KR20190097093A - 피토엔의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피토엔을 생산 및 축적하도록 유전자 조작된 재조합 데이노코쿠스 박테리아, 및 피토엔을 생산하기 위한 그것의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 조작된 데이노코쿠스 박테리아를 사용하는 피토엔의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

피토엔의 생산 방법
본 발명은 미생물학 분야, 및 특히 생합성 경로 조작 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 유전자 조작된 박테리아를 사용하는 피토엔 생산 분야에 관한 것이다.
카로테노이드는 모든 광합성 유기체에 의해 및 일부 종속영양으로 성장하는 박테리아 및 진균에서 합성되는 천연 색소의 부류이다. 동물은 이들 분자를 새로 합성할 수 없기 때문에, 카로테노이드는 식품 보충제, 동물 사료 첨가제 또는 기능식품으로서 상업적으로 널리 사용되어 왔다. 카로테노이드는 또한 착색제로서 또는 화장품 및 약제 목적을 위해 다양한 응용을 발견했다.
유색 카로테노이드가 가장 광범위하게 연구되어 있지만, 무색 카로테노이드 예컨대 피토엔 및 피토플루엔은 유사한 효과적인 및 유익한 활성을 보였다. 이들 카로테노이드는 대부분의 과일 및 채소에서 발견되고, UV 흡수제, 항산화제, 및 항-염증제로서 작용할 수 있다. 그 결과, 그들은 화장품, 영양제 및 치료제에서, 특히 피부 질환의 치료에서 유용한 것으로 발견되었다.
피토엔 (7,8,11,12,7',8',11',12'-옥타히드로-Ψ,Ψ-카로틴) 은 카로테노이드 생합성 경로에서 첫번째 카로테노이드이고, 20-탄소 원자 전구체, 게라닐게라닐 피로포스페이트 (GGPP) 의 이합체화에 의해 생산된다. 이러한 반응은 효소 피토엔 신타아제에 의해 촉매작용된다. 전구체로서, 피토엔은 그 후 탈포화되어 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 및 마지막으로 리코펜을 성공적으로 형성한다.
그들은 모든 다른 카로테노이드의 전구체이기 때문에, 피토플루엔 및 피토엔은 이들 화합물의 생합성을 다루는 조사에서 광범위하게 연구되어 왔다. 그러나, 그들은 다른 종류의 연구에서는 대체로 도외시되어 왔다. 그 결과, 현재까지, 임의의 생물학적 과정을 통한 피토엔 생산을 위한, 및 특히 피토플루엔이 없는 피토엔 생산을 위한 현재 이용가능한 방법은 없다.
본 발명은, 바람직하게는 피토플루엔이 없는, 상당한 양의 피토엔을 생산 및 축적하도록 유전자 조작된 재조합 데이노코쿠스 (Deinococcus) 박테리아 및 피토엔을 생산하기 위한 상기 재조합 박테리아의 용도에 관한 것이다.
따라서, 첫번째 양상에서, 본 발명은 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 박테리아를 배양하는 단계, 및 임의로는 상기 피토엔을 회수하는 단계를 포함하는 피토엔의 생산 방법으로서, 상기 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 증가된 피토엔 신타아제 활성 및 감소된 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내도록 유전자 조작된 생산 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 임의의 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내지 않는다. 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써, 바람직하게는 상기 유전자의 전부 또는 일부를 결실시키거나 또는 논센스 코돈, 카세트, 유전자 또는 프레임시프트 유도 돌연변이를 도입함으로써 유전자 조작될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 유전자 조작된다.
재조합 데이노코쿠스 박테리아는 또한 피토엔 신타아제를 인코딩하는 선천 유전자를 과발현하도록, 피토엔 신타아제를 인코딩하는 이종 유전자를 발현하도록, 피토엔 신타아제를 인코딩하고 인코딩된 효소의 피토엔 신타아제 활성을 개선하는 돌연변이를 포함하는 선천 유전자를 발현하도록, 또는 피드백 저항성 피토엔 신타아제를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 증가된 FPP 신타아제 활성, 증가된 DXP 신타아제 및/또는 IPP 아이소메라아제 활성, 바람직하게는 증가된 FPP 신타아제, DXP 신타아제 및 IPP 아이소메라아제 활성을 추가로 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 D. 게오테르말리스 (D. geothermalis), D. 무라이 (D. murrayi), D. 그란디스 (D. grandis), D. 아쿠아티쿠스 (D. aquaticus), D. 인디쿠스 (D. indicus), D. 셀룰로실리티쿠스 (D. cellulosilyticus), D. 데폴리메란스 (D. depolymerans) 및 D. 마리코펜시스 (D. maricopensis) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 데이노코쿠스 박테리아이다. 더욱 바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 데이노코쿠스 게오테르말리스 박테리아이다.
재조합 데이노코쿠스 박테리아는 바람직하게는, 특히 호기생활에서 및 탄소원으로서의 글루코오스의 존재 하에 배양될 때, 적어도 20 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산할 수 있다.
바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 생산하고, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 호열성 데이노코쿠스, 바람직하게는 D. 게오테르말리스이고, 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 배양은 40 내지 50℃, 바람직하게는 45 내지 48℃ 에 포함되는 온도에서 수행된다.
두번째 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 사용되는 재조합 데이노코쿠스 박테리아, 또는 그의 세포 추출물, 바람직하게는 세포 막을 포함하는 분획에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 세포 추출물은 피토엔을 포함하고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 세포 추출물은 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 또한 피토엔을 생산하기 위한 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득되는 피토엔, 바람직하게는 오직 15-시스 피토엔을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는, 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 화장품, 약제 또는 기능식품, 미용식품 조성물 또는 식품 또는 사료 첨가제이다.
본 발명의 상세한 설명
데이노코쿠스 박테리아는 Anderson 및 공동 연구자에 의해 1956 년에 처음으로 단리된 비-병원체 박테리아이다. 이러한 극한미생물 유기체는 바이오매스를 사용하는 산업 공정 또는 반응에서의 사용에 관해 제안되어 왔다 (예를 들어, WO2009/063079; WO2010/094665 또는 WO2010/081899 참고). 데이노코쿠스 대사 및 유전학의 그들의 확고한 지식에 기초하여, 본 발명자들은 데이노코쿠스 박테리아가 대규모 생산과 양립될 수 있는 조건 하에 상당한 양의 피토엔을 생산하도록 유전자 조작될 수 있다는 것을 발견했다. 게다가, 그들은 이러한 재조합 박테리아는 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜이 없는 피토엔을 생산할 수 있으며 그에 의해 추가의 정제 단계의 필요를 억제한다는 것을 보여줬다.
정의
본 발명의 맥락에서, 용어 "데이노코쿠스" 는 데이노코쿠스의 야생형 또는 천연 변이체 균주, 예를 들어, 가속된 진화, 돌연변이생성, DNA-셔플링 기술에 의해 수득된 균주, 또는 진핵생물, 원핵생물 및/또는 합성 핵산(들)의 삽입에 의해 수득되는 재조합 균주를 포함한다. 데이노코쿠스 박테리아는 데이노코쿠스 속의 임의의 박테리아, 예컨대 제한 없이 D. 악티노스클레루스 (D. actinosclerus), D. 애리우스 (D. aerius), D. 애로라투스 (D. aerolatus), D. 애로필루스 (D. aerophilus), D. 애테리우스 (D. aetherius), D. 알피니툰드래 (D. alpinitundrae), D. 알티투디니스 (D. altitudinis), D. 안타르크티쿠스 (D. antarcticus), D. 아파첸시스 (D. apachensis), D. 아쿠아티쿠스 (D. aquaticus), D. 아쿠아티쿠스 (D. aquaticus), D. 아쿠아틸리스 (D. aquatilis), D. 아쿠이라디오콜라 (D. aquiradiocola), D. 캐니 (D. caeni), D. 카리 (D. carri), D. 셀룰로실리티쿠스 (D. cellulosilyticus), D. 시트리 (D. citri), D. 클라우디오니스 (D. claudionis), D. 대제오넨시스 (D. daejeonensis), D. 데폴리메란스 (D. depolymerans), D. 데세르티이 (D. desertii), D. 엔클렌시스 (D. enclensis), D. 피쿠스 (D. ficus), D. 프리겐스 (D. frigens), D. 게오테르말리스 (D. geothermalis), D. 고비엔시스 (D. gobiensis), D. 그란디스 (D. grandis), D. 구안그리엔시스 (D. guangriensis), D. 길헤멘시스 (D. guilhemensis), D. 호호카멘시스 (D. hohokamensis), D. 호피엔시스 (D. hopiensis), D. 휴미 (D. humi), D. 인디쿠스 (D. indicus), D. 마리코펜시스 (D. maricopensis), D. 마르모리스 (D. marmoris), D. 메탈리 (D. metalli), D. 메탈리라투스 (D. metallilatus), D. 미사센시스 (D. misasensis), D. 무라이 (D. murrayi), D. 나바조넨시스 (D. navajonensis), D. 파파고넨시스 (D. papagonensis), D. 페라리딜리토리스 (D. peraridilitoris), D. 포에니시스 (D. phoenicis), D. 피멘시스 (D. pimensis), D. 피스시스 (D. piscis), D. 프로테올리티쿠스 (D. proteolyticus), D. 푸니세우스 (D. puniceus), D. 라디오두란스 (D. radiodurans), D. 라디오몰리스 (D. radiomollis), D. 라디오필루스 (D. radiophilus), D. 라디오푸그난스 (D. radiopugnans), D. 라디오레시스텐스 (D. radioresistens), D. 라디오톨레란스 (D. radiotolerans), D. 레티쿨리테르미티스 (D. reticulitermitis), D. 로세우스 (D. roseus), D. 사하리엔스 (D. sahariens), D. 삭시콜라 (D. saxicola), D. 솔리 (D. soli), D. 소노렌시스 (D. sonorensis), D. 스우엔시스 (D. swuensis), D. 울루무키엔시스 (D. wulumuqiensis), D. 신지안겐시스 (D. xinjiangensis), D. 시베이엔시스 (D. xibeiensis) 및 D. 야바파이엔시스 (D. yavapaiensis) 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 용어 "데이노코쿠스" 는 D. 게오테르말리스, D. 무라이, D. 그란디스, D. 아쿠아티쿠스, D. 인디쿠스, D. 셀룰로실리티쿠스, D. 데폴리메란스 또는 D. 마리코펜시스를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 용어 "데이노코쿠스" 는 D. 게오테르말리스, D. 무라이 또는 D. 마리코펜시스를 나타낸다. 더더욱 바람직하게는, 용어 "데이노코쿠스" 는 D. 게오테르말리스를 나타낸다.
용어 " 재조합 박테리아 " 및 "유전자 조작된 박테리아" 또는 "조작된 박테리아" 는 본원에서 호환되게 사용되고, 자연에서 발견되지 않고 한 개 또는 여러 개의 유전 요소의 결실, 삽입 또는 수식의 결과로서 변형된 게놈을 함유하는 박테리아를 지칭한다.
