CN103352049A - 一种转座因子载体及其转基因后代的筛选方法 - Google Patents

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赵建华
李军
周洁
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本发明涉及一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体及其转基因后代的筛选方法，该载体通过以下步骤构建：1）将绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶基因（AcTPase）和Ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pLJ26，其中Ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个AscI单酶切位点；2）构建一个在多克隆位点两侧均含有AscI酶切位点的中间载体pLJ16，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到Ds因子内部。本发明把基于GFP荧光标记的负选择技术与基于PCR的正选择技术相结合，在转基因后代依次淘汰含有T-DNA的个体和选择含有目的基因的无选择标记个体，从而提高转基因后代的筛选效率。

Description

一种转座因子载体及其转基因后代的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种转基因研究领域，尤其是一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体及其转基因后代的筛选方法。
背景技术
DNA载体应用于植物遗传转化研究领域时，通常会包含一个能表现抗生素抗性或除草剂抗性的选择标记基因，以提高转化细胞的筛选效率。然而，转基因植株中的标记基因可能会对人体产生毒性或者过敏反应，也可能会造成严重的环境灾难，这些因素严重地限制了转基因技术在实践中的应用。因此，近年来，建立高效而可靠的无选择标记转基因技术，已成为转基因育种应用的研究热点。
作为获得无选择标记转基因植株的一种方法，转座子技术利用玉米Ac/Ds转座因子，将目的基因与抗生素抗性选择标记一起导入植物基因组，通过Ds元件的转座跳跃使得目的基因与选择标记发生遗传重组，从而产生无选择标记的转基因后代。转座子技术相对于其他无选择标记系统具有两个主要的优点：第一，通过Ds转座，可以从少数几个水稻转化事件衍生出在不同基因组位点整合和遗传稳定的转基因后代，所以该方法仅需要获得较少数目的T0转化植株。第二，带有目的基因的转座因子，在植物基因组中稳定转座后，其插入边界清楚、转基因DNA结构变异的频率较低，有利于目的基因的稳定表达。
最初，Goldsbrough设计的T-DNA转化载体含有NptII选择标记基因、无转座功能的顺式Ac转座酶基因以及嵌合在Ds元件中的GUS报告基因。在转化番茄之后，Ds/GUS元件转座到非连锁的位点，并在转化体自交之后与NptII发生分离，从而产生了去除NptII或者Ds/GUS的转基因后代。然而，稳定的Ds插入系的鉴定常常依赖于对大量的转基因后代进行Southern blot印记杂交分析，这种方法费力且效率低。而Ac/Ds转座因子顺式激活标签系统描述了一种高效的负选择过程，其T-DNA供体位点上的Ds元件与Ac转座酶基因和GFP标记相连，而GFP被用作负选择标记，以剔除那些含有T-DNA供体位点的后代；同时，代表转座事件的植株被嵌合在Ds元件的RFP所选择。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种可以从Ac/Ds转座因子载体的转基因后代中高效地筛选无选择标记转基因个体的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体，其特征是：通过以下步骤构建：1）将绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶基因（AcTPase）和Ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pLJ26，其中Ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个AscI单酶切位点；2）构建一个在多克隆位点两侧均含有AscI酶切位点的中间载体pLJ16，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到Ds因子内部。
作为优选，步骤1）具体地说，分别将不能移动的Ac转座酶基因（AcTPase）、绿色荧光蛋白基因（GFP）、具有转座能力的Ds因子以及潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）顺次组装为顺式Ac/Ds转座因子载体pLJ26；由于该载体同时含有AcTPase和Ds，所以当T-DNA转入植物细胞后，便会发生Ds的转座行为；在Ds内部设有一个稀有的八碱基AscI单酶切位点，以便再导入目的基因；随着Ds在植物基因组的跳跃，目的基因也会整合到基因组中新的位置；而HPT被用作转基因的抗性选择标记。
作为优选，步骤2）具体地说，在克隆中间载体pLJ16的多克隆位点两侧设计AscI双酶切位点，可以将任意不含该位点的目的基因组装其内，随后将目的基因从中间载体释放出来，导入到与之配套的Ds因子的AscI酶切位点。
