CN111032874A - 表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性d-脯氨酸还原酶的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及表达活性D‑脯氨酸还原酶的微生物。

Description

表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性D-脯氨酸还 原酶的方法

技术领域

本公开涉及表达D-脯氨酸还原酶的微生物——其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强；和生产相应的活性D-脯氨酸还原酶的方法。在此基础上，本公开还涉及还原D-脯氨酸和D-脯氨酸类似物的方法；和PrdH蛋白，该PrdH蛋白具有当与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达时将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶的活性。

背景技术

由于环境友好产品的发展趋势以及不稳定的供油和耗油危机，已经对生物质衍生产品比如生物塑料、生物能源等进行了研究和开发。特别地，正在进行许多研究以将各种生物质衍生的单体应用于尼龙。例如，正在研究通过应用生物质衍生的腐胺来开发尼龙4,6，以及通过应用生物质衍生的尸胺来开发尼龙5,6，以替代尼龙6,6的己二胺(HMDA)。通过使用4-氨基丁酸(或γ-氨基丁酸(GABA))作为单体的尼龙4产品的开发也在进行中，该单体可以通过谷氨酸脱羧酶以谷氨酸为原料生产。

已知的是，作为尼龙5的单体的5-氨基戊酸通过D-脯氨酸还原酶由脯氨酸转化。然而，D-脯氨酸还原酶的活化需要PrdA蛋白的精确自切割并且同时引入丙酮酰基。然而，这被认为是技术限制，并且因而对能够制备活性D-脯氨酸还原酶的方法的需求日益增加。

发明内容

技术问题

本发明人继续研究可以生产活性形式的D-脯氨酸还原酶的重组表达系统和微生物菌株，并且还研究了其对各种D-脯氨酸类似物底物的适用性。结果，他们首次鉴定了PrdH蛋白，该蛋白在与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达时将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶。进一步地，他们成功地证明了表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物和由其生产的D-脯氨酸还原酶的活性。

技术方案

本公开的目的是提供表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强。

本公开的另一个目的是提供生产活性D-脯氨酸还原酶的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物，以及从微生物或培养基中回收活性D-脯氨酸还原酶。

本公开的仍另一个目的是提供使用微生物或由微生物生产的活性D-脯氨酸还原酶生产选自氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-AVA)、γ-氨基丁酸(GABA)和5-氨基-4-羟基戊酸的一种或多种的方法。

本公开的仍另一个目的是提供PrdH蛋白，该PrdH蛋白在与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达时将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶。

本公开的仍另一个目的是提供生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，该方法包括以下步骤：用包括prdA基因或prdA和prdH基因的表达盒转化宿主细胞，和用包括prdB基因或prdB和prdH基因的表达盒转化宿主细胞。

有益效果

在本公开中，新提出了能够将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶的多肽，并且当通过与构成现有D-脯氨酸还原酶的PrdA和PrdB的复合物相互作用而表达时或者当与Prd操纵子一起表达时，增强了活性D-脯氨酸还原酶的活性，从而提供了D-脯氨酸还原酶的新型活性形式和转化D-脯氨酸或其类似物的方法。

附图说明

图1是示出生产活性D-脯氨酸还原酶的方法的示意图。

图2显示了根据PrdA蛋白的表达条件的SDS-PAGE分析的结果。

图3显示了在有或没有振动的情况下PrdA蛋白表达的SDS-PAGE分析的结果。

图4显示了根据PrdB蛋白表达的蛋白质印迹分析的结果。

图5显示了通过PrdH蛋白自切割PrdA蛋白的蛋白质印迹分析的结果。

图6显示了重组D-脯氨酸还原酶和PrdDEE₂蛋白的活性的TLC分析的结果。

图7显示了普遍应用PrdH蛋白的蛋白质印迹分析的结果。

图8显示了PrdC蛋白对D-脯氨酸还原酶的活性的影响的TLC分析的结果。

图9显示了PrdG蛋白对D-脯氨酸还原酶(A)的活性和PrdG蛋白(B)的特性的影响的TLC分析的结果；

图10显示了通过共表达重组活性D-脯氨酸还原酶和另外的蛋白由糖源生产5-氨基戊酸的TLC分析的结果；和

图11显示了针对活性D-脯氨酸还原酶的D-脯氨酸类似物转化能力的TLC分析的结果。

具体实施方式

以下将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。也就是说，在本公开中公开的各种要素的所有组合落入本公开的范围内。进一步地，本公开的范围不受以下描述的具体实施方式的限制。

为了实现本公开的目的，本公开的一方面提供了表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强。

如本文所使用，术语“D-脯氨酸还原酶”是指由PrdA蛋白和PrdB蛋白组成的蛋白复合物。已知其主要功能为参与将D-脯氨酸还原为5-氨基戊酸(5-AVA)的转化过程。已知该反应对应于Stickland反应的最后一步，该Stickland反应用于厌氧菌株的能源(ATP)供应(Bouillaut等人,J.Bacteriol.,2013,195(4),844-854)。

Stickland反应，也称为Stickland发酵，是指涉及氨基酸至有机酸的偶联的氧化与还原的反应。详细地，电子供体氨基酸被氧化为比原始氨基酸短一个碳原子的挥发性羧酸。例如，具有三碳链的丙氨酸被转化为具有两个碳的乙酸。氨基酸可以充当Stickland受体和Stickland供体。

具有Stickland反应的代表性菌株可包括消化链球菌630(Peptoclostridiumdifficile 630)、艰难梭菌630(Clostridium difficile 630)、Peptoclostridiumstiklandii、斯氏梭菌(Clostridium stiklandii)或嗜氨基酸真杆菌(Eubacteriumacidaminophilum)。已知还包括一些乳酸杆菌菌株，比如唾液乳杆菌。因此，这些菌株可用于生产表达本公开的活性D-脯氨酸还原酶的微生物、具有将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶的活性的PrdH蛋白、和活性D-脯氨酸还原酶。

已知D-脯氨酸还原酶的主要功能为参与D-脯氨酸至5-氨基戊酸(5-AVA)的转化过程。但是，迄今为止，对于D-脯氨酸还原酶的反应机理尚不清楚，但已经提出了以下的反应机理。首先，在由α-PrdA、β-PrdA和PrdB蛋白的复合物组成的D-脯氨酸还原酶的组成蛋白中，α-PrdA蛋白在氨基末端具有丙酮酰基，其与作为底物的D-脯氨酸的胺基相互作用，结果，降低了底物的活化能。在下一步骤中，位于PrdB蛋白上的硒代半胱氨酸破坏了D-脯氨酸的α碳与胺基之间的C-N键，结果，发生了D-脯氨酸至5-氨基戊酸的转化反应(Kabisch等人,J.Biol.Chem.,1999,274(13),8445-8454)。如本文所使用，术语“活性D-脯氨酸还原酶”是指由α-PrdA、β-PrdA和PrdB蛋白组成的蛋白复合物，其中由于被本公开的辅助蛋白PrdH精确地自切割，构成D-脯氨酸还原酶的PrdA蛋白和PrdB蛋白中的PrdA蛋白被分离为α-PrdA和β-PrdA，并且丙酮酰基结合至α-PrdA的氨基末端。如上所述的活性D-脯氨酸还原酶是指该酶的活性形式，其能够经由α-PrdA的丙酮酰基结合至底物来还原D-脯氨酸或D-脯氨酸类似物底物。例如，活性D-脯氨酸还原酶能够将底物D-脯氨酸转化为5-氨基戊酸(5-氨基戊酸酯)。

如本文所使用，术语“D-脯氨酸”是L-脯氨酸的旋光异构体，其为α-氨基酸。特别地，作为非必需氨基酸的L-脯氨酸可以由L-谷氨酸合成并通过消旋酶转化为D-脯氨酸。

如本文所使用，术语“PrdA蛋白”是指构成D-脯氨酸还原酶的蛋白复合物的成分，并且通过自切割过程PrdA蛋白分离为α-PrdA蛋白(羧基末端片段)和β-PrdA蛋白(氨基末端片段)。一般的自切割过程通过肽键的简单切割发生，但是PrdA蛋白的自切割过程的特征在于，同时发生了肽键的切割过程以及引入丙酮酰基到α-PrdA蛋白的氨基末端。当PrdA蛋白独立存在时，由于该蛋白本身的缺陷而涉及非特异性切割/降解过程，并且存在PrdA蛋白不能完全分离为α-PrdA蛋白和β-PrdA蛋白的问题。

丙酮酰基已知为D-脯氨酸还原酶活性的必需残基，因为它在降低底物的活化能方面起重要作用(Kabisch等人,J.Biol.Chem.,1999,274(13),8445-8454)。然而，在通过一般水解反应的蛋白切割机理中，并未引入丙酮酰基，并且因而进行了各种研究以解决该问题。为了防止由PrdA蛋白(pro-PrdA蛋白)本身的结构不稳定性引起的非特异性蛋白降解，已经进行了研究，以通过将还原剂比如NaBH₄等添加至从其去除氨基末端的PrdA蛋白片段来诱导人工切割过程。结果，观察到所需的位点特异性切割，但是未获得丙酮酰基的引入(Bednarski等人,Eur.J.Biochem.,2001,268,3538-3544)。

PrdA蛋白的序列可以从NCBI的GenBank获得，其是公开数据库，并且可以无限制地使用任何序列，只要其编码具有Stickland反应的菌株的PrdA蛋白。其代表性实例可包括源自消化链球菌630(艰难梭菌630)或唾液乳杆菌的PrdA蛋白，但不限于此。例如，它可以是SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由SEQ ID NO：19的序列编码的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的PrdA蛋白可以包括与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：19具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的多肽。进一步地，显而易见的是，具有部分缺失、修饰、替换、保守替换或增加的氨基酸序列的PrdA蛋白也在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有上述同源性或同一性并展现出对应于上述蛋白的功效。

如本文所使用，术语“PrdB蛋白”是指构成D-脯氨酸还原酶的蛋白复合物的成分，并且PrdB蛋白是包括硒代半胱氨酸(Sec)的硒蛋白，其是非天然氨基酸。硒代半胱氨酸是已知为21^st氨基酸的非天然氨基酸，并且特征在于通过正常的蛋白合成机理不被引入到蛋白中(Itoh等人,Science,340(6128),2013,75-78.)。特别地，由于其引入是使用UGA密码子，即，64个密码子中的终止密码子进行，因此存在在没有硒代半胱氨酸插入系统的情况下蛋白合成在终止密码子处停止的现象。此外，为了不将硒代半胱氨酸插入密码子识别为一般终止密码子，必须将称为SECIS(SElenoCysteine Incorporation Sequence)的序列/结构特异性mRNA的二级结构定位在UGA密码子的下游，并且为了并入到蛋白中，需要Sel系统(SelABCD)(Su等人,Nucleic Acids Res.,2005,33(8),2486-2492)。

PrdB蛋白的序列可以从NCBI的GenBank获得，其是公共数据库，并且可以无限制地使用任何序列，只要其编码具有Stickland反应的菌株的PrdA蛋白。其代表性实例可包括源自消化链球菌630(艰难梭菌630)或唾液乳杆菌的PrdB蛋白，但不限于此。例如，其可以是SEQ ID NO：5的氨基酸序列或由SEQ ID NO：21的多肽序列编码的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的PrdB蛋白可以包括与SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：21具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的多肽。进一步地，显而易见的是，具有部分缺失、修饰、替换、保守替换或增加的氨基酸序列的PrdB蛋白也可以在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有上述同源性或同一性并展现出对应于上述蛋白的功效。

如本文所使用，术语“PrdH蛋白”是指通过使用基因ORF编码的新型蛋白，其存在于编码构成D-脯氨酸还原酶的PrdA蛋白和PrdB蛋白的基因之间。在本公开中，其被称为PrdH。进一步地，根据具有D-脯氨酸还原酶活性的菌株的种类或特性，PrdH蛋白可以与PrdA或PrdB部分重叠，并且PrdH的终止密码子可以位于PrdB的起始密码子之后，但不限于此。

