CN1863922A

CN1863922A - 在遗传修饰的非人生物中制备酮类胡萝卜素的方法

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Publication number: CN1863922A
Application number: CNA2004800290687A
Authority: CN
Inventors: R·弗拉赫曼; C·R·朔普费尔; K·赫伯斯; I·孔策; M·绍尔; M·克勒布萨特尔; T·卢克; D·弗斯特; A－M·皮菲弗尔
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-07-31
Publication date: 2006-11-15

Abstract

本发明涉及通过培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰的生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性。本发明也涉及经过遗传修饰的生物和它们作为食品和饲料的用途，以及它们在生产酮类胡萝卜素提取物中的用途。

Description

在遗传修饰的非人生物中制备酮类胡萝卜素的方法

技术领域

本发明涉及培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性；还涉及经过遗传修饰的生物和它们作为用以生产酮类胡萝卜素提取物的食品和饲料的用途。

背景技术

类胡萝卜素是在细菌、藻类、真菌及植物中从头合成的。酮类胡萝卜素，即含有至少一个酮基的类胡萝卜素，例如虾青素(Astaxanthin)、角黄素(Canthaxanthin)、海胆酮(echinenone)、3-羟基海胆酮(3-Hydroxyechinenon)、3’-羟基海胆酮(3’-Hydroxyechinenone)、金盏花玉红质(adonirubin)和金盏花黄质(adonixanthin)等天然抗氧化剂和色素，是某些藻类和微生物产生的次级代谢产物。

鉴于其着色特性，酮类胡萝卜素(尤其是虾青素)被用作动物饲料的色素添加剂，特别是用于鳟鱼、鲑鱼和虾的养殖中。

目前虾青素的制备主要是通过化学合成的方法进行的。现在，通过培养藻类(如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))或发酵基因工程最优化的微生物并加以分离的生物技术方法，可以获取少量天然酮类胡萝卜素(例如天然虾青素)。

因此，经济的用于制备天然酮类胡萝卜素的生物技术方法至关重要。

业已从多种生物中分离出编码酮酶的核酸以及相应蛋白质序列，并注释为如编码橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)来源酮酶的核酸(EP735 137，登陆号：D58420)，来源于产碱菌属种PC-1(Alcaligenes sp.PC-1)(EP 735137，登陆号：D58422)，雨生红球藻Flotow em.Wille和雨生红球藻，NIES-144(EP 725137，WO 98/18910；Lotan等，FEBS Letters 1995，364，125-128，登陆号：X86782及D45881)，Paracoccus marcusii(登陆号：Y15112)，聚球藻属(Synechocystis sp.)PC6803株(登陆号：NP_442491)，慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)(登陆号：AF218415)以及念珠藻属(Nostocsp.)PCC 7120(Kaneko等，DNA Res.2001，8(5)，205-213；登陆号：AP003592，BAB74888)的核酸。

EP735 137描述了将橙黄农杆菌或产碱菌属PC-1来源的酮酶基因(crtW)插入微生物，从而在微生物(如 E.coli)中制备叶黄素(xanthophylls)的方法。

从EP 725137、WO 98/18910、Kajiwara等(Plant Mol.Biol.1995，29，343-352)及Hirschberg等(FEBS Letters 1995，364，125-128)可知将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtW，crtO或bkt)插入E.coli，以制备虾青素的方法。

Hirschberg等(FEBS Letters 1997，404，129-134)描述了将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)插入聚球藻(Synechococcus)中制备虾青素。Sandmann等(Photochemistry and Photobiology 2001，73(5)，551-55)描述了类似的方法，但其导致了角黄素的产生，且仅能产出微量的虾青素。

WO 98/18910及Hirschberg等(Nature Biotechnology 2000，18(8)，888-892)描述了将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)插入烟草中，在烟草花的蜜腺中合成酮类胡萝卜素。

WO 01/20011描述了在油料种子植物(如油菜籽、向日葵、大豆以及大麻)的种子中，使用种子特异性的启动子以及雨生红球藻来源的酮酶，通过DNA构建体生产酮类胡萝卜素，尤其是虾青素。

现有技术中描述的制备酮类胡萝卜素的所有方法，尤其是所述的用于制备虾青素的方法具有以下不足之处。一方面，产率仍然不如人意；另一方面，转基因生物产生了大量的羟基化副产物(例如玉米黄质和金盏花黄质)。

发明内容

因此，本发明的目标在于提供通过培养遗传修饰的非人生物制备酮类胡萝卜素的方法；或进一步提供经过遗传修饰的能产生酮类胡萝卜素的非人生物，其减轻或不再具有上述现有技术的不足，或者能以更高产率生产所需的酮类胡萝卜素。

据此，已经发现了通过培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性，而其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列，或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

“与野生型相比修饰的酮酶活性”，在起始生物或野生型不具酮酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的酮酶活性”。

“与野生型相比修饰的酮酶活性”，在起始生物或野生型具有酮酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的酮酶活性”。

“与野生型相比修饰的β环化酶活性”，在起始生物或野生型不具β环化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的β环化酶活性”。

“与野生型相比修饰的β环化酶活性”，在起始生物或野生型具有β环化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的β环化酶活性”。

本发明的非人生物(如微生物或植物)优选起始生物时能够天然产生类胡萝卜素(如β-胡萝卜素或玉米黄质)，或能够通过遗传修饰(例如代谢途径的再调节或互补)生产类胡萝卜素(如β-胡萝卜素或玉米黄质)。

作为起始或野生型生物，一些生物已经能够产生酮类胡萝卜素，例如虾青素或角黄素。这些生物，如雨生红球藻、Paracoccus marcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、绿球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsis oocystiformis、Scenedesmusvacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血红裸藻(Euglena sanguinea)和Bacillus atrophaeus，作为起始或野生型生物，已经具有酮酶活性和β环化酶活性。

术语“野生型”，根据本发明应理解为相应的起始生物。

根据上下文，术语“生物”可以理解为非人起始生物(野生型)，或本发明中经过遗传修饰的非人生物，或二者兼之。

优选地，特别是在不能明确指定植物或野生型的情况下，“野生型”在每种情况下是指用于判定下列活性变化的参照生物：即酮酶活性的增加或造成、下文描述的羟化酶活性的增加或造成、下文描述的β环化酶活性的增加或造成、下文描述的HMG-CoA还原酶活性的增加、下文描述的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性的增加、下文描述的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的增加、下文描述的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性的增加、下文描述的异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性的增加、下文描述的牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的法呢基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的八氢番茄红素合酶活性的增加、下文描述的八氢番茄红素去饱和酶活性的增加、下文描述的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性的增加、下文描述的crtISO活性的增加、下文描述的FtsZ活性的增加、下文描述的MinD活性的增加、下文描述的ε-环化酶活性的增加和下文描述的内源β-羟化酶活性的降低，以及酮类胡萝卜素含量的增加。

对于野生型已具有酮酶活性的微生物而言，该参照生物优选雨生红球藻。

对于野生型不具有酮酶活性的微生物而言，该参照生物优选布拉霉(Blakeslea)。

对于野生型即已具有酮酶活性的植物而言，该参照生物优选夏侧金盏花(Adonis aestivalis)、火焰金盏花(Adonis flammeus)或Adonis annuus，特别优选夏侧金盏花。

对于野生型其花瓣中不具有酮酶活性的植物而言，该参照生物优选万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、普林万寿菊(Tagetes Pringlei)、Tagetes palmeri、小万寿菊(Tagetes minuta)或钟形万寿菊(Tagetes campanulata)，特别优选万寿菊。

酮酶活性应理解为酮酶的酶活性。

酮酶是指一种蛋白质，其具有在任选取代的类胡萝卜素β-芷香酮环上引入酮基的酶活性。

特别地，酮酶指具有将β-胡萝卜素转变成角黄素的酶活性的蛋白质。

据此，酮酶活性是指一定时间内由酮酶蛋白质反应的β-胡萝卜素的量或生成的角黄素的量。

本发明方法的实施方案之一使用的起始生物为作为野生型或起始生物已经具有一定酮酶活性的非人生物(如如雨生红球藻、Paracoccusmarcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、绿球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsisoocystiformis、Scenedesmus vacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血红裸藻(Euglena sanguinea)或Bacillusatrophaeus。在该实施方案中，遗传修饰导致了与野生型或起始生物相比酮酶活性的增加。

当相比于野生型酮酶活性增加时，与野生型相比，在一定时间内由酮酶蛋白质酮酶反应的β-胡萝卜素的量或生成的角黄素的量也因之增加。

优选地，该酮酶活性的增加至少为野生型酮酶活性的5％，进一步优选为至少20％，进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％，更优选为至少300％，更为优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的酮酶活性：

对植物或微生物材料中酮酶活性的测定，是基于Frazer等(J.Biol.Chem.272(10)：6128-6135，1997)的方法。通过使用β-胡萝卜素和角黄素底物，在脂质(大豆卵磷脂)和去污剂(胆酸钠)存在的情况下测定植物或微生物提取物的酮酶活性。酮酶分析的底物/产物比例通过HPLC手段检测。

有多种可以增加酮酶活性的途径，如通过在翻译和蛋白质水平关闭抑制性调节机制，或通过提高编码酮酶核酸相对于野生型的基因表达(例如通过活化剂诱导酮酶基因或通过向生物插入编码酮酶核酸)。

根据本发明，该实施方案中“提高编码酮酶核酸的基因表达”也指对该生物自身的内源酮酶表达的调控。这一点可以通过如修饰酮酶编码基因的启动子DNA序列来实现。这一修饰可以通过DNA序列的缺失或插入来实现，从而改变或优选增加至少一个内源酮酶基因的表达率。

如上所述，可以通过应用外源刺激来改变至少一种内源酮酶的表达。这一点可以通过特定的生理条件(即通过应用外源物质)来实现。

此外，还可以通过使用野生型生物中不具有的或经修饰的调节蛋白质，与酮酶基因的启动子相互作用，以增加至少一个内源酮酶基因的表达。

此类调节物可以是如WO 96/06166所描述的由DNA结合结构域和转录激活结构域所组成的嵌合蛋白质。

在优选实施方案中，通过提高编码酮酶核酸的基因表达，较野生型增加酮酶活性。

在另一优选实施方案中，通过向生物插入编码酮酶核酸来增加编码酮酶核酸的基因表达。

该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一另一个酮酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码酮酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码酮酶的内源核酸。

根据本发明，在本方法的另一优选实施方案中，使用的起始生物为野生型并不具有酮酶活性的非人生物(如布拉霉、Marigold、万寿菊、香叶万寿菊、小万寿菊、普林万寿菊、Tagetes palmeri及钟形万寿菊)。

在该优选实施方案中，遗传修饰造成了这些生物中的酮酶活性。该优选实施方案中，与未经遗传修饰的野生型相比，本发明的遗传修饰的生物具有酮酶活性，因而优选能够转基因表达酮酶。

在该优选实施方案中，与前述增加编码酮酶核酸的基因表达类似，优选通过向起始生物插入编码酮酶核酸，造成编码酮酶核酸的基因表达。

为此，在两个实施方案中，原则上可以使用各种酮酶基因，即编码酮酶的各种核酸。

本说明书中提到的所有核酸可以为如RNA、DNA或cDNA序列。

对于真核生物来源的含有内含子的基因组酮酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应酮酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。

可以用于本发明方法中的编码酮酶的核酸及相应酮酶的实例为如以下来源的序列：

雨生红球藻，特别是雨生红球藻Flotow em.Wille(登陆号：X86782；核酸：SEQ ID NO：3，蛋白质SEQ ID NO：4)，

雨生红球藻，NIES-144(登陆号：D45881；核酸：SEQ ID NO：35，蛋白质SEQ ID NO：36)，

橙黄农杆菌(登陆号：D58420；核酸：SEQ ID NO：37，蛋白质SEQ IDNO：38)，

产碱菌属种(登陆号：D58422；核酸：SEQ ID NO：39，蛋白质SEQ IDNO：40)，

Paracoccus marcusii(登陆号：Y15112；核酸：SEQ ID NO：41，蛋白质SEQ ID NO：42)。

聚球藻属PC6803株(登陆号：NP442491；核酸：SEQ ID NO：43，蛋白质SEQ ID NO：44)。

慢生根瘤菌属(登陆号：AF218415；核酸：SEQ ID NO：45，蛋白质SEQ ID NO：46)。

念珠藻PCC7120株(登陆号：AP003592，BAB74888；核酸：SEQ IDNO：47，蛋白质：SEQ ID NO：48)。

雨生红球藻

(登陆号：AF534876，AAN03484；核酸：SEQ ID NO：49，蛋白质：SEQID NO：50)

副球藻菌MBIC1143

(登陆号：D58420，P54972；核酸：SEQ ID NO：51，蛋白质：SEQ IDNO：52)

橙黄短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)

(登陆号：AY166610，AAN86030；核酸：SEQ ID NO：53，蛋白质：SEQID NO：54)

泡沫节球藻(Nodularia spumigena)NSOR10

(登陆号：AY210783，AAO64399；核酸：SEQ ID NO：55，蛋白质：SEQ ID NO：56)

点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133

(登陆号：NZ_AABC01000195，ZP_00111258；核酸：SEQ ID NO：57，蛋白质：SEQ ID NO：58)

点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133

(登陆号：NZ_AABC01000196；核酸：SEQ ID NO：59，蛋白质：SEQID NO：60)

耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)RI

(登陆号：E75561，AE001872；核酸：SEQ ID NO：61，蛋白质：SEQ IDNO：62)，

聚球藻属种WH 8102，

核酸：Acc.No.NZ_AABD01000001，碱基对1,354,725-1,355,528(SEQID NO：75)，蛋白质：Acc.No.ZP_00115639(SEQ ID NO：76)(注释为推定的蛋白质)，

或自上述序列衍生的序列，例如：

通过对如序列SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：57的变异/突变产生序列为SEQ ID NO：64或66的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：65，

通过对如序列SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：59的变异/突变产生序列为SEQ ID NO：68或70的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：69，或

通过对如序列SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：75的变异/突变产生序列为SEQ ID NO：72或74的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：73。

容易发现可用于本发明方法的其它酮酶和酮酶基因的天然实例，例如通过比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性(所述数据库含有前述序列，特别是具有SEQ ID NO：4和/或48和/或58和/60的序列)，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它酮酶和酮酶基因。

通过众所周知的杂交技术，从前述核酸序列起始，特别是从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO：3和/或47和/或57和/59的序列起始，可以容易地发现其它酮酶和酮酶基因的天然实例。

该杂交可以在温和(低严紧性)或优选在严紧(高严紧性)的条件下进行。

该类杂交条件可以应用于该说明书中的所有核酸，在如Sambrook，J.，Fritsch，E.F，Maniatis，T.，《Molecular Cloning(A Laboratory Manual)》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，9.31-9.57或CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有所描述。

例如，洗涤步骤的条件可以从低严紧性(在50℃使用2X SSC)和高严紧性(在50℃，优选在65℃使用0.2X SSC)所限定的条件范围中选择(20X SSC：0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH7.0)。

此外，还可以将洗涤步骤中的温度从温和条件的室温(22℃)升至严紧条件的65℃。

可以同时改变盐浓度和温度两参数，也可以保持其中之一恒定，只改变另一个。在杂交过程中也可以使用变性剂(如甲酰胺或SDS)。若为50％甲酰胺，优选在42℃下进行杂交。

以下给出了一些杂交条件和洗涤步骤的代表性条件：

(1)杂交条件，例如

(i)65℃、4X SSC，或

(ii)45℃、6X SSC，或

(iii)68℃、6X SSC、100mg/ml变性鱼精DNA，或

(iv)68℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性且片段化的鲑精DNA，或

(v)42℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性且片段化的鲑精DNA、50％甲酰胺，或

(vi)42℃、50％甲酰胺、4X SSC，或

(vii)42℃、50％(vol/vol)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)、750mM NaCl、75mM柠檬酸钠，或

(viii)50℃、2X或4X SSC(温和条件)，或

(ix)42℃、30至40％甲酰胺、2X或4X SSC(温和条件)。

(2)在以下条件进行10分钟的洗涤步骤，例如，

(i)50℃、0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，或

(ii)65℃、0.1X SSC，或

(iii)68℃、0.1X SSC、0.5％SDS，或

(iv)42℃、0.1X SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺，或

(v)42℃、0.2X SSC、0.1％SDS，或

(vi)65℃、2X SSC(温和条件)。

在本发明方法的一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：4氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：4序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。

同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO：4序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。

本发明方法的另一个优选实施方案应用编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：48氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：48序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。

同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO：48序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：58氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：58序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。

同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO：58序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：60氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：60序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。

同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO：60序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。

对于本说明书中的所有蛋白质，术语“替换”是指一个或多个氨基酸被一个或多个氨基酸所替换。优选进行“保守性取代”，其中替换的氨基酸与原始氨基酸具有相似的性质，如Glu被Asp、Gln被Asn、Val被Ile、Leu被Ile、Ser被Thr所替换。

“缺失”是指一个氨基酸直接被键所取代。优选的缺失位置为多肽的末端，以及单独蛋白质结构域间的连接处。

“插入”是指将氨基酸插入多肽链中，其中原直接连接被一个或多个氨基酸所取代。

“两种蛋白质间的同一性”是指各蛋白质全长中的氨基酸同一性，尤其是使用Informax(USA)提供的vector NTI 7.1版软件和clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignmentson a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)：151-1)，设定下述参数，通过比较计算出的同一性：

多重比对参数：

空位开放罚分(gap opening penalty) 10

空位扩展罚分(gap extension penalty) 10

空位分离罚分范围 8

空位分离罚分(gap separation penalty) 关闭

校正延迟的同一性％ 40

(％identity for alignment delay)

残基特异性空位(Residae specific gap) 关闭

亲水残基空位(Hydrophilic rdsidae gap) 关闭

转换权重(transition weighing) 0

成对比对参数：

FAST运算法则使用

K-tuple尺寸 1

空位罚分 3

窗口尺寸 5

最佳对角线数目(Number of best diagonals) 5

因此，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO：4或48或58或60具有至少70％同一性的蛋白质，是指其序列与SEQ ID NO：4或48或58或60的序列相比较(特别是根据上述程序对数)具有至少70％上述设置参数的同一性。

可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获取合适的核酸序列。

优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：3序列的核酸插入植物中。

在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：48序列的核酸插入植物中。

在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：58序列的核酸插入植物中。

在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：60序列的核酸插入植物中。

还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有酮酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloning：A laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。

如上所述，本发明的方法中使用的非人生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性以及修饰的β环化酶活性，该修饰的β环化酶活性源于该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

根据本发明，该方法的实施方案之一使用的起始生物为作为野生型或起始生物已经具有一定β环化酶活性的非人生物。在该实施方案中，遗传修饰引入了高于野生型或起始生物的β环化酶活性。该增加的β环化酶活性源于该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

β环化酶活性是指β环化酶的酶活性。

β环化酶是指一种蛋白质，其具有将末端的番茄红素线性残基转化为β-芷香酮环的酶活性。

具体而言，β环化酶指具有将γ-胡萝卜素转化成β-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。

因此，β环化酶活性是指在一定时间内由β环化酶蛋白质转化的γ-胡萝卜素的量，或生成的β-胡萝卜素的量。

当β环化酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由β环化酶蛋白质转化的番茄红素或γ-胡萝卜素的量或由番茄红素生成的γ-胡萝卜素的量或由γ-胡萝卜素生成的β-胡萝卜素的量也因之增加。

优选增加的β环化酶活性至少为野生型β环化酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的β环化酶活性：

根据Fraser和Sandmann的方法(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)在体外测定β环化酶活性。将作为缓冲液的磷酸钾(pH 7.6)、作为底物的番茄红素、及红辣椒(paprika)基质蛋白质、NADP⁺、NADPH和ATP加入特定量的生物提取物中。

特别优选在Bouvier、d′Harlingue和Camara(Molecular Analysis ofcarotenoid cyclase inhibition；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)的下述条件测定β环化酶活性：

在250μl的体积中进行体外测定。反应物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)、不同量的生物提取物、20nM番茄红素、250μg红辣椒有色体基质蛋白质、0.2mM NADP⁺、0.2mM NADPH和1mM ATP。将NADP/NADPH和ATP溶解于含有1mg Tween 80的10ml乙醇后加入孵育介质。30℃下反应60分钟后，加入氯仿/甲醇(2∶1)终止反应。反应产物经氯仿抽提后通过HPLC分析。

Fraser和Sandmann描述了另一种使用放射性底物的测定(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。

可以通过多种途径增加β环化酶的活性，如通过关闭在表达及蛋白质水平的抑制性调节机制或增加编码β环化酶的核酸相对于野生型的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列、或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

同样，有多种途径可以相对于野生型增加编码β环化酶核酸的基因表达，例如通过活化剂诱导β环化酶基因，或向生物插入一个或多个β环化酶基因拷贝，即向生物插入至少一个编码β环化酶的核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

根据本发明，增加编码β环化酶核酸的基因表达也指对该生物自身的内源β环化酶表达的调控，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

可以通过如修饰β环化酶编码基因的启动子DNA序列来实现这一调控。所述修饰可以通过如DNA序列的缺失或插入来完成，从而提高基因的表达率。

如上所述，可以通过应用外源刺激来改变内源β环化酶的表达。这一点可以通过特定的生理条件(即通过应用外源物质)来实现。

此外，还可以通过使用未转化生物中不具有的调节蛋白质，与该基因的启动子相互作用，以修饰或增加内源β环化酶基因的表达。

在优选实施方案中，通过向生物插入至少一个编码β环化酶的核酸来增加编码β环化酶核酸的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在另一个β环化酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码β环化酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码β环化酶的内源核酸。

在本发明方法的另一优选实施方案中，使用的起始生物为野生型并不具有β环化酶活性的非人生物。在该次优选的实施方案中，遗传修饰造成了生物中的β环化酶活性。该实施方案中，与未遗传修饰的野生型相比，本发明的遗传修饰的生物具有β环化酶活性，因而优选能够转基因表达β环化酶。

在该优选实施方案中，与前述增加编码β环化酶核酸的基因表达类似，优选通过向起始生物插入编码β环化酶的核酸造成编码β环化酶核酸的基因表达。

为此，在两个实施方案中，原则上可以使用各种β环化酶基因，即编码β环化酶的各种核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列，或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

对于真核生物来源的含有内含子的基因组β环化酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应β环化酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。

特别优选的β环化酶为番茄来源的色素细胞特异性β环化酶(AAG21133)(核酸：SEQ ID NO：1；蛋白质：SEQ ID NO：2)。

根据本发明，可以使用的β环化酶基因是编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者与SEQ ID NO：2序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有β环化酶的酶促性质。

容易发现可用于本发明方法的β环化酶和β环化酶基因的其他实例，例如如上所述比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID NO：2的同一性，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它β环化酶和β环化酶基因。

利用杂交和PCR技术，从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO：1序列起始，通过已知的方法可以容易地发现其它β环化酶和β环化酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加β环化酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有SEQ ID NO：2序列的β环化酶氨基酸序列。

可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获得合适的核酸序列。

优选为此使用的密码子，是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：1序列的核酸插入生物中。

还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有β环化酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloning：A laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。

在优选实施方案中培养非人生物，所述生物与其野生型相比，除了具有修饰的酮酶活性和修饰的β环化酶活性，还具有改良的羟化酶活性。

“与野生型相比改良的羟化酶活性”，在起始生物或野生型不具羟化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的羟化酶活性”。

“与野生型相比改良的羟化酶活性”，在起始生物或野生型具有羟化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的羟化酶活性”。

因此，在优选实施方案中培养非人生物，所述生物与其野生型相比，除了具有修饰的酮酶活性和修饰的β环化酶活性，还具有造成的或增加的羟化酶活性。

羟化酶活性是指羟化酶的酶活性。

羟化酶是指一种蛋白质，其具有在任选取代的类胡萝卜素β-芷香酮环上引入羟基的酶活性。

具体而言，羟化酶指具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄质或将角黄素转化成虾青素的酶活性的蛋白质。

据此，羟化酶活性是指在一定时间内由羟化酶蛋白质转化的β-胡萝卜素或角黄素的量，或生成的玉米黄质或虾青素的量。

当羟化酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质羟化酶转化的β-胡萝卜素或角黄素的量或生成的玉米黄质或虾青素的量也因之增加。

优选地，该羟化酶活性的增加至少为野生型羟化酶活性的5％，进一步优选为至少20％，进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％，更优选为至少300％，甚至更优选至少为500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的羟化酶活性：

根据Bouvier等的方法(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)在体外测定羟化酶活性。将铁氧化还原蛋白、铁氧化还原蛋白-NADP氧化还原酶、过氧化氢酶、NADPH和β-胡萝卜素及单-和双半乳糖苷甘油加入特定量的生物提取物中。

特别优选在Bouvier、Keller、d′Harlingue和Camara(Xanthophyllbiosynthesis：molecular and functional characterization of carotenoidhydroxylases from pepper fruits(Capsicum annuum L.)；Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)的下述条件测定羟化酶活性：

在0.250ml的体积中进行体外测定。反应物含有50mM磷酸钾(pH7.6)、0.025mg菠菜铁氧化还原蛋白、0.5单位铁氧化还原蛋白-NADP⁺氧化还原酶、0.25mM NADPH、0.010mg β-胡萝卜素(在0.1mg Tween 80中乳化)、0.05mM的单/双半乳糖苷甘油混合物(1∶1)、1单位过氧化氢酶、0.2mg胎牛血清白蛋白和不同体积的生物提取物。将反应混合物在30℃孵育2小时。反应产物经有机溶剂(如丙酮或氯仿/甲醇(2∶1))抽提后通过HPLC测定。

可以通过多种途径实现羟化酶活性的增加或造成，如通过关闭在表达及蛋白质水平的抑制性调节机制或相对于野生型增加或造成羟化酶编码核酸的基因表达。

同样，有多种途径可以实现羟化酶编码核酸的基因表达相对于野生型的增加或造成，例如通过活化剂诱导羟化酶基因，或向生物插入一个或多个羟化酶基因拷贝，即向生物插入至少一个编码羟化酶的核酸。

根据本发明，增加羟化酶编码核酸的基因表达也指对该生物自身的内源羟化酶表达的调控。

可以通过如修饰羟化酶编码基因的启动子DNA序列来实现这一调控。所述修饰可以通过如DNA序列的缺失或插入来完成，从而提高基因的表达率。

此外，还可以通过使用未转化生物中不具有的调节蛋白质，与该基因的启动子相互作用，以造成或增加内源羟化酶基因的表达。

此类调节物可以是如WO 96/06166所描述的由一个DNA结合结构域和一个转录激活结构域所组成的嵌合蛋白质。

在优选的实施方案中，通过向生物插入至少一个羟化酶编码核酸来增加或造成羟化酶编码核酸的基因表达。

为此，原则上可以使用各种羟化酶基因，即编码羟化酶的各种核酸。

对于真核生物来源的含有内含子的基因组羟化酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应羟化酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。

羟化酶基因的实例如：

雨生红球藻来源的羟化酶编码核酸(登陆号：AX038729，WO 0061764)；(核酸：SEQ ID NO：77，蛋白质：SEQ ID NO：78)。

以及以下登陆号的羟化酶：

|emb|CAB55626.1、CAA70427.1、CAA70888.1、CAB55625.1、AF499108_1、AF315289_1、AF296158_1、AAC49443.1、NP_94300.1、NP_200070.1、AAG10430.1、CAC06712.1、AAM88619.1、CAC95130.1、AAL80006.1、AF162276_1、AAO53295.1、AAN85601.1、CRTZ_ERWHE、CRTZ_PANAN、BAB79605.1、CRTZ_ALCSP、CRTZ_AGRAU、CAB56060.1、ZP_00094836.1、AAC44852.1、BAC77670.1、NP_745389.1、NP_344225.1、NP_849490.1、ZP_00087019.1、NP_503072.1、NP_852012.1、NP_115929.1、ZP_00013255.1。

此外，特别优选的羟化酶为番茄来源的羟化酶(登陆Y14810)(核酸：SEQ ID NO：5；蛋白质：SEQ ID NO：6)。

该优选实施方案中，与野生型相比，本发明的优选转基因生物中至少还存在另一个羟化酶基因。

该优选实施方案中，遗传修饰的生物具有如至少一个编码羟化酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码羟化酶的内源核酸。

优选地，上述优选实施方案中可以使用的羟化酶基因是编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：6氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者与SEQ ID NO：6序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有羟化酶的酶促性质。

容易发现羟化酶和羟化酶基因的其他实例，例如如上所述比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID NO：6的同一性，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它羟化酶和羟化酶基因。

利用杂交和PCR技术，从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO：5序列起始，通过已知的方法可以容易地发现其它羟化酶和羟化化酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加羟化酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：6的羟化酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：5序列的核酸插入生物中。

还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有羟化酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloning：A laboratory manual)》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。

特别优选地，本发明的方法使用起始生物时具有β环化酶活性而无酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性有所增加，且具有造成的酮酶活性，其中β环化酶活性增加是由于β环化酶所致，该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时缺乏β环化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物具有造成的β环化酶活性及酮酶活性，其中β环化酶活性的造成是由于β环化酶所致，该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性及酮酶活性均有所增加，其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性但不具有酮酶活性及羟化酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性有所增加，具有造成的酮酶活性及羟化酶活性，其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ IDNO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶及羟化酶活性但不具有酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性及羟化酶活性有所增加，具有造成酮酶活性。其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时缺乏β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物具有造成的β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性。其中β环化酶活性的造成是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性均有所增加。其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

在另一个优选实施方案中，培养遗传修饰的非人生物，所述生物与野生型相比还具有至少一种选自以下的活性增加：HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性。

HMG-CoA还原酶活性是指HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的酶活性。

HMG-CoA还原酶是指一种蛋白质，其具有可将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的酶活性。

据此，HMG-CoA还原酶活性是指一定时间内由HMG-CoA还原酶蛋白质反应的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的量或生成的甲羟戊酸的量。

当HMG-CoA还原酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的量或生成的甲羟戊酸的量也因之增加。

优选增加的HMG-CoA还原酶活性至少为野生型HMG-CoA还原酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的HMG-CoA还原酶活性：

在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl₂、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO₃。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。

根据已发表的描述(如Schaller，Grausem，Benveniste，Chye，Tan，Song和Chua，Plant Physiol.109(1995)，761-770；Chappell，Wolf，Proulx，Cuellar和Saunders，Plant Physiol.109(1995)1337-1343)，能够测定HMG-CoA还原酶活性。可以在冷缓冲液(100mM磷酸钾(pH 7.0)、4mMMgCl₂、5mM DTT)中对生物组织进行匀浆和抽提。将匀浆液在4℃、10 000g离心15分钟。随后将上清液以100 000g离心45-60分钟。测定上清液和微粒体级分的沉淀(重悬于100mM磷酸钾(pH 7.0)和50mMDTT之后)中HMG-CoA还原酶活性。将溶液和悬浮液(悬浮液中蛋白质含量相当于约1-10μg)的等分试样于30℃在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0，含3mM NADPH和20μM(¹⁴C)HMG-CoA(58μCi/μM)，理想体积为26μl)中孵育15-60分钟。加入5μl甲羟戊酸内酯(1mg/ml)和6NHCl终止反应。随后将混合物在室温下孵育15分钟。加入125μl饱和磷酸钾溶液(pH 6.0)及300μl乙酸乙酯，以定量反应中形成的(¹⁴C)甲羟戊酸。将混合物充分混合并离心。通过闪烁测量测定放射性。

(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶(也称作lytB或IspH)活性，是指(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的酶活性。

(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶是指一种蛋白质，其具有可将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯转化为异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的酶活性。

据此，(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯活性是指一定时间内由(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶蛋白质反应的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量。

当(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶转化的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量也因之增加。

优选增加的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性至少为野生型(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性：

在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl₂、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO₃。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。

通过免疫检测方法可以测定(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的活性。Rohdich及其同事(Rohdich，Hecht，G_rtner，Adam，Krieger，Amslinger，Arigoni，Bacher和Eisenreich：Studies on the nonmevalonateterpene biosynthetic pathway：metabolic role of IspH(LytB)protein，Natl.Acad.Natl.Sci.USA 99(2002)，1158-1163)已经描述了特异性抗体的制备。关于催化活性的测定，Altincicek及其同事(Altincicek，Duin，Reichenberg，Hedderich，Kollas，Hintz，Wagne，Wiesner，Beck和Jomaa：LytB proteincatalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway of isoprenoid biosynthesis；FEBS Letters 532(2002)437-440)描述了一种监测(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原为异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的体外系统。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶活性。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶是指一种蛋白质，其具有将羟乙基ThPP和3-磷酸甘油醛转化为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的酶活性。

据此，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指在一定时间内由1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶蛋白质转化的羟乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量。

当1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶转化的羟乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量，或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量也因之增加。

优选增加的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性至少为野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性：

用于测定D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶活性(DXS)的反应混合物(50-200μl)中含有：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MgCl₂、3mM MnCl₂、3mM ATP、1mM硫胺素二磷酸酯、0.1％Tween-60、1mM氟化钾、30μM(2-¹⁴C)丙酮酸(0.5μCi)、0.6mM DL-3-磷酸甘油醛。37℃下将生物提取物在反应溶液中孵育1-2小时。随后加热至80℃持续3分钟以终止反应。在13 000转/分钟下离心5分钟后，蒸发上清液，将残留物重悬于50μl甲醇，铺于TLC板进行薄层层析(硅胶60，Merck，Darmstadt)，并在正丙醇/乙酸乙酯/水(6∶1∶3；v/v/v)中进行分离。在此过程中，放射性标记的D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸(或D-1-脱氧木酮糖)与(2-¹⁴C)-丙酮酸得以分离。利用闪烁计数器进行定量。该法描述于Harker和Bramley(FEBS Letters 448(1999)115-119)。另外，测定DXS合酶活性的荧光测定法已由Querol及其同事描述(Analytical Biochemistry 296(2001)101-105)。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶(也称为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)活性是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶活性。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶是指一种蛋白质，其具有将1-脱氧-D-木糖-5-磷酸转化为2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的酶活性。

据此，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性是指在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量，或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量。

当1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量也因之增加。

优选增加的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性至少为野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性：

在下述缓冲液中测定D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的活性，所述缓冲液含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MnCl₂、0.3mMNADPH和0.3mM 1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸，其中1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸能够经酶合成(如Kuzuyama，Takahashi，Watanabe和Seto：Tetrahedonletters 39(1998)4509-4512)。加入生物提取物开始反应。反应体积一般可为0.2至0.5ml；37℃孵育30-60分钟。此间，用分光光度计在340nm处监控NADPH的氧化。

异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性是指异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的酶活性。

异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶是指一种蛋白质，其具有将异戊烯基二磷酸酯转化为二甲基烯丙基磷酸酯的酶活性。

据此，异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性是指在一定时间内由异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量。

当异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量也因之增加。

优选增加的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性至少为野生型异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性：

根据Fraser及其同事公开的方法(Fraser，R_mer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和Bramley：Evaluation of transgenictomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specificmanner；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal 24(2000)，551-558)，可以测定异戊烯基二磷酸酯异构酶(IPP异构酶)的活性。为进行酶测定，在含有1mM DTT、4mM MgCl₂、6mM MnCl₂、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化钾的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中(体积为大约150-500μl)，以0.5μCi(1-¹⁴C)IPP(异戊烯基焦磷酸酯)(56mCi/mmol，Amersham plc)为底物进行孵育。将提取物与缓冲液混合(例如以1∶1的比例)并在28℃孵育至少5小时。随后加入约200μl甲醇，并通过加入浓盐酸(终浓度为25％)在37℃进行约1小时酸水解。然后使用石油醚(与10％二乙醚混合)进行两次抽提(每次500μl)。利用闪烁计数器测定上层等分试样中的放射性。通过5分钟的短期孵育能够测定特异酶活性，因为短的反应时间抑制反应副产物生成(见Lützow和Beyer：The isopentenyl phosphate Δ-isomeraseand its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts；Biochim.Biophys.Acta 959(1988)，118-126)。

牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶活性。

牻牛儿基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有将异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基磷酸酯转化为牻牛儿基二磷酸酯的酶活性。

据此，牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由牻牛儿基二磷酸酯合酶蛋白质转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量或形成的牻牛儿基二磷酸酯的量。

当牻牛儿基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基二磷酸酯的量也因之增加。

优选增加的牻牛儿基二磷酸酯合酶活性至少为野生型牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性：

向50mM Tris-HCl(pH 7.6)、10mM MgCl₂、5mM MnCl₂、2mMDTT、1mMATP、0.2％Tween-20、5μM(¹⁴C)IPP和50μM DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸酯)中加入生物提取物，能够测定牻牛儿基二磷酸酯合酶(GPP合酶)的活性(根据Bouvier，Suire，d’Harlingue，Backhaus和Camara：Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentationof monoterpene synthesis in plant cells，Plant Journal 24(2000)241-252)。在如37℃下孵育2小时后，将反应产物去磷酸化(根据Koyama、Fuji和Ogura：Enzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphates，MethodsEnzymol.110(1985)，153-155)，利用薄层层析法和放射性掺入测定法进行分析(Dogbo，Bardat，Quennemet和Camara：Metabolism of plastidterpenoids：In vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethylpyrophosphate derivates，FEBS Letters 219(1987)211-215)。

法呢基二磷酸酯合酶活性是指法呢基二磷酸酯合酶的酶活性。

法呢基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有依次将2分子异戊烯基二磷酸酯与二甲基烯丙基二磷酸酯反应，所生成的牻牛儿基二磷酸酯再转化为法呢基二磷酸酯的酶活性。

据此，法呢基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量。

当法呢基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量也因之增加。

优选增加的法呢基二磷酸酯合酶活性至少为野生型法呢基二磷酸酯合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的法呢基二磷酸酯合酶的活性：

在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl₂、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO₃。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。

根据Joly和Edwards的方法能够测定法尼基焦磷酸酯合酶(FPP合酶)的活性(Journal of Biological Chemistry 268(1993)，26983-26989)。即，在含有10mM HEPES(pH 7.2)、1mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、20μM牻牛儿基焦磷酸酯和40μM(1-¹⁴C)异戊烯基焦磷酸酯(4Ci/mmol)的缓冲液中测定酶活性。将反应混合物在37℃孵育；加入2.5N HCl(在含有19μg/ml法呢醇的70％乙醇中)终止反应。随后通过酸水解在37℃水解反应产物30分钟。加入10％NaOH中和混合物，并通过与己烷振荡进行抽提。利用闪烁计数器测量己烷相的等分试样以确定掺入的放射性。

