CN114107144B

CN114107144B - 一种副产物少、高产1,3-丙二醇的重组微生物及其应用

Info

Publication number: CN114107144B
Application number: CN202111301013.9A
Authority: CN
Inventors: 陈振; 刘德华
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114107144A

Abstract

本发明涉及基因工程和生物发酵技术领域，具体公开了一种副产物少、高产1,3‑丙二醇的重组微生物及其应用。本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的乙醇脱氢酶adhA和/或乙醛脱氢酶ald的表达和/或酶活性；所述出发菌株为可合成1,3‑丙二醇的谷氨酸棒杆菌。所述表达和/或酶活性的降低可通过敲除或下调如下基因中的一个或多个实现：1)乙醇脱氢酶adhA基因；2)乙醛脱氢酶ald基因；3)adhA和ald的调控蛋白基因ramA。应用本发明的重组微生物生产1,3‑丙二醇时，生物安全度高、副产物少、产量高、操作简便且成本低廉。

Description

一种副产物少、高产1,3-丙二醇的重组微生物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种副产物少、高产1,3-丙二醇的重组微生物及其应用。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。

目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源。因此，化学法生产1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。

生物法生产1，3-丙二醇目前主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组微生物生产1，3-丙二醇。目前，工业上利用甘油生产1，3-丙二醇的工艺主要采用克雷伯氏肺炎杆菌(如中国专利CN200810105722.8)。这个工艺路线的主要缺点是：一、克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；二、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；三、甘油的来源有限，价格随市场波动大。

现有技术中还有一种是以葡萄糖为原料利用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇的方法。杜邦公司通过在大肠杆菌内外源表达来自酿酒酵母的甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸酶和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化(CN 200380104657.2)。这一工艺路线的缺点是大肠杆菌是生物安全性较差，大肠杆菌的发酵培养需要使用昂贵的原料酵母粉，因此该技术不利于产业化规模化生产。

因此，有必要对生物法生产1，3-丙二醇进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种可生产1,3-丙二醇的重组微生物，应用该微生物，生物安全度高、产量高、副产物少、操作简便且成本低廉。

本发明的技术方案如下：

一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的乙醇脱氢酶adhA和/或乙醛脱氢酶ald的表达和/或酶活性；所述出发菌株为可合成1,3-丙二醇的谷氨酸棒杆菌。

所述表达和/或酶活性的降低通过如下方式中的一种或多种实现：

(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；

(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件；

(3)对目标酶的调控蛋白的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶的调控蛋白失活或活性降低。

本发明的关键是发现在谷氨酸棒杆菌中利用外源途径合成1，3-丙二醇的过程中会大量积累副产物3-羟基丙酸。本发明通过大量的创造性工作，发现了影响3-羟基丙酸合成的关键基因主要包括乙醛脱氢酶基因ald、乙醇脱氢酶基因adhA、或者其调控基因ramA。通过降低的乙醇脱氢酶adhA和/或乙醛脱氢酶ald的表达和/或酶活性，可提升成1，3-丙二醇产量，减少副产物3-羟基丙酸生成。

本发明提出利用重组谷氨酸棒杆菌作为底盘来发酵生产1,3-丙二醇。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的微生物，广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸和赖氨酸的生产。利用谷氨酸棒杆菌来发酵生产1,3-丙二醇解决了生物安全性的问题。谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，所述含可发酵糖的原料包括糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、木糖、甘露糖、木质纤维素水解液等。同时谷氨酸棒杆菌还可以使用廉价的玉米浆作为营养成分替代昂贵的酵母粉，可以进一步降低原料的成本。发酵过程中的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。本发明方法操作简单，成本低廉，1,3-丙二醇得率高，副产物少，有利于进一步简化1,3-丙二醇的分离过程。

优选，本发明中所述表达和/或酶活性的降低通过敲除或下调如下基因中的一个或多个实现：

1)乙醇脱氢酶adhA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)乙醛脱氢酶ald基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)adhA和ald的调控蛋白基因ramA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过敲除/下调上述基因中的一种或者几种可以显著降低3-羟基丙酸的产量，使得重组谷氨酸棒杆菌的1，3-丙二醇的产量可以提高10％以上，因而具有重要的应用前景。

本发明所述出发菌株过可表达甘油-3-磷酸脱氢酶与甘油-3-磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

本发明中，所述出发菌株还具有提高的二醇脱水酶的表达和/或酶活性。

优选，所述提高的二醇脱水酶的表达和/或酶活性，通过过表达二醇脱水酶及其激活因子实现，所述二醇脱水酶及其激活因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明中，所述出发菌株还具有提高的醇脱氢酶的表达和/或酶活性。

优选，所述提高的醇脱氢酶的表达和/或酶活性，通过过表达醇脱氢酶实现，所述醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达一种融合的甘油-3-磷酸脱氢酶-甘油-3-磷酸酶，使谷氨酸棒杆菌能高效利用不同碳源合成甘油，甘油在外源的二醇脱水酶及其激活因子以及醇脱氢酶的作用下最终生成1,3-丙二醇。

本发明还提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：

(1)在发酵生产1,3-丙二醇中的应用；

(2)在用于生产1,3-丙二醇的微生物遗传育种中的应用；

(3)在降低生物法合成1,3-丙二醇的成本中的应用；

(4)在提高生物法合成1,3-丙二醇的安全性中的应用；

(5)在降低生物法合成1,3-丙二醇时，副产物3-羟基丙酸产量上的应用。

本发明另提供一种发酵生产1,3-丙二醇的方法，其包括培养上述的重组微生物的步骤。

优选，培养所述重组微生物时的碳源可为糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、木糖、甘露糖、木质纤维素水解液中的一种或多种。

本发明还提供一种构建生产1，3-丙二醇的重组微生物的方法，其包括：

敲除或下调出发菌株中的如下基因中的一个或多个：

1)乙醇脱氢酶adhA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)乙醛脱氢酶ald基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)adhA和ald的调控蛋白基因ramA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

使出发菌株过表达甘油-3-磷酸脱氢酶与甘油-3-磷酸酶的融合蛋白，或进一步过表达二醇脱水酶及其激活因子和醇脱氢酶；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述二醇脱水酶及其激活因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌。

本发明的有益效果至少在于：

本发明通过在表达外源1，3-丙二醇合成途径的谷氨酸棒杆菌中敲除乙醛脱氢酶基因ald、乙醇脱氢酶基因adhA、或者其调控基因ramA中的一个或者几个基因的组合，可以降低副产物3-羟基丙酸的产量，从而显著提高1，3-丙二醇的产量。谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，还可以使用廉价的玉米浆作为营养成分替代昂贵的酵母粉，可以进一步降低原料的成本，同时解决了生物安全性以及菌株对底物与产物的耐受性问题。同时发酵过程中的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。本发明方法副产物少，能够进一步简化1,3-丙二醇的分离过程。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1在谷氨酸棒杆菌中构建可以利用糖合成1，3-丙二醇的合成途径