PrdH蛋白可与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达，以诱导PrdA蛋白的精确自切割和丙酮酰基的引入，从而允许构建活性D-脯氨酸还原酶。具体地，可以无限制地使用任何序列，只要其编码具有Stickland反应的菌株的PrdH蛋白。换句话说，可以无限制地使用任何序列，只要其包括存在于编码具有Stickland反应的菌株的PrdA蛋白和PrdB蛋白的基因之间的基因ORF。其代表性实例可包括源自消化链球菌630(艰难梭菌630)或唾液乳杆菌的PrdH蛋白，但不限于此。源自消化链球菌630的PrdH蛋白与源自唾液乳杆菌的PrdH蛋白彼此具有40％的同源性或同一性，并且它们共同的是存在于编码源自两种微生物的每种的PrdA蛋白和PrdB蛋白的基因之间的基因ORF。更具体地，例如，PrdH蛋白可以是由SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：23的氨基酸序列组成的多肽序列编码的氨基酸序列，但不限于此。

进一步地，本公开的PrdH蛋白可包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：23具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的多肽。进一步地，显而易见的是，具有部分缺失、修饰、替换、保守替换或增加的氨基酸序列的PrdH蛋白也可以在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有上述同源性或同一性并且展现出对应于上述蛋白的功效。

如本文所使用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。术语“同源性”和“同一性”通常可以互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与所用程序建立的默认空位罚分(default gap penalties)一起使用。实质上，同源或同一的序列可以在中等或高度严格的条件下杂交，使得该序列的全长或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多可以杂交。而且，考虑了在杂交中含有简并密码子代替密码子的多核苷酸。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法，比如“FASTA”程序，使用例如Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444中的默认参数来确定，或使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定，如EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或更高版本)的Needle程序所实施(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]AcademicPress,San Diego,1994,and[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW可用于确定同源性、相似性或同一性。

例如，多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序比如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443比较序列信息确定，如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482所公开。简而言之，GAP程序将相似性限定为相似的比对的字符(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短序列的字符总数。GAP程序的默认参数可能包括：(1)一元比较矩阵(含有对于同一性为1且对于非同一性为0的值)；以及Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,AtlasOf Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中所公开(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵)；(2)每个空位的罚分为3.0，以及每个空位中的每个字符的另外罚分为0.10(或空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5)；(3)末端空位无罚分。因此，如本文所使用，术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性。

进一步地，即使本文描述了‘具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白’，显而易见的是，其部分缺失、修饰、替换、保守替换或增加的具有氨基酸序列的蛋白可在本公开中使用，只要其活性与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽的活性相同或相对应。具体地，不排除在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列之前和之后增加不改变蛋白功能的序列、其天然发生的突变、保守替换或同义突变。显而易见的是，即使多肽具有这种序列增加或突变，其落入本公开的范围内。

如本文所使用，术语“保守替换”意思是一个氨基酸被在氨基酸序列中具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换。例如，变体可以具有一种或多种保守替换，同时保留一种或多种生物学活性。这种氨基酸替换通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。例如，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；并且疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。通常，保守替换对所得多肽的活性影响很小或没有影响。编码具有由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：23组成的氨基酸序列的PrdH蛋白的多核苷酸也落入本公开的范围内。例如，多核苷酸可以是由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：24的核苷酸序列组成的多核苷酸。在多核苷酸中，由于密码子简并性或考虑到要在其中表达蛋白的生物体所偏好的密码子，可以在编码区进行各种修饰，条件是它们不改变蛋白的氨基酸序列。

显而易见的是，由于密码子简并性，还可以包括可以翻译成由SEQ ID NO：1或SEQID NO：23的氨基酸序列组成的蛋白或与其具有同源性或同一性的蛋白的多核苷酸。进一步地，还可以没有限制地包括可以由已知的核苷酸序列产生的探针，例如，在严格条件下与该核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交以编码具有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白活性的蛋白的序列。术语“严格条件”意思是允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。这种条件在文献(例如，J.Sambrook等人，同上)中详细描述。例如，严格条件可以包括，例如，具有高同源性或同一性，40％或更高、85％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、更具体地97％或更高、特别具体地99％或更高的同源性或同一性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因彼此不杂交，或Southern杂交的常规洗涤条件，即，在对应于60℃，1xSSC，0.1％SDS，具体地60℃，0.1xSSC，0.1％SDS，以及更具体地68℃，0.1x SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地，两次或三次的条件。

虽然由于杂交的严格性可能在核苷酸之间发生错配，但是需要两个核酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本相似的核酸序列，而且可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体地，可以使用杂交条件，其包括在55℃的Tm值下的杂交步骤和上述条件，来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据目的由本领域普通技术人员适当地控制。

多核苷酸杂交的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且该变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。

如本文所使用，术语“活性的增强”意思是与微生物的固有活性或修饰之前的活性相比，酶蛋白的活性的引入或其改善。活性的“引入”意思是微生物最初不具有的特定蛋白的活性自然地或人工地出现。“固有活性”是指当微生物的性状由于自然或人工因素引起的遗传变异而改变时，转化前亲本菌株最初具有的特定蛋白的活性。

例如，活性的增强可以包括将异种D-脯氨酸还原酶引入宿主细胞中或通过引入的增强或固有D-脯氨酸还原酶活性的增强的全部。

具体地，在本公开中，活性的增强可以通过以下方式进行：

1)增加编码酶的多核苷酸的拷贝数，

2)修饰用于增加多核苷酸的表达的表达控制序列，

3)修饰用于增强酶的活性的染色体上的多核苷酸序列，或

4)通过其组合进行修饰以便增强，但是不限于此。

1)多核苷酸的拷贝数的增加可以但不特别限于以其中多核苷酸可操作地连接至载体的形式进行，或通过将多核苷酸插入宿主细胞的染色体中进行。进一步地，可以通过将展现出酶活性的异种多核苷酸或该多核苷酸的密码子优化的变体多核苷酸引入宿主细胞中进行拷贝数的增加。可以在其来源或序列中无限制地使用任何异种多核苷酸序列，只要其展现出与上述酶的活性相同/相似的活性。可以通过本领域技术人员适当选择的已知的转化方法进行进行，并且可以通过在宿主细胞中表达引入的多核苷酸来产生酶，结果，可以增大其活性。

接着，2)用于增加多核苷酸表达的表达控制序列的修饰可以，但不特别限于，通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守替换或其组合诱导序列上的修饰以进一步增强表达控制序列的活性进行，或通过用具有更强活性的核苷酸序列代替多核苷酸序列进行。表达控制序列包括，但不特别限于，启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译的终止的序列。具体地，可以将强的外源启动子而不是原始启动子连接至多核苷酸的表达单元的上游区域。强启动子的实例可以包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等。启动子和多核苷酸彼此可操作地连接以提高编码该酶的多核苷酸的表达率，但不限于此。

此外，3)染色体上的多核苷酸序列的修饰可以，但不特别限于，通过缺失、插入、非保守或保守替换多核苷酸序列或其组合来诱导表达控制序列的修饰以进一步增强多核苷酸序列的活性进行，或者通过用改进为具有更强活性的多核苷酸序列代替该多核苷酸序列进行。

最后，4)通过1)至3)的组合进行修饰以便增强的方法，可以通过应用以下方法的一种或多种进行：增加编码蛋白的多核苷酸的拷贝数，修饰用于增加多核苷酸的表达的表达控制序列，修饰染色体上的多核苷酸序列，以及引入展现出该蛋白或其密码子是密码子优化的变体多核苷酸的活性的异种多核苷酸。

如本文所使用，术语“载体”是DNA构建体，其包括可操作地连接至适当的调控序列的编码所需蛋白以使得所需蛋白能够在适当的宿主细胞中表达的多核苷酸的核苷酸序列。调控序列可以包括能够启动转录的启动子，用于调控这种转录的任何操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列以及调控转录和翻译的终止的序列。在载体转化到适当的宿主细胞后，它可以独立于宿主基因组复制或起作用，并可以整合到基因组本身中。

本公开中使用的载体没有特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但不限于此。

适用于本公开的载体没有特别限制，并且可以使用已知的表达载体。进一步地，可以使用用于细胞内染色体插入的载体将编码所需蛋白的多核苷酸插入到染色体中。多核苷酸的染色体插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。可以进一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记是为了选择用载体转化的细胞，即，为了确认所需多核苷酸的插入，并且选择标记可以包括提供可选择表型的标记，比如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或表面蛋白的表达。由于仅表达选择标记的细胞在用选择剂处理的环境下能够存活或显示不同的表型，因此可以选择转化的细胞。

如本文所使用，术语“转化”意思是将包括编码所需蛋白的多核苷酸的载体以由该多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达的方式引入宿主细胞中。只要转化的多核苷酸在宿主细胞中表达，它就可以整合到宿主细胞的染色体中并定位在宿主细胞的染色体中，或者它可以在染色体外存在，或者与其无关。进一步地，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要可以将其引入到宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入到宿主细胞，表达盒是包括其自主表达所需的所有要素的基因构建体。通常，表达盒包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。进一步地，在表达盒的内部或外部可以包括有助于有效生产靶蛋白的各种因素。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。而且，可以将多核苷酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。进行转化的方法可以包括将核酸引入细胞中的任何方法，并且可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的适当标准技术进行转化。例如，该方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法和乙酸锂-DMSO法等，但不限于此。

如本文所使用，术语“可操作地连接”是指编码本公开的所需蛋白的多核苷酸序列与引发和介导多核苷酸的转录的启动子序列之间的功能性连接。可操作的连接可以使用本领域已知的基因重组技术制备，并且位点特异性的DNA切割和连接可以使用本领域中的限制酶和连接酶等制备，但不限于此。

进一步地，除了其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物之外，本公开的具体实施方式还提供了其中选自PrdD、PrdE和PrdE₂的一种或多种蛋白的活性增强的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物。

进一步地，除了其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物之外，本公开的具体实施方式还提供了其中选自PrdC，PrdG和PrdF的一种或多种蛋白的活性增强的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物。

“PrdD蛋白、PrdE蛋白、PrdE₂蛋白、PrdC蛋白、PrdG蛋白和PrdF蛋白”是指构成D-脯氨酸还原酶的Prd操纵子的蛋白。具体地，除了构成D-脯氨酸还原酶的PrdA和PrdB蛋白之外，构成Prd操纵子的蛋白被称为PrdDEE₂CGFR。最广为人知的prd操纵子存在于斯氏梭菌菌株中，并且该蛋白名称基于斯氏梭菌(C.sticklandii)(Jackson等人,J.Bacteriol.,2006,188,8487-8495)的操纵子(NCBI GenBank:FP565809.1)的构建。

尚未阐明构成Prd操纵子的蛋白的功能，并且PrdD、PrdE和PrdE₂蛋白与PrdA蛋白具有高度的序列同源性或同一性。在它们中，PrdD蛋白与β-PrdA蛋白具有高度的序列同源性或同一性，并且PrdE和PrdE₂蛋白与α-PrdA蛋白具有高度的同源性或同一性。PrdD、PrdE和PrdE₂蛋白的序列可从NCBI的GenBank获得，其是公共数据库。在本公开中，PrdD、PrdE和PrdE₂蛋白可以是源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的PrdD、PrdE和PrdE₂蛋白，并且具体地，它们可以是具有SEQ ID NO：7、9和11的氨基酸序列或者分别被SEQ ID NOS：8、10和12的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，但不限于此。

据报道，通过利用NADH，PrdC蛋白参与将电子转移至D-脯氨酸还原酶(Fonknechten等人,BMC Genomics,2010,11,555)。PrdG蛋白被称为膜蛋白，但尚未报道其功能。PrdC蛋白的序列可以从NCBI的GenBank获得，其是公共数据库。在本公开中，PrdC和PrdG蛋白可以是源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的PrdC和PrdG蛋白，并且具体地，它们可以是具有SEQ ID NOS：13和15的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NOS：14和16的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，但不限于此。

