CN1717173A - 花瓣中的4－酮类胡萝卜素 - Google Patents

Abstract

公开了含有4－酮－β－紫罗烯环的类胡萝卜素化合物如虾青素或角黄素在高等植物花中的形成，并且特别是在高等植物花的花冠和繁殖部分，其中所述高等植物的花瓣产生含有β－紫罗烯环的类胡萝卜素化合物如β－胡萝卜素或玉米黄素，但是否则就不产生虾青素或角黄素。将受启动子调控的一个或多个基因插入(转化)高等植物。所插入的基因编码嵌合酶，包括(a)至少为酮酶的类胡萝卜素形成酶。该基因被可操作地连接于(b)质体定向转运肽。一些将被转化的高等植物在其转化前的花中至少产生玉米黄素或β－胡萝卜素，而其它植物在转化之前如果有的话只产生极少量的有色类胡萝卜素色素，并且用类胡萝卜素形成基因盒进行转化。描述了转化方法和转化植物的用途。

Description

花瓣中的4-酮类胡萝卜素

相关申请的交互参照

本申请是2002年12月19日申请的申请系列号为No.10/325,265的专利的部分延续，并且该申请要求2002年3月21日申请的美国临时申请系列号No.60/366,444的优先权。

发明领域

本发明涉及类胡萝卜素生物合成和虾青素的生物技术生产。更加具体地，本发明涉及一种基因在花中优选地表达，并且特别是在花冠和花的繁殖部分如花瓣中优选地表达，该基因编码一种酶，这种酶可以将含有β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物如β-胡萝卜素转化成含有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物，从而使花瓣积累含有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。

背景技术

类胡萝卜素是天然色素，与在活生物体中所见到的许多黄色、橙色和红色有关。类胡萝卜素是40-碳(C40)萜类化合物，通常含有连接到一起的8个异戊二烯(C5)单元。在分子的中心单元的连接是反向的。“酮类胡萝卜素”是在分子的紫罗烯环部分含有酮基团的类胡萝卜素色素的总称，而“羟基类胡萝卜素”是指在紫罗烯环中含有羟基基团的类胡萝卜素色素。本公开中通篇将使用常用名和缩写，在第一次出现的常用名之后的括弧中给出IUPAC-建议的半系统命名。

类胡萝卜素是由五碳原子代谢的前体物异戊烯焦磷酸(IPP)合成的。至少有两种已知的生物合成途径形成IPP，其中所述IPP是普遍存在的异戊二烯单元。

一条途径开始于由乙酰辅酶A通过HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA)形成的第一个特异的萜类前体物甲羟戊酸，其自身转化成异戊烯焦磷酸(IPP)。在这条途径中，IPP与其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)缩合产生含有10个碳原子的牻牛儿基焦磷酸(GPP)。IPP与GPP缩合产生含有15个碳原子的焦磷酸法呢酯(FPP)。FPP通过与IPP再缩合产生具有20个碳原子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。2个GGPP分子彼此缩合产生无色的八氢番茄红素，这是最初的类胡萝卜素。

研究还表明了存在另外一条旁路途径，为甲羟戊酸非依赖的IPP形成途径，其最初仅在几种真细菌物种、绿藻和高等植物的质体中进行了描述。在这条旁路途径中第一个反应是丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的转酮酶型缩合反应，以产生作为中间体的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。中间体DXP被转化成2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸，其随后转化成IPP。[见Harker等，FEBS Letters，448：115-119(1999)]。

通过一系列去饱和反应，八氢番茄红素被转化成六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、四氢番茄红素并最终被转化为番茄红素。随后，通过环化反应将番茄红素转化为含有2个β-紫罗烯环的β-胡萝卜素。将酮基团和/或羟基基团引入β-胡萝卜素的每个环中从而合成角黄素、玉米黄素、虾青素。[见Britton，Plant Pigments，Goodwin，T.W.编辑，London，Academic Press，(1988)，pp.133-182；还见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584 (1995)]。

已经表明羟化酶可将角黄素转化成虾青素。同样地，已经表明酮酶可将玉米黄素转化成虾青素。酮酶也可将β-胡萝卜素转化成角黄素并且羟化酶也可将β-胡萝卜素转化成玉米黄素。[见Kajiwara等，Plant Mol.Biol.，29：343-352(1995)；和Fraser等，Eur.J.Biochem.，252：229-236(1998)]。

来自对橙黄农杆菌(A.aurantiacum)和噬夏孢欧文氏菌(E.Uredovora)的研究发现表明编码酮酶和羟化酶的基因是双功能的，因为其中的每个酶都能够与一个β-环结合并起反应，然后释放产物并重新结合、反应并释放第二产物。有几种不同的从β-胡萝卜素产生虾青素的生物合成途径，对于中间的类胡萝卜素的每次转化，仅使用酮酶和羟化酶就能够产生虾青素[见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。