谷氨酸棒杆菌不能利用糖合成1，3-丙二醇，为了使其能合成1，3-丙二醇，需要引入甘油及1，3-丙二醇的合成模块，主要包括：一种甘油-3-磷酸脱氢酶与甘油-3-磷酸酶的融合蛋白基因(gpd-gpp)使其能催化磷酸二羟基丙酮产生甘油，二醇脱水酶及其激活因子基因pduCDEGH及醇脱氢酶基因yqhD。

具体的构建方法如下：

人工设计一种甘油-3-磷酸脱氢酶与甘油-3-磷酸酶的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。通过基因合成一段包含trc启动子以及上述融合蛋白编码序列的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

将质粒pEC-K18mob2(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI进行酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将上述包含SEQ ID No.6的DNA片段一步连接到pEC-K18mob2上，获得的重组质粒分别命名为pEC-gpd-gpp-fusion。

进一步人工合成包含sod启动子(序列如SEQ ID No.7)，醇脱氢酶基因yqhD(序列如SEQ ID No.8)，二醇脱水酶基因pduCDEGH(序列如SEQ ID No.9)的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。将质粒pEC-gpd-gpp-fusion用XbaI酶进行酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将包含SEQ ID No.10的DNA片段插入到上述质粒中，获得的重组质粒分别命名为pEC-gpd-gpp-fusion-yqhD-pduCDEGH。

利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-gpd-gpp-fusion-yqhD-pduCDEGH通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，命名为C.glutamicum-fusion。

实施例2在谷氨酸棒杆菌中敲除影响3-羟基丙酸合成的关键基因

本发明发现利用重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusion发酵生产1，3-丙二醇的过程中会大量积累3-羟基丙酸，同时导致1，3-丙二醇的反耗(见实施例3)。通过大量的生物信息学与转录组学分析，本发明发现乙醛脱氢酶基因ald、乙醇脱氢酶基因adhA、或者其调控基因ramA影响3-羟基丙酸的合成和1，3-丙二醇的反耗。继而利用基因敲除的方法，构建不同的基因敲除菌株，方法如下：

1)在C.glutamicum-fusion中敲除ald基因(SEQ ID No.1)：以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物ald-up-F(acagctatgacatgattacgaccggttccgcaacggtgtt，SEQ ID No.11)和ald-up-R(aggagacccatctaagcgttaagtcctagaaaagctgc，SEQ IDNo.12)进行PCR获得ald基因上游的约1000bp的片段ald-up。以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物ald-down-F(aacgcttagatgggtctcctttgggccac，SEQ ID No.13)和ald-down-R(tgcatgcctgcaggtcgactattcagcacctcagccaggag，SEQ ID No.14)进行PCR获得ald基因下游的约1000bp的片段ald-down。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用GibsonAssembly试剂盒(NEB)将ald-up和ald-down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ald。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ald通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusion中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除ald基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔald。

2)在C.glutamicum-fusion中敲除adhA基因(SEQ ID No.2)：以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物adhA-up-F(cacacaggaaacagctatgacatgattacggacttcacccaatcactcacataatccg，SEQ ID No.15)和adhA-up-R(cgagaaggagtgagttttcggattgtgttgaaactgctctgaagctact，SEQ ID No.16)进行PCR获得adhA基因上游的约1000bp的片段adhA-up。以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物adhA-down-F(agcagtttcaacacaatccgaaaactcactccttctcgcttggattac，SEQ ID No.17)和adhA-down-R(agtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactaggcgacgagctcaatcaaatcc，SEQ ID No.18)进行PCR获得adhA基因下游的约1000bp的片段adhA-down。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal ofBiotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将adhA-up和adhA-down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-adhA。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-adhA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusion中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除adhA基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔadhA。

3)在C.glutamicum-fusion中敲除ramA基因(SEQ ID No.3)：以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物ramA-up-F(ttcacacaggaaacagctatgacatgattacgttcccaaggacgatccccgc，SEQ ID No.19)和ramA-up-R(gcaggaggaaatctgaagaaagattttgctttacgacgccaccctg，SEQ ID No.20)进行PCR获得ramA基因上游的约1000bp的片段ramA-up。以C.glutamicum-fusion的基因组为模板利用引物ramA-down-F(cgtcgtaaagcaaaatctttcttcagatttcctcctgctttacacccgt，SEQ ID No.21)和ramA-down-R(tgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactttctgttcattatttgtagaccgagcgt，SEQ ID No.22)进行PCR获得ramA基因下游的约1000bp的片段ramA-down。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal ofBiotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将ramA-up和ramA-down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ramA。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ramA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusion中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除ramA基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔramA。

4)在C.glutamicum-fusion中同时敲除ald和adhA基因：利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ald通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusionΔadhA中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除ald基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔaldΔadhA。

5)在C.glutamicum-fusion中同时敲除ald和ramA基因：利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ald通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusionΔramA中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除ald基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔaldΔramA。

6)在C.glutamicum-fusion中同时敲除adhA和ramA基因：利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-adhA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusionΔramA中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，敲除ald基因的重组子命名为C.glutamicum-fusionΔadhAΔramA。

实施例3重组谷氨酸棒杆菌的发酵培养

将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-fusion、C.glutamicum-fusionΔadhA、C.glutamicum-fusionΔald、C.glutamicum-fusionΔramA、C.glutamicum-fusionΔaldΔadhA、C.glutamicum-fusionΔaldΔramA、C.glutamicum-fusionΔadhAΔramA在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖25，(NH₄)₂SO₄ 5.0,K₂HPO₄ 1.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.005,FeSO₄ 0.005,玉米浆30，卡那霉素0.025。

以10％的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制温度为30℃，通气量为1vvm，调整转速使得溶氧水平保持在5％以上，通过流加氨水控制pH值稳定在7.0左右。流加600g/L的葡萄糖以维持发酵液中的葡萄糖浓度高于10g/L。

发酵培养基配方包括(g/L)：葡萄糖100，(NH₄)₂SO₄ 30.0,K₂HPO₄ 2.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.010,FeSO₄ 0.010,玉米浆15，生物素0.0005,盐酸硫胺素0.005，维生素B12 0.005。

代谢产物及发酵糖利用高效液相色谱进行测定，所用液相色谱柱为Aminex HPX-87H Column(300×7.8mm)，流动相为5mM H₂SO₄，流速0.8mL/min，检测温度65℃，检测器为示差检测器。

