KR20210047992A

KR20210047992A - 알파-휴물렌 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210047992A
Application number: KR1020190131159A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 덕 안 뉴엔; 이옥경
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-05-03
Also published as: KR102286815B1

Abstract

본 발명은 메탄으로부터 알파-휴물렌(a-humulene) 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 항산화, 항염, 항균작용 및 함암작용을 가지는 것으로 알려진 알파-휴물렌을 생산할 수 있고 포도당 기반이 아닌 저가의 탄소원인 메탄을 이용하므로 생산단가를 감소시킬 수 있어서 매우 유용하다.

Description

알파-휴물렌 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도{Transformed methanotrophs for producing a-humulene production from methane and uses thereof}

본 발명은 메탄으로부터 알파-휴물렌(a-humulene) 생성능을 가지는 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 알파-휴물렌의 제조방법에 관한 것이다.

이소프레노이드(Isoprenoids)는 식물, 동물 및 미생물을 포함한 많은 생물체의 2차 대사산물로써 의약품, 화장품 및 바이오 연료에 광범위하게 사용되고 있다.이소프레노이드(isoprenoid)는 낮은 생산성과 추출 방법의 어려움으로 인하여, 대장균과 같은 미생물에 식물 유래 이소프레노이드 생합성 경로를 도입하여 생물학적 전환을 통하여 생산하는 것이 더 매력적이다.

수년 동안, 대사공학적으로 개량된 대장균을 이용하여 높은 생산성을 가지고 다양한 이소프레노이드가 생산되어 왔다. 여러 종류의 이소프레노드 중에서, 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)는 7,000개 이상의 물질이 알려진 이소프레노드의 가장 큰 하위 그룹군이며, 화학 물질(예: farnesol, artemisinin) 및 바이오 연료 대체물(예: farnesene, bisabolene 및 휴물렌)로 사용되고 있다. 세스퀴테르페노이드는 자연적으로 C15 골격을 보유하고, 파르네실 2인산(farnesyl pyrophosphate, FPP)로부터 합성된다. FPP는 2몰의 이소펜 테닐피로인산(IPP) 및 1몰의 디메틸알릴 피로 포스페이트(DMAPP)의 축합에 의해 형성되며 IPP 및 DMAPP는 일반적으로 메발로산(mevalonate, MVA) 경로 또는 메틸에리트리톨 포스페이트(methylerythritol phosphate, MEP) 경로를 통해 생성된다고 알려져 있으며, 대장균의 MEP 경로의 상향 조절 또는 외래 MVA 경로의 도입을 통하여 효율적인 세스퀴테르페노이드 생산이 가능하다.

이소프레노이드 생산을 위하여 사용되는 기질은 주로 포도당으로 기질 단가가 높기 때문에 이소프레노이드 생산 공정 비용을 향상시킬 수 있어, 이를 대체할 저렴한 차세대 탄소 공급원으로 메탄 및 메탄올과 같은 C1 탄소원이 고려되고 있으며, 메탄을 유일 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 메탄자화균을 이용한 메탄의 생물학적 이소프레노이드 생산은 향후 유망한 생명공학기술로 평가받을 수 있다. 세스퀴테르페노이드의 한 종류인 휴물렌은 항면역 및 항암치료제로 많은 관심을 받고 있으며 다양한 미생물을 이용한 바이오 생합성이 연구 중에 있으나, 아직까지 메탄자화균을 이용한 생합성 방법은 보고된 바 없다.

(001) J Microbiol Biotechnol. 2015 Mar;25(3):375-80. (002) Sci Rep. 2018 Feb 6;8(1):2512. doi: 10.1038/s41598-018-20574-z.

이에 본 발명자들은 저렴한 탄소원인 메탄을 이용하여 알파-휴물렌을 생산할 수 있는 형질전환 메탄자화균을 개발하고, MEP 경로의 재설계를 통한 FPP 또는 NADPH 공급 풀 증가를 위한 경로 재설계 및 포스포케돌레이즈 경로의 도입을 통하여 알파-휴물렌 생산성 증대 기술을 완성하였다.

본 발명은 알파-휴물렌 합성효소(a-humulene synthase, zssl) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate, ispA)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균에 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성 효소(1-deoxy-xylulose-5-phosphate, dxs), (E)-4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐-디포스페이트 합성효소 ((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase, ispG)의 활성화이 강화된 알파-후물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균에 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase, pgi)의 활성이 약화 또는 불활성화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균에 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase, zwf2) 및 포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase, gnd)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균에 포스토케톨레이즈 (phosphoketolase, pkt)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균을 이용하여 메탄 기질로부터 알파-후물렌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 본 발명은 알파-휴물렌 합성효소(a-humulene synthase, zssl) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate, ispA)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환 메탄자화균에 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성 효소(1-deoxy-xylulose-5-phosphate, dxs), (E)-4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐-디포스페이트 합성효소 ((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase, ispG) 활성화이 강화된 알파-후물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환 메탄자화균에 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소 (glucose-6-phosphate isomerase, pgi)의 약화 또는 불활성화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환 메탄자화균에 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase 2, zwf 2) 및 포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase, pdg)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환 메탄자화균에 포스토케톨레이즈(phosphoketolase, pkt) 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

또한, 발명자들은 알파-휴물렌을 생산할 수 있는 방법으로, 메탄을 유일 탄소원으로 이용하여 예의 연구 노력한 결과, 놀랍게도 본 발명의 형질전환 메탄자화균을 이용할 경우 알파-휴물렌을 생산이 가능함을 확인하였다. 메틸로마이크로비움 트리코스포륨(Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z에 MEP(methylerythritol phosphate) 경로의 최적화, EMP 경로로의 대사 흐름 조절, 또는 NADPH 풀을 강화시킴으로써 메탄으로부터 알파-휴물렌을 생산 할 수 있음은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명을 통해 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.

본 발명의 용어 "알파-후물렌(α-humulene)"은 11-원고리를 함유하고 3개의 비접합된 C=C 이중 결합을 함유하는 3개의 이소프렌 단위로 이루어진 자연 발생 하나의 고리가 있는 세스퀴테르펜(monocyclic sesquiterpene, C₁₅H₂₄)이며, 이들 중 2 개는 삼중 치환되고 하나는 이중 치환된다. 또한, 바이오 디젤 연료로서 대체가 가능하기때문에 바이오 연료분야로 활용이 가능하다.

본 발명에서 용어 "메탄자화균(metahnotroph)"은 메탄을 주요 탄소원 또는 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 상기 메탄자화균은 본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 숙주 균주를 의미할 수 있으며, 본 발명의 목적상 메탄을 탄소원으로 사용하여, FPP를 거쳐 최종적으로 알파-후물린을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 알파-후물린을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 메탄, 메탄올, 메틸아민 등 C1 화합물을 에너지원으로 사용하는 메틸자화균(methylotroph) 중에서 메탄을 함께 사용할 수 있는 균주 또한 본 발명의 메탄화균에 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 상기 메탄자화균은 메탄 등 C1 화합물을 에너지원으로 사용할 수 있는 것인한 특별히 이에 제한되지 않으나, 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium) 또는 메틸로시너스 속(Methylosinus) 균주일 수 있으며, 구체적으로 메틸로마이크로비움 트리코스포륨(Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z일 수 있다. 이러한 메탄자화균을 이용한 바이오전환 공정의 경우, 비교적 저렴한 메탄을 탄소원으로 사용할 수 있어 경제적으로 유리하며, 대기 중의 메탄을 사용 가능하다는 점에서 온실가스의 방출 예방 등 환경적인 면에서도 장점이 있다. 또한, 기존에 포도당(glucose)을 이용한 공정 대비 산소의 손실이 없어 최종 생산 물질의 수율 또한 높다.