角黄素，其结构式示于下，是红叶黄素类胡萝卜素，它通常不存在于花瓣而发现于一些蘑菇和红鹳的羽毛中。角黄素用作食物色素。它也被用作口服防晒剂。

角黄素

虾青素，一种红叶黄素，其结构式显示如下，广泛地被用作培养的鱼类和贝壳类的着色剂。虾青素的全部生物医学特性仍在阐述之中，但最初的结果表明它在癌症和肿瘤预防中具有重要作用，而且引起免疫系统的阳性反应。[见Tanaka等，Carcinogenesis 15(1)：15-19(1994)，Jyonouchi等，Nutrition and Cancer 19(3)：269-280(1993)和Jyonouchi等，Nutrition andCancer 16(2)：93-105(1991)]。

虾青素

虾青素是多种海产动物特有的一种类胡萝卜素，包括鱼如鲑鱼和鲷，和有壳的水生动物如蟹、龙虾和虾。由于动物通常不能生物合成类胡萝卜素，它们从所摄食的微生物或植物中获得那些类胡萝卜素。由于这个原因，虾青素已经被广泛用作食物添加剂以达到增强所养殖的鱼和有壳的水生动物如鲷、鲑鱼和虾等等产生红色的目的。此外，虾青素作为可以去除体内产生的活性氧的抗氧化剂正在引起人们的注意，活性氧是癌的诱因[见Matuno等，化学和生物体(Chemistry and Organisms)，28：219-227(1990)]。

与通过有机合成方法获得虾青素相比，生物来源的虾青素，如从甲壳动物、酵母和绿藻来源的虾青素受到产量低和提取方法费用高的限制。然而，一般的合成方法会产生不需要的副产品。因此，期望找到相对廉价的(3S，3′S)-虾青素资源，被用作水产养殖中的食物添加剂并且作为有价值的化学试剂用于其它工业用途。

已经发现虾青素具有不同的生物学功能。它是维生素A的前体，能够作为自由基和活性氧的消除剂和/或淬灭剂起作用，这表面上看来可以预防癌症并且已经表明可以增强免疫反应。[见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995).]。从对虾青素特性的研究看出，类胡萝卜素对于制药、″医疗滋养食品″(作为维生素A前体和其它特性)和食品工业具有巨大的经济利益。

虾青素的来源包括甲壳动物如南冰洋磷虾、酵母Phaffia培养产物、绿藻中的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)培养产物和通过有机合成方法得到的产物。然而，当使用甲壳动物如磷虾等时，在收获和提取过程中，需要大量的工作和经费用于从污染物如脂类等中分离虾青素。而且，由于酵母具有坚硬的细胞壁并且虾青素的产量低，对于酵母Phaffia培养产物需要大量经费以收集和提取虾青素。

虽然，在各种生物体中雨生红球藻是可以产生高水平虾青素(干重为0.5-2％)的生物体之一，但这种藻类合成的虾青素大部分是酯化的。此种酯化可以降低它对鱼类的生物利用率。而且雨生红球藻需要高光照水平以形成虾青素。

由于这些原因，在成本方面，生物来源的虾青素注定要低于通过有机合成方法获得的虾青素。然而，鉴于虾青素作为鱼类和有壳水生动物的食物和作为食物添加剂，有机合成方法存在反应过程中产生副产物问题。通过有机合成方法获得的产物可能与一些消费者对于天然产品的偏爱相悖。因此，期望能够提供一种廉价的虾青素，它没有副产品的污染并且是从生物资源产生的。

增加生物系统中虾青素或角黄素产量的一个方法是使用遗传工程技术。已经报道了适于这种转化的基因。

如此处所使用，酮酶(β-胡萝卜素酮酶或β-胡萝卜素加氧酶或仅仅是酮酶)是指一种酶，该酶使酮(氧代)基团加入到类胡萝卜素β-紫罗烯环的4位碳原子上，使得能够在类胡萝卜素生物合成途径的较后时期形成多种酮类胡萝卜素化合物。存在几种来源的基因可编码能够使类胡萝卜素β-紫罗烯环转化成为存在于角黄素和虾青素中的4-酮-β-紫罗烯环的酮酶。

例如，Misawa等(见，美国专利号.6,150,130)阐述的DNA序列中包括一个从海洋细菌农杆菌属橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum sp.nov.MK1)或产碱菌(Alcaligenes sp.PC-1)分离的编码一种称做crtW的基因，该基因用于经由4-酮玉米黄素的以类胡萝卜素β-紫罗烯环化合物作为底物而产生虾青素。Cunningham(见，WO 99/61652)报道了从夏侧金盏花(Adonis aestivalis)分离编码具有酮酶活性的蛋白质的DNA，该植物是一种具有深红色花的植物，其部分原因是酮类胡萝卜素虾青素的积累。

已经从绿藻中的雨生红球藻分离了能够将类胡萝卜素β-紫罗烯环化合物转化成虾青素的两个不同的基因。克隆的cDNA表明它们编码将β-紫罗烯环亚甲基基团转化成β-紫罗烯环酮基基团的不同β-胡萝卜素酮酶(因此作为“酮酶”起作用)。