发酵周期为48小时，C.glutamicum-fusion可以产82g/L的1,3-丙二醇，同时产生24g/L的3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔadhA可以产86g/L的1,3-丙二醇，同时产生14g/L的3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔald可以产98g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔramA可以产90g/L的1，3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔaldΔadhA可以产108g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔaldΔramA可以产100g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔadhAΔramA可以产96g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。因此，通过敲除ald、adhA、ramA或者其组合可以显著降低3-羟基丙酸的积累并提高1，3-丙二醇的产量，具有重要应用价值。

此外本实施例进一步将上述培养基中的葡萄糖改为蔗糖进行发酵培养，流加液中的葡萄糖同样更改为蔗糖，而其他成分及含量不变，流加发酵的条件也保持一致。发酵周期为48小时，C.glutamicum-fusion可以产80g/L的1,3-丙二醇，同时产生27g/L的3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔadhA可以产88g/L的1,3-丙二醇，同时产生17g/L的3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔald可以产96g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔramA可以产92g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔaldΔadhA可以产106g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔaldΔramA可以产99g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。C.glutamicum-fusionΔadhAΔramA可以产97g/L的1,3-丙二醇，不产生3-羟基丙酸。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种副产物少、高产1,3-丙二醇的重组微生物及其应用

<130> KHP211122741.1

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgtct acgcaaatcc aggaaccgaa ggctcgatcg ttaactatga aaagcgctac 60

gagaactaca ttggtggcaa gtgggttcca ccggtagagg gccagtacct tgagaacatt 120

tcacctgtca ctggtgaagt tttctgtgag gtcgcacgtg gcaccgcagc ggacgtggag 180

cttgcactgg atgctgcaca tgcagccgct gatgcgtggg gcaagacttc tgtcgctgaa 240

cgtgctctga tcctgcaccg cattgcggac cgcatggaag agcacctgga agaaatcgca 300

gttgcagaaa cctgggagaa cggcaaggca gtccgtgaga ctcttgctgc agatatccca 360

ctggcaatcg accacttccg ctactttgct ggcgcgatcc gtgctcagga agatcgttcc 420

tcacagatcg accacaacac tgttgcttac cacttcaacg agccaatcgg tgttgttggt 480

cagatcattc cttggaactt cccaatcctc atggctacct ggaagctcgc accggcactt 540

gctgcaggta acgcgatcgt catgaagcca gctgagcaga ccccagcatc cattttgtat 600

ctgattaaca tcatcggcga tctcatccca gagggcgtcc tcaacatcgt caacggactc 660

ggcggtgaag caggcgctgc actgtccggc tctaatcgga ttggcaagat tgctttcacc 720

ggttccaccg aggtcggcaa gctgatcaac cgcgctgcat ccgacaagat cattcctgtc 780

accctggagc tcggcggtaa gtccccatcc atcttcttct ccgatgttct gtcacaggat 840

gacgccttcg cagagaaggc agttgaaggc ttcgcgatgt tcgccctcaa tcagggtgaa 900

gtttgtacct gtccttcccg tgcacttgtt catgagtcca tcgctgatga attcctcgag 960

cttggcgtga agcgagttca gaacatcaag ctgggtaacc cacttgatac tgaaaccatg 1020

atgggtgctc aggcgtccca ggagcagatg gacaagatct cctcctacct gaagatcggc 1080

ccagaagaag gcgctcaaac cctcactggt ggcaaggtca acaaggttga tggcatggag 1140

aacggttact acattgagcc aaccgttttc cgcggcacca acgacatgag gatcttccgc 1200

gaggaaatct tcggaccagt cctttctgtt gctaccttca gcgacttcga tgaggccatc 1260

cgtattgcaa acgacaccaa ctacggcctc ggcgctggtg tctggagccg tgaccaaaac 1320

accatttatc gtgcaggtcg cgcaatccag gctggtcgag tttgggtcaa ccagtaccac 1380

aactacccag cgcactccgc tttcggtgga tacaaggagt ccggcatcgg ccgtgagaac 1440

cacctcatga tgctgaacca ctaccagcag accaagaacc tgttggtctc ctacgatcca 1500

aacccaaccg gactgttctg a 1521

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccactg ctgcacccca agaatttacc gctgctgttg ttgaaaaatt cggtcatgac 60

gtgaccgtga aggatattga ccttccaaag ccagggccac accaggcatt ggtgaaggta 120

ctcacctccg gcatctgcca caccgacctc cacgccttgg agggcgattg gccagtaaag 180

ccggaaccac cattcgtacc aggacacgaa ggtgtaggtg aagttgttga gctcggacca 240

ggtgaacacg atgtgaaggt cggcgatatt gtcggcaatg cgtggctctg gtcagcgtgt 300

ggcacctgcg aatactgcat caccggcagg gaaactcagt gcaacgaagc tgagtatggt 360

ggctacaccc aaaatggatc cttcggccag tacatgctgg tggatacccg ttacgccgct 420

cgcatcccag acggcgtgga ctacctcgaa gcagcaccaa ttctgtgtgc aggcgtgact 480

gtctacaagg cactcaaagt ctctgaaacc cgcccgggcc aattcatggt gatctccggt 540

gtcggcggac ttggccacat cgcagtccaa tacgcagcgg cgatgggcat gcgtgtcatt 600

gcggtagata ttgccgatga caagctggaa cttgcccgta agcacggtgc ggaatttacc 660

gtgaatgcgc gtaatgaaga ttcaggcgaa gctgtacaga agtacaccaa cggtggcgca 720

cacggcgtgc ttgtgactgc agttcacgag gcagcattcg gccaggcact ggatatggct 780

cgacgtgcag gaacaattgt gttcaacggt ctgccaccgg gagagttccc agcatccgtg 840

ttcaacatcg tattcaaggg cctgaccatc cgtggatccc tcgtgggaac ccgccaagac 900

ttggccgaag cgctcgattt ctttgcacgc ggactaatca agccaaccgt gagtgagtgc 960

tccctcgatg aggtcaatgg tgtgcttgac cgcatgcgaa acggcaagat cgatggtcgt 1020

gtggcgattc gtttctaa 1038

<210> 3

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggataccc agcggattaa agatgacgaa gatgctattc gttcggcgct gacatcgctg 60