" 재조합 핵산 " 은 조작되었고 그 자체로 야생형 박테리아에서 발견되지 않는 핵산을 지칭한다. 일부 특별한 구현예에서, 이 용어는 그것의 자연 발생적 프로모터와 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 나타낼 수 있다.
용어 " 유전자 " 는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산을 지칭한다. 용어 유전자는 DNA, 예컨대 cDNA 또는 gDNA, 뿐만 아니라 RNA 를 망라한다. 유전자는 첫째로 예를 들어, 재조합, 효소 및/또는 화학 기술에 의해 제조되고, 후속적으로 숙주 세포에서 또는 인 비트로 (in vitro) 시스템에서 복제될 수 있다. 유전자는 전형적으로는 요망되는 단백질을 인코딩하는 열린 해독틀을 포함한다. 유전자는 서열 예컨대 전사 터미네이터 또는 신호 펩테드를 함유할 수 있다.
용어 " 작동가능하게 연결된 " 은 제어 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하는 방식으로 제어 서열이 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 위치하는 배열을 의미한다.
용어 " 제어 서열 " 은 유전자의 발현에 필수적인 핵산 서열을 의미한다. 제어 서열은 선천 또는 이종일 수 있다. 잘 알려지고 당업자에 의해 현재 사용되는 제어 서열이 바람직할 것이다. 그러한 제어 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 터미네이터를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 제어 서열은 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
용어 " 발현 카세트 " 는 코딩 영역, 즉 유전자, 및 조절 영역을 포함하는, 즉 작동가능하게 연결된 하나 이상의 제어 서열을 포함하는 핵산 구축물을 지칭한다. 바람직하게는, 제어 서열은 데이노코쿠스 숙주 세포에 적합하다.
본원에서 사용되는, 용어 " 발현 벡터 " 는 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 환형 이중 가닥 DNA 분자이다.
본원에서 사용되는, 용어 " 선천 " 또는 " 내인성 " 은, 박테리아에 관하여, 상기 박테리아에 자연적으로 존재하는 유전 요소 또는 단백질을 나타낸다. 용어 " 이종 " 은, 박테리아에 관하여, 상기 박테리아에 자연적으로 존재하지 않는 유전 요소 또는 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 " 과발현 " 및 " 증가된 발현 " 은 호환되게 사용되고, 비변형 박테리아, 예를 들어 야생형 박테리아 또는 피토엔을 생산하기 위해 유전자 조작되지 않은 상응하는 박테리아에 비해 유전자 또는 효소의 발현이 증가되는 것을 의미한다. 효소의 증가된 발현은 통상적으로 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 수득된다. 유전자 또는 효소가 본 발명의 박테리아에 자연적으로 존재하지 않는 구현예, 즉 이종 유전자 또는 효소에서, 용어 "과발현" 및 "발현" 은 호환되게 사용될 수 있다. 유전자의 발현을 증가시키기 위해서, 당업자는 임의의 알려진 기술을 사용할 수 있으며 예컨대 박테리아에서의 유전자의 카피수를 증가시키거나, 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터, 즉 강한 프로모터를 사용하거나, 상응하는 메신저 RNA 를 안정화시키는 요소를 사용하거나 또는 리보솜 결합 자리 (RBS) 서열 및 그 주위의 서열을 변형시킬 수 있다. 특히, 과발현은 박테리아에서의 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 수득될 수 있다. 유전자 대체 또는 IS 서열에의 멀티카피 삽입 (예를 들어 국제 특허 출원 WO 2015/092013 참고) 을 포함하는 당업자에게 알려진, 재조합 방법에 의해 유전자의 한 개 또는 여러 개의 카피가 게놈 내에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 바람직하게는 강한 프로모터의 제어 하에 놓인, 유전자를 포함하는 발현 카세트가 게놈 내에 통합된다. 대안적으로는, 유전자는 바람직하게는 강한 프로모터의 제어 하에 놓인 관심의 유전자와 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 복제 기점의 성질에 따라, 발현 벡터는 박테리아에 한 개 또는 여러 개의 카피로 존재할 수 있다. 유전자의 과발현은 또한 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 내인성 유전자의 프로모터는 더 강한 프로모터, 즉 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 대체될 수 있다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 프로모터는 당업자에게 알려져 있고, 구성적 또는 유도성, 및 선천 또는 이종일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 " 증가된 활성 " 은 비변형 박테리아, 예를 들어 야생형 박테리아 또는 피토엔을 생산 또는 축적하기 위해 유전자 조작되지 않은 상응하는 박테리아에 비해 증가된 효소 활성을 나타낸다. 이러한 증가는 예를 들어 선천 유전자의 과발현 또는 이종 유전자의 발현에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 " 감소된 활성 " 은 비변형 박테리아, 예를 들어 야생형 박테리아 또는 피토엔을 생산 또는 축적하기 위해 유전자 조작되지 않은 상응하는 박테리아에 비해 감소된 효소 활성을 나타낸다. 이러한 감소는 예를 들어 그러한 활성을 책임지는 효소를 인코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 " 서열 동일성 " 또는 " 동일성 " 은 두 개의 폴리펩티드 서열의 정렬로부터의 위치에서의 매치 (match) (동일한 아미노산 잔기) 의 수 (%) 를 나타낸다. 서열 동일성은 중첩 및 동일성을 최대화하는 한편 서열 갭을 최소화하도록 정렬되었을 때 서열을 비교함으로써 확인된다. 특히, 서열 동일성은, 두 개의 서열의 길이에 따라, 임의의 다수의 수학적 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 서열을 전체 길이에 걸쳐 최적으로 정렬시키는 글로벌 정렬 알고리즘 (예를 들어 Needleman 및 Wunsch 알고리즘; Needleman and Wunsch, 1970) 을 사용하여 정렬되며, 한편 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘 (예를 들어 Smith 및 Waterman 알고리즘 (Smith and Waterman, 1981) 또는 Altschul 알고리즘 (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)) 을 사용하여 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 확인하는 목적을 위한 정렬은 당해 기술분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 인터넷 웹사이트 예컨대 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/) 에서 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 확인할 수 있다. 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 두 개의 서열의 최적 글로벌 정렬을 생성하는 쌍방식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle 을 사용하여 생성되는 값을 나타내며, 여기에서 모든 검색 파라미터는 디폴트 값으로 설정되며, 즉 스코어링 매트릭스 (Scoring matrix) = BLOSUM62, 갭 오픈 (Gap open) = 10, 갭 익스텐드 (Gap extend) = 0.5, 엔드 갭 패널티 (End gap penalty) = 거짓 (false), 엔드 갭 오픈 (End gap open) = 10 및 엔드 갭 익스텐드 (End gap extend) = 0.5 이다.
용어 " 낮은 스트린전시 ", " 중간 스트린전시 ", " 중간/높은 스트린전시 ", " 높은 스트린전시 " 및 " 매우 높은 스트린전시 " 는 하이브리드화의 조건을 나타낸다. 뉴클레오티드 프로브와 상동 DNA 또는 RNA 서열 사이의 하이브리드화를 확인하기 위한 적합한 실험 조건은 하이브리드화하는 DNA 단편 또는 RNA 를 함유하는 필터를 5ХSSC (소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 에 10 min 동안 미리 담그고 (presoaking), 필터를 5ХSSC, 5Х 덴하르트 용액 (Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 ㎍/㎖ 의 변성된 초음파처리된 영어 정자 DNA 의 용액에서 예비하이브리드화시키고, 그에 뒤이어 농도 10 ng/㎖ 의 무작위 프라이밍된 (random-primed) 32P-dCTP-표지된 (특정 활성 >1Х109 cpm/㎍) 프로브를 함유하는 동일한 용액에서 12 시간 동안 약 45℃ 에서 하이브리드화시키는 것을 수반한다 (Feinberg and Vogelstein, 1983). 다양한 스트린전시 조건에서 필터는 그 후 30 분 동안 2ХSSC, 0.5% SDS 및 적어도 55℃ (낮은 스트린전시), 더욱 바람직하게는 적어도 60℃ (중간 스트린전시), 더더욱 바람직하게는 적어도 65℃ (중간/높은 스트린전시), 더더욱 바람직하게는 적어도 70℃ (높은 스트린전시), 및 더더욱 바람직하게는 적어도 75℃ (매우 높은 스트린전시) 에서 두 번 세정된다.
이 명세서에서 사용되는, 용어 " 약 " 은 값 ± 명시된 값의 10% 의 범위를 나타낸다. 예를 들어, "약 20" 은 20 의 ± 10 %, 또는 18 내지 22 를 포함한다. 바람직하게는, 용어 "약" 은 값 ± 명시된 값의 5 % 의 범위를 나타낸다.
본원에서 사용되는, 용어 " CrtB " 또는 " 피토엔 신타아제 " 는 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP) 의 두 개의 분자의 축합을 촉매작용하여 피토엔을 제공하는 crtB 유전자에 의해 인코딩되는 피토엔 신타아제 효소 (EC 2.5.1.32) 를 나타낸다.
용어 " CrtI " 또는 " 피토엔 디새튜라아제 " 또는 " 피토엔 데히드로게나아제 " 는 네 개 이하의 탈포화 단계를 촉매작용하는 crtI 유전자에 의해 인코딩되는 피토엔 디새튜라아제 효소 (EC 1.3.99.31) 를 나타낸다 (EC 1.3.99.28 [피토엔 디새튜라아제 (뉴로스포렌-형성)], EC 1.3.99.29 [피토엔 디새튜라아제 (제타-카로틴-형성)] 및 EC 1.3.99.30 [피토엔 디새튜라아제 (3,4-디데히드로리코펜-형성)]). 바람직한 구현예에서, 피토엔 디새튜라아제 효소는 피토플루엔 및 제타-카로틴의 중재자를 통해 피토엔을 뉴로스포렌 및 리코펜으로 전환시킨다.
유기체에 따라, 상기 확인된 효소 및 인코딩 유전자의 명명법은 다를 수 있다. 그러나, 명확성을 위해, 본 명세서에서, 이들 용어는 효소 또는 유전자의 기원과 독립적으로 사용된다.
본원에서 사용되는, 용어 " 피토엔 " 은 임의의 피토엔 이성질체, 및 바람직하게는 15-시스 피토엔을 나타낸다.
첫번째 양상에서, 본 발명은 증가된 피토엔 신타아제 활성 및 감소된 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내도록 유전자 조작된 재조합 데이노코쿠스 박테리아에 관한 것이다. 본 발명자들은 실제로 그러한 박테리아가 박테리아 생활력 또는 성장을 변경하지 않으면서, 피토플루엔이 없는, 상당한 양의 피토엔을 생산 및 축적할 수 있다는 것을 보여줬다.
본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 그것의 피토엔의 생산 및 축적을 증가시키기 위해서 유전자 조작된 데이노코쿠스 박테리아이다. 야생형 박테리아와 비교할 때, 이러한 재조합 박테리아는 위에 기재된 바와 같은 유전자 변형 뿐만 아니라 피토엔의 생산과 직접 연결되지 않으나 피토엔의 산업적 생산을 위한 이점 예컨대 항생제 저항성 또는 기질 범위를 확대하는 효소 활성을 제공하는 추가의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아에서, 피토엔 신타아제 활성은 비변형 박테리아에 비해 증가된다.