有一个基因产物已经被报道，其编码能够从宿主微生物或植物产生(3S，3′S)-虾青素的具有β-C-4-加氧酶活性的多肽，被第一个研究组命名为bkt。[见Kajiwara等，Plant Molecular Biology，29：343-352(1995)；和Kajiwara等，美国专利号5,910,433]。第二个虾青素形成基因和它的翻译产物被分离编码合成虾青素的酶的基因的研究者称为crtO。[见Harker等，FEBS Letters，404：129-134(1997)和Lotan等，FEBS Letters，364：125-128(1995)；和Hirschberg等，美国专利号5,965,795]。Hirschberg研究组的crtO cDNA与Kajiwara研究组的bkt基因具有大约75-76％的序列同一性。CrtO基因的蛋白质产物与bkt基因编码的蛋白质产物具有大约78％的序列同一性。Lotan等的论文报道了在试图用雨生红球藻的crtO基因产物转化大肠杆菌表达的玉米黄素时出现了阴性结果。

在海洋细菌橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)和产碱菌PC-1中还发现了编码转化类胡萝卜素β-紫罗烯环化合物如玉米黄素或β-胡萝卜素形成虾青素的酶的基因。这些基因和它们的酶产物，称为crtW，表现出彼此大约75％的同一性，并且与雨生红球藻的bkt基因产物具有大约37％的同源性。这三种β-胡萝卜素酮酶具有四个高度保守的区域。[见Kajiwara等，Plant Mol.Biol.，29：343-352(1995)；也见Misawa等，美国专利号5,811,273和5,972,690]。

如此处所用，术语“羟化酶”是指基因或所编码的这样的酶，该酶能够使羟基加入到类胡萝卜素β-紫罗烯环的3-位碳原子上，在类胡萝卜素生物合成途径的较后时期，形成玉米黄素或另一种羟基化的中间体。更明确地说，预期的羟化酶(或β-胡萝卜素羟化酶)是这样一种酶，它能够将β-胡萝卜素或4-酮-β-胡萝卜素转化成一种或多种在β-环3-位上发生羟基化的化合物。

已经鉴定了编码能够将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化成3-羟基-β-紫罗烯环的羟化酶的不同的来源。噬夏孢欧文氏菌的crtZ基因编码一种此类羟化酶。[见Kajiwara等，Plant Mol.Biol.，29：343-352(1995)]。一种适合的羟化酶也可以由草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的crtZ基因编码[见Ausich等，美国专利号5,684,238(1997)]。

在产虾青素细菌橙黄农杆菌中鉴定了类胡萝卜素生物合成基因簇。该基因簇中的crtZ基因鉴定为可编码β-胡萝卜素羟化酶[见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。在Misawa等的公开文件中，将橙黄农杆菌的crtZ基因导入积累全-反式-β-胡萝卜素的大肠杆菌转化体中。如此形成的转化体产生玉米黄素。

尽管实验数据没有显示虾青素的最终产量，但是那些数据确实证明了橙黄农杆菌crtZ基因编码羟化酶。因为橙黄农杆菌是虾青素产生菌，可以推断出已经证明具有双功能的羟化酶能够将角黄素转化为虾青素。至少，该羟化酶可以将β-胡萝卜素转化为玉米黄素，玉米黄素是由β-胡萝卜素到虾青素的类胡萝卜素生物合成途径中的中间体。

此外，已经在产碱菌PC-1株中鉴定出了与橙黄农杆菌crtZ基因具有大约90％同一性的crtZ基因。橙黄农杆菌和欧文氏菌属中的crtZ的功能是作为羟化酶[见Misawa，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。

已经从橙黄农杆菌分离了产生虾青素的类胡萝卜素生物合成基因簇。已经命名了5个在该基因簇中具有相同取向的胡萝卜素源基因，分别是crtW、crtZ、crtY、crtI和crtB。除了crtB之外每个crt基因的终止密码子与下一个crt基因的起始密码子重叠[见Misawa，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。在美国专利号5,811,273和5,972,690中，公开了橙黄农杆菌和产碱菌PC-1株中编码酮酶、羟化酶和番茄红素环化酶的crtW、crtZ和crtY基因的DNA序列。

从紫色光合作用细菌夹膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中也已经克隆到了编码类胡萝卜素生物合成途径的酶的基因簇[见Armstrong等，Mol.Gen.Genet.，216：254-268(1989)]。

已经从非光合作用细菌草生欧文氏菌中克隆得到了从普遍前体物如焦磷酸法呢酯和牻牛儿基焦磷酸生物合成类胡萝卜素的相似基因簇。从草生欧文氏菌鉴定的基因簇的成员包括称为编码GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶(4H)、番茄红素环化酶和β-胡萝卜素羟化酶的基因。[见Ausich等，美国专利号5,684,238；Sandmann等，FEMSMicrobiol.Lett.，71：77-82(1990)；Hundle等，Photochem.Photobiol.，54：89-93(1991)；和Schnurr等，FEMS Microbiol.Lett.78：157-162(1991)]。

而且已经从噬夏孢欧文氏菌中克隆得到了另一个类胡萝卜素生物合成基因簇。在噬夏孢欧文氏菌中，这些基因经鉴定为crtE、crtB、crtI和crtZ。[见Misawa等，美国专利号5,429,939；和Misawa等，J.Bacteriol.，172：6704-6712(1990)]。