aaaaccgcaa caggcatccc agtcaccatg ttcgccactg tgttgcagga caatcgcctg 120

caaattactc agtgggttgg gttgcgtacc ccggctctgc agaatctggt cattgaacca 180

ggtgtgggcg ttggtggacg cgtcgtcgca acccgtcgtc cggttggtgt gagtgattac 240

accagggcaa atgtcatttc acatgagaag gattccgcga ttcaggatga gggccttcat 300

tccattgtcg cagttcccgt gatcgtgcac cgcgaaattc gtggcgtttt gtatgttggc 360

gttcactctg cggtgcgtct cggcgacact gttattgaag aagtcaccat gactgcgcgc 420

acgttggaac aaaacctggc gatcaactcc gcgcttcgcc gcaatggcgt tcctgatggt 480

cgcggttccc tcaaagctaa ccgcgtgatg aatggggcgg agtgggagca ggttcgttcc 540

actcattcca agctgcgcat gctggcaaat cgtgtgaccg atgaggatct gcgccgcgat 600

ttggaagagc tttgcgatca gatggtcacc ccagtccgca tcaagcagac caccaagctg 660

tccgcgcgtg agttggacgt gctggcttgt gtcgcgctcg gtcacaccaa cgtcgaagct 720

gctgaagaga tgggcatcgg cgcggaaacc gtcaagagct acctgcgctc ggtcatgcgc 780

aagctcggcg cccacacgcg ctacgaggca gtcaacgcag cacgccggat cggcgcactg 840

ccttaa 846

<210> 4

<211> 636

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

35 40 45

Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile

100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys

165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg

275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Val

370 375 380

Val Ile Trp Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala

385 390 395 400

Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile

405 410 415

Ala Ala Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala

420 425 430

Glu His Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile

435 440 445

Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu

450 455 460

Glu Ala Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro

465 470 475 480

Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys

485 490 495

Trp Ala Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe

500 505 510

Glu His Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp

515 520 525

Val Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn

530 535 540

Gly Leu Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val

545 550 555 560

Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala

565 570 575

Gly Cys Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu

580 585 590

Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg

595 600 605

Val Gly Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp

610 615 620

Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp

625 630 635

<210> 5

<211> 1911

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtccgcag cagctgatcg tctgaacctg acctccggcc acctcaacgc cggtcgcaaa 60

cgctcctcct ccagcgtctc cctgaaggca gcagaaaagc ctttcaaggt taccgttatc 120

ggttccggta actggggcac caccatcgct aaggttgtag ctgagaactg caagggctac 180

ccagaggtct tcgcaccgat cgttcagatg tgggtcttcg aggaagaaat caacggtgag 240

aagcttaccg agatcatcaa cactcgccac cagaacgtca agtacctccc aggcatcacc 300

ctgccagaca accttgttgc caacccagac ctcatcgact ccgtgaagga cgttgacatc 360

atcgttttca acatcccaca tcagttcctc ccacgcatct gttctcaact caagggccac 420

gttgactccc acgttcgcgc aatctcctgc cttaagggtt tcgaagttgg tgctaagggc 480

gtacagcttc tgtcctccta catcaccgaa gagctgggta tccagtgcgg cgcactgagc 540

ggcgcgaaca tcgcaaccga ggtggctcag gaacactggt ccgagaccac cgttgcttac 600

cacatcccaa aggacttccg tggcgagggt aaggatgttg accacaaggt tctcaaggcc 660

ctgttccacc gcccttactt ccacgtttcc gttatcgagg acgtcgccgg catctccatc 720

tgcggagcac tgaagaacgt cgtagctctt ggttgcggtt tcgtcgaagg cctgggatgg 780

ggcaataacg cttccgcagc aatccagcgc gtgggcctgg gcgaaatcat ccgtttcggc 840

cagatgttct tcccagagtc ccgtgaggaa acctactacc aggaatcagc tggtgttgca 900

gacctgatca ccacctgtgc aggaggtcgc aacgtcaagg tcgcacgcct catggctact 960

tccggtaagg acgcttggga gtgcgagaag gagctcctga acggtcagtc tgctcagggc 1020

ctgatcacct gcaaggaggt acacgagtgg ctggagacat gcggctccgt cgaagacttc 1080

cctctcttcg aggctgtata ccagatcgtc tacaacaact acccaatgaa gaacctccct 1140

gacatgatcg tagttatatg gggtctgact accaagcctt tgtcactcaa ggtcaacgct 1200

gctcttttcg acgtcgacgg taccattatc atctctcagc cagctatcgc ggccttctgg 1260

cgcgacttcg gcaaggataa gccgtacttc gatgcggaac acgtcatcca ggtctcacac 1320

ggttggcgca ccttcgacgc aatcgctaag ttcgcaccag attttgcaaa cgaagagtac 1380

gtaaacaagc tggaggcaga gatcccagtt aagtacggcg aaaagtccat cgaggtccct 1440

ggtgctgtca agctctgcaa cgcactgaac gcactcccaa aggaaaagtg ggcagtcgcg 1500

accagcggca ctcgtgacat ggctcagaag tggttcgagc acctgggcat ccgtcgtcct 1560

aagtacttca tcaccgcaaa cgacgtcaag cagggcaagc ctcacccaga gccatacctc 1620

aagggccgta acggcctggg ctaccctatc aacgagcagg acccatccaa gtccaaggtc 1680

gttgtcttcg aagacgcacc agctggcatt gcagctggca aggcagctgg ctgtaagatc 1740

attggcatcg caactacctt cgatctggac ttcctgaagg agaagggctg cgacattatc 1800

gtcaagaacc acgaatccat ccgcgtcggt ggttacaacg ctgagactga tgaggttgag 1860

ttcatcttcg acgactacct ctacgctaag gacgaccttc tcaagtggta a 1911

<210> 6

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgagctgttg acaattaatc atccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 60