피토엔 신타아제 활성은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 피토엔 신타아제를 GGPP 와 인큐베이션하고, 피토엔을 회수하고, 리퀴드 신틸레이션 카운팅에 의해 피토엔을 정량화하여 평가될 수 있다 (예를 들어 Welsch et al., The Plant Cell, Vol. 22: 3348-3356, 2010 참고).
바람직하게는, 증가된 피토엔 신타아제 활성은 내인성 CrtB 유전자를 과발현하도록, 이종 CrtB 유전자를 발현하도록, 및/또는 내인성 피토엔 신타아제의 개선된 변이체를 발현하도록 데이노코쿠스 박테리아를 유전자 조작하여 수득된다.
특히, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있고/있거나 피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산을 과발현할 수 있다.
유전자의 발현을 증가시키기 위해서 (즉 유전자를 과발현시키기 위해서), 당업자는 임의의 알려진 기술을 사용할 수 있으며, 예컨대 박테리아에서의 유전자의 카피수를 증가시키거나, 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터, 즉 강한 프로모터를 사용하거나, 상응하는 메신저 RNA 를 안정화시키는 요소를 사용하거나 또는 리보솜 결합 자리 (RBS) 서열 및 그 주위의 서열을 변형시킬 수 있다.
특별한 구현예에서, 과발현은 박테리아에서의 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 수득된다. 유전자 대체를 포함하는, 당업자에게 알려진, 재조합 방법에 의해 유전자의 한 개 또는 여러 개의 카피가 게놈 내에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 유전자를 포함하는 발현 카세트가 게놈 내에 통합된다.
대안적으로는, 유전자는 관심의 유전자와 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 복제 기점의 성질에 따라, 발현 벡터는 박테리아에 1 내지 5, 20, 100 또는 500 개의 카피로 존재할 수 있다.
또다른 특별한 구현예에서, 유전자의 과발현은 또한 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 수득된다. 예를 들어, 내인성 유전자의 프로모터는 더 강한 프로모터, 즉 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 대체될 수 있다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 프로모터는 당업자에게 알려져 있고, 구성적 또는 유도성, 및 선천 또는 이종일 수 있다.
본 발명에서 유용한 발현 카세트는, 전형적으로는 유전자의 발현을 지시하는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는, 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 CrtB 유전자를 포함한다.
제어 서열은 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 효소의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 데이노코쿠스 박테리아에서 전사 활성을 보이는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 선천 또는 이종 프로모터일 수 있다. 바람직한 프로모터는 선천 및 데이노코쿠스 프로모터이다. 이와 관련하여, 데이노코쿠스 박테리아에서의 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 연구되고 사용되어 왔다. 적합한 프로모터의 예는 번역 신장 인자 Tu 유전자 tufA (예를 들어, D. 라디오두란스: DR_0309) 및 tufB (예를 들어, D. 라디오두란스: DR_2050) 로부터의 PtufA 및 PtufB 프로모터, pI3 에 위치하는 resU 유전자의 프로모터, groESL 오페론의 프로모터 영역 PgroESL (Lecointe, et al. 2004. Mol Microbiol 53: 1721-1730; Meima et al. 2001. J Bacteriol 183: 3169-3175), 또는 그러한 프로모터의 유도체를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 강한 구성적 프로모터이다.
제어 서열은 또한 데이노코쿠스 박테리아에 의해 인지되어 전사를 종결하는 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 터미네이터는 유전자의 3'-말단에 작동가능하게 연결되어 있다. 데이노코쿠스 박테리아에서 기능적인 임의의 터미네이터 예컨대, 예를 들어, Lecointe, et al. 2004. Mol Microbiol 53: 1721-1730 에 기재된 터미네이터 term116 가 본 발명에서 사용될 수 있다.
임의로는, 발현 카세트는 또한 재조합 박테리아의 용이한 선별을 허용하는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 전형적으로는, 선별가능한 마커는 항생제 저항성을 인코딩하거나 또는 자가영양을 제공하는 유전자이다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 강한 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 CrtB 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
발현 카세트는 박테리아의 게놈 내에 통합될 수 있고/있거나 에피솜 형태로 발현 벡터 내에 유지될 수 있다.
바람직하게는, 발현 카세트는 박테리아의 게놈 내에 통합된다. 유전자 대체를 포함하는, 당업자에게 알려진, 재조합 방법에 의해 발현 카세트의 한 개 또는 여러 개의 카피가 게놈 내에 도입될 수 있다. 발현 카세트는 내인성 CrtB 유전자를 대체할 수 있거나 또는 또다른 위치에서 게놈 내에 통합될 수 있다.
발현 카세트는 또한 표적 유전자를 불활성화시키기 위해서 게놈 내에 통합될 수 있다. 특별한 구현예에서, 발현 카세트는 CrtI 유전자를 불활성화시키기 위해서 게놈 내에 통합된다. 또다른 구현예에서, 발현 카세트는 포스포트랜스아세틸라아제 (pta) 유전자를 불활성화시키기 위해서 게놈 내에 통합된다. 표적화된 유전자는 카세트의 삽입에 의해 대체 또는 불활성화될 수 있다.
대안적으로는, 또는 또한, 발현 카세트는 게놈 내에 논-코딩 서열, 예를 들어 삽입 서열 (IS) 에서 통합될 수 있다 (예를 들어 국제 특허 출원 WO 2015/092013 참조).
발현 카세트가 에피솜 평태로 유지되는 구현예에서, 복제 기점의 성질에 따라, 발현 벡터는 박테리아에 한 개 또는 여러 개의 카피로 존재할 수 있다.
데이노코쿠스 숙주 세포는 일시적 또는 안정적 방식으로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입될 수 있다. 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예컨대 전기천공, 접합, 형질도입, 적격 세포 형질전환, 원형질체 형질전환, 원형질체 융합, 바이오리스틱 "유전자총" 형질전환, PEG-매개 형질전환, 지질-보조 형질전환 또는 형질감염, 화학물질 매개 형질감염, 리튬 아세테이트-매개 형질전환 또는 리포솜-매개 형질전환에 의해 수득될 수 있다.
용어 "재조합 데이노코쿠스 박테리아" 는 또한 유전자 조작된 숙주 세포 뿐만 아니라, 특히 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해, 부모 숙주 세포와 동일하지 않은 임의의 자손을 망라한다.
본 발명의 재조합 박테리아에서 발현 또는 과발현되는 CrtB 유전자는 내인성 피토엔 신타아제, 이종 피토엔 신타아제 또는 내인성 피토엔 신타아제의 개선된 변이체를 인코딩할 수 있다.
특히, 피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는, 예컨대 알려진 박테리아, 조류 또는 식물 피토엔 신타아제로부터 선택되는 임의의 알려진 피토엔 신타아제일 수 있다.
피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 비-데이노코쿠스 피토엔 신타아제 예컨대 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans) (GenBank 수탁 번호: AFZ89043.1, SEQ ID NO: 1) 로부터의 CrtB 또는 파라코쿠스 (Paracoccus) sp_N81106 (GenBank 수탁 번호: BAE47469.1; SEQ ID NO: 2) 로부터의 CrtB 로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 데이노코쿠스 박테리아로부터의 임의의 피토엔 신타아제로부터 선택될 수 있다.
데이노코쿠스 피토엔 신타아제 (CrtB) 의 예는 D. 게오테르말리스 (Uniprot 수탁 번호: Q1J109; SEQ ID NO: 3), D. 악티노스클레루스 (Uniprot 수탁 번호: A0A0U3KC93; SEQ ID NO: 4), D. 데세르티 (Uniprot 수탁 번호: C1D2Z3; SEQ ID NO: 5), D. 고비엔시스 (Uniprot 수탁 번호: H8GYF6; SEQ ID NO: 6), D. 마리코펜시스 (Uniprot 수탁 번호: E8UAM8; SEQ ID NO: 7), D. 페라리딜리토리스 (Uniprot 수탁 번호: L0A567; SEQ ID NO: 8), D. 푸니세우스 (Uniprot 수탁 번호: A0A172TDE8; SEQ ID NO: 9), D. 라디오두란스 (Uniprot 수탁 번호: Q9RW07; SEQ ID NO: 10), D. 솔리 (Uniprot 수탁 번호: A0A0F7JV05; SEQ ID NO: 11) 및 D. 스우엔시스 (Uniprot 수탁 번호: A0A0A7KGT0; SEQ ID NO: 12) 로부터의 피토엔 신타아제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 또한 임의의 피토엔 신타아제 활성을 나타내고 위에 열거된 임의의 피토엔 신타아제와 적어도 60 %, 바람직하게는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
특별한 구현예에서, 피토엔 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID NO: 1 내지 12 로 이루어지는 군으로부터, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 내지 12 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 을 포함하는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩티드; 및
b) 피토엔 신타아제 활성을 나타내고, SEQ ID NO: 1 내지 12 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 서열과, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 내지 12 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 서열과, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 과 적어도 60%, 바람직하게는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%, 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
본 발명에서 사용되는 CrtB 유전자는 또한 개선된 피토엔 신타아제, 즉 야생형 효소의 아미노산 서열과 비교할 때 그것의 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 효소를 인코딩할 수 있으며, 상기 돌연변이는 그것의 활성의 증가, 증가된 특정 촉매 활성, 증가된 기질 특이성, 증가된 단백질 또는 RNA 안정성 및/또는 증가된 세포내 효소 농도를 초래하거나, 또는 피드백 저항성 돌연변이체를 초래한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 개선된 피토엔 신타아제, 특히 개선된 데이노코쿠스 피토엔 신타아제를 인코딩하는 CrtB 유전자를 발현한다. 바람직하게는, 개선된 데이노코쿠스 피토엔 신타아제는 증가된 촉매 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아에서, 내인성 피토엔 디새튜라아제 활성은 비변형 박테리아에 비해 감소되며, 바람직하게는 이러한 활성은 억제된다.
피토엔 디새튜라아제 활성은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 피토엔 디새튜라아제를 카탈라아제 및 글루코오스 옥시다아제의 존재 하에 피토엔과 인큐베이션하고, 메탄올 및 KOH 의 혼합물을 첨가하고, 60℃ 에서 15 min 동안 가열하여 반응을 종료시키고, 인큐베이션 혼합물로부터의 생성물을 디에틸 에테르/경질 석유로 추출하고, 용매 상을 증발시키고, 잔류물을 냉 아세톤/메탄올에 재용해시키고, 생성물을 HPLC 에 의해 확인하여 평가될 수 있다 (예를 들어 Xu et al., Microbiology, 153, 1642-1652, 2007 참조).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 유의한 또는 검출가능한 양의 피토플루엔 또는 피토엔에서 리코펜으로의 임의의 기타 중간체 분자를 생산하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자, CrtI 유전자를 불활성화시키도록 유전자 조작된다. 이러한 불활성화는 피토엔이 리코펜으로 전환되는 것을 방지하고, 따라서 피토엔 축적을 초래한다.