在欧文氏菌属和红细菌属中，crtE编码GGPP合酶。然而，在橙黄农杆菌中不存在CrtE。尽管上述基因簇编码的酶的底物在物种之间是不同的，但已经证明在从存在的类胡萝卜素前体物产生虾青素时，较后面的crt基因具有重要的作用。海洋农杆菌属中虾青素的产生暗示如在多种物种中鉴定的那样，crtW和crtZ基因产物主要负责通过酮类胡萝卜素中间体将β-胡萝卜素转化为虾青素。[见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。

Fraser等人在Eur.J.Biochem.，252：229-236(1998)中报道的研究表明，在体外的实验研究中，与玉米黄素相比，对于橙黄农杆菌酮酶而言β-胡萝卜素和其他可能的氧化β-胡萝卜素衍生物是优选的底物。那些作者还报道了与β-胡萝卜素或其他氧化β-胡萝卜素衍生物相比，橙黄农杆菌羟化酶对于在一个环上具有羟基并且在另一个环上具有酮基的化合物(3-羟基-β-胡萝卜素-4-酮)仅具有不太显著的优先性。关于体外所观察到的底物优先性是否能应用于橙黄农杆菌体内或用那些酶的基因转化的植物体内，仍然是未知的和不可预测的。关于由其它有机体编码的酶在转化入高等植物细胞后是否与橙黄农杆菌的酶在体外或体内发挥相似作用也是未知的和不可预测的。

在许多植物中，番茄红素是类胡萝卜素生物合成的分支点。因此，一些植物的番茄红素被加工成β-胡萝卜素和玉米黄素，并且有时是玉米黄素二糖苷，而番茄红素的剩余部分形成α-胡萝卜素和另一种羟化的化合物叶黄素(3，3′-二羟基-α-胡萝卜素)。

在高等植物即被子植物中，类胡萝卜素发现于质体，即叶绿体和色质体。质体是细胞内贮存体，与液泡不同，它是由双层膜包绕而不是单层膜。质体如叶绿体也可以含有它们自己的DNA和核糖体，能独立繁殖并合成它们自己的一些蛋白质。因此质体具有线粒体的一些特性。

在叶子中，类胡萝卜素通常存在于叶绿体的基粒，在那里它们提供光防护功能。β-胡萝卜素和叶黄素是主要的类胡萝卜素，以少量的环氧化类胡萝卜素堇菜黄质和新黄质存在。类胡萝卜素在花瓣正在发育的色质体中积聚，通常伴随着叶绿素的消失。如在花瓣中一样，随着类胡萝卜素从叶绿体产生，它们出现在果实的色质体中。

在产生β-胡萝卜素的典型生物合成途径中，一些酶将中央类异戊二烯途径中的牻牛儿基牻牛儿基焦磷盐通过八氢番茄红素和番茄红素转化成β-胡萝卜素。玉米黄素、角黄素和虾青素属于来源于β-胡萝卜素的叶黄素。参与将八氢番茄红素转化为胡萝卜素的大多数酶和叶黄素是不稳定的，作为膜相关的蛋白质在溶解后丧失活性[见Breyer等，Eur.J.Biochem.，153：341-346(1985)；也见Hirschberg等，美国专利号5,965,795(1999)]。

目前，仅少数植物被广泛地用于商业着色的类胡萝卜素生产。然而，在大多数这些植物中着色的类胡萝卜素合成的产量相对较低，并且导致类胡萝卜素的生产是昂贵的。另外，角黄素和虾青素不是如此产生的类胡萝卜素。

Hirschberg等人的美国专利号5,965,795中教授了在转基因烟草植物的蜜腺中可以产生虾青素。那些转基因植物是利用载体通过根癌农杆菌(Argobacterium tumifaciens)-介导的烟草植物的转化制备的，其中载体含有雨生红球藻来源的酮酶编码基因，命名为crtO，同时还含有番茄来源的Pds基因作为启动子并编码一段前导序列。那些研究者称Pds基因可以直接在含有叶绿体和/或色质体的植物组织中转录并表达。

来自于转化的结果表明了五种含酮类胡萝卜素的产生，包括蜜腺中的虾青素。那些结果表明在转化植物的花中发现的类胡萝卜素大约75％含有酮基。然而，关于存在于花中的最初类胡萝卜素的量没有给出证据，也没有给出实际上所产生的总类胡萝卜素的量，也没有给出在花瓣和花的繁殖部分中类胡萝卜素的产量。

万寿菊属是菊科(Compositae)植物之一，也称为菊科(Asteraceae)，包括约30种具有强烈香味的一年生或多年生草本植物。万寿菊属是天然地从亚利桑那州和新墨西哥州传到阿根廷的属。[见 Hortus  Third A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States and Canada，MacMillan Publishing Company，New York(1976)]。培植的属包括万寿菊(Tagetes erecta)(通常称为非洲金盏花)、孔雀草(Tagetes patula)(通常称为法国金盏花)、万寿菊x孔雀草(通常称为三倍体金盏花)和细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)，也就是已知的细叶万寿菊(Tagetes signata)或小图章金盏花。