atttcacaca ggaaacagac catggaagga ggacaattcc atgtccgcag cagctgatcg 120

tctgaacctg acctccggcc acctcaacgc cggtcgcaaa cgctcctcct ccagcgtctc 180

cctgaaggca gcagaaaagc ctttcaaggt taccgttatc ggttccggta actggggcac 240

caccatcgct aaggttgtag ctgagaactg caagggctac ccagaggtct tcgcaccgat 300

cgttcagatg tgggtcttcg aggaagaaat caacggtgag aagcttaccg agatcatcaa 360

cactcgccac cagaacgtca agtacctccc aggcatcacc ctgccagaca accttgttgc 420

caacccagac ctcatcgact ccgtgaagga cgttgacatc atcgttttca acatcccaca 480

tcagttcctc ccacgcatct gttctcaact caagggccac gttgactccc acgttcgcgc 540

aatctcctgc cttaagggtt tcgaagttgg tgctaagggc gtacagcttc tgtcctccta 600

catcaccgaa gagctgggta tccagtgcgg cgcactgagc ggcgcgaaca tcgcaaccga 660

ggtggctcag gaacactggt ccgagaccac cgttgcttac cacatcccaa aggacttccg 720

tggcgagggt aaggatgttg accacaaggt tctcaaggcc ctgttccacc gcccttactt 780

ccacgtttcc gttatcgagg acgtcgccgg catctccatc tgcggagcac tgaagaacgt 840

cgtagctctt ggttgcggtt tcgtcgaagg cctgggatgg ggcaataacg cttccgcagc 900

aatccagcgc gtgggcctgg gcgaaatcat ccgtttcggc cagatgttct tcccagagtc 960

ccgtgaggaa acctactacc aggaatcagc tggtgttgca gacctgatca ccacctgtgc 1020

aggaggtcgc aacgtcaagg tcgcacgcct catggctact tccggtaagg acgcttggga 1080

gtgcgagaag gagctcctga acggtcagtc tgctcagggc ctgatcacct gcaaggaggt 1140

acacgagtgg ctggagacat gcggctccgt cgaagacttc cctctcttcg aggctgtata 1200

ccagatcgtc tacaacaact acccaatgaa gaacctccct gacatgatcg tagttatatg 1260

gggtctgact accaagcctt tgtcactcaa ggtcaacgct gctcttttcg acgtcgacgg 1320

taccattatc atctctcagc cagctatcgc ggccttctgg cgcgacttcg gcaaggataa 1380

gccgtacttc gatgcggaac acgtcatcca ggtctcacac ggttggcgca ccttcgacgc 1440

aatcgctaag ttcgcaccag attttgcaaa cgaagagtac gtaaacaagc tggaggcaga 1500

gatcccagtt aagtacggcg aaaagtccat cgaggtccct ggtgctgtca agctctgcaa 1560

cgcactgaac gcactcccaa aggaaaagtg ggcagtcgcg accagcggca ctcgtgacat 1620

ggctcagaag tggttcgagc acctgggcat ccgtcgtcct aagtacttca tcaccgcaaa 1680

cgacgtcaag cagggcaagc ctcacccaga gccatacctc aagggccgta acggcctggg 1740

ctaccctatc aacgagcagg acccatccaa gtccaaggtc gttgtcttcg aagacgcacc 1800

agctggcatt gcagctggca aggcagctgg ctgtaagatc attggcatcg caactacctt 1860

cgatctggac ttcctgaagg agaagggctg cgacattatc gtcaagaacc acgaatccat 1920

ccgcgtcggt ggttacaacg ctgagactga tgaggttgag ttcatcttcg acgactacct 1980

ctacgctaag gacgaccttc tcaagtggta a 2011

<210> 7

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttaccc 246

<210> 8

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300

accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360

caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420

gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480

caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210> 9

<211> 5089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga tggtttcgtt 60

aaggagtgga ttgaagaggg ctttatcgcg atggaaagcc ctaacgatcc caaaccttct 120

atccgcatcg tcaacggcgc ggtgaccgaa ctcgacggta aaccggttga gcagttcgac 180

ctgattgacc actttatcgc gcgctacggc attaatctcg cccgggccga agaagtgatg 240

gccatggatt cggttaagct cgccaacatg ctctgcgacc cgaacgttaa acgcagcgac 300

atcgtgccgc tcactaccgc gatgaccccg gcgaaaatcg tggaagtggt gtcgcatatg 360

aacgtggtcg agatgatgat ggcgatgcaa aaaatgcgcg cccgccgcac gccgtcccag 420

caggcgcatg tcactaatat caaagataat ccggtacaga ttgccgccga cgccgctgaa 480

ggcgcatggc gcggctttga cgaacaggag accaccgtcg ccgtggcgcg ctacgcgccg 540

ttcaacgcca tcgccctgct ggtgggttca caggttggcc gccccggcgt cctcacccag 600

tgttcgctgg aagaagccac cgagctgaaa ctgggcatgc tgggccacac ctgctatgcc 660

gaaaccattt cggtatacgg tacggaaccg gtgtttaccg atggcgatga cactccatgg 720

tcgaaaggct tcctcgcctc ctcctacgcc tcgcgcggcc tgaaaatgcg ctttacctcc 780

ggttccggtt ctgaagtaca gatgggctat gccgaaggca aatcgatgct ttatctcgaa 840

gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcc ggggtgcaag gcctgcagaa tggctccgtc 900

agctgtatcg gcgtaccgtc cgccgtgccg tccgggatcc gcgccgtact ggcggaaaac 960

ctgatctgct cagcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgatcaaac ctttacccac 1020

tcggatatgc ggcgtaccgc gcgtctgctg atgcagttcc tgccaggcac cgacttcatc 1080

tcctccggtt actcggcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggttc caacgaagat 1140

gccgaagact tcgatgacta caacgtgatc cagcgcgacc tgaaggtcga tggcggcctg 1200

cggccggtgc gtgaagagga cgtgatcgcc attcgcaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260

