CN104805167B - 一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产β‑胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β‑胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β‑胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β‑胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β‑胡萝卜素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。
背景技术
β-胡萝卜素属于萜类化合物，是类胡萝卜素家族中的一员，在食品、药品、化妆品和保健品中有着广泛的应用。
目前，β-胡萝卜素的生产方法有化学合成品的生产及天然品的生产方法，而化学合成产品全为反式结构，天然品为顺式和反式混合型。化学合成以维生素A合成过程中的中间体C14醛、维生素A为原料开始合成，而天然品的产生方法主要是从天然植物、蚕粪、盐藻和微生物发酵液中提取。由于人们对β胡萝卜素药理活性的要求，天然品逐渐成为一种趋势。
β-胡萝卜素属于萜类化合物，合成萜类化合物的内源性途径主要有甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径，其中MEP途径主要存在于植物的质体、细菌和藻类等，MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中。这两类代谢途径的终产物均是萜类化合物的共同的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）和异戊酰焦磷酸（IPP），之后在β-胡萝卜素合成基因存在下合成β-胡萝卜素。
微生物具有生产快、发酵周期短、遗传背景清晰、易于工程化操作等优点。近年来随着合成生物学的不断发展，人们对利用基因工程生产β-胡萝卜素进行了广泛的研究，主要是针对单个基因进行调控，过表达MEP途径中的单个基因，来提高β-胡萝卜素的产量。但是这些方法操作复杂，菌株稳定性较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的生产β胡萝卜素的方法操作复杂，稳定较低的问题，提供一种生产β-胡萝卜素的方法及其所用的大肠杆菌基因工程菌。
本发明的技术方案之一是：一种生产β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因）、crtB（茄红素合成酶基因）、crtI（番茄红素合成酶基因）和crtY（β-胡萝卜素合成酶基因），其中，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs（脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因）、idi（异戊酰基焦磷酸异构酶基因）、ispD（4-二磷酸胞苷甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因）和ispF（2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因）。
本发明所述的大肠杆菌基因工程菌的培养方法同常规的大肠杆菌培养方法，包括接种于LB培养基中进行培养，培养至菌体浓度至诱导浓度时加入诱导剂IPTG，即表达导入的外源基因，从而产生β-胡萝卜素。然后从发酵液中获得β-胡萝卜素。从发酵液中获得β-胡萝卜素的方法是本领域的常规方法。
本发明的技术方案之二是：一种高产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。
本发明所述的大肠杆菌基因工程菌含有含四个MEP途径基因的表达载体。大肠杆菌原基因组中含有上述四基因，通过外源的该四基因的导入，增加大肠杆菌上述四基因的拷贝数。
本发明所述的含四个MEP途径基因的表达载体，能够在大肠杆菌中表达该四基因。较佳的，所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒pET32a(+)，更佳的是质粒pTrcHis2B。质粒pTrcHis2B的启动子是trc，pET32a(+)的启动子的是T7，其中trc是弱启动子，T7是强启动子。一般而言，强启动子有利于重组蛋白的表达，可能有利于产物的产生，弱启动子不利于重组蛋白的表达，也就不利于产物的产生。本发明在做了多次重复试验后，发现pTrcHis2B中的的启动子trc虽然是弱启动子，但是相比于pET32a(+)的强启动子T7，更加利于β-胡萝卜素的产生。
本发明中，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体含有四个β-胡萝卜素合成基因：crtE、crtI、crtB和crtY。较佳的，所述的表达载体含有包括该四基因的β-胡萝卜素合成基因簇。优选的是本领域常规的β-胡萝卜素合成基因簇，更优选来自成团泛菌CGMCCNO.1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇。如本领域常规，β-胡萝卜素合成基因簇也称为crt基因簇，包含的基因有crtE、crtI、crtB和crtY。
本发明所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体能够在大肠杆菌中表达该四基因。较佳的所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体是质粒pACYC184-M-crt（参见文献：赵婧,刘怡,李清艳等.多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J].生物工程学报,2013,29(1):41-55.）。
采用上述两个表达载体转化大肠杆菌即获得所述的大肠杆菌基因工程菌。所述的转化的方法是常规的，采用常规方法转化大肠杆菌感受态细胞即可。
本发明所述的大肠杆菌是本领域常规的表达外源基因的宿主微生物，优选大肠杆菌BL21（DE3）。
所述的大肠杆菌基因工程菌的一较佳构建方法包括：
（1）上游质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF构建：
①以大肠杆菌基因组为模板，根据载体pET32a(+)设计的酶切位点，通过PCR获得目的片段dxs、idi和ispDF；
②利用酶切连接的方法，将目的片段dxs、idi和ispDF导入载体pET32a(+)中，从而构建上游质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF；
（2）上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF构建：
①以大肠杆菌基因组为模板，根据载体pTrcHis2B设计酶切位点，通过PCR获得目的片段dxs、idi和ispDF；
②利用酶切连接的方法，将目的片段dxs、idi和ispDF导入载体pTrcHis2B中，从而构建上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF；
（3）下游质粒pACYC184-M-crt构建：
下游质粒pACYC184-M-crt为已知的，参见文献：赵婧,刘怡,李清艳等.多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J].生物工程学报,2013,29(1):41-55。质粒pACYC184-M-crt具体构建方法包括：以成团泛菌CGMCC NO.1.2244基因组为模板，扩增β-胡萝卜素合成基因簇crtEXYIB，然后连接到载体pACYC184中，将该质粒导入感受态细胞大肠杆菌DE3中，由于大肠杆菌中本身含有内源性的MEP途径，故重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）可以产生β-胡萝卜素，但是含量比较低；
（4）重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）构建：
将上游质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF和下游质粒pACYC184-M-crt同时导入感受态细胞中，筛选具有双抗的阳性转化子；
（5）重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）构建：
将上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF和下游质粒pACYC184-M-crt同时导入感受态细胞中，筛选具有双抗的阳性转化子；
