CN101974451A - PopW抗菌蛋白与荧光假单胞菌的混合生防制剂PopW-PF1 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗菌蛋白PopW与生防菌的混合生防制剂PopW-PF1，属于植物保护技术领域。由荧光假单胞菌制成的生防菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml；抗菌蛋白PopW的浓度为30mg/ml，稀释300-30000倍使用；混合生防制剂PopW-PF1中，PopW蛋白和生防菌剂的混合体积比为(30000-30)∶1，使用时稀释50-100倍。混合生防制剂PopW-PF1对辣椒、番茄等蔬菜作物和水稻、大豆等粮食作物上的病毒病的防病效果达50％以上，对地上部其它病害也有较好的防治效果如叶霉病和水稻稻曲病等，其增产效果达10％。

Description

PopW抗菌蛋白与荧光假单胞菌的混合生防制剂PopW-PF1

一、技术领域

本发明涉及提高作物抗病性的PopW抗菌蛋白与荧光假单胞菌的混合生防制剂PopW-PF1，一种来自青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721抗菌蛋白PopW和防治植物病害的生防菌荧光假单胞菌，属于生物防治领域，专用于多种蔬菜和粮食作物的无公害防治。

二、背景技术

现在世界上已知的植物病毒(包括类病毒)有1目10科47属850余种。植物病毒病是非常严重的植物病害，防治非常困难，素有“植物癌症”之称。植物病毒病害的爆发十分广泛，灾害非常严重。几乎所有蔬菜、粮食作物、果木等都感染病毒病，使农业生产受到巨大损失，降低产品品质，并严重促使植物其它生理性病害的发生。全世界每年因植物病毒病造成作物危害的损失约为200亿美元。目前在防治病毒病方面的主要措施为选育抗病品种和施用抗病毒制剂，抗病毒制剂的作用以抑制病毒的活性和诱导作物产生抗病性为主。抗病品种的选育被誉为防治病毒病的基础措施，但在防治某些植物的病毒病方面差距较大，例如烟草，因为抗病品种同时伴随着劣质基因，获得抗病、优质的双重特性难度较大。除病毒病外，在田间实际生产中作物还要遭受真菌、细菌、线虫等病原物的危害。目前对这些病害，人们主要采用化学杀虫剂、选种抗病作物品种、实施轮作、建立无病种苗基地和对进出口农作物进行严格的检疫来控制病害的发生。化学药剂虽防效显著，但其选择性差，破坏农作物的生态环境；不易降解，高残留，对人畜极不安全；破坏土壤结构，造成土壤沙化；抗药性问题日益突出。随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治已成为继农业化学防治之后的又一重要防治方法。许多生物制剂及抗菌蛋白已相继问世，并广泛应用于实际生产当中，现已取得显著效果。

Harpins是受hrp基因调节并通过III型泌出通道分泌的一类蛋白质。经过大量的研究发现，harpins具有相似的生化特性：富含甘氨酸(Gly)、不含半胱氨酸(Cys)、热稳定、对蛋白酶敏感。harpins还有相似的功能，都是不亲和病原细菌在烟草等植物上诱导HR或HCD的效应分子。体外重组表达后的harpins使用在植物上，可诱导产生多种有益表型，如使植物增强对病原物和害虫的抗性，并促进大多数植物生长，增强植物抗旱性，促进植物生长并且减少作物产后损失等。Harpins可以引起植物细胞离子渗漏、氧爆发、某些蛋白质激酶的激活等多种信号传导相关联的反应。在某些信号传导事件与表型效应之间，可以发现一定程度的因果关系。鉴于这种特性，国内外已把harpins作为一种新型的生化诱导剂进行了广泛而深入的研制和开发，并取得了较好的效果。在本实验室前期研究中，我们从R.solanacearum ZJ3721中克隆了popW基因，通过体外表达获得PopW蛋白。PopW蛋白分子量为39.79KDa，酸性，富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸，耐热，能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应，属一种新的Harpin蛋白。该蛋白对烟草、辣椒和番茄等病毒病(TMV/CMV)的温室和大田防效均为50％以上，增产效果10％以上。同时该蛋白还可以增强番茄对叶霉病，水稻对稻曲病的抗病性，其防效分别可达70％、60％。同时对辣椒疫病也有一定的防治效果。在美国有同类的蛋白类产品Messenger(美国Eden公司)该产品在中国已有登记，但是因为成本和价格过高，在美国和中国市场销路均未拓开。本课题组研制的PopW与之相比具有完全不同的结构和序列，但具有类似功能，对于烟草花叶病毒的田间防治效果显著高于Messenger；而PopW的生产成本远低于此。可见PopW抗菌蛋白的应用前景更为广泛。