CrtI 유전자는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어 이 유전자의 전부 또는 일부의 결실에 의해, 논센스 코돈 또는 프레임시프트 유도 돌연변이의 도입에 의해, 또는 유전자 또는 발현 카세트, 예를 들어 CrtB 유전자 또는 CrtB 유전자를 포함하는 발현 카세트의 삽입에 의해 불활성화될 수 있다.
대안적으로는, 내인성 CrtI 유전자의 발현이 감소될 수 있다. 이러한 감소는, 예를 들어, 내인성 프로모터를 더 약한 프로모터, 예컨대 PlexA 또는 PamyE 프로모터로 대체하여 수득될 수 있다 (Meima et al. 2001. J Bacteriol 183: 3169-3175).
바람직한 구현예에서, CrtI 유전자는, 바람직하게는, 예를 들어 유전자 대체에 의해, 상기 유전자의 전부 또는 일부를 결실시켜 불활성화된다.
피토엔 디새튜라아제의 예는 D. 게오테르말리스 (Uniprot 수탁 번호: Q1J108; SEQ ID NO: 13), D. 악티노스클레루스 (Uniprot 수탁 번호: A0A0U4CEJ5; SEQ ID NO: 14), D. 데세르티 (Uniprot 수탁 번호: C1D2Z4; SEQ ID NO: 15), D. 고비엔시스 (Uniprot 수탁 번호: H8GYF5; SEQ ID NO: 16), D. 마리코펜시스 (Uniprot 수탁 번호: E8UAM7; SEQ ID NO: 17), D. 페라리딜리토리스 (Uniprot 수탁 번호: L0A6E5; SEQ ID NO: 18), D. 프로테올리티쿠스 (Uniprot 수탁 번호: F0RJ97; SEQ ID NO: 19), D. 푸니세우스 (Uniprot 수탁 번호: A0A172TAT8; SEQ ID NO: 20), D. 라디오두란스 (Uniprot 수탁 번호: Q9RW08; SEQ ID NO: 21), D. 솔리 (Uniprot 수탁 번호: A0A0F7JTT9; SEQ ID NO: 22) 및 D. 스우엔시스 (Uniprot 수탁 번호: A0A0A7KJM4; SEQ ID NO: 23) 의 피토엔 디새튜라아제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아에서 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 임의의 상기 확인된 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 핵산과의 상동에 기초하는, 일상적 방법을 사용하여 용이하게 확인될 수 있다.
피토엔의 생산을 향상시키기 위해서, 본 발명의 재조합 박테리아는 또한 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP) 의 생산을 증가시키기 위해서 유전자 조작될 수 있다.
특히, 본 발명의 재조합 박테리아는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP) 로의 탄소 유동을 증가시키도록 및/또는 IPP 및 DMAPP 의 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP) 로의 전환을 증가시키도록 유전자는 조작될 수 있다.
IPP 및 DMAPP 로의 탄소 유동은 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트/1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 (MEP/DXP) 경로를 향상시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "MEP 경로" 또는 "MEP/DXP 경로" 는 피루베이트 및 D-글리세르알데히드 3-포스페이트의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 (DXP) 로의 축합으로 IPP 및 DMAPP 의 형성을 초래하는 생합성 경로를 나타낸다. 이러한 경로는 하기 효소를 수반한다: 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (EC 2.2.1.7), 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 리덕토아이소머라아제 (EC 1.1.1.267), 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜일트랜스퍼라아제 (EC 2.7.7.60), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나아제 (EC 2.7.1.148), 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타아제 (EC 4.6.1.12), 4-히드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 신타아제 (EC 1.17.7.1), 4-히드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 리덕타아제 (EC 1.17.1.2), 및 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2).
이 경로는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어 특허 출원 WO 2015/189428 에 기재된 방법에 의해 향상될 수 있다. 특히, 이 경로는 DXP 신타아제 (DXS), DXP 리덕토아이소머라아제 (DXR), IspD, IspE, IspF, IspG, IspH 및 IPP 아이소메라아제 활성 (IDI) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소 활성을 증가시킴으로써, 바람직하게는 적어도 DXP 신타아제 및 IPP 아이소메라아제 활성을 증가시킴으로써 향상될 수 있다.
효소 활성 (예를 들어 DXS, DXR, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH, IDI 또는 FPPS 활성) 은 피토엔 신타아제 활성에 관해 위에서 상세히 기재된 바와 같이, 즉 내인성 유전자의 과발현 또는 이종 유전자의 발현, 및/또는 내인성 효소의 개선된 변이체의 발현에 의해 증가될 수 있다.
용어 "DXS" 또는 "DXP 신타아제" 는 피루베이트 및 D-글리세르알데히드 3-포스페이트의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 (DXP) 로의 축합을 촉매작용하는 dxs 유전자에 의해 인코딩되는 효소 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (EC 2.2.1.7) 를 나타낸다. 유전자 산물의 명칭, "DXP 신타아제", "DXS" 또는 "DXPS" 는 본 출원에서 호환되게 사용된다. DXP 신타아제 활성은 Lois et al. (1998) 에 의해 기재된 바와 같은 방사성표지된 기질 또는 당업자에게 알려진 임의의 기타 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 용어 "DXP 리덕토아이소머라아제" 또는 "DXR" 은 dxr 유전자에 의해 인코딩되는 효소 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 리덕토아이소머라아제 (EC 1.1.1.267) 를 나타낸다. 용어 "IspD" 는 ispD 유전자에 의해 인코딩되는 효소 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트 시티딜일트랜스퍼라아제 (EC 2.7.7.60) 를 나타낸다. 용어 "IspE" 는 ispE 유전자에 의해 인코딩되는 효소 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나아제 (EC 2.7.1.148) 를 나타낸다. 용어 "IspF" 는 ispF 유전자에 의해 인코딩되는 효소 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타아제 (EC 4.6.1.12) 를 나타낸다. 용어 "IspG" 는 ispG 유전자에 의해 인코딩되는 효소 4-히드록시-3-메틸부트-2-엔-1-일 디포스페이트 신타아제 (EC 1.17.7.1) 를 나타낸다. 용어 "IspH" 는 ispH 유전자에 의해 인코딩되는 또한 히드록시메틸부테닐 피로포스페이트 리덕타아제 (EC 1.17.1.2) 로 명명되는 효소 4-히드록시-3-메틸부트-2-에닐 디포스페이트 리덕타아제를 나타낸다. 용어 "IDI", "IPP 아이소메라아제" 또는 "이소펜테닐 피로포스페이트 아이소메라아제" 는 동형대립인자 기질 이소펜테닐 (IPP) 의 그것의 대립인자 이성질체, 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP) 로의 1,3-대립인자 재배열을 촉매작용하는 idi 유전자에 의해 인코딩되는 효소 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) 를 나타낸다. 유기체에 따라, 상기 확인된 효소의 명명법 및 인코딩 유전자는 다를 수 있다. 그러나, 명확성을 위해, 본 명세서에서, 이들 용어는 효소 또는 유전자의 기원에 독립적으로 사용된다.
바람직하게는, dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH 및 idi 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 과발현되고, 더욱 바람직하게는 적어도 dxs 및/또는 idi 유전자, 및 더더욱 바람직하게는 적어도 dxs 및 idi 유전자가 과발현된다. 이들 유전자는 내인성 또는 이종, 바람직하게는 내인성일 수 있다. 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH 및 idi 유전자는 특허 출원 WO 2015/189428 에 기재된 바와 같이 용이하게 식별될 수 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 내인성 dxs 유전자를 과발현하도록 또는 이종 dxs 유전자를 발현하도록, 및 내인성 idi 유전자를 과발현하도록 또는 이종 idi 유전자를 발현하도록 유전자 조작된다.
바람직한 구현예에서, 과발현된 내인성 또는 발현된 이종 dxs 유전자는 데이노코쿠스 박테리아로부터의 것이다. 데이노코쿠스 박테리아로부터의 dxs 유전자의 예는 D. 게오테르말리스 (SEQ ID NO: 24; UniProt 수탁 번호: Q1IZP0), D. 윤웨이엔시스 (D. yunweiensis) (SEQ ID NO: 25), D. 데세르티 (NCBI 수탁 번호: WP_012692944.1; GenBank: ACO45821.1; UniProt 수탁 번호: C1D1U7), D. 라디오두란스 (UniProt 수탁 번호: Q9RUB5; NCBI 수탁 번호: WP_010888114.1) 및 D. 라디오푸그난스 (SEQ ID NO: 26) 로부터의 dxs 유전자를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 바람직하게는, dxs 유전자는 D. 게오테르말리스, D. 윤웨이엔시스 및 D. 라디오푸그난스로부터의 dxs 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, dxs 유전자는 D. 윤웨이엔시스 또는 D. 라디오푸그난스로부터의 것이다. 그들 유전자에 의해 인코딩되는 임의의 폴리펩티드와, 바람직하게는 SEQ ID NO: 24, 25 또는 26 에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 서열 동일성을 갖고, DXS 활성을 갖는, 바람직하게는 데이노코쿠스 박테리아로부터의, 임의의 폴리펩티드가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 과발현된 내인성 또는 발현된 이종 idi 유전자는 데이노코쿠스 박테리아로부터의 것이다. 데이노코쿠스 박테리아로부터의 idi 유전자의 예는 D. 게오테르말리스 (SEQ ID NO: 27), D. 윤웨이엔시스 (SEQ ID NO: 28), D. 데세르티 (NCBI 수탁 번호: WP_012692934.1), D. 라디오두란스 (UniProt 수탁 번호: Q9RVE2.3) 또는 D. 라디오푸그난스 (SEQ ID NO: 29) 로부터의 idi 유전자를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 바람직하게는, idi 유전자는 D. 게오테르말리스 및 D. 윤웨이엔시스로부터의 idi 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, idi 유전자는 D. 윤웨이엔시스로부터의 것이다. 그들 유전자에 인코딩되는 임의의 폴리펩티드와, 바람직하게는 SEQ ID NO: 27, 28 또는 29 에 인코딩되는 폴리펩티드와 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 서열 동일성을 갖고, IDI 활성을 갖는, 바람직하게는 데이노코쿠스 박테리아로부터의, 임의의 폴리펩티드가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
또한, 또는 대안적으로는, 본 발명의 재조합 박테리아는 또한 야생형 효소와 비교할 때 증가된 활성을 나타내는 데이노코쿠스 DXP 신타아제의 변이체를 발현할 수 있다. 그러한 개선된 DXP 신타아제는 국제 특허 출원 WO 2015/189428 및 WO 2012/052171 에 기재되어 있다.
특히, 본 발명의 재조합 박테리아는 D. 라디오푸그난스로부터의 DXP 신타아제의 R244C 돌연변이체 (SEQ ID NO: 30) 를 인코딩하는 유전자, D. 윤웨이엔시스로부터의 DXP 신타아제의 R238C 돌연변이체 (SEQ ID NO: 31) 를 인코딩하는 유전자 및/또는 D. 게오테르말리스로부터의 DXP 신타아제의 R241C 돌연변이체 (SEQ ID NO: 32) 를 인코딩하는 유전자를 발현할 수 있다.