본 발명에서 용어 "형질전환 메탄자화균"은 상기 메탄자화균의 유전자를 도입하거나 또는 제거하여 형질을 전환시킨 균주를 의미한다.

알파-후물렌 생성효소(α-humulene synthase)를 코딩하는 유전자(zssl)는 Zingiber zerumbet 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 α-humulene synthase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate synthase"는 IPP와 DMAPP를 축합하여 FPP로 전환하는 효소이다.

상기 파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate synthase) 를 코딩하는 유전자(ispA)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 2의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 farnesyl pyrophosphate synthase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어 "1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소(1- deoxy-xylulose-5-phosphate synthase, dxs)"는 MEP 경로의 첫 단계로 피루베이트와 G3P를 축합시켜 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트(1- deoxy-xylulose-5-phosphate)로 전환하는 효소이다.

상기 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소(1- deoxy-xylulose-5-phosphate synthase)를 코딩하는 유전자(dxs)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 3의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 1- deoxy-xylulose-5-phosphate synthase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "4-히드록시-2-메틸부트-2-엔일-디스포스페이트 합성 효소((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase)"는 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MEC)를 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate(HMBPP)로 전환하는 효소이다.

상기 4-히드록시-2-메틸부트-2-엔일-디스포스페이트 합성 효소((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자(ispG)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 4의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "글루코즈-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase)"는 glucose 6-phosphate를 fructose 6-phosphate로 전환하는 효소로 가역반응이 가능하다.

상기 형질전환 메탄자화균에 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase)를 코딩하는 유전자(pgi)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 5의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 glucose-6-phosphate isomerase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다

본 발명에서 용어 "글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase)"는 glucose 6-phosphate를 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone으로 전환하는 효소로 1몰의 NADPH를 생산한다.

상기 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(zwf 2)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 6의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 6의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 glucose 6-phosphate dehydrogenase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase)"는 6-phosphogluconate를 ribulose 5-phosphate로 전환하는 효소로 1몰의 NADPH를 생산한다.

상기 포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gnd)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 7의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 phosphogluconate dehydrogenase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "포스포케톨레이즈 2(phosphketolase)"는 D-xylulose 5-phosphate를 acetyl phosphate로 전환하는 효소이다.

상기 포스포케톨레이즈 2(phosphoketolase)를 코딩하는 유전자(pkt2)는 M. alcaliphilum 20Z 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 8의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 8의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 phosphoketolase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서 용어 "강화"는 효소 또는 단백질의 활성이 야생형 또는그 내재적 활성에 비해 증가되는 것을 의미한다. 상기 효소 또는 단백질의 활성 강화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 알파-후물렌 생산용 형질전환 메탄자화균을 배양하는 단계를 포함하는, 알파-후물렌의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 "배양"은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 상기 환경 조건은 대표적으로 영양소,온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나뉠 수 있다. 본 발명의 형질전환 메탄자화균의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

구체적으로, 상기 배양은 상기 형질전환 메탄자화균으로부터 알파-후물렌을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 유가 배양 또는 주입배치 또는 반복 유가 배양 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 메탄자화균의 배양에 사용되는것으로 알려진 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있고, 메탄자화균에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 적절히 조절한 배지를 사용할 수있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 형질전환 메탄자화균의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 균주의 원활한 접촉을 위해, 150rpm 내지 300rpm,구체적으로 180rpm 내지 270rpm, 보다 구체적으로 200rpm 내지 250rpm으로 교반할수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 알파-후물렌의 제조방법은 상기 형질전환 메탄자화균을 메탄을 포함하는 배양액에 배양하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 배양액으로부터 알파-후물렌을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 알파-후물렌을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 알파-후물렌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 형질전환 메탄자화균은 메탄으로부터 항산화, 항염, 항균작용 및 함암작용을 가지는 것으로 알려진 알파-휴물렌을 생산할 수 있고, 포도당 기반이 아닌 메탄을 탄소원으로 이용하므로 생산단가를 감소시킬 수 있어 매우 유용하다.

도 1은 알파-휴물렌 생성을 위한 메탄자화균의 대사 경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 알파-후물렌 표준품과 형질전환 메탄자화균(pHM01 및 pHM02 균주)의 알파-휴물렌 시료를 GC-MS로 분석한 결과이다.
도 3은 pHM02 균주에 DXS 효소를 추가 도입하여 얻은 형질전환 메탄자화균 pHM03 균주의 알파-후물렌 생산성을 이전 균주와 비교한 그래프이다.
도 4는 형질전환 메탄자화균 pHM03 균주에서 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소를 결손시킨 후 후물렌 생산성을 비교한 그래프이다.
도 5의 A는 NADPH 풀을 늘리기 위해 인실리코 시뮬레이션을 통해 타겟 유전자를 예측한 결과이다.
도 5의 B는 NADPH 풀을 늘리기 위해 구축한 형질전환 메탄자화균의 알파-휴물렌 생산성을 비교한 그래프이다.
도 6의 A는 phosphoketolase를 통한 F6P 또는 X5P의 acyl phosphate로의 전환을 도식화한 그림이다.
도 6의 B는 pHM03 균주에 phosphoketolase를 추가 도입하여 얻은 pHM20 균주로부터 알파-휴물렌의 생산성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 후물렌의 생물학적 생산의 경제적 타당성을 향상시키기 위해 글루코스(glucose)보다 저렴한 메탄을 탄소원으로 이용하였다. 메탄으로부터의 휴물렌 생산을 위해 M. alcaliphilum 20Z를 이용하여 모델 플랫폼으로 이용하였다. Zingiber zerumbet 유래의 알파-휴물렌 합성효소를 M. alcaliphilum 20Z에 적합하도록 코돈 최적화한 후 이를 과발현시켜 초기 생산성을 0.04 mg/gDCW를 얻었다. FPP 풀을 향상시키기 위해 MEP 관련 주요 효소(IspA, IspG 및 Dxs)의 과발현을 통해 알파-휴물렌 생산성은 초기 균주에 비해 5배 증가하여 0.2 mg/gDCW를 얻었다. 그리고 탄소 핵심 대사 경로의 플럭스를 조절하기 위하여 glucose-6-phosphate isomerase를 결손시킴으로써 초기 균주대비 알파-휴물렌 생산량이 3배 증가하였다.

또한, 이차대사 산물 생합성에 필수적으로 요구되는 NADPH 풀을 증가시키기 위해 genome scale model을 사용하여 잠재적인 과발현 표적을 예측하고, 이를 과발현시켜 알파-휴물렌 합성에 미치는 영향을 분석하였다. 마지막으로 포스포케톨레이즈의 과발현이 알파-휴물렌 생산에 미치는 영향을 분석하고 본 발명을 완성하였다.