由于田间环境条件复杂多变，而且种植作物、土质、气候和管理等方面的差异，导致在实际生产过程中并非只发生单一病害，大部分情况是多种病害同时发生。而单一的生防菌只能防治少数几种病害，其防病谱虽较化学药剂较广，但还是难以满足广大用户的要求。已有研究表明抗菌蛋白与其他生防因子混合使用后可产生具有协同增效作用，Lorito表明Enterobacter cloacae是一种生防细菌，但产生内切几丁质酶能力很低，其生防活性是与细菌个体与病原菌细胞壁的结合相关。试验表明，在木霉内切几丁质酶的参与下，该细菌附着在灰葡萄孢霉的孢子和菌丝上并大量繁殖，因而增强了生防效果，同时两者混合使用可使抗菌谱扩大。本实验室已证明抗菌蛋白与生防菌混合使用后对病害的防治效果要显著高于两者单独使用，防效达50％以上，同时防治病害的种类也明显增加。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是针对现有的对防治大田常见病害有较高防效的生防制剂抗菌谱较窄、成本高，并且有时只针对单一性的病害的缺陷，提供开发一种抗菌蛋白和生防菌混合使用的生防制剂，可以针对田间的多种病害同时进行防治，防效达50％以上，显著高于抗菌蛋白和生防菌单独使用的情况，并且有增产功能。

技术方案

生防菌4AT8为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，菌种保藏号为CGMCCNO.3834。保藏日期：2010年05月13日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

用所述生防菌4AT8制备生防菌剂的方法，包括：

1)将所述荧光假单胞菌4AT8接种到KB培养液中分别培养28℃180rpm，16～20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用的KB即金氏B的配方为：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O 1.5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌；

2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入KB培养液中，28℃180rpm振荡培养20～24小时，成品中活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml。所述生防菌剂可以在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。

本发明还提供了一种PopW抗菌蛋白与所述生防菌的混合生防制剂PopW-PF1，该制剂含有来自青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物抗菌蛋白PopW和所述荧光假单胞菌4AT8制备的生防菌剂。其中PopW抗菌蛋白制备的方法为：将含有青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因的重组质粒pET-popW转化大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养过液，第二天按1％的比例接入含有50mg/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时，然后加入终浓度为1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，37℃继续振荡培养3h，将摇好的菌液6,000g，4℃，离心10min，收集菌体，然后用1/100体积的20mM tris-HCL，pH 8.0缓冲液，加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟PMSF重悬菌体，超声波破碎菌液至清透，10,000g，4℃，离心20min收集上清液，收集到的上清即为可溶性蛋白PopW，其浓度为30mg/ml，大小为40KDa，所用的LB的配方为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌。

混合生防制剂PopW-PF1由30mg/ml的PopW抗菌蛋白与活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml的荧光假单胞菌4AT8生防菌剂按(30000-30)∶1的体积比混合而成。该混合生防制剂PopW-PF1专用于防治蔬菜和大田作物病害。

有益效果

本发明是专门针对常见大田作物的多发性病害的生防制剂。在防治辣椒疫病、稻曲病、稻瘟病、青枯病和根结线虫病等常见的大田病害方面都取得了很好的效果，防病效果50％以上，增产效果达10％。混合生防制剂PopW-PF1由PopW蛋白(30mg/ml)和生防荧光假单胞菌剂(菌液浓度1×10⁹CFU/ml)按照(30000-30)∶1的体积比混合而成，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20。使用时稀释50-100倍，此法主要用于防治叶部病害。在喷雾处理时要尽量保证每张叶片均要喷施到。本制剂的使用，可减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜和粮食作物的出口。同时，本生防制剂还有增产功能，可为农民增加收入。

