CN108624628A

CN108624628A - 催化甲酸合成甲醛car酶的制备及其应用

Info

Publication number: CN108624628A
Application number: CN201710174197.4A
Authority: CN
Inventors: 江会锋; 缑俊冉; 杨晟; 逯晓云; 刘玉万; 卢丽娜
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2037-03-22
Also published as: CN108624628B

Abstract

本发明公开了催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用。本发明提供了CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。本发明的实验证明，本发明发现CAR新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。

Description

催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用。

背景技术

从生态角度讲，甲酸是糖发酵的中间产物，易于在发酵过程中累积。同时，甲酸还可以作为生成下游还原性代谢产物的原料，例如，生成乙醇，甲烷，氢气等。从生物技术角度讲，甲酸可以来源于二氧化碳还原、生物质选择性氧化、天然气部分氧化及合成气的氢化。因此甲酸可以作为连接物理化学与生物领域的桥梁，研究甲酸的同化途径具有重要的意义。

自然界存在的甲酸固定反应主要有甲酸直接还原反应、甲酸激酶反应、甲酸与乙酰辅酶缩合反应、乳酸合成反应等。甲酸的直接还原反应由甲醛脱氢酶催化，将甲酸直接还原为甲醛从热力学上是不利的，因此反应效率低下。甲酸激酶反应由甲酸-四氢叶酸连接酶催化，此同化途径路线长，需在厌氧条件下反应，因此应用受到限制。用乙酰辅酶A合成酶可以实现甲酸还原为甲醛，但目前利用效率依然不高。甲酸与乙酰辅酶缩合反应丙酮酸-甲酸裂合酶催化，此反应也是热力学甲酸有利的。乳酸合成反应即甲酸与乙醛缩合反应，目前还没有在体外成功实现。

这些甲酸固定反应是甲酸同化途径的重要组成部分，目前最优的甲酸同化途径是人工合成途径：甲酸还原为甲醛，甲醛聚合生成二羟基丙酮，二羟基丙酮磷酸化直接进入中心代谢。

CAR蛋白为carboxylic acid reductase(CAR)羧酸还原酶，催化一系列长链羧酸还原为相应的醛。

发明内容

本发明的一个目的是提供CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌的新用途。

本发明提供了CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；

或CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用。

上述应用中，所述CAR蛋白来源于Mycobacterium marinum。

上述应用中，所述CAR蛋白为如下1)或2)：

1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽。

上述应用中，所述CAR蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：

1)编码区为序列2的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛产品。

本发明提供的产品，包括CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。

上述产品为试剂盒。

所述产品还包括NADPH、ATP和MgCl₂。

本发明第3个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用所述CAR蛋白催化甲酸合成甲醛。

上述方法中，所述催化反应的条件为37℃反应2h。

上述方法中，所述催化反应的所需的pH值为pH7.4。

上述方法中，所述催化所在的体系包括NADPH、ATP、MgCl₂、甲酸和CAR蛋白。

上述每200ul所述体系由终浓度为1mM的NADPH、终浓度为1mM ATP、终浓度为5mMMgCl₂、终浓度为5mM甲酸、终浓度为1.5mg/ml所述CAR蛋白和pH＝7.4，50mM磷酸钾缓冲液(0.1M K₂HPO₃水溶液、0.1M KH₂PO₃水溶液、dH₂O按照体积比为4:1:5混匀)组成。

本发明的实验证明，本发明发现CAR新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。

附图说明

图1为重组质粒pET-28a-CAR的质粒图谱示意图。

图2为甲醛检测标准曲线。

图3为不同酶催化甲酸生成的甲醛浓度示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CAR的获得

1、CAR基因获得、载体构建

CAR种属来源为Mycobacterium marinum(strain ATCC BAA-535/M)，其氨基酸序列如序列1所示。在不改变CAR编码的氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如序列2所示。

将上述基因序列合成在pET-28a载体(Novagen，Kan⁺，见图1)上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒分别命名为pET-28a-CAR。

pET-28a-CAR为将序列4所示的CAR基因替换pET-28a载体的NdeI和XhoI位点间的DNA片段得到的载体。

2、基因的表达

为了体外检测CAR酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-CAR转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，200mM NaCl，5mM MgCl₂，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