gcggtatttg ccggcatggg tttgccgcct attacggatg aagaagtaga agccgccacc 1320

tacgcccacg gttcaaaaga tatgcctgag cgcaatatcg tcgaggacat caagtttgct 1380

caggagatca tcaacaagaa ccgcaacggc ctggaagtgg tgaaagccct ggcgaaaggc 1440

ggcttccccg atgtcgccca ggacatgctc aatattcaga aagccaagct caccggcgac 1500

tacctgcata cctccgccat cattgttggc gagggccagg tgctctcggc cgtgaatgac 1560

gtgaacgatt atgccggtcc ggcaacaggc taccgcctgc aaggcgagcg ctgggaagag 1620

attaaaaata tcccgggcgc gctcgatccc aatgaacttg gctaaggggt gaaaaatgga 1680

aattaacgaa acgctgctgc gccagattat cgaagaggtg ctgtcggaga tgaaatcagg 1740

cgcagataag ccggtctcct ttagcgcgcc tgcggcttct gtcgcctctg ccgcaccggt 1800

cgccgttgcg cctgtgtccg gcgacagctt cctgacggaa atcggcgaag ccaaacccgg 1860

cacgcagcag gatgaagtca ttattgccgt cgggccagcg tttggtctgg cgcaaaccgc 1920

caatatcgtc ggcattccgc ataaaaatat tctgcgcgaa gtgatcgccg gcattgagga 1980

agaaggcatc aaagcccggg tgatccgctg ctttaagtct tctgacgtcg ccttcgtggc 2040

agtggaaggc aaccgcctga gcggctccgg catctcgatc ggtattcagt cgaaaggcac 2100

caccgtcatc caccagcgcg gcctgccgcc gctttccaat ctggaactct tcccgcaggc 2160

gccgctgctg acgctggaaa cctaccgtca gattggcaaa aacgccgcgc gctacgccaa 2220

acgcgagtcg ccgcagccgg tgccgacgct taacgatcag atggctcgtc ccaaatacca 2280

ggcgaagtcg gccattttgc acattaaaga gaccaaatac gtggtgacgg gcaaaaaccc 2340

gcaggaactg cgcgtggcgc tttaacaaag gatatcccga tgaataccga cgcaattgaa 2400

tccatggtac gcgacgtgct gagccggatg aacagcctac aggacgggat aacgcccgcg 2460

ccagccgcgc cgacaaacga caccgttcgc cagccaaaag ttagcgacta cccgttagcg 2520

acccgccatc cggagtgggt caaaaccgct accaataaaa cgctcgatga cctgacgctg 2580

gagaacgtat taagcgatcg cgttacggcg caggacatgc gcatcactcc ggaaacgctg 2640

cgtatgcagg cggcgatcgc ccaggatgcc ggacgcgatc ggctggcgat gaactttgag 2700

cgggccgcag agctcaccgc ggttcccgac gaccgaatcc ttgagatcta caacgccctg 2760

cgcccatacc gttccaccca ggcggagcta ctggcgatcg ctgatgacct cgagcatcgc 2820

taccaggcac gactctgtgc cgcctttgtt cgggaagcgg ccgggctgta catcgagcgt 2880

aagaagctga aaggcgacga ttaacagggg gtaagcatgc gctatatcgc tggcattgat 2940

attggcaact cctcgacaga agtcgccctg gcgacggtcg atgacgcagg tgtgctgaac 3000

actcgccaca gcgcgttggc tgaaaccacg ggtataaaag gcacattacg aaatgtgttc 3060

ggtatccagg aggcgctaac gcaggcggca aaagcggccg gcattcagct cagcgatatt 3120

tcgcttattc gcattaacga agccacgccg gtcattggcg atgtggcgat ggaaaccatc 3180

acggaaacca tcatcaccga gtccaccatg atcggccata acccgaagac acccggcggc 3240

gtcggactgg gggtcggcat caccatcaca ccagaggcgc tgctgtcctg ctccgcggac 3300

actccctata ttctggtggt ctcctcggcc tttgactttg ccgatgtcgc cgcgatggtc 3360

aatgcggcaa cggcagcggg ctatcagata accggcatta ttttgcagca ggatgacggc 3420

gtgctggtca ataaccggct acagcaaccg ctaccggtga tcgacgaagt tcagcatatc 3480

gaccggattc cacttggcat gctggcggcc gtcgaggtcg ctttacccgg taagatcatc 3540

gaaacgctct ccaaccccta cggtattgcg accgttttcg atctcaacgc cgaggagacc 3600

aaaaatatcg tgccaatggc gcgggcgctg attggcaacc gctcggccgt ggtggtgaaa 3660

accccctccg gcgacgtcaa ggcccgcgct attccggcag gtaatctgct gctcatcgct 3720

caagggcgca gcgtacaggt tgatgtggcc gccggggcgg aagccatcat gaaagcggtt 3780

gacggctgcg gcaaactgga caacgtcgcg ggagaagcgg gcaccaatat cggcggcatg 3840

ctagagcacg tgcgccagac catggcggag cttaccaata agccagctca ggagatccgc 3900

attcaggatc tgctggccgt tgatacggcg gtgccagtca gcgtgaccgg cggtcttgcg 3960

ggggagttct cgctggagca ggcggtgggt atcgcctcga tggtcaagtc ggatcgcctg 4020

cagatggccc tcatcgcccg tgaaattgag cacaaactgc agattgcggt tcaggtgggc 4080

ggcgccgaag cggaggcggc cattcttggg gcgctcacca ctcccggcac cacgcgcccg 4140

ctggcgatcc tcgatctggg cgccgggtcg accgacgcct ccattatcaa tgcgcaggga 4200

gagatcagcg ccactcacct ggccggcgcc ggcgatatgg tcacgatgat catcgcccgc 4260

gagctggggc ttgaggaccg ctacctggcg gaagagatca aaaaatatcc gctggctaaa 4320

gtcgaaagcc tgtttcatct gcgtcatgaa gacggcagcg tccagttttt tccgtcggcc 4380

ttaccaccga cggtatttgc ccgcgtctgc gtggtgaaac cggatgaact ggttcccctg 4440

cccggcgatc tgccgctgga gaaagtgcgc gccattcgcc gtagcgccaa atcacgcgtc 4500

tttatcacca acgccctgcg agcgttacgc caggtgagcc ctaccggcaa cattcgcgac 4560

atcccgttcg tggtgctggt gggcggctcg tccctcgatt tcgagatccc ccagctggtc 4620

accgacgcgc tggcgcacta ccggctggtt gccgggcgcg gcaacatccg cggctgtgaa 4680

ggcccacgca atgcggtcgc cagcggatta ctcctttcct ggcaaaaagg aggcacacat 4740

ggagagtagc gtagtcgccc ccgccatcgt cattgccgtc actgacgaat gcagcgaaca 4800

gtggcgcgat gtcctgctgg gcattgaaga ggaaggcatt ccttttgttc tgcagccgca 4860

gaccggcggc gatcttatcc atcacgcctg gcaggcggcg cagcgttcgc cgctgcaggt 4920

aggcatcgcc tgcgaccggg aacggctcat cgtgcactac aaaaatttac ccgcatcaac 4980

tccgttgttt tcgctgatgt atcaccagaa caggctggcc cggcgaaaca ctggcaacaa 5040

tgcggctcgt ctcgtcaaag ggatcccatt tcgggatcgc catgcttaa 5089

<210> 10

<211> 6525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttacccaagg agatatacca tgaacaactt taatctgcac accccaaccc gcattctgtt 300