<실시예 1> 실험방법

<1-1> 세균 균주 및 성장 조건

본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드는 표 1에 기재하였다. M. alcaliphilum 20Z 세포는 NMS 배지를 사용하여 배양하였다. M. alcaliphilum 20Z 세포를 30℃, 230rpm에서 50ml의 NMS 배지를 함유하는 스크류 캡으로 밀봉 된 500ml 진탕형 플라스크에서 배양하였다. 가스 샘플 투입용 주사기(gas-tight syringe)를 사용하여 가스 치환에 의해 메탄을 30%(v/v)를 공급하고, 헤드 스페이스를 매일 30%(v/v) 메탄으로 새로 교체하였다. 세포의 밀도는 1.5ml 큐벳을 사용하는 Beckman 분광 광도계로 측정되하였다. 또한, 최종 농도가 50 ㎍/ml인 카나마이신(Km)을 사용하여 형질전환 메탄자화균의 선별하였다.

균주	특징	문헌
Escherichia coli DH5α		Novagen
Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z	Used as the host strain	DMSZ
pHM00	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM00 vector for overexpression of zssl	This work
pHM01	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM01 vector for overexpression of zssl along with ispA from E. coli	This work
pHM02	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM02 vector for overexpression of zssl along with ispA from M. alcaliphilum 20Z	This work
pHM03	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM03 vector for overexpression of zssl along with ispA, dxs and ispG from M. alcaliphilum 20Z	This work
M. alcaliphilum 20Z pgi	M. alcaliphilum 20Z with deletion of glucose-6-phosphate isomerase	This work
M. alcaliphilum 20Z pgi-pHM03	M. alcaliphilum 20Z pgi harboring pHM03 vector	This work
pHM13	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM13 vector for overexpression of zssl along with ispA, dxs, ispG and pntAB from M. alcaliphilum 20Z	This work
pHM14	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM14 vector for overexpression of zssl along with ispA, dxs, ispG and zwf1 from M. alcaliphilum 20Z	This work
pHM15	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM15 vector for overexpression of zssl along with ispA, dxs, ispG and zwf1-gnd from M. alcaliphilum 20Z	This work
pHM20	M. alcaliphilum 20Z harboring pHM20 vector for overexpression of zssl along with ispA, dxs, ispG and ptk2 from M. alcaliphilum 20Z	This work

<1-2> 유전자 변형을 위한 프라이머 및 수행 방법

본 발명은 표 2에 제시된 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭 및 클로닝하였다. M. alcaliphilum 20Z의 gDNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, USA)로 분리하였고, Lamp Pfu 중합 효소(BioFACT, Daejeon, Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였으며, Gibson 어셈블리 키트를 이용하여 재조합 벡터를 구축하였다. 올리고머 합성 및 DNA 서열 분석은 Macrogen(Korea)에 의해 수행되었다.

이름	서열	서열번호	프라이머 설명
pAWP89-For	TAGTTGTCGGGAAGATGCGT	9	For amplifying pAWP89 backbone which contained P_tac promoter and SD sequence
pAWP89-Rev	AGCTGTTTCCTGTGTGAATA	10
zssl-89-For	ttcacacaggaaacagctATGGAACGGCAATCGATGGC	11	For amplifying zssl and ligated into pAWP89, resulting in pHM00
zssl-89-Rev	gcatcttcccgacaactaTCAGATCAAAAACGATTCAACA	12
zssl-pLC291-For	tcagtgatagagaggtacATGGAACGGCAATCGATGGC	13	For pHM01 and pHM02 vectors construction. zssl, ispA from 20Z (for pHM02) and E.coli MG1655 (for pHM01) were amplified and ligated into pLC291 vector, resulting in pLC291-zssl-ispA vector. The whole fragment containing zssl, ispA was then amplified and ligated into pAWP89 backbone.
zssl-pLC291-Rev	cgtagatcttctagaggtacTCAGATCAAAAACGATTCAACA	14
ispA-pLC291-For	gatctgagtacctctagaaAATAAGGAGCAATCCAATGAGTAACGCACTGAAAGACT	15
ispA-pLC291-Rev	catgcactagtacgcgtaTTAATGATCTCGCTGGATAA	16
zssl-89-For	ttcacacaggaaacagctATGGAACGGCAATCGATGGC	17
ispA-89-Rev	gcatcttcccgacaactaTTAATGATCTCGCTGGATAA	18
ispA-MG1655_For	aaaataaggagcaatccaAATAAGGAGCAATCCAATGGACTTTCCGCAGCAACT	19
ispA-MG1655_Rev	gcatcttcccgacaactaTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTC C	20
ispG-For	ttgcgcgtgatacgcgtaCAGCAATAGAGAATATAAA CACTAAGGAGGTCAAACATGTCAATCAGCCCAAGAAA	21	For pHM03 vectors construction, dxs and ispG from 20Z were amplified from 20Z and ligated into pLC291-zssl-ispA vector. The whole fragment containing zssl, ispA, dxs and ispG was then amplified and ligated into pAWP89 backbone.
ispG-Rev	ccggtgagctcgcatgcaCTACTGAGCTGTGGTTCCGT	22
dxs-20Z-For	gagatcattaatacgcgtaCAATCCCCATATCTCACAAAATATATAAGGAGGTCAACATGAAAATCACAGGAAATTTCCCCC	23
dxs-20Z-Rev	ccggtgagctcgcatgcaTCACGCGCAAAATTGCTCG	24
pCM351-pgi-F1-For	cagctgtacaattggtacGTCAGGCATTTGCGGTGTTT	25	For amplifying flanks to knockout pgi then ligated into pCM351 vector opened by KpnI
pCM351-pgi-F1-Rev	catatgcatccatggtacCAAATGGGCGTTGAACTGGG	26
pCM351-pgi-F2-For	cgtgttaaccggtgagctTGAACGCGTGTCTTCTGTGA	27	For amplifying flanks to knockout pgi then ligated into pCM351-pgi-F1 vector opened by SacI
pCM351-pgi-F2-Rev	tggatcctctagtgagctCAAGCCCATAAGCGCTAGGA	28
20Z-PGI-Out-For	TTGGAGCTTGGCTTGCCTTA	29	Primers were designed in out of flank regions to confirmed the knockout of pgi
20Z-PGI-Out-Rev	GCACAAAACTCTTCGGCTGG	30
zwf2-20Z-For	cggaaccacagctcagtagAGGAAACAGCTATGAAATCAAATCAA AAATTCAAACCTTGC	31	zwf2 was amplified from 20Z and ligated into linear pHM03, resulting in pHM14
zwf2-20Z-Rev	gcatcttcccgacaactaTTACTCTTCCCAAGCCCGTC	32
pdg-20Z-89-For	cggaaccacagctcagtagAGGAAACAGCTATGAAAGCGAAT ATCGGTTTAATCGG	33	pdg-zwf1 operon was amplified from 20Z and ligated into linear pHM03, resulting in pHM15
pdg-20Z-89-Rev	gcatcttcccgacaactaTTACTGGCACCACTCCGG	34
pkt2-2-89-For	CGGAACCACAGCTCAGTAGAGGAAACAGCTATGAATACACAA ACTCTGAATCCTGA	35	pkt2 was amplified from 20Z and ligated into linear pHM03, resulting in pHM19
pkt2-2-89-Rev	gcatcttcccgacaactaTCATCCTTTCCATTTCCAGTGAC	36

<1-3> 알파-후물렌의 생산 방법

알파-후물렌 생산 플라스미드를 보유한 M. alcaliphilum 20Z를 30℃ 및 230 rpm에서 탄소 공급원으로서 30% 메탄을 보충하여 NMS 배지에서 배양하고, 스크류 캡으로 밀봉하였다. 액체 전 배양물을 180ml 진탕 플라스크(10 ml NMS 배지 포함)에서 한천 플레이트로부터 성장시켰다. 이어서, 예비 배양물을 알파-후물렌 생산을 위해 500ml 진탕 플라스크에서 유기상으로서 40ml 배지 및 10ml 도데칸(dodecane)에 접종하였다. 96시간의 배양 후, 50ml의 총 배양 부피를 5 ml 원심 분리 튜브에 따라 내고 3220g에서 10분 동안 원심 분리하였다. 알파-후물렌 분석을 위해 1 ml의 상부의 도데칸 층을 수득하여 분석하였다.