3、蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM、100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白CAR、stAckA、ASD。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/mL，即得到CAR蛋白，其氨基酸序列分别如序列1所示。

实施例2、CAR在催化甲酸生成甲醛中的应用

1、CAR催化甲酸生成甲醛，反应方程式如下：

2、酶活性检测:

显色法检测甲醛生成量：利用《中华人民共和国国家环境保护标准HJ601-2011》中的甲醛测定方法检测甲醛含量。具体流程如下：

A：配置乙酰丙酮溶液：将50g乙酸铵(CH₃COONH₄)、6mL冰乙酸(CH₃COOH)及0.5mL乙酰丙酮(C₅H₈O₂)试剂溶于100mL水中。此溶液在4℃冷藏可稳定保存一个月。

B：标准曲线的制备：分别配置浓度为0mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的甲醛标准溶液。

取2.5mL各浓度甲醛标准溶液，加入0.25mL乙酰丙酮溶液，混匀。60℃水浴加热15min，冷却后414nm下检测吸光值。绘制标准曲线，如图2所示。

C:CAR蛋白催化甲酸生成甲醛反应体系(200μL)：终浓为1mM的NADPH，1mM ATP，5mMMgCl2，5mM甲酸，1.5mg/ml实施例1制备的CAR蛋白，再用pH＝7.4，50mM磷酸钾缓冲液(0.1MK₂HPO₃水溶液、0.1M KH₂PO₃水溶液、dH₂O按照体积比为4:1:5混匀)补足至200ul，37℃反应2h,离心(12000rpm,2min)取上清，显色反应检测甲醛生成量。

用显色法检测甲醛生成量，根据甲醛浓度标准曲线计算甲醛浓度，结果如图3所示，可以看出，在所提供反应条件下CAR蛋白可以催化甲酸生产甲醛，加入5mM的甲酸可得到0.13mM的甲醛(0.13mmol/l×30g/mol＝4mg/l)。

在所提供反应条件下1.5mg/ml的CAR纯酶每分钟可利用甲酸生成1.11uM的甲醛。从而可得酶CAR比活力为3.70U/mg。

自然界存在的酶是可逆反应，主要催化甲醛生成甲酸，检验此酶催化活性(以甲酸为底物)，检测甲醛，没有检测到产物。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 催化甲酸合成甲醛CAR酶的制备及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala

20 25 30

Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile

35 40 45

Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg

50 55 60

Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg

85 90 95

Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro

100 105 110

Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr

115 120 125

Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln

130 135 140

Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln

145 150 155 160

Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu

165 170 175

Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His

180 185 190

His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu

195 200 205

Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala

210 215 220

Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr

225 230 235 240

Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr

260 265 270

Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile

275 280 285

Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu

290 295 300

Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu

325 330 335

Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln

340 345 350

Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu

355 360 365

Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg

370 375 380

Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys

385 390 395 400

Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly

405 410 415

Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro

420 425 430

Ala Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

435 440 445

Leu Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp

450 455 460

Ser Leu Phe Pro Gly Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Val Thr Ala Asp Val

465 470 475 480

Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Met Ala Glu Val

485 490 495

Gly Pro Glu Gln Phe Val Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys

500 505 510

Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ser Lys Leu Glu Ala Val Phe

515 520 525

Gly Asp Ser Pro Leu Val Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Ala

530 535 540

Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp

545 550 555 560

Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln

565 570 575

Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp

580 585 590

Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr

595 600 605

Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu

610 615 620

Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu

625 630 635 640

Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr

645 650 655

Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val

660 665 670

Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala

675 680 685

Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro

690 695 700

Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp

705 710 715 720

Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala

725 730 735

Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly

740 745 750

Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala

755 760 765

Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr

770 775 780

Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu

785 790 795 800

Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys

805 810 815

Ser Asp Thr Glu Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly

820 825 830

Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu

835 840 845

Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg

850 855 860

Gln Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Leu Ile Val Asp Pro

865 870 875 880

Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro

885 890 895

Asn Ala Leu Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys

900 905 910

Ile Lys Pro Tyr Ser Tyr Thr Ser Thr Ile Gly Val Ala Asp Gln Ile

915 920 925

Pro Pro Ser Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp Ile Arg Val Ile Ser Ala