一种转座因子载体的转基因后代的筛选方法，包含以下步骤：3）在转化水稻的过程中，GFP用作报告基因正向筛选T0代被转化的阳性植物细胞和植株，而在T1代以及后续分离世代，GFP用作负选择标记以筛查并淘汰含有T-DNA的GFP阳性植株，从而富集GFP阴性植株中非连锁的Ds（目的基因）转座事件；4）将GFP阴性植株的叶片混合成池，提取混池样品DNA并通过PCR检测目的基因，然后对阳性混池中的每一个体分别进行目的基因的检测，由此获得的阳性植株便是无选择标记的转基因个体。
作为优选，步骤3）具体地说，在愈伤组织的选择培养、分化培养乃至阳性T0植株的筛选等过程中，可以通过台式荧光检测器检测水稻的转化愈伤组织细胞和转基因植株的绿色荧光，以区分成功的转化事件和未成功的转化事件；从T0代阳性植株收获T1代种子，在其发芽之后，按照同样的方法观察T1代幼苗的绿色荧光，以负向选择的方式淘汰那些带有绿色荧光的含有T-DNA（包括GFP基因本身、潮霉素抗性选择标记、Ac转座酶）的T1代植株，同时，那些转座到T-DNA附近的非连锁转座事件也被剔除；最终，将非连锁的Ds（目的基因）转座事件富集到GFP阴性的无选择标记后代当中；T2代乃至更多的分离世代，也可以按照上述方法筛选非连锁的Ds（目的基因）转座事件。
作为优选，所述步骤4）具体地说，在转基因分离世代（T1、T2等），在完成GFP阳性植株的负选择之后，将5-8个GFP阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，提取混合池样品DNA，通过PCR检测目的基因，以筛选带目的基因的无选择标记混合池；然后对阳性混合池中每一个体分别进行目的基因的检测，从而获得带有目的基因的无选择标记植株。通过这种DNA混合手段，可以对GFP阴性群体中含有目的基因的无选择标记个体进行高通量的筛选。
发明有益的效果是：本发明将基于GFP荧光筛选的负选择方法，与基于GFP阴性混合池中目的基因的PCR检测的正选择方法相结合，建立两步筛选法，从而可以从Ac/Ds转座因子载体的转基因后代高效地筛选无选择标记的转基因个体。
附图说明
图1：获得无选择标记转基因植株的Ac/Ds转座子载体
A：pLJ26，转座子介导的转基因重新整合系统的通用载体；pLJ16，组装目的基因DNA片段的中间克隆载体；组装到pLJ16中的目的基因可以被AscI酶切下来并装入pLJ26中。AcTPase，Ac转座酶；GFP，绿色荧光蛋白；Ds，Ds转座元件；HPT，潮霉素磷酸转移酶；LB和RB，T-DNA左边界和右边界序列；
B：Ds介导的转基因重新整合示意图，在AcTPase存在的条件下，基于Ds的目的基因从T-DNA上切离并整合到非连锁的染色体位点。转座的Ds与T-DNA发生重组便产生无选择标记的T1代植株。GOI，目的基因；
C：pZJ53和pZJ54，获得无选择标记转Bt基因的转座子载体；Bt-1和Bt-2均编码Bt基因，后者比前者的5’端多含有一个叶绿体引导肽；
图2：无选择标记转基因水稻植株中Bt、HPT、GFP的PCR检测
11-1、14-1、22-1、29-1、30-1：pZJ53转空育131的T1代植株；13-1：pZJ53转浙粳22的T1代植株；7-1、16-1、30-1：pZJ54转空育131的T1代植株；Bt、HPT、GFP的片段大小分别为452bp、1116bp、294bp。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
实施例：以Bt抗虫基因为例，通过Ac/Ds转座载体，高效筛选无选择标记转基因抗虫水稻种质材料。
载体构建：首先，将绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶和Ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子通用载体pLJ26，随后将目的基因Bt导入Ds元件，形成终载体pZJ53或pZJ54。
其中产生无选择标记转基因植物的转座子通用载体pLJ26、目的基因中间载体pLJ16以及目的基因Bt的转座载体pZJ53和pZJ54，如图1所示。具体地说：利用特异性的引物将pWS32(GenBank accession AF433043)载体的3’Ds序列克隆至pMD19-T，获得载体pLJ11；将AscI接头（扩增序列为5’-phosphate-AGCTTGCGGCCGCGGCGCGCCG-3’和5’-GATCCGGCGCGCCGCGGCCGCA-3’）克隆至载体pCAMBIA-0380(GenBank accessionAF234290)的BglII和HindIII酶切位点，产生pWX01载体；将pWS32载体的5’Ds序列用EcoRI酶切下来，连至pWX01，获得载体pLJ20。pLJ11的3’Ds（AscI/SacI酶切）、pLJ20的5’Ds（AscI/HindIII酶切）与pCAMBIA-1300(GenBank accession AF234296)的SacI/HindIII酶切产物进行三片段连接，产生一个含有2.1Kb完整Ds元件的载体pLJ21。用SacI将Ds从pLJ21载体上切下，并连至pSQ5（Shaohong Qu,Aparna Desai,Rod Wing,Venkatesan Sundaresan(2008)A Versatile Transposon-Based Activation Tag Vector System for Functional Genomics in Cerealsand Other Monocot Plants.Plant Physiology146:189-199），得到转座子通用载体pLJ26。将水稻Act-1启动子、目的基因（Bt-1和Bt-2，Bt-2是在Bt-1的基础上添加了一段信号肽而成）以及T3A终止子组成的表达框组装到通用中间载体pLJ16，随后将其克隆至pLJ26的AscI位点，产生目的基因Bt的Ac/Ds转座载体pZJ53和pZJ54。载体经过酶切和测序验证正确之后，通过电激法分别转化农杆菌菌系EHA105。通过农杆菌介导的水稻转化方法将pZJ53或pZJ54转化水稻品种空育131、浙粳22，并获得转基因个体。