或者，将生物提取物与放射性标记的IPP孵育之后，在苯/甲醇(9∶1)中通过薄层层析(Silica-Gel SE60，Merck)分离反应产物。洗脱放射性标记的产物并测定其放射活性(根据Gaffe，Bru，Causse，Vidal，Stamitti-Bert，Carde和Gallusci：LEFPS1，a tomato farnesyl pyrophosphate gene highlyexpressed during early fruit development；Plant Physiology 123(2000)1351-1362)。

牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶活性。

牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有将法呢基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯转化为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的酶活性。

据此，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量。

当牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量也因之增加。

优选增加的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性至少为野生型活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性：

可以根据Dogbo和Camara所述的方法测定牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶(GGPP合酶)的活性(Biochim.Biophys.Acta 920(1987)，140-148：Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranylpyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinitychromatography)。为此，将总体积约为200μl的生物提取物加入缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.6)、2mM MgCl₂、1mM MnCl₂、2mM二硫苏糖醇、(1-¹⁴C)IPP(0.1μCi、10μM)、15μM DMAPP、GPP或FPP)中。在30℃孵育1-2小时(或更长)。加入0.5ml乙醇和0.1ml 6N HCl终止反应。37℃孵育10分钟之后，用6N NaOH中和反应混合物，与1ml水混合并用4ml乙醚振荡进行抽提。利用闪烁计数测定乙醚相等分试样(如0.2ml)中的放射活性。或者在酸水解之后，可通过在乙醚中振荡抽提放射性标记的异戊二烯醇，并利用HPLC(25cm Spherisorb ODS-1柱，5μm；用甲醇/水(90∶10；v/v)以1ml/分钟的流速洗脱)分离，并通过放射活性监测进行定量(Wiedemann，Misawa和Sandmann：Purification and enzymaticcharacterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase fromErwinia uredovora after expression in Escherichia coli；ArchivesBiochemistry and Biophysics 306(1993)，152-157)。

八氢番茄红素合酶活性是指八氢番茄红素合酶的酶活性。

具体而言，八氢番茄红素合酶是指一种具有将牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯转化为八氢番茄红素的酶活性的蛋白质。

据此，八氢番茄红素合酶活性是指在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量。

当八氢番茄红素合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量也因之增加。

优选增加的八氢番茄红素合酶活性至少为野生型八氢番茄红素合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的八氢番茄红素合酶的活性：

在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7-4)、10mM MgCl₂、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO₃。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。

根据Fraser及其同事所发表的方法能够测定八氢番茄红素合酶(PSY)活性(Fraser，Romer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和Bramley：Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additionalphytoene synthase in a fruit-specific manner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal24(2000)551-558)。为测定酶，在含有1mM DTT、4mM MgCl₂、6mMMnCl₂、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化钾的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中，以(³H)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(15mCi/mM，AmericanRadiolabeled Chemicals，St.Louis)为底物进行孵育。将生物提取物与缓冲液混合，例如将295μl缓冲液与提取物混合使总体积为500μl。该混合物在28℃孵育至少5小时。随后用氯仿两次(每次500μl)振荡抽提八氢番茄红素。通过薄层层析法，在甲醇/水(95∶5；v/v)的二氧化硅板上分离反应中形成的放射性标记的八氢番茄红素。富碘环境下(通过加热几块碘晶体)可以在二氧化硅板上鉴定八氢番茄红素。以八氢番茄红素标准品作为参照。通过闪烁计数器测定法检测放射性标记产物的量。或者，也可以利用装有放射性探测器的HPLC定量八氢番茄红素(Fraser、Albrecht和Sandmann：Development of high performance liquid chromatographic systems for theseparation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specificenzymatic reactions；J.Chromatogr.645(1993)265-272)。

八氢番茄红素去饱和酶活性是指八氢番茄红素去饱和酶的酶活性。

八氢番茄红素去饱和酶是指一种蛋白质，其具有将八氢番茄红素转化为六氢番茄红素和/或将六氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素(zeta-胡萝卜素)的酶活性。

据此，八氢番茄红素去饱和酶活性是指在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量，或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量。

当八氢番茄红素去饱和酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量，或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量也因之增加。

优选增加的八氢番茄红素去饱和酶活性至少为野生型八氢番茄红素去饱和酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的八氢番茄红素去饱和酶活性：

将放射性标记的(¹⁴C)-八氢番茄红素插入不饱和胡萝卜素中能够测定八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的活性(根据R_mer，Fraser，Kiano，Shipton，Misawa，Schuch和Bramley Elevation of the provitamin A content oftransgenic tomato plants；Nature Biotechnology 18(2000)666-669)。可如Fraser所述合成放射性标记的八氢番茄红素(Fraser，De la Rivas，Mackenzie，Bramley：Phycomyces blakesleanus CarB mutants：their use inassays of phytoene desaturase；Phytochemistry 30(1991)，3971-3976)。可在含有10mM MgCl₂和1mM二硫苏糖醇的100mM MES缓冲液(pH 6.0)(总体积为1ml)中孵育靶组织的质体膜。加入溶于丙酮中的(¹⁴C)八氢番茄红素(每例中每次孵育约100000裂变/分钟)，其中丙酮浓度不超过5％(v/v)。将混合物在28℃下暗处振荡孵育约6-7小时。随后，用约5ml石油醚(与10％乙醚混合)抽提色素三次并通过HPLC法分离并定量。

或者，可根据Fraser等(Fraser，Misawa，Linden，Yamano，Kobayashi和Sandmann：Expression in Escherichia coli，purification，and reactivationof the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase，Journal ofBiological Chemistry 267(1992)，19891-19895)的方法，测定八氢番茄红素去饱和酶的活性。

ζ-胡萝卜素去饱和酶活性是指ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶活性。

ζ-胡萝卜素去饱和酶是指一种蛋白质，其具有将ζ-胡萝卜素转化为四氢番茄红素和/或将四氢番茄红素转化为番茄红素的酶活性。

据此，ζ-胡萝卜素去饱和酶活性是指在一定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量。

当ζ-胡萝卜素去饱和酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量，或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量也因之增加。

优选增加的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性至少为野生型ζ-胡萝卜素去饱和酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性：

可在0.2M磷酸钾(pH 7.8，缓冲液体积大约1ml)中进行测定ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS去饱和酶)的分析。其分析方法已由Breitenbach及其同事发表(Breitenbach，Kuntz，Takaichi和Sandmann：Catalytic propertiesof an expressed and purified higher plant type ζ-carotene desaturase fromCapsicum annuum；European Journal of Biochemistry.265(1)：376-383，1999)。每种分析混合物含有3mg悬浮于0.4M磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中的磷脂酰胆碱、5μgζ-胡萝卜素或四氢番茄红素、0.02％丁基羟基甲苯、10μl癸基质体醌(1mM甲醇贮存液)及生物提取物。生物提取物的体积需根据存在的ZDS去饱和酶活性进行调节，以便能在线性测量范围内进行定量。孵育一般在暗处、约28℃下，剧烈振荡(200转/分钟)进行约17小时。加入4ml丙酮在50℃时振荡10分钟抽提类胡萝卜素。将类胡萝卜素从该混合物转移至石油醚相(含有10％乙醚)。在氮气中蒸发乙醚/石油醚相，将类胡萝卜素重新溶为20μl并通过HPLC法进行分离和定量。

crtISO活性是指crtISO蛋白的酶活性。

crtISO蛋白是指一种蛋白质，其具有将7，9，7’，9’-四顺式番茄红素转化为全反式番茄红素的酶活性。

据此，crtISO活性是指在一定时间内由蛋白质crtISO转化的7，9，7’，9’-四顺式番茄红素的量或形成的全反式番茄红素的量。

当crtISO活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由crtISO蛋白转化的7，9，7’，9’-四顺式番茄红素的量或形成的全反式番茄红素的量也因之增加。

优选增加的crtISO活性至少为野生型crtISO活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。

FtsZ活性是指FtsZ蛋白的生理学活性。

FtsZ蛋白是指一种蛋白质，其具有促进细胞分裂和质体分裂的活性，且与微管蛋白质同源。

MinD活性是指MinD蛋白的生理学活性。

MinD蛋白是指一种在细胞分裂中具有多功能作用的蛋白质。它是一种膜相关ATP酶并且在细胞内可表现为从一极到另一极的振动运动。

另外，非甲羟戊酸途径的酶活性的增加能够导致目的酮类胡萝卜素终产物的进一步增加。其实例包括，4-二磷酸胞苷(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶和2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸酯合酶。通过修饰相应基因的基因表达，可以提高所述酶的活性。以标准方式通过抗体和相应印迹技术能够检测相应蛋白质的浓度改变。

可以通过多种途径，增加HMG-CoA还原酶活性和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或法呢基二磷酸酯合酶活性和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或八氢番茄红素合酶活性和/或八氢番茄红素去饱和酶活性和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶活性和/或crtISO活性和/或FtsZ活性和/或MinD活性，例如通过在表达和蛋白质水平关闭抑制性调节机制，或通过提高编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸相对于野生型的基因表达。

也可通过多种途径提高编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸相对于野生型的基因表达，例如通过活化剂诱导HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，或者通过插入一个或多个拷贝的HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，即向植物中插入至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码crtISO蛋白的核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的核酸和/或至少一个编码MinD蛋白的核酸。

根据本发明，编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸的基因表达的增加，也指对该生物自身的内源HMG-CoA还原酶和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或法呢基二磷酸酯合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或八氢番茄红素合酶和/或八氢番茄红素去饱和酶和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶和/或crtISO蛋白和/或FtsZ蛋白和/或MinD蛋白表达的调控。

这一点可以通过如修饰相应启动子DNA序列来实现。这一修饰可以通过DNA序列的缺失或插入来实现，从而增加该基因的表达率。

在优选实施方案中，编码HMG-CoA还原酶核酸的基因表达的增加和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶核酸的基因表达的增加和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶核酸的基因表达的增加和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶核酸的基因表达的增加和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶核酸的基因表达的增加和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码法呢基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码八氢番茄红素合酶核酸的基因表达的增加和/或编码八氢番茄红素去饱和酶核酸的基因表达的增加和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶核酸的基因表达的增加和/或编码crtISO蛋白核酸的基因表达的增加和/或编码FtsZ蛋白核酸的基因表达的增加和/或编码MinD蛋白核酸的基因表达的增加是通过向植物中插入至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码crtISO蛋白的核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的核酸和/或至少一个编码MinD蛋白的核酸而实现。

为此，原则上可以使用任何HMG-CoA还原酶基因或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因或法呢基二磷酸酯合酶基因或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因或八氢番茄红素合酶基因或八氢番茄红素去饱和酶基因或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因或crtISO基因或FtsZ基因或MinD基因。

对于真核生物来源的含有内含子的基因组HMG-CoA还原酶序列或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶序列或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶序列或牻牛儿基二磷酸酯合酶序列或法呢基二磷酸酯合酶序列或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶序列或八氢番茄红素合酶序列或八氢番茄红素去饱和酶序列或ζ-胡萝卜素去饱和酶序列或crtISO序列或FtsZ序列或MinD序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应酮酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。

该优选的实施方案中，与野生型相比，本发明优选的转基因生物中至少还存在另一个HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或FtsZ基因和/或MinD基因。

在该优选实施方案中，遗传修饰的植物具有，例如至少一个编码HMG-CoA还原酶的外源核酸或至少两个编码HMG-CoA还原酶的内源核酸，和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的外源核酸或至少两个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的内源核酸，和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的内源核酸，和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的内源核酸，和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的外源核酸或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的内源核酸，和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码法呢基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的外源核酸或至少一个编码八氢番茄红素合酶的内源核酸，和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码八氢番茄红素去饱和酶的内源核酸，和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的内源核酸，和/或至少一个编码crtISO蛋白的外源核酸或至少两个编码crtISO蛋白的内源核酸，和/或至少一个编码FtsZ蛋白的外源核酸或至少两个编码FtsZ蛋白的内源核酸，和/或至少一个编码MinD蛋白的外源核酸或至少两个编码MinD蛋白的内源核酸。

HMG-CoA还原酶基因的实例为：

拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的编码HMG-CoA还原酶的核酸，登录号NM_106299(核酸：SEQ ID NO：7，蛋白质：SEQ ID NO：8)，

还包括其他生物来源的登录号如下的其他HMG-CoA还原酶基因：

P54961、P54870、P54868、P54869、O02734、P22791、P54873、P54871、P23228、P13704、P54872、Q01581、P17425、P54874、P54839、P14891、P34135、O64966、P29057、P48019、P48020、P12683、P43256、Q9XEL8、P34136、O64967、P29058、P48022、Q41437、P12684、Q00583、Q9XHL5、Q41438、Q9YAS4、O76819、O28538、Q9Y7D2、P54960、O51628、P48021、Q03163、P00347、P14773、Q12577、Q59468、P04035、O24594、P09610、Q58116、O26662、Q01237、Q01559、Q12649、O74164、O59469、P51639、Q10283、O08424、P20715、P13703、P13702、Q96UG4、Q8SQZ9、O15888、Q9TUM4、P93514、Q39628、P93081、P93080、Q944T9、Q40148、Q84MM0、Q84LS3、Q9Z9N4、Q9KLM0。

(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的实例为：

拟南芥来源的编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸(lytB/ISPH)，登录号AY168881，(核酸：SEQ ID NO：9，蛋白质：SEQ ID NO：102)，

还包括其他生物来源的登录号如下的其他(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因：

T04781、AF270978_1、NP_485028.1、NP_442089.1、NP_681832.1、ZP_00110421.1、ZP_00071594.1、ZP_00114706.1、ISPH_SYNY3、ZP_00114087.1、ZP_00104269.1、AF398145_1、AF398146_1、AAD55762.1、AF514843_1、NP_622970.1、NP_348471.1、NP_562001.1、NP_223698.1、NP_781941.1、ZP_00080042.1、NP_859669.1、NP_214191.1、ZP_00086191.1、ISPH_VIBCH、NP_230334.1、NP_742768.1、NP_302306.1、ISPH_MYCLE、NP_602581.1、ZP_00026966.1、NP_520563.1、NP_253247.1、NP_282047.1、ZP_00038210.1、ZP_00064913.1、CAA61555.1、ZP_00125365.1、ISPH_ACICA、EAA24703.1、ZP_00013067.1、ZP_00029164.1、NP_790656.1、NP_217899.1、NP_641592.1、NP_636532.1、NP_719076.1、NP_660497.1、NP_422155.1、NP_715446.1、ZP_00090692.1、NP_759496.1、ISPH_BURPS、ZP_00129657.1、NP_215626.1、NP_335584.1、ZP_00135016.1、NP_789585.1、NP_787770.1、NP_769647.1、ZP_00043336.1、NP_242248.1、ZP_00008555.1、NP_246603.1、ZP_00030951.1、NP_670994.1、NP_404120.1、NP_540376.1、NP_733653.1、NP_697503.1、NP_840730.1、NP_274828.1、NP_796916.1、ZP_00123390.1、NP_824386.1、NP_737689.1、ZP_00021222.1、NP_757521.1、NP_390395.1、ZP_00133322.1、CAD76178.1、NP_600249.1、NP_454660.1、NP_712601.1、NP_385018.1、NP_751989.1。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的实例为：

食用番茄(Lycopersicon esculentum)来源的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，登录号#AF143812(核酸：SEQ ID NO：103，蛋白质：SEQ IDNO：12)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因：

AF143812_1、DXS_CAPAN、CAD22530.1、AF182286_1、NP_193291.1、T52289、AAC49368.1、AAP14353.1、D71420、DXS_ORYSA、AF443590_1、BAB02345.1、CAA09804.2、NP_850620.1、CAD22155.2、AAM65798.1、NP_566686.1、CAD22531.1、AAC33513.1、CAC08458.1、AAG10432.1、T08140、AAP14354.1、AF428463_1、ZP_00010537.1、NP_769291.1、AAK59424.1、NP_107784.1、NP_697464.1、NP_540415.1、NP_196699.1、NP_384986.1、ZP_00096461.1、ZP_00013656.1、NP_353769.1、BAA83576.1、ZP_00005919.1、ZP_00006273.1、NP_420871.1、AAM48660.1、DXS_RHOCA、ZP_00045608.1、ZP_00031686.1、NP_841218.1、ZP_00022174.1、ZP_00086851.1、NP_742690.1、NP_520342.1、ZP_00082120.1、NP_790545.1、ZP_00125266.1、CAC17468.1、NP_252733.1、ZP_00092466.1、NP_439591.1、NP_414954.1、NP_752465.1、NP_622918.1、NP_286162.1、NP_836085.1、NP_706308.1、ZP_00081148.1、NP_797065.1、NP_213598.1、NP_245469.1、ZP_00075029.1、NP_455016.1、NP_230536.1、NP_459417.1、NP_274863.1、NP_283402.1、NP_759318.1、NP_406652.1、DXS_SYNLE、DXS_SYNP7、NP_440409.1、ZP_00067331.1、ZP_00122853.1、NP_717142.1、ZP_00104889.1、NP_243645.1、NP_681412.1、DXS_SYNEL、NP_637787.1、DXS_CHLTE、ZP_00129863.1、NP_661241.1、DXS_XANCP、NP_470738.1、NP_484643.1、ZP_00108360.1、NP_833890.1、NP_846629.1、NP_658213.1、NP_642879.1、ZP_00039479.1、ZP_00060584.1、ZP_00041364.1、ZP_00117779.1、NP_299528.1。

1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的实例为：

拟南芥来源的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸，登录号#AF148852，(核酸：SEQ ID NO：13，蛋白质：SEQ ID NO：14)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因：

AF148852、AY084775、AY054682、AY050802、AY045634、AY081453、AY091405、AY098952、AJ242588、AB009053、AY202991、NP_201085.1、T52570、AF331705_1、BAB16915.1、AF367205_1、AF250235_1、CAC03581.1、CAD22156.1、AF182287_1、DXR_MENPI、ZP_00071219.1、NP_488391.1、ZP_00111307.1、DXR_SYNLE、AAP56260.1、NP_681831.1、NP_442113.1、ZP_00115071.1、ZP_00105106.1、ZP_00113484.1、NP_833540.1、NP_657789.1、NP_661031.1、DXR_BACHD、NP_833080.1、NP_845693.1、NP_562610.1、NP_623020.1、NP_810915.1、NP_243287.1、ZP_00118743.1、NP_464842.1、NP_470690.1、ZP_00082201.1、NP_781898.1、ZP_00123667.1、NP_348420.1、NP_604221.1、ZP_00053349.1、ZP_00064941.1、NP_246927.1、NP_389537.1、ZP_00102576.1、NP_519531.1、AF124757_19、DXR_ZYMMO、NP_713472.1、NP_459225.1、NP_454827.1、ZP_00045738.1、NP_743754.1、DXR_PSEPK、ZP_00130352.1、NP_702530.1、NP_841744.1、NP_438967.1、AF514841_1、NP_706118.1、ZP_00125845.1、NP_404661.1、NP_285867.1、NP_240064.1、NP_414715.1、ZP_00094058.1、NP_791365.1、ZP_00012448.1、ZP_00015132.1、ZP_00091545.1、NP_629822.1、NPP_798691.1、NP_231885.1、NP_252340.1、ZP_00022353.1、NP_355549.1、NP_420724.1、ZP_00085169.1、EAA17616.1、NP_273242.1、NP_219574.1、NP_387094.1、NP_296721.1、ZP_00004209.1、NP_823739.1、NP_282934.1、BAA77848.1、NP_660577.1、NP_760741.1、NP_641750.1、NP_636741.1、NP_829309.1、NP_298338.1、NP_444964.1、NP_717246.1、NP_224545.1、ZP_00038451.1、DXR_KITGR、NP_778563.1。

异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因的实例为：

巴勒斯提纳侧金盏花(Adonis palaestina)克隆ApIPI28来源的编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸(ipiAa1)，登录号#AF188060，由Cunningham、F.X.Jr.和Gantt，E.发表：Identification of multi-gene familiesencoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologouscomplementation in Escherichia coli，Plant Cell Physiol.41(1)、119-123(2000)(核酸：SEQ ID NO：15，蛋白质：SEQ ID NO：16)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因：

Q38929、O48964、Q39472、Q13907、O35586、P58044、O42641、O35760、Q10132、P15496、Q9YB30、Q8YNH4、Q42553、O27997、P50740、O51627、O48965、Q8KFR5、Q39471、Q39664、Q9RVE2、Q01335、Q9HHE4、Q9BXS1、Q9KWF6、Q9CIF5、Q88WB6、Q92BX2、Q8Y7A5、Q8TT35 Q9KK75、Q8NN99、Q8XD58、Q8FE75、Q46822、Q9HP40、P72002、P26173、Q9Z5D3、Q8Z3X9、Q8ZM82、Q9X7Q6、O13504、Q9HFW8、Q8NJL9、Q9UUQ1、Q9NH02、Q9M6K9、Q9M6K5、Q9FXR6、O81691、Q9S7C4、Q8S3L8、Q9M592、Q9M6K3、Q9M6K7、Q9FV48、Q9LLB6、Q9AVJ1、Q9AVG8、Q9M6K6、Q9AVJ5、Q9M6K2、Q9AYS5、Q9M6K8、Q9AVG7、Q8S3L7、Q8W250、Q94IE 1、Q9AVI8、Q9AYS6、Q9SAY0、Q9M6K4、Q8GVZ0、Q84RZ8、Q8KZ12、Q8KZ66、Q8FND7、Q88QC9、Q8BFZ6、BAC26382、CAD94476。

牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例为：

拟南芥来源的编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，登录号#Y17376，Bouvier，F.、Suire，C.、d’Harlingue，A.、Backhaus，R.A.和Camara，B.：Molecular cloning of geranyl phosphate synthase and compartmentation ofmonoterpene synthesis in plant cells，Plant J.24(2)，241-252(2000)(核酸：SEQ ID NO：17，蛋白质：SEQ ID NO：18)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他牻牛儿基二磷酸酯合酶基因：

Q9FT89、Q8LKJ2、Q9FSW8、Q8LKJ3、Q9SBR3、Q9SBR4、Q9FET8、Q8LKJ1、Q84LG1、Q9JK86。

法呢基二磷酸酯合酶基因的实例为：

拟南芥来源的编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸(FPS1)，登录号#U80605，发表于Cunillera，N.、Arro，M.、Delourme，D.、Karst，E、Boronat，A.和Ferrer，A.：Arabidopsis thaliana contains two differentially expressedfarnesyl phosphate synthase genes，J.Biol Chem.271(13)，7774-7780(1996)(核酸：SEQ ID NO：19，蛋白质：SEQ ID NO：112)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他法呢基二磷酸酯合酶基因：

P53799、P37268、Q02769、Q09152、P49351、O24241、Q43315、P49352、O24242、P49350、P08836、P14324、P49349、P08524、O66952、Q08291、P54383、Q45220、P57537、Q8K9A0、P22939、P45204、O66126、P55539、Q9SWH9、Q9AVI7、Q9FRX2、Q9AYS7、Q94IE8、Q9FXR9、Q9ZWF6、Q9FXR8、Q9AR37、O50009，Q94IE9，Q8RVK7、Q8RVQ7、O04882、Q93RA8、Q93RB0、Q93RB4、Q93RB5，Q93RB3、Q93RB1、Q93RB2、Q920E5。

牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例为：

白芥(Sinapis alba)来源的编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，登录号#X98795，发表于Bonk，M.、Hoffmann，B.、Von Lintig，J.、Schledz，M.、Al-Babili，S.、Hobeika，E.、Kleinig，H.和Beyer，P.：Chloroplastimport of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differentialfates prior to membrane binding and oligomeric assembly，Eur.J.Biochem.247(3)，942-950(1997)(核酸：SEQ ID NO：21，蛋白质：SEQ ID NO：114)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因：

P22873、P34802，P56966、P80042、Q42698、Q92236、O95749、Q9WTN0、Q50727、P24322、P39464、Q9FXR3、Q9AYN2、Q9FXR2、Q9AVG6、Q9FRW4、Q9SXZ5、Q9AVJ7、Q9AYN1、Q9AVJ4、Q9FXR7、Q8LSC5、Q9AVJ6、Q8LSC4、Q9AVJ3、Q9SSU0、Q9SXZ6、Q9SST9、Q9AVJ0、Q9AVI9、Q9FRW3、Q9FXR5、Q94IF0、Q9FRX1、Q9K567、Q93RA9、Q93QX8、CAD95619、EAA31459。

八氢番茄红素合酶基因的实例为：

噬夏孢欧文菌(Erwinia uredovora)来源的编码八氢番茄红素合酶的核酸，登录号#D90087，发表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.：Elucidation of theErwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysisof gene products expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol.172(12)，6704-6712(1990)(核酸：SEQ ID NO：23，蛋白质：SEQ ID NO：24)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他八氢番茄红素合酶基因：

CAB39693、BAC69364、AAF10440、CAA45350、BAA20384、AAM72615、BAC09112、CAA48922、P_001091、CAB84588、AAF41518、CAA48155、AAD38051、AAF33237、AAG10427、AAA34187、BAB73532、CAC19567、AAM62787、CAA55391、AAB65697、AAM45379、CAC27383、AAA32836、AAK07735、BAA84763、P_000205、AAB60314、P_001163、P_000718、AAB71428、AAA34153、AAK07734、CAA42969、CAD76176、CAA68575、P_000130、P_001142、CAA47625、CAA85775、BAC14416、CAA79957、BAC76563、P_000242、P_000551、AAL02001、AAK15621、CAB94795、AAA91951、P_000448。

八氢番茄红素去饱和酶基因的实例为：

噬夏孢欧文菌来源的编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸，登录号#D90087；发表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.：Elucidation of the Erwiniauredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of geneproducts expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol. 172(12)，6704-6712(1990)(核酸：SEQ ID NO：25，蛋白质：SEQ ID NO：26)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他八氢番茄红素去饱和酶基因：

AAL15300、A39597、CAA42573、AAK51545、BAB08179、CAA48195、BAB82461、AAK92625、CAA55392、AAG10426、AAD02489、AAO24235、AAC12846、AAA99519、AAL38046、CAA60479、CAA75094、ZP_001041、ZP_001163、CAA39004、CAA44452、ZP_001142、ZP_000718、BAB82462、AAM45380、CAB56040、ZP_001091、BAC09113、AAP79175、AAL80005、AAM72642、AAM72043、ZP_000745、ZP_001141、BAC07889、CAD55814、ZP_001041、CAD27442、CAE00192、ZP_001163、ZP_000197、BAA18400、AAG10425、ZP_001119、AAF13698、2121278A、AAB35386、AAD02462、BAB68552、CAC85667、AAK51557、CAA12062、AAG51402、AAM63349、AAF85796、BAB74081、AAA91161、CAB56041、AAC48983、AAG14399、CAB65434、BAB73487、ZP_001117、ZP_000448、CAB39695、CAD76175、BAC69363、BAA17934、ZP_000171、AAF65586、ZP_000748、BAC07074、ZP_001133、CAA64853、BAB74484、ZP_001156、AAF23289、AAG28703、AAP09348、AAM71569、BAB69140、ZP_000130、AAF41516、AAG18866、CAD95940、NP_656310、AAG10645、ZP_000276、ZP_000192、ZP_000186、AAM94364、EAA31371、ZP_000612、BAC75676、AAF65582。

ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的实例为：

黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)来源的编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸，登录号#AJ224683，发表于Al-Babili，S.、Oelschlegel，J.和Beyer，P.：A cDNA encoding for beta carotene desaturase(Aceession No.AJ224683)from Narcissus pseudonarcissus L..(PGR98-103)，Plant Physiol.117，719-719(1998)(核酸：SEQ ID NO：119，蛋白质：SEQ ID NO：28)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他ζ-胡萝卜素去饱和酶基因：

Q9R6X4、Q38893、Q9SMJ3、Q9SE20、Q9ZTP4、O49901、P74306、Q9FV46、Q9RCT2、ZDS_NARPS、BAB68552.1、CAC85667.1、AF372617_1、ZDS_TARER、CAD55814.1、CAD27442.1、2121278A、ZDS_CAPAN、ZDS_LYCES、NP_187138.1、AAM63349.1、ZDS_ARATH、AAA91161.1、ZDS_MAIZE、AAG14399.1、NP_441720.1、NP_486422.1、ZP_00111920.1、CAB56041.1、ZP_00074512.1、ZP_00116357.1、NP_681127.1、ZP_00114185.1、ZP_00104126.1、CAB65434.1、NP_662300.1。

crtISO基因的实例为：

食用番茄来源的编码crtISO的核酸；登录号#AF416727，发表于Isaacson，T.、Ronen，G.、Zamir，D.和Hirschberg，J.：Cloning of tangerinefrom tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production ofbeta-carotene and xanthophylls in plants；Plant Cell 14(2)，333-342(2002)(核酸：SEQ ID NO：29，蛋白质：SEQ ID NO：122)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他crtISO基因：

AAM53952

FtsZ基因的实例为：

万寿菊来源的编码FtsZ的核酸，登录号#AF251346，发表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.：Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸：SEQ ID NO：31，蛋白质：SEQ IDNO：32)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他FtsZ基因：

CAB89286.1、AF205858_1、NP_200339.1、CAB89287.1、CAB41987.1、AAA82068.1、T06774，AF383876_1、BAC57986.1、CAD22047.1、BAB91150.1、ZP_00072546.1、NP_440816.1、T51092、NP_683172.1、BAA85116.1、NP_487898.1、JC4289、BAA82871.1、NP_781763.1、BAC57987.1、ZP_00111461.1、T51088、NP_190843.1、ZP_00060035.1、NP_846285.1、AAL07180.1、NP_243424.1、NP_833626.1、AAN04561.1、AAN04557.1、CAD22048.1、T51089、NP_692394.1、NP_623237.1、NP_565839.1、T51090、CAA07676.1、NP_113397.1、T51087、CAC44257.1、E84778、ZP_00105267.1、BAA82091.1、ZP_00112790.1、BAA96782.1、NP_348319.1、NP_471472.1、ZP_00115870.1、NP_465556.1、NP_389412.1、BAA82090.1、NP_562681.1、AAM22891.1、NP_371710.1、NP_764416.1、CAB95028.1、FTSZ_STRGR、AF120117_1、NP_827300.1、JE0282、NP_626341.1、AAC45639.1、NP_785689.1、NP_336679.1、NP_738660.1、ZP_00057764.1、AAC32265.1、NP_814733.1、FTSZ_MYCKA、NP_216666.1、CAA75616.1、NP_301700.1、NP_601357.1、ZP_00046269.1、CAA70158.1、ZP_00037834.1、NP_268026.1、FTSZ_ENTHR、NP_787643.1、NP_346105.1、AAC32264.1、JC5548、AAC95440.1、NP_710793.1、NP_687509.1、NP_269594.1、AAC32266.1、NP_720988.1、NP_657875.1、ZP_00094865.1、ZP_00080499.1、ZP_00043589.1、JC7087、NP_660559.1、AAC46069.1、AF179611_14、AAC44223.1、NP_404201.1。

MinD基因的实例为：

万寿菊来源的编码MinD的核酸，登录号#AF251019，发表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.：Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸：SEQ ID NO：33，蛋白质：SEQ IDNO：34)，

还包括其他生物体来源的登录号如下的其他MinD基因：

NP_197790.1、BAA90628.1、NP_038435.1、NP_045875.1、AAN33031.1、NP_050910.1、CAB53105.1、NP_050687.1、NP_682807.1、NP_487496.1、ZP_00111708.1、ZP_00071109.1、NP_442592.1、NP_603083.1、NP_782631.1、ZP_00097367.1、ZP_00104319.1、NP_294476.1、NP_622555.1、NP_563054.1、NP_347881.1、ZP_00113908.1、NP_834154.1、NP_658480.1、ZP_00059858.1、NP_470915.1、NP_243893.1、NP_465069.1、ZP_00116155.1、NP_390677.1、NP_692970.1、NP_298610.1、NP_207129.1、ZP_00038874.1、NP_778791.1、NP_223033.1、NP_641561.1、NP_636499.1、ZP_00088714.1、NP_213595.1、NP_743889.1、NP_231594.1、ZP_00085067.1、NP_797252.1、ZP_00136593.1、NP_251934.1、NP_405629.1、NP_759144.1、ZP_00102939.1、NP_793645.1、NP_699517.1、NP_460771.1、NP_860754.1、NP_456322.1、NP_718163.1、NP_229666.1、NP_357356.1、NP_541904.1、NP_287414.1、NP_660660.1、ZP_00128273.1、NP_103411.1、NP_785789.1、NP_715361.1、AF149810_1、NP_841854.1、NP_437893.1、ZP_00022726.1、EAA24844.1、ZP_00029547.1、NP_521484.1、NP_240148.1、NP_770852.1、AF345908_2、NP_777923.1、ZP_00048879.1、NP_579340.1、NP_143455.1、NP_126254.1、NP_142573.1、NP_613505.1、NP_127112.1、NP_712786.1、NP_578214.1、NP_069530.1、NP_247526.1、AAA85593.1、NP_212403.1、NP_782258.1、ZP_00058694.1、NP_247137.1、NP_219149.1、NP_276946.1、NP_614522.1、ZP_00019288.1、CAD78330.1。

上述优选的实施方案中优选使用的HMG-CoA还原酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：8氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：8序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有HMG-CoA还原酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：8的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：7序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加HMG-CoA还原酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：8的HMG-CoA还原酶氨基酸序列。

可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：7序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：10氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：10序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％，更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：10的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：9序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：10的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：9序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：12氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ IDNO：12序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：12的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：11序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ IDNO：12的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：11序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：14氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：14序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：14的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：13序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：14的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：13序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的异戊烯基-D-异构酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：16氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：16序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有异戊烯基-D-异构酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现异戊烯基-D-异构酶和异戊烯基-D-异构酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO：16的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：15序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它异戊烯基-D-异构酶和异戊烯基-D-异构酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加异戊烯基-D-异构酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：16的异戊烯基-D-异构酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：15序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的牻牛儿基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：18氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：18序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％；且所述蛋白质具有牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQID NO：18的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：17序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：18的牻牛儿基二磷酸酯合酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：17序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的法呢基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：20氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：20序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有法呢基二磷酸酯合酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO：20的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：19序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加法呢基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：20的法呢基二磷酸酯合酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：19序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：22氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQID NO：22序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：22的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：21序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQID NO：22的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：21序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的八氢番茄红素合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：24氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：24序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有八氢番茄红素合酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：24的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：23序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加八氢番茄红素合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：24的八氢番茄红素合酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：23序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的八氢番茄红素去饱和酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：26氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：26序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有八氢番茄红素去饱和酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQID NO：26的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：25序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加八氢番茄红素去饱和酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：26的八氢番茄红素去饱和酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：25序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的ζ-胡萝卜素去饱和酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：28氨基酸序列，或含有对该序列进行氢基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：28序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO：28的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：119序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加ζ-胡萝卜素去饱和酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：28的ζ-胡萝卜素去饱和酶氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：119序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的CrtISO基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：30氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：30序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有CrtIso的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现CrtISO和CrtISO基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：30的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：29序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它CrtISO和CrtISO基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加CrtISO的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：30的CrtISO氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：29序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的FtsZ基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：32氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：32序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有FtsZ的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现FtsZn和FtsZ基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO：32的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：31序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它FtsZn和FtsZ基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加FtsZ的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：32的FtsZ氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：31序列的核酸插入生物中。

上述优选实施方案中优选使用的MinD基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO：34氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO：34序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有MinD的酶促性质。

可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现MinDn和MinD基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO：34的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。

如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO：33序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它MinDn和MinD基因的实例。

在另一个特别优选的实施方案中，为增加MinD的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO：34的MinD氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO：33序列的核酸插入生物中。

还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有HMG-CoA还原酶基因、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因、异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因、牻牛儿基二磷酸酯合酶基因、法呢基二磷酸酯合酶基因、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因、八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素去饱和酶基因、ζ-胡萝卜素去饱和酶基因、crtISO基因、FtsZ基因或MinD基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)，可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloning：A laboratorymanual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press所述。

编码酮酶的核酸、编码β-羟化酶的核酸、编码β环化酶的核酸(含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性)，以及编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸在以下也称为“作用基因”。

可以通过下述途径产生遗传修饰的非人生物，如插入含有一个作用基因的单个核酸构建体(表达盒)、或插入包含上至2个或3个作用基因或多于3个作用基因的多重构建体。

本发明的生物优选指野生型或起始生物时可天然产生或能够通过遗传互补和/或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素(特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新叶黄素和/或紫黄质(violaxanthin)和/或叶黄素)的生物。

其他优选的生物在野生型或起始生物时已经具有羟化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能产生玉米黄质。

优选生物为植物或微生物，例如，细菌、酵母、藻类或真菌。

使用的细菌可以是由于插入产类胡萝卜素生物的类胡萝卜素生物合成基因而能合成叶黄素的细菌(例如含有例如欧文氏菌(Erwinia)来源的crt基因的埃希氏杆菌属(Escherichia)细菌)，以及自身即能够合成叶黄素的细菌(如欧文氏菌属、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属的细菌或集胞藻属的蓝细菌(Cyanobacteria))。

优选的细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、噬夏孢欧文氏菌、橙黄农杆菌、产碱菌属种PC-1、黄杆菌属种R1534菌株、集胞藻属蓝细菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。

优选的酵母为假丝酵母(Candida)、酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)或法夫酵母(Phaffia)。特别优选的酵母为Xanthophyllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。

优选的真菌为曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、阿舒嚢霉(Ashbya)、脉孢菌(Neurospora)、布拉霉(特别是Blakeslea trispora)、须霉(Phycomyces)、镰孢霉(Fusarium)或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15页，表6中描述的其它真菌。

优选的藻类有绿藻，如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻属(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)的藻类。特别优选的藻类有雨生红球藻或杜氏藻属巴德成藻(Dunaliellabardawil)。

其它可用于实施本发明方法的微生物及其生产，公开于如此处引用作为参考的DE-A-199 16 140。

特别优选的植物选自苋科(Amaranthaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、紫菀科(Asteraceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科(Berberidaceae)、十字花科(Brassicaceae)、大麻科(Cannabaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、十字花科(Cruciferae)、大戟属(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Graminae)、Illiaceae、唇形科(Labiatae)、薄荷科(Lamiaceae)、豆科(Leguminosae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、山梗菜属(Lobeliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、木犀科(Oleaceae)、兰科(Orchidaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、报春花科(Primulaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、旱金莲科(Tropaeolaceae)、伞状花科(Umbelliferae)、毛蕊花科(Verbanaceae)、葡萄科(Vitaceae)及紫罗兰科(Violaceae)。