또한, 또는 대안적으로는, 피토엔 생산은 또한 IPP 및 DMAPP 의 GGPP 로의 전환을 증가시킴으로써 개선될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아에서, FPP 신타아제 활성은 야생형 박테리아와 비교할 때 증가된다.
본원에서 사용되는, 용어 "IspA", "FDPS", "FPPS" 또는 "FPP 신타아제" 는 fdps (또는 crtE) 유전자에 의해 인코딩되고 파르네실 디포스페이트 신타아제 활성 (EC 2.5.1.10), 디메틸알릴트랜스트랜스퍼라아제 활성 (EC 2.5.1.1) 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타아제 활성 (EC 2.5.1.29) 을 나타내는 효소를 나타낸다.
바람직하게는, FPP 신타아제 활성은 내인성 유전자의 과발현 또는 이종 fdps 유전자의 발현에 의해 증가된다. 특히, 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 FPP 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있고/있거나 FPP 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산을 과발현할 수 있다.
FPP 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 임의의 알려진 FPP 신타아제, 바람직하게는 데이노코쿠스 박테리아로부터의 임의의 FPP 신타아제일 수 있다.
데이노코쿠스 FPP 신타아제의 예는 D. 게오테르말리스 (NCBI 수탁 번호: ABF45913; SEQ ID NO: 33), D. 라디오두란스 (NCBI 수탁 번호: NP_295118; SEQ ID NO: 34) 및 D. 데세르티 (NCBI 수탁 번호: ACO46371; SEQ ID NO: 35) 로부터의 FPP 신타아제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. FPP 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 또한 FPP 신타아제 활성을 나타내고 위에 열거된 임의의 FPP 신타아제와 적어도 60 %, 바람직하게는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 임의의 폴리펩티드일 수 있다.
특별한 구현예에서, FPP 신타아제 활성을 나타내는 폴리펩티드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID NO: 33 내지 35 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩티드; 및
b) FPP 신타아제 활성을 나타내고 SEQ ID NO: 33, 34 또는 35 와 적어도 60%, 바람직하게는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
특별한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP) 로의 탄소 유동을 증가시키기 위해서 및 IPP 및 DMAPP 의 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP) 로의 전환을 증가시키기 위해서 유전자 조작된다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 야생형 박테리아와 비교할 때 증가된 FPP 신타아제, DXP 신타아제 및/또는 IPP 아이소메라아제 활성을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 야생형 박테리아와 비교할 때 증가된 FPP 신타아제, DXP 신타아제 및 IPP 아이소메라아제 활성을 나타낸다.
더욱 특별한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아, 바람직하게는 D. 게오테르말리스 박테리아는
- 바람직하게는 선천 CrtB 유전자를 과발현시킴으로써, 증가된 피토엔 신타아제 활성을 나타내도록,
- 바람직하게는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 CrtI 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써, 감소된 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내도록,
- 바람직하게는 선천 FPP 신타아제 유전자를 과발현시킴으로써, 증가된 FPP 신타아제 활성을 나타내도록,
- 바람직하게는 데이노코쿠스 DXP 신타아제의 변이체, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 31 에 의해 인코딩되는 변이체를 발현시킴으로써, 증가된 DXP 신타아제 활성을 나타내도록, 및
- 바람직하게는 선천 idi 유전자를 과발현시키거나 또는 이종 idi 유전자를 발현시키거나, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 28 에 의해 인코딩되는 효소를 발현시킴으로써, 증가된 IPP 아이소메라아제 활성을 나타내도록
유전자 조작된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아, 바람직하게는 데이노코쿠스 게오테르말리스, 더욱 바람직하게는 이전 단락에서 정의된 바와 같은 재조합 박테리아는, 호기생활에서 및 탄소원으로서의 글루코오스의 존재 하에 배양될 때, 적어도 5 ㎎/g DCW 의 피토엔, 바람직하게는 적어도 10 ㎎/g DCW 의 피토엔, 더욱 바람직하게는 적어도 15 ㎎/g DCW 의 피토엔, 더더욱 바람직하게는 적어도 20 ㎎/g DCW 의 피토엔을 생산할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 피토엔의 오직 하나의 이성질체, 즉 15-시스 피토엔을 생산하고, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않는다.
또다른 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 세포 추출물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는, 용어 "세포 추출물" 은 숙주 세포로부터 수득되는 임의의 분획, 예컨대 세포 상청액, 세포 잔해물, 세포 벽, DNA 또는 RNA 추출물, 효소 또는 효소 제제 또는, 생세포가 본질적으로 또는 대개 없는, 화학적, 물리적 및/또는 효소 처리에 의해 숙주 세포로부터 유래하는 임의의 제제를 나타낸다.
특별한 구현예에서, 세포 추출물은 피토엔을 포함하고, 바람직하게는 세포 막을 포함하는 분획이다. 특히, 세포 추출물은 피토엔 및 지질, 예컨대 막 지질을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 추출물은 피토엔을 포함하고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는다.
더욱 특별한 구현예에서, 세포 추출물은 오직 하나의 카로테노이드 화합물을 포함하고, 상기 화합물은 피토엔이다.
바람직한 구현예에서, 추출물은 피토엔의 오직 하나의 이성질체, 즉 15-시스 피토엔을 포함하고, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 피토엔을 생산하기 위한 상기 세포 추출물의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 피토엔을 생산하기 위한 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 피토엔, 바람직하게는 15-시스 피토엔의 생산 방법으로서, (i) 본 발명에 따른 재조합 데이노코쿠스 박테리아를 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및 임의로는 (ii) 상기 피토엔을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 추가로 상기 피토엔을 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 유의한 또는 검출가능한 양의 피토플루엔 또는 피토엔에서 리코펜으로의 임의의 기타 중간체 분자를 생산하지 않는다.
따라서, 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 또는 본 발명의 용도에 따라 생산된 피토엔은 피토플루엔 또는 피토엔에서 리코펜으로의 임의의 기타 중간체 분자 (즉 ζ-카로틴, 뉴로스포렌), 또는 리코펜이 없다.
본원에서 사용되는, 용어 "없는" 은 피토엔이 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔 또는 피토엔에서 리코펜으로의 임의의 기타 중간체 분자, 바람직하게는 피토플루엔을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 피토플루엔 또는 임의의 기타 중간체 분자의 존재는 당업자에게 알려진 임의의 방법 예컨대 HPLC 분석에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아에 관해 위에서 기재된 모든 구현예가 또한 이러한 양상에서 고려된다.
피토엔을 생산하기에 적합한 조건은 사용되는 재조합 데이노코쿠스 박테리아에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특히, 탄소원은 C5 당 예컨대 자일로오스 및 아라비노오스, C6 당 예컨대 글루코오스, 셀로비오스, 사카로오스 및 전분으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 탄소원은 글루코오스이다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 호기생활에서 및 탄소원으로서의 글루코오스의 존재 하에 배양했다.
대안적으로는, 피토엔은 재생가능한, 생물학적으로 유래된 탄소원 예컨대 본원에서 사용되는 셀룰로오스 바이오매스로부터 생산된다. 용어 "셀룰로오스 바이오매스" 는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그노셀룰로오스를 포함하는, 바람직하게는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 포함하는 임의의 바이오매스 물질, 바람직하게는 식물 바이오매스를 나타낸다. 셀룰로오스 바이오매스는 식물 물질 예컨대 임산물, 목질 공급원료 (연재 및 경재), 농업 폐기물 및 식물 잔재 (예컨대 옥수수 대, 수수, 수개인 바가스 (sugane bagasse), 잔디, 볏짚, 밀짚, 기름 야자나무와 대추야자나무의 빈 과실 송이, 데킬라 공업의 아가베 바가스), 다년생초 (지팽이풀, 억새, 카나리아풀, 에리안투스 (erianthus), 내피어 그라스 (napier grass), 물대, 및 알팔파); 도시 고형 폐기물 (MSW), 수산물 예컨대 조류 및 해조류, 휴지, 가죽, 면, 삼베, 천연 고무 제품, 및 식품 가공 부산물을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 셀룰로오스 바이오매스가 리그노셀룰로오스를 포함하는 경우에, 이러한 바이오매스는 가수분해 전에 전처리된다. 이러한 전처리는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스의 고분자 사슬에 접근하기 위해서 리그노셀룰로오스의 번들을 여는 것을 의도한다. 전처리 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 물리적 전처리 (예를 들어 고압 스티밍, 압출, 열분해 또는 조사), 물리화학적 및 화학적 전처리 (예를 들어 암모니아 섬유 폭발, 알칼리성, 산성, 용매 또는 산화제 처리) 및/또는 생물학적 전처리를 포함할 수 있다.
온도 조건은 또한 중온성 또는 호열성 데이노코쿠스 박테리아의 사용에 따라 적응될 수 있다.
하나의 구현예에서, 데이노코쿠스 박테리아는 호열성 데이노코쿠스, 예컨대 예를 들어 D. 게오테르말리스 또는 D. 무라이이고, 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 배양은 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 35 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 50℃, 더더욱 바람직하게는 45 내지 48℃ 에 포함되는 온도에서 수행된다.
또다른 구현예에서, 데이노코쿠스 박테리아는 중온성 데이노코쿠스, 예컨대 예를 들어 D. 그란디스, D. 아쿠아티쿠스, D. 인디쿠스, D. 셀룰로실리티쿠스 또는 D. 데폴리메란스이고, 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 배양은 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28 내지 35℃ 에 포함되는 온도에서, 더욱 바람직하게는 약 30℃ 에서 수행된다.
바람직한 구현예에서, 적어도 5 ㎎/g DCW 의 피토엔, 바람직하게는 적어도 10 ㎎/g DCW 의 피토엔, 더욱 바람직하게는 적어도 15 ㎎/g DCW 의 피토엔, 더더욱 바람직하게는 적어도 20 ㎎/g DCW 의 피토엔이 본 발명의 방법으로 생산 및/또는 회수된다.