转Bt抗虫基因无选择标记后代植株的筛选：从T0代植株收获T1代种子，发芽后在荧光检测器下检测转基因植株的绿色荧光，大量、快速地筛除GFP阳性转基因后代植株(T1或T2)。取5-8个GFP阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，利用TPS法小量提取混池样品DNA，PCR检测混池样品的Bt基因，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32cycles；72℃延伸5min；4℃保存。然后分别提取阳性池中每一个体的DNA，再次用Bt引物进行PCR检测，以筛选带有目的基因的无选择标记植株（表1）。为了进一步确认所得的植株是否为无选择标记个体，又对其进行HTP以及GFP的PCR鉴定（图2），其反应程序同上。T2代乃至更多的分离世代，都可以按照上述方法筛选无选择标记转基因个体。通过这种DNA混合手段，可以对GFP阴性群体中含有目的基因的无选择标记个体进行高通量的筛选。
T1代水稻植株的二化螟抗性鉴定：将转Bt的无选择标记转基因水稻植株叶片用湿润的棉花保湿，置于指形管中，每管放入六头二龄二化螟幼虫，同时以未转化的受体水稻叶片作为对照组。每个株系设3个生物学重复，采用随机区组设计放置指形管。在饲虫后的连续四天内，每24小时观察1次试虫的成活情况，并统计其死亡率（表2）。
表1T1代无选择标记转Bt基因水稻植株的筛选
Figure BDA00003482292500051
Figure BDA00003482292500061
注：*显著水平(χ2 0.05＝3.84)；**极显著水平(χ2 0.01＝6.64)；ND，未检测。
表2T1代无选择标记抗虫转基因水稻植株的饲虫实验
Figure BDA00003482292500062
注：#11为pZJ53转空育131的T1代无选择标记转基因植株，#13为pZJ53转浙粳22的T1代无选择标记转基因植株。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种转座因子载体，其特征是：通过以下步骤构建：1）将绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶基因（AcTPase）和Ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pLJ26，其中Ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个AscI单酶切位点；2）构建一个在多克隆位点两侧均含有AscI酶切位点的中间载体pLJ16，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到Ds因子内部。
2.根据权利要求1所述的转座因子载体，其特征是：所述步骤1）具体地说，分别将不能移动的Ac转座酶基因（AcTPase）、绿色荧光蛋白基因（GFP）、具有转座能力的Ds因子以及潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）顺次组装为顺式Ac/Ds转座因子载体pLJ26；在Ds内部设有一个稀有的八碱基AscI单酶切位点，以便再导入目的基因。
3.根据权利要求1所述的转座因子载体，其特征是：所述步骤2）具体地说，在克隆中间载体pLJ16的多克隆位点两侧设计AscI双酶切位点，可以将任意不含该位点的目的基因组装其内，随后将目的基因从中间载体释放出来，导入到与之配套的Ds因子的AscI酶切位点。
4.根据权利要求1所述的转座因子载体转基因后代的筛选方法，包含以下步骤：3）在转化水稻的过程中，GFP用作报告基因正向筛选T0代被转化的阳性植物细胞和植株，而在T1代以及后续分离世代，GFP用作负选择标记以筛查并淘汰含有T-DNA的GFP阳性植株，从而富集GFP阴性植株中非连锁的Ds（目的基因）转座事件；4）将GFP阴性植株的叶片混合成池，提取混池样品DNA并通过PCR检测目的基因，然后对阳性混池中的每一个体分别进行目的基因的检测，由此获得的阳性植株便是无选择标记的转基因个体。
5.根据权利要求4所述的转座因子载体转基因后代的筛选方法，其特征是：所述步骤3）具体地说，在愈伤组织的选择培养、分化培养乃至阳性T0植株的筛选等过程中，可以通过台式荧光检测器检测水稻的转化愈伤组织细胞和转基因植株的绿色荧光，以区分成功的转化事件和未成功的转化事件；从T0代阳性植株收获T1代种子，在其发芽之后，按照同样的方法观察T1代幼苗的绿色荧光，以负向选择的方式淘汰那些带有绿色荧光的含有T-DNA的T1代植株，同时，那些转座到T-DNA附近的非连锁转座事件也被剔除；最终，将非连锁的Ds（目的基因）转座事件富集到GFP阴性的无选择标记后代当中；T2代乃至更多的分离世代，也可以按照上述方法筛选非连锁的Ds（目的基因）转座事件。
6.根据权利要求4所述的转座因子载体转基因后代的筛选方法，其特征是：所述步骤4）具体地说，在转基因分离世代，在完成GFP阳性植株的负选择之后，将5-8个GFP阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，提取混合池样品DNA，通过PCR检测目的基因，以筛选带目的基因的无选择标记混合池；然后对阳性混合池中每一个体分别进行目的基因的检测，从而获得带有目的基因的无选择标记植株。
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