tggtaaaggc gcaatcgctg gtttacgcga acaaattcct cacgatgctc gcgtattgat 360

tacctacggc ggcggcagcg tgaaaaaaac cggcgttctc gatcaagttc tggatgccct 420

gaaaggcatg gacgtgctgg aatttggcgg tattgagcca aacccggctt atgaaacgct 480

gatgaacgcc gtgaaactgg ttcgcgaaca gaaagtgact ttcctgctgg cggttggcgg 540

cggttctgta ctggacggca ccaaatttat cgccgcagcg gctaactatc cggaaaatat 600

cgatccgtgg cacattctgc aaacgggcgg taaagagatt aaaagcgcca tcccgatggg 660

ctgtgtgctg acgctgccag caaccggttc agaatccaac gcaggcgcgg tgatctcccg 720

taaaaccaca ggcgacaagc aggcgttcca ttctgcccat gttcagccgg tatttgccgt 780

gctcgatccg gtttatacct acaccctgcc gccgcgtcag gtggctaacg gcgtagtgga 840

cgcctttgta cacaccgtgg aacagtatgt taccaaaccg gttgatgcca aaattcagga 900

ccgtttcgca gaaggcattt tgctgacgct aatcgaagat ggtccgaaag ccctgaaaga 960

gccagaaaac tacgatgtgc gcgccaacgt catgtgggcg gcgactcagg cgctgaacgg 1020

tttgattggc gctggcgtac cgcaggactg ggcaacgcat atgctgggcc acgaactgac 1080

tgcgatgcac ggtctggatc acgcgcaaac actggctatc gtcctgcctg cactgtggaa 1140

tgaaaaacgc gataccaagc gcgctaagct gctgcaatat gctgaacgcg tctggaacat 1200

cactgaaggt tccgatgatg agcgtattga cgccgcgatt gccgcaaccc gcaatttctt 1260

tgagcaatta ggcgtgccga cccacctctc cgactacggt ctggacggca gctccatccc 1320

ggctttgctg aaaaaactgg aagagcacgg catgacccaa ctgggcgaaa atcatgacat 1380

tacgttggat gtcagccgcc gtatatacga agccgcccgc taaaaggaga tataccatga 1440

gatcgaaaag atttgaagca ctggcgaaac gccctgtgaa tcaggatggt ttcgttaagg 1500

agtggattga agagggcttt atcgcgatgg aaagccctaa cgatcccaaa ccttctatcc 1560

gcatcgtcaa cggcgcggtg accgaactcg acggtaaacc ggttgagcag ttcgacctga 1620

ttgaccactt tatcgcgcgc tacggcatta atctcgcccg ggccgaagaa gtgatggcca 1680

tggattcggt taagctcgcc aacatgctct gcgacccgaa cgttaaacgc agcgacatcg 1740

tgccgctcac taccgcgatg accccggcga aaatcgtgga agtggtgtcg catatgaacg 1800

tggtcgagat gatgatggcg atgcaaaaaa tgcgcgcccg ccgcacgccg tcccagcagg 1860

cgcatgtcac taatatcaaa gataatccgg tacagattgc cgccgacgcc gctgaaggcg 1920

catggcgcgg ctttgacgaa caggagacca ccgtcgccgt ggcgcgctac gcgccgttca 1980

acgccatcgc cctgctggtg ggttcacagg ttggccgccc cggcgtcctc acccagtgtt 2040

cgctggaaga agccaccgag ctgaaactgg gcatgctggg ccacacctgc tatgccgaaa 2100

ccatttcggt atacggtacg gaaccggtgt ttaccgatgg cgatgacact ccatggtcga 2160

aaggcttcct cgcctcctcc tacgcctcgc gcggcctgaa aatgcgcttt acctccggtt 2220

ccggttctga agtacagatg ggctatgccg aaggcaaatc gatgctttat ctcgaagcgc 2280

gctgcatcta catcaccaaa gccgccgggg tgcaaggcct gcagaatggc tccgtcagct 2340

gtatcggcgt accgtccgcc gtgccgtccg ggatccgcgc cgtactggcg gaaaacctga 2400

tctgctcagc gctggatctg gagtgcgcct ccagcaacga tcaaaccttt acccactcgg 2460

atatgcggcg taccgcgcgt ctgctgatgc agttcctgcc aggcaccgac ttcatctcct 2520

ccggttactc ggcggtgccg aactacgaca acatgttcgc cggttccaac gaagatgccg 2580

aagacttcga tgactacaac gtgatccagc gcgacctgaa ggtcgatggc ggcctgcggc 2640

cggtgcgtga agaggacgtg atcgccattc gcaacaaagc cgcccgcgcg ctgcaggcgg 2700

tatttgccgg catgggtttg ccgcctatta cggatgaaga agtagaagcc gccacctacg 2760

cccacggttc aaaagatatg cctgagcgca atatcgtcga ggacatcaag tttgctcagg 2820

agatcatcaa caagaaccgc aacggcctgg aagtggtgaa agccctggcg aaaggcggct 2880

tccccgatgt cgcccaggac atgctcaata ttcagaaagc caagctcacc ggcgactacc 2940

tgcatacctc cgccatcatt gttggcgagg gccaggtgct ctcggccgtg aatgacgtga 3000

acgattatgc cggtccggca acaggctacc gcctgcaagg cgagcgctgg gaagagatta 3060

aaaatatccc gggcgcgctc gatcccaatg aacttggcta aggggtgaaa aatggaaatt 3120

aacgaaacgc tgctgcgcca gattatcgaa gaggtgctgt cggagatgaa atcaggcgca 3180

gataagccgg tctcctttag cgcgcctgcg gcttctgtcg cctctgccgc accggtcgcc 3240

gttgcgcctg tgtccggcga cagcttcctg acggaaatcg gcgaagccaa acccggcacg 3300

cagcaggatg aagtcattat tgccgtcggg ccagcgtttg gtctggcgca aaccgccaat 3360

atcgtcggca ttccgcataa aaatattctg cgcgaagtga tcgccggcat tgaggaagaa 3420

ggcatcaaag cccgggtgat ccgctgcttt aagtcttctg acgtcgcctt cgtggcagtg 3480

gaaggcaacc gcctgagcgg ctccggcatc tcgatcggta ttcagtcgaa aggcaccacc 3540

gtcatccacc agcgcggcct gccgccgctt tccaatctgg aactcttccc gcaggcgccg 3600

ctgctgacgc tggaaaccta ccgtcagatt ggcaaaaacg ccgcgcgcta cgccaaacgc 3660

gagtcgccgc agccggtgcc gacgcttaac gatcagatgg ctcgtcccaa ataccaggcg 3720

aagtcggcca ttttgcacat taaagagacc aaatacgtgg tgacgggcaa aaacccgcag 3780

gaactgcgcg tggcgcttta acaaaggata tcccgatgaa taccgacgca attgaatcca 3840

tggtacgcga cgtgctgagc cggatgaaca gcctacagga cgggataacg cccgcgccag 3900

ccgcgccgac aaacgacacc gttcgccagc caaaagttag cgactacccg ttagcgaccc 3960

gccatccgga gtgggtcaaa accgctacca ataaaacgct cgatgacctg acgctggaga 4020

acgtattaag cgatcgcgtt acggcgcagg acatgcgcat cactccggaa acgctgcgta 4080

tgcaggcggc gatcgcccag gatgccggac gcgatcggct ggcgatgaac tttgagcggg 4140

ccgcagagct caccgcggtt cccgacgacc gaatccttga gatctacaac gccctgcgcc 4200

cataccgttc cacccaggcg gagctactgg cgatcgctga tgacctcgag catcgctacc 4260

aggcacgact ctgtgccgcc tttgttcggg aagcggccgg gctgtacatc gagcgtaaga 4320

agctgaaagg cgacgattaa cagggggtaa gcatgcgcta tatcgctggc attgatattg 4380