极其优选的植物选自万寿菊属(Marigold、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、金合欢属(Acacia)、乌头属(Aconitum)、侧金盏花属(Adonis)、阿尼菊属(Arnica)、耧斗菜属(Aquilegia)、紫菀属(Aster)、黄芪属(Astragalus)、紫葳属(Bignonia)、金盏花属(Calendula)、驴蹄草属(Caltha)、风铃草属(Campanula)、美人蕉属(Canna)、矢车菊属(Centaurea)、桂竹香属(Cheiranthus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、柑桔属(Citrus)、还阳参属(Crepis)、番红花属(Crocus)、南瓜属(Curcurbita)、金雀儿属(Cytisus)、Delonia属、翠雀属(Delphinium)、石竹属(Dianthus)、康乃馨属(Dimorphotheca)、多榔菊属(Doronicum)、花菱草属(Eschscholtzia)、连翘属(Forsythia)、Fremontia属、勋章菊属(Gazania)、钩吻属(Gelsemium)、染料木属(Genista)、龙胆属(Gentiana)、老鹳草属(Geranium)、非洲菊属(Gerbera)、路边青属(Geum)、银桦属(Grevillea)、堆心菊属(Helenium)、向日葵属(Helianthus)、细辛属(Hepatica)、独活属(Heracleum)、木槿属(Hisbiscus)、赛菊芋属(Heliopsis)、金丝桃属(Hypericum)、黄金菊属(Hypochoeris)、凤仙花属(Impatiens)、鸢尾属(Iris)、蓝花楹属(Jacaranda)、棣堂属(Kerria)、毒豆属(Laburnum)、山黧豆属(Lathyrus)、猫耳草属(Leontodon)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、珍珠菜属(Lysimachia)、Maratia属、苜蓿属(Medicago)、沟酸浆属(Mimulus)、水仙属(Narcissus)、月见草属(Oenothera)、木犀属(Osmanthus)、碧冬茄属(Petunia)、石楠属(Photina)、酸浆属(Physalis)、牧根草属(Phyteuma)、委陵草属(Potentilla)、火棘属(Pyracantha)、毛茛属(Raunculus)、杜鹃花属(Rhododendron)、蔷薇属(Rosa)、金光菊属(Rudbeckia)、千里光属(Senecio)、蝇子草属(Silene)、松香草属(Silphium)、Sinapsis属、花楸属(Sorbus)、鹰爪豆属(Spartium)、黄钟花属(Tecoma)、蝴蝶草属(Torenia)、婆罗们参属(Tragopogon)、金莲花属(Trollius)、旱金莲属(Tropaeolum)、郁金香属(Tulipa)、款冬属(Tussilago)、荆豆属(Ulex)、堇菜属(Viola)或百日草属(Zinnia)植物，特别优选万寿菊属(Marigold)、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetespatula)、番茄属(Lycopersicon)、蔷薇属(Rosa)、金盏花属(Calendula)、酸浆属(Physalis)、苜蓿属(Medicago)、向日葵属(Helianthus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、紫菀属(Aster)、郁金香属(Tulipa)、水仙属(Narcissus)、碧冬茄属(Petunia)、老鹳草属(Geranium)、旱金莲属(Tropaeolum)或侧金盏花属(Adonis)植物之一。

在本发明制备酮类式胡萝卜素的方法中，优选在培养遗传修饰的生物之后收获生物、并进一步优选从生物中分离酮类胡萝卜素。

可以通过众所周知的适合特定生物的方式收获生物。在液体营养培养基中发酵培养的微生物(如细菌、酵母、藻类或真菌)或植物细胞，可以通过例如离心、滗析或过滤分离。通过已知的方式将植物生长于营养培养基中并适当时收获。

优选在有氧、至少约20℃的培养温度(例如20℃到40℃)、pH约6-9的条件下培养遗传修饰的微生物。对于遗传修饰的微生物，优选先在有氧、合成培养基(如TB或LB培养基)中、约20℃或更高温度的培养温度、pH约6至9的条件下培养，直到达到足够的细胞密度。为了能更好地控制氧化反应，优选使用可诱导的启动子。诱导酮酶表达后继续在有氧条件下培养如12小时到3天。

可以通过已知的方式从收获的生物质中分离酮类胡萝卜素，如通过抽提，并适当时经进一步的化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶、热分离法(如精馏法)或物理分离法(如层析)。

可如下所述在本发明遗传修饰的植物中特异地产生酮类胡萝卜素，优选在多种植物组织中产生，如种子、叶、果实、花，特别是花瓣。

可以通过已知的方式从收集的花瓣中分离酮类胡萝卜素，例如通过干燥并随后抽提，以及适当时进一步利用化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶、热分离法(如精馏法)或物理分离法(如层析)。例如，优选使用有机溶剂(如丙酮、己烷、乙醚或叔-甲基丁基醚)从花瓣中分离酮类胡萝卜素。

其他分离酮类胡萝卜素(特别是从花瓣中分离)的方法描述于如Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。

优选的酮类胡萝卜素选自虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花玉红质和金盏花黄质。

特别优选的酮类胡萝卜素为虾青素。

取决于使用生物的不同，获取的酮类胡萝卜素为游离的或脂肪酸酯或二葡萄糖苷形式。

利用本发明方法从植物花瓣中获得的酮类胡萝卜素为其与脂肪酸形成的单酯或二酯的形式。一些检测到的脂肪酸的实例为肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和月桂酸(Kamata和Simpson(1987)Comp.Biochem.Physio.卷86B(3)，587-591)。

酮类胡萝卜素的生产可以在整个植物中进行，或在优选实施方案中，特定在含有有色体的植物组织中进行。优选的植物组织例如根、种子、叶、果实、花，特别是蜜腺和花瓣。

在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，使用了在花中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。

优选使用花特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与花特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。

在本发明方法的另一特别优选的实施方案中，使用了在果实中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。

优选使用果实特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与果实特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。

在本发明方法的另一特别优选的实施方案中，使用了在种子中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。

优选使用种子特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与种子特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。

通过功能性连接的质体转运肽可以实现对有色体的靶向定位。

以下通过实施例描述遗传修饰植物的产生，所述遗传修饰的植物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β环化酶活性(其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ IDNO：2序列至少有70％的同一性)。

其他活性，如羟化酶活性、HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通过使用相应的作用基因，得到类似的增加。

在组合的遗传修饰中，转化可以逐个进行，或通过多重构建体完成。

优选使用含有上述的编码酮酶及编码β环化酶核酸的核酸构建体转化起始植物来产生转基因植物，所述核酸与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接；所述核酸编码的β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

另外，也优选使用两个核酸构建体转化起始植物来产生转基因植物。一个核酸构建体含有至少一个上述编码酮酶的核酸，其与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接。另一个核酸构建体含有至少一个上述编码β环化酶的核酸，其与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接，所述核酸编码的β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

以下也将这些作用基因与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接的核酸构建体称为表达盒。

优选调节信号含有一个或多个确保在植物中转录和翻译的启动子。

表达盒含有调节信号，即控制作用基因在宿主细胞中表达的调节性核酸序列。根据优选实施方案之一，表达盒包含上游启动子(即位于编码序列5’端)和下游多腺苷酸化信号(即位于编码序列3’端)，并在适当时还含有与至少一个上述基因有效连接的其它调节元件，其中作用基因的编码序列存在于所述调节元件中。“有效连接”是指启动子、编码序列、终止子和适当时的其它调节元件以各调节元件能够在编码序列的表达中发挥其预期功能的方式依次排列。

以下举例描述了优选的用于植物的核酸构建体、表达盒和载体，以及产生转基因植物的方法及转基因植物自身。

用于有效连接的优选序列(但并不仅限于此)为确保在质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油质体或其它区室中亚细胞定位的靶向序列，以及翻译增强子(如烟草花叶病毒来源的5’前导序列)(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

原则上能够控制外源基因在植物中表达的任何启动子都适合用作表达盒启动子。

“组成型”启动子是指在植物发育过程中的相对长时期(优选植物发育的全部时期)，确保在许多组织(优选所有组织)中表达的启动子。

具体而言，优选使用植物启动子或植物病毒来源的启动子。特别优选花椰菜嵌合病毒35S转录物的CaMV启动子(Franck等(1980)Cell 21：285-294；Odell等(1985)Nature 313：810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140：281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6：221-228)、19SCaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 8：2195-2202)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙糖磷酸转运蛋白(TPT)启动子(Acc.No.AB006698，碱基对53242至55281，起始于bp 55282的基因被注释为“磷酸/丙糖磷酸转运蛋白”)，或玄参(figwort)嵌合病毒来源的34S启动子(Acc.No.X16673，碱基对1到554)。

其他合适的组成型启动子为pds启动子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：4962-4966)或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank Acc.No.X03677)、农杆菌胭脂碱合成酶启动子、TR双重启动子、农杆菌OCS(章鱼碱合成酶)启动子、泛素启动子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29：637-639)、泛素1启动子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol 18：675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696)、Smas启动子、桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基的启动子或小麦来源富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO 91/13991)、Pnit启动子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)，以及本领域技术人员已知的在植物中组成型表达的其它基因的启动子。

表达盒也可以含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz等(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108)，通过这种启动子可以在某一特定时间点控制作用基因在植物中的表达。该类启动子，例如PRP1启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)、水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺诱导的启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导的启动子(Gatz等(1992)Plant J 2：397-404)、脱落酸诱导的启动子(EP 0 335 528)或乙醇或环己酮诱导的启动子(WO 93/21334)也同样可使用。

优选的启动子还有为生物或非生物应激所诱导的启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)，热诱导的番茄hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、冷诱导的马铃薯α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光诱导的PPDK启动子或损伤诱导的pinII启动子(EP375091)。

病原体诱导的启动子包括受病原体攻击诱导产生的基因的启动子，如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等的基因的启动子(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89：245-254；Uknes等(1992)ThePlant Cell 4：645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4：111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9：335-342；Matton等(1987)MolecularPlant-Microbe Interactions 2：325-342；Somssich等(1986)Proc Natl AcadSci USA 83：2427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics 2：93-98；Chen等(1996)Plant J 10：955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl AcadSci USA 91：2507-2511；Warner等(1993)Plant J 3：191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968(1989))。

也包括损伤诱导的启动子，如pinII基因启动子(Ryan(1990)Ann RevPhytopath 28：425-449；Duan等(1996)Nat Biotech 14：494-498)、wun1和wun2基因启动子(US 5,428,148)、win1和win2基因启动子(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215：200-208)、系统素(systemin)基因启动子(McGurl等(1992)Science 225：1570-1573)、WIP1基因启动子(Rohmeier等(1993)Plant Mol Biol 22：783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 323：73-76)、MPI基因启动子(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)：141-150)等。

其它合适的启动子有如果实成熟特异性启动子，例如番茄果实成熟特异性启动子(WO 94/21794、EP 409 625)。发育依赖的启动子部分地包括组织特异性启动子，因为个体组织的天然形成依赖于发育。

此外，特别优选那些确保在组织或植物部位中表达(例如生物合成酮类胡萝卜素或其前体)的启动子。优选启动子有花药、子房、花瓣、萼片、花、叶、茎、种子和根以及其组合特异性的启动子。

球茎、块茎、贮藏根或根特异性启动子，例如I类patatin启动子(B33)或马铃薯组织蛋白酶D抑制物启动子。

叶特异性启动子例如马铃薯胞质FBP酶启动子(WO 97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU启动子(小亚基)或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J 8：2445-2451)。

花特异性启动子例如八氢番茄红素合成酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因启动子(WO 98/22593)、拟南芥AP3启动子、CHRC启动子(黄瓜(Cucumis sativus)来源的有色体特异的类胡萝卜素相关蛋白质(CHRC)基因启动子，Acc.No.AF099501，碱基对1至1532)、EPSP合成酶启动子(碧冬茄(Petunia hybrida)来源的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因启动子Acc.No.M37029，碱基对1至1788)、PDS启动子(番茄(SolanumLycopersicum)来源的八氢番茄红素去饱和酶基因启动子Acc.No.U46919，碱基对1至2078)、DFR-A启动子(碧冬茄来源的二氢黄酮醇4-还原酶基因A启动子，Acc.No.X79723，碱基对32至1902)，或FBP1启动子(碧冬茄来源的花结合蛋白1基因启动子，Acc.No.L10115，碱基对52至1069)。

花药特异性启动子例如5126启动子(US 5,689,049、US 5,689,051)、glob-I启动子或g-玉米醇溶蛋白启动子。

种子特异性启动子，例如ACP05启动子(酰基载体蛋白基因，WO9218634)、拟南芥属AtS1和AtS3启动子(WO 9920775)、蚕豆(Vicia faba)LeB4启动子(WO 9729200和US 06403371)、欧洲油菜(Brassica napus)启动子(US 5608152；EP 255378；US 5420034)、蚕豆SBP启动子(DE 9903432)或玉米End1和End2启动子(WO 0011177)。

其它适合在植物中表达的启动子如Rogers等(1987)Meth in Enzymol153：253-277；Schardl等(1987)Gene 61：1-11和Berger等(1989)Proc NatlAcad Sci USA 86：8402-8406中所述。

本发明方法中特别优选种子特异性、果实特异性、花特异性、特别是花瓣特异性的组成型启动子。

优选通过如T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusiohs，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，《Current Protocols inMolecular Biology》，G reene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的常规重组和克隆技术，将合适的启动子与至少一个上述作用基因融合并优选在启动子与核酸序列之间插入的编码质体特异性转运肽的核酸及多腺苷酸化信号，来生成表达盒。

优选插入的编码质体转运肽的核酸能确保在质体(特别是有色体)中的定位。

也可以使用其核酸序列编码作用基因产物融合蛋白的表达盒，其中融合蛋白质的一部分为控制多肽易位的转运肽。优选有色体特异的转运肽，其在作用基因转移进有色体之后，可被酶解从作用基因产物部分中除去。

特别优选的转运肽来自烟草(Nicotiana tabacum)质体转酮酶或其它转运肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(rbcS)的转运肽或铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶的转运肽，以及异戊烯-焦磷酸异构酶2的转运肽)或其功能等价物。

特别优选三种烟草质体转酮酶质体转运肽盒的核酸序列，其以KpnI/BamHI片段的形式处于三个读码框中，其中ATG密码子位于NcoI切割位点：

pTP09

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC

GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-

CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-

TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-

GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGG-

GATCC_BamHI

pTP10

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC

GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-

CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-

TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-

GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG-

GATCC_BamHI

pTP11

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC

GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-

CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-

TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-

GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGG-

GATCC_BamHI

其它质体转运肽的实例有拟南芥质体异戊烯-焦磷酸异构酶2(IPP-2)的转运肽，以及豌豆来源的核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的转运肽(Guerineau，F，Woolston，S，Brooks，L，Mullineaux，P(1988)An expressioncassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts.Nucl.Acids Res.16：11380)。

本发明核酸可以合成制备或从天然获得，或者可以包含合成及天然核酸组分的混合物，并可以由多种生物来源的多个异源基因部分组成。

如上所述，优选具有植物优选密码子的合成核苷酸序列。这些植物优选的密码子，可以从大多数目的植物物种表达蛋白质时出现频率最高的密码子中确定。

在制备表达盒时，可以利用多种DNA片段以便获得便于从正确方向阅读并带有正确阅读框的核苷酸序列。可以在片段上附加连接子或接头，将DNA片段彼此相连。

方便起见，以转录的方向提供具有接头或多聚接头的启动子和终止子区域，所述接头含有用于插入该核酸序列的一个或多个限制位点。一般地，接头含有1至10，通常1至8，优选2至6个限制位点。接头在调节区内的大小一般小于100bp，常常小于60bp，但至少长5bp。对于宿主植物而言，启动子可以是天然的(或同源的)或外源的(或异源的)。表达盒优选以5’-3’转录方向含有启动子、编码核酸序列或核酸构建体，以及转录终止区。不同的终止区可以按需要互换。

终止子的实例有35S终止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.16：11380)、nos终止子(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.Nopaline synthase：transcript mapping and DNA sequence.J Mol Appl Genet.1982；1(6)：561-73)或ocs终止子(Gielen，J，deBeuckeleer，M，Seurinck，J，Debroek，H，de Greve，H，Lemmers，M，vanMontagu，M，Schell，J(1984)The complete sequence of the TL-DNA of theAgrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5.EMBO J.3：835-846)。

此外还可以进行操作，以提供适当的限制性切割位点，或删除冗余DNA或限制性切割位点。可能进行插入、缺失或替换(如转换和颠换)时，可以使用如体外诱变、引物修补、限制性酶切或连接的方法。

通过适当的操作(如限制性酶切、回嚼(chewing back)或将突出端填补成平端)，可提供进行连接的片段互补末端。

优选的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选那些基本上与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来源的T-DNA多腺苷酸化信号对应的信号，特别是Ti质粒pTiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835 ff)的T-DNA(章鱼碱合成酶)基因3的多腺苷酸化信号或其功能等价物。

将外源基因转移进植物基因组称为转化。

为此，可以使用已知的转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法，以进行瞬时或稳定转化。

适于转化植物的方法有通过聚乙二醇诱导DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的生物轰击法——“粒子轰击”法、电穿孔、在含有DNA的溶液中孵育干胚、显微注射及上文所述农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，《Transgenic Plants》，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，AcademicPress(1993)，128-143和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。

优选将要表达的构建体克隆入适于转化根癌农杆菌的载体，如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)，或特别优选pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。

用表达质粒转化的农杆菌可以通过已知的方式用于转化植物，例如在农杆菌溶液中浸浴损伤的叶子或叶子的碎片，并随后培养在适当的培养基中。

为了优选制备遗传修饰的植物(下文也称为转基因植物)，将融合表达盒克隆入适于在根癌农杆菌中转化的载体，如pBin19，或特别是pSUN5和pSUN3。此后将通过已知方式将这种载体转化的农杆菌用于转化植物(特别是农作物)，例如，通过在农杆菌溶液中浸浴损伤的叶子或叶子的碎片，并随后在适当的培养基中培养。

利用农杆菌进行植物转化特别公开于F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；《Transgenic Plants》，卷1中“Engineering andUtilization”，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页。可以通过已知的方式从损伤的叶子或叶片段的转化细胞进行转基因植物再生，所述转基因植物含有整合入表达盒的一个或多个基因。

为了用一个或多个本发明的作用基因转化宿主植物，将表达盒插入其DNA中含有额外功能调节信号(如用于复制或整合的序列)的重组载体。合适的载体特别描述于《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993)。

使用上文引用的重组和克隆技术，可以将表达盒克隆进能够在如大肠杆菌中复制的适当载体中。合适的克隆载体有例如pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.16：11380)、pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特别合适的是能够在大肠杆菌和农杆菌中复制的二元载体。

以下将通过实施例更为详细地描述本发明中遗传修饰微生物的产生，所述遗传修饰的微生物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β环化酶活性(其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ IDNO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性)。

其他活性，如羟化酶活性、HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通过使用相应的作用基因得到类似的增加。

优选将上述编码酮酶、β-羟化酶或β环化酶的核酸，以及编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸插入表达构建体及载体中，其中所述构建体含有处在调节性核酸序列遗传控制下的编码本发明中酶的核酸序列，所述载体至少含有一个这类表达构建体。

优选本发明的这类构建体含有，位于特定编码序列5’上游端的启动子和3’端下游的终止子序列，并在适当时还含有每种情况下与作用基因有效连接的其它常规调节元件。“有效连接”指的是启动子、编码序列、终止子及适当时其它调节元件以各调节元件能够在编码序列的表达中发挥其预期功能的方式依次排列。

有效连接的序列的实例有靶向序列和翻译增强子、增强子、多腺苷酸化信号等等。其它的调节元件包括选择性标记、扩增信号、复制起点等等。

除了人工调节序列之外，在实际的作用基因前仍可以存在天然的调节序列。通过遗传修饰可在需要时关闭这一天然调节作用，并增加或降低基因的表达。然而基因构建体也可以具有更简单的结构，即在结构基因的前面没有插入额外的调节信号，也没有除去天然启动子及其调节作用。反之则可以突变天然的调节序列使其不再产生调节作用，从而增加或降低基因表达。基因构建体中可以具有一个或多个拷贝的此类核酸序列。

可以使用的微生物启动子有例如在革兰氏阴性细菌中优先使用的cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc、ara-、SP6-、λ-PR-或λ-PL-启动子，及革兰氏阳性启动子amy和SPO2或酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH。特别优选使用可诱导的启动子，如光、特别是温度诱导的启动子(如P_rP_l启动子)。

原则上可以使用所有天然的启动子及其调节序列。此外，也可以有利地使用合成的启动子。

所述调节序列可使核酸序列的选择性表达及蛋白质的表达成为可能。这可能意味着(例如取决于宿主生物的不同)基因只在诱导后表达或过表达，或是立即表达和/或过表达。

既然如此，可优选调节序列或因子使其正面影响表达，从而增加或降低之。因此，通过使用如启动子和/或增强子之类的强转录信号，可以在转录水平上有利的实现调节元件的增强作用。然而，也可以例如通过提高mRNA的稳定性，增强翻译。

通过将适当的启动子与以上描述的编码酮酶、β-羟化酶、β环化酶、HMG-CoA还原酶、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶、牻牛儿基二磷酸酯合酶、法呢基二磷酸酯合酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶、ζ-胡萝卜素去饱和酶、crtISO蛋白质、FtsZ蛋白质和/或MinD蛋白质的核酸序列，以及终止子或多腺苷酸化信号融合以产生表达盒。为此可使用如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)的常规重组和克隆技术。

为了在合适的宿主生物中表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利的插入能使基因在宿主中最佳表达的宿主特异性载体。载体是本领域技术人员所熟知的，并可见于如《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。载体不仅指质粒，也指本领域技术人员已知的所有其它载体，如噬菌体、病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或随染色体复制。

可以提及的合适的表达载体的实例为：

常规融合表达载体，如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中重组目的蛋白质分别与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和A蛋白融合。

非融合蛋白表达载体，如pTrc(Amann等，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)，或pBluescript及pUC载体。

用于在酿酒酵母中表达的酵母表达载体，如pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFα(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。

适合用于其它真菌(如丝状真菌)的载体以及构建载体的方法包括，van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)″Gene transfer systemsand vector development for filamentous fungi″，《Applied MolecularGenetics of Fungi》，J.F.Peberdy等编辑，1-28页，Cambridge UniversityPress：Cambridge中详细描述的载体和方法。

可用于在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体，包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

其它合适的原核和真核细胞表达系统描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，《Molecular cloning：A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N Y，1989的第16和17章。

借助于本发明的表达构建体或载体，可以利用如至少一种本发明的载体进行转化，制备遗传修饰的生物。

将上述的本发明重组构建体有利的引入合适的宿主系统，并加以表达。这一步中，优选使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法(如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等)，以在特定表达系统中表达所述核酸。合适的系统如《Current Protocols in Molecular Biology》，F.Ausub等编辑，Wiley Interscience，New York 1997中所述。

可以通过同样存在于载体或表达盒中的标记基因来挑选成功转化的生物。这类标记基因的实例如抗生素耐药基因及催化成色反应(使转化细胞染色)的酶基因。然后可以通过自动细胞分选进行选择。

可以通过含有适当抗生素的培养基或营养培养基来选择被载体成功转化的微生物，所述载体具有适当抗生素耐药基因(如G418或潮霉素)。存在于细胞表面的标记蛋白质可用于亲和层析法进行选择。

宿主生物与适用于该生物的载体(如质粒、病毒或噬菌体，如具有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体8或其它温和噬菌体或转座子)和/或其它有利的调节序列的组合形成了表达系统。

本发明还涉及遗传修饰的非人生物，其中该遗传修饰

A对于已经具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其酮酶活性，且

B对于不具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比造成酮酶活性，

且其中该遗传修饰

C对于已经具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其β环化酶活性，且

D对于不具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比造成β环化酶活性，

而C中增加的β环化酶活性或D中造成的β环化酶活性源于以下β环化酶，该β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

如上所述，优选通过提高编码酮酶的核酸的基因表达，以相对于野生型增加(A中)或造成(B中)酮酶活性。

在另一个优选实施方案中，通过将编码酮酶的核酸引入生物，提高编码酮酶的核酸的基因表达。

该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一个酮酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码酮酶的外源(＝异源)核酸，或具有至少两个编码酮酶的内源核酸。

为此，原则上可以使用任何酮酶基因，即编码酮酶的任何核酸。

优选的编码酮酶的核酸如上面本发明方法所述。

如上所述，优选通过相对于野生型提高编码β环化酶的核酸的基因表达，以增加或造成β环化酶活性，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

在优选实施方案中，通过向生物中插入至少一个编码β环化酶的核酸，提高编码β环化酶的核酸的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一个β环化酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码β环化酶的外源(＝异源)核酸，或具有至少两个编码β环化酶的内源核酸。

为此，原则上可以使用任何β环化酶基因，即编码β环化酶的任何核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

优选的β环化酶如上所述。

如上所述，特别优选的遗传修饰生物还具有相对于野生型生物增加或造成的羟化酶活性。其他优选实施方案如上面本发明方法所述。

此外，如上所述，特别优选的遗传修饰的非人生物相对于野生型还具有选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性及MinD活性中至少一种增加的活性。其他优选实施方案如上面本发明方法所述。

本发明的生物优选指野生型或起始生物可天然产生或能够通过遗传互补和/或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新叶黄素和/或紫黄质和/或叶黄素的生物。

其他优选的生物，野生型或起始生物已经具有羟化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能产生玉米黄质。

使用的细菌可以是由于插入生产类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成基因而能合成叶黄素的细菌(例如含有例如欧文氏菌来源的crt基因的埃希氏杆菌属细菌)，以及自身即能够合成叶黄素的细菌(如欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属的细菌或集胞藻属的蓝细菌)。

优选的细菌为大肠杆菌、草生欧文氏菌、噬夏孢欧文氏菌、橙黄农杆菌、产碱菌属种PC-1、黄杆菌属种R1534菌株、集胞藻属蓝细菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。

优选的酵母为假丝酵母、酵母、汉逊酵母、毕赤酵母)或法夫酵母。特别优选的酵母为Xanthopyvllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。

优选的真菌为曲霉、木霉、阿舒囊霉、脉孢菌、布拉霉(特别是Blakesleatrispora)、须霉、镰孢霉或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15页表6中描述的其它真菌。

优选的藻类有绿藻，如红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属的藻类。特别优选的藻类有雨生红球藻或杜氏藻属巴德成藻。

其它可用于实施本发明方法的微生物及其生产，公开于如，此处引用作为参考的DE-A-19916140。

特别优选的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科及紫罗兰科。

极其优选的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、苘蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maraia属、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis属、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物，特别优选万寿菊属、万寿菊、孔雀草、番茄属、蔷薇属、金盏花属、酸浆属、苜蓿属、向日葵属、苘蒿属、紫菀属、郁金香属、水仙属、碧冬茄属、老鹳草属、旱金莲属或侧金盏花属植物之一。

极其特别优选的遗传修饰的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、侧金盏花属、番茄属、蔷薇属、金盏花属、酸浆属、苜蓿属、向日葵属、茼蒿属、紫菀属、郁金香属、水仙属、碧冬茄属、老鹳草属或旱金莲属，遗传修饰的植物含有至少一个编码酮酶的转基因核酸。

本发明还涉及转基因植物、其繁殖物质以及其植物细胞、组织或部分，特别是其果实、种子、花及花瓣。

如上所述，遗传修饰的植物可用于产生酮类胡萝卜素，特别是虾青素。

可以被人或动物食用的的本发明遗传修饰生物，特别是植物或植物的部分(例如特别是酮类胡萝卜素(特别是虾青素)含量增加的花瓣)，也可以直接或经过已知的方式加工后用作食品和饲料或食品和饲料的添加剂。

此外，遗传修饰生物也可以用于制备含有酮类胡萝卜素的生物提取物和/或制备食品和饲料添加剂。

与野生型相比，遗传修饰生物的酮类胡萝卜素含量增加。

酮类胡萝卜素含量的增加通常指酮类胡萝卜素总含量的增加。

然而，酮类胡萝卜素含量的增加也特别指优选的酮类胡萝卜素含量的改变，而总的类胡萝卜素含量不一定增加。

在特别优选的实施方案中，相对于野生型，本发明遗传修饰的植物的虾青素含量增加。

在这种情况下，增加的含量也指造成的酮类胡萝卜素(如虾青素)的含量。

通过以下的实施例(但并不仅限于此)对本发明进行说明。

一般实验条件：

重组DNA序列分析

根据Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，利用Licor激光荧光DNA测序仪(MWG Biotech，Ebersbach所售)对重组DNA分子测序。

实施例1：

扩增念珠藻属PCC 7120来源的编码NOST酮酶的完整一级序列DNA

通过PCR从念珠藻属PCC 7120(″Pasteur Culture Collection ofCyanobacterium″菌株)中扩增编码念珠藻属PCC 7120的NOST酮酶DNA。

为了从念珠藻属PCC 7120悬浮培养物制备基因组DNA，将细胞离心收集，冷冻于液氮，并在研钵中碾磨成粉。所述悬浮培养物在25℃、连续光照且恒定振荡(150rpm)条件下于BG 11培养基(1.5g/l NaNO₃、0.04g/lK₂PO₄×3H₂O、0.075g/l MgSO₄×H₂O、0.036g/l CaCl₂×2H₂O、0.006g/l柠檬酸、0.006g/l柠檬酸铁铵、0.001g/l EDTA二钠镁、0.04g/l Na₂CO₃、1ml痕量金属混合物A5+Co(2.86g/l H₃BO₃、1.81g/l MnCl₂×4H₂O、0.222g/lZnSO₄×7H₂O、0.39g/l NaMoO₄×2H₂O、0.079g/l CuSO₄×5H₂O、0.0494g/lCo(NO₃)₂×6H₂O))中生长1周。

从念珠藻PCC 7120中分离DNA的方法：

在8000rpm离心10分钟，从10ml液体培养物中沉淀细菌细胞。然后用研钵在液氮中粉碎并碾磨细胞。将细胞材料重悬浮于1ml 10mM TrisHCl(pH 7.5)，并转移至Eppendorf反应试管(容积2ml)内。加入100μl蛋白酶K(浓度：20mg/ml)后，将细胞悬浮液在37℃孵育3小时。随后用500μl苯酚抽提悬浮液。在13000rpm离心5分钟后，将上层水相转移到新的2ml Eppendorf反应试管中。用苯酚反复抽提3次。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和0.6体积的异丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗涤。在室温干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加热至65℃溶解。

通过聚合酶链式反应(PCR)，使用正义特异引物(NOSTF，SEQ ID NO：79)和反义特异引物(NOSTG SEQ ID NO：80)从念珠藻属PCC 7120中扩增编码念珠藻属PCC 7120酮酶的核酸。

使用的PCR条件如下：

在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋白质的DNA，所述混合物含有：

-1μl念珠藻属PCC 7120 DNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2mM NOSTF(SEQ ID NO.79)

-0.2mM NOSTG(SEQ ID NO：80)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-25.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

55℃ 1分钟

72℃ 3分钟

1X 72℃ 10分钟

利用SEQ ID NO.79和SEQ ID NO：80进行PCR扩增产生了805bp的片段，所述片段编码由完整一级序列组成的蛋白质(SEQ ID NO：81)。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pGEM-T(Promega)，获得pNOSTF-G克隆。

使用M 13F和M 13R引物对pNOSTF-G克隆的测序确证了与数据库条目AP003592的88,886-89,662之DNA序列一致的序列。此核苷酸序列在独立的扩增实验中可以重复，因此代表使用的念珠藻属PCC 7120中的核苷酸序列。

因此，该pNOSTF-G克隆被用于克隆进表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.16：11380)。通过从pNOSTF-G分离799bp SphI片段并连接进SphI切割的pJIT117载体，完成这一克隆。以正确方向含有念珠藻属PCC 7120酮酶的克隆被称为pJNOST，其中酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。

实施例2：

构建质粒pMCL-CrtYIBZ/idi/gps，用于在大肠杆菌中合成玉米黄质。

经中间体pMCL-CrtYIBZ和pMCL-CrtYIBZ/idi，通过3个步骤构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。使用的载体是与高拷贝数载体相容的pMCL200质粒(Nakano，Y.，Yoshida，Y.，Yamashita，Y.和Koga，T.；Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors；Gene 162(1995)，157-158)。

实施例2.1：构建pMCL-CrtYIBZ

生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtZ来自噬夏孢欧文氏菌，并通过PCR方法扩增。噬夏孢欧文氏菌(DSM 30080)的基因组DNA由GermanCollection of Microorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作为提供的服务而制备。根据制造商提供的详细信息进行PCR(Roche，Long Template PCR：Procedure for amplification of 5-20kbtargets with the expand long template PCR system)。扩增噬夏孢欧文氏菌生物合成簇的PCR条件如下：

Master Mix 1：

-1.75μl dNTP(终浓度350μM)

-0.3μM引物Crt1(SEQ ID NO：82)

-0.3μM引物Crt2(SEQ ID NO：83)

-250-500ng DSM 30080基因组DNA

加蒸馏水至总体积50μl

Master Mix 2：

-5μl 10x PCR缓冲液1(终浓度1x，含1.75mM Mg2+)

-10x PCR缓冲液2(终浓度1x，含2.25mM Mg2+)

-10x PCR缓冲液3(终浓度1x，含2.25mM Mg2+)

-0.75μl Expand Long Template Enzyme Mix(终浓度2.6单位)

加蒸馏水至总体积50μl

用移液器将两种混合物“Master Mix 1”和“Master Mix 2”混合。在50μl总体积中以如下循环条件进行PCR：

1X 94℃ 两分钟

30X 94℃ 30秒

58℃ 1分钟

68℃ 4分钟

1X 72℃ 10分钟

使用SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83进行PCR扩增产生了编码基因CrtY(蛋白质：SEQ ID NO：85)、CrtI(蛋白质：SET NID NO.86)、crtB(蛋白质：SEQ ID NO：87)和CrtZ(iDNA)的片段(SEQ ID NO：84)。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，获得pCR2.1-CrtYIBZ克隆。

用SalI和HindIII切割pCR2.1-CrtYIBZ质粒，分离所产生的SalI/HindIII片段，并通过连接将其转移进SalI/HindIII切割的pMCL200载体。克隆入pMCL 200的pCR2.1-CrtYIBZ SalI/HindIII片段长度为4624bp，编码CrtY、CrtI、crtB和CrtZ基因，对应D90087中2295位点到6918位点的序列(SEQ ID NO：84)。通过CrtZ基因内源性启动子，逆CrtY、CrtI和CrtB基因的阅读框方向转录该基因。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ。

实施例2.2：构建pMCL-CrtYIBZ/idi

通过PCR方法从大肠杆菌中扩增idi(异戊烯二磷酸异构酶；IPP异构酶)基因。使用正义特异引物(5′-idi SEQ ID NO：88)和反义特异引物(3′-idi SEQ ID NO：89)，通过聚合酶链式反应(PCR)，从大肠杆菌中扩增包含idi启动子和核糖体结合位点的编码完整idi基因的核酸。

PCR条件如下：

扩增DNA的PCR在50μl反应混合物中进行，其中含有：

-1μl大肠杆菌TOP10悬浮液

-0.25mM dNTP

-0.2mM 5′-idi(SEQ ID NO：88)

-0.2mM 3′-idi(SEQ ID NO：89)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

以下循环条件中进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

20X 94℃ 1分钟

62℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

利用SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89进行PCR扩增产生679bp的片段，该片段编码由完整一级序列(SEQ ID NO：90)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，获得pCR2.1-idi克隆。

对pCR2.1-idi克隆的测序确证了与发表的AE000372序列8774到9440位置无异的序列。这一区域包括启动子区域、可能的核糖体结合位点和完整的IPP异构酶开放阅读框。由于在idi基因的5，端插入了XhoI切割位点、3’端插入了SalI切割位点，克隆进pCR2.1-idi的片段总长为679bp。

因此，使用该克隆将idi基因克隆进pMCL-CrtYIBZ载体。通过从pCR2.1-idi分离XhoI/SalI片段并连接进XhoI/SalI切割的pMCL-CrtYIBZ载体完成这一克隆。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ/idi。

实施例2.3.：构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps

通过PCR方法从嗜超高温硫酸根还原古细菌(Archaeglobus fulgidus)中扩增gps(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶；GGPP合酶)基因。使用正义特异引物(5′-gps SEQ ID NO：92)和反义特异引物(5′-gps SEQ ID NO：93)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增嗜超高温硫酸根还原古细菌gps基因。

嗜超高温硫酸根还原古细菌DNA由German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作为提供的服务而制备。PCR条件如下：

在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的GGPP合酶蛋白质的DNA，所述混合物含有：

-1μl嗜超高温硫酸根还原古细菌DNA

-0.25mM dNTP

-0.2mM 5′-gps(SEQ ID NO：92)

-0.2mM 3′-gps(SEQ ID NO：93)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

在以下循环条件进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

20X 94℃ 1分钟

56℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

用已知方法从琼脂糖凝胶中洗脱利用PCR和SEQ ID NO：92及SEQID NO：93引物扩增的DNA片段，并用限制酶NcoI和HindIII切割之。由此产生编码由完整一级序列(SEQ ID NO：94)组成蛋白质的962bp片段。使用标准方法，将NcoI/HindIII切割的扩增子克隆进pCB97-30载体，获得pCB-gps克隆。

对pCB-gps克隆的测序确证了与发表的AF120272序列有一个核苷酸差异的A.fulgidus GGPP合酶序列。在gps基因中引入一个NcoI切割位点，改变GGPP合酶的第二个密码子。在发表的AF120272序列中，CTG(4-6位点)编码亮氨酸。使用SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93两种引物的扩增将此第二密码子改变为编码缬氨酸的GTG。