<1-4> 분석방법

알파-후물렌을 분석하고 HP-5MS 컬럼이 장착된 GC-MS(Agilent, USA)를 통해 정량화 하였다. 캐리어 가스: 헬륨; 250℃에서 분할 주입(8 : 1); 컬럼 흐름 : 2.2 ml/분; 인터페이스 온도: 250℃; 프로그램 : 3분 동안 80℃ 유지, 16℃/분~240℃, 2분 동안 유지. 알파-후물렌의 체류 시간은 8.7분이었다. 정량화를 위해, 시그마 (Sigma)로부터 구입한 알파-후물렌 표준의 교정 곡선을 사용하였다.

<1-5> M. alcaliphilum 20Z의 형질전환 방법

50 ml의 배양액을 OD₆₀₀= 0.4 내지 0.6 정도로 배양하고 배양된 균주는 5000× g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 회수된 세포는 50ml의 멸균수로 재현탁하였다 (2회 반복). 회수된 세포 펠렛은 100μL의 멸균주로 재현탁시키고 50㎕ 의 세포 현탁액에 500ng DNA 플라스미드를 넣어 혼합한 후 전기침공법을 이용한 형질전환을 실시하였다. Gene Pulser Xcell ™ 전기 천공 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 1.3kV, 25μF 및 200O에서 전기천공을 수행하였다. 전기천공 후 즉시, 1ml의 NMS를 세포에 첨가하여 회수된 세포를 0.1 % 메탄올을 함유하는 10ml NMS 배지옮겨 30℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 원심분리기 5000g에서 10분동안 원심분리하여 얻은 세포를 항생제가 첨가된 NMS 한천 배지에 평판 도말하였다.

<실시예 1> 알파-휴물렌 생산용 형질전환 메탄자화균의 제작

M. alcaliphilum 20Z는 MEP 경로를 통해 FPP를 생산하고 알파-후물렌 합성효소의 이종 발현에 통하여 알파-후물렌을 생산할 수 있다.

구체적으로, M. alcaliphilum 20Z에서 알파-휴물렌 합성하기 위하여 알파-휴물렌 합성효소를 도입한 pHM00 벡터를 구축하고 이를 야생형 균주 M. alcaliphilum 20Z에 도입하여 알파-휴물렌 0.04 mg/gDCW이 생산됨을 확인하였다.. FPP 공급 풀을 추가로 향상시키기 위해 pHM00 벡터에 M. alcaliphilum 20Z 유래의 FPP 합성 효소 (ispA)와 E. coli 유래의 ispA를 추가하여 각각 pHM01 및 pHM02 벡터를 구축한 후 M. alcaliphilum 20Z에 형질전환하여 pHM01 및 pHM02 균주를 제작하였다.

야생형 균주 M. alcaliphilum 20Z, pHM01 및 pHM02 균주의 알파-후물렌 생산량은 GC-MS를 이용하여 분석하였고(도 2), 야생형 M. alcaliphilum 20Z에서는 후물렌이 검출되지 않았으며, M. alcaliphilum 20Z 유래 ispA와 zssl를 공동 과발현한 pHM02 균주에서 0.14 mg/gDCW의 알파-후물렌을 생산하여 E. coli 유래의 ispA를 도입한 pHM02 균주보다 생산성이 우수하였다(도 2).

<실시예 2> 알파-휴물렌 생산성 향상을 위한 MEP 경로 최적화

MEP 경로의 첫 단계는 DXP synthase(dxs)에 의해 피루베이트와 G3P가 축합하여 1-deoxy-xylulose-5-phosphate(DXP)로 전환한다. dxs는 MEP 경로의 rate-limiting step으로 입증되었고, 최근에는 ispG도 MEP 경로의 rate-limiting step으로 알려졌있다. 이에 dxs와 ispG의 과발현을 통해 FPP 풀을 향상시켜, 알파-휴물렌 생산성을 향상시키고자 하였다.

그 결과, pHM03 균주(dxs와 ispG를 과발현한 균주)는 pHM02보다 알파-휴물렌 생산성이 1.5배 증가하여 2.0 mg/gDCW의 알파-휴물렌을 생산하였다(도 3).

<실시예 3> EMP 경로로의 플럭스 증가를 통한 알파-휴물렌 생산성 향상

알파-휴물렌 생산을 추가로 늘리기 위해 MEP 경로의 상위 단계를 살펴본 결과, DXP의 전구체인 G3P 및 피루베이트의 불균형은 알파-휴물렌 생산의 병목 단계으로 예측되었다. M. alcaliphilum 20Z에서는 세포 내 75% 피루베이트가 EMP 경로를 통해 생성되고 ED 경로로부터 25% 피루베이트로 생성되는 것으로 보고되어 있어, 본 발명에서는 핵심 탄소 경로인 EMP 경로로의 플럭스를 증가시키고자 하였다. 이를 위해 glucose-6-phosphate isomerase(pgi)를 결손시켜 M.alcaliphilum 20Z_Δpgi 균주를 구축하였고 PHM03 벡터를 도입하여 알파-휴물렌 생산성를 비교 평가하였다.

그 결과, M.alcaliphilum 20Z_Δpgi의 알파-휴물렌 생산성은 pHM03 균주(도 3)에 비해 3배 증가하여 0.62 mg/gDCW의 알파-휴물렌을 생산하였다(도 4).

<실시예 3> NADPH 공급 풀 향상을 통한 알파-휴물렌 생산

알파-휴물렌 생산성 향상을 위한 하나의 전략은 in silico simulation으로 도출된 NADPH 추가 공급을 위한 경로 재설계이다. MEP 경로 재설계에도 불구하고 생산성이 3배만 향상된 것은 중요한 cofactor인 NADPH pool이 낮은 것에 기인한 것으로 예상된다.

FBA 분석에서 대부분의 NADPH는 glucose 6-phosphate dehydrogenase(zwf) (62%)와 transhydrogenase(pntAB)(24%)에서 생성됨을 확인하였다. 또한, 유전체 및 전사체 분석에서, NADPH를 생산할 수 있는 phosphogluconate dehydrogenase(pgd)의 발현과 zwf2와 동시 전사가 발견되었다. 이들 NADPH 생성하는 효소들의 과발현은 NADPH의 공급 pool을 향상시킬 수 있으며, 그 결과 알파-휴물렌의 생산성도 향상시킬 것으로 기대하였다.

이에 zwf1, zwf2 및 pntAB operon의 과발현을 수행하였고, zwf1의 과발현은 대조군(pHM03) 대비 알파-휴물렌 생산성이 1.5배 증가하였고, pgd-zwf2 및 zwf1의 동시 과발현을 통한 RuMP cycle의 oxidative branch의 활성화는 pHM03 균주 대비 알파-휴물렌 생산성이 4배 향상된 반면, pntAB operon의 과발현은 pHM03 균주보다 후물렌 생산성이 감소하였다(도 5).