进一步地，已知PrdF蛋白——其是脯氨酸外消旋酶——参与脯氨酸的旋光异构体的形成，并且据报道，PrdR蛋白具有与prd操纵子的激活相关的功能(Bouillaut等人,J.Bacteriol.,2013,195(4),844-854)。PrdF蛋白的序列可从NCBI的GenBank获得，其是公共数据库。在本公开中，PrdF蛋白可以是源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的PrdF蛋白，并且具体地，它可以是具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列或由SEQ ID NO：18的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，但不限于此。

如本文所使用，表达活性D-脯氨酸还原酶的术语“微生物”是指表达由结合丙酮酰基的α-PrdA组成的活性D-脯氨酸还原酶的微生物，该结合丙酮酰基的α-PrdA通过PrdA蛋白、β-PrdA和PrdB的精确自切割获得。“微生物”可以包括原核微生物和真核微生物中的任一种，只要它能够生产活性D-脯氨酸还原酶。例如，微生物可以包括埃希氏杆菌属，欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗维登西亚属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物。埃希氏杆菌属微生物的实例可以是大肠杆菌，但不限于此。

能够表达具有本公开的D-脯氨酸还原酶活性的多肽的埃希氏杆菌属的产活性D-脯氨酸还原酶的微生物，可以包括除了以上载体引入之外能够通过各种已知方法表达该多肽的所有微生物。

本公开的另一方面提供了生产活性D-脯氨酸还原酶的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，和从该微生物或培养基中回收该活性D-脯氨酸还原酶。

“表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物”与上述相同。

“培养”意思是使微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养工艺可以根据本领域已知的适当的培养基和培养条件进行。根据所选择的菌株，本领域技术人员可以容易地调控和使用该培养过程。培养微生物的步骤可以，但不特别限于，通过已知的分批培养、连续培养、补料分批培养等进行。在这方面，培养条件不特别受限制，而是可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节最佳pH(例如，pH 5至9，具体地pH 6至8，以及最具体地pH 6.8)。而且，在培养期间可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯以抑制泡沫产生。为了使培养物保持在有氧状态，可以将氧气或含氧气体注入培养物中。为了将培养物保持在厌氧或微需氧状态，可以不注入气体，或者可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养物中。培养温度可以保持在20℃至45℃，并且具体地保持在25℃至40℃，但不限于此。可以继续培养，具体地持续约10小时至约160小时，但不限于此，直到获得所需量的所需材料。另外，在要使用的培养基中，碳源——比如糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)可以单独或以其混合物使用，但不限于此。氮源比如含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)可以单独或以其混合物使用，但不限于此。钾源——比如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐，可以单独或以其混合物使用，但不限于此。另外，培养基中可以包括其他必需的促进生长的物质，其包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。

在本领域已知的优化的培养基和培养条件下，本领域技术人员可以容易地确定生产活性D-脯氨酸还原酶的方法。回收活性D-脯氨酸还原酶的步骤可以使用本领域已知的适当方法进行。例如，可以使用离心、过滤、蒸馏、离子交换色谱、结晶、HPLC等，但不限于此。

进一步地，回收步骤可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，要收集的活性D-脯氨酸还原酶可以是纯化形式或包含活性D-脯氨酸还原酶的微生物的发酵培养液。

本公开的仍另一方面提供了使用表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物或由其产生的活性D-脯氨酸还原酶通过还原方法转化D-脯氨酸或其类似物的方法。

具体地，该方法可以是使用表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物或由其产生的活性D-脯氨酸还原酶生产选自5-氨基戊酸(5-AVA)、γ-氨基丁酸(GABA)和5-氨基-4-羟基戊酸的一种或多种的方法。

D-脯氨酸类似物是具有与D-脯氨酸相似的结构的物质，并且包括其中羧基、α碳和氨基顺序地连接，并且不论环的大小如何，都会形成包括α碳和氨基的环结构，并且其可以被本公开的活性D-脯氨酸还原酶还原的所有类似物。具体地，D-脯氨酸类似物可以选自D-氮杂环丁烷-2-羧酸、反式-4-羟基-D-脯氨酸和顺式-4-羟基-D-脯氨酸，但不限于此。

进一步地，被活性D-脯氨酸还原酶还原意思是D-脯氨酸或其类似物的结构中的α碳与氨基之间的键断裂，结果，环结构被释放。具体地，D-脯氨酸可以被活性D-脯氨酸还原酶转化成5-氨基戊酸(5-AVA)。进一步地，与D-脯氨酸相比，由于缺少一个碳原子，D-氮杂环丁烷-2-羧酸具有4元环结构，并且当被活性D-脯氨酸还原酶转化时，可以生产γ-氨基丁酸(GABA)。进一步地，当通过在D-脯氨酸的环结构上增加羟基(-OH)形成的顺式-4-羟基-D-脯氨酸或反式-4-羟基-D-脯氨酸通过活性D-脯氨酸还原酶进行转化反应时，可以生产5-氨基-4-羟基戊酸，但不限于此。

仍另一个方面提供了具有将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶同时与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达的活性的PrdH蛋白。

“PrdA蛋白”、“PrdB蛋白”、“PrdH蛋白”和“活性D-脯氨酸还原酶”与上述相同。

如本文所使用，术语“共表达”意思是同时发生两种或多种蛋白的表达或编码两种或多种蛋白的基因的表达。本领域技术人员可以由本领域已知的方法容易地确定表达该基因或蛋白的方法。

如本文所使用，术语“将非活性的D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶”意思是将非活性状态的D-脯氨酸还原酶转化为具有活性D-脯氨酸还原酶的活性。这意味着非活性D-脯氨酸还原酶被转化为由通过PrdA蛋白、β-PrdA和PrdB的精确自切割获得的结合丙酮酰基的α-PrdA组成的活性D-脯氨酸还原酶。“非活性D-脯氨酸还原酶”意思是其中不发生PrdA蛋白的自切割，或者即使发生PrdA蛋白的自切割，包括未结合丙酮酰基的α-PrdA和β-PrdA，或者PrdA或PrdB的蛋白不表达，或者即使表达，PrdA或PrdB的蛋白也没有活性的D-脯氨酸还原酶。

仍另一个方面提供了生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，该方法包括以下步骤：用包括prdA基因或prdA和prdH基因的表达盒转化宿主细胞，和用包括prdB基因或prdB和prdH基因的表达盒转化宿主细胞。

“PrdA蛋白”、“PrdB蛋白”、“PrdH蛋白”、“表达盒”、“活性D-脯氨酸还原酶”和“表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物”与上述相同。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明本公开，并且本公开的范围并不旨在由这些实施例限制。

实施例1：PrdA和PrdH蛋白的表达

1-1：PrdA蛋白表达的基因选择

为了表达PrdA蛋白，对源自消化链球菌630(艰难梭菌630)——其已知为为具有Stickland反应的代表性的菌株——的D-脯氨酸还原酶PrdA蛋白的氨基酸序列(Q17ZY9，UniProtKB，SEQ ID NO：3)进行了实验。D-脯氨酸还原酶PrdA蛋白的核苷酸序列(CD630_32440,NCBI GeneBank AM180355.1,SEQ ID NO:4)用于构建表达载体。

1-2：构建表达PrdA的载体(pETDuet_H6-prdA-H6)

将用于蛋白质印迹分析的6X组氨酸标签(H6)并入核苷酸序列的两个末端，并合成分别在氨基和羧基末端具有NdeI和XhoI限制酶序列的基因。分别用NdeI/XhoI限制酶特异性消化合成的基因和pETDuet-1载体，并且然后通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建表达PrdA的载体(pETDuet_H6-prdA-H6)。

1-3：构建在PrdA蛋白的自切割位点具有定点突变的表达载体(pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6)

将丙氨酸扫描法应用于位置421处的氨基酸，该位置已知为发生PrdA蛋白自切割的位点。为了用丙氨酸替换(C421A)半胱氨酸——其为421位置处的氨基酸，进行了定点诱变。为此，将构建的pETDuet_H6-prdA-H6载体和为C421A突变设计的SEQ ID NOS：25和26的引物(表1)添加至Pfu PCR预混物中以扩增该基因。此时，PCR反应进行30个循环的94℃下变性1分钟，55℃下退火1分钟，以及72℃下延伸10分钟。将该PCR产物用DpnI(37℃，3小时)处理，并转化到大肠杆菌(DH5α)中。培养转化的大肠杆菌以获得菌株，并从其分离质粒载体。进行测序以获得pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6载体。

[表1]

序列号	引物	序列(5’-3’)
			25	PrdA(C421A)-F	GGTATCCATGCATTAACTGCCATAGGACCTGCATC AAAAG
26	PrdA(C421A)-R	CTTTTGATGCAGGTCCTATGGCAGTTAATGCAT GGA TAC C

*划线部分：C421A突变位点

1-4：构建共表达PrdA和PrdH蛋白的表达载体(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)

为了诱导PrdA蛋白的自切割，尝试共表达通过使用存在于编码PrdA和PrdB的基因之间的基因ORF编码的新型蛋白(氨基酸序列：Q17ZY5，UniProtKB，SEQ ID NO：1/核苷酸序列：CD630_32430，NCBI GeneBank AM180355.1，SEQ ID NO：2；在下文中，其被称为PrdH蛋白)，该PrdA和PrdB是构成源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的prd操纵子的蛋白中的结构蛋白。为此，合成了在核苷酸序列的氨基和羧基末端分别具有NcoI/NotI组合的限制性酶序列的基因。分别用NcoI/NotI限制酶特异性地消化合成的prdH基因和先前构建的pETDuet_H6-prdA-H6载体，并且然后通过在琼脂糖凝胶上的分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建能够共表达PrdA和PrdH蛋白的表达载体(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)。

1-5：通过构建的三种表达载体鉴定PrdA蛋白表达以及PrdA的自切割

在下一个步骤中，将构建的pETDuet_H6-prdA-H6、pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6或pETDuet_prdH_H6-prdA-H6表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并且然后接种在含有氨苄西林抗生素(0.1mg/ml)的LB培养基(50ml)中，接着在37℃和200rpm的条件下培育。

为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(以下称为IPTG)。

进一步地，为了通过结合底物诱导PrdA蛋白的自切割，在存在或不存在底物D-脯氨酸(10mM)的情况下，在培养基中培养用pETDuet_H6-prdA-H6载体转化的大肠杆菌。

此后，分别在30℃下200rpm的振动条件下或者在30℃下静置培养条件下分别进一步地进行16小时的培养。通过省略振动过程以减少表达的PrdA蛋白的非特异性降解来进行静置培养条件。

为了检查重组PrdA蛋白的表达，破坏所获得的菌株，并进行离心(15000rpm，4℃和10分钟)以分离上清液，接着进行SDS-PAGE分析和蛋白质印迹分析。分析的结果证实，表达了具有等于PrdA蛋白的理论分子量的67.6kDa的分子量的所需蛋白(图2)。然而，该蛋白以pro-PrdA蛋白的形式表达，该pro-PrdA蛋白不能自切割，其是PrdA蛋白的非活性形式。由于这个原因，没有发现另外的蛋白产生(α-PrdA，21.9kDa和β-PrdA，44.7kDa)。进一步地，在蛋白质印迹的结果中发现了非特异性切割的蛋白条带，表明由于未自切割的pro-PrdA蛋白的结构不稳定性发生了许多蛋白降解(图2，泳道2)。进一步地，通过用丙氨酸替换PrdA蛋白的421位——其已知为自切割发生位点——处的半胱氨酸制备的PrdA(C421A)变异蛋白的表达模式与野生型PrdA的表达模式相同，也证实了PrdA蛋白的独立机制没有发生自切割(图2，泳道3)。进一步地，当添加D-脯氨酸(图2，泳道4)以通过底物结合诱导PrdA蛋白的自切割或PrdA蛋白与PrdH蛋白共表达时，没有发生PrdA蛋白的自切割(图，泳道5)。