930 935 940

Thr Arg Ala Val Asp Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Ser Lys

945 950 955 960

Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu

965 970 975

Pro Val Ala Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Trp

980 985 990

Ala Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Met Ile Leu Ser

995 1000 1005

Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Ala

1010 1015 1020

Ala Asp Gly Ala Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val

1025 1030 1035

Glu Phe Ile Ala Glu Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ala Gln Ser Gln

1040 1045 1050

Asp Gly Phe His Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly

1055 1060 1065

Ile Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp Leu Asn Glu Ser Gly Cys

1070 1075 1080

Pro Ile Gln Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Asp Trp Leu Gln Arg Phe

1085 1090 1095

Glu Thr Ala Leu Arg Ala Leu Pro Asp Arg Gln Arg His Ser Ser

1100 1105 1110

Leu Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr Arg Gln Pro Glu Arg Pro Val

1115 1120 1125

Arg Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Arg Phe Arg Ala Ala Val Gln

1130 1135 1140

Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile Pro His Val Gly Ala

1145 1150 1155

Pro Ile Ile Val Lys Tyr Val Ser Asp Leu Arg Leu Leu Gly Leu

1160 1165 1170

Leu

<210> 2

<211> 3522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atgtctccga tcacccgtga agaacgtctg gaacgtcgta tccaggacct gtacgctaac 60