<실시예 4> 포스포케톨라아제(phosphoketolase) 도입을 통한 알파-휴물렌 생산

포스포케톨라아제(phosphoketolase) 경로는 EMP 경로에서 피루베이트 decarboxylation을 통해 손실되는 CO₂경로를 우회하여 아세틸-CoA를 생산하는 대안 경로이다. M. alcaliphilum 20Z는 M. buryatense와 유사한 포스포케톨라아제로 2 copy가 보존되어 있으며 이 효소는 메탄과 메탄올에서 배양했을 때 활성화됨을 확인하였다. 포스포케톨라아제 과발현 균주의 metabolite profiling을 살펴본 결과, 탄소 플럭스 변화를 관찰할 수 있었고, ptkB의 과발현은 세포 내 아세틸-CoA pool을 2배 증가할 뿐만 아니라, MEP 경로의 장점이 되는 피루베이트 pool도 7배 이상 증가하는 것으로 예측되었다. 이에 두 종류의 phosphoketolases 이성질체를 각각 과발현시켜 알파-휴물렌 생산에 영향을 미치는지 영향을 살펴보았다.

그 결과, ptk2를 과발현시키 pHM20 균주의 알파-휴물렌 생산성 pHM03 균주 대비 2.5 배 향상되어 0.55 mg/gDCW의 알파-휴물렌을 생산하였다 (도 6).