因此，使用pCB-gps克隆将gps基因克隆进pMCL-CrtYIBZ/idi载体。通过从pCB-gps中分离KpnI/XhoI片段并连接进用KpnI和XhoI切割的pMCL-CrtYIBZ/idi载体完成这一克隆。克隆的KpnI/XhoI片段(SEQ IDNO：94)带有Prrn 16启动子和rbcL的最小5’UTR序列、延伸GGPP合酶N末端的前6个rbcL密码子和gps基因3’端的psbA序列。因此该GGPP合酶的N末端具有改变的氨基酸序列Met-Thr-Pro-Gln-Thr-Ala-Met-Val-Lys-Glu，而不是天然氨基酸序列Met-Leu-Lys-Glu(AF120272的1到4位氨基酸)。这使得重组GGPP合酶从位点3(在AF120272中)的Lys开始在氨基酸序列上具有同一性，并且没有更多改变。参考Eibl等(Plant J.19.(1999)，1-13)使用rbcL和psbA序列。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。

实施例3：

在重组大肠杆菌菌株中生物转化玉米黄质

为进行玉米黄质的生物转化，通过异源互补制备能产生玉米黄质的重组大肠杆菌菌株。大肠杆菌TOP10菌株作为宿主细胞，用于用质粒pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps的互补实验。

为了制备可合成高浓度玉米黄质的大肠杆菌菌株，构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps质粒。该质粒带有噬夏孢欧文氏菌的生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtY、嗜超高温硫酸根还原古细菌的gps(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶)基因和大肠杆菌idi(异戊烯二磷酸异构酶)基因。该构建体解除了类胡萝卜素以及其生物合成前体大量聚积的限速步骤。这一点已由Wang等之前使用若干质粒以相似的方式描述(Wang，C.-W.，Oh，M.-K.和Liao，J.C.；Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthinproduction in Escherichia coli，Biotechnology and Bioengineering 62(1999)，235-241)。

使用pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps两种质粒，以已知的方式转化大肠杆菌TOP 10培养物，并在30℃或37℃的LB培养基培养过夜。同样通过已知的方式加入氨苄青霉素(50μg/ml)、氯霉素(50μg/ml)和异丙基-β-硫代半乳糖苷(1mmol)培养过夜。

为从重组菌株中分离类胡萝卜素，用丙酮抽提细胞，将有机溶剂蒸干，并通过HPLC方法在C30柱上分离类胡萝卜素。条件设置如下。

分离柱：Prontosil C30柱、250×4.6mm(Bischoff，Leonberg)

流速：1.0ml/min

洗脱液：洗脱液A-100％甲醇

洗脱液B-80％甲醇、0.2％醋酸胺

洗脱液C-100％叔丁基甲基醚

梯度曲线：

时间	流速	％洗脱液A	％洗脱液B	％洗脱液C
时间	流速	％洗脱液A	％洗脱液B	％洗脱液C	1.00	1.0	95.0	5.0	0
1.05	1.0	80.0	5.0	15.0	1.00	1.0	95.0	5.0	0
1.05	1.0	80.0	5.0	15.0	14.00	1.0	42.0	5.0	53.0
14.05	1.0	95.0	5.0	0	14.00	1.0	42.0	5.0	53.0
14.05	1.0	95.0	5.0	0	17.00	1.0	95.0	5.0	0
18.00	1.0	95.0	5.0	0	17.00	1.0	95.0	5.0	0

检测：300-500nm

使用光(电)二极管矩阵检测器直接从洗脱峰检测光谱。

通过与标准样品比较吸收光谱和保留时间，鉴定分离的物质。

实施例4：

与先前的实施例类似，制备表达雨生红球藻Flotow em.Wille来源的酮酶大肠杆菌菌株。为此，扩增编码雨生红球藻Flotow em.Wille酮酶完整一级序列的cDNA，并将此cDNA克隆进与实施例1相同的表达载体中。

通过对雨生红球藻(″Collection of algal cultures of the University ofG_ttingen″的192.80菌株)悬浮培养物进行PCR，扩增编码雨生红球藻酮酶的cDNA。为了从雨生红球藻(192.80菌株)悬浮培养物中制备总RNA，收集细胞，在液氮中冷冻，并在研钵中碾磨成粉，所述悬浮培养物在室温间接日光条件下于红球藻培养基(1.2g/l醋酸钠、2g/l酵母提取物、0.2g/lMgCl₂×6H₂O、0.02CaCl₂×2H₂O；pH 6.8；高压灭菌后加入400mg/l L-天冬酰胺、10mg/1FeSO₄×H₂O)中生长两周。随后将100mg冷冻的藻类细胞研磨粉末转移到反应试管内，并加入0.8ml Trizol缓冲液(LifeTechnologies)。用0.2ml氯仿抽提悬浮液。12000g离心15分钟后，将水相上清液转移到新的反应试管内，并用一体积的乙醇抽提。用一体积异丙醇沉淀RNA，用75％的乙醇洗涤并将沉淀溶解于DEPC水(用1/1000体积焦碳酸二乙酯水在室温孵育过夜，然后高压灭菌)。通过分光光度法测定RNA浓度。

为合成cDNA，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟，并按照制造商说明，使用反义特异引物PR1(gcaagctcga cagctacaaa cc)，通过cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)转录成cDNA。

利用正义特异引物PR2(gaagcatgca gctagcagcgacag)和反义特异引物PR1，对雨生红球藻进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增编码雨生红球藻(192.80菌株)酮酶的核酸。

PCR条件如下：

在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋

白质的DNA，所述混合物含有：

-4ml雨生红球藻cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2mM PR1

-0.2mM PR2

-5ml 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)

-25.8ml蒸馏水

在以下循环条件进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

53℃ 2分钟

72℃ 3分钟

1X 72℃ 10分钟

利用PR1和PR2进行PCR扩增产生编码由完整一级序列组成蛋白质的1155bp片段：

gaagcatgca gctagcagcg acagtaatgt tggagcagct taccggaagc gctgaggcac 60

tcaaggagaa ggagaaggag gttgcaggca gctctgacgt gttgcgtaca tgggcgaccc 120

agtactcgct tccgtcagag gagtcagacg cggcccgccc gggactgaag aatgcctaca 180

agccaccacc ttccgacaca aagggcatca caatggcgct agctgtcatc ggctcctggg 240

ccgcagtgtt cctccacgcc atttttcaaa tcaagcttcc gacctccttg gaccagctgc 300

actggctgcc cgtgtcagat gccacagctc agctggttag cggcagcagc agcctgctgc 360

acatcgtcgt agtattcttt gtcctggagt tcctgtacac aggccttttt atcaccacgc 420

atgatgctat ccatggcacc atcgccatga gaaacaggca gcttaatgac ttcttgggca 480

gagtatgcat ctccttgtac gcctggtttg attacaacat gctgcaccgc aagcattggg 540

agcaccacaa ccacactggc gaggtgggca aggaccctga cttccacagg ggaaaccctg 600

gcattgtgcc ctggtttgcc agcttcatgt ccagctacat gtcgatgtgg cagtttgcgc 660

gcctcgcatg gtggacggtg gtcatgcagc tgctgggtgc gccaatggcg aacctgctgg 720

tgttcatggc ggccgcgccc atcctgtccg ccttccgctt gttctacttt ggcacgtaca 780

tgccccacaa gcctgagcct ggcgccgcgt caggctcttc accagccgtc atgaactggt 840

ggaagtcgcg cactagccag gcgtccgacc tggtcagctt tctgacctgc taccacttcg 900

acctgcactg ggagcaccac cgctggccct ttgccccctg gtgggagctg cccaactgcc 960

gccgcctgtc tggccgaggt ctggttcctg cctagctgga cacactgcag tgggccctgc 1020

tgccagctgg gcatgcaggt tgtggcagga ctgggtgagg tgaaaagctg caggcgctgc 1080

tgccggacac gctgcatggg ctaccctgtg tagctgccgc cactagggga gggggtttgt 1140

agctgtcgag cttgc

使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pGEM-Teasy(Promega)，获得pGKETO2克隆。

利用T7和SP6引物对pGKETO2克隆的测序，确证了仅在73、114和119三个密码子中各有一个碱基与发表的X86782序列不同的序列。这些核苷酸置换可以在独立的扩增实验中重复，因此代表所用雨生红球藻192.80菌株中的核苷酸序列。

该克隆被用于雨生红球藻酮酶的表达。如实施例3所述进行大肠杆菌菌株的转化、培养和类胡萝卜素谱的分析。

表1比较了细菌产生的类胡萝卜素量：

表1：比较使用两种不同酮酶---念珠藻属PCC7120NOST酮酶(实施例1)和雨生红球藻酮酶(实施例4)---的细菌酮类胡萝卜素合成。类胡萝卜素的量以ng/ml培养液表示。

酮酶来源	虾青素	金盏花玉红质	金盏花黄质	角黄素	玉米黄质
酮酶来源	虾青素	金盏花玉红质	金盏花黄质	角黄素	玉米黄质	雨生红球藻Flotow em.Wille	13	102	738
念珠藻属PCC7120株	491	186		120		雨生红球藻Flotow em.Wille	13	102	738

实施例5：

扩增编码点形念珠藻ATCC 29133来源的NP196酮酶完整一级序列的DNA

通过PCR方法，从点形念珠藻ATCC 29133(美国典型培养物保藏中心菌株)扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的DNA。

为了从点形念珠藻ATCC 29133悬浮培养物中制备基因组DNA，离心收集细胞，在液氮中冷冻，并在研钵中碾磨成粉，所述悬浮培养物在25℃、连续光照及恒定振荡(150rpm)下于BG 11培养基(1.5g/l NaNO₃、0.04g/lK₂PO₄×3H₂O、0.075g/l MgSO₄×H₂O、0.036g/l CaCl₂×2H₂O、0.006g/l柠檬酸、0.006g/l柠檬酸铁铵、0.001g/l EDTA二钠镁、0.04g/l Na₂CO₃、1ml痕量金属混合物A5+Co(2.86g/l H₃BO₃、1.81g/l MnCl₂×4H₂O、0.222g/lZnSO₄×7H₂O、0.39g/l NaMoO₄×2H₂O、0.079g/l CuSO₄×5H₂O、0.0494g/1Co(NO₃)₂×6H₂O))中生长1周。

从点形念珠藻ATCC 29133中分离DNA的方法：

在8000rpm离心10分钟，从10ml液体培养物中沉淀细菌细胞。然后用研钵在液氮中粉碎并碾磨细菌细胞。将细胞材料重悬浮于1ml 10mMTris HCI(pH7.5)，并转移至Eppendorf反应试管(容积2ml)。加入100μl蛋白酶K(浓度：20mg/ml)后，将细胞悬浮液在37℃孵育3小时。随后用500μl苯酚抽提悬浮液。在13000rpm离心5分钟后，将上层水相转移到新的2ml Eppendorf反应试管中。用苯酚反复抽提3次。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和0.6体积的异丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗涤。在室温干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加热至65℃溶解。

通过聚合酶链式反应(PCR)，使用正义特异引物(NP196-1，SEQ ID NO：100)和反义特异引物(NP196-2SEQ ID NO：101)从点形念珠藻ATCC29133中扩增编码点形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。

PCR条件如下：

-1μl点形念珠藻ATCC29133DNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2mM NP196-1(SEQ ID NO：100)

-0.2mM NP196-2(SEQ ID NO：101)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-25.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

55℃ 1分钟

72℃ 3分钟

1X 72℃ 10分钟

利用SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101进行PCR扩增产生792bp的片段，所述片段编码由完整一级序列(NP196，SEQ ID NO：102)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pNP196克隆。

使用引物M13F和M13R对pNP196克隆的测序确证了与数据库NZ AABC01000196条目140,571-139,810的DNA序列一致的序列(与发表的数据库条目方向相反)，只是其中140,571位点的G被A取代以产生标准的起始密码子ATG。该核苷酸序列在独立扩增实验中可以重复，因此代表所用的点形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。

因此，该pNP196克隆被用于克隆进表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.16：11380)。

用根癌农杆菌Ti质粒pTi15955的OCS终止子(章鱼碱合酶)(数据库条目X00493，12,541-12,350位点，Gielen等(1984)EMBO J.3835-846)替换35S终止子，对pJIT117进行修饰。

使用质粒pHELLSGATE(数据库条目AJ311874，Wesley等(2001)Plant J.27581-590，用标准方法从大肠杆菌中分离)以及引物OCS-1(SEQ ID NO：133)和OCS-2(SEQ ID NO：134)，通过PCR方法制备含有OCT终止子区域的DNA片段。

PCR条件如下：

在50μl反应混合物中进行扩增含有章鱼碱合酶(OCS)终止子区域DNA(SEQ ID NO：106)的PCR，所述混合物中含有：

-100ng pHELLSGATE质粒DNA

-0.25mM dNTP

-0.2mM OCS-1(SEQ ID NO：104)

-0.2mM OCS-2(SEQ ID NO：105)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)

-28.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用标准方法，将210bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pOCS质粒。

对pOCS克隆测序确证了与根癌农杆菌Ti质粒pTi15955(数据库条目X00493)上12,541-12,350位点对应的序列部分。

从pOCS分离210bp的SalI-XhoI片段并将其连入SalI-XhoI切割的pJIT117载体，完成这一克隆。

该克隆被称为pJO，并用于克隆进表达载体pJONP196。

从pNP196分离782bp的SphI片段，并将其连入SphI切割的pJO载体，从而完成克隆。以正确方向含有点形念珠藻NP196酮酶的克隆被称为pJONP196，其中酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。

实施例6：

制备用于在食用番茄和万寿菊中组成性表达点形念珠藻ATCC 29133来源的NP196酮酶的表达载体

食用番茄和万寿菊中点形念珠藻NP196酮酶的表达，是在拟南芥来源的组成型启动子FNR(铁氧还蛋白NADPH氧化还原酶，数据库条目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)控制下进行的。FNR基因起始于69492碱基对，并被命名为“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”。使用豌豆转运肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240：709-715)进行表达。

使用基因组DNA(通过标准方法从拟南芥中分离)及引物FNR-1(SEQID NO：107)和FNR-2(SEQ ID NO：108)，通过PCR方法制备含有拟南芥FNR启动子区域的DNA片段。

PCR条件如下：

在50μl反应混合物中进行扩增含有FNR启动子片段FNR的DNA(SEQ ID NO：109)的PCR，所述混合物含有：

-100ng拟南芥基因组DNA

-0.25mM dNTP

-0.2mM FNR-1(SEQ ID NO：107)

-0.2mM FNR-2(SEQ ID NO：108)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)

-28.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 1分钟

72℃ 1分钟

IX 72℃ 10分钟

使用标准方法将652bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pFNR质粒。

对pFNR克隆的测序确证了与拟南芥5号染色体上70127到69493位点(数据库条目AB011474)对应的序列片段。

该克隆被称为pFNR，并因此被用于克隆进表达载体pJONP196(如实施例5所述)。

从pFNR分离644bp的SmaI-HindIII片段，并将其连入Ecl136II-HindIII切割的pJONP196载体来完成克隆。含有FNR启动子而非原始d35S启动子且以正确方向含有NP196片段的克隆被称为pJOFNR：NP196，所述NP196片段的N-末端与rbcS转运肽融合。

使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化念珠藻NP196酮酶的表达盒。

为制备表达载体MSP105，将来自pJOFNR：NP196的1839bpEcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP105含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TP FRA GMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化含有点形念珠藻NP196酮酶的表达载体的表达盒。

为制备万寿菊表达载体MSP106，将来自pJOFNR:NP196的1839bp的EcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN5载体相连。MSP106含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

实施例7：

制备用于在食用番茄和万寿菊中花特异性表达点形念珠藻ATCC29133来源的NP196酮酶的表达载体

使用豌豆rbcS转运肽(Anderson等1986，Biochem J.240：709-715)，在食用番茄和万寿菊中表达点形念珠藻NP196酮酶。该表达在碧冬茄来源的花特异性启动子EPSPS(数据库条目M37029；核苷酸区域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2：849-856)的控制下进行。

使用基因组DNA(通过标准方法从碧冬茄中分离)及引物EPSPS-1(SEQ ID NO：110)和EPSPS-2(SEQ ID NO：111)，通过PCR方法制备含有碧冬茄EPSPS启动子区域的DNA片段(SEQ ID NO：112)。

PCR条件如下：

在50μl反应混合物中进行扩增含有EPSPS启动子片段(数据库条目M37029：核苷酸区域7-1787)DNA的PCR，所述混合物含有：

-100ng拟南芥基因组DNA

-0.25mM dNTP

-0.2mM EPSPS-1(SEQ ID NO：110)

-0.2mM EPSPS-2(SEQ ID NO：111)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)

-28.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 1分钟

72℃ 2分钟

1X 72℃ 10分钟

使用标准方法将1773bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pEPSPS质粒。

对pEPSPS克隆的测序确证了与发表的EPSPS序列(数据库条目M37029：核苷酸区域7-1787)仅相差两个缺失(M37029序列46-58位点的ctaagtttcagga碱基；M37029序列1422-1429位点的aaaaatat碱基)及碱基置换(T替换M37029序列1447位点的G；A替换M37029序列1525位点的C；A替换M37029序列1627位点的G)的序列。这两个缺失和M37029序列1447及1627位点的两个碱基置换在独立扩增实验中可以重复，因此代表实际所用的碧冬茄植物的核苷酸序列。

因此，pEPSPS克隆被用于克隆进pJONP196表达载体(如实施例5所述)。

通过从pEPSPS分离1763bp的SacI-HindIII片段，并将其连接进SacI-HindIII切割的JONP196载体来完成克隆。含有EPSPS启动子而非原始d35S启动子的克隆被称为pJOESP:NP196。该表达盒以正确方向含有NP196片段，所述片段的N-末端与rbcS转运肽融合。

使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化EPSPS控制的点形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的表达载体。

为制备表达载体MSP107，将来自pJOESP:NP196的2961KBbpSachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP107含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化EPSPS控制的点形念珠藻NP196酮酶的表达载体。

为制备表达载体MSP108，将来自pJOESP:NP196的2961 KBbp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP108含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

实施例8：

扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶完整一级序列的DNA

通过PCR方法，从点形念珠藻ATCC 29133(美国典型培养物保藏中心菌株)扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的DNA。从点形念珠藻ATCC 29133的悬浮培养物中制备基因组DNA已在实施例5中描述。

使用正义特异引物(NP195-1，SEQ ID NO：113)和反义特异引物(NP195-2SEQ ID NO：114)，通过聚合酶链式反应(PCR)从点形念珠藻ATCC 29133中扩增编码点形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。

PCR条件如下：

-1μl点形念珠藻ATCC 29133 DNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2mM NP195-1(SEQ ID NO：113)

-0.2mM NP195-2(SEQ ID NO：114)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-25.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

55℃ 1分钟

72℃ 3分钟

1X 72℃ 10分钟

利用SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114进行PCR扩增产生819bp的片段，所述片段编码由完整一级序列(NP195，SEQ ID NO：115)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pNP195克隆。

使用M13F和M13R引物对pNP195克隆的测序确证了与数据库NZ AABC010001965条目55,604-56,392的DNA序列一致的序列，只是其中55,604位点的T被A替换以产生标准的起始密码子ATG。该核苷酸序列在独立扩增实验中可以重复，因此代表所用的点形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。

因此，该pNP195克隆被用于克隆进表达载体pJO(如实施例5所述)。通过从pNP195分离809bp的SphI片段，并将其连入SphI切割的pJO载体来完成克隆。以正确方向含有点形念珠藻NP195酮酶的克隆被称为pJONP195，其中所述酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。

实施例9：

制备用于在食用番茄和万寿菊中组成性表达点形念珠藻ATCC 29133来源的NP195酮酶的表达载体

食用番茄和万寿菊中点形念珠藻NP195酮酶的表达是在拟南芥来源的组成型启动子FNR(铁氧还蛋白NADPH氧化还原酶，数据库条目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)的控制进行的。FNR基因起始于69492碱基对，并被命名为“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”。使用豌豆转运肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240：709-715)进行表达。

因此，将pFNR克隆(如实施例6所述)用于克隆进表达载体pJONP195(如实施例8所述)。

通过从pFNR分离644bp的Sma-HindIII片段，并将其连入Ecl136II-HindIII切割的pJONP195载体来完成克隆。含有FNR启动子而非原始d35S启动子并以正确方向含有NP195片段的克隆被称为pJOFNR:NP195，所述NP195片段的N-末端与rbcS转运肽融合。

使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化点形念珠藻NP195酮酶的表达盒。

为制备表达载体MSP109，将来自pJOFNR:NP195的1866bpEcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP109含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于通过农杆菌介导下向万寿菊转化含有点形念珠藻NP195酮酶的表达载体的表达盒。

为制备MSP110万寿菊表达载体，将来自pJOFNR:NP195的1866bp的EcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP110含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TP

FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

实施例10：

制备用于在食用番茄和万寿菊中花特异性表达点形念珠藻ATCC29133来源的NP195酮酶的表达载体

使用豌豆rbcS转运肽(Anderson等1986，Biochem J.240：709-715)在食用番茄和万寿菊中表达点形念珠藻NP195酮酶。该表达在碧冬茄来源的花特异性启动子EPSPS(数据库条目M37029；核苷酸区域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2：849-856)的控制下进行。

因此，将pEPSPS克隆(如实施例7所述)用于克隆进表达载体pJONP195(如实施例8所述)。

通过从pEPSPS分离1763bp的SacI-HindIII片段，并将其连入SacI-HindIII切割的pJONP195载体来完成克隆。含有EPSPS启动子而非原始d35S启动子的克隆被称为pJOESP:NP195。该表达盒以正确方向含有NP195片段，所述片段的N-末端与rbcS转运肽融合。

使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于通过农杆菌介导下向食用番茄转化EPSPS控制的点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的表达载体。

为制备MSP111表达载体，将来自pJOESP:NP195的2988KB bp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP111含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化EPSPS控制的点形念珠藻NP195酮酶的表达载体。

为制备MSP112表达载体，将来自pJOESP:NP195的2988KBbp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP112含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。

实施例11：

制备用于花特异性过量表达食用番茄色素体特异的β-羟化酶的表达盒

在矮牵牛的花特异性启动子EPSPS(实施例7)的控制下，进行万寿菊中食用番茄色素体特异的β-羟化酶的表达。使用蚕豆(Vicia faba)来源的LB3为终止子元件。通过分离RNA、反转录和PCR制备色素体特异的β-羟化酶的序列。

为了制备蚕豆LB3终止子序列，按照标准方法从蚕豆组织中分离基因组DNA，并利用引物PR206和PR207对其进行基因组PCR。在50μl反应混合物中进行PCR扩增该LB3DNA片段，所述混合物含有：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2μM PR206(SEQ ID NO：116)

-0.2μM PR207(SEQ ID NO：117)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

利用PR206和PR207进行PCR扩增得到含有LB终止子的0.3kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13测序确证了与序列SEQ ID NO：118一致的序列。该克隆被命名为pTA-LB3，并因此用于克隆到载体pJIT117中(见下文)。

从番茄制备总RNA，以制备β-羟化酶序列。为此，将100mg冰冻粉碎的花转移到反应试管中，并加入0.8ml Trizol缓冲液(Life Technologies)。用0.2ml氯仿抽提悬浮液。以12000g离心15分钟后，将水相上清液取出并转移到新反应试管中并用1体积乙醇抽提。用1体积异丙醇沉淀RNA，以75％乙醇洗涤之，并将沉淀溶于DEPC水(水与1/1000体积焦碳酸二乙酯在室温下过夜孵育，然后高压灭菌)中。通过光度法测定RNA浓度。为合成cDNA，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟并根据生产商详细说明使用cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)、利用反义特异引物(PR215 SEQ ID NO：119)转录成cDNA。

随后的PCR条件如下：

在50μl反应混合物中进行PCR扩增编码β-羟化酶的VPR203-PR215DNA片段，所述混合物含有：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2μM VPR203(SEQ ID NO：120)

-0.2μM PR215(SEQ ID NO：119)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

利用VPR203和PR215进行PCR扩增得到编码β-羟化酶的0.9kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的测序确证了与序列SEQ ID NO：121一致的序列。该克隆被命名为pTA-CrtR-b2，并因此用于克隆到载体pCSP02中(见下文)。

使用质粒MSP107(见实施例7)以及引物VPR001和VPR002，通过PCR扩增制备来自矮牵牛的EPSPS启动子序列。在50μl反应混合物中进行PCR扩增该EPSPS DNA片段，所述混合物含有：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTP

-0.2μM VPR001(SEQ ID NO：122)

-0.2μM VPR002(SEQ ID NO：123)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

利用 VPR001和PR002进行PCR扩增得到编码EPSPS启动子的1.8kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的测序确证了与序列SEQ ID NO：124一致的序列。该克隆被命名为pTA-EPSPS，并因此用于克隆到载体pCSP03中(见下文)。

从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-LB3中分离0.3kbPR206-PR207EcoRI-XhoI片段，并与EcoRI-XhoI切割的载体pJIT117连接，进行克隆第一步。该含有0.3kb终止子LB3的克隆被命名为pCSP02。

从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-CrtR-b2分离0.9kb VPR003-PR215EcoRI-HindIII片段，并与EcoRI-HindIII切割的载体pCSP02连接进行克隆第二步。该含有0.9kbβ-羟化酶片段CrtR-b2的克隆被命名为pCSP03。通过连接，在终止子LB3和β-羟化酶片段CrtR-b2间形成了转录融合。

从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-EPSPS上分离1.8kb VPR001-VPR002 NcoI-SacI片段，并与NcoI-SacI切割的载体pCSP03连接完成克隆第三步。该含有1.8kb EPSPS启动子片段的克隆被命名为pCSP04。通过连接，在EPSPS启动子和β-羟化酶片段CrtR-b2之间形成了转录融合。pCSP04含有片段EPSPS(1792bp)--EPSPS启动子、片段crtRb2(929bp)--β-羟化酶CrtRb2、LB3片段(301bp)--LB3终止子。

为将该β-羟化酶过量表达盒克隆到用于农杆菌介导下转化万寿菊的表达载体中，以3103bp Ecl136II-XhoI片段分离β-羟化酶盒。通过标准方法(Klenow填补)补平3’末端(30℃，30分钟)。

该表达载体被命名为pCSEbhyd。

实施例12：

制备用于在启动子P76控制下花特异性表达食用番茄色素体特异的番茄红素β环化酶以及在EPSPS启动子控制下花特异性表达点形念珠藻ATCC 29133酮酶NP196的表达载体

通过PCR，以拟南芥基因组DNA为模板分离启动子P76(SEQ ID NO：125)。

为此使用寡核苷酸引物P76for(SEQ ID NO：126)和P76rev(SEQ IDNO：127)。在合成过程中，提供具有5’-磷酸残基的寡核苷酸。

P76for 5’-CCCGGGTGCCAAAGTAACTCTTTAT-3’

P76rev 5’-GTCGACAGGTGCATGACCAAGTAAC-3’

如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，201：25-34)从拟南芥分离基因组DNA。

如下进行PCR扩增：

80ng基因组DNA

1x Expand Long Template PCR缓冲液

2.5mM MgCl₂

dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM

300nM各引物

2.5单位Expand Long Template聚合酶

终体积为25μl

使用下面的温度程序：

94℃120秒1个循环

94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分钟35个循环

68℃ 10分钟1个循环。

通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并通过凝胶洗脱分离1032bp片段。

用限制性内切酶EcoRV消化载体pSUN5，也同样用琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。

将纯化的PCR产物克隆到如此处理的载体中。

将该构建体命名为p76。对代表拟南芥启动子P76的长为1032bp的片断(SEQ ID NO：131)进行测序。

使用限制性内切酶Kpn1和SmaI消化，从pJIT117得到35ST终止子。用琼脂糖凝胶电泳纯化该法所得的969bp片段，并以凝胶洗脱分离。

同样用限制性内切酶Kpn1和SmaI消化载体p76。用琼脂糖凝胶电泳纯化所得的7276bp片段，并以凝胶洗脱分离。

将所得35ST片段克隆到如此处理的p76中。

所得载体被命名为p7635ST。

以食用番茄的基因组DNA为模板，通过PCR方法分离Bgene(SEQ IDNO：128)。

为此使用寡核苷酸引物BgeneFor(SEQ ID NO：129)和BgeneRev(SEQ ID NO：130)。在合成过程中，提供了具有5’-磷酸残基的寡核苷酸。

SEQ ID NO 129：Bgenefor：5’-CTATTGCTAGATTGCCAATCAG-3’

SEQ ID NO 130：Bgeneves：5’-ATGGAAGCTCTTCTCAAG-3’

如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，201：25-34)从食用番茄分离基因组DNA。

如下进行PCR扩增：

80ng基因组DNA

1x Expand Long Template PCR缓冲液

2.5mM MgCl₂

dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM

300nM各引物

2.5单位Expand Long Template聚合酶

终体积为25μl

使用下面的温度程序：

94℃120秒1个循环

94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分钟35个循环

68℃ 10分钟1个循环。

利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，并通过凝胶洗脱分离1665bp片段。

用限制性内切酶SmaI消化载体p7635ST，并同样通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。

将纯化的PCR产物克隆到如此处理的载体中。

该构建体被命名为pB。对代表番茄Bgene的长为1486bp的片断进行测序，其核苷酸序列与数据库条目AF254793(SEQ ID NO：1)一致。

使用限制性内切酶PmeI和SspI消化pB，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收含有启动子P76、Bgene和35ST的3906bp片段。

用限制性内切酶Ecl126II消化MSP108(实施例7)，通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。

将纯化的来自pB的含有启动子P76、Bgene和35ST的3906bp片段克隆到如此处理的载体MSP108中。

该构建体被命名为pMKP1。

实施例13：

转基因食用番茄植物的制备和分析

根据Ling等发表的方法(Plant Cell Reports(1998)，17：843-847)转化并再生番茄植物。对于品种Microtom，使用更高浓度的卡那霉素(100mg/l)进行选择。

使用Microtom系的7到10天龄幼苗的子叶和下胚轴作为转化用的起始外植体。萌发使用Murashige和Skoog所述含2％蔗糖、pH 6.1的培养基(1962：Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant 15,473-)。在21℃、低光照(20-100μE)的条件下进行萌发。7到10天后，横向分割子叶并将下胚轴切成约5-10mm长的节段，并置于一天前预先涂布悬浮培养番茄细胞的MSBN培养基(MS，pH 6.1，3％蔗糖+1mg/1BAP、0.1mg/l NAA)上。所述番茄细胞用无菌滤纸无气泡覆盖。在上述培养基上将外植体预培养3到5天。分别用质粒独立转化根癌农杆菌LBA4404株细胞。每一次，将用二元载体转化的各农杆菌菌株在28℃含卡那霉素(20mg/l)的YEB培养基中过夜培养，并离心细胞。将细菌沉淀重悬浮于液体MS培养基(3％蔗糖、pH 6.1)，并调节到光密度为0.3(600nm处)。将预培养的外植体转移到悬浮液中，并在室温温和振荡的条件下孵育30分钟。随后，用无菌滤纸干燥外植体，并重置于其预培养基进行3天共培养(21℃)。

共培养后，将外植体转移到MSZ2培养基(MS pH 6.1+3％蔗糖、2mg/l玉米素、100mg/l卡那霉素、160mg/l替曼汀(timentin))并储存，以在21℃、弱光条件(20-100μE、光节律16h/8h)下选择性再生。在芽形成以前每两到3周转移一次外植体。可以从外植体上分离小芽，并使其在MS(pH 6.1+3％蔗糖)、160mg/l替曼汀、30mg/l卡那霉素、0.1mg/l IAA上生根。将生根的植物转移到温室。

根据上述转化方法，用以下表达构建体获得了如下株系：

用MSP105获得：MSP105-1、MSP105-2、MSP105-3

用MSP107获得：MSP107-1、MSP107-2、MSP107-3

用MSP109获得：MSP109-1、MSP109-2、MSP109-3

用MSP111获得：MSP111-1、MSP111-2、MSP111-3

实施例14：

转基因万寿菊植物的制备

将万寿菊种子灭菌并置于萌发培养基(MS培养基；Murashige和Skoog，Physio.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)上。萌发的温度/光照/时间间隔为18-28℃/20-200μE/3-16周，但是优选在21℃、20-70μE、持续4-8周。

到时收获体外发育的植物的所有叶子，并从中部横切。制备过程中将由此得到的10-60mm²大小的叶外植体储存于室温下的液体MS培养基中最多两小时。

过夜培养任何一种所需的根癌农杆菌菌株，并用于与叶子材料共培养，其中优选超毒力菌株，如具有适当二元质粒的EHA 105，所述二元质粒可以携带选择性标记基因(优选bar或pat)和一种或多种性状或报告基因。可以如下培养细菌菌株：将适当菌株的单菌落接种于具有25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸镁x7H₂O)，并在28℃培养16到20小时。然后以6000g离心10分钟收获细菌悬浮液，并以产生约0.1到0.8的OD₆₀₀的方式重悬浮于液体MS培养基。这一悬浮液用于与叶子材料共培养。

紧邻共培养之前，用细菌悬浮液替换储存叶子的MS培养基。室温及温和振荡下在农杆菌悬浮液中孵育叶子30分钟。然后将感染的外植体置于用琼脂(如0.8％的植物琼脂(Duchefa，NL))固化的具有生长调节剂(如3mg/l的苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA))的MS培养基上。叶子在培养基上的方向并不重要。外植体的培养进行1到8天，但优选6天，此过程中可使用以下条件：光强度：30-80μmol/m²x秒，温度：22-24℃，16/8小时明/暗交替。然后，将共培养的外植体转移到新鲜MS培养基，优选具有相同生长调节剂，此第二培养基额外含有抑制细菌生长的抗生素。浓度为200到500mg/l的替曼汀特别适合这一目的。使用可用于选择成功转化的第二选择性组分。1到5mg/l浓度的膦丝菌素选择特别有效，但是也可以根据所用方法考虑其它选择性组分。

每次在1到3周后，将外植体转移到新鲜培养基直至形成胚芽和小芽，此后将其转移以植根于相同基础培养基，所述培养基含有替曼汀和PPT或替代组分，以及生长调节剂(即如0.5mg/l的吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l的赤霉酸GA₃)。已生根的芽可以被转移到温室。

除所述方法外，可以进行以下有利的修改：

●在用细菌感染外植体以前，可以将其于上述共培养用的培养基上预孵育1到12天(优选3-4天)。然后如上述进行感染、共培养和选择性再生。

●再生的pH值(通常为5.8)可降为5.2。这样能改善对农杆菌生长的控制。

●向再生培养基加入AgNO₃(3-10mg/l)能改善包括再生自身在内的培养条件。

●技术人员所知的减少苯酚形成的组分(如柠檬酸、抗坏血酸、PVP和许多其它组分)对于培养有利。

●整个过程可以使用液体培养基。也可以将培养物孵育在置于液体培养基上的可购支持物上。

根据上述转化方法，用以下表达构建体获得了下述株系：

用MSP106获得：MSP106-1、MSP106-2、MSP106-3

用MSP108获得：MSP108-1、MSP108-2、MSP108-3

用MSP110获得：MSP110-1、MSP110-2、MSP110-3

用MSP112获得：MSP112-1、MSP112-2、MSP112-3

用pCSEbhyd获得：csebhyd-1、csebhyd1-2、csebhyd1-3

用pMKP1获得：mkp-1、mkp1-2、mkp1-3

实施例15：植物材料来源的类胡萝卜素酯的脂酶催化水解以及类胡萝卜素的鉴定

一般方法

a)用100％的丙酮抽提(3次500μl；每次振荡约15分钟)在研钵中碾磨的植物材料(湿重30-100mg)。将溶剂蒸发。然后将类胡萝卜素溶解于495μl丙酮，加入4.95ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.4)后充分混合溶液。然后加入约17mg胆汁盐(Sigma)以及149μl NaCl/CaCl₂溶液(3MNaCl和75mM CaCl₂)。将悬浮液在37℃孵育30分钟。为了酶促水解类胡萝卜素酯，加入595μl脂酶溶液(50mg/ml皱褶假丝酵母(Candidarugosa)来源的7型脂酶(Sigma))并在37℃振荡下孵育。约21小时后，再次加入595μl脂酶在37℃再孵育至少5小时。然后在溶液中溶解约700mgNa₂SO₄。加入1800μl石油醚后，通过剧烈振荡将类胡萝卜素抽提至有机相。重复这一振荡抽提直至有机相变为无色。合并石油醚级分并蒸发掉石油醚。用100-120μl丙酮吸收游离的类胡萝卜素。通过HPLC和C30反相柱方法，根据滞留时间和UV-VIS光谱鉴定游离的类胡萝卜素。

所用的胆汁盐或胆酸盐为胆酸盐与脱氧胆酸盐1∶1的混合物。

b)当植物材料中仅存在少量类胡萝卜素酯时采用的方法

另外，也可以利用薄层层析法分离的皱褶假丝酵母来源的脂酶水解类胡萝卜素酯。为此，用约750μl丙酮抽提50-100mg植物材料3次。将溶剂抽提物在旋转蒸发器的真空中浓缩(可耐受升高温度至40-50℃)。随后加入300ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)并充分混合。然后将悬浮物离心(1-2分钟)沉淀。将上层相转移到新的反应试管中。残留物再次用200ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)抽提并离心去除悬浮物。将两次抽提物混合(体积500ul)并蒸发掉溶剂。残余物在30ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)中重悬浮并铺在薄层板上(silica gel 60，Merck)。如果为制备/分析目的需要使用一次以上，每次应当按照薄层层析法分离所述的方法准备湿重为50-100mg的若干等分试样。

薄层板在石油醚∶丙酮(比例5∶1)中展开。可根据其颜色肉眼鉴别类胡萝卜素条带。刮下单个类胡萝卜素条带，并可为制备/分析目的而富集。用丙酮将类胡萝卜素从硅材料上洗脱；将溶剂在真空中蒸发。为水解类胡萝卜素酯，将残留物溶解于495μl丙酮中，并加入17mg胆汁盐(Sigma)、4.95ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)以及149μl 3M NaCl+75mM CaCl₂。充分混合后，将溶液在37℃平衡30分钟。随后加入595μl皱褶假丝酵母脂酶(Sigma，5mM CaCl₂贮藏液中50mg/ml)，并在37℃时振荡孵育过夜。约21小时后，再次加入等量的脂酶；将此混合物在37℃时再次振荡孵育至少5小时。然后加入约700mg Na₂SO₄(无水)，加入1800μl石油醚振荡抽提该混合物约1分钟并在3500转/分钟下离心5分钟。将上层相转移到新的反应试管中，重复振荡抽提直至上层相变为无色。合并石油醚相在真空中浓缩(温度可以为40-50℃)。残余物溶解于120μl丙酮中，如需要可使用超声。利用C30柱通过HPLC方法分离溶解的类胡萝卜素，并借助参照物质定量。