gacccgcagt tcgctgctgc taaaccggct accgctatca ccgctgctat cgaacgtccg 120

ggtctgccgc tgccgcagat catcgaaacc gttatgaccg gttacgctga ccgtccggct 180

ctggctcagc gttctgttga attcgttacc gacgctggta ccggtcacac caccctgcgt 240

ctgctgccgc acttcgaaac catctcttac ggtgaactgt gggaccgtat ctctgctctg 300

gctgacgttc tgtctaccga acagaccgtt aaaccgggtg accgtgtttg cctgctgggt 360

ttcaactctg ttgactacgc taccatcgac atgaccctgg ctcgtctggg tgctgttgct 420

gttccgctgc agacctctgc tgctatcacc cagctgcagc cgatcgttgc tgaaacccag 480

ccgaccatga tcgctgcttc tgttgacgct ctggctgacg ctaccgaact ggctctgtct 540

ggtcagaccg ctacccgtgt tctggttttc gaccaccacc gtcaggttga cgctcaccgt 600

gctgctgttg aatctgctcg tgaacgtctg gctggttctg ctgttgttga aaccctggct 660

gaagctatcg ctcgtggtga cgttccgcgt ggtgcttctg ctggttctgc tccgggtacc 720

gacgtttctg acgactctct ggctctgctg atctacacct ctggttctac cggtgctccg 780

aaaggtgcta tgtacccgcg tcgtaacgtt gctaccttct ggcgtaaacg tacctggttc 840

gaaggtggtt acgaaccgtc tatcaccctg aacttcatgc cgatgtctca cgttatgggt 900

cgtcagatcc tgtacggtac cctgtgcaac ggtggtaccg cttacttcgt tgctaaatct 960

gacctgtcta ccctgttcga agacctggct ctggttcgtc cgaccgaact gaccttcgtt 1020

ccgcgtgttt gggacatggt tttcgacgaa ttccagtctg aagttgaccg tcgtctggtt 1080

gacggtgctg accgtgttgc tctggaagct caggttaaag ctgaaatccg taacgacgtt 1140

ctgggtggtc gttacacctc tgctctgacc ggttctgctc cgatctctga cgaaatgaaa 1200

gcttgggttg aagaactgct ggacatgcac ctggttgaag gttacggttc taccgaagct 1260

ggtatgatcc tgatcgacgg tgctatccgt cgtccggctg ttctggacta caaactggtt 1320

gacgttccgg acctgggtta cttcctgacc gaccgtccgc acccgcgtgg tgaactgctg 1380

gttaaaaccg actctctgtt cccgggttac taccagcgtg ctgaagttac cgctgacgtt 1440

ttcgacgctg acggtttcta ccgtaccggt gacatcatgg ctgaagttgg tccggaacag 1500

ttcgtttacc tggaccgtcg taacaacgtt ctgaaactgt ctcagggtga attcgttacc 1560

gtttctaaac tggaagctgt tttcggtgac tctccgctgg ttcgtcagat ctacatctac 1620

ggtaactctg ctcgtgctta cctgctggct gttatcgttc cgacccagga agctctggac 1680

gctgttccgg ttgaagaact gaaagctcgt ctgggtgact ctctgcagga agttgctaaa 1740

gctgctggtc tgcagtctta cgaaatcccg cgtgacttca tcatcgaaac caccccgtgg 1800

accctggaaa acggtctgct gaccggtatc cgtaaactgg ctcgtccgca gctgaaaaaa 1860

cactacggtg aactgctgga acagatctac accgacctgg ctcacggtca ggctgacgaa 1920

ctgcgttctc tgcgtcagtc tggtgctgac gctccggttc tggttaccgt ttgccgtgct 1980

gctgctgctc tgctgggtgg ttctgcttct gacgttcagc cggacgctca cttcaccgac 2040

ctgggtggtg actctctgtc tgctctgtct ttcaccaacc tgctgcacga aatcttcgac 2100

atcgaagttc cggttggtgt tatcgtttct ccggctaacg acctgcaggc tctggctgac 2160

tacgttgaag ctgctcgtaa accgggttct tctcgtccga ccttcgcttc tgttcacggt 2220

gcttctaacg gtcaggttac cgaagttcac gctggtgacc tgtctctgga caaattcatc 2280

gacgctgcta ccctggctga agctccgcgt ctgccggctg ctaacaccca ggttcgtacc 2340

gttctgctga ccggtgctac cggtttcctg ggtcgttacc tggctctgga atggctggaa 2400

cgtatggacc tggttgacgg taaactgatc tgcctggttc gtgctaaatc tgacaccgaa 2460

gctcgtgctc gtctggacaa aaccttcgac tctggtgacc cggaactgct ggctcactac 2520

cgtgctctgg ctggtgacca cctggaagtt ctggctggtg acaaaggtga agctgacctg 2580

ggtctggacc gtcagacctg gcagcgtctg gctgacaccg ttgacctgat cgttgacccg 2640

gctgctctgg ttaaccacgt tctgccgtac tctcagctgt tcggtccgaa cgctctgggt 2700

accgctgaac tgctgcgtct ggctctgacc tctaaaatca aaccgtactc ttacacctct 2760

accatcggtg ttgctgacca gatcccgccg tctgctttca ccgaagacgc tgacatccgt 2820

gttatctctg ctacccgtgc tgttgacgac tcttacgcta acggttactc taactctaaa 2880

tgggctggtg aagttctgct gcgtgaagct cacgacctgt gcggtctgcc ggttgctgtt 2940

ttccgttgcg acatgatcct ggctgacacc acctgggctg gtcagctgaa cgttccggac 3000

atgttcaccc gtatgatcct gtctctggct gctaccggta tcgctccggg ttctttctac 3060

gaactggctg ctgacggtgc tcgtcagcgt gctcactacg acggtctgcc ggttgaattc 3120

atcgctgaag ctatctctac cctgggtgct cagtctcagg acggtttcca cacctaccac 3180

gttatgaacc cgtacgacga cggtatcggt ctggacgaat tcgttgactg gctgaacgaa 3240

tctggttgcc cgatccagcg tatcgctgac tacggtgact ggctgcagcg tttcgaaacc 3300

gctctgcgtg ctctgccgga ccgtcagcgt cactcttctc tgctgccgct gctgcacaac 3360

taccgtcagc cggaacgtcc ggttcgtggt tctatcgctc cgaccgaccg tttccgtgct 3420

gctgttcagg aagctaaaat cggtccggac aaagacatcc cgcacgttgg tgctccgatc 3480

atcgttaaat acgtttctga cctgcgtctg ctgggtctgc tg 3522

Claims

1.CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌在催化甲酸合成甲醛中的应用；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CAR蛋白来源于Mycobacteriummarinum。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述CAR蛋白为如下1)或2)：

1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述CAR蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：

1)编码区为序列2的DNA分子；

5.一种催化甲酸合成甲醛产品，包括CAR蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：

所述产品包括还包括NADPH、ATP和MgCl₂；

或所述产品为试剂盒。

7.一种催化甲酸合成甲醛的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用所述CAR蛋白催化甲酸合成甲醛。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述催化反应的条件为37℃反应2h。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述催化反应所需的pH值为pH7.4。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述催化所在的体系包括NADPH、ATP、MgCl₂、甲酸和CAR蛋白。