金盏花的花序是单一头部，含有数百个无柄或亚无柄小花的致密簇，也称为小聚伞花序。金盏花具有辐射状花冠，其外部舌状或带状的放射小聚伞花序围绕在中央管状小聚伞花序圆盘周围。一些形式的金盏花花冠具有由圆盘状花转化形成的边花并含有少量(如果有的话)圆盘状花。此类花冠被称为双花。

边花或小聚伞花序通常被那些将花冠称为花的外行人称之为花瓣。为了便于理解，金盏花花冠在此处将被称为花或花冠，而由花冠构成的花或小聚伞花序、雄蕊群和雌蕊将被称为花瓣。

培植的金盏花拥有艳丽的花，并且常被用于装饰。此外，该属被认为是天然色素、精油和噻吩的来源。从所谓的叶黄素金盏花得到的干金盏花花瓣和金盏花花瓣浓缩物可以在家禽养殖业中用作食物添加剂以增加卵黄和烤制后禽类皮肤的黄颜色。[见Piccalia等，Ind.Crops and Prod.，8：45-51(1998)]。在禽类组织中预期的类胡萝卜素与其饲料浓度有关，因为禽类没有从头合成类胡萝卜素的能力。[见Balnave等，Asian-Australiasian J.Animal Sci.，9(5)：515-517(1996)]。

金盏花花瓣的着色能力大部分是由于称为胡萝卜醇主要是叶黄素酯类的类胡萝卜素级分[见Piccalia等，Ind.Crops and Prod.，8：45-51(1998)]。也在金盏花花瓣中发现的胡萝卜醇玉米黄素已经表明能够有效的作为烤制着色剂，以产生非常适宜的黄色至橙黄色[见Marusich等，Poultry Sci.，55：1486-1494(1976)]。在胡萝卜醇中，叶黄素和玉米黄素色素在市售的混合物中是最丰富的。叶黄素和玉米黄素的结构式显示如下：

叶黄素

玉米黄素

叶黄素和玉米黄素每个末端的环结构均含有一个羟基，因此每个分子含有2个羟基。叶黄素被认为是通过α-胡萝卜素2个独立的羟基化作用生物产生的，而玉米黄素被认为是通过β胡萝卜素2个独立的羟基化作用生物产生的。α-胡萝卜素和β-胡萝卜素都可以理解为是通过适当的环化酶分别作用δ-胡萝卜素和γ-胡萝卜素形成的，就是通过番茄红素的环化作用形成的。番茄红素、δ-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素均是类胡萝卜素碳氢化合物，并且它们的40-碳前体物被称为胡萝卜素。氧化的类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄素、虾青素和堇菜黄质被称为胡萝卜醇。

图1图示了产生叶黄素和玉米黄素的生物合成途径和随后的来自于八氢番茄红素，该途径中第一个C40类胡萝卜素，的产物。叶黄素和玉米黄素主要作为单酯或二酯脂肪酸存在于金盏花花瓣中。图1还指出了含有环氧化物的来源于玉米黄素的较后产物，其中堇菜黄质是脱落酸合成途径中的中间体。

已经在多种高等植物的贮存器官和花瓣中发现了类胡萝卜素。例如，金盏花花瓣积聚大量酯化叶黄素作为它们主要的胡萝卜醇类胡萝卜素(大约75％到90％以上)，其中含有较少量的酯化玉米黄素。除了叶黄素和玉米黄素之外，金盏花花瓣还典型地表现出少量积累β-胡萝卜素和环氧化胡萝卜醇，但是由于在天然存在的金盏花或它们的杂交种中缺乏4-酮-β-紫罗烯环形成酶，金盏花花瓣不产生或积累角黄素或虾青素。

胡萝卜醇金盏花与装饰用金盏花有几点特性不同。首先且最重要的是，胡萝卜醇金盏花是被用作类胡萝卜素的可提取资源并且具有不同于装饰用金盏花的植物习性。装饰用金盏花一般仅从地面生长大约45-60cm，而胡萝卜醇金盏花从地面生长大约65-70cm。胡萝卜醇金盏花比装饰用金盏花更具有灌木生长习性，并且能够作为成行的作物生长，而装饰用金盏花却一般不能如此生长。胡萝卜醇金盏花一般呈现暗橙色，而装饰用金盏花可为白色、黄色或橙色，或可以是混合色，包括由于在胡萝卜醇金盏花中不太丰富的花青甙而呈现的桃花心木色。

增加生物合成生产能力的一种方法是应用重组DNA技术。因此，通常期望产生着色的类胡萝卜素，并且利用最近研发的对从β-胡萝卜素到角黄素或虾青素或到这两者所确定的类胡萝卜素生物合成来控制类胡萝卜素，特别是角黄素和虾青素的生产。这种生产允许控制质量、数量和选择最适的且最有效的生产者生物。对于商业生产经济学而言后者特别重要并且有益于消费者。

如果可以得到下述金盏花或其他植物，这将是有利的，它们的花可产生大量β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素、或其他虾青素前体物和少量或不产生叶黄素，从而能够用一种或多种适合的羟化酶基因和适合的酮酶基因转化此类植物以从所得到的转化体的花产生虾青素。本发明以下的论述涉及一些关于此类转化植物的实施方案，并且特别涉及转化的金盏花属植物。