（6）阳性转化子发酵验证
重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）、pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）和pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）同时进行发酵，检测其中β-胡萝卜素产量。
更优选的，所述的大肠杆菌基因工程菌，由包括以下步骤的方法制备而得：
（1）基因克隆
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
（2）表达载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pET32a(+)分别用NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs，
将胶回收后的idi基因与载体pET32a(+)-dxs分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi，
将胶回收后的ispDF基因与载体pET32a(+)-dxs-idi分别用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF；
（3）转化宿主细胞
将质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，得重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）；
或者，由包括以下步骤的方法制备而得：
（1）基因克隆
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示,
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示,
以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
（2）表达载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pTrcHis2B分别用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs，
将胶回收后的idi基因与载体pTrcHis2B-dxs分别用XhoⅠ和PstⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi，
将胶回收后的ispDF基因与载体pTrcHis2B-dxs-idi分别用PstⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF；
（3）转化宿主细胞
将质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，得重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明主要通过基因工程手段提高MEP途径中的4个基因：脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（dxs）、异戊酰基焦磷酸异构酶基因（idi）、4-二磷酸胞苷甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因（ispD）和2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因（ispF）的表达水平，构建含有不同启动子强度控制的dxs-idi-ispDF片段的质粒，增加前体物质DMAPP和IPP的供应，从而进一步提高β-胡萝卜素产量。
本发明是利用大肠杆菌中原有的MEP途径，避免了由于过多外源基因而导致细胞自身代谢的影响，同时通过构建不同启动子强度的上游质粒来过表达MEP途径中的4个关键酶，组合含有β-胡萝卜素合成基因簇的下游质粒，最终提高大肠杆菌中β-胡萝卜素产量的产量。
相对于无MEP途径的菌株pACYC184-M-crt（DE3），本发明含有pET32a(+)-dxs-idi-ispDF、pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF的菌株β-胡萝卜素产量提高1.89、7.27倍，β-胡萝卜素产量的产量得到大幅提高，使之具有工业化价值。
附图说明
图1上游质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF构建示意图。
图2上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF构建示意图。
图3下游质粒pACYC184-M-crt构建示意图。
图4β-胡萝卜素在453nm下的标准曲线。
图5重组菌株的β-胡萝卜素含量。其中1表示重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）；2表示pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）；3表示pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt构建
1.1上游质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF构建
1.1.1MEP途径中关键酶基因克隆
1.1.1.1大肠杆菌脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（dxs）克隆
提取大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655（购自国家菌种保藏中心，即ATCCNO.10798）基因组DNA，根据载体pET32a(+)设计引物，然后PCR扩增脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（dxs），GenBank登录号：945060，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
dxs-上游：CATGCCATGGCTAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO.1)；
dxs下游：CGGAATTCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG(SEQ ID NO.2)。
1.1.1.2大肠杆菌异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)克隆
提取大肠杆菌K12MG1655基因组DNA，根据载体pET32a(+)设计引物，然后PCR扩增异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)，GenBank登录号：949020，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
idi-上游：CGGAATTCGAAGGAGATATACATATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG(SEQ IDNO.3)；
idi-下游：ATAA GAAT GCGGCCGC TTATTTAAGCTGGGTAAATGCAG(SEQ ID NO.4)。
1.1.1.3大肠杆菌4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因（ispD）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因（ispF）克隆
提取大肠杆菌K12MG1655基因组DNA，根据载体pET32a(+)设计引物，然后PCR扩增4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因（ispD）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因（ispF），GenBank登录号分别是：948269和945057，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
ispDF-上游：
ATAAGAATGCGGCCGCGAAGGAGATATACATATGGCAACCACTCATTTGGATGTTTG(SEQ IDNO.5)；
ispDF-下游：CCGCTCGAGTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC(SEQ ID NO.6)。