温室试验表明，PopW制剂和荧光假单胞菌剂的混合生防制剂PopW-PF1使用后对辣椒、番茄、烟草上的常见的病毒病(TMV\CMV)都有很好的防治效果，并促进植物生长(表1、2、3、4、5)。田间试验也表明：混合生防制剂PopW-PF1对辣椒、番茄、黄瓜等蔬菜作物和水稻等粮食作物常见的地上部真菌、细菌、病毒病和线虫病害都有很好的防治效果，帮助农民增产增收(表6、7、8、9)。

四、具体实施方式

生防菌株用于制备生防菌剂的方法为常规细菌培养法：

1)将所述荧光假单胞菌4AT8接种到KB培养液中分别培养28℃180rpm，16～20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用的KB即金氏B的配方为：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O 1.5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌；

2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入KB培养液中，28℃180rpm振荡培养20～24小时，成品中活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml。

PopW抗菌蛋白制备的方法为：

将重组质粒pET-popW(专利申请号：200910029118.6，公开号：CN 101457228A，公开日：2009年6月17日)转化大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养过液，第二天按1％的比例接入含有50mg/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时，然后加入终浓度为1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃继续振荡培养3h。将摇好的菌液6,000g，4℃，离心10min，收集菌体，然后用1/100体积的20mM tris-HCL，PH 8.0缓冲液，加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride PMSF)重悬菌体，超声波破碎菌液至清透，10,000g，4℃，离心20min收集上清液，收集到的上清即为可溶性蛋白PopW，利用SDS-PAGE胶和BSA小牛血清蛋白标准品检测检测PopW蛋白的浓度和纯度，所用的LB的配方为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌。(PopW的浓度为30mg/ml，大小为40KDa)。

SDS-PAGE胶制作方法如下：

取样品10μl与10μl的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，沸水浴3min，10,000g，4℃，离心10min，取上清液备用。

聚丙烯酰胺胶的配制：

12％的分离胶(15ml体系)：

30％丙烯酰胺             6ml

ddH₂O                    4.9ml

1.5M Tris(pH 8.8)        3.8ml

10％十二烷基硫酸钠(SDS)  150μl

10％过硫酸铵(APS)        150μl

TEMED                    6μl

                                    

5％的浓缩胶(5ml体系)：

30％丙烯酰胺             0.83ml

ddH₂O                    3.4ml

1M Tris(pH 6.8)          0.63ml

10％十二烷基硫酸钠(SDS)  50μl

10％过硫酸铵(APS)        50μl

TEMED                    5μl

                                       

聚丙烯酰胺凝胶的灌制及蛋白SDS-PAGE电泳，按以下程序进行：

(1)安装好垂直电泳板，小心灌入分离胶，给浓缩胶留出足够空间(约为梳齿以下1cm)，然后用去离子水封顶。

(2)室温聚合0.5～1h后，用去离子水冲洗顶部数次，尽可能排去凝胶上的液体。

(3)将浓缩胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的梳子，注意不要混入气泡，然后再加一些浓缩胶溶液彻底填满梳子之间的孔隙，将凝胶垂直放置于室温下。

(4)浓缩胶聚合30min后，小心拔下梳子，用去离子水洗涤加样槽，以除去未聚合的丙烯酰胺。

(5)将玻璃胶板放至垂直电泳槽中，加入SDS-PAGE电极缓冲液。

(6)每一加样孔中加入20μl样品并在一加样孔中加入蛋白Marker。

(7)接通电泳仪开始电泳，起始电压为50V，待样品进入分离胶呈一条直线后，将电压调至100V，继续电泳至溴酚蓝到达胶板底部。

(8)电泳完毕后，将凝胶置染色液中，室温摇床染色1h之后，将凝胶置脱色液中，室温下摇床脱色至条带清晰。

(一)温室实验：

1.病原菌接种准备：

本次试验所用病毒TMV、CMV购买自贵州省烟草科学研究所，均采用摩擦接种的方法。使用前在新鲜烟草叶片上活化并确定使用浓度。采用摩擦接种法接种TMV/CMV(方中达，1998)。具体操作步骤如下。

