，防治病害的效果不够理想。

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种既能有效地控制农作物病害，又有益于植物生长，且不会污染环境的生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：生物农药促生拮抗菌M18，这种促生拮抗菌M18类属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，该菌已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.0462。

生物农药促生拮抗菌M18的制备方法，它包括以下工艺步骤：第一步，以环丙烷-1-羧酸1-氨基(1-aminocyclopropane-lcarboxylate，ACC)为唯一氮源筛选促生细菌，并在含有ACC的平板上反复验证各菌株的脱氨酶活性；第二步，将培养3天后的黄瓜枯萎病原菌，用直径为8mm的打孔器取出长满菌丝的琼脂片，接种在马铃薯葡萄糖(PDA)平板的中央，经25-30℃培养1-5天，然后将具有ACC脱氨酶活性的各菌株分别点接于距病原菌中心的2cm处，一块平板可同时测试4个不同的菌株，经25-30℃培养1-5天后观察抑菌效果，制成菌株，重复三次，选出对黄瓜枯萎病原菌具有最强抑制作用的菌株；第三步，用异步法制备具有广谱抑制真菌性病原物能力的目标细菌M18；第四步，将该目标细菌置于经高压灭菌的培养基上，25-30℃振荡培养1-5天，得到促生拮抗菌M18。

所述的培养基的配方为(重量百分数)：甘油0.5-2.5％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.01-0.05％、硫酸镁0.05-0.35％、余量为水，PH5.5-7.5。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：

1、M18代谢物对植物病原菌具有高效广谱的抑菌作用

经过室内异步法反复测定，荧光假单胞菌M18的代谢物对多种植物真菌性病原菌具有强大的抑制能力，这些病原菌包括黄瓜枯萎病菌(代号为H)，西瓜枯萎病菌(X)，甜瓜蔓枯病(K)、水稻纹枯病菌(W)，串株链刀病菌(C)，棉花枯萎病菌(M)、炭疽病菌(Q)，稻瘟病菌(D)、甜瓜枯萎病菌(T)等。在异步培养中M18的抑菌能力列于表1。

          表1     M18对各种植物病原菌的抑菌作用

待测菌				病原菌
											H	X	T	W	M	C	Q	D	K
空白	100	100	100	100	100	100	100	100	100
										E.coli	60	56	26	63	43	41	77	74	74
M18	0	0	0	0	0	0	0	0	0

注：表中数值表示病原菌菌丝面积相对增长量。相对增长量＝[病原菌直径(处理)²－8²]÷[病原菌直径(空白)²－8²]×100，其中，8(mm)表示接种时接入的病原菌菌丝圆片的直径。]

2、在连续3年的多次点大田试验中，对黄瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病以及甜椒的根腐病的防治效果都能达到75％以上。

从98年以来的三年中，申请人已将双功能细菌M18研制成微生态制剂抗菌剂M18，试验使用的菌制剂量已达到2000升以上。活菌制剂的菌数可达10¹⁰CFU/ml，保存6个月后的活菌数仍等达到10⁸CFU/ml。通过对种子、苗床和定植后的土壤进行处理，已经在浦东新区，南汇和苏北淮阴三个地区，对大棚内黄瓜，甜瓜、西瓜和辣椒等4种作物，在几十个大小不同的试验点次中，试验面积已累计达到400亩次以上。利用稀释200倍的双功能促生菌M18，开展了防治各种枯萎性病害和根腐病害的田间试验。防治效果都能达到75％以上。

3、比较抗菌剂M18和井岗霉素对水稻纹枯病菌的抑制能力，M18对纹枯病菌具有较强的抑制真菌生长的能力。

安徽农业大学植保系测定了抗菌剂M18和井岗霉素对水稻纹枯病菌的室内毒力回归方程，结果列于表2：

表2  M18发酵产物和井岗霉素对水稻纹枯病菌抑制作用(表中数据为：

                     防治面积率％)

抗菌剂M18	200倍稀释液	400倍稀释液	800倍稀释液	1200倍稀释液	1600倍稀释液	井岗霉素50(μg/ml)
							抑菌率	90.9	72.5	59.4	56.5	44.2	50.0