实施例16：游离类胡萝卜素的HPLC分析

在以下条件下分析根据实施例15的工作步骤获取的样品：

设定了以下HPLC条件。

分离柱：Prontosil C30柱，250×4.6mm，(Bischoff，Leonberg，Germany)

流速：1.0ml/min

洗脱液：洗脱液A-100％甲醇

洗脱液B-80％甲醇、0.2％乙酸铵

洗脱液C-100％叔丁基甲基醚

检测：300-530nm

梯度曲线：

时间	流速	％洗脱液A	％洗脱液B	％洗脱液C
时间	流速	％洗脱液A	％洗脱液B	％洗脱液C	1.00	1.0	95.0	5.0	0
12.00	1.0	95.0	5.0	0	1.00	1.0	95.0	5.0	0
12.00	1.0	95.0	5.0	0	12.10	1.0	80.0	5.0	15.0
22.00	1.0	76.0	5.0	19.0	12.10	1.0	80.0	5.0	15.0
22.00	1.0	76.0	5.0	19.0	22.10	1.0	66.5	5.0	28.5
38.00	1.0	15.0	5.0	80.0	22.10	1.0	66.5	5.0	28.5
38.00	1.0	15.0	5.0	80.0	45.00	1.0	95.0	5.0	0
46.0	1.0	95.0	5.0	0	45.00	1.0	95.0	5.0	0

某些根据本发明形成的类胡萝卜素特征性的迟滞时间为，例如，紫黄质11.7分钟，虾青素17.7分钟，金盏花黄质19分钟，金盏花玉红质19.9分钟，玉米黄质21分钟。

序列表

<110>太阳基因有限公司

<120>在遗传修饰的非人类生物中制备酮式类胡萝卜素的方法

<130>PF 55340

<160>131

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1666

<212>DNA

<213>食用番茄

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1494)

<223>

<400>1

atg gaa gct ctt ctc aag cct ttt cca tct ctt tta ctt tcc tct cct 48

Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro

1 5 10 15

aca ccc cat agg tct att ttc caa caa aat ccc tct ttt cta agt ccc 96

Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro

20 25 30

acc acc aaa aaa aaa tca aga aaa tgt ctt ctt aga aac aaa agt agt 144

Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser

35 40 45

aaa ctt ttt tgt agc ttt ctt gat tta gca ccc aca tca aag cca gag 192

Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu

50 55 60

tct tta gat gtt aac atc tca tgg gtt gat cct aat tcg aat cgg gct 240

Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala

65 70 75 80

caa ttc gac gtg atc att atc gga gct ggc cct gct ggg ctc agg cta 288

Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu

85 90 95

gct gaa caa gtt tct aaa tat ggt att aag gta tgt tgt gtt gac cct 336

Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro

100 105 110

tca cca ctc tcc atg tgg cca aat aat tat ggt gtt tgg gtt gat gag 384

Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu

115 120 125

ttt gag aat tta gga ctg gaa aat tgt tta gat cat aaa tgg cct atg 432

Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met

130 135 140

act tgt gtg cat ata aat gat aac aaa act aag tat ttg gga aga cca 480

Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro

145 150 155 160

tat ggt aga gtt agt aga aag aag ctg aag ttg aaa ttg ttg aat agt 528

Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser

165 170 175

tgt gtt gag aac aga gtg aag ttt tat aaa gct aag gtt tgg aaa gtg 576

Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val

180 185 190

gaa cat gaa gaa ttt gag tct tca att gtt tgt gat gat ggt aag aag 624

Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys

195 200 205

ata aga ggt agt ttg gtt gtg gat gca agt ggt ttt gct agt gat ttt 672

Ile Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe

210 215 220

ata gag tat gac agg cca aga aac cat ggt tat caa att gct cat ggg 720

Ile Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln Ile Ala His Gly

225 230 235 240

gtt tta gta gaa gtt gat aat cat cca ttt gat ttg gat aaa atg gtg 768

Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val

245 250 255

ctt atg gat tgg agg gat tct cat ttg ggt aat gag cca tat tta agg 816

Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg

260 265 270

gtg aat aat gct aaa gaa cca aca ttc ttg tat gca atg cca ttt gat 864

Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp

275 280 285

aga gat ttg gtt ttc ttg gaa gag act tct ttg gtg agt cgt cct gtt 912

Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val

290 295 300

tta tcg tat atg gaa gta aaa aga agg atg gtg gca aga tta agg cat 960

Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His

305 310 315 320

ttg ggg atc aaa gtg aaa agt gtt att gag gaa gag aaa tgt gtg atc 1008

Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Val Ile Glu Glu Glu Lys Cys Val Ile

325 330 335

cct atg gga gga cca ctt ccg cgg att cct caa aat gtt atg gct att 1056

Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg Ile Pro Gln Asn Val Met Ala Ile

340 345 350

ggt ggg aat tca ggg ata gtt cat cca tca aca ggg tac atg gtg gct 1104

Gly Gly Asn Ser Gly Ile Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala

355 360 365

agg agc atg gct tta gca cca gta cta gct gaa gcc atc gtc gag ggg 1152

Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly

370 375 380

ctt ggc tca aca aga atg ata aga ggg tct caa ctt tac cat aga gtt 1200

Leu Gly Ser Thr Arg Met Ile Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val

385 390 395 400

tgg aat ggt ttg tgg cct ttg gat aga aga tgt gtt aga gaa tgt tat 1248

Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr

405 410 415

tca ttt ggg atg gag aca ttg ttg aag ctt gat ttg aaa ggg act agg 1296

Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg

420 425 430

aga ttg ttt gac gct ttc ttt gat ctt gat cct aaa tac tgg caa ggg 1344

Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly

435 440 445

ttc ctt tct tca aga ttg tct gtc aaa gaa ctt ggt tta ctc agc ttg 1392

Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu

450 455 460

tgt ctt ttc gga cat ggc tca aac atg act agg ttg gat att gtt aca 1440

Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp Ile Val Thr

465 470 475 480

aaa tgt cct ctt cct ttg gtt aga ctg att ggc aat cta gca ata gag 1488

Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Leu Ala Ile Glu

485 490 495

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Ser Leu

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aa 1666

<210>2

<211>498

<212>PRT

<213>食用番茄

<400>2

Met Glu Ala Leu Leu Lys pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro

20 25 30

Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser

35 40 45

Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu

50 55 60

Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala

65 70 75 80

Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu

85 90 95

Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro

100 105 110

Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met

130 135 140

Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro

145 150 155 160

Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser

165 170 175

Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val

180 185 190

Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys

195 200 205

Ile Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe

210 215 220

Ile Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln Ile Ala His Gly

225 230 235 240

Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val

245 250 255

Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg

260 265 270

Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp

275 280 285

Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val

290 295 300

Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His

305 310 315 320

Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Val Ile Glu Glu Glu Lys Cys Val Ile

325 330 335

Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg Ile Pro Gln Asn Val Met Ala Ile

340 345 350

Gly Gly Asn Ser Gly Ile Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala

355 360 365

Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly

370 375 380

Leu Gly Ser Thr Arg Met Ile Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val

385 390 395 400

Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr

405 410 415

Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg

420 425 430

Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly

435 440 445

Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu

450 455 460

Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp Ile Val Thr

465 470 475 480

Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Leu Ala Ile Glu

485 490 495

Ser Leu

<210>3

<211>1771

<212>DNA

<213>雨生红球藻

<220>

<221>CDS

<222>(166)..(1155)

<223>

<400>3

ggcacgagct tgcacgcaag tcagcgcgcg caagtcaaca cctgccggtc cacagcctca 60

aataataaag agctcaagcg tttgtgcgcc tcgacgtggc cagtctgcac tgccttgaac 120

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Met Gln Leu Ala

1

gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga agc gct gag gca ctc aag 225

Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys

5 10 15 20

gag aag gag aag gag gtt gca ggc agc tct gac gtg ttg cgt aca tgg 273

Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp

25 30 35

gcg acc cag tac tcg ctt ccg tca gaa gag tca gac gcg gcc cgc ccg 321

Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro

40 45 50

gga ctg aag aat gcc tac aag cca cca cct tcc gac aca aag ggc atc 369

Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile

55 60 65

aca atg gcg cta cgt gtc atc ggc tcc tgg gcc gca gtg ttc ctc cac 417

Thr Met Ala Leu Arg Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His

70 75 80

gcc att ttt caa atc aag ctt ccg acc tcc ttg gac cag ctg cac tgg 465

Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp

85 90 95 100

ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag ctg gtt agc ggc acg agc agc 513

Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser

105 110 115

ctg ctc gac atc gtc gta gta ttc ttt gtc ctg gag ttc ctg tac aca 561

Leu Leu Asp Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr

120 125 130

ggc ctt ttt atc acc acg cat gat gct atg cat ggc acc atc gcc atg 609

Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met

135 140 145

aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga gta tgc atc tcc ttg 657

Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu

150 155 160

tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg cac cgc aag cat tgg gag cac 705

Tyr Ala Trp phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His

165 170 175 180

cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag gac cct gac ttc cac agg gga 753

His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly

185 190 195

aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc agc ttc atg tcc agc tac atg 801

Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met

200 205 210

tcg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg acg gtg gtc atg cag 849

Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln

215 220 225

ctg ctg ggt gcg cca atg gcg aac ctg ctg gtg ttc atg gcg gcc gcg 897

Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala

230 235 240

ccc atc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt ggc acg tac atg ccc 945

pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro

245 250 255 260

cac aag cct gag cct ggc gcc gcg tca ggc tct tca cca gcc gtc atg 993

His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met

265 270 275

aac tgg tgg aag tcg cgc act agc cag gcg tcc gac ctg gtc agc ttt 1041

Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe

280 285 290

ctg acc tgc tac cac ttc gac ctg cac tgg gag cac cac cgc tgg ccc 1089

Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro

295 300 305

ttc gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc cgc ctg tct ggc cga 1137

Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg

310 315 320

ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc cctgctgcca 1185

Gly Leu Val Pro Ala

325

gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa agctgcaggc gctgctgccg 1245

gacacgctgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta ggggaggggg tttgtagctg 1305

tcgagcttgc cccatggatg aagctgtgta gtggtgcagg gagtacaccc acaggccaac 1365

acccttgcag gagatgtctt gcgtcgggag gagtgttggg cagtgtagat gctatgattg 1425

tatcttaatg ctgaagcctt taggggagcg acacttagtg ctgggcaggc aacgccctgc 1485

aaggtgcagg cacaagctag gctggacgag gactcggtgg caggcaggtg aagaggtgcg 1545

ggagggtggt gccacaccca ctgggcaaga ccatgctgca atgctggcgg tgtggcagtg 1605

agagctgcgt gattaactgg gctatggatt gtttgagcag tctcacttat tctttgatat 1665

agatactggt caggcaggtc aggagagtga gtatgaacaa gttgagaggt ggtgcgctgc 1725

ccctgcgctt atgaagctgt aacaataaag tggttcaaaa aaaaaa 1771

<210>4

<211>329

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<400>4

Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala

1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val

20 25 30

Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp

35 40 45

Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp

50 55 60

Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Arg Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala

65 70 75 80

Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp

85 90 95

Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser

100 105 110

Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu

115 120 125

Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly

130 135 140

Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val

145 150 155 160

Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys

165 170 175

His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp

180 185 190

Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met

195 200 205

Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr

210 215 220

Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe

225 230 235 240

Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly

245 250 255

Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser

260 265 270

Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp

275 280 285

Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His

290 295 300

His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg

305 310 315 320

Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala

325

<210>5

<211>1163

<212>DNA

<213>食用番茄

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(942)

<223>

<400>5

att cgg cac gag att tca gcc tcc gct agt tcc cga acc att cgc ctc 48

Ile Arg His Glu Ile Ser Ala Ser Ala Ser Ser Arg Thr Ile Arg Leu

1 5 10 15

cgt cat aac ccg ttt ctc agt cca aaa tcc gcc tca acc gcc ccg ccg 96

Arg His Asn Pro Phe Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ser Thr Ala Pro Pro

20 25 30

gtt ctg ttc ttc tct ccg tta act cgc aat ttt ggc gca att ttg ctg 144

Val Leu Phe Phe Ser pro Leu Thr Arg Asn Phe Gly Ala Ile Leu Leu

35 40 45

tct aga aga aag ccg aga ttg gcg gtt tgt ttt gtg ctg gag aat gag 192

Ser Arg Arg Lys Pro Arg Leu Ala Val Cys Phe Val Leu Glu Asn Glu

50 55 60

aaa ttg aat agt act atc gaa agt gag agt gaa gta ata gag gat cgg 240

Lys Leu Asn Ser Thr Ile Glu Ser Glu Ser Glu Val Ile Glu Asp Arg

65 70 75 80

ata caa gta gag att aat gag gag aag agt tta gct gcc agt tgg ctg 288

Ile Gln Val Glu Ile Asn Glu Glu Lys Ser Leu Ala Ala Ser Trp Leu

85 90 95

gcg gag aaa ttg gcg agg aag aaa tcg gag agg ttt act tat ctt gtg 336

Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val

100 105 110

gca gct gtg atg tct agt ttg ggg att act tct atg gcg att ttg gcg 384

Ala Ala Val Met Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ser Met Ala Ile Leu Ala

115 120 125

gtt tat tac aga ttt tca tgg caa atg gag ggt gga gaa gtg cct ttt 432

Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Phe

130 135 140

tct gaa atg tta gct aca ttc act ctc tcg ttt ggc gct gcc gta gga 480

Ser Glu Met Leu Ala Thr Phe Thr Leu Ser Phe Gly Ala Ala Val Gly

145 150 155 160

atg gag tac tgg gcg aga tgg gct cat aga gca cta tgg cat gct tct 528

Met Glu Tyr Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp His Ala Ser

165 170 175

tta tgg cac atg cac gag tcg cac cat aga cca aga gaa gga cct ttt 576

Leu Trp His Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Glu Gly Pro Phe

180 185 190

gag atg aac gac gtt ttc gcc ata aca aat gct gtt cca gct ata ggt 624

Glu Met Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala Ile Gly

195 200 205

ctt ctt tcc tac ggt ttc ttc cat aaa ggg atc gtc cct ggc ctc tgt 672

Leu Leu Ser Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Ile Val Pro Gly Leu Cys

210 215 220

ttc ggc gct gga ttg ggg atc aca gta ttt ggg atg gct tac atg ttc 720

Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met Phe

225 230 235 240

gtt cac gat gga ctg gtt cat aag aga ttt ccc gta ggg cct att gcc 768

Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe pro Val Gly Pro Ile Ala

245 250 255

aac gtg cct tac ttt cgg agg gta gct gca gca cat cag ctt cat cac 816

Asn Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Leu His His

260 265 270

tcg gac aaa ttt gat ggt gtc cca tat ggc ttg ttt cta gga cct aag 864

Ser Asp Lys Phe Asp Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys

275 280 285

gaa ttg gaa gaa gta gga gga ctt gaa gag tta gaa aag gaa gtc aac 912

Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val Asn

290 295 300

cga agg att aaa att tct aag gga tta tta tgatcaaaag atacgtctga 962

Arg Arg Ile Lys Ile Ser Lys Gly Leu Leu

305 310

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tatatatatg aatataatat aaaatgcaac aagctttcta tggagaagac cttttctttt 1082

ttggtacctg tacgtaaaag gtgaacaatt tgatgtccta gtacttgttg acaaaccaga 1142

agaacgataa ttcaaaacaa a 1163

<210>6

<211>314

<212>PRT

<213>食用番茄

<400>6

Ile Arg His Glu Ile Ser Ala Ser Ala Ser Ser Arg Thr Ile Arg Leu

1 5 10 15

Arg His Asn pro Phe Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ser Thr Ala Pro Pro

20 25 30

Val Leu phe phe Ser Pro Leu Thr Arg Asn Phe Gly Ala Ile Leu Leu

35 40 45

Ser Arg Arg Lys Pro Arg Leu Ala Val Cys Phe Val Leu Glu Asn Glu

50 55 60

Lys Leu Asn Ser Thr Ile Glu Ser Glu Ser Glu Val Ile Glu Asp Arg

65 70 75 80

Ile Gln Val Glu Ile Asn Glu Glu Lys Ser Leu Ala Ala Ser Trp Leu

85 90 95

Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val

100 105 110

Ala Ala Val Met Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ser Met Ala Ile Leu Ala

115 120 125

Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Phe

130 135 140

Ser Glu Met Leu Ala Thr Phe Thr Leu Ser Phe Gly Ala Ala Val Gly

145 150 155 160

Met Glu Tyr Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp His Ala Ser

165 170 175

Leu Trp His Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Glu Gly Pro Phe

180 185 190

Glu Met Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala Ile Gly

195 200 205

Leu Leu Ser Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Ile Val pro Gly Leu Cys

210 215 220

Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met phe

225 230 235 240

Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Ile Ala

245 250 255

Asn Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Leu His His

260 265 270

Ser Asp Lys Phe Asp Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys

275 280 285

Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val Asn

290 295 300

Arg Arg Ile Lys Ile Ser Lys Gly Leu Leu

305 310

<210>7

<211>1779

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1779)

<223>

<400>7

atg gat ctc cgt cgg agg cct cct aaa cca ccg gtt acc aac aac aac 48

Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn

1 5 10 15

aac tcc aac gga tct ttc cgt tct tat cag cct cgc act tcc gat gac 96

Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp

20 25 30

gat cat cgt cgc cgg gct aca aca att gct cct cca ccg aaa gca tcc 144

Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ile Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser

35 40 45

gac gcg ctt cct ctt ccg tta tat ctc aca aac gcc gtt ttc ttc acg 192

Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr

50 55 60

ctc ttc ttc tcc gtc gcg tat tac ctc ctc cac cgg tgg cgt gac aag 240

Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys

65 70 75 80

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<213>食用番茄

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100 105 110

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340 345 350

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370 375 380

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Asp Ile Val Ala Ile His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Met Asn

420 425 430

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Leu Phe His Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly Ile Ala

435 440 445

gaa caa cat gca gta acc ttt gct gct gga ttg gct tgt gaa ggc att 1392

Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly Ile

450 455 460

aaa cct ttc tgt gca atc tat tcg tct ttc atg cag agg gct tat gac 1440

Lys Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Ser Phe Met Gln Arg Ala Tyr Asp

465 470 475 480

cag gta gtg cat gac gtt gat ttg caa aag ctg ccc gtg agg ttt gca 1488

Gln Va1 Val His Asp Val Asp Leu Gln Lys Leu Pro Val Arg Phe Ala

485 490 495

atg gac aga gca ggt ctt gtt gga gca gat ggt cca aca cat tgt ggt 1536

Met Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly

500 505 510

gca ttt gat gtt act tac atg gca tgt ctt cct aac atg gtt gta atg 1584

Ala Phe Asp Val Thr Tyr Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met

515 520 525

gct cct tct gat gaa gcg gag cta ttt cac atg gta gca act gct gcc 1632

Ala Pro Ser Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala

530 535 540

gcc att gat gac aga cca agt tgt ttt aga tac cca aga gga aat ggg 1680

Ala Ile Asp Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly

545 550 555 560

atc ggt gta gag ctt ccg gct gga aac aaa gga att cct ctt gag gtt 1728

Ile Gly Val Glu Leu Pro Ala Gly Asn Lys Gly Ile Pro Leu Glu Val

565 570 575

ggt aaa ggt agg ata ttg att gag ggg gag aga gtg gct cta ttg gga 1776

Gly Lys Gly Arg Ile Leu Ile Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly

580 585 590

tat ggc tca gca gtg cag aac tgt ttg gat gct gct att gtg cta gaa 1824

Tyr Gly Ser Ala Val Gln Asn Cys Leu Asp Ala Ala Ile Val Leu Glu

595 600 605

tcc cgc ggc tta caa gta aca gtt gca gat gca cgt ttc tgc aaa cca 1872

Ser Arg Gly Leu Gln Val Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro

610 615 620

ctg gac cat gcc ctc ata agg agc ctt gca aaa tca cat gaa gtg cta 1920

Leu Asp His Ala Leu Ile Arg Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu

625 630 635 640

atc act gtc gaa gaa gga tca att gga ggt ttt gga tct cat gtt gtt 1968

Ile Thr Val Glu Glu Gly Ser Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Val

645 650 655

cag ttc atg gcc tta gat ggg ctt ctt gat ggc aag ttg aag tgg aga 2016

Gln Phe Met Ala Leu Asp Gly Leu Leu Asp Gly Lys Leu Lys Trp Arg

660 665 670

cca ata gtt ctt cct gat cga tac att gac cat gga tct cct gtt gat 2064

Pro Ile Val Leu Pro Asp Arg Tyr Ile Asp His Gly Ser Pro Val Asp

675 680 685

cag ttg gcg gaa gct ggc cta aca cca tct cac att gca gca aca gta 2112

Gln Leu Ala Glu Ala Gly Leu Thr pro Ser His Ile Ala Ala Thr Val

690 695 700

ttt aac ata ctt gga caa acc aga gag gct cta gag gtc atg aca taa 2160

Phe Asn Ile Leu Gly Gln Thr Arg Glu Ala Leu Glu Val Met Thr

705 710 715

<210>12

<211>719

<212>pRT

<213>食用番茄

<400>12

Met Ala Leu Cys Ala Tyr Ala Phe Pro Gly Ile Leu Asn Arg Thr Gly

1 5 10 15

Val Val Ser Asp Ser Ser Lys Ala Thr Pro Leu phe Ser Gly Trp Ile

20 25 30

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35 40 45

Val Lys Lys Arg Ser Arg Val Val Gln Ala Ser Leu Ser Glu Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Asp Glu Leu Arg Ser Asp Thr Ile Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly

100 105 110

Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu

115 120 125

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130 135 140

His Gln Ser Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Met

145 150 155 160

Ser Thr Leu Arg Gln Thr Asp Gly Leu Ala Gly Phe Thr Lys Arg Ser

165 170 175

Glu Ser Glu Tyr Asp Cys Phe Gly Thr Gly His Ser Ser Thr Thr Ile

180 185 190

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l95 200 205

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210 215 220

Ala Tyr Glu Ala Met Asn Asn Ala Gly Tyr Leu Asp Ser Asp Met Ile

225 230 235 240

Val Ile Leu Asn Asp Asn Arg Gln Val Ser Leu Pro Thr Ala Thr Leu

245 250 255

Asp Gly Pro Val Ala Pro Val Gly Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ser Arg

260 265 270

Leu Gln Ser Asn Arg Pro Leu Arg Glu Leu Arg Glu Val Ala Lys Gly

275 280 285

Val Thr Lys Gln Ile Gly Gly Pro Met His Glu Leu Ala Ala Lys Val

290 295 300

Asp Glu Tyr Ala Arg Gly Met Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Leu Phe

305 310 315 320

Glu Glu Leu Gly Leu Tyr Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly His Asn Ile

325 330 335

Asp Asp Leu Ile Ala Ile Leu Lys Glu Val Arg Ser Thr Lys Thr Thr

340 345 350

Gly Pro Val Leu Ile His Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro

355 360 365

Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Ala Lys Phe Asp

370 375 380

Pro Ala Thr Gly Lys Gln Phe Lys Ala Ser Ala Lys Thr Gln Ser Tyr

385 390 395 400

Thr Thr Tyr Phe Ala Glu Ala Leu Ile Ala Glu Ala Glu Ala Asp Lys

405 410 4l5

Asp Ile Val Ala Ile His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Met Asn

420 425 430

Leu Phe His Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly Ile Ala

435 440 445

Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly Ile

450 455 460

Lys Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Ser Phe Met Gln Arg Ala Tyr Asp

465 470 475 480

Gln Val Val His Asp Val Asp Leu Gln Lys Leu Pro Val Arg Phe Ala

485 490 495

Met Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly

500 505 510

Ala Phe Asp Val Thr Tyr Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met

515 520 525

Ala Pro Ser Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala

530 535 540

Ala Ile Asp Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly

545 550 555 560

Ile Gly Val Glu Leu Pro Ala Gly Asn Lys Gly Ile Pro Leu Glu Val

565 570 575

Gly Lys Gly Arg Ile Leu Ile Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly

580 585 590

Tyr Gly Ser Ala Val Gln Asn Cys Leu Asp Ala Ala Ile Val Leu Glu

595 600 605

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610 615 620

Leu Asp His Ala Leu Ile Arg Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu

625 630 635 640

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645 650 655

Gln Phe Met Ala Leu Asp Gly Leu Leu Asp Gly Lys Leu Lys Trp Arg

660 665 670

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675 680 685

Gln Leu Ala Glu Ala Gly Leu Thr Pro Ser His Ile Ala Ala Thr Val

690 695 700

Phe Asn Ile Leu Gly Gln Thr Arg Glu Ala Leu Glu Val Met Thr

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<220>

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<223>

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1 5 10 15

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Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly

20 25 30

ttt agt ttg agg agg agg aat caa ggg aga ggt ttt gga aaa ggt gtt 144

Phe Ser Leu Arg Arg Arg Asn Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val

35 40 45

aag tgt tca gtg aaa gtg cag cag caa caa caa cct cct cca gca tgg 192

Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp

50 55 60

cct ggg aga gct gtc cct gag gcg cct cgt caa tct tgg gat gga cca 240

Pro Gly Arg Ala Val Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro

65 70 75 80

aaa ccc atc tct atc gtt gga tct act ggt tct att ggc act cag aca 288

Lys Pro Ile Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr

85 90 95

ttg gat att gtg gct gag aat cct gac aaa ttc aga gtt gtg gct cta 336

Leu Asp Ile Val Ala Glu Ash Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu

100 105 110

gct gct ggt tcg aat gtt act cta ctt gct gat cag gta agg aga ttt 384

Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg phe

115 120 125

aag cct gca ttg gtt gct gtt aga aac gag tca ctg att aat gag ctt 432

Lys Pro Ala Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asn Glu Leu

130 135 140

aaa gag gct tta gct gat ttg gac tat aaa ctc gag att att cca gga 480

Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Leu Glu Ile Ile Pro Gly

145 150 155 160

gag caa gga gtg att gag gtt gcc cga cat cct gaa gct gta acc gtt 528

Glu Gln Gly Val Ile Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val

165 170 175

gtt acc gga ata gta ggt tgt gcg gga cta aag cct acg gtt gct gca 576

Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala

180 185 190

att gaa gca gga aag gac att gct ctt gca aac aaa gag aca tta atc 624

Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile

195 200 205

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Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Asn Val Lys

210 215 220

att ctt ccg gca gat tca gaa cat tct gcc ata ttt cag tgt att caa 720

Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln

225 230 235 240

ggt ttg cct gaa ggc gct ctg cgc aag ata atc ttg act gca tct ggt 768

Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly

245 250 255

gga gct ttt agg gat tgg cct gtc gaa aag cta aag gaa gtt aaa gta 816

Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val

260 265 270

gcg gat gcg ttg aag cat cca aac tgg aac atg gga aag aaa atc act 864

Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr

275 280 285

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Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr

340 345 350

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Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg

355 360 365

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Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn

370 375 380

gtg aaa tac cca tcc atg gat ctt gct tat gct gct gga cga gct gga 1200

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385 390 395 400

ggc aca atg act gga gtt ctc agc gcc gcc aat gag aaa gct gtt gaa 1248

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405 410 415

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420 425 430

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Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser

435 440 445

ctt gaa gag att gtt cac tat gac ttg tgg gca cgt gaa tat gcc gcg 1392

Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala

450 455 460

aat gtg cag ctt tct tct ggt gct agg cca gtt cat gca tga 1434

Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala

465 470 475

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<212>PRT

<213>拟南芥

<400>14

Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala Ile Ser

1 5 10 15

Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly

20 25 30

Phe Ser Leu Arg Arg Arg Asn Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val

35 40 45

Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp

50 55 60

Pro Gly Arg Ala Val Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro

65 70 75 80

Lys Pro Ile Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr

85 90 95

Leu Asp Ile Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu

100 105 110

Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe

115 120 125

Lys Pro Ala Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asn Glu Leu

130 135 140

Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Leu Glu Ile Ile Pro Gly

145 150 155 160

Glu Gln Gly Val Ile Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val

165 170 175

Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala

180 185 190

Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile

195 200 205

Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Asn Val Lys

210 215 220

Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln

225 230 235 240

Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly

245 250 255

Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val

260 265 270

Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr

275 280 285

Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala

290 295 300

His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His

305 310 315 320

Pro Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val

325 330 335

Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr

340 345 350

Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg

355 360 365

Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn

370 375 380

Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly

385 390 395 400

Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu

405 410 415

Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val

420 425 430

Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser

435 440 445

Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala

450 455 460

Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala

465 470 475

<210>15

<211>884

<212>DNA

<213>巴勒斯提纳侧金盏花克隆ApIPI28

<220>

<221>CDS

<222>(180)..(884)

<223>

<400>15

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cttcgtgttc ttctcccgct gttcatcttc agcagcgttg tcgtactctt tctatttctt 120

cttccatcac taacagtcct cgccgagggt tgaatcggct gttcgcctca acgtcgact 179

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1 5 10 15

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Met Phe Asp Asp Glu Cys Ile Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val

20 25 30

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Gly His Asp Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Met Glu Lys Ile Glu Ala

35 40 45

gaa aac ttg ctt cac aga gcc ttc agt gtt ttc tta ttc aac tca aaa 37l

Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys

50 55 60

tac gag ttg ctt ctt cag caa cga tct gca acg aag gta aca ttc ccg 419

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro

65 70 75 80

ctc gta tgg aca aac acc tgt tgc agc cat ccc ctc ttc cgt gat tcc 467

Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser

85 90 95

gaa ctc ata gaa gaa aat ttt ctc ggg gta cga aac gct gca caa agg 515

Glu Leu Ile Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg

100 105 1l0

aag ctt tta gac gag cta ggc att cca gct gaa gac gta cca gtt gat 563

Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp

115 120 125

gaa ttc act cct ctt ggt cgc att ctt tac aaa gct cca tct gac gga 611

Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly

130 135 140

aaa tgg gga gag cac gaa ctg gac tat ctt ctg ttt att gtc cga gat 659

Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp

145 150 155 160

gtg aaa tac gat cca aac cca gat gaa gtt gct gac gct aag tac gtt 707

Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val

165 170 175

aat cgc gag gag ttg aaa gag ata ctg aga aaa gct gat gca ggt gaa 755

Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu

180 185 190

gag gga ata aag ttg tct cct tgg ttt aga ttg gtt gtg gat aac ttt 803

Glu Gly Ile Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe

195 200 205

ttg ttc aag tgg tgg gat cat gta gag gag ggg aag att aag gac gtc 851

Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys Ile Lys Asp Val

2l0 215 220

gcc gac atg aaa act atc cac aag ttg act taa 884

Ala Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu Thr

225 230

<210>16

<211>234

<212>PRT

<213>巴勒斯提纳侧金盏花克隆ApIPI28

<400>16

Met Gly Glu Val Ala Asp Ala Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu

1 5 10 15

Met Phe Asp Asp Glu Cys Ile Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val

20 25 30

Gly His Asp Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Met Glu Lys Ile Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys

50 55 60

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro

65 70 75 80

Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser

85 90 95

Glu Leu Ile Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg

100 105 110

Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp

115 120 125

Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly

130 135 140

Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp

145 150 155 160

Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val

165 170 175

Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu

180 185 190

Glu Gly Ile Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe

195 200 205

Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys Ile Lys Asp Val

210 215 220

Ala Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu Thr

225 230

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<211>1402

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(52)..(1317)

<223>

<400>17

aagtctttgc ctctttggtt tactttcctc tgttttcgat ccatttagaa a atg tta 57

Met Leu

1

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5 10 15

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Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe Ala Ile

20 25 30

att ccc gat cag ggt cac tct tgt tct gac tct cca cac aag ggt tac 201

Ile Pro Asp Gln Gly His Ser Cys Ser Asp Ser Pro His Lys Gly Tyr

35 40 45 50

gtt tgc aga aca act tat tca ttg aaa tct ccg gtt ttt ggt gga ttt 249

Val Cys Arg Thr Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Gly Gly Phe

55 60 65

agt cat caa ctc tat cac cag agt agc tcc ttg gtt gag gag gag ctt 297

Ser His Gln Leu Tyr His Gln Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu Glu Leu

70 75 80

gac cca ttt tcg ctt gtt gcc gat gag ctg tca ctt ctt agt aat aag 345

Asp Pro Phe Ser Leu Val Ala Asp Glu Leu Ser Leu Leu Ser Asn Lys

85 90 95

ttg aga gag atg gta ctt gcc gag gtt cca aag ctt gcc tct gct gct 393

Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser Ala Ala

100 105 110

gag tac ttc ttc aaa agg ggt gtg caa gga aaa cag ttt cgt tca act 441

Glu Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg Ser Thr

115 120 125 130

att ttg ctg ctg atg gcg aca gct ctg gat gta cga gtt cca gaa gca 489

Ile Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro Glu Ala

135 140 145

ttg att ggg gaa tca aca gat ata gtc aca tca gaa tta cgc gta agg 537

Leu Ile Gly Glu Ser Thr Asp Ile Val Thr Ser Glu Leu Arg Val Arg

150 155 160

caa cgg ggt att gct gaa atc act gaa atg ata cac gtc gca agt cta 585

Gln Arg Gly Ile Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala Ser Leu

165 170 175

ctg cac gat gat gtc ttg gat gat gcc gat aca agg cgt ggt gtt ggt 633

Leu His Asp Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg Arg Gly Val Gly

180 185 190

tcc tta aat gtt gta atg ggt aac aag atg tcg gta tta gca gga gac 681

Ser Leu Asn Val Val Met Gly Asn Lys Met Ser Val Leu Ala Gly Asp

195 200 205 210

ttc ttg ctc tcc cgg gct tgt ggg gct ctc gct gct tta aag aac aca 729

Phe Leu Leu Ser Arg Ala Cys Gly Ala Leu Ala Ala Leu Lys Asn Thr

215 220 225

gag gtt gta gca tta ctt gca act gct gta gaa cat ctt gtt acc ggt 777

Glu Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val Glu His Leu Val Thr Gly

230 235 240

gaa acc atg gag ata act agt tca acc gag cag cgt tat agt atg gac 825

Glu Thr Met Glu Ile Thr Ser Ser Thr Glu Gln Arg Tyr Ser Met Asp

245 250 255

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Tyr Tyr Met Gln Lys Thr Tyr Tyr Lys Thr Ala Ser Leu Ile Ser Asn

260 265 270

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Ser Cys Lys Ala Val Ala Val Leu Thr Gly Gln Thr Ala Glu Val Ala

275 280 285 290

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295 300 305

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310 315 320

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Gly Ser Leu Ser Asp Ile Arg His Gly Val Ile Thr Ala Pro Ile Leu

325 330 335

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Phe Ala Met Glu Glu Phe Pro Gln Leu Arg Glu Val Val Asp Gln Val

340 345 350

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355 360 365 370

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Ser Lys Gly Ile Gln Arg Ala Arg Glu Leu Ala Met Glu His Ala Asn

375 380 385

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20 25 30

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85 90 95

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Val Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Leu Ala Phe

290 295 300

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<223>

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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165 170 175

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180 185 190

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260 265 270

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275 280 285

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Ile Asn Asp Gly Ile Leu Leu Arg Asn His Ile His Arg Ile Leu Lys

165 170 175

Lys His Phe Arg Asp Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Phe

180 185 190

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Ile Asp Val Lys Asn Val Leu Val Asp Met Gly Ile Tyr Phe Gln Val

260 265 270

Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys

290 295 300

Ala Leu Glu Arg Cys Ser Glu Glu Gln Thr Lys Ile Leu Tyr Glu Asn

305 310 315 320

Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Ser Asn Val Ala Lys Val Lys Asp Leu Tyr

325 330 335

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340 345 350

Tyr Glu Lys Leu Thr Gly Ala Ile Glu Gly His Gln Ser Lys Ala Ile

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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130 135 140

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180 185 190

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Ala Ser Ala Thr Ser Ser Glu Val Ser Pro Ala Arg Val Val Arg Ala

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gtg gga gag ttg gct aaa gcc atc ggc acc gaa ggg ctc gtg gcg gga 672

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245 250 255

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gag atc gag agg ctg agg aag ttc gcg agg tgt att ggg ttg ttg ttt 864

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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Glu Ala Ser Ala Val Leu Gly Gly Ile Ile Gly Gly Gly Ser Asp Glu

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Glu Ile Glu Arg Leu Arg Lys Phe Ala Arg Cys Ile Gly Leu Leu Phe

275 280 285

Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Gln Glu Leu

290 295 300

Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu Ile Ala Asp Lys Leu Thr Tyr Pro

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130 135 140

atg atg gcg caa atc atg ggc gtg cgg gat aac gcc acg ctg gac cgc 480

Met Met Ala Gln Ile Met Gly Val Arg Asp Asn Ala Thr Leu Asp Arg

145 150 155 160

gcc tgt gac ctt ggg ctg gca ttt cag ttg acc aat att gct cgc gat 528

Ala Cys Asp Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile Ala Arg Asp

165 170 175

att gtg gac gat gcg cat gcg ggc cgc tgt tat ctg ccg gca agc tgg 576

Ile Val Asp Asp Ala His Ala Gly Arg Cys Tyr Leu Pro Ala Ser Trp

180 185 190

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Leu Glu His Glu Gly Leu Asn Lys Glu Asn Tyr Ala Ala Pro Glu Asn

195 200 205

cgt cag gcg ctg agc cgt atc gcc cgt cgt ttg gtg cag gaa gca gaa 672

Arg Gln Ala Leu Ser Arg Ile Ala Arg Arg Leu Val Gln Glu Ala Glu

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Ser Ala Trp Ala Ile Ala Thr Ala Lys Gln Val Tyr Arg Lys Ile Gly

245 250 255

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Val Lys Val Glu Gln Ala Gly Gln Gln Ala Trp Asp Gln Arg Gln Ser

260 265 270

acg acc acg ccc gaa aaa tta acg ctg ctg ctg gcc gcc tct ggt cag 864

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<223>

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275 280 285

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<220>

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<223>

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ctt tct gtt cgt ata cac cga gag tat gat gac ttc att gaa gag ctt 624

Leu Ser Val Arg Ile His Arg Glu Tyr Asp Asp Phe Ile Glu Glu Leu

195 200 205

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Val Ser Lys Phe Pro His Glu Lys Glu Gly Ile Ile Lys Phe Tyr Ser

210 215 220

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Glu Cys Trp Lys Ile Phe Asn Ser Leu Asn Ser Leu Glu Leu Lys Ser

225 230 235 240

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Leu Glu Glu Pro Ile Tyr Leu Phe Gly Gln Phe Phe Lys Lys Pro Leu

245 250 255

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Glu Cys Leu Thr Leu Ala Tyr Tyr Leu Pro Gln Asn Ala Gly Ser Ile