配制接种物所需的1％磷酸氢二钾(K₂HPO₄)和亚硫酸钠(Na₂SO₃)的混合液，将1g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)和0.1g亚硫酸钠(Na₂SO₃)溶于100ml冷冻的蒸馏水中。取病叶组织1g加上述溶液1.5ml，在灭菌后冷却的研钵中研成匀浆。将匀浆用小块细纱布过滤到试管中，试管放在冰水中备用。将少量金刚砂(600目)撒在待接种的叶片上，用加样器吸取的TMV/CMV悬浮液均匀点滴在叶面上，用手指在叶面上轻轻摩擦接种。接种6-8叶期的烟草/辣椒/番茄，每张叶片均需接种，接种后的叶片用水轻轻冲洗，将试验植株置于22-25℃温室中培养。

2.混合生防制剂PopW-PF1对辣椒、番茄和烟草常见病毒病的防效实验：

生防菌单独使用时，施用浓度为1×10⁹CFU/ml，喷雾处理，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有植株叶片均匀覆盖生防菌；PopW抗菌蛋白单独使用时，使用浓度为将原液稀释1000倍使用，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有叶片全部均匀覆盖PopW蛋白溶液；使用混合生防制剂PopW-PF1时，混合体积比为PopW蛋白∶生防菌剂＝(30000-30)∶1，混合制剂使用时稀释50-100倍，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有叶片全部均匀覆盖生防混合制剂PopW-PF1。24h后用纯化的TMV(Tobacco mosaicvirus)/CMV(cucumber mosaic virus)悬浮液接种寄主植物。读取260nm处的吸收值，由公式计算病毒的浓度，灭菌水将病毒的浓度稀释为0.1mg/ml摩擦接种普通烟(参考《植物病毒研究法》)。接种病毒时，将少量细金刚砂(600目)撒在待接种的寄主植物叶面上，用加样器吸取50μl TMV或CMV悬浮液均匀点滴在叶面上，用手指在叶面上轻轻摩擦接种。接种后的叶片用自来水轻轻冲洗，将植物置于25℃、黑暗培育12h后放回温室培育。同时以未喷施蛋白的烟草/辣椒/番茄接种TMV/CMV作为对照。

从接种病毒后第3天起观察统计枯斑数(注意要等距离等参数拍照)，计算抗病效果。抗病效果＝[(对照叶片上枯斑数-处理叶片枯斑数)/对照叶片上枯斑数]×100％。

抗菌蛋白和生防菌处理辣椒、番茄和烟草6-8叶期的幼苗。移栽30天后，称取并记录幼苗植株的鲜重、茎长和根长，生物量增长率的计算公式如下：生物量增长率％＝[(处理组鲜重/茎长/根长-对照组鲜重/茎长/根长)/对照组鲜重/茎长/根长]×100％

3.实验结果

使用混合生防制剂PopW-PF1后对辣椒、番茄、烟草上的常见的病毒病TMV、CMV都有很好的防治效果，较生防菌——荧光假单胞菌和PopW抗菌蛋白单独施用时对病毒病的防效高。表1、表2为辣椒、番茄、烟草移栽20天对TMV、CMV的温室防治效果。表3、表4、表5为辣椒、番茄和烟草的鲜重、茎长、根长的数值和生物量的增加率，从表中的数据可知使用混合生防制剂PopW-PF1后对辣椒、番茄、烟草的促生效果要高于生防菌和PopW抗菌蛋白单独施用时的效果。