当单独表达PrdA蛋白时，为了减少已表达蛋白的非特异性降解，进行静置培养，而没有振动过程，并且分析了PrdA蛋白的表达模式。在这种情况下，由于其相对较低的表达水平而改善了蛋白本身的降解，但是未发生自切割(图3，泳道3和4)。详细地，发现了具有与β-PrdA蛋白相似尺寸的切割的蛋白，但是未发现α-PrdA蛋白，表明该切割的蛋白是通过非特异性切割产生的蛋白。这些结果与现有技术的结果一致(韩国专利公开号2015-0029526；Bednarski等人，Eur.J.Biochem.,2001,268,3538-3544)。

实施例2：PrdB蛋白的表达

2-1：PrdB蛋白表达的基因选择

对于PrdB蛋白表达，对源自消化链球菌630(艰难梭菌630)——其已知为具有Stickland反应的代表性菌株——的D-脯氨酸还原酶PrdB蛋白的氨基酸序列(Q17ZY6，UniProtKB，SEQ ID NO：5)进行了实验。该蛋白的核苷酸序列(CD630_32410，NCBI GeneBankAM180355.1，SEQ ID NO：6)用于构建表达载体。

2-2：构建PrdB表达载体(pCDFDuet_prdB-H6)

通过在核苷酸序列的羧基末端并入用于蛋白质印迹分析的6X组氨酸标签(H6)并且在氨基和羧基末端分别包括NdeI和XhoI限制酶序列，合成基因。分别用NdeI/XhoI限制酶特异性消化合成的基因和pCDFDuet-1载体，并且然后通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建表达PrdB的载体(pCDFDuet_prdB-H6)。

2-3：用于将硒代半胱氨酸引入PrdB蛋白的载体的构建

PrdB蛋白已知为硒蛋白。换句话说，由于硒代半胱氨酸包括在PrdB蛋白的氨基酸序列中并且硒代半胱氨酸是非天然氨基酸，因此存在技术上的限制，即，难以通过一般的蛋白合成方法引入。因此，在本公开中，通过引入作为已知技术的sel操纵子系统(selABC)(Su等人,Nucleic Acids Res.,2005,33(8),2486-2492)尝试了PrdB蛋白的硒代半胱氨酸引入。

2-3-1：SelAB引入的载体(pACYCDuet_selB/pACYCDuet_selA_selB)

为此，使用源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的SelA蛋白(氨基酸序列：Q182I2，UniProtKB/核苷酸序列：CD630_24950，NCBI GeneBank AM180355.1)和SelB蛋白(氨基酸序列：Q182I0，UniProtKB/核苷酸序列：CD630_24930，NCBI GeneBank AM180355.1)，并且合成这样的基因使得其在氨基和羧基末端分别具有NcoI/NotI和NdeI/XhoI组合的限制性酶序列。

接着，分别用NdeI/XhoI限制性酶的组合处理可商业上获得的pACYCDuet-1质粒载体(Novagene)和selB基因，并在琼脂糖凝胶上分离。然后，通过T4连接酶反应，构建pACYCDuet_selB载体。通过NdeI/XhoI组合的另外的限制性酶反应，将selA基因插入到载体(pACYCDuet_selB)中。最后，构建pACYCDuet_selA_selB载体。

2-3-2：selC引入的载体(pCDFDuet_prdB-H6_P_selC-selC)

selC基因编码硒代半胱氨酸特异性的tRNA，并且通过包括源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的selC基因(核苷酸序列：CDIF630_02727，NCBI GeneBank CP010905.1)和来自氨基末端的另外的150个核苷酸和来自羧基末端的250个核苷酸合成使得包括selC的内在的启动子和终止子，以及最后在两端处的XbaI限制酶序列。用XbaI限制酶处理因而获得的selC基因和先前构建的pCDFDuet_prdB-H6载体，并且然后在琼脂糖凝胶上分离。通过T4连接酶反应，最终构建pCDFDuet_prdB-H6_PselC-selC载体。

2-4：通过构建的三种表达载体鉴定PrdB蛋白表达

1)PrdB蛋白的单独表达

将实施例2-2中制备的pCDFDuet_prdB-H6载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(50μg/ml的大观霉素)的LB培养基(50ml)中培养(37℃，200rpm)。

2)PrdB蛋白和selC的共表达

将实施例2-3中制备的pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并以与1)相同的方式进行培养。

3)PrdB蛋白和selAB蛋白的共表达

将实施例2-2中制备的pCDFDuet_prdB-H6和实施例2-3中制备的pACYCDuet_selA_selB载体的组合转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并以与1)相同的方式进行培养。

4)PrdB蛋白和selABC的共表达

将实施例2-3中制备的pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并以与1)相同的方式进行培养。

为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mMIPTG。进一步地，为了供应生物合成和硒代半胱氨酸引入所需的硒，供应或不供应10μM亚硒酸钠，并且然后进一步培养16小时。破坏每种所获得的大肠杆菌菌株，并进行离心分离每种上清液，接着进行蛋白质印迹分析。

分析的结果是，当单独表达PrdB蛋白时，由于硒代半胱氨酸的较低的引入效率，PrdB蛋白以非常低的水平表达(图4，泳道1和2)，并且当PrdB蛋白和selC共表达时(图4，泳道3和4)或当PrdB和SelAB蛋白共表达时(图4，泳道5和6)，观察到相同的结果(图4)。然而，当PrdB蛋白和selABC基因共表达时，PrdB蛋白的表达水平显著增加(图4，泳道7)，表明由于构成sel操纵子的SelA和SelB蛋白以及作为硒代半胱氨酸特异性tRNA的SelC的作用，非天然氨基酸硒代半胱氨酸被有效地掺入PrdB蛋白中。进一步地，与不添加亚硒酸钠(泳道7)相比，添加亚硒酸钠(图7，泳道8；最终浓度：10μM)进一步提高了PrdB蛋白的表达水平，这表明构建有效并入硒代半胱氨酸的系统是增加PrdB蛋白表达水平的主要因素。

实施例3：PrdH蛋白的功能验证和包括PrdH蛋白表达的D-脯氨酸还原酶活性的评 估

3-1：D-脯氨酸还原酶蛋白的表达以便验证PrdH功能

基于以上证实的信息，尝试了D-脯氨酸还原酶的表达，并且为此，评估了载体的以下组合。

1)PrdA和PrdB蛋白的共表达

共表达先前构建的表达PrdA蛋白的载体(pETDuet_H6-prdA-H6)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)。将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基(50ml)中培养(37℃，200rpm)。

2)PrdA、PrdB蛋白和PrdH蛋白的共表达

对先前构建的共表达PrdA和PrdH的载体(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)进行共表达。培养方法以与1)相同的方式进行。

3)PrdA(C421A)、PrdB蛋白和PrdH蛋白的共表达

对先前构建的共表达PrdA(C421A)蛋白和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_H6-prdA(C421A)-H6)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)进行共表达。培养方法以与1)和2)相同的方式进行。

为了诱导所需蛋白的过表达，当培养基的OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，将0.1mM IPTG添加到每种培养基中。供应10μM亚硒酸钠，然后进一步培养16小时。

3-2：通过引入PrdH蛋白鉴定PrdA蛋白的自切割-蛋白质印迹分析

破坏在实施例3-1中获得的每种培养基的大肠杆菌细胞，并进行离心以分离上清液，接着进行蛋白质印迹分析。

分析的结果是，当仅PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达时，未观察到PrdA蛋白的自切割现象(图5，泳道1)。然而，当PrdH蛋白与PrdA和PrdB蛋白共表达时，PrdA蛋白(Pro-PrdA蛋白)的非活性形式消失，同时形成了另外的蛋白条带(图5，泳道2)。

为了证实上述实验结果是否归因于PrdA蛋白的内在自切割机制，将已知为PrdA蛋白的自切割位点的位置421处的半胱氨酸替换为丙氨酸(C421A)，并进行PrdB和PrdH蛋白的共表达。结果，维持了Pro-PrdA蛋白，而没有观察到切割的蛋白(图5，泳道3)，表明另外出现的蛋白是由于在PrdA蛋白的位置421处半胱氨酸的特异性切割而产生的蛋白。

因此，证实了PrdH蛋白是PrdA蛋白的自切割的必需蛋白，并且是在确保PrdA蛋白的活性中起重要作用的辅助蛋白。

另外，基于先前实施例的结果——其中即使PrdA蛋白和PrdH蛋白被共表达，也没有发生PrdA蛋白的自切割(实施例1；图2，泳道5)，证实了PrdH蛋白和PrdB蛋白必须同时存在以诱导PrdA蛋白的自切割，这表明PrdA蛋白和PrdB蛋白优先以预定水平或更高水平形成复合物，然后发生PrdH蛋白的切割过程。

3-3：PrdH蛋白共表达的D-脯氨酸还原酶的活性的评估–TLC分析

将3-1中获得的大肠杆菌细胞的最终OD调节至50，接着离心。在初步洗涤后，用1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)稀释大肠杆菌细胞。接着，以每200ul稀释的样品分配，并且添加DTT(最终浓度为25mM)和D-脯氨酸(最终浓度为10mM)并使其反应6小时，接着进行TLC分析。

共表达PrdA、PrdB和PrdH蛋白的菌株显示出在TLC上形成了与5-氨基戊酸(5-AVA)相对应的斑点(图6，泳道1)。在不存在PrdH蛋白的情况下，未观察到活性(图6，泳道2)，表明由于不存在PrdH蛋白，未发生PrdA蛋白的自切割，因此，没有观察到D-脯氨酸还原酶的活性。

共表达PrdA、PrdB和PrdH蛋白的菌株被指定为CC04-9007，然后于2017年2月2日保藏在《布达佩斯条约》下的国际保存机构韩国微生物保藏中心(KCCM)中，其保藏号为KCCM11963P。

实施例4.PrdH蛋白的通用应用的验证

4-1：用于验证PrdH蛋白通用应用的菌株选择

为了验证PrdH蛋白是通用地应用于PrdA蛋白自切割的必需辅助蛋白，检查了PrdH蛋白(以下称为LsPrdH)是否参与了源自唾液乳杆菌的PrdA蛋白的自切割(下文称为LsPrdA)，该唾液乳杆菌是除了消化链球菌630之外已知还具有Stickland反应的菌株。

4-2：构建表达LsPrdA的载体(pETDuet_H6-LsprdA-H6)

通过将用于蛋白质印迹分析的6X组氨酸标签(H6)并入LsPrdA蛋白的核苷酸序列的两个末端(氨基酸序列：E1JLY6，UniProtKB，SEQ ID NO：19/核苷酸序列：HMPREF9269_1797，NCBI GeneBank AEBA01000066，SEQ ID NO：20)，并且通过分别在氨基和羧基末端包括NdeI和XhoI限制酶序列来合成基因。用NdeI/XhoI限制酶的组合消化pETDuet-1载体和合成的基因，并且然后通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建pETDuet_H6-LsprdA-H6表达载体。

4-3：构建共表达LsPrdA和LsPrdH蛋白的载体(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)

另外，将NcoI/NotI组合的限制性酶序列添加到LsPrdH蛋白的核苷酸序列的两个末端(氨基酸序列：E1JLY7，UniProtKB，SEQ ID NO：23/核苷酸序列：HMPREF9269_1798，NCBIGeneBank AEBA01000066.1，SEQ ID NO：NO：24)，并且然后进行合成。用NcoI/NotI限制酶的组合消化构建的pETDuet_H6-LsPrdA-H6表达载体，并通过在琼脂糖凝胶上分离获得基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6表达载体。

4-4：表达LsPrdB的载体的构建(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)