表中数据为4次重复的平均数

抗菌剂M18对水稻纹枯病的毒力回归方程：

Y＝9.6885－1.5068gx，r＝0.9761，EC₅₀为1288倍稀释液。

测定M18的5天发酵液经苯萃取、HPLC制备的纯品(含量为90％)，对水稻纹枯病菌的抑制能力，结果列于表3：

         表3  抗菌剂M18的提纯品对水稻纹枯病菌的抑制率

提纯品(ug/ml)	5	10	15	20	25	30
							防治面积率％	34.3±9.96	58.8±4.25	72.8±2.64	76.5±5.64	81.8±1.52	92.7±0.64

根据以上数据，可得M18发酵物的纯品(相对含量为90％)对水稻纹枯病菌的毒力回归方程，y＝33.03＋2.08x，相关系数r＝0.95，EC₅₀为8.24μg/ml。EC₈₀为22.54μg/ml。

根据以上测定，抗菌剂M18经1200倍稀释后，对纹枯病的抑菌率可达56.5％，而井岗霉素(50μg/ml)，按成品含量5％计，约稀释1000倍的抑菌率仅为50.0％，表明M18对纹枯病的抑菌能力强于井岗霉素。根据纯度为90％的吩嗪物质对纹枯病的毒力回归方程，可推算培养基中含有吩嗪物质8.24μg/ml时，抑菌效果为50％，灭活剂中的有效成份的含量约为0.1％。

M18发酵产物经灭活和除菌两种不同处理后，分别置于0℃±1℃和54℃±2℃条件下，14天后，测定其对水稻纹枯病菌抑菌能力的冷、热稳定性，结果列于表4：

表4  M18发酵产物的冷、热稳定性(表中数据为：防治面积率％)

冷稳定性			热稳定性
					浓度μg/ml2545	灭活85.8±1.0493.2±0.57	除菌86.6±0.6992.9±0.30	灭活85.3±1.5195.3±0.50	除菌85.1±2.9292.2±0.678

所得结果经方差分析与相应回归方程一致，表明M18的发酵产物具有冷、热稳定性。

4、M18对幼苗的生长具有明显的促进作用

M18活菌对黄瓜幼苗的生长具有显著的促进作用。测定经M18和1％(W/V)羧甲基纤维素钠包裹的种子，每粒种子带有活菌数为10⁸CFU，播种后7天，与对照相比，株重增加12％。平均根长增加21.4％，差异达到极显著程度(P＜0.001)，结果列于表5。

        表5  M18对黄瓜幼苗生长的的促进作用    品种：黄瓜116号

处理	总株数数	总鲜重(g)	单株鲜重(g)	平均根长(cm)
					对照M18	4341	15.516.0	0.360.40	7.0±1.78.5±1.5

5、抗菌剂M18对甜瓜蔓枯病害具有治疗作用

2000年春，在南汇县的盐仓、书院等，运用抗菌剂M18能有效治疗感染后的甜瓜植株，能达到100％治疗效果。

6、抗菌剂M18的有效成分对动物的毒性和环境的影响

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的若干菌株已经是美国环保局登记的微生物菌种之一，可商业应用于控制土传的植物病原菌[1]。椐国外报道这类促生菌控制植物病原菌的主要机制之一是分泌抗生素[2]，利用荧光假单胞菌株2-79防治小麦全食病，羧基吩嗪的贡献占50至90％。该化合物对供试的各种动物无明显的毒害作用，将含羧基吩嗪的水溶液注射给小鼠和白鼠类，剂量可达7至15mg/只，10天内能保持健康；将相同浓度的羧基吩嗪与兔粪渣混合物，作为蟑螂的唯一食物来源，蟑螂能存活2个月；4天内，在含量高达10μg/ml的水溶液中，10条2英寸鲤鱼全部存活[3]。

对M18分泌的抗真菌有效成分进行了提取和纯化技术研究。经苯提取，硅胶G薄层展层分析，R_f0.35为M18分泌的主要抗性物质。测定了该物质的紫外吸收，它的最大吸收峰分别为251nm和365nm。经254nm下高压液相分析，获得单一出峰。经高压液相-质谱联用测定分子量为224物质，并对该物质红外光谱作了进一步测定和分析，可确定为羧基吩嗪。并利用纯品吩嗪测定了对水稻纹枯病的毒力回归方程。在微量测试中，肯定了这类吩嗪物质对病原菌的孢子和菌丝体的生长具有明显的抑菌作用。