表1  混合生防制剂PopW-PF1对TMV的防效

表2  混合生防制剂PopW-PF1对CMV的防效

表3  混合生防制剂PopW-PF1对辣椒的促生效果

表4  混合生防制剂PopW-PF1对番茄的促生效果

表5  混合生防制剂PopW-PF1对烟草的促生效果

(二)田间试验

1、混合生防制剂PopW-PF1对田间常见病害的防效试验

本次田间试验所用农作物为辣椒、番茄和水稻，田间试验共设以下几个处理：A、化学农药；B、空白对照；C、混合生防制剂PopW-PF1；D、PopW抗菌蛋白；E生防菌荧光假单胞菌。每个小区20m²，小区间设三行隔离区，各处理按完全随机区组排列，重复4次，全试验共12个小区。生防菌单独使用时，施用浓度为1×10⁹CFU/ml，喷雾处理，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有植株叶片均匀覆盖生防菌；PopW抗菌蛋白单独使用时，使用浓度为将原液稀释1000倍使用，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有叶片全部均匀覆盖PopW蛋白溶液；使用混合生防制剂PopW-PF1时，混合体积比为PopW蛋白∶生防菌剂＝(30000-30)∶1，混合制剂使用时稀释50-100倍，加终浓度为0.03％的表面活性剂吐温-20，用喷雾器喷洒植物直至所有叶片全部均匀覆盖生防混合制剂PopW-PF1。移栽一周后使用，每隔20天施用一次。

2、调查方法

分别对番茄病毒病、辣椒病毒病、番茄叶霉病和水稻稻曲病进行田间调查，调查采用五点取样方式，每点取十颗苗。

番茄病毒病病情分级标准如下：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或1～2片叶呈现花叶；

3级：中上部叶片花叶；

5级：除多数叶片花叶外，少数叶片畸形；

7级：多数叶片重花叶、畸形、皱缩或植株矮化；

9级：多数叶片重花叶、畸形、植株明显矮化，甚至枯萎死亡。

辣椒病毒病病情分级标准如下：

0级，不发病；

1级，新叶有明显明脉或轻微花叶或1/3以上花叶，叶变小；

2级，1/3～1/2叶片花叶或叶片变小，病株与健株相比矮约1/3；

3级，1/2～2/3叶片花叶，部分叶片变小，与健株相比矮约1/2，辣椒果实小，畸形；4级，全部叶片花叶，变小、矮约1/2～3/4，花育，不结实。

水稻稻曲病病情分级标准如下：每个小区每小区5点取样，每点选5穴，统计每穗上的曲果数。

0级：未发病；

1级：每穗1个曲果；

2级：每穗2个曲果；

3级：每穗3～5个曲果；

4级：每穗6～9个曲果；

5级：每穗10个以上曲果。

番茄叶霉病的病害分级标准如下：每小区5点取样，每点选2株，每株各选5片叶片(既定点、定株、定叶)挂牌调查。

番茄叶霉病的分级标准：以每株每一片叶上的病斑面积占整个叶面积的百分率来分级。

病叶分级标准：0级：无病斑；

1级：病斑面积占整片叶面积的25％以下；

2级：病斑面积占整片叶面积的25％～50％；

3级：病斑面积占整片叶面积的50％～75％；

4级：病斑面积占整片叶面积的75％以上。

病害严重度和防效的计算公式如下：

病害严重度＝[∑(病植株数×病情指数)/(总植株数×最高病情指数)]×100

生防效果％＝[(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度]×100％

对产量的调查：从采收开始分别对小区产量进行登记，并统计小区总产量。

增产率(％)＝[(不同处理的作物产量-空白对照产量)/空白对照产量]×100％

3、实验结果

田间试验(表6、7、8、9)结果表明，生防菌——荧光假单胞菌(施用浓度为1×10⁹CFU/ml)和PopW抗菌蛋白(原液稀释1000倍使用)分别单独使用时，对番茄病毒病、辣椒病毒病、番茄叶霉病和水稻稻曲病等均有较好的防病促生效果，但如果使用混合生防制剂PopW-PF1时，其防病、促生效果要显著高于两种生防制剂单独使用的效果。

表6  混合生防制剂PopW-PF1对番茄病毒病的防治效果(移栽50天)