260 265 270

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Ala Arg Lys Tyr Ile Arg Asp Pro Gly Leu Leu Ser Phe Ile Asp Ala

275 280 285

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Glu Cys Phe Ile Val Ser Thr Val Asn Ala Leu Gln Thr Pro Met Ile

290 295 300

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Asn Ala Ser Met Val Leu Cys Asp Arg His Phe Gly Gly Ile Asn Tyr

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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<210>30

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<213>食用番茄

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

Leu Ser Val Arg Ile His Arg Glu Tyr Asp Asp Phe Ile Glu Glu Leu

195 200 205

Val Ser Lys Phe Pro His Glu Lys Glu Gly Ile Ile Lys Phe Tyr Ser

210 215 220

Glu Cys Trp Lys Ile Phe Asn Ser Leu Asn Ser Leu Glu Leu Lys Ser

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Leu Glu Glu Pro Ile Tyr Leu Phe Gly Gln Phe Phe Lys Lys Pro Leu

245 250 255

Glu Cys Leu Thr Leu Ala Tyr Tyr Leu Pro Gln Asn Ala Gly Ser Ile

260 265 270

Ala Arg Lys Tyr Ile Arg Asp Pro Gly Leu Leu Ser Phe Ile Asp Ala

275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

Asp Asp His Gly Ser Gln Ile Leu Tyr Arg Ala Asn Val Thr Ser Ile

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Phe Gly Lys Leu Leu Lys Ala Glu Asn Leu Pro Lys Glu Glu Glu Asn

385 390 395 400

Phe Gln Lys Ala Tyr Val Lys Ala Pro Ser Phe Leu Ser Ile His Met

405 410 415

Gly Val Lys Ala Asp Val Leu Pro Pro Asp Thr Asp Cys His His Phe

420 425 430

Val Leu Glu Asp Asp Trp Thr Asn Leu Glu Lys Pro Tyr Gly Ser Ile

435 440 445

Phe Leu Ser Ile Pro Thr Val Leu Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly

450 455 460

His His Ile Leu His Ile Phe Thr Thr Ser Ser Ile Glu Asp Trp Glu

465 470 475 480

Gly Leu Ser Pro Lys Asp Tyr Glu Ala Lys Lys Glu Val Val Ala Glu

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

Ala Phe Ser Gly Val Met Cys Ala His Arg Val Ala Ala Asp Leu Gly

580 585 590

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<220>

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<223>

<400>31

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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Leu Leu Ala Asp Pro Lys Gly Ala Lys Leu Val Asp Arg Asn Gln Glu

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<212>PRT

<213>万寿菊

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Gln Gly Ile Ser Asp Ile Ile Thr Ile Pro Gly Leu Val Asn Val Asp

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260 265 270

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

Asn Ile Ile Phe Gly Ala Val Val Asp Glu Arg Tyr Asn Gly Glu Ile

340 345 350

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355 360 365

Leu Leu Ala Asp Pro Lys Gly Ala Lys Leu Val Asp Arg Asn Gln Glu

370 375 380

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<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

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20 25 30

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50 55 60

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Asn Arg Val Asn Tyr Thr Val Val Glu Val Leu Asn Gly Asp Cys Arg

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100 105 110

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Leu Cys Ile Ser Lys Pro Arg Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Gly Gly

115 120 125

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130 135 140

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180 185 190

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210 215 220

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Met Leu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Asp Thr Arg Gly Phe Glu Val Ile

225 230 235 240

cgg agt acg aat aga ggg ttt ccg ctt gtg ttg aac aag cct ccg act 768

Arg Ser Thr Asn Arg Gly Phe Pro Leu Val Leu Asn Lys Pro Pro Thr

245 250 255

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Leu Ala Gly Leu Ala Phe Glu Gln Ala Ala Trp Arg Leu Val Glu Gln

260 265 270

gat agc atg aag gct gtg atg gtg gag gaa gaa cct aaa aag agg gga 864

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275 280 285

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Phe Phe Ser Phe Phe Gly Gly

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<213>万寿菊

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Thr Phe Pro Thr Phe Asn Pro Leu His Lys Thr Leu Thr Lys Pro Thr

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Pro Lys Pro Tyr Pro Lys Pro Pro Pro Ile Arg Ser Val Leu Gln Tyr

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Asn Arg Lys Pro Glu Leu Ala Gly Asp Thr Pro Arg Val Val Ala Ile

50 55 60

Asp Ala Asp Val Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Leu Leu Gly Leu Glu

65 70 75 80

Asn Arg Val Asn Tyr Thr Val Val Glu Val Leu Asn Gly Asp Cys Arg

85 90 95

Leu Asp Gln Ala Leu Val Arg Asp Lys Arg Trp Ser Asn Phe Glu Leu

100 105 110

Leu Cys Ile Ser Lys Pro Arg Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Gly Gly

115 120 125

Lys Ala Leu Val Trp Leu Asp Ala Leu Lys Asp Arg Gln Glu Gly Cys

130 135 140

Pro Asp Phe Ile Leu Ile Asp Cys Pro Ala Gly Ile Asp Ala Gly Phe

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Ile Thr Ala Ile Thr Pro Ala Asn Glu Ala Val Leu Val Thr Thr Pro

165 170 175

Asp Ile Thr Ala Leu Arg Asp Ala Asp Arg Val Thr Gly Leu Leu Glu

180 185 190

Cys Asp Gly Ile Arg Asp Ile Lys Met Ile Val Asn Arg Val Arg Thr

195 200 205

Asp Leu Ile Arg Gly Glu Asp Met Met Ser Val Leu Asp Val Gln Glu

210 215 220

Met Leu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Asp Thr Arg Gly Phe Glu Val Ile

225 230 235 240

Arg Ser Thr Asn Arg Gly Phe Pro Leu Val Leu Asn Lys Pro Pro Thr

245 250 255

Leu Ala Gly Leu Ala Phe Glu Gln Ala Ala Trp Arg Leu Val Glu Gln

260 265 270

Asp Ser Met Lys Ala Val Met Val Glu Glu Glu Pro Lys Lys Arg Gly

275 280 285

Phe Phe Ser Phe Phe Gly Gly

290 295

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<211>1662

<212>DNA

<213>雨生红球藻

<220>

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<222>(168)..(1130)

<223>

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1

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5 10 15

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20 25 30 35

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40 45 50

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55 60 65

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85 90 95

cag ctt ttg ggc gga agc agc agc cta ctg cac atc gct gca gtc ttc 512

Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala Ala Val Phe

100 105 110 115

att gta ctt gag ttc ctg tac act ggt cta ttc atc acc aca cat gac 560

Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp

120 125 130

gca atg cat ggc acc ata gct ttg agg cac agg cag ctc aat gat ctc 608

Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg His Arg Gln Leu Asn Asp Leu

135 140 145

ctt ggc aac atc tgc ata tca ctg tac gcc tgg ttt gac tac agc atg 656

Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met

150 155 160

ctg cat cgc aag cac tgg gag cac cac aac cat act ggc gaa gtg ggg 704

Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly

165 170 175

aaa gac cct gac ttc cac aag gga aat ccc ggc ctt gtc ccc tgg ttc 752

Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe

180 185 190 195

gcc agc ttc atg tcc agc tac atg tcc ctg tgg cag ttt gcc cgg ctg 800

Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu

200 205 210

gca tgg tgg gca gtg gtg atg caa atg ctg ggg gcg ccc atg gca aat 848

Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn

215 220 225

ctc cta gtc ttc atg gct gca gcc cca atc ttg tca gca ttc cgc ctc 896

Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu

230 235 240

ttc tac ttc ggc act tac ctg cca cac aag cct gag cca ggc cct gca 944

Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala

245 250 255

gca ggc tct cag gtg atg gcc tgg ttc agg gcc aag aca agt gag gca 992

Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala

260 265 270 275

tct gat gtg atg agt ttc ctg aca tgc tac cac ttt gac ctg cac tgg 1040

Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp

280 285 290

gag cac cac agg tgg ccc ttt gcc ccc tgg tgg cag ctg ccc cac tgc 1088

Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu Pro His Cys

295 300 305

cgc cgc ctg tcc ggg cgt ggc ctg gtg cct gcc ttg gca tga 1130

Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Leu Ala

310 315 320

cctggtccct ccgctggtga cccagcgtct gcacaagagt gtcatgctac agggtgctgc 1190

ggccagtggc agcgcagtgc actctcagcc tgtatggggc taccgctgtg ccactgagca 1250

ctgggcatgc cactgagcac tgggcgtgct actgagcaat gggcgtgcta ctgagcaatg 1310

ggcgtgctac tgacaatggg cgtgctactg gggtctggca gtggctagga tggagtttga 1370

tgcattcagt agcggtggcc aacgtcatgt ggatggtgga agtgctgagg ggtttaggca 1430

gccggcattt gagagggcta agttataaat cgcatgctgc tcatgcgcac atatctgcac 1490

acagccaggg aaatcccttc gagagtgatt atgggacact tgtattggtt tcgtgctatt 1550

gttttattca gcagcagtac ttagtgaggg tgagagcagg gtggtgagag tggagtgagt 1610

gagtatgaac ctggtcagcg aggtgaacag cctgtaatga atgactctgt ct 1662

<210>36

<211>320

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<400>36

Met His Val Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gln Lys Gly Ser Glu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gln Tyr His

20 25 30

Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala

35 40 45

Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Thr

50 55 60

Ile Ile Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile

65 70 75 80

Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu

85 90 95

Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala

100 105 110

Ala Val Phe Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr

115 120 125

Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg His Arg Gln Leu

130 135 140

Asn Asp Leu Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp

145 150 155 160

Tyr Ser Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly

165 170 175

Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val

180 185 190

Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe

195 200 205

Ala Arg Leu Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro

210 215 220

Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala

225 230 235 240

Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro

245 250 255

Gly Pro Ala Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr

260 265 270

Ser Glu Ala Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp

275 280 285

Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu

290 295 300

Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Leu Ala

305 310 315 320

<210>37

<211>729

<212>DNA

<213>橙黄农杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(729)

<223>

<400>37

atg agc gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc acc agc ctg 48

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

atc gtc tcg ggc ggc atc atc gcc gct tgg ctg gcc ctg cat gtg cat 96

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc atc ctg gcg atc gca 144

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala

35 40 45

aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg 192

Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

cat gac gcg atg cac ggg tcg gtg gtg ccg ggg cgt ccg cgc gcc aat 240

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg 288

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc 336

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc 384

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctt ggg gat cgc tgg atg tac 480

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

gtg gtc ttc tgg ccg ctg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528

Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe

165 170 175

gtg ttc ggc acc tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg 576

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190

gac cgc cac aat gcg cgg tcg tcg cgg atc agc gac ccc gtg tcg ctg 624

Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

ctg acc tgc ttt cac ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac 672

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac 720

Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

acc gca tga 729

Thr Ala

<210>38

<211>242

<212>PRT

<213>橙黄农杆菌

<400>38

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala

35 40 45

Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe

165 170 175

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190

Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

Thr Ala

<210>39

<211>1631

<212>DNA

<213>产碱菌属

<220>

<221>CDS

<222>(99)..(827)

<223>

<400>39

ctgcaggccg ggcccggtgg ccaatggtcg caaccggcag gactggaaca ggacggcggg 60

ccggtctagg ctgtcgccct acgcagcagg agtttcgg atg tcc gga cgg aag cct 116

Met Ser Gly Arg Lys Pro

1 5

ggc aca act ggc gac acg atc gtc aat ctc ggt ctg acc gcc gcg atc 164

Gly Thr Thr Gly Asp Thr Ile Val Asn Leu Gly Leu Thr Ala Ala Ile

10 15 20

ctg ctg tgc tgg ctg gtc ctg cac gcc ttt acg cta tgg ttg cta gat 212

Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe Thr Leu Trp Leu Leu Asp

25 30 35

gcg gcc gcg cat ccg ctg ctt gcc gtg ctg tgc ctg gct ggg ctg acc 260

Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Ala Gly Leu Thr

40 45 50

tgg ctg tcg gtc ggg ctg ttc atc atc gcg cat gac gca atg cac ggg 308

Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala His Asp Ala Met His Gly

55 60 65 70

tcc gtg gtg ccg ggg cgg ccg cgc gcc aat gcg gcg atc ggg caa ctg 356

Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn Ala Ala Ile Gly Gln Leu

75 80 85

gcg ctg tgg ctc tat gcg ggg ttc tcg tgg ccc aag ctg atc gcc aag 404

Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp Pro Lys Leu Ile Ala Lys

90 95 100

cac atg acg cat cac cgg cac gcc ggc acc gac aac gat ccc gat ttc 452

His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr Asp Asn Asp Pro Asp Phe

105 110 115

ggt cac gga ggg ccc gtg cgc tgg tac ggc agc ttc gtc tcc acc tat 500

Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly Ser Phe Val Ser Thr Tyr

120 125 130

ttc ggc tgg cga gag gga ctg ctg cta ccg gtg atc gtc acc acc tat 548

Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro Val Ile Val Thr Thr Tyr

135 140 145 150

gcg ctg atc ctg ggc gat cgc tgg atg tat gtc atc ttc tgg ccg gtc 596

Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr Val Ile Phe Trp Pro Val

155 160 165

ccg gcc gtt ctg gcg tcg atc cag att ttc gtc ttc gga act tgg ctg 644

Pro Ala Val Leu Ala Ser Ile Gln Ile Phe Val Phe Gly Thr Trp Leu

170 175 180

ccc cac cgc ccg gga cat gac gat ttt ccc gac cgg cac aac gcg agg 692

Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro Asp Arg His Asn Ala Arg

185 190 195

tcg acc ggc atc ggc gac ccg ttg tca cta ctg acc tgc ttc cat ttc 740

Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe

200 205 210

ggc ggc tat cac cac gaa cat cac ctg cat ccg cat gtg ccg tgg tgg 788

Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His Pro His Val Pro Trp Trp

215 220 225 230

cgc ctg cct cgt aca cgc aag acc gga ggc cgc gca tga cgcaattcct 837

Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly Arg Ala

235 240

cattgtcgtg gcgacagtcc tcgtgatgga gctgaccgcc tattccgtcc accgctggat 897

tatgcacggc cccctaggct ggggctggca caagtcccat cacgaagagc acgaccacgc 957

gttggagaag aacgacctct acggcgtcgt cttcgcggtg ctggcgacga tcctcttcac 1017

cgtgggcgcc tattggtggc cggtgctgtg gtggatcgcc ctgggcatga cggtctatgg 1077

gttgatctat ttcatcctgc acgacgggct tgtgcatcaa cgctggccgt ttcggtatat 1137

tccgcggcgg ggctatttcc gcaggctcta ccaagctcat cgcctgcacc acgcggtcga 1197

ggggcgggac cactgcgtca gcttcggctt catctatgcc ccacccgtgg acaagctgaa 1257

gcaggatctg aagcggtcgg gtgtcctgcg cccccaggac gagcgtccgt cgtgatctct 1317

gatcccggcg tggccgcatg aaatccgacg tgctgctggc aggggccggc cttgccaacg 1377

gactgatcgc gctggcgatc cgcaaggcgc ggcccgacct tcgcgtgctg ctgctggacc 1437

gtgcggcggg cgcctcggac gggcatactt ggtcctgcca cgacaccgat ttggcgccgc 1497

actggctgga ccgcctgaag ccgatcaggc gtggcgactg gcccgatcag gaggtgcggt 1557

tcccagacca ttcgcgaagg ctccgggccg gatatggctc gatcgacggg cgggggctga 1617

tgcgtgcggt gacc 1631

<210>40

<211>242

<212>PRT

<213>产碱菌属

<400>40

Met Ser Gly Arg Lys Pro Gly Thr Thr Gly Asp Thr Ile Val Asn Leu

1 5 10 15

Gly Leu Thr Ala Ala Ile Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe

20 25 30

Thr Leu Trp Leu Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu

35 40 45

Cys Leu Ala Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

Ala Ala Ile Gly Gln Leu Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Set Trp

85 90 95

Pro Lys Leu Ile Ala Lys His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

Asp Asn Asp Pro Asp Phe Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly

115 120 125

Ser Phe Val Ser Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

Val Ile Val Thr Thr Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

Val Ile Phe Trp Pro Val Pro Ala Val Leu Ala Ser Ile Gln Ile Phe

165 170 175

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro

180 185 190

Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu

195 200 205

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

Pro His Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly

225 230 235 240

Arg Ala

<210>41

<211>729

<212>DNA

<213>Paracoccus marcusii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(729)

<223>

<400>41

atg agc gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc aca agc ctg 48

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

atc gtc tcg ggc ggc atc atc gcc gca tgg ctg gcc ctg cat gtg cat 96

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

gcg ctg tgg ttt ctg gac gcg gcg gcc cat ccc atc ctg gcg gtc gcg 144

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala

35 40 45

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Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

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His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg 288

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc 336

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

gac gac gac cca gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc 384

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctg ggg gat cgc tgg atg tac 480

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

gtg gtc ttc tgg ccg ttg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528

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165 170 175

gtg ttc ggc act tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg 576

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190

gac cgc cat aat gcg cgg tcg tcg cgg atc agc gac cct gtg tcg ctg 624

Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

ctg acc tgc ttt cat ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac 672

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac 720

Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

acc gca tga 729

Thr Ala

<210>42

<211>242

<212>PRT

<213>Paracoccus marcusii

<400>42

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala

35 40 45

Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe

165 170 175

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190

Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

Thr Ala

<210>43

<211>1629

<212>DNA

<213>Synechococystis

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1629)

<223>

<400>43

atg atc acc acc gat gtt gtc att att ggg gcg ggg cac aat ggc tta 48

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1 5 10 15

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20 25 30

gaa aag cgg gaa gta cca ggg ggg gcg gcc acc aca gaa gct ctc atg 144

Glu Lys Arg Glu Val Pro Gly Gly Ala Ala Thr Thr Glu Ala Leu Met

35 40 45

ccg gag cta tcc ccc cag ttt cgc ttt aac cgc tgt gcc att gac cac 192

Pro Glu Leu Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asn Arg Cys Ala Ile Asp His

50 55 60

gaa ttt atc ttt ctg ggg ccg gtg ttg cag gag cta aat tta gcc cag 240

Glu Phe Ile Phe Leu Gly Pro Val Leu Gln Glu Leu Asn Leu Ala Gln

65 70 75 80

tat ggt ttg gaa tat tta ttt tgt gac ccc agt gtt ttt tgt ccg ggg 288

Tyr Gly Leu Glu Tyr Leu Phe Cys Asp Pro Ser Val Phe Cys Pro Gly

85 90 95

ctg gat ggc caa gct ttt atg agc tac cgt tcc cta gaa aaa acc tgt 336

Leu Asp Gly Gln Ala Phe Met Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Thr Cys

100 105 110

gcc cac att gcc acc tat agc ccc cga gat gcg gaa aaa tat cgg caa 384

Ala His Ile Ala Thr Tyr Ser Pro Arg Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Gln

115 120 125

ttt gtc aat tat tgg acg gat ttg ctc aac gct gtc cag cct gct ttt 432

Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Leu Leu Asn Ala Val Gln Pro Ala Phe

130 135 140

aat gct ccg ccc cag gct tta cta gat tta gcc ctg aac tat ggt tgg 480

Asn Ala Pro Pro Gln Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Trp

145 150 155 160

gaa aac tta aaa tcc gtg ctg gcg atc gcc ggg tcg aaa acc aag gcg 528

Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ala Ile Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ala

165 170 175

ttg gat ttt atc cgc act atg atc ggc tcc ccg gaa gat gtg ctc aat 576

Leu Asp Phe Ile Arg Thr Met Ile Gly Ser Pro Glu Asp Val Leu Asn

180 185 190

gaa tgg ttc gac agc gaa cgg gtt aaa gct cct tta gct aga cta tgt 624

Glu Trp Phe Asp Ser Glu Arg Val Lys Ala Pro Leu Ala Arg Leu Cys

195 200 205

tcg gaa att ggc gct ccc cca tcc caa aag ggt agt agc tcc ggc atg 672

Ser Glu Ile Gly Ala Pro Pro Ser Gln Lys Gly Ser Ser Ser Gly Met

210 215 220

atg atg gtg gcc atg cgg cat ttg gag gga att gcc aga cca aaa gga 720

Met Met Val Ala Met Arg His Leu Glu Gly Ile Ala Arg Pro Lys Gly

225 230 235 240

ggc act gga gcc ctc aca gaa gcc ttg gtg aag tta gtg caa gcc caa 768

Gly Thr Gly Ala Leu Thr Glu Ala Leu Val LVs Leu Val Gln Ala Gln

245 250 255

ggg gga aaa atc ctc act gac caa acc gtc aaa cgg gta ttg gtg gaa 816

Gly Gly Lys Ile Leu Thr Asp Gln Thr Val Lys Arg Val Leu Val Glu

260 265 270

aac aac cag gcg atc ggg gtg gag gta gct aac gga gaa cag tac cgg 864

Asn Asn Gln Ala Ile Gly Val Glu Val Ala Asn Gly Glu Gln Tyr Arg

275 280 285

gcc aaa aaa ggc gtg att tct aac atc gat gcc cgc cgt tta ttt ttg 912

Ala Lys Lys Gly Val Ile Ser Asn Ile Asp Ala Arg Arg Leu Phe Leu

290 295 300

caa ttg gtg gaa ccg ggg gcc cta gcc aag gtg aat caa aac cta ggg 960

Gln Leu Val Glu Pro Gly Ala Leu Ala Lys Val Asn Gln Asn Leu Gly

305 310 315 320

gaa cga ctg gaa cgg cgc act gtg aac aat aac gaa gcc att tta aaa 1008

Glu Arg Leu Glu Arg Arg Thr Val Asn Asn Asn Glu Ala Ile Leu Lys

325 330 335

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Ile Asp Cys Ala Leu Ser Gly Leu Pro His Phe Thr Ala Met Ala Gly

340 345 350

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Pro Glu Asp Leu Thr Gly Thr Ile Leu Ile Ala Asp Ser Val Arg His

355 360 365

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Val Glu Glu Ala His Ala Leu Ile Ala Leu Gly Gln Ile Pro Asp Ala

370 375 380

aat ccg tct tta tat ttg gat att ccc act gta ttg gac ccc acc atg 1200

Asn Pro Ser Leu Tyr Leu Asp Ile Pro Thr Val Leu Asp Pro Thr Met

385 390 395 400

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Ala Pro Pro Gly Gln His Thr Leu Trp Ile Glu Phe Phe Ala Pro Tyr

405 410 415

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Arg Ile Ala Gly Leu Glu Gly Thr Gly Leu Met Gly Thr Gly Trp Thr

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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Gly Ala Gly Thr His Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Met Pro Gly Arg

515 520 525

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Asn Cys Ala Arg Val Phe Leu Lys Gln Gln Arg Arg Phe Trp

530 535 540

<210>44

<211>542

<212>PRT

<213>Synechococystis

<400>44

Met Ile Thr Thr Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly His Asn Gly Leu

1 5 10 15

Val Cys Ala Ala Tyr Leu Leu Gln Arg Gly Leu Gly Val Thr Leu Leu

20 25 30

Glu Lys Arg Glu Val Pro Gly Gly Ala Ala Thr Thr Glu Ala Leu Met

35 40 45

Pro Glu Leu Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asn Arg Cys Ala Ile Asp His

50 55 60

Glu Phe Ile Phe Leu Gly Pro Val Leu Gln Glu Leu Asn Leu Ala Gln

65 70 75 80

Tyr Gly Leu Glu Tyr Leu Phe Cys Asp Pro Ser Val Phe Cys Pro Gly

85 90 95

Leu Asp Gly Gln Ala Phe Met Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Thr Cys

100 105 110

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115 120 125

Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Leu Leu Asn Ala Val Gln Pro Ala Phe

130 135 140

Asn Ala Pro Pro Gln Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Trp

145 150 155 160

Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ala Ile Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ala

165 170 175

Lau Asp Phe Ile Arg Thr Met Ile Gly Ser Pro Glu Asp Val Leu Asn

180 185 190

Glu Trp Phe Asp Ser Glu Arg Val Lys Ala Pro Leu Ala Arg Leu Cys

195 200 205

Ser Glu Ile Gly Ala Pro Pro Ser Gln Lys Gly Ser Ser Ser Gly Met

210 215 220

Met Met Val Ala Met Arg His Leu Glu Gly Ile Ala Arg Pro Lys Gly

225 230 235 240

Gly Thr Gly Ala Leu Thr Glu Ala Leu Val Lys Leu Val Gln Ala Gln

245 250 255

Gly Gly Lys Ile Leu Thr Asp Gln Thr Val Lys Arg Val Leu Val Glu

260 265 270

Asn Asn Gln Ala Ile Gly Val Glu Val Ala Asn Gly Glu Gln Tyr Arg

275 280 285

Ala Lys Lys Gly Val Ile Ser Asn Ile Asp Ala Arg Arg Leu Phe Leu

290 295 300

Gln Leu Val Glu Pro Gly Ala Leu Ala Lys Val Asn Gln Asn Leu Gly

305 310 315 320

Glu Arg Leu Glu Arg Arg Thr Val Asn Asn Asn Glu Ala Ile Leu Lys

325 330 335

Ile Asp Cys Ala Leu Ser Gly Leu Pro His Phe Thr Ala Met Ala Gly

340 345 350

Pro Glu Asp Leu Thr Gly Thr Ile Leu Ile Ala Asp Ser Val Arg His

355 360 365

Val Glu Glu Ala His Ala Leu Ile Ala Leu Gly Gln Ile Pro Asp Ala

370 375 380

Asn Pro Ser Leu Tyr Leu Asp Ile Pro Thr Val Leu Asp Pro Thr Met

385 390 395 400

Ala Pro Pro Gly Gln His Thr Leu Trp Ile Glu Phe Phe Ala Pro Tyr

405 410 415

Arg Ile Ala Gly Leu Glu Gly Thr Gly Leu Met Gly Thr Gly Trp Thr

420 425 430

Asp Glu Leu Lys Glu Lys Val Ala Asp Arg Val Ile Asp Lys Leu Thr

435 440 445

Asp Tyr Ala Pro Asn Leu Lys Ser Leu Ile Ile Gly Arg Arg Val Glu

450 455 460

Ser Pro Ala Glu Leu Ala Gln Arg Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Asn Val

465 470 475 480

Tyr His Leu Asp Met Ser Leu Asp Gln Met Met Phe Leu Arg Pro Leu

485 490 495

Pro Glu Ile Ala Asn Tyr Gln Thr Pro Ile Lys Asn Leu Tyr Leu Thr

500 505 510

Gly Ala Gly Thr His Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Met Pro Gly Arg

515 520 525

Asn Cys Ala Arg Val Phe Leu Lys Gln Gln Arg Arg Phe Trp

530 535 540

<210>45

<211>776

<212>DNA

<213>慢生根瘤菌属

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(774)

<223>

<400>45

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala Ile Ile Ala Ala Val

145 150 155 160

tcg ctg gtt tat cag ctc gtc ttc gcc gtt ccc ttg cag aac atc ctg 528

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165 170 175

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Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr

180 185 190

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195 200 205

cgc cac aac gcg cgg acg agc gaa ttt ccc gcg tgg ctg tcg ctg ctg 672

Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu

210 215 220

acc tgc ttc cac ttc ggc ttt cat cac gag cat cat ctg cat ccc gat 720

Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp

225 230 235 240

gcg ccg tgg tgg cgg ctg ccg gag atc aag cgg cgg gcc ctg gaa agg 768

Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu Ile Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg

245 250 255

cgt gac ta 776

Arg Asp

<210>46

<211>258

<212>PRT

<213>慢生根瘤菌属

<400>46

Met His Ala Ala Thr Ala Lys Ala Thr Glu Phe Gly Ala Ser Arg Arg

1 5 10 15

Asp Asp Ala Arg Gln Arg Arg Val Gly Leu Thr Leu Ala Ala Val Ile

20 25 30

Ile Ala Ala Trp Leu Val Leu His Val Gly Leu Met Phe Phe Trp Pro

35 40 45

Leu Thr Leu His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Gln

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ser Leu Val Pro Phe Lys Pro Gln Val Asn Arg Arg Ile Gly Gln

85 90 95

Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val

100 105 110

Glu His His Lys His His Arg His Pro Gly Thr Ala Glu Asp Pro Asp

115 120 125

Phe Asp Glu Val Pro Pro His Gly Phe Trp His Trp Phe Ala Ser Phe

130 135 140

Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala Ile Ile Ala Ala Val

145 150 155 160

Ser Leu Val Tyr Gln Leu Val Phe Ala Val Pro Leu Gln Asn Ile Leu

165 170 175

Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr

180 185 190

Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Ala Thr Gln Pro Phe Ala Asp

195 200 205

Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu

210 215 220

Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp

225 230 235 240

Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu Ile Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg

245 250 255

Arg Asp

<210>47

<211>777

<212>DNA

<213>念珠藻属

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(777)

<223>

<400>47

atg gtt cag tgt caa cca tca tct ctg cat tca gaa aaa ctg gtg tta 48

Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu

1 5 10 15

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Leu Ser Ser Thr Ile Arg Asp Asp Lys Asn Ile Asn Lys Gly Ile Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg Ile Asn Asn

85 90 95

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Phe Ile Gly Lys Leu Thr Leu Ile Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys

100 105 110

gat tta ttg aaa aaa cat tgg tta cac cac gga cat cct ggt act gat 384

Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp

115 120 125

tta gac cct gat tat tac aat ggt cat ccc caa aac ttc ttt ctt tgg 432

Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp

130 135 140

tat cta cat ttt atg aag tct tat tgg cga tgg acg caa att ttc gga 480

Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln Ile Phe Gly

145 150 155 160

tta gtg atg att ttt cat gga ctt aaa aat ctg gtg cat ata cca gaa 528

Leu Val Met Ile Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His Ile Pro Glu

165 170 175

aat aat tta att ata ttt tgg atg ata cct tct att tta agt tca gta 576

Asn Asn Leu Ile Ile Phe Trp Met Ile Pro Ser Ile Leu Ser Ser Val

180 185 190

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Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly

195 200 205

ggt tat act aac ccc cat tgt gcg cgc agt atc cca tta cct ctt ttt 672

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210 215 220

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225 230 235 240

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Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys Ile

245 250 255

tct tta taa 777

Ser Leu

<210>48

<211>258

<212>PRT

<213>念珠藻属

<400>48

Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Thr Ile Arg Asp Asp Lys Asn Ile Asn Lys Gly Ile Phe

20 25 30

Ile Ala Cys Phe Ile Leu Phe Leu Trp Ala Ile Ser Leu Ile Leu Leu

35 40 45

Leu Ser Ile Asp Thr Ser Ile Ile His Lys Ser Leu Leu Gly Ile Ala

50 55 60

Met Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His

65 70 75 80

Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Phe Ile Gly Lys Leu Thr Leu Ile Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys

100 105 110

Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp

115 120 125

Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp

130 135 140

Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln Ile Phe Gly

145 150 155 160

Leu Val Met Ile Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His Ile Pro Glu

165 170 175

Asn Asn Leu Ile Ile Phe Trp Met Ile Pro Ser Ile Leu Ser Ser Val

180 185 190

Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly

195 200 205

Gly Tyr Thr Asn Pro His Cys Ala Arg Ser Ile Pro Leu Pro Leu Phe

210 215 220

Trp Ser Phe Val Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Lys Glu His His

225 230 235 240

Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys Ile

245 250 255

Ser Leu

<210>49

<211>831

<212>DNA

<213>雨生红球藻

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(831)

<223>

<400>49

atg cca tcc gag tcg tca gac gca gct cgt cct gtg ttg aag cac gcc 48

Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Val Leu Lys His Ala

1 5 10 15

tat aaa cct cca gca tct gac gcc aag ggc atc act atg gcg ctg acc 96

Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Thr

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ala Val Phe Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr

85 90 95

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Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg Asn Arg Gln Leu

100 105 110

aat gat ctc ctt ggc aac atc tgc ata tca ctg tac gcc tgg ttt gac 384

Asn Asp Leu Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp

115 120 125

tac agc atg cac tgg gag cac cac aac cat act ggc gaa gtg ggg aaa 432

Tyr Ser Met His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys

130 135 140

gac cct gac ttc cac aaa gga aat cct ggc ctt gtc ccc tgg ttc gcc 480

Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe Ala

145 150 155 160

agc ttc atg tcc agc tac atg tcc ctg tgg cag ttt gcc cgg ctg gca 528

Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala

165 170 175

tgg tgg gca gtg gtg atg caa acg ttg ggg gcc ccc atg gcg aat ctc 576

Trp Trp Ala Val Val Met Gln Thr Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu

180 185 190

cta gtc ttc atg gct gca gcc cca atc ttg tca gca ttc cgc ctc ttc 624

Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe

195 200 205

tac ttc ggc act tac ctg cca cac aag cct gag cca ggc cct gca gca 672

Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala Ala

210 215 220

ggc tct cag gtc atg tct tgg ttc agg gcc aag aca agt gag gca tct 720

Gly Ser Gln Val Met Ser Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala Ser

225 230 235 240

gat gtg atg agc ttc ctg aca tgc tac cac ttt gac ctg ttt gcc ccc 768

Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu Phe Ala Pro

245 250 255

tgg tgg cag ctg ccc cac tgc cgc cgc ctg tct ggg cgt ggc ctg gtg 816

Trp Trp Gln Leu Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val

260 265 270

cct gcc ttg gca tga 831

Pro Ala Leu Ala

275

<210>50

<211>276

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<400>50

Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Val Leu Lys His Ala

1 5 10 15

Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Thr

20 25 30

Ile Ile Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile

35 40 45

Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu

50 55 60

Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala

65 70 75 80

Ala Val Phe Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr

85 90 95

Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg Asn Arg Gln Leu

100 105 110

Asn Asp Leu Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp

115 120 125

Tyr Ser Met His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys

130 135 140

Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe Ala

145 150 155 160

Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala

165 170 175

Trp Trp Ala Val Val Met Gln Thr Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu

180 185 190

Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe

195 200 205

Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala Ala

210 215 220

Gly Ser Gln Val Met Ser Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala Ser

225 230 235 240

Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu Phe Ala Pro

245 250 255

Trp Trp Gln Leu Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val

260 265 270

Pro Ala Leu Ala

275

<210>51

<211>729

<212>DNA

<213>副球菌属MBIC1143

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(729)

<223>

<400>51

atg agc gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc acc agc ctg 48

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

atc gtc tcg ggc ggc atc atc gcc gct tgg ctg gcc ctg cat gtg cat 96

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc atc ctg gcg atc gca 144

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala

35 40 45

aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg 192

Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

cat gac gcg atg cac ggg tcg gtg gtg ccg ggg cgt ccg cgc gcc aat 240

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg 288

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc 336

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc 384

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctt ggg gat cgc tgg atg tac 480

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

gtg gtc ttc tgg ccg ctg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528

Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe

165 170 175

gtg ttc ggc acc tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg 576

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190

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Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

ctg acc tgc ttt cac ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac 672

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210 215 220

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Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

acc gca tga 729

Thr Ala

<210>52

<211>242

<212>PRT

<213>副球菌属MBIC1143

<400>52

Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His

20 25 30

Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala

35 40 45

Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala

50 55 60

His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn

65 70 75 80

Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp

85 90 95

Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr

100 105 110

Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala

115 120 125

Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro

130 135 140

Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr

145 150 155 160

Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe

165 170 175

Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro

180 185 190Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu

195 200 205

Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His

210 215 220

Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp

225 230 235 240

Thr Ala

<210>53

<211>735

<212>DNA

<213>橙黄短波单胞菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(735)

<223>

<400>53

atg acc gcc gcc gtc gcc gag cca cgc acc gtc ccg cgc cag acc tgg 48

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1 5 10 15

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Ile Gly Leu Thr Leu Ala Gly Met Ile Val Ala Gly Trp Ala Val Leu

20 25 30

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35 40 45

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Ile Ala Pro Ala Ile Val Ala Val Gln Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Arg Glu Met Ala Val Leu Thr Ala Leu Val Leu Ile Ala Leu Phe Gly

145 150 155 160

ctg ggg gcg cgg ccg gcc aat ctc ctg acc ttc tgg gcc gcg ccg gcc 528

Leu Gly Ala Arg Pro Ala Asn Leu Leu Thr Phe Trp Ala Ala Pro Ala

165 170 175

ctg ctt tca gcg ctt cag ctc ttc acc ttc ggc acc tgg ctg ccg cac 576

Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr Phe Gly Thr Trp Leu Pro His

180 185 190

cgc cac acc gac cag ccg ttc gcc gac gcg cac cac gcc cgc agc agc 624

Arg His Thr Asp Gln Pro Phe Ala Asp Ala His His Ala Arg Ser Ser

195 200 205

ggc tac ggc ccc gtg ctt tcc ctg ctc acc tgt ttc cac ttc ggc cgc 672

Gly Tyr Gly Pro Val Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Arg

210 215 220

cac cac gaa cac cat ctg agc ccc tgg cgg ccc tgg tgg cgt ctg tgg 720

His His Glu His His Leu Ser Pro Trp Arg Pro Trp Trp Arg Leu Trp

225 230 235 240

cgc ggc gag tct tga 735

Arg Gly Glu Ser

<210>54

<211>244

<212>PRT

<213>橙黄短波单胞菌

<400>54

Met Thr Ala Ala Val Ala Glu Pro Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Trp

1 5 10 15

Ile Gly Leu Thr Leu Ala Gly Met Ile Val Ala Gly Trp Ala Val Leu

20 25 30

His Val Tyr Gly Val Tyr Phe His Arg Trp Gly Pro Leu Thr Leu Val

35 40 45

Ile Ala Pro Ala Ile Val Ala Val Gln Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu

50 55 60

Phe Ile Val Ala His Asp Ala Met Tyr Gly Ser Leu Ala Pro Gly Arg

65 70 75 80

Pro Arg Leu Asn Ala Ala Val Gly Arg Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Ala

85 90 95

Gly Phe Arg Phe Asp Arg Leu Lys Thr Ala His His Ala His His Ala

100 105 110

Ala Pro Gly Thr Ala Asp Asp Pro Asp Phe His Ala Pro Ala Pro Arg

115 120 125

Ala Phe Leu Pro Trp Phe Leu Asn Phe Phe Arg Thr Tyr Phe Gly Trp

130 135 140

Arg Glu Met Ala Val Leu Thr Ala Leu Val Leu Ile Ala Leu Phe Gly

145 150 155 160

Leu Gly Ala Arg Pro Ala Asn Leu Leu Thr Phe Trp Ala Ala Pro Ala

165 170 175

Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr Phe Gly Thr Trp Leu Pro His