M18在土壤中，不会长期累积，在土壤中的存活量会随着时间的推移而减少。黄瓜定植以后，根际浇灌施M18菌悬液，对土壤中施用M18菌的衰减趋势变化作了跟踪测定，种植宝杨5号和沪116号的土壤中，活菌存活量都随着时间的延长而减少，呈现相同趋势，表明活菌M18不会在土壤中累积。

下面结合实施例及大田试验效果，对本发明作进一步说明。

实施例1

a.以环丙烷-1-羧酸1-氨基(1-aminocyclopropane-lcarboxylate，ACC)为唯一氮源筛选促生细菌，并在含有ACC的平板上反复验证各菌株的脱氨酶活性。

b.运用同步法筛选出对黄瓜枯萎病原菌的拮抗菌，将培养3天后的黄瓜枯萎病原菌，用直径为8mm的打孔器取出长满菌丝的琼脂片，接种在马铃薯葡萄糖(PDA)平板的中央，经28℃培养2天，然后将具有ACC脱氨酶活性的各菌株分别点接于距病原菌中心的2cm处，一块平板可同时测试4个不同的菌株，经28℃培养4天后观察抑菌效果，制成菌株，重复三次，选出对黄瓜枯萎病原菌具有最强抑制作用的菌株。

c.用异步法制备具有广谱抑制真菌性病原物能力的目标细菌M18。

d.将该目标细菌置于经0.105Mpa高压灭菌30分钟的培养基上，28℃振荡培养4天，得到促生拮抗菌M18；所述的培养基的配方为(重量百分数)：甘油1.5％、蛋白胨2％、磷酸氢二钾0.03％、硫酸镁0.15％、余量为水，PH7。

实施例2

a.以环丙烷-1-羧酸1-氨基(1-aminocyclopropane-lcarboxylate，ACC)为唯一氮源筛选促生细菌，并在含有ACC的平板上反复验证各菌株的脱氨酶活性。

b.运用同步法筛选出对黄瓜枯萎病原菌的拮抗菌，将培养3天后的黄瓜枯萎病原菌，用直径为8mm的打孔器取出长满菌丝的琼脂片，接种在马铃薯葡萄糖(PDA)平板的中央，经25℃培养5天，然后将具有ACC脱氨酶活性的各菌株分别点接于距病原菌中心的2cm处，一块平板可同时测试4个不同的菌株，经30℃培养1天后观察抑菌效果，制成菌株，重复三次，选出对黄瓜枯萎病原菌具有最强抑制作用的菌株。

c.用异步法制备具有广谱抑制真菌性病原物能力的目标细菌M18。

d.将该目标细菌置于经0.105Mpa高压灭菌30分钟的培养基上，25℃振荡培养5天，得到促生拮抗菌M18；所述的培养基的配方为(重量百分数)：甘油0.5％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.01％、硫酸镁0.05％、余量为水，PH7.5。

实施例3

a.以环丙烷-1-羧酸1-氨基(1-aminocyclopropane-lcarboxylate，ACC)为唯一氮源筛选促生细菌，并在含有ACC的平板上反复验证各菌株的脱氨酶活性。

b.运用同步法筛选出对黄瓜枯萎病原菌的拮抗菌，将培养3天后的黄瓜枯萎病原菌，用直径为8mm的打孔器取出长满菌丝的琼脂片，接种在马铃薯葡萄糖(PDA)平板的中央，经30℃培养1天，然后将具有ACC脱氨酶活性的各菌株分别点接于距病原菌中心的2cm处，一块平板可同时测试4个不同的菌株，经25℃培养5天后观察抑菌效果，制成菌株，重复三次，选出对黄瓜枯萎病原菌具有最强抑制作用的菌株。

c.用异步法制备具有广谱抑制真菌性病原物能力的目标细菌M18。

d.将该目标细菌置于经0.105Mpa高压灭菌30分钟的培养基上，30℃振荡培养1天，得到促生拮抗菌M18；所述的培养基的配方为(重量百分数)：甘油2.5％、蛋白胨3％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.35％、余量为水，PH5.5。