不同处理	病害严重度	防效(％)	产量(kg/亩)	增产(％)
					PopW抗菌蛋白	23.66±1.59c	42.52	3429.20±189c	6.49
生防菌荧光假单胞菌	21.41±1.22c	47.98	3484.50±224c	8.21
					PopW-PF1	15.91±1.29d	61.37	3624.30±183d	12.54
病毒清	32.86±2.14b	21.86	3361.70±205b	4.39
					CK	41.16±2.45a	——	3220.10±187a	——

表7  混合生防制剂PopW-PF1对辣椒病毒病的防治效果(移栽50天)

不同处理	病害严重度	防效(％)	产量(kg/亩)	增产(％)
					PopW抗菌蛋白	3.46±0.42c	39.28	879.40±98c	2.81
生防菌荧光假单胞菌	3.11±0.31c	44.66	894.50±142c	4.38
					PopW-PF1	2.52±0.11d	55.16	935.80±101d	9.41
克毒宝	4.34±1.21b	23.21	867.90±103b	1.47

CK

5.62±1.45a

——

855.30±92a

——

表8  混合生防制剂PopW-PF1对番茄叶霉病的防治效果(移栽80天)

处理	病害严重度	防效(％)	产量(kg/亩)	增产(％)
					PopW抗菌蛋白	6.00±0.94c	70.00	3629.80±212c	4.97
生防菌荧光假单胞菌	10.00±1.95c	50.00	3583.30±209c	4.77
					PopW-PF1	3.00±0.94d	85.00	3942.50±197d	15.27
多菌灵	14.00±2.25b	30.00	3542.50±245b	3.57
					CK	20.00±2.45a	——	3420.10±215a	——

表9  混合生防制剂PopW-PF1对水稻稻曲病的防治效果(移栽50天)

处理	病害严重度	防效(％)	产量(kg/亩)	增产(％)
					PopW抗菌蛋白	1.57±0.01c	53.69	472.10±56.41c	4.95
生防菌荧光假单胞菌	1.38±0.01c	59.29	481.60±40.82c	7.06
					PopW-PF1	0.54±0.01d	84.07	508.20±51.90d	12.98
三环唑	3.35±0.35b	1.18	457.30±42.62b	1.66
					CK	3.39±0.31a	——	449.80±46.74a	——

Claims (8)

1.一种生防菌，其特征在于，该生防菌4AT8为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，保藏日期：2010年05月13日，保藏号为CGMCC NO.3834。

2.用权利要求1所述生防菌制备的生防菌剂。

3.权利要求2所述生防菌剂的制备方法，包括：

1)将权利要求1所述荧光假单胞菌4AT8接种到KB培养液中分别培养28℃180rpm，16～20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用的KB即金氏B的配方为：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O1.5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌；

2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入KB培养液中，28℃180rpm振荡培养20～24小时，成品中活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml。

4.权利要求2或3所述生防菌剂在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。

5.一种PopW抗菌蛋白与权利要求1所述生防菌的混合生防制剂PopW-PF1，该制剂含有来自青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物抗菌蛋白PopW和权利要求2或3所述生防菌剂。

6.根据权利要求5所述混合生防制剂PopW-PF1，其中PopW抗菌蛋白制备的方法为：将含有青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因的重组质粒pET-popW转化大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养过液，第二天按1％的比例接入含有50mg/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时，然后加入终浓度为1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，37℃继续振荡培养3h，将摇好的菌液6,000g，4℃，离心10min，收集菌体，然后用1/100体积的20mM tris-HCL，PH 8.0缓冲液，加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟PMSF重悬菌体，超声波破碎菌液至清透，10,000g，4℃，离心20min收集上清液，收集到的上清即为可溶性蛋白PopW，PopW的浓度为30mg/ml，大小为40KDa。所用的LB的配方为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌。

7.根据权利要求5或6所述的混合生防制剂PopW-PF1是由浓度为30mg/ml的PopW抗菌蛋白与活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml的荧光假单胞菌4AT8生防菌剂按体积比为30000-30∶1混合而成，使用时稀释50-100倍。

8.权利要求5-7之一所述的混合生防制剂PopW-PF1在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。