180 185 190

Arg His Thr Asp Gln Pro Phe Ala Asp Ala His His Ala Arg Ser Ser

195 200 205

Gly Tyr Gly Pro Val Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Arg

210 215 220

His His Glu His His Leu Ser Pro Trp Arg Pro Trp Trp Arg Leu Trp

225 230 235 240

Arg Gly Glu Ser

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<211>690

<212>DNA

<213>泡沫节球藻NSOR10

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(690)

<223>

<400>55

atg gcg atc gcc att att agt ata tgg gct atc agc cta ggt ttg tta 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

aaa ctt tta aaa aag cat tgg cta cat cac cat aat cca gcc agt gaa 288

Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Glu

85 90 95

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100 105 110

tat tta tat ttt atg aag cgt tac tgg agt tgg tta caa att atc aca 384

Tyr Leu Tyr Phe Met Lys Arg Tyr Trp Ser Trp Leu Gln Ile Ile Thr

115 120 125

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Leu Met Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Tyr Ile Trp His Phe Pro Glu

130 135 140

gat aat atg act tat ttt tgg gta gtt ccc tca att tta agt tct tta 480

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Ser Lys Ser Asn Leu

225

<210>56

<211>229

<212>PRT

<213>泡沫节球藻NSOR10

<400>56

Met Ala Ile Ala Ile Ile Ser Ile Trp Ala Ile Ser Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Tyr Ile Asp Ile Ser Gln Phe Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Leu

20 25 30

Ile Phe Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His

35 40 45

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50 55 60

Phe Ile Gly Ser Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln

65 70 75 80

Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Glu

85 90 95

Thr Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys Gln Lys Asn Phe Phe Ala Trp

100 105 110

Tyr Leu Tyr Phe Met Lys Arg Tyr Trp Ser Trp Leu Gln Ile Ile Thr

115 120 125

Leu Met Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Tyr Ile Trp His Phe Pro Glu

130 135 140

Asp Asn Met Thr Tyr Phe Trp Val Val Pro Ser Ile Leu Ser Ser Leu

145 150 155 160

Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Val Glu

165 170 175

Gly Tyr Lys Glu Pro His Arg Ser Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Ser Lys Ser Asn Leu

225

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<212>DNA

<213>点形念珠藻ATCC29133

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(789)

<223>

<400>57

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys Ile Asn Asn Phe Ile Gly Ser

85 90 95

cta gct gta gcg ctt tac gct gtg ttt cca tat caa cag atg tta aag 336

Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys

100 105 110

aat cat tgc tta cat cat cgt cat cct gct agc gaa gtt gac cca gat 384

Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp

115 120 125

ttt cat gat ggt aag aga aca aac gct att ttc tgg tat ctc cat ttc 432

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130 135 140

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145 150 155 160

ttt aat tta gct aaa tac gtt ttg cac atc cat caa ata aat ctc atc 528

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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245 250 255

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Asn Ser Val Thr Asn Ser

260

<210>58

<211>262

<212>PRT

<213>点形念珠藻ATCC29133

<400>58

Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala Ile Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Val

20 25 30

Ile Ile Ser Leu Trp Val Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ile Asn

35 40 45

Tyr Ala Lys Val Pro Ile Trp Leu Ile Pro Ile Ala Ile Val Trp Gln

50 55 60

Met Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His Asp Ala Met His

65 70 75 80

Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys Ile Asn Asn Phe Ile Gly Ser

85 90 95

Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys

100 105 110

Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp

115 120 125

Phe His Asp Gly Lys Arg Thr Asn Ala Ile Phe Trp Tyr Leu His Phe

130 135 140

Met Ile Glu Tyr Ser Ser Trp Gln Gln Leu Ile Val Leu Thr Ile Leu

145 150 155 160

Phe Asn Leu Ala Lys Tyr Val Leu His Ile His Gln Ile Asn Leu Ile

165 170 175

Leu Phe Trp Ser Ile Pro Pro Ile Leu Ser Ser Ile Gln Leu Phe Tyr

180 185 190

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Arg Glu Pro Lys Lys Gly Tyr Val Tyr

195 200 205

Pro His Cys Ser Gln Thr Ile Lys Leu Pro Thr Phe Leu Ser Phe Ile

210 215 220

Ala Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His

225 230 235 240

Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Ser Val Tyr Lys Gln Arg Val Phe Asn

245 250 255

Asn Ser Val Thr Asn Ser

260

<210>59

<211>762

<212>DNA

<213>点形念珠藻ATCC29133

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(762)

<223>

<400>59

gtg atc cag tta gaa caa cca ctc agt cat caa gca aaa ctg act cca 48

Val Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro

1 5 10 15

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20 25 30

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Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His Leu Ile Gly Thr

85 90 95

ttg acc cta tcc ctt tat ggt ctt tta cca tat caa aaa cta ttg aaa 336

Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys

100 105 110

aaa cat tgg tta cac cac cac aat cca gca agc tca ata gac ccg gat 384

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115 120 125

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Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe

130 135 140

atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att gcg ttg act att att 480

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145 150 155 160

tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca agt gat aat cta act 528

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

165 170 175

tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca tta caa tta ttc tat 576

Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr

180 185 190

ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata ggg ggt tat gtt cag 624

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln

195 200 205

cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att tgg tgg tca ttt atc 672

Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile

210 215 220

acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat cac gaa tat cct cat 720

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225 230 235 240

att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa gca aaa tag 762

Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys

245 250

<210>60

<211>253

<212>PRT

<213>点形念珠藻ATCC29133

<400>60

Val Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe Ile Ala Ile Val

20 25 30

Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp

35 40 45

Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val Ile Leu Trp Gln

50 55 60

Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His Asp Ala Met His

65 70 75 80

Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His Leu Ile Gly Thr

85 90 95

Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys

100 105 110

Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser Ile Asp Pro Asp

115 120 125

Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe

130 135 140

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

165 170 175

Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr

180 185 190

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln

195 200 205

Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile

210 215 220

Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His

225 230 235 240

Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys

245 250

<210>61

<211>1536

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌R1

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1536)

<223>

<400>61

atg ccg gat tac gac ctg atc gtc atg ggc gcg ggc cac aac gcg ctg 48

Met Pro Asp Tyr Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Gly His Asn Ala Leu

1 5 10 15

gtg act gct gcc tac gcc gcc cgg gcg ggc ctg aaa gtc ggc gtg ttc 96

Val Thr Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Ala Gly Leu Lys Val Gly Val Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

atg acg ccc atc gtg cgc gaa ctc gaa ctc acg cgg cac ggg ctg cat 240

Met Thr Pro Ile Val Arg Glu Leu Glu Leu Thr Arg His Gly Leu His

65 70 75 80

tac ctc gaa gtg gac cct atg ttt cac gct tcc gac ggt gaa acg ccc 288

Tyr Leu Glu Val Asp Pro Met Phe His Ala Ser Asp Gly Glu Thr Pro

85 90 95

tgg ttc att cac cgc gac gcc ggg cgg acc atc cgc gaa ctg gac gaa 336

Trp Phe Ile His Arg Asp Ala Gly Arg Thr Ile Arg Glu Leu Asp Glu

100 105 110

aag ttt ccc ggg cag ggc gac gcc tac ggg cgc ttt ctc gac gat tgg 384

Lys Phe Pro Gly Gln Gly Asp Ala Tyr Gly Arg Phe Leu Asp Asp Trp

115 120 125

aca ccc ttc gcg cgc gcc gtg gcc gac ctg ttc aac tcg gcg ccg ggg 432

Thr Pro Phe Ala Arg Ala Val Ala Asp Leu Phe Asn Ser Ala Pro Gly

130 135 140

ccg ctc gac ctg ggc aaa atg gtg atg cgc agc ggc cag ggc aag gac 480

Pro Leu Asp Leu Gly Lys Met Val Met Arg Ser Gly Gln Gly Lys Asp

145 150 155 160

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Trp Asn Glu Gln Leu Pro Arg Ile Leu Arg Pro Tyr Gly Asp Val Ala

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Gly Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Ala Leu Arg Arg Ala Thr Glu Ala

225 230 235 240

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245 250 255

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290 295 300

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Gly Asn Gly Phe Gly Met Ile Leu Arg Leu Ala Leu Ser Glu Lys Val

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325 330 335

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Leu Ile Lys Asn Glu Arg Gln Ile Met Gln Gly Tyr Gly Glu Tyr Leu

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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465 470 475 480

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485 490 495

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<212>PRT

<213>耐辐射奇异球菌R1

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Gly Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Ala Leu Arg Arg Ala Thr Glu Ala

225 230 235 240

Glu Gly Gly Glu Val Phe Thr Asp Ala Pro Val Lys Glu Ile Leu Val

245 250 255

Lys Asp Gly Lys Ala Gln Gly Ile Arg Leu Glu Ser Gly Glu Thr Tyr

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Gly Asn Gly Phe Gly Met Ile Leu Arg Leu Ala Leu Ser Glu Lys Val

305 310 315 320

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325 330 335

Leu Ile Lys Asn Glu Arg Gln Ile Met Gln Gly Tyr Gly Glu Tyr Leu

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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435 440 445

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<212>DNA

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1 5 10 15

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<212>PRT

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<211>262

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100 105 110

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180 185 190

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195 200 205

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Ile Ser Lys Ile His Lys Trp Met Leu Leu Pro Val Ile Leu Trp Gln

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115 120 125

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130 135 140

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

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<212>DNA

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130 135 140

atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att gcg ttg act att att 480

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145 150 155 160

tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca agt gat aat cta act 528

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

165 170 175

tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca tta caa tta ttc tat 576

Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr

180 185 190

ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata ggg ggt tat gtt cag 624

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln

195 200 205

cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att tgg tgg tca ttt atc 672

Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile

210 215 220

acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat cac gaa tat cct cat 720

Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His

225 230 235 240

att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa gca aaa tag 762

Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys

245 250

<210>70

<211>253

<212>PRT

<213>合成序列

<400>70

Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe Ile Ala Ile Val

20 25 30

Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp

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Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val Ile Leu Trp Gln

50 55 60

Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His Asp Ala Met His

65 70 75 80

Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His Leu Ile Gly Thr

85 90 95

Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys

100 105 110

Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Asp Leu Asp Pro Asp

115 120 125

Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe

130 135 140

Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr

165 170 175

Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr

180 185 190

Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln

195 200 205

Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile

210 215 220

Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His

225 230 235 240

Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys

245 250

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<211>804

<212>DNA

<213>合成变体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(804)

<223>

<400>71

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Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His

1 5 10 15

cag ccg agt tgc tca agc tgg gtg gca aat gag ttc agc cct cag gcc 96

Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala

20 25 30

ctc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tca gcc tgg ctg ctc 144

Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

35 40 45

tcc ctg ggc ctg agc tac acc ctg cca ctt gat cag acg cct ggg ctg 192

Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu

50 55 60

ttg att ggc agc ttg att ctg tgg cag acc ttt ctg cac acc ggg ctg 240

Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu His Thr Gly Leu

65 70 75 80

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Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His

85 90 95

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100 105 110

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Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arq Arg His His Leu

115 120 125

gca ccg gag acg ttc cag gat cct gac tac caa cgt tgc acc aat aac 432

Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn

130 135 140

aac atc cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg 480

Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met

145 150 155 160

cgg caa ctg tta aat cta agc tgt ctt tgg ctg gcg cta atc att ctc 528

Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu

165 170 175

aac ggt tct gat ctc cct gct cag atc atg cat ctg ctg ttg ttc agc 576

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

gtt ctg ccg ttg atc atc agt tcc tgt caa ttg ttt cta gtg gga acc 624

Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr

195 200 205

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Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr

210 215 220

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Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn

225 230 235 240

ttt ggc tat cat cgt gaa cat cat gaa tcg cct tcc aca ccc tgg ttt 768

Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe

245 250 255

cag ctg cca caa ctt cga aat gaa tca ttc act tga 804

Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr

260 265

<210>72

<211>267

<212>PRT

<213>合成变体

<400>72

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Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala

20 25 30

Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

35 40 45

Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu

50 55 60

Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu His Thr Gly Leu

65 70 75 80

Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His

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100 105 110

Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu

115 120 125

Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn

130 135 140

Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met

145 150 155 160

Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu

165 170 175

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr

195 200 205

Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr

210 215 220

Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn

225 230 235 240

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260 265

<210>73

<211>804

<212>DNA

<213>合成变体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(804)

<223>

<400>73

atg aaa acg aca aga tct att tcg tgg cca tcg act tgc tgg cat cac 48

Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His

1 5 10 15

cag ccg agt tgc tca agc tgg gtg gca aat gag ttc agc cct cag gcc 96

Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala

20 25 30

ctc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tca gcc tgg ctg ctc 144

Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

35 40 45

tcc ctg ggc ctg agc tac acc ctg cca ctt gat cag acg cct ggg ctg 192

Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu

50 55 60

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Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu

65 70 75 80

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Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His

85 90 95

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100 105 110

ggc ttg tct tat gag cgt tgt tcc cgc aac cac aga cgt cat cac gga 384

Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Gly

115 120 125

cat cct ggt act gat tta gat cct gac tac caa cgt tgc acc aat aac 432

His Pro Gly Thr Asp Leu Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn

130 135 140

aac atc cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg 480

Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met

145 150 155 160

cgg caa ctg tta aat cta agc tgt ctt tgg ctg gcg cta atc att ctc 528

Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu

165 170 175

aac ggt tct gat ctc cct gct cag atc atg cat ctg ctg ttg ttc agc 576

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn

225 230 235 240

ttt ggc tat cat cgt gaa cat cat gaa tcg cct tcc aca ccc tgg ttt 768

Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe

245 250 255

cag ctg cca caa ctt cga aat gaa tca ttc act tga 804

Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr

260 265

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<211>267

<212>PRT

<213>合成变体

<400>74

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Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

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Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met

145 150 155 160

Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu

165 170 175

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr

195 200 205

Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr

210 215 220

Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn

225 230 235 240

Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe

245 250 255

Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr

260 265

<210>75

<211>804

<212>DNA

<213>聚球藻WH8102

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(804)

<223>

<400>75

atg aaa acg aca aga tct att tcg tgg cca tcg act tgc tgg cat cac 48

Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His

1 5 10 15

cag ccg agt tgc tca agc tgg gtg gca aat gag ttc agc cct cag gcc 96

Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala

20 25 30

ctc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tca gcc tgg ctg ctc 144

Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

35 40 45

tcc ctg ggc ctg agc tac acc ctg cca ctt gat cag acg cct ggg ctg 192

Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu

50 55 60

ttg att ggc agc ttg att ctg ctc aga gca ttt ctg cac acc ggg ctg 240

Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu

65 70 75 80

ttc atc gtt gcc cac gat tcc atg cac gcc agt ctg gtt ccg ggt cat 288

Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His

85 90 95

ccc gga ttg aac cgc tgg atc ggc aaa gtg tat ttg ttg gtg tat gca 336

Pro Gly Leu Asn Arg Trp Ile Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala

100 105 110

ggc ttg tct tat gag cgt tgt tcc cgc aac cac aga cgt cat cac ctg 384

Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu

115 120 125

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Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn

130 135 140

aac atc cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg 480

Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met

145 150 155 160

cgg caa ctg tta aat cta agc tgt ctt tgg ctg gcg cta atc att ctc 528

Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu

165 170 175

aac ggt tct gat ctc cct gct cag atc atg cat ctg ctg ttg ttc agc 576

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

gtt ctg ccg ttg atc atc agt tcc tgt caa ttg ttt cta gtg gga acc 624

Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe

245 250 255

cag ctg cca caa ctt cga aat gaa tca ttc act tga 804

Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr

260 265

<210>76

<211>267

<212>PRT

<213>聚球藻WH8102

<400>76

Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His

1 5 10 15

Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala

20 25 30

Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser

180 185 190

Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr

195 200 205

Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr

210 215 220

Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn

225 230 235 240

Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe

245 250 255

Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr

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<213>雨生红球藻

<220>

<221>CDS

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<223>

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Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile

1 5 10 15

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Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu

20 25 30

tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc 143

Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala

35 40 45

cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg 191

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tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga 239

Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly

65 70 75

acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca 287

Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala

80 85 90 95

ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa 335

Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys

100 105 110

cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc 383

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Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His

130 135 140

atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc 479

Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu

145 150 155

ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat 527

Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr

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gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac 575

Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His

180 185 190

aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg 623

Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu

195 200 205

ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc 671

Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly

210 215 220

ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg 719

Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu

225 230 235

ggc atc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg 767

Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu

240 245 250 255

gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg 815

Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met

260 265 270

aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt 863

Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly

275 280 285

ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att 911

Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile

290 295 300

cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959

Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp

305 310 315

tcc aag cgg tag ggtgcggaac caggcacgct ggtttcacac ctcatgcctg 1011

Ser Lys Arg

320

tgataaggtg tggctagagc gatgcgtgtg agacgggtat gtcacggtcg actggtctga 1071

tggccaatgg catcggccat gtctggtcat cacgggctgg ttgcctgggt gaaggtgatg 1131

cacatcatca tgtgcggttg gaggggctgg cacagtgtgg gctgaactgg agcaqttgtc 1191

caggctggcg ttgaatcagt gagggtttgt gattggcggt tgtgaagcaa tgactccgcc 1251

catattctat ttgtgggagc tgagatgatg gcatgcttgg gatgtgcatg gatcatggta 1311

gtgcagcaaa ctatattcac ctagggctgt tggtaggatc aggtgaggcc ttgcacattg 1371

catgatgtac tcgtcatggt gtgttggtga gaggatggat gtggatggat gtgtattctc 1431

agacgtagac cttgactgga ggcttgatcg agagagtggg ccgtattctt tgagagggga 1491

ggctcgtgcc agaaatggtg agtggatgac tgtgacgctg tacattgcag gcaggtgaga 1551

tgcactgtct cgattgtaaa atacattcag atgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1608

<210>78

<211>322

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<400>78

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1 5 10 15

Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser

20 25 30

Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg

35 40 45

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50 55 60

Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr

65 70 75 80

Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu

85 90 95

Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg

100 105 110

Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly Val

115 120 125

Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met

130 135 140

Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu

145 150 155 160

Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala

165 170 175

His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys

180 185 190

Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe

195 200 205

Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe

210 215 220

Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly

225 230 235 240

Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val

245 250 255

His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys

260 265 270

Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly

275 280 285

Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile Pro

290 295 300

Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser

305 310 315 320

Lys Arg

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<211>33

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<222>(1)..(33)

<223>

<400>79

gcatgctcta gaccttataa agatattttg tga 33

<210>80

<211>33

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<222>(1)..(33)

<223>

<400>80

gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac cat 33

<210>81

<211>805

<212>DNA

<213>念珠藻属Pcc7120株

<220>

<221>variation

<222>(1)..(805)

<223>

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gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac catcatctct gcattcagaa aaactggtgt 60

tattgtcatc gacaatcaga gatgataaaa atattaataa gggtatattt attgcctgct 120

ttatcttatt tttatgggca attagtttaa tcttattact ctcaatagat acatccataa 180

ttcataagag cttattaggt atagccatgc tttggcagac cttcttatat acaggtttat 240

ttattactgc tcatgatgcc atgcacggcg tagtttatcc caaaaatccc agaataaata 300

attttatagg taagctcact ctaatcttgt atggactact cccttataaa gatttattga 360

aaaaacattg gttacaccac ggacatcctg gtactgattt agaccctgat tattacaatg 420

gtcatcccca aaacttcttt ctttggtatc tacattttat gaagtcttat tggcgatgga 480

cgcaaatttt cggattagtg atgatttttc atggacttaa aaatctggtg catataccag 540

aaaataattt aattatattt tggatgatac cttctatttt aagttcagta caactatttt 600

attttggtac atttttgcct cataaaaagc tagaaggtgg ttatactaac ccccattgtg 660

cgcgcagtat cccattacct cttttttggt cttttgttac ttgttatcac ttcggctacc 720

acaaggaaca tcacgaatac cctcaacttc cttggtggaa attacctgaa gctcacaaaa 780

tatctttata aggtctagag catgc 805

<210>82

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<223>

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aggtaccgca cggtctgcca atcc 24

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<211>26

<212>DNA

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<220>

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<222>(1)..(26)

<223>

<400>83

aagcttgacc tgattatcag cacggt 26

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<212>DNA

<213>噬夏孢欧文菌

<220>

<221>CDS

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<223>

<220>

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<223>

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<223>

<220>

<221>misc_feature

<222>(3631)..(4158)

<223>

<400>84

gtcgactttc agcagcgcat ggcgaaaatc cagacagccc ttcgtttggc agggggcacc 60

atggccgctg ccgatatcat tgagcaggtt atgtgcaccg gtcagcctgt cttaagtggg 120

agcggct atg caa ccg cat tat gat ctg att ctc gtg ggg gct gga ctc 169

Met Gln Pro His Tyr Asp Leu Ile Leu Val Gly Ala Gly Leu

1 5 10

gcg aat ggc ctt atc gcc ctg cgt ctt cag cag cag caa cct gat atg 217

Ala Asn Gly Leu Ile Ala Leu Arg Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asp Met

15 20 25 30

cgt att ttg ctt atc gac gcc gca ccc cag gcg ggc ggg aat cat acg 265

Arg Ile Leu Leu Ile Asp Ala Ala Pro Gln Ala Gly Gly Asn His Thr

35 40 45

tgg tca ttt cac cac gat gat ttg act gag agc caa cat cgt tgg ata 313

Trp Ser Phe His His Asp Asp Leu Thr Glu Ser Gln His Arg Trp Ile

50 55 60

gct ccg ctg gtg gtt cat cac tgg ccc gac tat cag gta cgc ttt ccc 361

Ala Pro Leu Val Val His His Trp Pro Asp Tyr Gln Val Arg Phe Pro

65 70 75

aca cgc cgt cgt aag ctg aac agc ggc tac ttt tgt att act tct cag 409

Thr Arg Arg Arg Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Phe Cys Ile Thr Ser Gln

80 85 90

cgt ttc gct gag gtt tta cag cga cag ttt ggc ccg cac ttg tgg atg 457

Arg Phe Ala Glu Val Leu Gln Arg Gln Phe Gly Pro His Leu Trp Met

95 100 105 110

gat acc gcg gtc gca gag gtt aat gcg gaa tct gtt cgg ttg aaa aag 505

Asp Thr Ala Val Ala Glu Val Asn Ala Glu Ser Val Arg Leu Lys Lys

115 120 125

ggt cag gtt atc ggt gcc cgc gcg gtg att gac ggg cgg ggt tat gcg 553

Gly Gln Val Ile Gly Ala Arg Ala Val Ile Asp Gly Arg Gly Tyr Ala

130 135 140

gca aat tca gca ctg agc gtg ggc ttc cag gcg ttt att ggc cag gaa 601

Ala Asn Ser Ala Leu Ser Val Gly Phe Gln Ala Phe Ile Gly Gln Glu

145 150 155

tgg cga ttg agc cac ccg cat ggt tta tcg tct ccc att atc atg gat 649

Trp Arg Leu Ser His Pro His Gly Leu Ser Ser Pro Ile Ile Met Asp

160 165 170

gcc acg gtc gat cag caa aat ggt tat cgc ttc gtg tac agc ctg ccg 697

Ala Thr Val Asp Gln Gln Asn Gly Tyr Arg Phe Val Tyr Ser Leu Pro

175 180 185 190

ctc tcg ccg acc aga ttg tta att gaa gac acg cac tat att gat aat 745

Leu Ser Pro Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asp Thr His Tyr Ile Asp Asn

195 200 205

gcg aca tta gat cct gaa tgc gcg cgg caa aat att tgc gac tat gcc 793

Ala Thr Leu Asp Pro Glu Cys Ala Arg Gln Asn Ile Cys Asp Tyr Ala

210 215 220

gcg caa cag ggt tgg cag ctt cag aca ctg ctg cga gaa gaa cag ggc 841

Ala Gln Gln Gly Trp Gln Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Glu Gln Gly

225 230 235

gcc tta ccc att act ctg tcg ggc aat gcc gac gca ttc tgg cag cag 889

Ala Leu Pro Ile Thr Leu Ser Gly Asn Ala Asp Ala Phe Trp Gln Gln

240 245 250

cgc ccc ctg gcc tgt agt gga tta cgt gcc ggt ctg ttc cat cct acc 937

Arg Pro Leu Ala Cys Ser Gly Leu Arg Ala Gly Leu Phe His Pro Thr

255 260 265 270

acc ggc tat tca ctg ccg ctg gcg gtt gcc gtg gcc gac cgc ctg agt 985

Thr Gly Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Leu Ser

275 280 285

gca ctt gat gtc ttt acg tcg gcc tca att cac cat gcc att acg cat 1033

Ala Leu Asp Val Phe Thr Ser Ala Ser Ile His His Ala Ile Thr His

290 295 300

ttt gcc cgc gag cgc tgg cag cag cag ggc ttt ttc cgc atg ctg aat 1081

Phe Ala Arg Glu Arg Trp Gln Gln Gln Gly Phe Phe Arg Met Leu Asn

305 310 315

cgc atg ctg ttt tta gcc gga ccc gcc gat tca cgc tgg cgg gtt atg 1129

Arg Met Leu Phe Leu Ala Gly Pro Ala Asp Ser Arg Trp Arg Val Met

320 325 330

cag cgt ttt tat ggt tta cct gaa gat tta att gcc cgt ttt tat gcg 1177

Gln Arg Phe Tyr Gly Leu Pro Glu Asp Leu Ile Ala Arg Phe Tyr Ala

335 340 345 350

gga aaa ctc acg ctg acc gat cgg cta cgt att ctg agc ggc aag ccg 1225

Gly Lys Leu Thr Leu Thr Asp Arg Leu Arg Ile Leu Ser Gly Lys Pro

355 360 365

cct gtt ccg gta tta gca gca ttg caa gcc att atg acg act 1267

Pro Val Pro Val Leu Ala Ala Leu Gln Ala Ile Met Thr Thr

370 375 380

catcgttaaa gagcgactac atgaaaccaa ctacggtaat tggtgcaggc ttcggtggcc 1327

tggcactggc aattcgtcta caagctgcgg ggatccccgt cttactgctt gaacaacgtg 1387

ataaacccgg cggtcgggct tatgtctacg aggatcaggg gtttaccttt gatgcaggcc 1447

cgacggttat caccgatccc agtgccattg aagaactgtt tgcactggca ggaaaacagt 1507

taaaagagta tgtcgaactg ctgccggtta cgccgtttta ccgcctgtgt tgggagtcag 1567

ggaaggtctt taattacgat aacgatcaaa cccggctcga agcgcagatt cagcagttta 1627

atccccgcga tgtcgaaggt tatcgtcagt ttctggacta ttcacgcgcg gtgtttaaag 1687

aaggctatct aaagctcggt actgtccctt ttttatcgtt cagagacatg cttcgcgccg 1747

cacctcaact ggcgaaactg caggcatgga gaagcgttta cagtaaggtt gccagttaca 1807

tcgaagatga acatctgcgc caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc 1867

ccttcgccac ctcatccatt tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct 1927

ggtttccgcg tggcggcacc ggcgcattag ttcaggggat gataaagctg tttcaggatc 1987

tgggtggcga agtcgtgtta aacgccagag tcagccatat ggaaacgaca ggaaacaaga 2047

ttgaagccgt gcatttagag gacggtcgca ggttcctgac gcaagccgtc gcgtcaaatg 2107

cagatgtggt tcatacctat cgcgacctgt taagccagca ccctgccgcg gttaagcagt 2167

ccaacaaact gcagactaag cgcatgagta actctctgtt tgtgctctat tttggtttga 2227

atcaccatca tgatcagctc gcgcatcaca cggtttgttt cggcccgcgt taccgcgagc 2287

tgattgacga aatttttaat catgatggcc tcgcagagga cttctcactt tatctgcacg 2347

cgccctgtgt cacggattcg tcactggcgc ctgaaggttg cggcagttac tatgtgttgg 2407

cgccggtgcc gcatttaggc accgcgaacc tcgactggac ggttgagggg ccaaaactac 2467

gcgaccgtat ttttgcgtac cttgagcagc attacatgcc tggcttacgg agtcagctgg 2527

tcacgcaccg gatgtttacg ccgtttgatt ttcgcgacca gcttaatgcc tatcatggct 2587

cagccttttc tgtggagccc gttcttaccc agagcgcctg gtttcggccg cataaccgcg 2647

ataaaaccat tactaatctc tacctggtcg gcgcaggcac gcatcccggc gcaggcattc 2707

ctggcgtcat cggctcggca aaagcgacag caggtttgat gctggaggat ctgatttgaa 2767

taatccgtcg ttactcaatc atgcggtcga aacgatggca gttggctcga aaagttttgc 2827

gacagcctca aagttatttg atgcaaaaac ccggcgcagc gtactgatgc tctacgcctg 2887

gtgccgccat tgtgacgatg ttattgacga tcagacgctg ggctttcagg cccgqcagcc 2947

tgccttacaa acgcccgaac aacgtctgat gcaacttgag atgaaaacgc gccaggccta 3007

tgcaggatcg cagatgcacg aaccggcgtt tgcggctttt caggaagtgg ctatggctca 3067

tgatatcgcc ccggcttacg cgtttgatca tctggaaggc ttcgccatgg atgtacgcga 3127

agcgcaatac agccaactgg atgatacgct gcgctattgc tatcacgttg caggcgttgt 3187

cggcttgatg atggcgcaaa tcatgggcgt gcgggataac gccacgctgg accgcgcctg 3247

tgaccttggg ctggcatttc agttgaccaa tattgctcgc gatattgtgg acgatgcgca 3307

tgcgggccgc tgttatctgc cggcaagctg gctggagcat gaaggtctga acaaagagaa 3367

ttatgcggca cctgaaaacc gtcaggcgct gagccgtatc gcccgtcgtt tggtgcagga 3427

agcagaacct tactatttgt ctgccacagc cggcctggca gggttgcccc tgcgttccgc 3487

ctgggcaatc gctacggcga agcaggttta ccggaaaata ggtgtcaaag ttgaacaggc 3547

cggtcagcaa gcctgggatc agcggcagtc aacgaccacg cccgaaaaat taacgctgct 3607

gctggccgcc tctggtcagg cccttacttc ccggatgcgg gctcatcctc cccgccctgc 3667

gcatctctgg cagcgcccgc tctagcgcca tgtctttccc ggagcgtcgc ctgaagtttt 3727

gacaggggcg gcgcatagag gaagccaaaa gaaacacaac cttctttgcc cctgacggcg 3787

tgatgcatac ggtgcgccat atacaaccgt ttgaggtagc ccttgcgtgg aatatagcgg 3847

aatggccaac gttgatgcac cagcccgtcg tgcaccataa aatagagtaa tccatacgcc 3907

gtcatacctg cgccaatcca ctggagcgqc cacattcctg tactgcccag ataaatcagc 3967

aggatcgata atgcagcaaa aaccacggca taaagatcgt taacttcaaa cgcaccttta 4027

cgcggttcat gatgtgaaag atgccatccc caaccccagc cgtgcatgat gtatttgtgt 4087

gccagtgcag caatcacttc catgccaatc acggtaacga aaacgatcag ggcattccaa 4147

atccacaaca taatttctcc ggtagagacg tctggcagca ggcttaagga ttcaatttta 4207

acagagatta gccgatctgg cggcgggaag ggaaaaaggc gcgccagaaa ggcgcgccag 4267

ggatcagaag tcggctttca gaaccacacg gtagttggct ttacctgcac gaacatggtc 4327

cagtgcatcg ttgattttcg acatcgggaa gtactccact gtcggcgcaa tatctgtacg 4387

gccagccagc ttcagcagtg aacgcagctg cgcaggtgaa ccggttgaag aacccgtcac 4447

ggcgcggtcg cctaaaatca ggctgaaagc cgggcacgtc aaacggcttc agtacggcac 4507

ccacggtatg gaacttaccg cgaggcgcca gggccgcaaa gtagggttgc cagtcgagat 4567

cgacggcgac cgtgctgata atcaggtcaa actggcccgc caggcttttt aaagctt 4624

<210>85

<211>380

<212>PRT

<213>噬夏孢欧文菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(1288)..(2766)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<222>(2802)..(3689)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<222>(3631)..(4158)

<223>

<400>85

Met Gln Pro His Tyr Asp Leu Ile Leu Val Gly Ala Gly Leu Ala Asn

1 5 10 15

Gly Leu Ile Ala Leu Arg Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asp Met Arg Ile

20 25 30

Leu Leu Ile Asp Ala Ala Pro Gln Ala Gly Gly Asn His Thr Trp Ser

35 40 45

Phe His His Asp Asp Leu Thr Glu Ser Gln His Arg Trp Ile Ala Pro

50 55 60

Leu Val Val His His Trp Pro Asp Tyr Gln Val Arg Phe Pro Thr Arg

65 70 75 80

Arg Arg Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Phe Cys Ile Thr Ser Gln Arg Phe

85 90 95

Ala Glu Val Leu Gln Arg Gln Phe Gly Pro His Leu Trp Met Asp Thr

100 105 110

Ala Val Ala Glu Val Asn Ala Glu Ser Val Arg Leu Lys Lys Gly Gln

115 120 125

Val Ile Gly Ala Arg Ala Val Ile Asp Gly Arg Gly Tyr Ala Ala Asn

130 135 140

Ser Ala Leu Ser Val Gly Phe Gln Ala Phe Ile Gly Gln Glu Trp Arg

145 150 155 160

Leu Ser His Pro His Gly Leu Ser Ser Pro Ile Ile Met Asp Ala Thr

165 170 175

Val Asp Gln Gln Asn Gly Tyr Arg Phe Val Tyr Ser Leu Pro Leu Ser

180 185 190

Pro Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asp Thr His Tyr Ile Asp Asn Ala Thr

195 200 205

Leu Asp Pro Glu Cys Ala Arg Gln Asn Ile Cys Asp Tyr Ala Ala Gln

210 215 220

Gln Gly Trp Gln Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Glu Gln Gly Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ile Thr Leu Ser Gly Asn Ala Asp Ala Phe Trp Gln Gln Arg Pro

245 250 255

Leu Ala Cys Ser Gly Leu Arg Ala Gly Leu Phe His Pro Thr Thr Gly

260 265 270

Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Leu Ser Ala Leu

275 280 285

Asp Val Phe Thr Ser Ala Ser Ile His His Ala Ile Thr His Phe Ala

290 295 300

Arg Glu Arg Trp Gln Gln Gln Gly Phe Phe Arg Met Leu Asn Arg Met

305 310 315 320

Leu Phe Leu Ala Gly Pro Ala Asp Ser Arg Trp Arg Val Met Gln Arg

325 330 335

Phe Tyr Gly Leu Pro Glu Asp Leu Ile Ala Arg Phe Tyr Ala Gly Lys

340 345 350

Leu Thr Leu Thr Asp Arg Leu Arg Ile Leu Ser Gly Lys Pro Pro Val

355 360 365

Pro Val Leu Ala Ala Leu Gln Ala Ile Met Thr Thr

370 375 380

<210>86

<211>32

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<223>

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tttttctcga gcgataaacg ctcacttggt ta 32

<210>87

<211>32

<212>DNA

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<222>(1)..(32)

<223>

<400>87

tttttgtcga cacgttatgc tcacaacccc gg 32

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<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

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<223>

<400>88

ctcgagcgat aaacgctcac ttggttaatc atttcactct tcaattatct ataatgatga 60

gtgatcagaa ttacatgtga gaaatt atg caa acg gaa cac gtc att tta ttg 113

Met Gln Thr Glu His Val Ile Leu Leu

1 5

aat gca cag gga gtt ccc acg ggt acg ctg gaa aag tat gcc gca cac 161

Asn Ala Gln Gly Val Pro Thr Gly Thr Leu Glu Lys Tyr Ala Ala His

10 15 20 25

acg gca gac acc cgc tta cat ctc gcg ttc tcc agt tgg ctg ttt aat 209

Thr Ala Asp Thr Arg Leu His Leu Ala Phe Ser Ser Trp Leu Phe Asn

30 35 40

gcc aaa gga caa tta tta gtt acc cgc cgc gca ctg agc aaa aaa gca 257

Ala Lys Gly Gln Leu Leu Val Thr Arg Arg Ala Leu Ser Lys Lys Ala

45 50 55

tgg cct ggc gtg tgg act aac tcg gtt tgt ggg cac cca caa ctg gga 305

Trp Pro Gly Val Trp Thr Asn Ser Val Cys Gly His Pro Gln Leu Gly

60 65 70

gaa agc aac gaa gac gca gtg atc cgc cgt tgc cgt tat gag ctt ggc 353

Glu Ser Asn Glu Asp Ala Val Ile Arg Arg Cys Arg Tyr Glu Leu Gly

75 80 85

gtg gaa att acg cct cct gaa tct atc tat cct gac ttt cgc tac cgc 401

Val Glu Ile Thr Pro Pro Glu Ser Ile Tyr Pro Asp Phe Arg Tyr Arg

90 95 100 105

gcc acc gat ccg agt ggc att gtg gaa aat gaa gtg tgt ccg gta ttt 449

Ala Thr Asp Pro Ser GlyIle Val Glu Asn Glu Val Cys Pro Val Phe

110 115 120

gcc gca cgc acc act agt gcg tta cag atc aat gat gat gaa gtg atg 497

Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ala Leu Gln Ile Asn Asp Asp Glu Val Met

125 130 135

gat tat caa tgg tgt gat tta gca gat gta tta cac ggt att gat gcc 545

Asp Tyr Gln Trp Cys Asp Leu Ala Asp Val Leu His Gly Ile Asp Ala

140 145 150

acg ccg tgg gcg ttc agt ccg tgg atg gtg atg cag gcg aca aat cgc 593

Thr Pro Trp Ala Phe Ser Pro Trp Met Val Met Gln Ala Thr Asn Arg

155 160 165

gaa gcc aga aaa cga tta tct gca ttt acc cag ctt aaa taa 635

Glu Ala Arg Lys Arg Leu Ser Ala Phe Thr Gln Leu Lys

170 175 180

aaaaaccccg acatttgccg gggttgtgag cataacgtgt cgac 679

<210>89

<211>182

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>89

Met Gln Thr Glu His Val Ile Leu Leu Asn Ala Gln Gly Val Pro Thr

1 5 10 15

Gly Thr Leu Glu Lys Tyr Ala Ala His Thr Ala Asp Thr Arg Leu His

20 25 30

Leu Ala Phe Ser Ser Trp Leu Phe Asn Ala Lys Gly Gln Leu Leu Val

35 40 45

Thr Arg Arg Ala Leu Ser Lys Lys Ala Trp Pro Gly Val Trp Thr Asn

50 55 60

Ser Val Cys Gly His Pro Gln Leu Gly Glu Ser Asn Glu Asp Ala Val

65 70 75 80

Ile Arg Arg Cys Arg Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ile Thr Pro Pro Glu