임의로는, 본 발명의 방법은 생산된 또는 회수된 피토엔을, 예를 들어 아이소메라아제를 사용하는, 이성질화 단계에 적용하여 또다른 피토엔 이성질체를 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 반응기, 특히 바이오매스의 전환 반응기에서 수행될 수 있다. "반응기" 는 종래의 발효 탱크 또는 바이오매스 전환을 위한 임의의 장비 또는 시스템, 전형적으로는 생물반응기, 바이오필터, 회전식 생물학적 접촉기, 및 기타 기체 및/또는 액체 상 생물반응기로부터 선택되는 것을 의미한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 장비는 연속적으로 또는 회분식 로드로 사용될 수 있다. 사용되는 세포에 따라, 본 발명의 방법은 호기생활, 혐기생활 또는 미세호기생활 하에 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아, 또는 그의 세포 추출물을 포함하는 반응기에 관한 것이다. 바람직하게는, 반응기는 탄소원, 더욱 바람직하게는 생물학적으로 유래된 탄소원 예컨대 셀룰로오스 바이오매스를 추가로 포함한다. 본 발명은 추가로 피토엔을 생산하기 위한 상기 반응기의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아 또는 그의 추출물을 포함하는 조성물 및 피토엔을 생산하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 탄소원, 더욱 바람직하게는 생물학적으로 유래된 탄소원 예컨대 셀룰로오스 바이오매스를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득되는 피토엔, 바람직하게는 단리된 또는 정제된 피토엔에 관한 것이다. 단리된 피토엔에는 전형적으로는 적어도 일부의 단백질 또는 그것이 통상적으로 관련되는 또는 그것이 함께 통상적으로 혼합되거나 또는 용액에 있는 세포의 기타 구성성분이 없다. 정제된 피토엔에는 전형적으로는 세포의 기타 구성성분이 거의 없다.
본 발명은 추가로 본 발명의 방법에 의해 수득되는 피토엔을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 상기 조성물은 화장품 또는 약제 조성물이다.
또다른 구현예에서, 상기 조성물은 기능식품 또는 미용식품 조성물, 또는 식품 또는 사료 첨가제이다.
본원에서 사용되는, 용어 "기능식품 조성물" 은 식품으로부터 단리 또는 정제된 영양소를 포함하고 소비자의 건강에 유익한 효과를 갖는 조성물을 나타낸다. 본원에서 사용되는, 용어 "미용식품 조성물" 은 영양 경구 성분을 포함하고 구체적으로는 미용 목적을 위해 배합 및 시판되는 조성물을 나타낸다.
특별한 구현예에서, 화장품 또는 약제 조성물은 피부 미백, 라이트닝 또는 표백 조성물 또는 노화, 산화 또는 광산화 손상 방지 조성물이다.
피토엔은 또한 항암 및 항-염증 특성을 보이는 것으로 알려졌다. 따라서, 하나의 구현예에서, 조성물은 암의 치료에서 또는 염증 장애의 치료 에서 사용되는 약제 조성물이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 국소 또는 경구 경로에 의해 투여될 것이다.
바람직하게는, 상기 조성물은 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 및/또는 리코펜을 포함하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 상기 조성물은 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 재조합 데이노코쿠스 박테리아 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 명백히, 그것의 용도에 따라, 기타 성분, 예컨대 미용적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 보존제, 항산화제 예컨대 카로테노이드, 뿐만 아니라 약제학적 또는 미용적 활성 성분을 또한 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 조성물은 전형적으로는 화장품, 약제 또는 식품 산업에서 사용되는 오일, 예컨대 식물, 광물 또는 합성 오일로부터 선택될 수 있는 소수성 담체를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물, 특히 화장품, 약제, 기능식품, 미용식품 조성물 또는 식품 또는 사료 첨가제의 생산 방법으로서, (i) 본 발명에 따른 재조합 데이노코쿠스 박테리아를 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, (ii) 상기 피토엔을 회수하는 단계, 및 (iii) 상기 피토엔을 적어도 하나의 담체 또는 화장품, 약제, 기능식품, 미용식품 조성물 또는 식품 또는 사료 첨가제의 적어도 하나의 기타 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
재조합 데이노코쿠스 박테리아, 피토엔의 생산 방법 및 본 발명의 조성물에 관해 위에서 기재된 모든 구현예가 또한 이러한 양상에서 고려된다.
본 발명의 추가의 양상 및 이점은 하기 실시예에서 기재될 것이며, 실시예는 예시적이며 제한적이 아니라고 여겨질 것이다.
실시예
실시예 1
데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 피토엔을 생산하도록 유전자 조작했다. 카로테노이드 경로의 일부를 파괴함으로써, 즉 피토엔 디새튜라아제 (E.C. 1.3.99.26, 1.3.99.28, 1.3.99.29, 1.3.99.31) (crtI) 유전자를 녹아웃시킴으로써, 피토엔을 생산하는 재조합 D. 게오테르말리스가 수득되었다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검했다.
시드 배양물을 만들기 위해서, 개별 콜로니를 뽑아서 주요 탄소원으로서 2% 글루코오스 또는 덱스트로오스를 함유하는 25 ㎖ 의 CMG 2% 배지 (펩톤 2 g/L; 효모 추출물 5 g/L; 글루코오스 55 mM (20 g/L); MOPS 산 40 mM; NH4Cl 20 mM; NaOH 10 mM; KOH 10 mM; CaCl2·2H2O 0.5 μM; Na2SO4·10H2O 0.276 mM; MgCl2 ·6H2O 0.528 mM; (NH4)6(Mo7)O24·4H2O 3 nM; H3BO3 0.4 μM; CoCl2·6H2O 30 nM; CuSO4·5H2O 10 nM; MnCl2 0.25 μM; ZnSO4·7H2O 10 nM; D-비오틴 1 ㎍/L; 니아신 (니코틴산) 1 ㎍/L; B6 비타민 1 ㎍/L; B1 비타민; FeCl3 20 μM; 소듐 시트레이트·2H2O 20 μM; K2HPO4 5.7 mM) 에 접종하고, 45℃ 및 250 rpm 에서 밤새 배양했다. 그 후 log 성장기로부터의 시드를 25 ㎖ 의 동일한 새로운 배지에 0.4 의 600 ㎚ (OD600) 에서의 초기 광학 밀도로 접종했다. 이러한 두번째 시드 배양을 45℃ 및 250 rpm 에서 밤새 배양했다. 피토엔 생산을 위한 배양을 45℃ 및 250 rpm 에서 log 성장기로부터 24 h 동안 25 ㎖ 의 미네랄 규정 배지 (NH4)2SO4 < 100 mM; NaH2PO4·H2O < 10 mM; KCl < 10 mM; Na2SO4 < 10 mM; 시트르산 < 30 mM; MgCl2·6H2O < 10 mM; CaCl2·2H2O < 10 mM; ZnCl2 < 50 ㎎/L; FeSO4·7H2O <50 ㎎/L; MnCl2·4H2O <50 ㎎/L; CuSO4 < 50 ㎎/L; CoCl2·6H2O < 50 ㎎/L; H3BO3 < 5 ㎎/L; MES < 200 mM; (NH4)6Mo7O24·4H2O < 0.5 mM; 글루코오스 또는 덱스트로오스 < 30 g/L (166 mM) 에 0.4 의 600 ㎚ (OD600) 에서의 초기 광학 밀도로 접종하여 수행했다.
24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행했다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석했다.
마지막으로, 피토엔 수율 (단위: ㎎/g 건조 세포 중량 (DCW)) 을 피토엔 표준의 희석에 의해 확인했다. 재조합 D. 게오테르말리스는 0.4 ㎎/g DCW 의 피토엔을 생산했고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않았다.
재조합 D. 게오테르말리스에 의해 생산된 피토엔 이성질체를 RMN 에 의해 분석했고, 15-시스 피토엔으로서 확인되었다.
실시예 2
실시예 1 의 재조합 데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 하기를 포함하는 발현 카세트를 염색체 내에 삽입함으로써 추가로 변형시켰다:
(i) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (E.C. 2.2.1.7) (DXS) 의 R238C 돌연변이체를 인코딩하는 유전자, 및
(ii) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) (IDI) 를 인코딩하는 유전자.
이들 유전자를 구성적 프로모터의 제어 하에 두고, the 발현 카세트를 염색체 내에 삽입하여 아밀라아제 (amy) 유전자를 대체했다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검했다.
시드 배양 및 피토엔의 생산을 위한 배양을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다.
24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행했다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석했다.
재조합 D. 게오테르말리스는 약 1 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산했고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않았다는 것이 그에 따라 확인되었다.
실시예 3
실시예 1 의 재조합 데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 하기를 포함하는 발현 카세트를 염색체 내에 삽입함으로써 추가로 변형시켰다:
(i) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (E.C. 2.2.1.7) (DXS) 의 R238C 돌연변이체를 인코딩하는 유전자,
(ii) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) (IDI) 를 인코딩하는 유전자,
(iii) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 파르네실 피로포스페이트 신타아제 (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) 를 인코딩하는 유전자 (FPPS), 및
(iv) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 피토엔 신타아제 (EC 2.5.1.32) (CrtB) 를 인코딩하는 유전자.
이들 유전자를 구성적 프로모터의 제어 하에 두고, 발현 카세트를 염색체 내에 삽입하여 아밀라아제 (amy) 유전자를 대체했다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검했다.
시드 배양 및 피토엔의 생산을 위한 배양을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다.
24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행했다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석했다.
재조합 D. 게오테르말리스는 약 22 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산했고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않았다는 것이 그에 따라 확인되었다.
실시예 4
실시예 1 의 재조합 데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 하기를 염색체 내에 삽입함으로써 추가로 변형시켰다:
하기를 포함하는 첫번째 발현 카세트
(i) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (E.C. 2.2.1.7) (DXS) 의 R238C 돌연변이체를 인코딩하는 유전자, 및
(ii) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) (IDI) 를 인코딩하는 유전자,
및 하기를 포함하는 두번째 발현 카세트
(iii) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 파르네실 피로포스페이트 신타아제 (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) 를 인코딩하는 유전자 (FPPS), 및
(iv) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 피토엔 신타아제 (EC 2.5.1.32) (CrtB) 를 인코딩하는 유전자.
이들 유전자를 구성적 프로모터의 제어 하에 두었다. 첫번째 및 두번째 발현 카세트를 염색체 내에 삽입하여 아밀라아제 (amy) 유전자 및 내인성 fdps 유전자, 각각을 대체했다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검했다.
시드 배양 및 피토엔의 생산을 위한 배양을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다.
24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행했다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석했다.
재조합 D. 게오테르말리스는 23 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산?고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않았다는 것이 그에 따라 확인되었다.
실시예 5
실시예 1 의 재조합 데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 하기를 포함하는 발현 카세트를 염색체 내에 삽입함으로써 추가로 변형시켰다:
(i) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (E.C. 2.2.1.7) (DXS) 또는 데이노코쿠스 게오테르말리스를 인코딩하는 유전자,
(ii) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) (IDI) 를 인코딩하는 유전자,
(iii) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 파르네실 피로포스페이트 신타아제 (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) 를 인코딩하는 유전자 (FPPS), 및
(iv) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 피토엔 신타아제 (EC 2.5.1.32) (CrtB) 를 인코딩하는 유전자.
이들 유전자를 구성적 프로모터의 제어 하에 두고, 발현 카세트를 염색체 내에 삽입하여 아밀라아제 (amy) 유전자를 대체한다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검한다.
시드 배양 및 피토엔의 생산을 위한 배양을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행한다. 24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행한다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석한다.