将用于蛋白质印迹分析的6X组氨酸标签(H6)并入源自唾液乳杆菌的PrdB(以下称为LsPrdB)蛋白的相应基因的羧基末端(氨基酸序列：E1JLY8和E1JLY9，UniProtKB，SEQ IDNO：21/核苷酸序列：HMPREF9269_1799和HMPREF9269_1800，NCBI GeneBankAEBA01000066.1，SEQ ID NO：22；)；在序列数据库上，存在于LsPrdB蛋白中的终止密码子(UAG)序列未被识别为用于硒代半胱氨酸引入的序列，而是识别为蛋白表达的终止密码子，因而该序列被表达为两个蛋白或核苷酸序列，因此，通过评估两个核苷酸序列以及作为LsPrdB蛋白的核苷酸序列的两个核苷酸序列之间的序列来构建表达载体。)。进一步地，为了不将为了有效表达PrdB蛋白而引入的硒代半胱氨酸的密码子(UGA)识别为终止密码子，将该密码子替换为半胱氨酸密码子(UGT)，并分别在氨基和羧基末端添加NdeI和XhoI限制酶的序列。

在此基础上，分别用NdeI/XhoI限制酶的组合消化pCDFDuet-1载体和合成的基因，然后通过在琼脂糖凝胶上分离，并通过T4连接酶的酶促反应获得每个基因片段，构建pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6表达载体。

4-5：通过引入LsPrdH蛋白鉴定LsPrdA蛋白的自切割-蛋白质印迹分析

对构建的表达LsPrdA蛋白的载体(pETDuet_H6-LsprdA-H6)和表达LsPrdB蛋白的载体(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)或表达LsPrdA和LsPrdH蛋白的载体(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)和表达LsPrdB蛋白的载体(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)的组合进行共表达。将表达载体的两种组合分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml的氨苄西林，50μg/ml的大观霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并且然后进一步培养16小时。破坏所获得的每种大肠杆菌菌株，并进行离心以分离每种上清液，接着进行蛋白质印迹分析。

作为实验的结果，当LsPrdA蛋白和LsPrdB(U151C)蛋白共表达时，LsPrdA蛋白的非切割形式(Pro-LsPrdA蛋白)和LsPrdB蛋白被表达，并且观察到LsPrdA蛋白的非特异性降解(图7，泳道1)。相反，当与LsPrdH蛋白共表达时，Pro-LsPrdA蛋白减少，同时观察到另外的蛋白条带，表明LsPrdA蛋白的自切割现象(图7，泳道2)。LsPrdH蛋白与先前获得的PrdH蛋白具有约55％的氨基酸序列同源性，但具有相同的特征：它们由位于基因组上的prdA基因和prdB基因之间的基因ORF编码。

因此，已经证实存在于基因组上相似位置的两种蛋白(PrdH和LsPrdH蛋白)具有相同的功能，即使它们具有相对较低水平的序列同源性，并且也证实了不管菌株的种类和序列同源性如何，PrdH蛋白具有诱导PrdA蛋白自切割的通用功能，这是生产活性D-脯氨酸还原酶的必要步骤。

实施例5：评估D-脯氨酸还原酶操纵子完全表达的蛋白的活性—与PrdDEE₂蛋白共 表达

为了评估其他prd操纵子中的蛋白对D-脯氨酸还原酶(其活性已被证实)的影响，进行了另外的共表达。作为第一个步骤，进行PrdDEE₂蛋白的共表达。

5-1：构建共表达PrdA、PrdH和PrdDEE₂蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdADEE₂)

为了与PrdA蛋白共表达源自消化链球菌630(艰难梭菌630)PrdD蛋白(氨基酸序列：Q17ZY7，UniProtKB，SEQ ID NO：7/核苷酸序列：CD630_32400，NCBI GeneBankAM180355.1，SEQ ID NO：8)、PrdE蛋白(氨基酸序列：Q17ZY2，UniProtKB，SEQ ID NO：9/核苷酸序列：CD630_32390，NCBI GeneBank AM180355.1，SEQ ID NO：10)和PrdE₂蛋白(氨基酸序列：Q17ZY3，UniProtKB，SEQ ID NO：11/核苷酸序列：CD630_32380，NCBI GeneBankAM180355.1，SEQ ID NO：12)的每个基因，在各个基因之间添加核糖体结合位点，并且将NdeI/XhoI组合的限制性酶序列添加至两个末端以进行合成(prdADEE₂)。详细地，用限制性酶NdeI/XhoI的组合消化先前在实施例1-4中构建的pETDuet_prdH_H6-prdA-H6表达载体和合成的prdDEE₂基因，并且然后通过在琼脂糖凝胶上分离获得基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建pETDuet_prdH_prdADEE₂表达载体。

5-2：PrdA、PrdB、PrdH和PrdDEE₂蛋白的共表达以及验证增强的D-脯氨酸还原酶活性-TLC分析

进行表达PrdADEE₂和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdADEE₂)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-PselC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)的共表达。

将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并且供应10μM亚硒酸钠，然后进一步培养16小时。将所获得的大肠杆菌细胞的最终OD调节至50，接着离心。初步洗涤之后，用1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释大肠杆菌细胞。

接着，以每200ul的稀释样品分配，并添加DTT(最终浓度为25mM)和D-脯氨酸(最终浓度为10mM)并使其反应6小时，接着进行TLC分析。

结果，与PrdAHB蛋白的组合相比，与PrdAHBDEE₂的组合在TLC上显示出相对较大的5-氨基戊酸斑点，并且D-脯氨酸还原酶的初始反应速率也很快(图6，泳道3)。这些结果表明PrdDEE₂蛋白诱导了D-脯氨酸还原酶活性的增强。

实施例6：PrdC蛋白的另外表达和增强的D-脯氨酸还原酶活性的验证

接着，进行PrdC蛋白的共表达。已知的是，D-脯氨酸还原酶通过消耗NADH进行转化反应，并且PrdC参与NADH依赖的电子转移。因此，PrdC蛋白可能有助于D-脯氨酸还原酶的电子转移。为了检查PrdC蛋白的作用，在存在或不存在还原剂DTT的条件下进行了实验。

6-1：构建表达PrdC蛋白的载体(pACYCDuet_selA-prdC_selB)

为了将源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的PrdC蛋白(氨基酸序列：Q17ZZ2,UniProtKB,SEQ ID NO:13/核苷酸序列：CD630_32470,NCBI GeneBank AM180355.1,SEQ IDNO:14)添加到现有D-脯氨酸还原酶表达系统，构建能够共表达SelA和SelB蛋白的载体。在selA和prdC基因之间插入核糖体结合位点，并且在两个末端都添了NcoI/NotI组合的限制性酶序列以进行合成(selA-prdC)。分别用NcoI/NotI限制酶的组合消化先前构建的pACYCDuet_selA_selB表达载体和合成的selA-prdC基因，并通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建表达pACYCDuet_selA-prdC_selB的载体。

6-2：PrdA、PrdB、PrdH和PrdC蛋白的共表达以及增强的D-脯氨酸还原酶活性的验证-TLC分析

进行表达PrdADEE₂和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdADEE₂)以及表达PrdB和PrdC蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-PselC_selC和pACYCDuet_selA-prdC_selB载体的组合)的共表达。

将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1m/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并供应10μM亚硒酸钠，并且然后进一步培养16小时。将获得的大肠杆菌细胞的最终OD调节至50，接着离心。在初步洗涤之后，用1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释大肠杆菌细胞。作为其对照组，使用其中共表达了实施例5的表达PrdADEE₂和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdADEE2)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)的大肠杆菌。接着，以每200ul的稀释样品分配，并添加D-脯氨酸(最终浓度为10mM)，并在存在或不存在DTT(最终浓度为25mM)的条件下反应6小时，接着进行TLC分析。

作为反应的结果，与添加DTT相比，观察到相对较低的反应速率。然而，当仅存在PrdC蛋白时，即使在不存在DTT的情况下，D-脯氨酸也被转化为5-氨基戊酸(图8，泳道2)。这些结果表明，PrdC蛋白有助于D-脯氨酸还原酶的电子转移，并且可能的是，通过使用细胞内NADH的还原能力而不添加还原剂(DTT)进行转化反应。

实施例7：prdG蛋白的另外表达和增强的D-脯氨酸还原酶活性的验证

据估计，PrdG蛋白是膜蛋白，但是至今尚未报道其准确功能。

7-1：构建共表达PrdG和PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC)

通过在源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的PrdG蛋白(氨基酸序列：Q17ZY0,UniProtKB,SEQ ID NO:15/核苷酸序列CD630_32360,NCBIGeneBank AM180355.1；其在序列数据库中未被命名为PrdG蛋白，但是基于与斯氏梭菌的PrdG蛋白的同源性在此命名为PrdG蛋白，SEQ ID NO:16)的核苷酸序列的氨基和羧基末端包括NcoI/NotI组合的限制酶序列来合成基因。用NcoI/NotI限制酶消化合成的prdG基因和预先构建的pCDFDuet_prdB-P_selC_selC载体，并且然后通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建共表达PrdG蛋白和PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC)。

7-2：PrdA、PrdB、PrdH和PrdCG蛋白的共表达和增强的D-脯氨酸还原酶活性的验证-TLC分析

对表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)与表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB)的组合或表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)与共表达PrdB和PrdCG蛋白的载体(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA-prdC_selB)的组合进行共表达。

将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并供应10μM亚硒酸钠，并且然后进一步培养16小时。将所获得的大肠杆菌细胞的最终OD调节至50，接着离心。在初步洗涤之后后，用1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释大肠杆菌细胞。

考虑到PrdG蛋白是膜蛋白，各自分配200ul的PrdAHB组合和PrdAHBCG组合的稀释样品，并添加D-脯氨酸(最终浓度为10mM)，并且使得在相同OD条件下的全细胞、细胞裂解液，及其通过离心获得的上清液，在存在或不存在DTT的条件下(最终浓度为25mM)以及在存在或不存在1％葡萄糖的条件下进行反应6小时，接着进行TLC分析。

作为实验的结果，当另外包含PrdC蛋白的PrdAHBCG组合在有或没有DTT的情况下均展现现出活性(图9，wo，泳道4至6)时，并且特别地，当将DTT添加到细胞裂解液的上清液中并且使其反应时，与PrdAHB组合相比，PrdAHBCG组合显示较低水平的活性(图9，DTT，泳道6)。

这些结果表明，通过离心去除了很大部分的表达的D-脯氨酸还原酶，并且由于与具有膜蛋白特征的PrdG蛋白结合，因此在通过离心沉淀之后去除了表达的D-脯氨酸还原酶。进一步地，在基于DTT的转化反应中，PrdAHB和PrdAHBCG组合二者在全细胞和细胞裂解液中均显示出相似的活性水平。当添加1％葡萄糖以增加不含DTT的NADH的供应时，只有PrdAHBCG组合显示出活性(图9，1％葡萄糖)。基于实施例6的实验结果显示PrdC蛋白与NADH的利用率有关，可以看出，通过与PrdC蛋白结合，PrdG蛋白诱导了D-脯氨酸还原酶复合物的形成，该复合物容易利用细胞内NADH。换句话说，当使用还原剂比如DTT时，有或没有介体蛋白都可能将电子直接转移至D-脯氨酸还原酶。然而，在不外部添加还原剂的情况下使用细胞内NADH时，需要能够帮助电子转移的介体蛋白(PrdC蛋白)，并且为了构建有效的电子转移系统，PrdG蛋白起到增加D-脯氨酸还原酶整合的作用，从而起到提高活性的作用。