大田试验效果

自98年以来的三年中，科研人员已将荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)M18研制成生物抗菌剂M18，试验使用的菌制剂量已达到2000升以上。活菌制剂的菌数可达10¹⁰CFU/ml，保存6个月后的活菌数仍等达到10⁸CFU/ml。通过对种子、苗床和定植后的土壤进行处理，已经在浦东新区，南汇和苏北淮阴三个地区，对大棚内黄瓜，甜瓜和辣椒等3种作物，在几十个大小不同的试验点次中，利用稀释200倍的生物抗菌剂M18，开展了防治枯萎病害和根腐病害的田间试验。试验面积已累计达到400亩次以上。防治效果都能达到75％以上。M18通过改变土壤的微生态环境，控制农作物病害的发生，效果十分显著。大田试验的结果表明，抗菌剂M18对甜瓜蔓枯病还具有良好的治疗作用。

99年春，大棚甜瓜的防治效果，盐仓红二村祝龙生农户使用M18防治甜瓜枯萎病的面积为0.45亩，效果达到80％以上。因大量减少了蔓枯病害，估计可增加产量2～3成。

98年春，在上海市的一级无公害蔬菜基地，浦东新区锦园园艺场对5亩大棚黄瓜，进行了田间的病害防治试验。大棚黄瓜的生产过程中经常会出现枯萎病的危害，枯萎病是一种维管束病害，至今无有效的化学农药可以防治；经过试验，与对照相比，微生态制剂处理过的黄瓜，枯萎病发生率下降80％左右，而且对霜霉病和角斑病也有明显的效果，可增加黄瓜产量2成以上。1999年，南汇王家农户的黄瓜试验进一步重复了98年的防治结果。

江苏省淮阴县，由于连续栽作甜椒，各种土传病害引起的根腐病发病严重，一般为20～30％，98年的秋季和春季，对苏椒5号的根腐病进行了大棚试验。98年秋，一家农户的对照地发病率达80％以上，而处理的1000株甜椒的发病率仅为20％左右，防治效果极为显著。

2000年春，在南汇县开展了面积达300亩以上的西、甜瓜的大田示范试验，初步结果表明，经200倍稀释代谢产物浇灌作物根际，能基本控制甜瓜蔓枯病和西瓜枯萎病的危害。同时，在植株茎部发病时，刮去表面病斑，涂布抗菌剂M18，具有明显的治疗作用。

Claims (3)

1.生物农药促生拮抗菌M18，其特征在于，所述的促生拮抗菌M18类属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，该菌已在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.0462。

2.生物农药促生拮抗菌M18的制备方法，其特征在于，它包括以下工艺步骤：第一步，以环丙烷-1-羧酸1-氨基(1-aminocyclopropane-lcarboxylate，ACC)为唯一氮源筛选促生细菌，并在含有ACC的平板上反复验证各菌株的脱氨酶活性；第二步，将培养3天后的黄瓜枯萎病原菌，用直径为8mm的打孔器取出长满菌丝的琼脂片，接种在马铃薯葡萄糖(PDA)平板的中央，经25-30℃培养1-5天，然后将具有ACC脱氨酶活性的各菌株分别点接于距病原菌中心的2cm处，一块平板可同时测试4个不同的菌株，经25-30℃培养1-5天后观察抑菌效果，制成菌株，重复三次，选出对黄瓜枯萎病原菌具有最强抑制作用的菌株；第三步，用异步法制备具有广谱抑制真菌性病原物能力的目标细菌M18；第四步，将该目标细菌置于经高压灭菌的培养基上，25-30℃振荡培养1-5天，得到促生拮抗菌M18。

3.根据权利要求2所述的生物农药促生拮抗菌M18的制备方法，其特征在于，所述的培养基的配方为(重量百分数)：甘油0.5-2.5％、蛋白胨1-3％、磷酸氢二钾0.01-0.05％、硫酸镁0.05-0.35％、余量为水，PH5.5-7.5。