发明简述

本发明涉及在转化的高等植物花中，特别是至少在花的花冠和花繁殖部分如花瓣中形成4-酮-β-紫罗烯化合物如角黄素和虾青素。将被启动子如花瓣优先的启动子控制的一个或多个基因插入(转化)到高等植物中。插入的基因编码嵌合酶，包括(a)类胡萝卜素形成酶，它是酮酶、羟化酶或这两种酶，被可操作连接于(b)质体定向转运肽上。此种最低限度转化的植物的花瓣产生并比转化前优选地至少积累β-胡萝卜素或玉米黄素。

虾青素是一般通过β-胡萝卜素的2个β-环中的每个环的双羟化和双酮基化产生的，而角黄素被认为是通过β-胡萝卜素的2个β-环中的每个环的双酮基化产生的。一些高等植物在它们的花瓣中产生并积累β-胡萝卜素或其他虾青素前体物，并且能够用编码β-环酮化酶或β-环羟化酶的其中之一或2个基因进行转化。其他高等植物的花瓣含有不足量的β-胡萝卜素或其他适当的类胡萝卜素前体物，并且用一种或多种编码从存在的前体物产生虾青素所必需的酶的额外基因转化，其中所述存在的前体物包括普遍存在的前体物如牻牛儿基焦磷酸和焦磷酸法呢酯。

本发明所涉及的一个方面是转化的高等植物(转基因植物)或其可再生部分，它们的花和至少花冠或其他花繁殖部分产生并优选地积累具有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物，并且优选地是积累含有2个β-紫罗烯环且每个环自身含有4个酮基的类胡萝卜素化合物。该转基因植物含有异源基因组DNA片段(转基因)，所述转基因(a)编码嵌合酮酶并且(b)含有控制嵌合酶表达的启动子。嵌合酮酶包含(i)融合至(ii)的含有质体转运肽的N-末端第一部分，(ii)将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的第二酮酶部分。启动子和质体转运肽优选地是来自于不同的物种。在所涉及的植物中表达转基因的结果是含有4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物的花瓣积累，如β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、金盏花玉红质、金盏花黄质和虾青素。在一个优选的实施方案中，这些类胡萝卜素化合物的β-紫罗烯环中也含有3-羟基。

一个实施方案中所涉及的植物是转基因植物的F₁杂合体或后代杂合体，或转基因植物自身。在一个优选的实施方案中，植物是F₁杂合体。在该实施方案的一方面，杂合体的两个亲本都是转基因的，而在该实施方案的另一方面，一个亲本是转基因的而另一个不是。一个或两个亲本植物可以是呈现出一个或多个类胡萝卜素色素异常表达的突变植物；即通常不以可分离的量存在于植物中的类胡萝卜素色素的表达，或者一种或多种通常发现以异常高数量存在的色素的表达。

对于转化而言，金盏花是一种优选的宿主植物，由于此类植物通常产生含有β-紫罗烯环的类胡萝卜素色素，如β-胡萝卜素和玉米黄素。特别优选的非转化突变体金盏花宿主植物在它的花瓣中产生约4-约20mg/g新鲜干重的胡萝卜醇，并且为表现出玉米黄素比率大于约1∶10并优选地大于约2∶10的突变体。更加优选地是，至少约70％，并且最优选地是至少约90％的胡萝卜醇是玉米黄素，以至于比率接近1(一)。另一种非转化突变体金盏花宿主呈现出β-胡萝卜素比率大于约1∶10，并且优选地大于约2∶10。

转化植物的花粉和胚珠被分别考虑。此种所涉及的转化植物的再生部分包括选自胚、子叶、下胚轴、分生组织、花粉、叶、花药、根、根尖和花的细胞，源自它们的原生质体或愈伤组织。

进一步的实施方案涉及种子，当将这些种子种植于适宜的环境中时，可以生长成熟产生转基因植物如转基因金盏花，它的花瓣和繁殖部分积累含有一个或多个4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素色素，如β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、金盏花玉红质(adonirubin)、金盏花黄质(adonixanthin)和虾青素，而相同类型的非转基因植物的花瓣不积累此类色素。

本发明涉及的转基因植物至少在花瓣中优选地积累类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环化合物，并且也能够在花繁殖部分如雄蕊和雌蕊和其他花部分积累此类化合物。所涉及的转基因植物当存在萼片或蜜腺时能够但优选地是不在其中积累类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环化合物。进一步优选地是，类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环化合物是类胡萝卜素4，4′-二酮-β-紫罗烯环化合物，如角黄素、金盏花玉红质和虾青素，并且特别是虾青素或角黄素。最优选的是：β-胡萝卜素或玉米黄素是产生于非转化宿主植物花中的β-紫罗烯环化合物，并且虾青素是积聚于转化植物(转化体)花中的4，4′-二酮-β-紫罗烯环化合物。在另一个实施方案中也特别优选的是：角黄素是积聚于转化植物(转化体)花中的4，4′-二酮-β-紫罗烯环化合物。