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Transformed methanotrophs for producing a-humulene production from methane and uses thereof <130> PN1910-473 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1647 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> zssl <400> 1 atggaacggc aatcgatggc cttggttggc gataaagaag aaatcatccg gaaatcgttt 60 gaatatcatc cgaccgtttg gggcgattat tttatccgga actattcgtg cttgccgttg 120 gaaaaagaat gcatgatcaa acgggttgaa gaattgaaag atcgggttcg gaacttgttt 180 gaagaaaccc atgatgtttt gcaaatcatg atcttggttg attcgatcca attgttgggc 240 ttggattatc attttgaaaa agaaatcacc gccgccttgc ggttgatcta tgaagccgat 300 gttgaaaact atggcttgta tgaagtttcg ttgcggtttc ggttgttgcg gcaacatggc 360 tataacttgt cgccggatgt ttttaacaaa tttaaagatg ataaaggccg gtttttgccg 420 accttgaacg gcgatgccaa aggcttgttg aacttgtata acgccgccta tttgggcacc 480 catgaagaaa ccatcttgga tgaagccatc tcgtttacca aatgccaatt ggaatcgttg 540 ttgggcgaat tggaacaacc gttggccatc gaagtttcgt tgtttttgga aaccccgttg 600 tatcggcgga cccggcggtt gttggttcgg aaatatatcc cgatctatca agaaaaagtt 660 atgcggaacg ataccatctt ggaattggcc aaattggatt ttaacttgtt gcaatcgttg 720 catcaagaag aagttaaaaa aatcaccatc tggtggaacg atttggcctt gaccaaatcg 780 ttgaaatttg cccgggatcg ggttgttgaa tgctattatt ggatcgttgc cgtttatttt 840 gaaccgcaat attcgcgggc ccgggttatc acctcgaaag ccatctcgtt gatgtcgatc 900 atggatgata tctatgataa ctattcgacc ttggaagaat cgcggttgtt gaccgaagcc 960 atcgaacggt gggaaccgca agccgttgat tgcgttccgg aatatttgaa agatttttat 1020 ttgaaattgt tgaaaaccta taaagatttt gaagatgaat tggaaccgaa cgaaaaatat 1080 cggatcccgt atttgcaaga agaaatcaaa gttttgtcgc gggcctattt tcaagaagcc 1140 aaatggggcg ttgaacggta tgttccggcc ttggaagaac atttgttggt ttcgttgatc 1200 accgccggct attttgccgt tgcctgcgcc tcgtatgttg gcttgggcga agatgccacc 1260 aaagaaacct ttgaatgggt tgcctcgtcg ccgaaaatct tgaaatcgtg ctcgatccat 1320 tgccggttga tggatgatat cacctcgcat caacgggaac aagaacggga tcattttgcc 1380 tcgaccgttg aatcgtatat gaaagaacat ggcacctcgg ccaaagttgc ctgcgaaaaa 1440 ttgcaagtta tggttgaaca aaaatggaaa gatttgaacg aagaatgctt gcggccgacc 1500 caagttgccc ggccgttgat cgaaatcatc ttgaacttgt cgcgggccat ggaagatatc 1560 tataaacata aagataccta taccaactcg aacacccgga tgaaagataa cgtttcgttg 1620 atctttgttg aatcgttttt gatctga 1647 <210> 2 <211> 897 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ispA <400> 2 atgagtaacg cactgaaaga ctatctctcc ttttgtcaaa accgtgtcga aagagccttg 60 gaagcccgac tgccaagcga aaaccaaatt ccgacaaaat tgcacgaagc gatgcgctat 120 tgcgtgctgg acggcggtaa acgcatgcgt ccgatgctaa cctactgtac aggaaaagcc 180 gtgggcattg caccggaaga tttagatggc gcggcctgtg cggttgaatt cattcatgtt 240 tattcgttga tacatgacga tttgccggcc atggacgacg acgacctcag acgcggaaag 300 ccgacctgtc atatcgctta tgatgaagcg accgccattt tgaccggcga cgctttacaa 360 gcattggcat tcaaggtctt ggctgacgac cctaccatcc gagccgatgc cgaaagccgt 420 ctaaaaatga ttacgttgct ggctaaggct agcggctctc aaggcatggt cggcggccaa 480 gccatcgatt tagaatcggt cggcacgatg ctgacgctgc ctcagcttga aaatatgcat 540 atccacaaga ccggagcgtt aattcgagcc agcgtcaaca tggcgacgtt aacgagaccc 600 gatatcgacc cgaaacaggc cgaagggctc gatcattacg caaaatgcat cggcctatcc 660 ttccaagtca aggatgatat tttggacgaa gaaagcgata ccgcaacact cggcaaaacc 720 caaggcaagg acaaagacaa cgacaagccg acttaccctg ccttactcgg cttggccggc 780 gcaaagcaaa aagctcagga acttcatgag caagccattg aaagcttaaa cggattcggc 840 cccgaagccg atctgcttcg tgacttgtcg ctttatatta tccagcgaga tcattaa 897 <210> 3 <211> 1863 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> dxs <400> 3 atgaaaatca caggaaattt ccccctacta gacagcatca agctcccctc cgaccttaga 60 aaactgccaa aggaacgatt aaaaccgctt gccaaagaac ttcgcgagtt tctgacccac 120 acagtcagta tttccggcgg gcatttttcg gcaggcctcg gcaccgtaga gttgactgtg 180 gcgctgcatt acgtattcga cacgccgcgc gatcaattgg tttgggatgt cggccatcag 240 gcctatccgc ataagatcct gaccggacgc aaggagcgca tgacgacaat tcgcacccgc 300 gacggctttt gcccctttcc aaaccgttcc aagagcgaat acaatgcctt cggcgtcggc 360 cattcgagca cgtcaattag cgcggcctta ggcatggcga tcgcatccgg tttacgcggc 420 gaggacaagc actgtgtcgc gatcattggc gacggcagca tcaccggcgg catggccttc 480 aaagcaatga accatgccgg tgcgatcgat gcaaatctgt tggtgatctt gaacgacaac 540 aatttgtcaa tttctccaaa tgtcggcccg ttgaaaaatt atctgactaa aattctgtcg 600 agtaaaattt attcttcggt acgcgaaaaa agcaaaaaag ctctcaccag catgccaagc 660 gtctgggagc tggcgcgcaa aaccaaaaag cacatgaaag gcatggtcgt gcccggcacc 720 ttgttcaagg aaatggggtt caattatatc ggtccaatcg acggccatga cctggacatg 780 ctggtgtcaa ccctggaaaa tctaaaacac atttccggcc cgcgtttctt gcatatcgtc 840 accaagaaag gcaagggcta tgcgccggcc gagaaagacc cgctcgccta tcacggcgtg 900 ccggccttcg acccgagccg cgattgtctg ccgaaatcgg ccccttctcc gcacccgacg 960 tatacgcagg tattcggaca atggctctgc gacatggccg agcaggacga gcgcttgttg 1020 ggcattaccc cggcaatgcg cgaaggctcg ggcctggtcg ctttttccga acgctttccg 1080 aagcgttatt tcgatgtcgc catcgccgag cagcatgccg tgaccttagc ggcgggcctg 1140 gcctgcgagg gcggcaaacc ggtcgtcgcg atctattcaa ccttcttaca acgcggctac 1200 gatcaattga tacacgatgt ggtcttgcag gacctggacg tattgtttgc gctcgaccgc 1260 gcaggtttag tcggcccgga cggcccgacc catgccggca gtttcgatta cacctacatg 1320 cgctgcctgc cgaacatgct aatcatggca ccggccgacg agaacgaatg ccggcagatg 1380 ctctataccg gttatctgca taaaggcccg gcttcggtac gctatccgcg cggcaaaggc 1440 ccgggcgtgc cggtcgattg caccatgacc gcgctaccga tcggcaaggc cgaattgcgc 1500 catcaaggcg gccgcatcgc gattctggcg ttcggcagca tggttacgcc gtcggtcgag 1560 gtcggtaagc agctcggcgc gaccgtcgtc aatatgcgct tcgtcaagcc gctcgatgaa 1620 gcgttgattc tggaactggc caagagtcac gatatcatcg tcacggtcga agaaaacgtc 1680 attgccggcg gcgccggcag cgcggtcaac gaatttctgc aggcacaaag aatcgtgatg 1740 ccggtcttga atatcggtct gcccgatgcc ttcatcgaac aaggcacgcg cgaagaatta 1800 ctgagttttt gcggattaga tacccaaggc atattgcaga gcatcgagca attttgcgcg 1860 tga 1863 <210> 4 <211> 1227 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ispG <400> 4 atgtcaatca gcccaagaaa aattacccat caagttcaaa tcggcgacat caaagtgggc 60 ggcggcgcgc caatcgtcgt tcaatcaatg accaataccg ataccgccga tatcaaagca 120 acagtcaacc aagtcatgga actgtcgaag gccggatcgg aaatcgtccg tattaccgtc 180 aactccgaag acgcggctaa agccgttcct gaaatccgca accaactcaa tcaaaaaggc 240 tttaccgttc cgatcgtcgg cgatttccat tttaacggac ataaattact cgaaaaatac 300 cccgcctgcg ccgaagcctt agataaatat cgcatcaatc ccggaaatgt cggacgaggt 360 aaaaaccgcg atccacaatt tcaacaaatg atcgagttcg cttgccgcta cgacaagccc 420 gttcgaatcg gcgttaacgg cggtagcctg gatcaagcgg ttttaacgcg ccttttggat 480 gaaaacagac aaaaagaaaa tccggacgaa ctacctgccg ttactcgaga agcaatcatc 540 gtttcggcac tcgaaagcgc ggcccgcgcc gaagaaatag gcctacccgc caacaaaatt 600 ttattgtctt gtaaaatcag caacgttcag gaattgatca gaatttatca agatctaagt 660 aaacgctgcg attacgcgtt acacctcggc ctaaccgaag ccggcatggg ctcgaaaggc 720 atcgtggcat cttcggccgc tctatccgtg cttatgcaac agggcatcgg agacacgatt 780 cgcatctcgc taacaccgga acccggcacg gccagaaccc aagaagttgt agtcgcacag 840 gaaatcttgc aaaccatggg ctttcgttcc tttactccga tggttatcgc ctgcccaggc 900 tgcggccgaa caaccagcga ctatttccaa aaattggcga tggaaattca aaattatcta 960 cgcgtcagta tgccgtcttg gcgcactaaa tatcccggcg tcgaagaaat ggaagtcgcg 1020 gtcatgggtt gtgtcgtcaa tggtcccgga gaaagtaaga atgccagcat cggcatcagc 1080 ttgcccggca ccggagaaac cccggttgct ccggtttatg 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aattaatgac gaaaaagcca tcggtaagca ttttgtcgcg 720 atttccacac accctgaaaa tgtcattgaa tttggcatcg acccggaaaa cattttcgaa 780 ttttgggact gggttggcgg acgctattca ttatggtcat caattggcct gtccattgcg 840 ctacaagtag ggatggataa tttcgaacaa ttgttgcaag gcgcccatga ggccgattta 900 cattttagag atacgccatt cgaccgcaat attccggtca tcatgggttt actaggcatt 960 tggtataaca atttttatgg cgcagaatct catgcaatat tgccctacga ccaatcactg 1020 cgttattttt gcgagttcct acaacaaagc gacatggaaa gtaacggtaa aagcatcgat 1080 agaaaggggc aaccggtaga ttatagtacc ggcccgatca tctggggcca gccgggaacg 1140 aatggacagc atgcatttta ccaattgatc catcaaggca ctaaactaat accttgtgac 1200 ttcctggcag cggctaactc acattatcac ctaccgaaac atcacgatat tttaatttca 1260 aactttcttg cccaaccgga agctttgatg catggcagaa gtgccgaaga ggtcattgcc 1320 gagctacccg aacaagacaa aaataacgcc atattagtcg catctaaagt ctttgtgggc 1380 aacaagccgt ctaattcttt tcttttcgat aagcttacgc ctaaaacatt aggctcgttg 1440 atcgcatttt acgagcataa aatcttcgtg caaggcgcta tttggaatat caattctttc 1500 gaccaaatgg gcgttgaact gggcaaagta ctggccaaag tcattttgcc cgaactgcta 1560 aatgacgaaa ccatcggcag tcatgactgt tccacgaacg gtctgattaa tgcctataaa 1620 aaattacgta aagcagacga ttaa 1644 <210> 6 <211> 1470 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> zwf2 <400> 6 atgaaatcaa atcaaaaatt caaaccttgc gacctggtca tatatggcgc gttaggcgat 60 ttatcgacac gcaaattatt aatttcgtta tatcggctcg aaaaatccga attgatcgag 120 cccgagactc gtatcatcgg tattgaccgg catgctctcg aagagggcgg cttcgttaaa 180 gttgctagga aaagtttaca gtcttatctt aatgagacga tcgaggatga agtctggcag 240 cgttactcgg ctcgaatgca atatctcatg atcgacctaa ctcagctcga tcaatataaa 300 caattgaatg cggtcatcga ttccaaatcc agagtgctgg tcaattattt agctgtcgcg 360 ccgtttttgt tcaaaaatat ttgccagggt ctcgataaag caaaaatttt gactcgagaa 420 tcgcgagtgg tgatggaaaa accgatcggc aacgatctga aatccaatcg ggaaatcaac 480 gatgccgttg ctgaagtgtt taacgaggat caggtattcc gtatcgatca ttatttaggc 540 aaggaaacgg ttctgaatct gttggcctta cgatttgcca attcgatttt tacgaccaat 600 tggaatcaca atactatcga ccacattcaa attaccgttg gcgaggaagt cggaatcgag 660 ggccgttggg agtatttcga