CN105838725A - 一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法 - Google Patents

一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高烟草中β‑胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法。所述NtDXS1基因序列如SEQ ID NO：1所示，所示提高烟草中β‑胡萝卜素的方法，包括以下步骤：A、获取NtDXS1基因；B、构建含NtDXS1基因序列的载体，作为表达载体；C、使用表达载体转染烟草植株，并使烟草植株过量表达NtDXS1基因。将所述NtDXS1基因导入烟草中，并通过35S启动子驱动NtDXS1基因过量表达，提高了β‑胡萝卜素的含量。

Description

一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法。
背景技术
烟草是我国主要的经济作物之一，种植面积和产量均居世界首位。烟草香气是评价烟叶和卷烟制品内在质量优劣的重要指标之一，一直以来改善烟草香气质量是育种工作者苦苦追求的目标。其中烟草中的单萜、双萜及四萜等物质是烟草重要致香前提物，四萜化合物的代表是β-胡萝卜素，它是烟叶中重要的致香物前体物，其降解产物如大马酮、紫罗兰酮、巨豆三烯酮等是烟叶中重要的中性香味成分。另外，烟草是典型的基因工程模式植物，目前烟草已经作为生物反应器成功应用于多种药用蛋白、抗体以及疫苗的生产。
有针对性的提高烟草品种中β-胡萝卜素的含量，可以提升烟草致香前体物含量，提高烟草品质。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因和方法。本申请的发明人，将所述NtDXS1基因导入烟草中，并通过35S启动子驱动NtDXS1基因过量表达，提高了β-胡萝卜素的含量。
1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是萜类物质合成途径MEP途径的第一个关键酶,是单萜和双萜类芳香物质、类胡萝卜素(四萜)、VE和叶绿素等重要物质合成的关键调控位点。
在烟草基因组中，共有5个DXS家族基因，本发明中利用的DXS基因编号为1的DXS基因，为描述简便起见，根据烟草的学名Nicotiana tabacum.，本发明中，将所述基因命名为：NtDXS1基因。
本发明所采用的技术方案为：一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列，所述NtDXS1基因序列如SEQ ID NO：1所示。
根据所述的NtDXS1基因序列，本发明还提供了一种使用所述NtDXS1基因序列提高烟草中β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：
A、获取NtDXS1基因；
B、构建含NtDXS1基因序列的载体，作为表达载体；
C、使用表达载体转染烟草植株，并使烟草植株过量表达NtDXS1基因。
根据本发明的实验例，通过将所述NtDXS1基因导入烟草中，并通过35S启动子驱动NtDXS1基因过量表达，与野生型烟草叶片相比，转基因烟草叶片的β-胡萝卜素的含量增加。
步骤A中，根据权利要求1所述的基因系列，人工合成所述NtDXS1基因；
或者，从烟草中提取所述NtDXS1基因：使用烟草作为原料，在限制酶的作用下，使用NtDXS-F作为上游引物，NtDXS-R作为下游引物对所述NtDXS1基因进行PCR扩增，得到所述NtDXS1基因的PCR产物；其中，NtDXS-F的序列如SEQ ID NO：2所示，NtDXS-R的序列如SEQ ID NO：3所示。
步骤A中，所述限制酶为SpeI酶和SacI酶，所述SpeI酶的酶切位点为：ACTAGT，所述SacI酶的酶切位点为：GAGCTC。
步骤B中，将步骤A中得到的NtDXS1基因用SpeI酶和SacI酶酶切，得到的酶切产物与经过相同SpeI酶和SacI酶酶切的PYG57-GFP载体连接，得到表达载体。
其中PYG57-GFP载体为常用的载体，所述PYG57-GFP载体的序列如SEQID NO：12所示。当然，本领域技术人员也可使用其他的通用载体，如pCX-GUS、pEarleyGate 100等，在此就不再赘述。