85 90 95

Ser Ile Tyr Pro Asp Phe Arg Tyr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Gly Ile

100 105 110

Val Glu Asn Glu Val Cys Pro Val Phe Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ala

115 120 125

Leu Gln Ile Asn Asp Asp Glu Val Met Asp Tyr Gln Trp Cys Asp Leu

130 135 140

Ala Asp Val Leu His Gly Ile Asp Ala Thr Pro Trp Ala Phe Ser Pro

145 150 155 160

Trp Met Val Met Gln Ala Thr Asn Arg Glu Ala Arg Lys Arg Leu Ser

165 170 175

Ala Phe Thr Gln Leu Lys

180

<210>90

<211>31

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<222>(1)..(31)

<223>

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tttttccatg gtgaaggagg aaatagcgaa a 31

<210>91

<211>32

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

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<222>(1)..(32)

<223>

<400>91

tttttaagct ttcacttttt tcttgtaacc aa 32

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<212>DNA

<213>嗜超高温硫酸根还原古细菌(Archaeoglobus fulgidus)

<220>

<221>CDS

<222>(3)..(956)

<223>

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cc atg gtg aag gag gaa ata gcg aaa agg gcc gaa ata atc aac aaa 47

Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys

1 5 10 15

gcc att gaa gag ctt ctg ccc gaa agg gag ccg att gga ctc tac aaa 95

Ala Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys

20 25 30

gcc gca agg cat ctg atc aaa gca ggt ggc aag agg cta agg cct gta 143

Ala Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val

35 40 45

ata agc ctc tta gca gtc gaa gcc ctt ggg aaa gac tac aga aag att 191

Ile Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile

50 55 60

atc ccg gct gct gtc agc att gaa aca atc cac aac ttc acc ctc gtg 239

Ile Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val

65 70 75

cat gac gac ata atg gac agg gac gag atg agg agg gga gtt ccg acg 287

His Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr

80 85 90 95

gta cac agg gtt tat ggg gaa gcg acq gcc att tta gca ggc gac aca 335

Val His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr

100 105 110

ctc ttt gct gaa gcc ttc aag ctg ctg aca aag tgc gat gtt gag agc 383

Leu Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser

115 120 125

gag gga atc aga aaa gct aca gaa atg ctt tcg gac gtt tgc ata aaa 431

Glu Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys

130 135 140

ata tgc gag ggg cag tac tac gac atg agc ttt gag aaa aag gag agc 479

Ile Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser

145 150 155

gtt tcc gag gag gag tat ctc agg atg gtc gag ctg aag acc gga gtg 527

Val Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val

160 165 170 175

ctg att gca gct tct gca gca tta cct gcg gtg ctt ttt ggg gag agc 575

Leu Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser

180 185 190

gag gaa att gta aag gcg ctg tgg gac tac gga gtt ctt agc ggt att 623

Glu Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile

195 200 205

ggc ttc cag atc cag gac gac ctg ctt gac ctg act gag gag acc gga 671

Gly Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly

210 215 220

aag gac tgg gga agc gac ctg ctt aaa ggg aag aaa acc ctg att gtc 719

Lys Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val

225 230 235

ata aag gcg ttc gaa aag gga gtg aag cta aag acg ttt gga aag gaa 767

Ile Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu

240 245 250 255

aag gcg gac gtc tct gag att aga gat gat atc gaa aag tta aga gag 815

Lys Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu

260 265 270

tgt ggt gcg att gat tac gct gcc agc atg gca aga aag atg gct gaa 863

Cys Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu

275 280 285

gag gcg aaa aga aag ctc gaa gtt ctg cct gaa agc aaa gcc aag gaa 911

Glu Ala Lys Arq Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu

290 295 300

aca ctg ctg gaa ctt acc gac ttc ttg gtt aca aga aaa aag tga 956

Thr Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys

305 310 315

aagctt 962

<210>93

<211>317

<212>PRT

<213>嗜超高温硫酸根还原古细菌

<400>93

Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala

1 5 10 15

Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala

20 25 30

Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile

35 40 45

Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile

50 55 60

Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val His

65 70 75 80

Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr Val

85 90 95

His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu

100 105 110

Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu

115 120 125

Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile

130 135 140

Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val

145 150 155 160

Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu

165 170 175

Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu

180 185 190

Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly

195 200 205

Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys

210 215 220

Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile

225 230 235 240

Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys

245 250 255

Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys

260 265 270

Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu

275 280 285

Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr

290 295 300

Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys

305 310 315

<210>94

<211>1293

<212>DNA

<213>嗜超高温硫酸根还原古细菌

<220>

<221>CDS

<222>(206)..(1159)

<223>

<400>94

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 60

gccccccctc gacgccgtcg ttcaatgaga atggataaga ggctcgtggg attgacgtga 120

gggggcaggg atggctatat ttctgggagc gaactccggg cgaggatcta gttgtaggga 180

gggattcatg acaccacaaa cagcc atg gtg aag gag gaa ata gcg aaa agg 232

Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg

1 5

gcc gaa ata atc aac aaa gcc att gaa gag ctt ctg ccc gaa agg gag 280

Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu

10 15 20 25

ccg att gga ctc tac aaa gcc gca agg cat ctg atc aaa gca ggt ggc 328

Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly

30 35 40

aag agg cta agg cct gta ata agc ctc tta gca gtc gaa gcc ctt ggg 376

Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly

45 50 55

aaa gac tac aga aag att atc ccg gct gct gtc agc att gaa aca atc 424

Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile

60 65 70

cac aac ttc acc ctc gtg cat gac gac ata atg gac agg gac gag atg 472

His Asn Phe Thr Leu Val His Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met

75 80 85

agg agg gga gtt ccg acg gta cac agg gtt tat ggg gaa gcg acg gcc 520

Arg Arg Gly Val Pro Thr Val His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala

90 95 100 105

att tta gca ggc gac aca ctc ttt gct gaa gcc ttc aag ctg ctg aca 568

Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr

110 115 120

aag tgc gat gtt gag agc gag gga atc aga aaa gct aca gaa atg ctt 616

Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu

125 130 135

tcg gac gtt tgc ata aaa ata tgc gag ggg cag tac tac gac atg agc 664

Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser

140 145 150

ttt gag aaa aag gag agc gtt tcc gag gag gag tat ctc agg atg gtc 712

Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val

155 160 165

gag ctg aag acc gga gtg ctg att gca gct tct gca gca tta cct gcg 760

Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala

170 175 180 185

gtg ctt ttt ggg gag agc gag gaa att gta aag gcg ctg tgg gac tac 808

Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr

190 195 200

gga gtt ctt agc ggt att ggc ttc cag atc cag gac gac ctg ctt gac 856

Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp

205 210 215

ctg act gag gag acc gga aag gac tgg gga agc gac ctg ctt aaa ggg 904

Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly

220 225 230

aag aaa acc ctg att gtc ata aag gcg ttc gaa aag gga gtg aag cta 952

Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu

235 240 245

aag acg ttt gga aag gaa aag gcg gac gtc tct gag att aga gat gat 1000

Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp

250 255 260 265

atc gaa aag tta aga gag tgt ggt gcg att gat tac gct gcc agc atg 1048

Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met

270 275 280

gca aga aag atg gct gaa gag gcg aaa aga aag ctc gaa gtt ctg cct 1096

Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro

285 290 295

gaa agc aaa gcc aag gaa aca ctg ctg gaa ctt acc gac ttc ttg gtt 1144

Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val

300 305 310

aca aga aaa aag tga aagcttcaat tgcatgctct agatgatcaa agaattcctg 1199

Thr Arg Lys Lys

315

gcctagtcta taggaggttt tgaaaagaaa ggagcaataa tcattttctt gttctatcaa 1259

gagggtgcta ttgctccttt ctttttttct cgag 1293

<210>95

<211>317

<212>PRT

<213>嗜超高温硫酸根还原古细菌

<400>95

Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala

1 5 10 15

Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala

20 25 30

Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile

35 40 45

Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile

50 55 60

Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val His

65 70 75 80

Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr Val

85 90 95

His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu

100 105 110

Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu

115 120 125

Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile

130 135 140

Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val

145 150 155 160

Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu

165 170 175

Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu

180 185 190

Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly

195 200 205

Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys

210 215 220

Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile

225 230 235 240

Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys

245 250 255

Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys

260 265 270

Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu

275 280 285

Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr

290 295 300

Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys

305 310 315

<210>96

<211>35

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(35)

<223>

<400>96

gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgacc 35

<210>97

<211>38

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(38)

<223>

<400>97

aagcttggttgatcagaaga agaagaagaa gatgaact 38

<210>98

<211>647

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(647)

<223>

<400>98

gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgaccagcga acgcagaata ccttgttgtg 60

taatacttta cccgtgtaaa tcaaaaacaa aaaggctttt gagctttttg tagttgaatt 120

tctctggctg atcttttctg tacagattca tatatctgca gagacgatat cattgattat 180

ttgagcttct tttgaactat ttcgtgtaat ttgggatgag agctctatgt atgtgtgtaa 240

actttgaaga caacaagaaa ggtaacaagt gagggaggga tgactccatg tcaaaataga 300

tgtcataaga ggcccatcaa taagtgcttg agcccattag ctagcccagt aactaccaga 360

ttgtgagatg gatgtgtgaa cagttttttt tttgatgtag gactgaaatg tgaacaacag 420

gcgcatgaaa ggctaaatta ggacaatgat aagcagaaat aacttatcct ctctaacact 480

tggcctcaca ttgcccttca cacaatccac acacatccaa tcacaacctc atcatatatc 540

tcccgctaat ctttttttct ttgatctttt tttttttgct tattattttt ttgactttga 600

tctcccatca gttcatcttc ttcttcttct tctgatcaac caagctt 647

<210>99

<211>28

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(28)

<223>

<400>99

gagctcactc actgatttcc attgcttg 28

<210>100

<211>37

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(37)

<223>

<400>100

gcgcatgcat ctagaaatga tccagttaga acaacca 37

<210>101

<211>37

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(37)

<223>

<400>101

gcgcatgctc tagactattt tgctttgtaa atttctg 37

<210>102

<211>792

<212>DNA

<213>点形念珠藻ATCC 29133

<220>

<221>CDS

<222>(5)..(775)

<223>

<400>102

gcgc atg cat cta gaa atg atc cag tta gaa caa cca ctc agt cat caa 49

Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln

1 5 10 15

gca aaa ctg act cca gta ctg aga agt aaa tct cag ttt aag ggg ctt 97

Ala Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu

20 25 30

ttc att gct att gtc att gtt agc gca tgg gtc att agc ctg agt tta 145

Phe Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu

35 40 45

tta ctt tcc ctt gac atc tca aag cta aaa ttt tgg atg tta ttg cct 193

Leu Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro

50 55 60

gtt ata cta tgg caa aca ttt tta tat acg gga tta ttt att aca tct 241

Val Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser

65 70 75

cat gat gcc atg cat ggc gta gta ttt ccc caa aac acc aag att aat 289

His Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn

80 85 90 95

cat ttg att gga aca ttg acc cta tcc ctt tat ggt ctt tta cca tat 337

His Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr

100 105 110

caa aaa cta ttg aaa aaa cat tgg tta cac cac cac aat cca gca agc 385

Gln Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser

115 120 125

tca ata gac ccg gat ttt cac aat ggt aaa cac caa agt ttc ttt gct 433

Ser Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala

130 135 140

tgg tat ttt cat ttt atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att 481

Trp Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile

145 150 155

gcg ttg act att att tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca 529

Ala Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro

160 165 170 175

agt gat aat cta act tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca 577

Ser Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser

180 185 190

tta caa tta ttc tat ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata 625

Leu Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile

195 200 205

ggg ggt tat gtt cag cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att 673

Gly Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile

210 215 220

tgg tgg tca ttt atc acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat 721

Trp Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His

225 230 235

cac gaa tat cct cat att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa 769

His Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys

240 245 250 255

gca aaa tagtctagag catgcgc 792

Ala Lys

<210>103

<211>257

<212>PRT

<213>点形念珠藻ATCC 29133

<400>103

Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala

1 5 10 15

Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe

20 25 30

Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val

50 55 60

Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His

65 70 75 80

Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His

85 90 95

Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln

100 105 110

Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser

115 120 125

Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp

130 135 140

Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser

165 170 175

Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu

180 185 190

Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly

195 200 205

Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp

210 215 220

Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His

225 230 235 240

Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala

245 250 255

Lys

<210>104

<211>26

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>104

gtcgaccctg ctttaatgag atatgc 26

<210>105

<211>27

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(27)

<223>

<400>105

ctcgagcttg gacaatcagt aaattga 27

<210>106

<211>210

<212>DNA

<213>根癌农杆菌

<220>

<221>终止子

<222>(1)..(210)

<223>

<400>106

gtcgaccctg ctttaatgag atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat ttgctttcaa 60

ttctgttgtg cacgttgtaa aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt accgccggtt 120

tcggttcatt ctaatgaata tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa taatattctc 180

cgttcaattt actgattqtc caagctcgag 210

<210>107

<211>37

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(37)

<223>

<400>107

cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtg 37

<210>108

<211>38

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(38)

<223>

<400>108

aagcttggtt gatcagaaga agaagaagaa gatgaact 38

<210>109

<211>652

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(652)

<223>

<400>109

cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtgacc agcgaacgca gaataccttg 60

ttgtgtaata ctttacccgt gtaaatcaaa aacaaaaagg cttttgagct ttttgtagtt 120

gaatttctct ggctgatctt ttctgtacag attcatatat ctgcagagac gatatcattg 180

attatttgag cttcttttga actatttcgt gtaatttggg atgagagctc tatgtatgtg 240

tgtaaacttt gaagacaaca agaaaggtaa caagtgaggg agggatgact ccatgtcaaa 300

atagatgtca taagaggccc atcaataagt gcttgagccc attagctagc ccagtaacta 360

ccagattgtg agatggatgt gtgaacagtt ttttttttga tgtaggactg aaatgtgaac 420

aacaggcgca tgaaaggcta aattaggaca atgataagca gaaataactt atcctctcta 480

acacttggcc tcacattgcc cttcacacaa tccacacaca tccaatcaca acctcatcat 540

atatctcccg ctaatctttt tttctttgat cttttttttt ttgcttatta tttttttgac 600

tttgatctcc catcagttca tcttcttctt cttcttctga tcaaccaagc tt 652

<210>110

<211>29

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>110

gagctctagc gcaatcttat gtggtacaa 29

<210>111

<211>29

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>111

aagcttttct tgaaagtaaa gattgagtc 29

<210>112

<211>1773

<212>DNA

<213>碧冬茄

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1773)

<223>

<400>112

gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60

cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag 120

catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat 180

gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgagqcct ttcttttcct 240

tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc 300

tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat 360

tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg 420

tattcaatag tctatccgag taaattgtaa atttaacaac cattgataat attgacacct 480

actaacatat actagtaaag agaatattaa catggcacat ataatttgat gcaaaatgag 540

tatgatgaaa tttaaaccca aaatctcttg attttgacag tgtcaccttg acttgttaac 600

taataagtca tgttttagtg gcagaaagac aaactcatcc accaactgta tagcaataaa 660

aaatagaaga atcttcctga ggcaaagttt tggaaaaatt aagagtggct gagatttaat 720

ttcaacagga attagttcca cttaactttt aggttacgat acagtgctaa ttaaataact 780

taattgtatt agatatttct tqcacctaaa aaatttaaaa actgaaaaaa ggtagcaatc 840

aaaataaaca aaaggacaaa ataagtgaaa ggtacagcca ccaaccctgg cggctcactg 900

tttgttggtt aaaacgtaga cttacaccta ccaaaatcta caactaaaat gagqcaataa 960

tactttgccc aaaattacca agaaaagaaa aagaaaggaa tcccttaata ttactctcct 1020

ccatttcaca ataaatatcc tagtttgact taaattagag tttaaaaaat gaaagacgac 1080

ttttaaaact tgtaatctaa aataaatcat agttaaatgt gtggctataa atcattgtat 1140

taacggtaaa gtggtaagtt taaaagttaa ttgttttcaa atataaaatt gtactatcat 1200

tctttttgga atggactaat aagaaaacta tgacatccat tatggagcgg agggagtatc 1260

tccttttaac aataaccttt gtcccttcaa ttcaattatc agtatgcaaa cattaaaaat 1320

tattattgat gttaagtacc acatcatcct taatgataga atcatcgtag aacgcttttc 1380

caggcacaca ttcaaactag ttagaccagt accacacatc gaatattcca gacttctttg 1440

tttgaatagt cgactacatt ggataatgga acttctcgaa ttaacttcga attagtcgag 1500

cccaaaataa tatatacgtc gggtggaaaa ctataaaatg tttgacaaaa atgtcaaatt 1560

aatatatcaa tctgcaacaa ccttttcacc ttgagaacgc agctgaaatt ttttacaaag 1620

gtagttggtg aagctagtca gcgaatccca ttaccttcca ctctacctaa cccccttcac 1680

caacaacaaa tttctgtaat ttaaaaacta gccaaaaaag aactctcttt tacaaagagc 1740

caaagactca atctttactt tcaagaaaag ctt 1773

<210>113

<211>39

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(39)

<223>

<400>113

gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagt 39

<210>114

<211>37

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(37)

<223>

<400>114

gcgcatgctc tagattacga attggttact gaattgt 37

<210>115

<211>819

<212>DNA

<213>点形念珠藻ATCC 29133

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(802)

<223>

<400>115

gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagtt agctattatg ttgcaataga 60

gcaattaagt gctaaagaag atactgtttg ggggctggtg attgtcatag taattattag 120

tctttgggta gctagtttgg cttttttact agctattaat tatgccaaag tcccaatttg 180

gttgatacct attgcaatag tttggcaaat gttcctttat acagggctat ttattactgc 240

acatgatgct atgcatgggt cagtttatcg taaaaatccc aaaattaata attttatcgg 300

ttcactagct gtagcgcttt acgctgtgtt tccatatcaa cagatgttaa agaatcattg 360

cttacatcat cgtcatcctg ctagcgaagt tgacccagat tttcatgatg gtaagagaac 420

aaacgctatt ttctggtatc tccatttcat gatagaatac tccagttggc aacagttaat 480

agtactaact atcctattta atttagctaa atacgttttg cacatccatc aaataaatct 540

catcttattt tggagtattc ctccaatttt aagttccatt caactgtttt atttcggaac 600

atttttgcct catcgagaac ccaagaaagg atatgtttat ccccattgca gccaaacaat 660

aaaattgcca acttttttgt catttatcgc ttgctaccac tttggttatc atgaagaaca 720

tcatgagtat ccccatgtac cttggtggca acttccatct gtatataagc agagagtatt 780

caacaattca gtaaccaatt cgtaatctag agcatgcgc 819

<210>116

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(24)

<223>

<400>116

gaattcctgc aatagaatgt tgag 24

<210>117

<211>25

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>

<400>117

ctcgagctta cgagcatttt ctaag 25

<210>118

<211>307

<212>DNA

<213>蚕豆

<220>

<221>终止子

<222>(1)..(307)

<223>

<400>118

gaattcctgc aatagaatgt tgaggtgacc actttctgta ataaaataat tataaaataa 60

atttagaatt gctgtagtca agaacatcag ttctaaaata ttaataaagt tatggccttt 120

tgacatatgt gtttcgataa aaaaatcaaa ataaattgag atttattcga aatacaatga 180

aagtttgcag atatgagata tgtttctaca aaataataac ttaaaactca actatatgct 240

aatgtttttc ttggtgtgtt tcatagaaaa ttgtatccgt ttcttagaaa atgctcgtaa 300

gctcgag 307

<210>119

<211>25

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>

<400>119

gaattcccaa taataatcta cagcc 25

<210>120

<211>25

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>

<400>120

aagcttccat gqcggccgga atttc 25

<210>121

<211>1020

<212>DNA

<213>食用番茄

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1020)

<223>编码β-羟化酶的核酸

<400>121

aagcttccat ggcggccgga atttcagcct ccgctagttc ccgaaccatt cgcctccgtc 60

ataacccgtt tctcagtcca aaatccgcct caaccgcccc gccggttctg ttcttctctc 120

cgttaactcg caattttggc gcaattttgc tgtctagaag aaagccgaga ttggcggttt 180

gttttgtgct ggagaatgag aaattgaata gtactatcga aagtgagagt gaagtaatag 240

aggatcggat acaagtagag attaatgagg agaagagttt agctgccagt tggctggcgg 300

agaaattggc gaggaagaaa tcggagaggt ttacttatct tgtggcagct gtgatgtcta 360

gtttggggat tacttctatg gcgattttgg cggtttatta cagattttca tggcaaatgg 420

agggtggaga agtgcctttt tctgaaatgt tagctacatt cactctctcg tttggcgctg 480

ccgtaggaat ggagtactgg gcgagatggg ctcatagagc actatggcat gcttctttat 540

ggcacatgca cgagtcgcac catagaccaa gagaaggacc ttttgagatg aacgacgttt 600

tcgccataac aaatgctgtt ccagctatag gtcttctttc ctacggtttc ttccataaag 660

ggatcgtccc tggcctctgt ttcggcgctg gattggggat cacagtattt gggatggctt 720

acatgttcgt tcacgatgga ctggttcata agagatttcc cgtagggcct attgccaacg 780

tgccttactt tcggagggta gctgcagcac atcagcttca tcactcggac aaatttgatg 840

gtgtcccata tggcttgttt ctaggaccta aggaattgga agaagtagga ggacttgaag 900

agttagaaaa ggaagtcaac cgaaggatta aaatttctaa gggattatta tgatcaaaag 960

atacgtctga taataataaa atgcgattgt atttaggctg tagattatta ttgggaattc 1020

<210>122

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(24)

<223>

<400>122

gagctctagc gcaatcttat gtgg 24

<210>123

<211>22

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>123

ccatggttct cacttctgta tg 22

<210>124

<211>1802

<212>DNA

<213>碧冬茄

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1802)

<223>

<400>124

gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60

cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag 120

catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat 180

gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgaggcct ttcttttcct 240

tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc 300

tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat 360

tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg 420

tattcaatag tctatccgag taaattgtaa atttaacaac cattgataat attgacacct 480

actaacatat actagtaaag agaatattaa catggcacat ataatttgat gcaaaatgag 540

tatgatgaaa tttaaaccca aaatctcttg attttgacag tgtcaccttg acttgttaac 600

taataagtca tgttttagtg gcagaaagac aaactcatcc accaactgta tagcaataaa 660

aaatagaaga atcttcctga ggcaaagttt tggaaaaatt aagagtggct gagatttaat 720

ttcaacagga attagttcca cttaactttt aggttacgat acagtgctaa ttaaataact 780

taattgtatt agatatttct tgcacctaaa aaatttaaaa actgaaaaaa ggtagcaatc 840

aaaataaaca aaaggacaaa ataagtgaaa ggtacagcca ccaaccctgg cggctcactg 900

tttgttggtt aaaacgtaga cttacaccta ccaaaatcta caactaaaat gaggcaataa 960

tactttgccc aaaattacca agaaaagaaa aagaaaggaa tcccttaata ttactctcct 1020

ccatttcaca ataaatatcc tagtttgact taaattagag tttaaaaaat gaaagacgac 1080

ttttaaaact tgtaatctaa aataaatcat agttaaatgt gtggctataa atcattgtat 1140

taacggtaaa gtggtaagtt taaaagttaa ttgttttcaa atataaaatt gtactatcat 1200

tctttttgga atggactaat aagaaaacta tgacatccat tatggagcgg agggagtatc 1260

tccttttaac aataaccttt gtcccttcaa ttcaattatc agtatgcaaa cattaaaaat 1320

tattattgat gttaagtacc acatcatcct taatgataga atcatcgtag aacgcttttc 1380

caggcacaca ttcaaactag ttagaccagt accacacatc gaatattcca gacttctttg 1440

tttgaatagt cgactacatt ggataatgga acttctcgaa ttaacttcga attagtcgag 1500

cccaaaataa tatatacgtc gggtggaaaa ctataaaatg tttgacaaaa atgtcaaatt 1560

aatatatcaa tctgcaacaa ccttttcacc ttgagaacac agctgaaatt ttttacaaag 1620

gtagttggtg aagctagtca gcgaatccca ttaccttcca ctctacctaa cccccttcac 1680

caacaacaaa tttctgtaat ttaaaaacta gccaaaaaag aactctcttt tacaaagagc 1740

caaagactca atctttactt tcaagaaaag ctttgcaatt catacagaag tgagaaccat 1800

gg 1802

<210>125

<211>1033

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1033)

<223>P76

<400>125

aggtgcatga ccaagtaaca atttgattcc tttccagcat aacgtcatgt tggttgcaaa 60

aagaaggcaa agtagagcaa gcaagcaagc aaagcatttt tcttatttta tattttgttg 120

cggattccac cacccacttg aaaaattgac atgtcacaat gatttcgtat cctagtcttt 180

tattatttaa cactctcaca atcccattac tctacacctc tttcattaag tcaacacacg 240

gttttcaaaa atccactacc ctcccaccac ctagaatctt ttgttaccta ccaacaccct 300

cctttgttct ctttatatat tggtccaact aaatcaataa gggaaagcat ccttttggtt 360

ggaggaattg ctttcattct cactctttgt gtgttgatca atggactagc taataacaag 420

ttcctcctct atatatttca aaagaatgga acagaaacat aaacgaaaga cagagtacct 480

gatgttgatg attcattgtc tgtctggagc tcccaaatgc cttttatgct tacatattca 540

taaccaacaa cggctattaa ttataaacca aaaacacgaa ataagtttgt agcaaagtga 600

aattaggaat cttggagatg gatccattag tagtaggata ataggatatg atggaatttg 660

gttggggaac agtgataact tacgcttgct tccggcgccg ggaaagttgg aaaacctaca 720

aagtacagaa atggatctgg gccttgaagt gggcttttta ttaaagaaaa aaatacatct 780

ccgttatcaa tcaccatctt cttctatcta caaattaaag aaggtaacaa cagaacgtgg 840

tggatcatgt ggttaggcat taattatttg ctttgtttcg ccgttttggt aacacacaga 900

cacagttccg gtaagagctt ttgcagccac tctttatagt tatttagaat tggcgatcga 960

atcaatctca ctccctccct cccttaagtc ttgttgaatc tgctgaattg ttttataaag 1020

agttactttg gca 1033

<210>126

<211>19

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>126

tgccaaagta actctttat 19

<210>127

<211>19

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>127

aggtgcatga ccaagtaac 19

<210>128

<211>996

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(996)

<223>

<400>128

ggcacgagcc tctctctatt tttacacttc aatggcggca gcaattgctg tcccttgtag 60

ctcaagacca tttggcttag gtcgaatgcg gttacttggt cataaaccca caaccataac 120

ttgtcacttc cccttttctt tttctatcaa atcatttacc ccaattgtta ggggcagaag 180

atgtactgtt tgttttgttg ccggtggcga cagtaatagt aacagtaata ataatagtga 240

cagtaatagt aataatccgg gtctggattt aaacccggcg gttatgaacc gtaaccgttt 300

ggttgaagaa aaaatggaga ggaaaaaatc ggaacgattt acttatcttg ttgcagctat 360

tatgtctact tttggaatta cttcaatggc ggttatggcg gtttattacc ggttttcatg 420

gcaaatggag ggtggagaaa ttccttatgt ggagatgttt ggtacatttg ctctctccgt 480

tggtgctgcg gtaggaatgg agtattgggc aagatgggct catgaggcac tatggcatgc 540

ttctttgtgg cacatgcatg agtcacacca taagccacga gaaggtccgt ttgagcttaa 600

tgatgtgttt gctataacaa atgcggtccc ggccattgcg ttgcttagtt atgggttttt 660

ccacaaaggc ataattccgg gtctttgttt tggggcggga ctgggaatta cggtgtttgg 720

aatggcgtat atgttcgtcc acgacgggct agttcacaga agattccaag tgggtccgat 780

tgcgaatgtt ccctatcttc gaagggttgc agcggctcat cagctgcatc acacggaaaa 840

atttaatggt gttccttatg gcttgttctt gggacctaag gagctagaag aagtgggtgg 900

tacggaagaa ttggacaagg agattcaaag aagaattaaa ttgtataata atactaaata 960

aataaatttt gtataaaatt aatataattt aatgat 996

<210>129

<211>18

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(18)

<223>

<400>129

atggaagctc ttctcaag 18

<210>130

<211>18

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(18)

<223>

<400>130

accttaccta aaacattt 18

<210>131

<21I>1045

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1045)

<223>

<400>131

gtcgacaggt gcatgaccaa gtaacaattt gattcctttc cagcataacg tcatgttggt 60

tgcaaaaaga aggcaaagta gagcaagcaa gcaagcaaag catttttctt attttatatt 120

ttgttgcgga ttccaccacc cacttgaaaa attgacatgt cacaatgatt tcgtatccta 180

gtcttttatt atttaacact ctcacaatcc cattactcta cacctctttc attaagtcaa 240

cacacggttt tcaaaaatcc actaccctcc caccacctag aatcttttgt tacctaccaa 300

caccctcctt tgttctcttt atatattggt ccaactaaat caataaggga aagcatcctt 360

ttggttggag gaattgcttt cattctcact ctttgtgtgt tgatcaatgg actagctaat 420

aacaagttcc tcctctatat atttcaaaag aatggaacag aaacataaac gaaagacaga 480

gtacctgatg ttgatgattc attgtctgtc tggagctccc aaatgccttt tatgcttaca 540

tattcataac caacaacggc tattaattat aaaccaaaaa cacgaaataa gtttgtagca 600

aagtgaaatt aggaatcttg gagatggatc cattagtagt aggataatag gatatgatgg 660

aatttggttg gggaacagtg ataacttacg cttgcttccg gcgccgggaa agttggaaaa 720

cctacaaagt acagaaatgg atctgggcct tgaagtgggc tttttattaa agaaaaaaat 780

acatctccgt tatcaatcac catcttcttc tatctacaaa ttaaagaagg taacaacaga 840

acgtggtgga tcatgtggtt aggcattaat tatttgcttt gtttcgccgt tttggtaaca 900

cacagacaca gttccggtaa gagcttttgc agccactctt tatagttatt tagaattggc 960

gatcgaatca atctcactcc ctccctccct taagtcttgt tgaatctgct gaattgtttt 1020

ataaagagtt actttggcac ccggg 1045

Claims

1.通过培养遗传修饰的非人生物制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰的生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性，而其修饰的β环化酶活性是由于β环化酶造成，其含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

2.如权利要求1的方法，其中使用野生型具有酮酶活性而遗传修饰使其酮酶活性相对于野生型增加的非人生物。

3.如权利要求2的方法，其中通过提高编码酮酶的核酸相对于野生型的基因表达来增加酮酶活性。

4.如权利要求3的方法，其中通过向生物中插入编码酮酶的核酸来增加基因表达。

5.如权利要求4的方法，其中插入的编码酮酶的核酸所编码的酮酶含有SEQ ID NO：4氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：4序列至少有70％的同一性。

6.如权利要求1的方法，其中使用野生型不具有酮酶活性而遗传修饰使其相对于野生型造成酮酶活性的非人生物。

7.如权利要求6的方法，其中使用转基因表达酮酶的遗传修饰生物。

8.如权利要求6或7的方法，其中通过向生物中插入编码酮酶的核酸来造成基因表达。

9.如权利要求8的方法，其中插入的核酸编码的酮酶含有SEQ ID NO：4氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：4序列至少有70％的同一性。

10.如权利要求5或9的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：3的核酸。

11.如权利要求1至10中任一项的方法，其中使用野生型已经具有β环化酶活性而遗传修饰使其β环化酶活性相对于野生型增加的生物。

12.如权利要求11的方法，其中通过提高编码β环化酶的核酸相对于野生型的基因表达来增加β环化酶活性，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

13.如权利要求12的方法，其中通过向生物中插入编码β环化酶的核酸来增加基因表达，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

14.如权利要求1至10中任一项的方法，其中使用野生型不具有β环化酶活性而遗传修饰使其相对于野生型造成β环化酶活性的生物。

15.如权利要求14的方法，其中使用转基因表达β环化酶的遗传修饰生物，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

16.如权利要求14或15的方法，其中通过向生物中插入编码β环化酶的核酸来造成基因表达，所述β环化酶含有SEQ ID NO：2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2序列至少有70％的同一性。

17.如权利要求13或16的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：1的核酸。

18.如权利要求1至17中任一项的方法，其中使用相对于野生型额外具有增加的或造成的羟化酶活性的非人生物。

19.如权利要求18的方法，其中通过增加或造成编码羟化酶的核酸相对于野生型的基因表达来额外增加或造成羟化酶活性。

20.如权利要求19的方法，其中通过向生物中插入编码羟化酶的核酸来增加或造成基因表达。

21.如权利要求20的方法，其中插入的编码羟化酶的核酸，其编码的羟化酶含有SEQ ID NO：6氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：6序列至少有70％的同一性。

22.如权利要求21的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：5的核酸。

23.如权利要求1至22中任一项的方法，其中使用相对于野生型额外具有增加的或造成的选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性中至少一种的生物。

24.如权利要求23的方法，其中通过增加选自编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸、编码MinD蛋白的核酸中至少一种相对于野生型的基因表达来额外增加或造成至少一种活性。

25.如权利要求24的方法，其中通过向非人生物中插入选自编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸、编码MinD蛋白的核酸中至少一种来增加或造成至少一种核酸的基因表达。

26.如权利要求25的方法，其中插入编码HMG-CoA还原酶的核酸，其编码的HMG-CoA还原酶含有SEQ ID NO：8氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：8序列至少有20％的同一性。

27.如权利要求26的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：7的核酸。

28.如权利要求25的方法，其中插入编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸，其编码的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶含有SEQ ID NO：10氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：10序列至少有20％的同一性。

29.如权利要求28的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：9的核酸。

30.如权利要求25的方法，其中插入编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，其编码的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶含有SEQ ID NO：12氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：12序列至少有20％的同一性。

31.如权利要求30的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：11的核酸。

32.如权利要求25的方法，其中插入编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸，其编码的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶含有SEQ IDNO：14氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：14序列至少有20％的同一性。

33.如权利要求32的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：13的核酸。

34.如权利要求25的方法，其中插入编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸，其编码的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶含有SEQ ID NO：16氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：16序列至少有20％的同一性。

35.如权利要求34的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：15的核酸。

36.如权利要求25的方法，其中插入编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的牻牛儿基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO：18氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：18序列至少有20％的同一性。

37.如权利要求36的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：17的核酸。

38.如权利要求25的方法，其中插入编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的法呢基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO：20氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQID NO：20序列至少有20％的同一性。

39.如权利要求38的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：19的核酸。

40.如权利要求25的方法，其中插入编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO：22氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：22序列至少有20％的同一性。

41.如权利要求40的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：21的核酸。

42.如权利要求25的方法，其中插入编码八氢番茄红素合酶的核酸，其编码的八氢番茄红素合酶含有SEQ ID NO：24氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：24序列至少有20％的同一性。

43.如权利要求42的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：23的核酸。

44.如权利要求25的方法，其中插入编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸，其编码的八氢番茄红素去饱和酶含有SEQ ID NO：26氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：26序列至少有20％的同一性。

45.如权利要求44的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：25的核酸。

46.如权利要求25的方法，其中插入编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸，其编码的ζ-胡萝卜素去饱和酶含有SEQ ID NO：28氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQID NO：28序列至少有20％的同一性。

47.如权利要求46的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：27的核酸。

48.如权利要求25的方法，其中插入编码crtISO蛋白的核酸，其编码的crtISO蛋白含有SEQ ID NO：30氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：30序列至少有20％的同一性。

49.如权利要求48的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：29的核酸。

50.如权利要求25的方法，其中插入编码FtsZ蛋白的核酸，其编码的FtsZ蛋白含有SEQ ID NO：32氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：32序列至少有20％的同一性。

51.如权利要求50的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：31的核酸。

52.如权利要求25的方法，其中插入编码MinD蛋白的核酸，其编码的MinD蛋白含有SEQ ID NO：34氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO：34序列至少有20％的同一性。

53.如权利要求52的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO：33的核酸。

54.如权利要求1至53中任一项的方法，其中在培养后收集遗传修饰的生物并随后从生物中分离酮类胡萝卜素。

55.如权利要求1至54中任一项的方法，其中使用起始生物可天然产生或能够通过遗传互补或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素的生物。

56.如权利要求1至55中任一项的方法，其中使用的生物是微生物或植物。

57.如权利要求56的方法，其中使用的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。

58.如权利要求57的方法，其中微生物选自埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属、集胞藻属蓝细菌、假丝酵母属、酵母属、汉逊酵母属、法夫酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属、阿舒囊霉属、脉孢菌属、布拉霉属、须霉属、镰孢霉属、红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属。

59.如权利要求56的方法，其中使用的生物为植物。

60.如权利要求59的方法，其中使用的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科或紫罗兰科。

61.如权利要求60的方法，其中使用的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maratia、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物。

62.如权利要求1至61中任一项的方法，其中酮类胡萝卜素选自虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花玉红质和金盏花黄质。

63.遗传修饰的非人生物，其中该遗传修饰，

A.对于已经具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其酮酶活性，且

B.对于不具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比造成酮酶活性，且其中该遗传修饰

C.对于已经具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其β环化酶活性，且

D.对于不具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比造成β环化酶活性，

64.如权利要求63的遗传修饰的生物，所述生物的起始生物可天然产生或能够通过遗传互补产生类胡萝卜素。

65.如权利要求63或64的遗传修饰的生物，选自微生物或植物。

66.如权利要求65的遗传修饰的生物，其中微生物选自细菌、酵母、藻类或真菌。

67.如权利要求66的遗传修饰的生物，其中微生物选自埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属、集胞藻属蓝细菌、假丝酵母属、酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属、阿舒囊霉属、脉孢菌属、布拉霉属、须霉属、镰孢霉属、红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属。

68.如权利要求65的遗传修饰的生物，其中使用的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科及紫罗兰科。

69.如权利要求68的遗传修饰的生物，其中使用的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maratia、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物。

70.如权利要求63至69中任一项的遗传修饰生物作为饲料或食品的用途。

71.如权利要求63至69中任一项的遗传修饰生物在生产含酮类胡萝卜素提取物或生产饲料添加剂或食品添加剂中的用途。