还涉及到含有角黄素和虾青素之一或两者的花部分如花瓣。这些花部分一般以捣碎形式存在。该实施方案的另一方面是这样的转基因金盏花花瓣，其含有β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、金盏花玉红质、金盏花黄质和虾青素其中之一种或多种。转基因金盏花花瓣优选地以捣碎形式存在。

还涉及到包含角黄素和虾青素脂肪酸酯之一或两者的植物含油树脂。还涉及到适宜用作食品添加剂的组合物。食品添加剂包含溶解于或分散于食物介质中的角黄素和虾青素脂肪酸酯之一或两者。在食品添加剂或医疗滋养食品中，还可以使用这样的水解(皂化)含油树脂，其含有不具有酯化羟基的类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环化合物。

本发明关注的另一方面涉及纯化且分离的DNA片段。该DNA片段编码嵌合酮酶多肽，其自身含有(i)融合至(ii)的包含质体转运肽的N-末端第一部分，(ii)第二部分是将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮-β-紫罗烯环的酮酶。该DNA包括(iii)指导表达，并且优先地指导花瓣优先表达的启动子，该启动子可操作连接于编码嵌合酮酶多肽的序列上。该DNA转化进入高等植物导致这样的酶在花部分表达，所述酶催化将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化成4-酮-β-紫罗烯环，这样含有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物在可产生含β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物的经转化植物中积累。作为例证的含有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物包括β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、金盏花玉红质、金盏花黄质和虾青素。

本发明的另一个实施方案还涉及到这样的转基因植物，其花部分如花冠或其它花繁殖部分产生具有3-羟基-4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。该转基因植物含有编码嵌合酮酶多肽(如上所述)的基因组第一转基因，并且还含有(a)编码嵌合羟化酶多肽和(b)指导嵌合羟化酶表达，优选地是花瓣优先表达，的启动子的基因组第二转基因。编码嵌合羟化酶多肽的第二转基因含有(i)融合至(ii)的包含质体转运肽的N-末端第一部分，(ii)第二部分是将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素3-羟基-β-紫罗烯环的羟化酶部分。启动子和质体转运肽也优选地来自于不同物种。在所涉及的植物中表达转基因的结果是3-羟基-4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物的花优先积累。

本发明这一方面所涉及的转基因植物可在花部分如花瓣中积累3-羟基-4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物，并且还可在花繁殖部分如雄蕊和雌蕊中积累此类化合物。所涉及的转基因植物当存在萼片或蜜腺时可以但优选地是不在其中积累类胡萝卜素3-羟基-4-酮-β-紫罗烯环化合物。作为例证的在β-紫罗烯环中具有3-羟基和4-酮基的类胡萝卜素化合物包括虾青素、金盏花黄质、金盏花玉红质、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮。优选地是：类胡萝卜素3-羟基-4-酮基-β-紫罗烯环化合物是类胡萝卜素3，3′-二羟基-4-酮基-β-紫罗烯环化合物如虾青素或金盏花黄质。

对于上述任意一个或两个嵌合多肽优选的质体转运肽是RUBISCO转运肽。优选的启动子是仙女扇(Clarkia breweri)芳樟醇合酶1(LIS1)基因5′端上游的约1kb片段，拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的遍在蛋白3(UBQ3)启动子或遍在蛋白11(UBQ11)启动子。LIS1启动子是花瓣优先的，而UBQ3和UBQ11启动子是组成型的。

能够将类胡萝卜素β-环转化为4-酮基-β-环的优选酮酶是由雨生红球藻bkt基因编码的酮酶、由雨生红球藻crtO基因编码的酮酶、由橙黄农杆菌crtW基因编码的酮酶或由产碱菌PC-1 crtW基因编码的酮酶。为了便于讨论，不管基因序列的来源，在下文中酮酶基因通常被称为crtW基因。

能够将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素3-羟基-β-紫罗烯环的优选羟化酶是由噬夏孢欧文氏菌crtZ基因编码的羟化酶、由草生欧文氏菌crtZ基因编码的羟化酶、由橙黄农杆菌crtZ基因编码的羟化酶或由产碱菌PC-1 crtZ基因编码的羟化酶。

本发明进一步的实施方案涉及这样的转基因植物，它含有的基因组序列编码如前所述的酮酶、羟化酶和一个或多个额外的形成类胡萝卜素的转基因。每个额外转基因表达的嵌合多肽类胡萝卜素形成酶含有N-末端质体转运肽部分，并且每一基因优选地可操作连接于指导花瓣优先表达的启动子上。可以从大量来源获得额外的类胡萝卜素形成转基因，包括(a)在Misawa等的美国专利号5,429,939中详细说明的噬夏孢欧文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ基因，或(b)在Ausich等的美国专利号5,684,238中详细说明的草生欧文氏菌的GGPP合酶基因、八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶(4H)基因、番茄红素环化酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因。