步骤B中，还包括所述表达载体的验证步骤：将表达载体转化大肠杆菌感受态，获得转化子，提取转化子的质粒并对质粒进行测序，以检验所述NtDXS1基因是否插入PYG57-GFP载体中SpeI和SacI酶切位点之间。
步骤C中，将步骤B中得到的表达载体转入根瘤农杆菌中，获得单克隆重组菌。
步骤C中，将所述单克隆重组菌侵染烟草的叶片，并将侵染后的叶片进行脱分化、分化培养后，得到T0代转NtDXS烟草植株。
步骤C中，还包括对NtDXS1基因的鉴定步骤和对转NtDXS烟草植株RNA水平的鉴定；
对NtDXS1基因的鉴定步骤为：取T0代转NtDXS烟草植株，使用35S-F作为上游引物，35S-R作为下游引物对NtDXS1基因进行检测；其中，35S-F的序列如SEQ ID NO：4所示，35S-R的序列如SEQ ID NO：5所示。
对转NtDXS烟草植株RNA水平的鉴定，包括以下步骤：
①提取T0代转NtDXS烟草植株中的总RNA，进行cDNA反转录；
②将中得到的cDNA反转录产物，使用DXS-qF作为上游引物，DXS-qR作为下游引物，进行PCR扩增，得到序列长度为190bp的PCR产物；其中DXS-qF的序列如SEQ ID NO：6所示，DXS-qR的序列如SEQ ID NO：7所示，序列长度为190bp的PCR产物的序列如SEQ ID NO：8所示；
③利用荧光染料法对中得到的PCR产物进行相对荧光定量PCR反应：使用actin-qF作为上游引物，actin-qR作为下游引物；其中actin-qF的序列如SEQ IDNO：9所示，actin-qR的序列如SEQ ID NO：10所示。
在步骤C后，还包括D、对烟草植株中β-胡萝卜素含量的检测步骤：使用SPE-LC-MS法测定烟草植株中β-胡萝卜素含量。
需要说明的是，DXS-qF和DXS-qR是根据NtDXS1基因CDS序列信息，设计的荧光定量检测上、下游引物，分别命名为DXS-qF和DXS-qR；actin-qF和actin-qR为使用通用的内参引物，分别命名为actin-qF和actin-qR。
当然，以上方法中DNA全序列人工合成的方法、限制酶的选择、载体的选择、转染菌种的选择、遗传物质以及β-胡萝卜素含量的鉴定方法，本领域技术人员根据本发明中的技术精神，通过现有技术均可得到，在此就不在赘述。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列和方法。本申请的发明人，在分析得到所述NtDXS1基因序列后，深入研究烟草中DXS参与的代谢机理，通过将所述将所述NtDXS1基因导入烟草中，并通过35S启动子驱动NtDXS1基因过量表达，与野生型烟草叶片相比，提高了β-胡萝卜素的含量。
附图说明
图1是实施例3中对NtDXS1基因的检测结果图；
图2是实施例3中NtDXS1基因的相对表达量的检测结果图；
图3是实施例3中烟草植株中β-胡萝卜素含量的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例3中使用的烟草，为红花大金元纯系，简称为野生型烟草，购自中国农业科学院烟草研究所。种植在中国农业科学院烟草研究所实验基地，烟草成熟期取中部叶片组织液氮速冻后-80℃保存用于荧光定量检测，取中部叶片冷干后磨样4℃保存用于进行致香物质含量检测。
实施例1
一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列，述NtDXS1基因序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2
烟草中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)，即NtDXS的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
实施例3
一种使用所述NtDXS1基因序列提高烟草中β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：
A、获取NtDXS1基因；
取1克烟草品种红花大金元幼嫩叶片，液氮速冻后迅速用研钵研碎，进行总RNA提取、cDNA反转录。