实施例8：使用辅助蛋白PrdH制备由D-脯氨酸生产5-氨基戊酸的菌株

8-1：生产5-氨基戊酸的菌株的制备

为了通过微生物从糖源生产5-氨基戊酸，需要供应D-脯氨酸，其是D-脯氨酸还原酶的底物。然而，由于大肠杆菌没有D-脯氨酸生物合成途径，因此设计了使用由L-脯氨酸转化的D-脯氨酸的代谢途径。详细地，必须同时存在具有脯氨酸异构体形成能力的脯氨酸消旋酶。因此，在本公开中，通过引入脯氨酸消旋酶进行实验，该脯氨酸消旋酶是已知技术(Rudnick等人,Biochemistry,1975,14(20),4515-4522)。

为此，为了将源自消化链球菌630(艰难梭菌630)的脯氨酸消旋酶蛋白的prdF基因(氨基酸序列：Q17ZY4，UniProtKB，SEQ ID NO：17/核苷酸序列：CD630_32370，NCBIGeneBank AM180355.1，SEQ ID NO：18)插入到现有的D-脯氨酸还原酶表达系统中，在各个基因之间添加核糖体结合位点以与PrdG蛋白共表达，然后将NcoI/NotI组合的限制性酶序列添加至两个末端以进行合成(prdGF)。

用NcoI/NotI限制酶的组合消化先前构建的pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC表达载体和合成的prdGF基因，并通过在琼脂糖凝胶上分离获得每个基因片段。通过T4连接酶的酶促反应，构建表达pCDFDuet_prdGF_prdB-P_selC_selC的载体。

8-2：通过活性D-脯氨酸还原酶验证5-氨基戊酸的生产-LC/MS和TLC分析

对表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)与PrdBCG(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA-prdC_selB载体)的组合，以及表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)与表达PrdBCGF的载体(pCDFDuet_prdGF_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA-prdC_selB载体)的组合进行表达。将表达载体的两种组合转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并供应10μM亚硒酸钠和1％葡萄糖(NADH增强)，并且然后在30℃，200rpm下进一步培养24小时。将通过离心获得的培养基进行LC/MS和TLC分析。

作为实验的结果，在脯氨酸外消旋酶的存在下产生约67.7ppm的5-氨基戊酸(图10，泳道3)，而在不存在脯氨酸外消旋酶的情况下不产生5-氨基戊酸(图10，泳道1至2)。换句话说，证实了通过在大肠杆菌中的代谢从添加的糖源产生L-脯氨酸，然后通过脯氨酸消旋酶将其转化为D-脯氨酸，最后，通过引入的活性D-脯氨酸还原酶产生了5-氨基戊酸。

8-3：由添加至培养基中的D-脯氨酸生产5-氨基戊酸

除了通过直接发酵由糖源生产5-氨基戊酸的工艺之外，还进行了由D-脯氨酸转化为5-氨基戊酸的实验，该D-脯氨酸是在培养包含活性D-脯氨酸还原酶的微生物期间从外部添加的。

详细地，进行实验以检查是否可以由添加至培养基中的D-脯氨酸生物合成5-氨基戊酸。为此，对先前构建的表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)和表达PrdBCG蛋白的载体(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA-prdC_selB载体的组合)进行共表达。将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并供应10μM亚硒酸钠和1％葡萄糖，然后在存在5mM D-脯氨酸的情况下在30℃，200rpm下进一步培养24小时。将通过离心获得的培养基进行LC/MS分析。

分析的结果证实，在不存在D-脯氨酸的情况下未观察到5-氨基戊酸，而在存在5mMD-脯氨酸的情况下，平均生产196.7ppm(1.68mM)的5-氨基戊酸，这通过HPLC(Shimadzu)分析证实。

实施例9：基于D-脯氨酸还原酶评估D-脯氨酸类似物底物

为了进一步证实所构建的活性D-脯氨酸还原酶的活性，对除了脯氨酸以外的各种底物进行转化反应。在该实施例中，具有与D-脯氨酸相似结构的D-氮杂环丁烷-2-羧酸(D-Aze)、顺式-4-羟基-D-脯氨酸和反式-4-羟基-D-脯氨酸——其中羟基(-OH)添加至D-脯氨酸的环结构，用作D-脯氨酸还原酶的底物。

为此，对先前构建的表达PrdA和PrdH蛋白的载体(pETDuet_prdH_prdA)和表达PrdB蛋白的载体(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC和pACYCDuet_selA_selB载体的组合)进行共表达。将这三种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在含有抗生素(0.1mg/ml氨苄西林，50μg/ml大观霉素和30μg/ml氯霉素)的LB培养基中培养(37℃，200rpm)。为了诱导所需蛋白的过表达，当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，添加0.1mM IPTG，并供应10μM亚硒酸钠，然后进一步培养16小时。将获得的大肠杆菌细胞的最终OD调节至50，接着离心。在初步洗涤之后，用1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释大肠杆菌细胞。接着，以每200ul的稀释样品分配，并添加DTT(最终浓度为25mM)和各种底物(最终浓度为10mM，图11A)，并使其反应6小时，接着进行TLC分析。与D-脯氨酸相比，D-氮杂环丁烷-2-羧酸由于缺少一个碳原子而具有4元环结构，并且当通过D-脯氨酸还原酶转化时，产生γ-氨基丁酸(GABA)。作为反应的结果，与D-脯氨酸相比，D-氮杂环丁烷-2-羧酸显示出相对较低的反应速率，但是在TLC上清楚地观察到了GABA产生(图11B，泳道6)。

当顺式-4-羟基-D-脯氨酸或反式-4-羟基-D-脯氨酸进行转化反应时，产生5-氨基-4-羟基戊酸。作为反应的结果，与D-脯氨酸相比，顺式-4-羟基-D-脯氨酸或反式-4-羟基-D-脯氨酸显示出较低的反应速率，但是不论羟基的异构体形式如何，在TLC和新形成的TLC斑点上均观察到底物还原(图11C，泳道5和泳道8)。

这些结果表明，表达的活性D-脯氨酸还原酶能够转化具有不同尺寸的环结构的其他底物和具有另外修饰的底物类似物以及已知的D-脯氨酸。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，可以以不同的特定形式实施本公开，而不改变其技术精神或基本特征。因此，应当理解，上述实施方式在所有方面均不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求而不是由其之前的描述限定，因此，落入权利要求的界限之内的所有改变和修改或这种界限的等同物因此旨在由所附权利要求书涵盖。

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CJ第一制糖中心

330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔100-400

大韩民国

证明上述翻译与原文无误

2017年7月12日

专利代理人Son Min印

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性D-脯氨酸还原酶的方法

<130> OPA18191

<150> KR 10-2017-0088632

<151> 2017-07-12

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<212> PRT

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<220>

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Met Asp Arg Leu Lys Tyr Ile Ser Ser Glu Thr Phe Tyr Glu Gly Ile

1 5 10 15

Ile Val Asp Ile Lys Gly Gly Gly Val Thr Ile Asp Leu Lys Gly Arg

20 25 30

Leu Gly Gln Phe Lys Ile Pro Asn Arg Met Leu Ile Thr Asp Tyr Glu

35 40 45

Leu Lys Ile Gly Gln Glu Val Gly Phe Met Leu Ser Tyr Pro Glu Val

50 55 60

Leu Ser Pro Glu Pro Asn Gln Glu Tyr Val Glu Asn Ile Arg Arg Glu

65 70 75 80

Lys Glu Lys Gln Ala Glu Met Gln Ser Lys Gln Glu Glu Lys

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<212> DNA

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<220>

<223> PrdH

<400> 2

atggataggt taaaatatat ctcatcagag actttttatg aaggtattat agttgacatc 60

aaaggcggtg gagtgactat agacctaaaa ggtagacttg gacaatttaa aatacctaat 120

agaatgctta taactgacta cgaacttaag ataggtcaag aagttggatt catgctaagc 180

tatcctgagg tattaagtcc agagcctaat caagagtatg tagaaaatat taggagagaa 240

aaagaaaaac aagcagaaat gcaatcaaaa caagaagaaa aataa 285

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<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> PrdA

<400> 3

Met Ser Ile Thr Leu Glu Thr Ala Gln Ala His Ala Asn Asp Pro Ala

1 5 10 15

Val Cys Cys Cys Arg Phe Glu Ala Gly Thr Ile Ile Ala Pro Glu Asn

20 25 30

Leu Glu Asp Pro Ala Ile Phe Ala Asp Leu Glu Asp Ser Gly Leu Leu

35 40 45

Thr Ile Pro Glu Asn Gly Leu Thr Ile Gly Gln Val Leu Gly Ala Lys

50 55 60

Leu Lys Glu Thr Leu Asp Ala Leu Ser Pro Met Thr Thr Asp Asn Val

65 70 75 80

Glu Gly Tyr Lys Ala Gly Glu Ala Lys Glu Glu Val Val Glu Glu Thr

85 90 95

Val Glu Glu Ala Ala Pro Val Ser Glu Ala Ala Val Val Pro Val Ser

100 105 110

Thr Gly Val Ala Gly Glu Thr Val Lys Ile His Ile Gly Glu Gly Lys

115 120 125

Asn Ile Ser Leu Glu Ile Pro Leu Ser Val Ala Gly Gln Ala Gly Val

130 135 140

Ala Ala Pro Val Ala Asn Val Ala Ala Pro Val Ala Ser Ala Ala Ala

145 150 155 160

Glu Val Ala Pro Lys Val Glu Glu Lys Lys Leu Leu Arg Ser Leu Thr

165 170 175

Lys Lys His Phe Lys Ile Asp Lys Val Glu Phe Ala Asp Glu Thr Lys

180 185 190

Ile Glu Gly Thr Thr Leu Tyr Ile Arg Asn Ala Glu Glu Ile Cys Lys

195 200 205

Glu Ala Asn Glu Thr Gln Glu Leu Val Val Asp Met Lys Leu Glu Ile

210 215 220

Ile Thr Pro Asp Lys Tyr Glu Thr Tyr Ser Glu Ala Val Leu Asp Ile

225 230 235 240

Gln Pro Ile Ala Thr Lys Glu Glu Gly Glu Leu Gly Ser Gly Ile Thr

245 250 255

Arg Val Ile Asp Gly Ala Val Met Val Leu Thr Gly Thr Asp Glu Asp

260 265 270

Gly Val Gln Ile Gly Glu Phe Gly Ser Ser Glu Gly Glu Leu Asn Thr

275 280 285

Thr Ile Met Trp Gly Arg Pro Gly Ala Ala Asp Lys Gly Glu Ile Phe

290 295 300

Ile Lys Gly Gln Val Thr Ile Lys Ala Gly Thr Asn Met Glu Arg Pro

305 310 315 320

Gly Pro Leu Ala Ala His Arg Ala Phe Asp Tyr Val Thr Gln Glu Ile

325 330 335

Arg Glu Ala Leu Lys Lys Val Asp Asn Ser Leu Val Val Asp Glu Glu

340 345 350

Val Ile Glu Gln Tyr Arg Arg Glu Gly Lys Lys Lys Val Val Val Ile

355 360 365

Lys Glu Ile Met Gly Gln Gly Ala Met His Asp Asn Leu Ile Leu Pro

370 375 380

Val Glu Pro Val Gly Thr Leu Gly Ala Gln Pro Asn Val Asp Leu Gly

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Asn Met Pro Val Val Leu Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp Gly Gly Ile

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His Ala Leu Thr Cys Ile Gly Pro Ala Ser Lys Glu Met Ser Arg His

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Tyr Trp Arg Glu Pro Leu Val Ile Arg Ala Met Glu Asp Glu Glu Ile

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Asp Leu Val Gly Val Val Phe Val Gly Ser Pro Gln Val Asn Ala Glu

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Lys Phe Tyr Val Ser Lys Arg Leu Gly Met Leu Val Glu Ala Met Glu

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Val Asp Gly Ala Val Val Thr Thr Glu Gly Phe Gly Asn Asn His Ile

485 490 495

Asp Phe Ala Ser His Ile Glu Gln Ile Gly Met Arg Gly Ile Pro Val

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Val Gly Val Ser Phe Ser Ala Val Gln Gly Ala Leu Val Val Gly Asn