taaaaccggg caactacggg atatgctgca aaatcattta 720 ttgcagatcc tgacctttat cacaatggaa ccgcccgcgt cgctggaagc cgaaagcatt 780 catagcgaaa aaatcaaggt gttgaaagcc ttgcgtccga ttaccgccga caatgtcgaa 840 gaagtcaccg tgcgcgggca atacaccgcc ggttatatga aaggacaagc cgtgccgggc 900 tataccgagg aggaaggtgc cgataaggag agtaccaccg aaagtttcgt cgcggtgcgt 960 gtcgatatcg ataattggcg ctgggccgga gtgccgatat atctgcgtac cggcaagcgc 1020 atgcaaaata agcgcaccga aatcgtcgtt tatttcaagc gtttgccaca caatatcttc 1080 aaggacagtt accgcgaatt gccgccgaat aaattgatca ttcatttgca accgaaagaa 1140 ggcgtggaaa tcgaaatgct caataaggta cccggaatcg gcggtagtat cacgttacag 1200 cagaataaac tggatttgag cttttctgaa acgttcaaaa acagcccgtt tttcggcggt 1260 tacgagcggc tgattttgga agcaatgcgg ggcgacccga ccttgttcct gagtcggcag 1320 gaaatcgaac aggcttgggc atgggtcgat tcaatacaag atgcttgggc gcgtagaaaa 1380 attgcgccaa aaccctattc cgcaggaagc tgggggccgg tcgcgtcggt ggcattgttg 1440 gcgcgtgacg gacgggcttg ggaagagtaa 1470 <210> 7 <211> 1446 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gnd <400> 7 atgaaagcga atatcggttt aatcggcctg gcggtcatgg gccagaattt agttctcaac 60 atcaatgaca atggttttaa ggtagccgtc tacaaccgca cgacagaaaa gaccgacgag 120 ttcctcacgg ggccggccaa gggcaccgaa atcgtcggaa cttactcgat cgaagatctc 180 gtgcagaaac tggaaacgcc gcgcatcgtg atgttaatgg tcaaagccgg aaccgtggtc 240 gatcattata tcgagcaact agtactgcta ctcgatgccg gcgatatcat catcgacggc 300 ggcaattcgc tatttaccga caccgaccga cgcacaaagg cgctaaagga aaaaggcttg 360 ctttatatcg gcaccggcgt atcgggcgga gaggaaggcg cgaggcacgg gccctcgatc 420 atgcccggcg gtcacccgga tgcctggaac cgagtcaaac cggtattgca ggcgatcagc 480 gcaaaagtcg acggccagcc ttgctgtgaa tgggtcggct atggcggcgc gggccactat 540 gtcaaaatga tccataacgg catcgaatac ggcgacatgc aaatcatttg cgaagcctat 600 caactgatgt ccgaagggct cggcctttct gccgatgaga tttcctctat tttcgccgaa 660 tggaacagcg cggaactcag ttcctaccta gtcgaaatca cggccaatat tcttgcctat 720 aaagacgaag acggcagtcc gctccttgac aagatcctcg acacagccgg ccaaaaaggc 780 accggtaaat ggaccggcat caatgcactg gatttgggca ttccgctgac gctgatcggc 840 gaatcggtct tcgcacgctg cctgtcggcg atgaaagacg aacgcatcaa tgcctcgcaa 900 aagctgccta aaccggtcaa ccgttttgag ggaaaccggc aagaagccct cgaaaccatc 960 cgcaatgcct tgtatgcatc gaaaatcatt tcttacgcgc aggggttccg gctcatgcgc 1020 gaagcggcga aagaatacgg ctggacgttg aactacggta aaatcgcact gatgtggcgg 1080 ggcggctgta ttattcgcag cgcattttta aacgatatca aacaagcata cgatagcaat 1140 cctgatttgg aaaatttgct gctggccgat ttcttcgtcg atgctatgcg gcaggccgaa 1200 cccggctggc gtaaagccgt catactcagt atcgaactcg gtattccggc cccggcgttt 1260 tccagtgcgc tagcgtttta cgacggctac cggacggcac gcttgcccgc caatctgttg 1320 caggctcaac gcgattattt cggcgcgcac agttacgaac gcaccgaccg tccgcgcggc 1380 gagttttttc ataccgactg gaccgggcac ggcggtaaaa ccgcatcgtc tacttataac 1440 gtttaa 1446 <210> 8 <211> 2354 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pkt2 <400> 8 atgaatacac aaactctgaa tcctgaattg ctgaggaaaa ttgacgccta ttggcgtgca 60 gcaaactatc tatcggttgg tcagatttat ctctatgaca atccgctgtt gaagaagccg 120 ctcaagcagg cgcacatcaa accgcgcctg cttgggcact ggggcacgac gccggggcta 180 aactttgcct acgtccactt gaaccgtgtt atcaagatgc atgatctaaa cgtaatctac 240 attaccgggc cggggcatgg cggacccgcg ctggtggcga atgcctatct agagggtacc 300 tacagcgagg tgtatcccaa tatcgcccaa aatgagtcgg ggatgaaacg gctgttcaaa 360 cagttttcct tccccggcgg cataccgagt cacgttgcac ctgaaacacc gggctcgatt 420 cacgagggag gcgagctggg ttattcgctg tcgcatgcct acggggcagc gttcgacaat 480 cccgatctga tcgttgcttg tgtcgtcggc gatggtgaag cagagaccgg tcctctggct 540 gccagttggc attcgaataa atttctcaat ccggtccacg acggtgccgt gttgcccatc 600 ctgcatttga atggctataa aattgccggc cccacggttt tggcgcgcat tccgcatgac 660 gaactggacg cgatgtttcg tggcctcggt tacacgccgt atttcgtcga aggcgaggat 720 ccgatggcga tgcatcagct gatggcggct acgctggaca ctgtggtcgg cgagatccaa 780 cgcatccaaa ctgaagcccg cgccaacgga ttcaagaaac gtccgaattg gcctatgatc 840 atcttgcgct caccgaaagg ctggaccggc cctaaggaag tcgatgacaa acctaccgag 900 ggaacatttc gatcgcatca ggttccgatg ggcgacatga gtgaagcggg gcatgtgaag 960 attctggaaa agtggttgaa aagctaccat ccgaagcaat tgttcgacaa gaccgggaaa 1020 ttggttgccg aattggctga attggcgccg gctggagagc ggcgcatgag tgccaatcca 1080 cacgccaacg gagggctctt gttacagcaa ctgcatctgc ctgattttca cgactacgag 1140 gttaaggtgt ccaagccggg aaacgtggag gccgaatcca cccgagtgca aggggaattt 1200 atccgcgacg tgatcaaacg gaaccctgaa aacttccgta tctttagtcc ggacgaaacg 1260 aattcaaacc gctggggcgc tgtgttcgaa gtgacgaacc gttgttcgac cgcggaaatt 1320 gtgcccggcg acgatcacgt tgcccccgat ggccgggtga tggagatatt gagcgagcat 1380 cagtgcgagg gttggctcga aggttacctg ctgactgggc gtcacggatt tttctcttgc 1440 tacgaagcgt ttatccacat cattgattcg atgttcaacc agcatgccaa atggctcaag 1500 gtctcgaatc agattccatg gcgccgcccg attgcatctt tgaactatct gctttcttcg 1560 cacgtctggc gacaggatca taacggtttt agtcatcagg atccaggctt catggaccat 1620 gtcgtgaaca aaaaggcgga agtcattcgt gtctttctgc ccccgatgcg aatacgctgc 1680 tttcggtaac cgatcattgc ctgcgtagcc gcaattatgt caacgttatc gttgccggca 1740 agcaaccctc gccgcagtgg ttagacatgg atgaggccat taaacactgt actgctggtt 1800 tgggtatttg gccgtgggcc agcaacgatc aggatggcga accggatgtt gtcatggcat 1860 gctgcggcga cgtaccgacg ctagaaacct tggccgccgt cgagttgttg cgggaatatt 1920 tcccagagct gaaagttagg gtgattaatg tagtcgattt gatgaaactc cagacccaaa 1980 gcgaacaccc gaatggtctg agcgacaaag atttcgattt actttttacc aaggataagc 2040 cgatcatctt cgccttccac ggttatccat tgctcattca tcggttgacc tatcgtcgca 2100 gtaaccactc gaacctgcat gtgcgcggtt tcaaagaaga aggcaccacc actacgccct 2160 tcgacatgac ggtattgaac gacctggacc ggtttcattt ggttggcgat gtcattgacc 2220 gcctcccgca attgggagct cgggctgcct acgccaagca agccatgcga gacaagctca 2280 tcgaacacaa acaatacatc aggaagcatg gcgaggatat gccggaaatt cgtcactgga 2340 aatggaaagg atga 2354 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAWP89-For <400> 9 tagttgtcgg gaagatgcgt 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAWP89-Rev <400> 10 gctgtttcct gtgtgaata 19 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zssl-89-For <400> 11 ttcacacagg aaacagctat ggaacggcaa tcgatggc 38 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zssl-89-Rev <400> 12 gcatcttccc gacaactatc agatcaaaaa cgattcaaca 40 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zssl-pLC291-For <400> 13 tcagtgatag agaggtacat ggaacggcaa tcgatggc 38 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zssl-pLC291-Rev <400> 14 cgtagatctt ctagaggtac tcagatcaaa aacgattcaa ca 42 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-pLC291-For <400> 15 gatctgagta cctctagaaa ataaggagca atccaatgag taacgcactg aaagact 57 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-pLC291-Rev <400> 16 catgcactag tacgcgtatt aatgatctcg ctggataa 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zssl-89-For <400> 17 ttcacacagg aaacagctat ggaacggcaa tcgatggc 38 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-89-Rev <400> 18 gcatcttccc gacaactatt aatgatctcg ctggataa 38 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-MG1655_For <400> 19 aaaataagga gcaatccaaa taaggagcaa tccaatggac tttccgcagc aact 54 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-MG1655_Rev <400> 20 gcatcttccc gacaactatt atttattacg ctggatgatg tagtcc 46 <210> 21 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispG-For <400> 21 ttgcgcgtga tacgcgtaca gcaatagaga atataaacac taaggaggtc aaacatgtca 60 atcagcccaa gaaa 74 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispG-Rev <400> 22 ccggtgagct cgcatgcact actgagctgt ggttccgt 38 <210> 23 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dxs-20Z-For <400> 23 gagatcatta atacgcgtac aatccccata tctcacaaaa tatataagga ggtcaacatg 60 aaaatcacag gaaatttccc cc 82 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dxs-20Z-Rev <400> 24 ccggtgagct cgcatgcatc acgcgcaaaa ttgctcg 37 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCM351-pgi-F1-For <400> 25 cagctgtaca attggtacgt caggcatttg cggtgttt 38 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCM351-pgi-F1-Rev <400> 26 catatgcatc catggtacca aatgggcgtt gaactggg 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCM351-pgi-F2-For <400> 27 cgtgttaacc ggtgagcttg aacgcgtgtc ttctgtga 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCM351-pgi-F2-Rev <400> 28 tggatcctct agtgagctca agcccataag cgctagga 38 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20Z-PGI-Out-For <400> 29 ttggagcttg gcttgcctta 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20Z-PGI-Out-Rev <400> 30 gcacaaaact cttcggctgg 20 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf2-20Z-For <400> 31 cggaaccaca gctcagtaga ggaaacagct atgaaatcaa atcaaaaatt caaaccttgc 60 60 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf2-20Z-Rev <400> 32 gcatcttccc gacaactatt actcttccca agcccgtc 38 <210> 33 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdg-20Z-89-For <400> 33 cggaaccaca gctcagtaga ggaaacagct atgaaagcga atatcggttt aatcgg 56 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdg-20Z-89-Rev <400> 34 gcatcttccc gacaactatt actggcacca ctccgg 36 <210> 35 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pkt2-2-89-For <400> 35 cggaaccaca gctcagtaga ggaaacagct atgaatacac aaactctgaa tcctga 56 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pkt2-2-89-Rev <400> 36 gcatcttccc gacaactatc atcctttcca tttccagtga c 41