실시예 6
실시예 1 의 재조합 데이노코쿠스 게오테르말리스 균주를 하기를 염색체 내에 삽입함으로써 추가로 변형시켰다:
하기를 포함하는 첫번째 발현 카세트
(i) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 1-데옥시-D-자일룰로오스 5-포스페이트 신타아제 (E.C. 2.2.1.7) (DXS) 또는 데이노코쿠스 게오테르말리스를 인코딩하는 유전자, 및
(ii) 데이노코쿠스 윤웨이엔시스로부터의 이소펜테닐-디포스페이트 델타-아이소머라아제 (EC 5.3.3.2) (IDI) 를 인코딩하는 유전자,
및 하기를 포함하는 두번째 발현 카세트
(iii) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 파르네실 피로포스페이트 신타아제 (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) 를 인코딩하는 유전자 (FPPS), 및
(iv) 데이노코쿠스 게오테르말리스로부터의 피토엔 신타아제 (EC 2.5.1.32) (CrtB) 를 인코딩하는 유전자.
이들 유전자를 구성적 프로모터의 제어 하에 둔다. 첫번째 및 두번째 발현 카세트를 염색체 내에 삽입하여 아밀라아제 (amy) 유전자 및 내인성 fdps 유전자, 각각을 대체한다. 결과적인 구축물을 서열분석에 의해 점검한다.
시드 배양 및 피토엔의 생산을 위한 배양을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행한다. 24h 의 배양 후에, 1 ㎖ 의 배양물을 원심분리하고, 1 ㎖ 의 에탄올을 펠렛과 혼합하여 카로테노이드 추출을 수행한다. 에탄올 상을 OD 285 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 분석하고, HPLC (Column c18 poroshell agilent 150㎜*2.1㎜*2.7um, 이동상 아세토니트릴/메탄올/에틸 아세테이트) 에 의해 분석했다.
SEQUENCE LISTING <110> DEINOVE <120> Methods of producing phytoene <130> B2390PC <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 296 <212> PRT <213> Pantoea agglomerans <400> 1 Met Glu Val Gly Ser Lys Ser Phe Ala Thr Ala Ser Lys Leu Phe Asp 1 5 10 15 Ala Lys Thr Arg Arg Ser Val Leu Met Leu Tyr Ala Trp Cys Arg His 20 25 30 Cys Asp Asp Val Ile Asp Asp Gln Val Leu Gly Phe Ser Asn Asp Thr 35 40 45 Pro Ser Leu Gln Ser Ala Glu Gln Arg Leu Ala Gln Leu Glu Met Lys 50 55 60 Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Gly Ser Gln Met His Glu Pro Ala Phe Ala 65 70 75 80 Ala Phe Gln Glu Val Ala Met Ala His Asp Ile Leu Pro Ala Tyr Ala 85 90 95 Phe Asp His Leu Ala Gly Phe Ala Met Asp Val His Glu Thr Arg Tyr 100 105 110 Gln Thr Leu Asp Asp Thr Leu Arg Tyr Cys Tyr His Val Ala Gly Val 115 120 125 Val Gly Leu Met Met Ala Gln Ile Met Gly Val Arg Asp Asn Ala Thr 130 135 140 Leu Asp Arg Ala Cys Asp Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ala Arg Asp Ile Val Glu Asp Ala Glu Ala Gly Arg Cys Tyr Leu Pro 165 170 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Met Leu Ile Val Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val 180 185 190 Gly Ala Met Asn Lys Phe Met Arg Gly Leu Gln Val Gln Lys Trp Phe 195 200 205 Gln Glu Gly Glu Gly Ala Gly Lys Lys Ala Met Gln Ala Val Ser Arg 210 215 220 Pro Leu Ala Asn Phe Met Ser Arg Ala Lys Ser Ser Thr Cys His Phe 225 230 235 240 Phe Asp Pro Ala Ser Val Asn Pro Phe Ala Thr Met Gly Val Arg Tyr 245 250 255 Val Gly Pro Val Asp Gly His Asn Val Gln Glu Leu Val Trp Leu Leu 260 265 270 Glu Arg Leu Val Glu Leu Asp Gly Pro Thr Ile Leu His Val Val Thr 275 280 285 Lys Lys Gly Lys Gly Leu Ser Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Ile Tyr Trp 290 295 300 His Gly Pro Gly Lys Phe Asp Pro Glu Thr Gly Asp Phe Val Pro Ser 305 310 315 320 Asn Ala Tyr Ser Trp Ser Asn Ala Phe Gly Asp Ala Val Thr Glu Leu 325 330 335 Ala Lys Ala Asp Pro Arg Thr Phe Val Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu 340 345 350 Gly Ser Gly Leu Val Gly Tyr Ser Lys Ala His Pro His Arg Tyr Leu 355 360 365 Asp Val Gly Ile Ala Glu Glu Val Ala Val Thr Ala Ala Ala Gly Met 370 375 380 Ala Leu Gln Gly Leu Arg Pro Val Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu 385 390 395 400 Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Glu His Leu 405 410 415 Asn Val Thr Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly 420 425 430 Ala Thr His Asn Gly Val Phe Asp Leu Ser Phe Leu Arg Ser Ile Pro 435 440 445 Gly Val Arg Ile Gly Leu Pro Lys Asp Ala Thr Glu Leu Arg Gly Met 450 455 460 Leu Lys Tyr Ala Gln Glu His Pro Gly Pro Phe Ala Ile Arg Tyr Pro 465 470 475 480 Arg Gly Thr Thr Glu Arg Val Pro Glu Gly Thr Trp Pro Thr Leu Ala 485 490 495 Trp Gly Thr Trp Glu Arg Val Lys Ser Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 500 505 510 Ala Gly Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ala Gln Lys Ala Ala Ala Asp Leu 515 520 525 Pro Gly Val Gly Val Val Asn Ala Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Asp 530 535 540 Ala Met Leu Arg Glu Val Ala Gly Ser Ala Arg Ala Ile Val Thr Val 545 550 555 560 Glu Asp Asn Thr Val Val Gly Gly Phe Gly Ser Ala Val Leu Glu Ala 565 570 575 Leu Asn Ala Trp Gly Leu Thr Val Pro Val Arg Val Leu Gly Ile Pro 580 585 590 Asp Glu Phe Gln Glu His Ala Thr Val Asp Ser Val His Ala Arg Ala 595 600 605 Gly Ile Asp Ala Pro Ala Ile Arg Thr Val Leu Ala Glu Leu Gly Val 610 615 620 Asp Val Pro Leu Gly Val 625 630 <210> 32 <211> 633 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R241C mutant of the DXP synthase from D. geothermalis <400> 32 Met Ser Glu Pro Thr Ala Asn Leu Gln Pro Ala Ser Arg Thr Pro Leu 1 5 10 15 Leu Asp Arg Val Asn Gly Pro Glu Asp Leu Lys Arg Leu Gly Arg Asp 20 25 30 Gln Leu Pro Gln Leu Ala Ala Glu Leu Arg Glu Glu Ile Val Arg Val 35 40 45 Cys Ser Val Gly Gly Leu His Leu Ala Ser Ser Leu Gly Ala Thr Asp 50 55 60 Leu Ile Val Ala Leu His Tyr Val Leu His Ser Pro Arg Asp Arg Ile 65 70 75 80 Leu Phe Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Ala His Lys Met Leu Thr Gly 85 90 95 Arg Arg His Leu Met His Thr Val Lys Lys Glu Gly Gly Leu Ser Gly 100 105 110 Phe Thr Lys Val Ser Glu Ser Glu His Asp Ala Ile Thr Val Gly His 115 120 125 Ala Ser Thr Ser Leu Ala Asn Ala Leu Gly Met Ala Leu Ala Arg Asp 130 135 140 Ala Leu Gly Gln Asp Tyr Lys Val Ala Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Ala Ala Leu Asn Thr Ile Gly Asp Leu 165 170 175 Gly Arg Arg Met Leu Ile Val Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser 180 185 190 Glu Asn Val Gly Ala Ile Asn Arg Phe Met Arg Gly Leu Gln Val Gln 195 200 205 Lys Trp Phe Gln Glu Gly Glu Glu Ala Gly Lys Lys Ala Val Gln Ala 210 215 220 Val Ser Lys Pro Leu Ala Asn Leu Met Ser Arg Ala Lys Ser Ser Thr 225 230 235 240 Cys His Phe Phe Asp Pro Ala Ser Val Asn Pro Phe Ala Ala Met Gly 245 250 255 Val Arg Tyr Val Gly Pro Val Asp Gly His Asn Val Gln Glu Leu Val 260 265 270 Trp Leu Ile Glu Arg Leu Val Asp Leu Asp Gly Pro Thr Ile Leu His 275 280 285 Val Val Thr Lys Lys Gly Lys Gly Leu Ser Tyr Ala Glu Ala Asp Pro 290 295 300 Ile Lys Trp His Gly Pro Gly Lys Phe Asp Pro Ala Thr Gly Glu Ser 305 310 315 320 Val Pro Ser Asn Ala Tyr Ser Trp Ser Ser Ala Phe Gly Asp Ala Val 325 330 335 Thr Glu Leu Ala Arg Leu Asp Pro Arg Thr Phe Val Ile Thr Pro Ala 340 345 350 Met Arg Glu Gly Ser Gly Leu Val Arg Tyr Ser Gln Val His Pro His 355 360 365 Arg Tyr Leu Asp Val Gly Ile Ala Glu Asp Val Ala Val Thr Thr Ala 370 375 380 Ala Gly Met Ala Leu Gln Gly Met Arg Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser 385 390 395 400 Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile 405 410 415 Glu Asn Leu Asn Val Thr Phe Ala Ile Asp Arg Gly Gly Ile Val Gly 420 425 430 Ala Asp Gly Ala Thr His Asn Gly Val Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg 435 440 445 Ser Ile Pro Asn Val Gly Ile Gly Leu Pro Lys Asp Ala Ala Glu Leu 450 455 460 Arg Gly Met Leu Lys Tyr Ala Gln Glu His Ala Gly Pro Phe Ala Ile 465 470 475 480 Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Val Glu Arg Val Pro Glu Gly Thr Trp Pro 485 490 495 Glu Leu Arg Trp Gly Thr Trp Glu Arg Leu Gln Asp Gly Asp Asp Val 500 505 510 Val Ile Leu Ala Gly Gly Lys Ala Leu Glu Tyr Ala Leu Lys Ala Ala 515 520 525 Arg Asp Leu Pro Gly Val Gly Val Val Asn Ala Arg Phe Val Lys Pro 530 535 540 Leu Asp Gln Gly Met Leu Arg Glu Val Ala Thr Lys Ala Arg Ala Leu 545 550 555 560 Val Thr Val Glu Asp Asn Thr Val Val Gly Gly Phe Gly Ser Ala Val 565 570 575 Leu Glu Ala Leu Ser Ala Leu Gly Leu Arg Thr Pro Val Arg Val Leu 580 585 590 Gly Ile Pro Asp Ala Phe Gln Asp His Ala Thr Val Glu Ser Val His 595 600 605 Ala Arg Ala Gly Ile Asp Ala Pro Ala Ile Arg Thr Val Leu Ala Glu 610 615 620 Leu Gly Val Asp Val Pro Leu Glu Val 625 630 <210> 33 <211> 329 <212> PRT <213> Deinococcus geothermalis <400> 33 Met His Pro Asp Leu Leu Pro Arg Val Leu Ser Leu Leu Pro Asn Arg 1 5 10 15 Gly Asp Arg Pro Glu Leu Arg Ala Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Tyr 20 25 30 Pro Glu Arg Gly Gly Lys Gly Ile Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ala Arg Ala His Gly Ala Leu