根据所述NtDXS1基因序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增出完整编码框的上、下游引物，上游和下游引物序列中分别包括限制性酶切位点，以便构建表达载体。使用NtDXS-F作为上游引物，NtDXS-R作为下游引物对所述NtDXS1基因进行PCR扩增，得到所述NtDXS1基因的PCR产物；其中，NtDXS-F的序列如SEQ ID NO：2所示，NtDXS-R的序列如SEQ ID NO：3所示。
本步骤中，所述限制酶为SpeI酶和SacI酶，所述SpeI酶的酶切位点为：ACTAGT，所述SacI酶的酶切位点为：GAGCTC。
进行PCR扩增后，得到约2154bp的PCR产物。
B、构建含NtDXS1基因序列的载体，作为表达载体；
将步骤A中得到的NtDXS1基因用SpeI酶和SacI酶酶切，得到的酶切产物与经过相同SpeI酶和SacI酶酶切的PYG57-GFP载体连接，得到表达载体。
将连接产物转化大肠杆菌感受态，获得转化子。提取转化子的质粒，进行测序，测序结果显示，该质粒为将NtDXS1基因插入PYG57-GFP载体中SpeI和SacI酶切位点之间，将所述表达载体命名为PYG57-NtDXS-GFP。
C、使用表达载体转染烟草植株，并使烟草植株过量表达NtDXS1基因。
将步骤B中得到的表达载体转入根瘤农杆菌(LBA4404)中，获得单克隆重组菌产物进行PCR验证，提取质粒并测序。结果表明，该质粒为PYG57-NtDXS-GFP，含NtDXS1基因的表达载体已成功构建到根瘤农杆菌中。将含有该质粒的单克隆重组菌命名为LBA4404/PYG57-NtDXS-GFP。
将所述LBA4404/PYG57-NtDXS-GFP侵染品种为红花大金元烟草的叶片，所述单克隆重组菌侵染了100个1cm2的方形叶盘，并将侵染后的叶片进行脱分化、分化出的芽培养后，经过50mg/L的卡那霉素抗生素抗性筛选，最后移栽成活得到32株T0代转NtDXS烟草植株。
对NtDXS1基因的鉴定：取T0代转NtDXS烟草植株，根据CaMV35S的序列设计上游引物，根据NtDXS1基因的序列设计下游引物对NtDXS1基因进行检测，本实施例中使用35S-F作为上游引物，35S-R作为下游引物对NtDXS1基因进行检测；其中，35S-F的序列如SEQ ID NO：4所示，35S-R的序列如SEQID NO：5所示。检测结果如图1所示，图1说明，利用上述引物扩增出400bp的特异DNA片段。而以非转化烟草基因组DNA为模板时，没有扩增出任何条带。
对转NtDXS烟草植株RNA水平的鉴定，包括以下步骤：
①提取T0代转NtDXS烟草植株中的总RNA，进行cDNA反转录；
②将中得到的cDNA反转录产物，使用DXS-qF作为上游引物，DXS-qR作为下游引物，进行PCR扩增，得到序列长度为190bp的PCR产物；其中DXS-qF的序列如SEQ ID NO：6所示，DXS-qR的序列如SEQ ID NO：7所示，序列长度为190bp的PCR产物的序列如SEQ ID NO：8所示；
③利用荧光染料法对中得到的PCR产物进行相对荧光定量PCR反应：使用actin-qF作为上游引物，actin-qR作为下游引物；其中actin-qF的序列如SEQ IDNO：9所示，actin-qR的序列如SEQ ID NO：10所示。
采用Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TakaRa公司)的试剂盒以及操作说明书进行，每个样品设三次重复。通过ABI 7500Fast Real-TimePCR System的SDSShell.exe分析系统分析NtDXS1基因的相对表达量，检测结果见图2。由图2可知，野生型烟草的NtCHS基因的表达水平低，而T0代转NtDXS烟草植株中，DXS-01和DXS-02均过量表达，DXS-02表达量更高。
D、对烟草植株中β-胡萝卜素含量的检测
使用SPE-LC-MS法测定烟草植株中β-胡萝卜素含量，本实施例直接参考以下文献进行：贾春晓,张瑾洁,朱永华.烟草中β-胡萝卜素化合物含量的SPE-LC-MS法测定[C]//河南省化学会2014年学术年会论文摘要集.2014.