Claims

알파-후물렌 생성효소(a-humulene synthase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate synthase)의 활성이 강화된 알파-휴물렌을 생산하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 알파-휴물렌 생성효소(a-humulene synthase)를 코딩하는 유전자(zssl)는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, 파르네실 피로포스페이트 합성효소(farnesyl pyrophosphate synthase)를 코딩하는 유전자(ispA)는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서,
상기 형질전환 메탄자화균은 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-xylulose-5-phosphate synthase) 또는 (E)-4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐-디포스페이트 합성효소((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase)의 활성이 더 강화되어, MEP(methylerythritol phosphate) 경로가 강화된 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 3항에 있어서, 1-데옥시-크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-xylulose-5-phosphate synthase)를 코딩하는 유전자(dxs)는 서열번호 3의 염기서열로 표시되고, (E)-4-하이드록시-3-메틸부트-2-에닐-디포스페이트 합성효소((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자(ispG)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase)의 활성이 감소 또는 불활성화되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 5항에 있어서, 상기 글루코즈-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase)를 코딩하는 유전자(pgi)는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase) 또는 포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase)의 활성이 더 강화된 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 7항에 있어서, 상기 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(zwf2)는 서열번호 6의 염기서열로 표시되고, 포스포글로코네이트 탈수소효소(phosphogluconate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gnd)는 서열번호 7로의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 글포스포케톨라아제(phosphoketolase)의 활성이 더 강화된 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 9항에 있어서, 포스포케톨라아제(phosphoketolase)를 코딩하는 유전자(pkt2)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium) 속 또는 메틸로시너스 속(Methylosinus) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 메탄자화균은 메틸로마이크로비움 트리코스포륨(Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z인 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 메탄을 사용하여 알파-휴물렌을 생산하는 것을 특징으로 하는 형질전환 메탄자화균.
메탄을 포함하는 배양액에 제1항의 형질전환 메탄자화균을 배양하는 단계를 포함하는 알파-후물렌의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 배양액으로부터 알파-후물렌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-후물렌의 제조방법.