Pro Ser Thr Ser Ala Trp Glu Gly Ala 50 55 60 Leu Trp Leu Ala Ala Gly Leu Glu Leu Phe Gln Asn Trp Val Leu Ile 65 70 75 80 His Asp Asp Ile Glu Asp Asp Ser Glu Glu Arg Arg Gly Arg Pro Ala 85 90 95 Leu His Arg Leu Tyr Gly Val Pro Val Ala Ile Asn Val Gly Asp Ala 100 105 110 Leu His Ala Ser Met Trp Ala Ala Val His Arg Ala Gly Val Pro Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Glu Phe Leu Asn Met Val Trp Arg Thr Ala Glu Gly Gln 130 135 140 His Leu Asp Leu Thr Trp Val Gln Glu Arg Ser Trp Asn Leu Gly Glu 145 150 155 160 Ala Asp Tyr Leu Ala Met Val Arg Leu Lys Thr Ala Leu Tyr Thr Val 165 170 175 Val Val Pro Leu Arg Leu Gly Ala Leu Ala Ala Gly Val Leu Pro Asp 180 185 190 Glu Arg Phe Thr Ala Ala Gly Glu Ala Leu Gly Ala Ala Phe Gln Ile 195 200 205 Arg Asp Asp Val Leu Asn Leu Ala Gly Asp Pro Ala Lys Tyr Gly Lys 210 215 220 Glu Ile Gly Gly Asp Leu Trp Glu Gly Lys Arg Thr Leu Ile Val Leu 225 230 235 240 His Trp Leu Ala His Ala Pro Glu Glu Gln Arg Gln Val Phe Leu Glu 245 250 255 Gln Met Arg Arg Asp Arg Ala Asp Lys Asp Ala Ala Ala Ile Ala Ala 260 265 270 Ile His Arg Trp Leu Leu Glu Ser Gly Ser Val Gln Tyr Ala Gln Ala 275 280 285 Tyr Ala Asp Thr Gln Ala Arg Glu Gly Leu Ala Arg Leu Thr Glu Ala 290 295 300 Leu Glu Asn Ala Pro Asp Pro Gln Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ala Gln 305 310 315 320 Leu Arg Gly Leu Ala Thr Arg Glu Ala 325 <210> 34 <211> 329 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans <400> 34 Met Arg Pro Glu Leu Leu Ala Arg Val Leu Ser Leu Leu Pro Glu Thr 1 5 10 15 Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Tyr 20 25 30 Pro Gln Arg Gly Gly Lys Gly Ile Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ala Arg Ala His Gly Leu Ser Glu Ser Asp Thr Gly Trp Glu Ser Ala 50 55 60 Leu Trp Leu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Phe Gln Asn Trp Val Leu Val 65 70 75 80 His Asp Asp Ile Glu Asp Asp Ser Glu Glu Arg Arg Gly Arg Pro Ala 85 90 95 Leu His His Leu Cys Gly Met Pro Val Ala Leu Asn Val Gly Asp Ala 100 105 110 Leu His Ala Tyr Met Trp Ala Ala Val Gly Lys Ala Asn Val Pro Gly 115 120 125 Ala Phe Glu Glu Phe Leu Gln Met Val Tyr Arg Thr Ala Glu Gly Gln 130 135 140 His Leu Asp Leu Ala Trp Val Glu Gly Arg Glu Trp Gly Leu Arg Pro 145 150 155 160 Ala Asp Tyr Leu Gln Met Val Gly Leu Lys Thr Ala His Tyr Thr Val 165 170 175 Ile Val Pro Leu Arg Leu Gly Ala Leu Ala Ala Gly Met Ala Pro Gln 180 185 190 Asp Ala Phe Thr Pro Ala Gly Leu Ala Leu Gly Thr Ala Phe Gln Ile 195 200 205 Arg Asp Asp Val Leu Asn Leu Ala Gly Asp Pro Val Lys Tyr Gly Lys 210 215 220 Glu Ile Gly Gly Asp Leu Leu Glu Gly Lys Arg Thr Leu Ile Val Leu 225 230 235 240 Asp Trp Leu Thr Thr Ala Pro Asp Asp Arg Lys Ala Ile Phe Leu Asp 245 250 255 Gln Met Arg Arg His Arg Ala Asp Lys Asp Pro Ala Val Ile Asp Glu 260 265 270 Ile His Arg Trp Leu Leu Glu Ser Gly Ser Val Glu Ala Ala Gln Asp 275 280 285 Tyr Ala Gln Ala Gln Ala Ala Glu Gly Leu Asp Leu Leu Glu Lys Ala 290 295 300 Leu Ala Asp Ala Pro Asp Ala Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser 305 310 315 320 Val Arg Glu Leu Ala Thr Arg Glu Lys 325 <210> 35 <211> 329 <212> PRT <213> Deinococcus deserti <400> 35 Met Arg Pro Asp Leu Leu Ser Arg Val Leu Ser Leu Leu Pro Asp Gly 1 5 10 15 Gly Thr Arg Pro Glu Leu Arg Gln Phe Ser Glu Met Leu Arg Asp Tyr 20 25 30 Pro Gln Arg Gly Gly Lys Gly Ile Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ala Gln Ala His Gly Val Ala His Asp Thr Asp Ala Trp Asp Gln Ala 50 55 60 Gln Trp Leu Ala Ala Gly Leu Glu Leu Phe Gln Asn Trp Val Leu Ile 65 70 75 80 His Asp Asp Ile Gln Asp Asp Ser Glu Glu Arg Arg Gly Gln Pro Ala 85 90 95 Leu His Arg Leu Tyr Gly Val Pro Leu Ala Ile Asn Val Gly Asp Ala 100 105 110 Leu His Ala Tyr Met Trp Ala Ala Val His Arg Ala Gly Val Pro Gly 115 120 125 Ala Met Glu Glu Phe Leu Thr Met Ile His Arg Thr Ala Glu Gly Gln 130 135 140 His Leu Asp Leu Ser Trp Val Glu His Arg Glu Trp Lys Leu Arg Glu 145 150 155 160 Ala Asp Tyr Leu Glu Met Val Gln Leu Lys Thr Ala His Tyr Thr Val 165 170 175 Ile Val Pro Leu Arg Leu Gly Ala Leu Ala Ala Gly Val Gln Pro Ala 180 185 190 Ser Ala Phe Thr Asn Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ser Ala Phe Gln Ile 195 200 205 Arg Asp Asp Val Leu Asn Leu Leu Gly Asp Pro Leu Lys Tyr Gly Lys 210 215 220 Glu Ile Gly Gly Asp Leu Leu Glu Gly Lys Arg Thr Leu Ile Val Leu 225 230 235 240 Arg Trp Leu Ala Gln Ala Pro Ala Glu Gln Arg Glu Val Phe Leu Asp 245 250 255 Gln Met Arg Arg Asp Arg Ala Ala Lys Asp Pro Ala Val Ile Ala Gln 260 265 270 Ile His Arg Trp Leu Leu Asp Ser Gly Cys Val Thr Ala Ala Gln Asp 275 280 285 Tyr Ala Ala Ala Arg Ala Glu Glu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Ser Ala 290 295 300 Leu Ser Gly Ala Pro Gly Gln Ala Ala Val Gln Gln Ile Leu Gly Ala 305 310 315 320 Met Arg Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ala 325

Claims (23)

  1. 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 (Deinococcus) 박테리아를 배양하는 단계, 및 임의로는 상기 피토엔을 회수하는 단계를 포함하는 피토엔의 생산 방법으로서, 상기 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 증가된 피토엔 신타아제 활성 및 감소된 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내도록 유전자 조작되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 임의의 피토엔 디새튜라아제 활성을 나타내지 않는 생산 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는, 바람직하게는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 결실시키거나 또는 논센스 코돈, 카세트, 유전자 또는 프레임시프트 유도 돌연변이를 도입하는 것에 의해, 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써 유전자 조작되는 생산 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 디새튜라아제를 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 유전자 조작되는 생산 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 신타아제를 인코딩하는 선천 유전자를 과발현하도록 유전자 조작되는 생산 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피토엔 신타아제를 인코딩하는 이종 유전자 또는 피토엔 신타아제를 인코딩하고 인코딩된 효소의 피토엔 신타아제 활성을 개선하는 돌연변이를 포함하는 선천 유전자를 발현하도록 유전자 조작되는 생산 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 피드백 저항성 피토엔 신타아제를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 유전자 조작되는 생산 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 증가된 FPP 신타아제 활성을 추가로 나타내는 생산 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 증가된 DXP 신타아제 및/또는 IPP 아이소메라아제 활성, 바람직하게는 증가된 DXP 신타아제 및 IPP 아이소메라아제 활성을 추가로 나타내는 생산 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 D. 게오테르말리스 (D. geothermalis), D. 무라이 (D. murrayi), D. 그란디스 (D. grandis), D. 아쿠아티쿠스 (D. aquaticus), D. 인디쿠스 (D. indicus), D. 셀룰로실리티쿠스 (D. cellulosilyticus), D. 데폴리메란스 (D. depolymerans), D. 마리코펜시스 (D. maricopensis) 로부터 선택되는 데이노코쿠스 박테리아인 생산 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 데이노코쿠스 게오테르말리스 박테리아인 생산 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 적어도 20 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산할 수 있는 생산 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 호기생활에서 및 탄소원으로서의 글루코오스의 존재 하에 배양될 때 적어도 20 ㎎/g DCW (건조 세포 중량) 의 피토엔을 생산할 수 있는 생산 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 생산하고, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 생산하지 않는 생산 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 데이노코쿠스 박테리아는 호열성 데이노코쿠스, 바람직하게는 D. 게오테르말리스이고, 피토엔을 생산하기에 적합한 조건 하에 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 배양은 40 내지 50℃, 바람직하게는 45 내지 48℃ 에 포함되는 온도에서 수행되는 생산 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 데이노코쿠스 박테리아.
  17. 제 16 항에 따른 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 세포 추출물로서, 바람직하게는 상기 세포 추출물은 피토엔을 포함하고, 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는 세포 추출물.
  18. 제 17 항에 있어서, 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 포함하는 세포 추출물.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 세포 막을 포함하는 분획인 세포 추출물.
  20. 피토엔을 생산하기 위한, 제 16 항에 따른 재조합 데이노코쿠스 박테리아의 용도.
  21. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득되는 피토엔을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 임의의 검출가능한 양의 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌 또는 리코펜을 포함하지 않는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 조성물은 15-시스 피토엔인 피토엔의 오직 하나의 이성질체를 포함하는 조성물.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 화장품, 약제 또는 기능식품, 미용식품 조성물 또는 식품 또는 사료 첨가제인 조성물.
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