1.1.2表达载体构建
1.1.2.1pET32a(+)-dxs载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pET32a(+)分别用NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pET32a(+)-dxs，再进行双酶切和测序验证。
1.1.2.2pET32a(+)-dxs-idi载体构建
将胶回收后的idi基因与载体pET32a(+)-dxs分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pET32a(+)-dxs-idi，再进行双酶切和测序验证。
1.1.2.3pET32a(+)-dxs-idi-ispDF载体构建
将胶回收后的ispDF基因与载体pET32a(+)-dxs-idi分别用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF，再进行双酶切和测序验证。见图1。
1.2质粒pACYC184-M-crt制备
质粒pACYC184-M-crt参见文献（赵婧,刘怡,李清艳等.多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J].生物工程学报,2013,29(1):41-55）制备。见图3，质粒pACYC184-M-crt具体构建方法包括：以成团泛菌CGMCC NO.1.2244基因组为模板，扩增β-胡萝卜素合成基因簇crtEXYIB，然后连接到载体pACYC184（赵婧,刘怡,李清艳等.多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J].生物工程学报,2013,29(1):41-55）中，将该质粒导入感受态细胞大肠杆菌DE3中，由于大肠杆菌中本身含有内源性的MEP途径，故重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）可以产生β-胡萝卜素，但是含量比较低。
1.3重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）构建
将质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化进入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，涂布与含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）。
1.4重组菌株发酵
分别在LB液体培养基（蛋白胨10%，酵母提取物5%，NaCl10%）中接种重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）、pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3），接种量为10μL/2mL，37℃，220r/min培养过夜。第二天转接入新的LB液体培养基中，接种量为500μL/50mL，30℃，250r/min培养2h，待OD600=0.1左右时，添加终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导。培养24小时后，取样进行含量测定。
1.5发酵液中β-胡萝卜素含量测定
1.5.1β-胡萝卜素标准曲线制作
1.5.1.1β-胡萝卜素标准溶液配制
精确称取β-胡萝卜素12.5mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转至50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg/mL，-18℃储存备用，2个月内稳定。根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准溶液稀释成100μg/mL
1.5.1.2β-胡萝卜素使用液配制
分别吸取β-胡萝卜素标准溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6mL与10mL容量瓶中，各加石油醚：丙酮（8:2）至刻度，即得β-胡萝卜素标准系列，分别含有β-胡萝卜素1、2、3、4、5、6μg/mL。
1.5.1.3β-胡萝卜素标准曲线绘制
利用紫外分光光度计（Ultrospec2100pro，GE）测定β-胡萝卜素标准系列的吸光度，然后绘制成标准曲线。见图4。
1.5.2发酵液中β-胡萝卜素含量测定
取1ml发酵液，14000r/min离心5min，弃上清，取菌泥沉淀，用1ml石油醚：丙酮（体积比8:2）悬浮，接着14000r/min离心10min，将含有β-胡萝卜素的上清液转移至新离心管，反复数次至菌体无色，然后利用紫外分光光度计测定其在453nm下的吸光度，依据标准曲线计算β-胡萝卜素含量。重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）、pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）发酵液中β-胡萝卜素含量分别是2.42μg/mL、4.58μg/mL。见图5。
实施例2重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt构建
2.1上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF构建
2.1.1MEP途径中关键酶基因克隆
2.1.1.1大肠杆菌脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（dxs）克隆
提取大肠杆菌K12MG1655基因组DNA，根据载体pTrcHis2B（购自上海业力生物）设计引物，然后PCR扩增脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（dxs），GenBank登录号：945060，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
dxs-上游：CATGCCATGGCTAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO.7)；
dxs下游：CCGCTCGAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG(SEQ ID NO.8)。
2.1.1.2大肠杆菌异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)克隆
提取大肠杆菌K12MG1655基因组DNA，根据载体pTrcHis2B设计引物，然后PCR扩增异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)，GenBank登录号：949020，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
idi-上游：CCGCTCGAGGAAGGAGATATACATATGCAAACGGAACACGTCATTTTAT(SEQ IDNO.9)；
idi-下游：AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAG(SEQ ID NO.10)。
2.1.1.3大肠杆菌4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因（ispD）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因（ispF）克隆
提取大肠杆菌K12MG1655基因组DNA，根据载体pTrcHis2B设计引物，然后PCR扩增4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因（ispD）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因（ispF），GenBank登录号分别是：948269和945057，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
ispDF-上游：AACTGCAGGAAGGAGATATACATATGGCAACCACTCATTTGGATGTT(SEQ IDNO.11)；
ispDF-下游：CGGAATTCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC(SEQ ID NO.12)。
2.1.2表达载体构建