检测结果如图3所示，由图3可知，转NtDXS烟草植株中β-胡萝卜素含量得到了不同程度的提高，DO1中β-胡萝卜素含量较野生型烟草提高了7.4％，DO2中β-胡萝卜素含量较野生型烟草提高了12.6％。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高烟草中β-胡萝卜素含量的NtDXS1基因序列，其特征在于，所述NtDXS1基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种使用权利要求1所述NtDXS1基因序列提高烟草中β-胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、获取NtDXS1基因；
B、构建含NtDXS1基因序列的载体，作为表达载体；
C、使用表达载体转染烟草植株，并使烟草植株过量表达NtDXS1基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中，根据权利要求1所述的基因系列，人工合成所述NtDXS1基因；
或者，从烟草中提取所述NtDXS1基因：使用烟草作为原料，在限制酶的作用下，使用NtDXS-F作为上游引物，NtDXS-R作为下游引物对所述NtDXS1基因进行PCR扩增，得到所述NtDXS1基因的PCR产物；其中，NtDXS-F的序列如SEQ ID NO：2所示，NtDXS-R的序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A中，所述限制酶为SpeI酶和SacI酶，所述SpeI酶的酶切位点为：ACTAGT，所述SacI酶的酶切位点为：GAGCTC。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤B中，将步骤A中得到的NtDXS1基因用SpeI酶和SacI酶酶切，得到的酶切产物与经过相同SpeI酶和SacI酶酶切的PYG57-GFP载体连接，得到表达载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤B中，还包括所述表达载体的验证步骤：将表达载体转化大肠杆菌感受态，获得转化子，提取转化子的质粒并对质粒进行测序，以检验所述NtDXS1基因是否插入PYG57-GFP载体中SpeI和SacI酶切位点之间。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤C中，将步骤B中得到的表达载体转入根瘤农杆菌中，获得单克隆重组菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤C中，将所述单克隆重组菌侵染烟草的叶片，并将侵染后的叶片进行脱分化、分化培养后，得到T0代转NtDXS烟草植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤C中，还包括对NtDXS1基因的鉴定步骤和对转NtDXS烟草植株RNA水平的鉴定；
对NtDXS1基因的鉴定步骤为：取T0代转NtDXS烟草植株，使用35S-F作为上游引物，35S-R作为下游引物对NtDXS1基因进行检测；其中，35S-F的序列如SEQ ID NO：4所示，35S-R的序列如SEQ ID NO：5所示。
对转NtDXS烟草植株RNA水平的鉴定，包括以下步骤：
①提取T0代转NtDXS烟草植株中的总RNA，进行cDNA反转录；
②将①中得到的cDNA反转录产物，使用DXS-qF作为上游引物，DXS-qR作为下游引物，进行PCR扩增，得到序列长度为190bp的PCR产物；其中DXS-qF的序列如SEQ ID NO：6所示，DXS-qR的序列如SEQ ID NO：7所示，序列长度为190bp的PCR产物的序列如SEQ ID NO：8所示；
③利用荧光染料法对②中得到的PCR产物进行相对荧光定量PCR反应：使用actin-qF作为上游引物，actin-qR作为下游引物；其中actin-qF的序列如SEQID NO：9所示，actin-qR的序列如SEQ ID NO：10所示。
10.根据权利要求2-9所述的方法，其特征在于，在步骤C后，还包括D、对烟草植株中β-胡萝卜素含量的检测步骤：使用SPE-LC-MS法测定烟草植株中β-胡萝卜素含量。
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