gcaactcctc gacagaagtc gccctggcga cggtcgatga cgcaggtgtg ctgaacactc 4440

gccacagcgc gttggctgaa accacgggta taaaaggcac attacgaaat gtgttcggta 4500

tccaggaggc gctaacgcag gcggcaaaag cggccggcat tcagctcagc gatatttcgc 4560

ttattcgcat taacgaagcc acgccggtca ttggcgatgt ggcgatggaa accatcacgg 4620

aaaccatcat caccgagtcc accatgatcg gccataaccc gaagacaccc ggcggcgtcg 4680

gactgggggt cggcatcacc atcacaccag aggcgctgct gtcctgctcc gcggacactc 4740

cctatattct ggtggtctcc tcggcctttg actttgccga tgtcgccgcg atggtcaatg 4800

cggcaacggc agcgggctat cagataaccg gcattatttt gcagcaggat gacggcgtgc 4860

tggtcaataa ccggctacag caaccgctac cggtgatcga cgaagttcag catatcgacc 4920

ggattccact tggcatgctg gcggccgtcg aggtcgcttt acccggtaag atcatcgaaa 4980

cgctctccaa cccctacggt attgcgaccg ttttcgatct caacgccgag gagaccaaaa 5040

atatcgtgcc aatggcgcgg gcgctgattg gcaaccgctc ggccgtggtg gtgaaaaccc 5100

cctccggcga cgtcaaggcc cgcgctattc cggcaggtaa tctgctgctc atcgctcaag 5160

ggcgcagcgt acaggttgat gtggccgccg gggcggaagc catcatgaaa gcggttgacg 5220

gctgcggcaa actggacaac gtcgcgggag aagcgggcac caatatcggc ggcatgctag 5280

agcacgtgcg ccagaccatg gcggagctta ccaataagcc agctcaggag atccgcattc 5340

aggatctgct ggccgttgat acggcggtgc cagtcagcgt gaccggcggt cttgcggggg 5400

agttctcgct ggagcaggcg gtgggtatcg cctcgatggt caagtcggat cgcctgcaga 5460

tggccctcat cgcccgtgaa attgagcaca aactgcagat tgcggttcag gtgggcggcg 5520

ccgaagcgga ggcggccatt cttggggcgc tcaccactcc cggcaccacg cgcccgctgg 5580

cgatcctcga tctgggcgcc gggtcgaccg acgcctccat tatcaatgcg cagggagaga 5640

tcagcgccac tcacctggcc ggcgccggcg atatggtcac gatgatcatc gcccgcgagc 5700

tggggcttga ggaccgctac ctggcggaag agatcaaaaa atatccgctg gctaaagtcg 5760

aaagcctgtt tcatctgcgt catgaagacg gcagcgtcca gttttttccg tcggccttac 5820

caccgacggt atttgcccgc gtctgcgtgg tgaaaccgga tgaactggtt cccctgcccg 5880

gcgatctgcc gctggagaaa gtgcgcgcca ttcgccgtag cgccaaatca cgcgtcttta 5940

tcaccaacgc cctgcgagcg ttacgccagg tgagccctac cggcaacatt cgcgacatcc 6000

cgttcgtggt gctggtgggc ggctcgtccc tcgatttcga gatcccccag ctggtcaccg 6060

acgcgctggc gcactaccgg ctggttgccg ggcgcggcaa catccgcggc tgtgaaggcc 6120

cacgcaatgc ggtcgccagc ggattactcc tttcctggca aaaaggaggc acacatggag 6180

agtagcgtag tcgcccccgc catcgtcatt gccgtcactg acgaatgcag cgaacagtgg 6240

cgcgatgtcc tgctgggcat tgaagaggaa ggcattcctt ttgttctgca gccgcagacc 6300

ggcggcgatc ttatccatca cgcctggcag gcggcgcagc gttcgccgct gcaggtaggc 6360

atcgcctgcg accgggaacg gctcatcgtg cactacaaaa atttacccgc atcaactccg 6420

ttgttttcgc tgatgtatca ccagaacagg ctggcccggc gaaacactgg caacaatgcg 6480

gctcgtctcg tcaaagggat cccatttcgg gatcgccatg cttaa 6525

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acagctatga catgattacg accggttccg caacggtgtt 40

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggagaccca tctaagcgtt aagtcctaga aaagctgc 38

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacgcttaga tgggtctcct ttgggccac 29

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgcatgcctg caggtcgact attcagcacc tcagccagga g 41

<210> 15

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cacacaggaa acagctatga catgattacg gacttcaccc aatcactcac ataatccg 58

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgagaaggag tgagttttcg gattgtgttg aaactgctct gaagctact 49

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcagtttca acacaatccg aaaactcact ccttctcgct tggattac 48

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac taggcgacga gctcaatcaa atcc 54

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcacacagg aaacagctat gacatgatta cgttcccaag gacgatcccc gc 52

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcaggaggaa atctgaagaa agattttgct ttacgacgcc accctg 46

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgtcgtaaag caaaatcttt cttcagattt cctcctgctt tacacccgt 49

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactt tctgttcatt atttgtagac cgagcgt 57

Claims

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的乙醇脱氢酶adhA和/或乙醛脱氢酶ald的表达和/或酶活性；所述出发菌株为可合成1,3-丙二醇的谷氨酸棒杆菌；

所述表达和/或酶活性的降低通过敲除如下基因中的一个或多个实现：

1)乙醇脱氢酶adhA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)乙醛脱氢酶ald基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述出发菌株过表达甘油-3-磷酸脱氢酶与甘油-3-磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述出发菌株具有提高的二醇脱水酶的表达和/或酶活性，所述提高的二醇脱水酶的表达和/或酶活性，通过过表达二醇脱水酶及其激活因子实现，所述二醇脱水酶及其激活因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述出发菌株具有提高的醇脱氢酶的表达和/或酶活性，所述提高的醇脱氢酶的表达和/或酶活性，通过过表达醇脱氢酶实现，所述醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.权利要求1所述的重组微生物的如下任一种应用：

（1）在发酵生产1,3-丙二醇中的应用；

（2）在用于生产1,3-丙二醇的微生物遗传育种中的应用；

（3）在降低生物法合成1,3-丙二醇的成本中的应用；

（4）在提高生物法合成1,3-丙二醇的安全性中的应用；

（5）在降低生物法合成1,3-丙二醇时，副产物3-羟基丙酸产量上的应用。

3.一种发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，包括培养权利要求1所述的重组微生物的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，培养所述重组微生物时的碳源为糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、木糖、甘露糖、木质纤维素水解液中的一种或多种。