2.1.2.1pTrcHis2B-dxs载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pTrcHis2B分别用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pTrcHis2B-dxs，再进行双酶切和测序验证。
2.1.2.2pTrcHis2B-dxs-idi载体构建
将胶回收后的idi基因与载体pTrcHis2B-dxs分别用XhoⅠ和PstⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi，再进行双酶切和测序验证。
2.1.2.3pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF载体构建
将胶回收后的ispDF基因与载体pTrcHis2B-dxs-idi分别用PstⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，然后从阳性克隆中提取重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF，再进行双酶切和测序验证。见图2。
2.2重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）构建
将质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化进入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，涂布与含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）。
2.3重组菌株发酵
分别在LB液体培养基中接种重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）、pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3），接种量为10μL/2mL，37℃，220r/min培养过夜。第二天转接入新的LB液体培养基中，接种量为500μL/50mL，30℃，250r/min，培养2h，待OD600=0.1左右时，添加终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导。培养24小时后，取样进行含量测定。
2.4发酵液中β-胡萝卜素含量测定
2.4.1β-胡萝卜素标准曲线制作
2.4.1.1β-胡萝卜素标准溶液配制
精确称取β-胡萝卜素12.5mg与烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转至50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg/mL，-18℃储存备用，2个月内稳定。根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准溶液稀释成100μg/mL
2.4.1.2β-胡萝卜素使用液配制
分别吸取β-胡萝卜素标准溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6mL与10mL容量瓶中，各加石油醚：丙酮（体积比8:2）至刻度，即得β-胡萝卜素标准系列，分别含有β-胡萝卜素1、2、3、4、5、6μg/mL。
2.4.1.3β-胡萝卜素标准曲线绘制
利用紫外分光光度计（Ultrospec2100pro，GE）测定β-胡萝卜素标准系列的吸光度，然后绘制成标准曲线。
2.4.2发酵液中β-胡萝卜素含量测定
取1ml发酵液14000r/min离心5min，弃上清，取菌泥沉淀，用1ml石油醚：丙酮（体积比8:2）悬浮，接着14000r/min离心10min，将含有β-胡萝卜素的上清液转移至新离心管，反复数次至菌体无色，然后利用紫外分光光度计测定其在453nm下的吸光度，依据标准曲线计算β-胡萝卜素含量。重组菌株pACYC184-M-crt（DE3）、pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt（DE3）发酵液中β-胡萝卜素含量分别是2.42μg/mL、18.96μg/mL。见图5。
Claims (9)
1.一种生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF；所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒pET32a(+)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌基因工程菌的培养方法包括接种于LB培养基中进行培养，培养至菌体浓度至诱导浓度时加入诱导剂IPTG，即表达导入的外源基因。
3.一种高产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF，所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒pET32a(+)。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的载体骨架是质粒pTrcHis2B。
5.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体为含有包括该四基因的β-胡萝卜素合成基因簇的表达载体。
6.如权利要求5所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的β-胡萝卜素合成基因簇是来自成团泛菌CGMCC NO.1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇。
7.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体是质粒pACYC184-M-crt。
8.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备而得：
(1)基因克隆
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
(2)表达载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pET32a(+)分别用NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs，
将胶回收后的idi基因与载体pET32a(+)-dxs分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi，
将胶回收后的ispDF基因与载体pET32a(+)-dxs-idi分别用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF；
(3)转化宿主细胞
将质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)；
或者，由包括以下步骤的方法制备而得：
(1)基因克隆
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示,
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示,
以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
(2)表达载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pTrcHis2B分别用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs，
将胶回收后的idi基因与载体pTrcHis2B-dxs分别用XhoⅠ和PstⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi，
将胶回收后的ispDF基因与载体pTrcHis2B-dxs-idi分别用PstⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF；
(3)转化宿主细胞
将质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)。
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| 生产β 胡萝卜素大肠杆菌工程菌的构建;刘敏等;《药物生物技术》;20071231;第14卷(第1期);第1-4页 * |
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