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Lys Tyr Met Thr His Met Val Asp Asn Asn Lys Ser Lys Gln Gly Ile

530 535 540

Glu Asn Glu Ile Leu Ser Asn Asn Thr Leu Ala Pro Glu Asp Ala Val

545 550 555 560

Arg Ile Met Ala Met Leu Lys Asn Ala Ile Glu Gly Val Glu Val Lys

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Ala Pro Glu Arg Lys Trp Asn Pro Asn Val Lys Leu Asn Asn Ile Glu

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Ala Ile Glu Lys Val Thr Gly Glu Lys Ile Val Leu Glu Glu Asn Glu

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Gln Ser Leu Pro Met Ser Lys Lys Arg Arg Glu Ile Tyr Glu Lys Asp

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<213> 未知

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ctaggagcta agttaaaaga aactttagat gcactttctc caatgactac agataacgta 240

gaaggataca aagcaggaga ggctaaagaa gaagtagtag aagaaacagt agaagaagca 300

gctccagtat cagaagcagc agtagttcca gtaagcacag gagttgcagg tgaaacagtt 360

aaaatacaca taggtgaagg taagaacata agcttagaga tacctttatc agtagctggt 420

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gaagtagctc caaaagttga agaaaagaaa cttttaagaa gcttaactaa aaaacacttt 540

aaaatagata aagttgaatt tgctgatgaa actaaaatag aaggaactac tttatacatc 600

agaaacgcag aagaaatatg taaagaagct aatgaaactc aagagttagt tgtagatatg 660

aagttagaaa taataactcc tgataaatat gaaacttaca gtgaagctgt attagatata 720

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tgtataggac ctgcatcaaa agaaatgtca agacattact ggagagagcc attagtaata 1320

agagctatgg aagacgaaga aatagattta gtaggtgttg tatttgttgg ttctccacaa 1380

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aaaatagtat tagaagagaa tgagcaatct ctaccaatga gtaagaagag aagagaaata 1860

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Met Thr Ile Ala Leu Ala Thr Ala Ala Gly Val His Leu Lys Ser Asp

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Lys Arg Phe Asn Leu Ala Gly Asp Thr Thr Phe Arg Ala Ile Pro Asn

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Gln Arg Ala Ile Glu Glu Ala Gly Ile Pro Thr Ile Ile Ile Ala Ala

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Leu Pro Pro Val Val Arg Gln Asn Gly Thr Pro Arg Ala Val Ala Pro

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Leu Val Pro Met Gly Ala Asn Ala Gly Glu Pro His Asn Ile Glu Met

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Gln Thr His Ile Leu Arg Asp Thr Leu Glu Gln Leu Val Ala Ile Pro

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<213> 未知

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Gly Arg Leu Gly Glu Gly Ile Thr His Thr Leu Thr Gly Val Tyr Val

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Gly Arg Asn Ala Thr Gln Val Arg Glu Tyr Phe Asp Lys Ile Arg Pro

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Asn Ala Lys Lys Val Val Ile Val Lys Gln Ile Ala Gly Gln Gly Ala

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Gly Gly Gly Asn Glu Leu Gly Leu Thr Gly Val Lys Leu Val Ile Gly

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35 40 45

Arg Thr Ala Ile Met Leu Glu Pro Arg Gly His Asn Asp Met Phe Gly

50 55 60

Ser Val Met Thr Gln Pro Cys Cys Pro Asp Ala Asp Phe Gly Ile Ile

65 70 75 80

Phe Met Asp Gly Gly Gly Tyr Leu Asn Met Cys Gly His Gly Thr Ile

85 90 95

Gly Ala Met Thr Ala Ala Ile Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Val Glu

100 105 110

Pro Val Thr His Val Val Met Glu Ala Pro Ala Gly Ile Ile Arg Gly

115 120 125

Asp Val Thr Val Val Asp Gly Lys Ala Lys Glu Val Ser Phe Leu Asn

130 135 140

Val Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Glu Gly Val Glu Val Asp Leu Pro Gly

145 150 155 160

Val Gly Thr Val Lys Phe Asp Ile Ser Phe Gly Gly Ser Phe Phe Ala

165 170 175

Ile Ile His Ala Ser Gln Leu Gly Leu Lys Ile Glu Pro Gln Asn Ala

180 185 190

Gly Lys Leu Thr Glu Leu Ala Met Lys Leu Arg Asp Ile Ile Asn Glu

195 200 205

Lys Ile Glu Ile Gln His Pro Thr Leu Ala His Ile Lys Thr Val Asp

210 215 220

Leu Val Glu Ile Tyr Asp Glu Pro Thr His Pro Glu Ala Thr Tyr Lys

225 230 235 240

Asn Val Val Ile Phe Gly Gln Gly Gln Val Asp Arg Ser Pro Cys Gly

245 250 255

Thr Gly Thr Ser Ala Lys Leu Ala Thr Leu His Ala Lys Gly Glu Leu

260 265 270

Lys Val Gly Glu Lys Phe Val Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Thr Leu Phe

275 280 285

Lys Gly Glu Ile Val Glu Glu Thr Lys Val Ala Asp Phe Asn Ala Val

290 295 300

Val Pro Lys Ile Thr Gly Ser Ala Tyr Ile Thr Gly Phe Asn His Phe

305 310 315 320

Val Ile Asp Glu Glu Asp Pro Leu Lys His Gly Phe Ile Leu Lys

325 330 335

<210> 18

<211> 1008

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> PrdF

<400> 18

atgaaattta gcagaagtat acaagctata gactctcata cagcaggtga agcaactaga 60

atagttgtag gtggaatacc taacataaaa ggaaattcta tgcctgagaa aaaagaatat 120

ttagaggaaa atctagatta tttaagaact gctataatgt tagagccaag aggacataat 180

gatatgtttg gttctgtaat gactcaacct tgttgcccag atgctgactt tggaataatc 240

ttcatggatg gtggcggata ccttaacatg tgtggccatg gtacaatagg agctatgaca 300

gcagctatag aaacaggtgt agttccagca gtagagcctg taactcatgt agttatggaa 360

gctccagcag gaataataag aggagacgtt acagttgtag atggaaaagc taaagaagta 420

tcattcttaa acgtaccagc tttcttatat aaagaaggtg ttgaagttga cttaccaggt 480

gttggaactg ttaaatttga catatcattt ggtggaagct tctttgctat aatacatgca 540

agtcaattag gtttaaaaat cgaacctcaa aatgctggta aattaactga actagctatg 600

aaacttagag atataataaa tgagaaaata gaaatacaac atccaacttt agctcatata 660

aaaactgtag acttagttga aatatatgat gagccaactc atccagaagc tacttacaaa 720

aatgtagtta tatttggtca aggtcaagtt gacagatctc catgtggaac tggaacaagt 780

gctaaattag ctactttaca tgctaaaggt gaattaaaag taggagaaaa attcgtatat 840

gaaagtatat taggaacttt attcaaaggt gaaatagttg aagaaactaa agttgcagat 900

ttcaatgctg tagtacctaa aataactggt tctgcttata taactggatt taatcatttt 960

gtaatagatg aagaagaccc acttaaacat ggatttattc ttaaataa 1008

<210> 19

<211> 634

<212> PRT

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(634)

<223> PrdA(LsPrdA)

<400> 19

Met Ser Ile Ser Val Glu Gln Ala Lys Glu His Ala Lys Asp Pro Ala

1 5 10 15

Val Leu Cys Cys Arg Arg Glu Ala Gly Lys Val Leu Glu Ala Ala Asp

20 25 30

Phe Glu Asp Pro Thr Leu Phe Asp Asp Tyr Val Ser Ser Gly Leu Leu

35 40 45

Glu Ile Pro Glu Asp Thr Leu Thr Ile Glu Gln Ala Leu Gly Ala Thr

50 55 60

Leu Asn Thr Thr Thr Asp Ala Leu Asn Pro Leu Val Pro Gly Ile Val

65 70 75 80

Asp Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Ala Ser Glu Ser Asp Lys Asp Glu

85 90 95

Asn Val Glu Glu Glu Thr Pro Val Val Ala Glu Ala Asn Asn Glu Val

100 105 110

Val Asn Ser Thr Ser Ser Asn Gly Thr Phe His Leu Arg Ile Ala Lys

115 120 125

Gly Glu Gly Ile Asp Leu Glu Ile Pro Leu Asp Val Leu Lys Lys Asn

130 135 140

Thr Ala Asn Ser Ala Val Asp Val Pro Lys Ala Glu Thr Ser Ala Asp

145 150 155 160

Val Thr Asn Lys Asp Val Ala Glu Asp Glu Glu Ser Ala Glu Asp Ala

165 170 175

Lys Val Val Arg Thr Leu Thr Lys Lys Tyr Phe Lys Val Asp Glu Val

180 185 190

Lys Phe Gly Asp Thr Thr Lys Phe Asp Gly Thr Thr Leu Tyr Leu Arg

195 200 205

Asn Pro Lys Glu Leu Cys Lys Glu Ala Val Asp Thr Glu Ala Ile Val

210 215 220

Lys Gly Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr

225 230 235 240

Ser Asn Thr Ile Met Asp Val Gln Pro Ile Ala Thr Lys Glu Gly Asp

245 250 255

Ser Asp Leu Gly Val Gly Val Thr Lys Val Val Asp Gly Ala Val Val

260 265 270

Val Leu Thr Gly Thr Asp Glu Asn Gly Val Gln Val Gly Glu Phe Gly

275 280 285

Ser Ser Glu Gly Pro Leu Asn Glu Asn Ile Met Trp Asn Arg Pro Gly

290 295 300

Ala Val Asp Lys Gly Glu Ile Met Ile Lys Ile Asp Val Val Ile Glu

305 310 315 320

Ala Gly Thr Asn Arg Glu Arg Lys Gly Pro Leu Gly Ala His Leu Ala

325 330 335

Ala Asp Tyr Ile Thr Gln Glu Ile Arg Glu Ala Leu Lys Asp Val Asp

340 345 350

Asp Ser Ser Ala Val Arg Thr Glu Glu Phe Val Gln Lys Arg His Pro

355 360 365

Lys Gln Lys Arg Val Leu Ile Val Lys Glu Ile Met Gly Gln Gly Ala

370 375 380

Met His Asp Asn Leu Ile Met Pro Val Glu Pro Val Gly Thr Leu Gly

385 390 395 400

Ala Lys Pro Asn Val Asp Leu Gly Asn Leu Pro Val Val Leu Ala Pro

405 410 415

Thr Glu Leu Leu Asp Gly Gly Val His Ala Leu Thr Cys Ile Gly Pro

420 425 430

Ala Ser Lys Glu Thr Ser Arg His Tyr Phe Arg Glu Pro Leu Val Glu

435 440 445

Glu Ala Met Ala Asp Glu Asp Ile Asp Leu Val Gly Ile Ala Leu Val

450 455 460

Gly Ser Pro Gln Glu Asn Val Gln Lys Phe Tyr Val Ser Lys Arg Leu

465 470 475 480

Gly Met Met Val Glu Ala Met Asn Leu Asp Gly Ala Ile Val Thr Thr

485 490 495

Glu Gly Phe Gly Asn Asn His Ile Asp Phe Ala Ser His Ile Glu Gln

500 505 510

Ile Gly Glu Arg Gly Val Asp Val Val Gly Met Thr Tyr Ala Ala Val

515 520 525

Gln Gly Gln Leu Val Val Gly Asn Lys Tyr Met Asp Ala Met Val Asp

530 535 540

Asn Asn Lys Ser Arg Gln Gly Ile Glu Asn Glu Ile Leu Glu Asn Asn

545 550 555 560

Thr Leu Ser Arg Glu Asp Ala Ile Arg Ala Leu Ala Met Leu Glu Thr

565 570 575

Lys Met Ala Gly Gly Ser Ile Lys Lys Pro Glu Arg Gln Trp Asn Pro

580 585 590

Asn Val Lys Gln Asn Asn Ile Glu Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys

595 600 605

Lys Ile Asp Leu Val Glu Asn Glu Gln Ser Leu Pro Met Ser Lys Lys

610 615 620

Arg Arg Glu Ile Tyr Glu Lys Asp Ala Gln

625 630

<210> 20

<211> 1905

<212> DNA

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1905)

<223> PrdA(LsPrdA)

<400> 20

atgtcaattt cagttgaaca agctaaagaa catgctaagg atccagcagt tctttgctgt 60

agaagagagg caggaaaagt tctggaagct gccgattttg aagacccaac tttgtttgat 120

gactatgtta gttcaggact tttagaaata cctgaagata cgttaactat tgaacaagca 180

ttgggtgcaa cattaaatac tactacggat gcattaaatc ctttagttcc aggtattgta 240

gataatattc agggaaatga agaagcatct gaaagtgata aggacgaaaa tgttgaagaa 300

gaaacaccag ttgtagcaga agctaacaat gaagtagtaa attcaacatc atcaaatggt 360

acattccatt taagaatcgc taaaggtgaa ggtattgatt tagaaatacc tttggatgta 420

ttaaaaaaaa acacagctaa ctcagctgta gatgtcccca aggcggaaac aagtgctgat 480

gtaactaata aggatgttgc agaagatgaa gaatcagcag aagatgctaa agttgttcgt 540

actctaacta aaaaatactt caaagtagat gaagttaaat ttggagacac aacaaagttt 600

gatggaacaa cactttactt acgtaatcct aaagaacttt gcaaagaagc tgttgatact 660

gaagcaatcg ttaagggtat ggaaatcgaa attatcacac ctgatgatta ttccaactat 720

agtaacacta ttatggatgt tcaaccaatc gctacaaaag aaggagatag tgatttgggt 780

gtaggcgtta caaaagttgt ggatggtgct gtagtagtac tcacaggtac tgatgaaaat 840

ggtgtccaag ttggtgaatt tggttcttca gaaggtccat tgaatgaaaa tattatgtgg 900

aatcgtcctg gtgcagttga taaaggcgaa atcatgatta agattgatgt tgttatcgaa 960

gctggaacta accgtgaacg taaaggacct ttaggagcac atttagcagc agactacatt 1020

acacaagaaa ttagagaagc actaaaagat gttgatgata gttcagcagt tagaactgaa 1080

gaatttgttc aaaaacgtca tcctaagcaa aagagagtat taattgtaaa agaaatcatg 1140

ggtcaaggtg caatgcacga taatttaatt atgcctgtgg aaccagttgg tactcttggt 1200

gcaaagccaa atgttgattt aggtaacttg ccagttgtat tagctccaac ggaattatta 1260

gatggtggtg tacatgcttt aacatgtatt ggacctgctt ctaaggaaac atccagacat 1320

tacttcagag aacctttggt agaagaagca atggctgatg aagatattga tttagttggt 1380

attgcattag tcggttcacc tcaagaaaat gttcaaaaat tctatgtttc taagagatta 1440

ggtatgatgg tagaagctat gaatttagat ggtgctattg ttacaacaga aggatttggt 1500

aataaccata tcgactttgc ttctcacatc gaacaaattg gtgaaagagg agtagatgtt 1560

gttggaatga catatgctgc tgtccaagga caattagttg ttggtaacaa gtatatggat 1620

gcaatggtgg ataacaacaa atcccgtcaa ggtattgaaa acgaaattct tgaaaacaat 1680

actctatcac gtgaagatgc tatcagagct ttagcaatgt tggaaacaaa gatggctggt 1740

ggatcaatta agaaacctga acgtcaatgg aatccaaatg ttaagcaaaa taatatcgaa 1800

attattgaaa aagaaaccgg taagaagatt gacttagttg agaatgaaca atctctacca 1860

atgagtaaga agcgtcgtga aatttacgaa aaggatgctc aatag 1905

<210> 21

<211> 240

<212> PRT

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(240)

<223> PrdB(LsPrdB)

<400> 21

Met Ser Leu Lys Lys Tyr Asp Gly Leu Gln Ser Glu Ile Phe Val Pro

1 5 10 15

Ile Thr Pro Thr Pro Val Trp Ala Pro Val Lys Lys Lys Leu Lys Asp

20 25 30

Met Thr Val Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Val His Leu Lys Ser Asp

35 40 45

Lys Pro Phe Asn Leu Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Arg Val Val Pro Ser

50 55 60

Thr Ala Thr Asp Asp Glu Leu Met Val Ser His Gly Gly Tyr Asp Asn

65 70 75 80

Thr Asp Val Asn Arg Asp Ile Asn Cys Met Phe Pro Ile Asp Arg Leu

85 90 95

Arg Glu Leu Ala Glu Lys Gly Phe Ile Lys Asn Ile Ala Pro Asn Met

100 105 110

Tyr Thr Cys Met Gly Gly Gly Gly Asp Val Lys Val Phe Thr Glu Glu

115 120 125

Thr Gly Pro Glu Ile Ala Gln Lys Leu Leu Asp Glu His Val Asp Ala

130 135 140

Val Val Met Thr Ala Gly Gly Thr Cys His Arg Thr Ala Val Ile Val

145 150 155 160

Gln Arg Ala Ile Glu Ser Val Gly Ile Pro Thr Ile Ile Ile Ala Ala

165 170 175

Leu Pro Pro Val Val Arg Gln Gln Gly Ser Pro Arg Ala Val Ala Pro

180 185 190

Arg Val Pro Met Gly Ala Asn Ala Gly Glu Pro His Asn Val Glu Met

195 200 205

Gln Thr Gly Ile Leu Lys Asp Thr Leu Glu Gln Leu Glu Lys Leu Asp

210 215 220

Ser Pro Gly Lys Ile Val Pro Leu Pro Tyr Glu Tyr Ile Ala Asn Ile

225 230 235 240

<210> 22

<211> 726

<212> DNA

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(726)

<223> PrdB(LsPrdB)

<400> 22

atgagtctta agaaatatga tggactacaa tccgaaatat ttgtacctat tactcctacg 60

ccagtgtggg ctccagttaa aaagaagcta aaagatatga ctgtagcaat tgtaactgct 120

gctggtgtac atttgaaatc agataaacca tttaatttag ctggtgatac ttcatataga 180

gtagtacctt caactgcaac tgatgatgaa ttgatggtat cacatggtgg ttatgataac 240

actgatgtta acagagatat taactgtatg ttcccaattg atagattaag agaacttgca 300

gagaaaggat ttattaagaa tattgcgcca aacatgtata catgtatggg tggtggtgga 360

gacgttaaag tctttactga agaaactggt ccagaaattg cccaaaaatt attggatgaa 420

catgtagatg ctgtcgtaat gactgctggt tgaggtacct gtcatagaac tgccgtgatc 480

gtgcagagag ctattgaatc agttggtatc ccaacaatta ttattgcagc cttacctcca 540

gtagtacgtc aacaaggatc tcctagagct gttgctcctc gagttcctat gggggctaat 600

gccggagaac cacacaacgt cgaaatgcaa acaggtattt tgaaagatac gttagagcaa 660

ttagaaaaat tagattcccc aggtaagatt gtgccactac catatgaata tatagcaaat 720

atatag 726

<210> 23

<211> 105

<212> PRT

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(105)

<223> PrdH(LsPrdH)

<400> 23

Met Glu Glu Gln Ser Thr Gly Phe Asp Lys Leu Lys Tyr Ala Ser Thr

1 5 10 15

Glu Arg Val Trp Glu Gly Ile Ile Ile Glu Leu Thr Asp Ala Ser Val

20 25 30

Ile Ile Asp Leu Lys Gly Arg Leu Gly Arg Leu Glu Ile Pro Asn Arg

35 40 45

Met Ile Ile Ser Asp Tyr Glu Leu Lys Val Gly Gln Glu Val Ala Phe

50 55 60

Leu Met Ser Tyr Pro Glu Val Leu Asp Ser Glu Pro Asn Gln Lys Tyr

65 70 75 80

Leu Gly Ala Leu Asn Ala Tyr His Lys Lys Met Lys Glu Ile Lys Glu

85 90 95

Lys Gln Arg Arg Asp Lys Asn Glu Ser

100 105

<210> 24

<211> 318

<212> DNA

<213> 唾液乳杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(318)

<223> PrdH(LsPrdH)

<400> 24

atggaagaac aaagtacagg atttgacaag ttgaaatatg cctcaactga aagagtatgg 60

gagggtataa taatagaatt gacagatgcg agtgtcataa ttgatcttaa aggacgtcta 120

ggtagactag aaattcctaa tagaatgatt attagtgact atgagttgaa agtcggtcag 180

gaagtagcat tcttaatgtc atatcccgaa gttttggata gtgaacctaa tcaaaaatat 240

ttaggagcac taaatgcata ccataaaaaa atgaaagaaa taaaagaaaa gcaaaggaga 300

gataaaaatg agtcttaa 318

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PrdA(C421A)-F

<400> 25

ggtatccatg cattaactgc cataggacct gcatcaaaag 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PrdA(C421A)-R

<400> 26

cttttgatgc aggtcctatg gcagttaatg catggatacc 40

Claims (24)

1.一种表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中PrdA蛋白、PrdB蛋白和PrdH蛋白的活性增强。

2.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述PrdA蛋白包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述PrdB蛋白包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：21的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述PrdH蛋白是由存在于编码所述PrdA蛋白的基因与编码所述PrdB蛋白的基因之间的基因ORF编码的蛋白。

5.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述PrdH蛋白包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中另外增强了选自PrdD、PrdE和PrdE2的一种或多种蛋白的活性。

7.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中另外增强了选自PrdC、PrdG和PrdF的一种或多种蛋白的活性。

8.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述微生物是埃希氏杆菌属的微生物。

9.根据权利要求1所述的表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。

10.一种生产活性D-脯氨酸还原酶的方法，所述方法包括以下步骤：

在培养基中培养根据权利要求1至9中任一项所述的微生物，和

从所述微生物或所述培养基中回收所述活性D-脯氨酸还原酶。

11.一种使用权利要求1至9中任一项所述的微生物或由权利要求1至8中任一项所述的微生物生产的脯氨酸还原酶生产选自氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-AVA)、γ-氨基丁酸(GABA)和5-氨基-4-羟基戊酸中的一种或多种的方法。

12.一种PrdH蛋白，其具有将非活性D-脯氨酸还原酶转化为活性D-脯氨酸还原酶的活性，同时与PrdA蛋白和PrdB蛋白共表达。

13.根据权利要求12所述的PrdH蛋白，其中所述PrdA蛋白包括SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：19的氨基酸序列。

14.根据权利要求12所述的PrdH蛋白，其中所述PrdB蛋白包括SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：21的氨基酸序列。

15.根据权利要求12所述的PrdH蛋白，其中所述PrdH蛋白包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：23的氨基酸序列。

16.一种生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，所述方法包括：

用包括prdA基因或prdA和prdH基因的表达盒转化宿主细胞；和

用包含prdB基因或prdB和prdH基因的表达盒转化所述宿主细胞。

17.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述PrdA蛋白包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

18.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述PrdB蛋白包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：21的氨基酸序列。

19.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述PrdH蛋白是由存在于编码所述PrdA蛋白的基因与编码所述PrdB蛋白的基因之间的基因ORF编码的蛋白。

20.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述PrdH蛋白包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

21.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中另外增强了选自PrdD、PrdE和PrdE2的一种或多种蛋白的活性。

22.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中另外增强了选自PrdC、PrdG和PrdF的一种或多种蛋白的活性。

23.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述微生物是埃希氏杆菌属的微生物。

24.根据权利要求16所述的生产表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。

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