本发明还涉及一些实施方案，其中在虾青素产生中的β-胡萝卜素或其他类胡萝卜素前体化合物存在于选择作为宿主的开花植物(例如金盏花)的花中。本发明还涉及一些实施方案，其中宿主植物的花缺乏β-胡萝卜素或其他类胡萝卜素前体，如长春花属。在后一类型的植物中，所插入的DNA包括编码类胡萝卜素前体(可以被生物转化为β-胡萝卜素的化合物)和酮酶的基因，以及编码羟化酶的基因，否则植物中就缺乏这些基因。

优选的开花植物包括，但不限于：石蒜科(葱属、水仙属)；夹竹桃科(长春花属)；菊科(Asteraceae)或称为菊科(Compositae)(紫莞属、金盏草、翠菊属、菊苣属、波斯菊、大利花、菊属、杂色菊属、大丁草、向日葵、蜡菊属、莴苣属、金光菊属、万寿菊、百日草属)；凤仙花科(凤仙花属)；秋海棠科(秋海棠属)；石竹科(石竹类属)；藜科(甜菜属、菠菜属)；葫芦科(西瓜属、南瓜属、香瓜属)；十字花科(香雪球、芸苔属、糖芥属、紫罗兰属、萝卡属)；龙胆科(桔梗)；牻牛儿苗科(天竺葵属)；禾本科(Graminae)，或称为禾本科(Poaceae)(燕麦属、大麦属、稻属、黍属、狼尾草属、早熟禾属、甘蔗属、黑麦属、高粱属、小麦属、玉蜀黍属)；大戟科(猩猩木)；唇形科(鼠尾草属)；豆科(大豆属、香豌豆属、苜蓿属、菜豆属、豌豆属)；百合科(百合属)；半边莲科(半边莲属)；锦葵科(秋葵属、棉属、锦葵属)；白花丹科(补血草属)；花荵科(草夹竹桃属)；报春花科(樱草属)；毛茛科(乌头属、银莲花属、耧斗菜属、驴蹄草属、翠雀属、毛茛属)；蔷薇科(蔷薇属)；茜草科(繁星花属)；玄参科(香彩雀属、金鱼草属、蝴蝶草属)；茄科(辣椒属、番茄属、烟草属、矮牵牛属、茄属)；伞形科(芹菜属、胡萝卜属、欧防风属)；马鞭草科(马鞭草属、马缨丹属)；堇菜科(堇菜属)。

附图简述

在形成本公开一部分的附图中，

图1是产生叶黄素、虾青素和其它胡萝卜醇的生物合成途径的简单图示，其中八氢番茄红素，即途径中的第一个C₄₀类胡萝卜素，在几个步骤中(两个箭头)被转化为番茄红素，之后该途径分开为形成含有一个ε-环的δ-胡萝卜素，然后形成含有一个ε-环和一个β-环的α-胡萝卜素，然后经α-玉米黄质形成叶黄素；或者形成含有一个β-环的γ-胡萝卜素，然后是含有2个β-环的β-胡萝卜素。β-胡萝卜素之后，该途径分支形成β-玉米黄质，然后形成玉米黄素，玉米黄素或者继续形成含有环氧化物的胡萝卜醇即花药黄质、堇菜黄质和新黄质，或通过额外的步骤(两个箭头)形成虾青素。通过另一条分支，β-胡萝卜素被转化为β-胡萝卜素-4-酮，然后形成角黄素并通过一个额外步骤(两个箭头)形成虾青素。

图2图示说明了含有大约2948碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX533，其中包括来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图3图示说明了含有大约3919bp DNA片段的质粒pBHX539，其中包括编码可操作连接到来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列上的酮酶(雨生红球藻crtW)多肽的序列，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图4图示说明了含有大约4076碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX543，其中包括编码RUBISCO(RBCS)/酮酶(雨生红球藻crtW)嵌合多肽的基因，以及来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列，和几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图5图示说明了含有大约5422碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX546，其中包括编码RUBISCO(RBCS)/酮酶(雨生红球藻crtW)嵌合多肽的基因，以及来源于拟南芥菜的遍在蛋白3启动子(UBQ3)、来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列，和几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图6图示说明了含有大约5099碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX544，其中包括编码RUBISCO(RBCS)/酮酶(雨生红球藻crtW)嵌合多肽的基因，以及芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列，和几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图7图示说明了由质粒pBHX544制备而成的含有大约4652bp DNA片段的质粒pBHX560，其中包括来源于拟南芥菜的遍在蛋白11(UBQ11)启动子以代替LIS1启动子，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图8图示说明了由质粒pBHX544制备而成的含有大约4862bp DNA片段的质粒pBHX562，其中包括橙黄农杆菌crtW基因以代替来源于雨生红球藻的基因，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图9图示说明了由质粒pBHX560制备而成的含有大约4325bp DNA片段的质粒pBHX564，其中包括橙黄农杆菌crtW基因以代替来源于雨生红球藻的基因，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图10图示说明了含有大约14,188bp DNA片段的双元质粒pBHX567，其中包括编码RUBISCO(RBCS)/酮酶(雨生红球藻crtW)嵌合多肽的DNA，以及来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图11图示说明了由商业载体pBI101制备而成含有大约3718bp的中间质粒pBHX503，它是利用PCR工程设计插入了新霉素磷酸转移酶II(nptII)选择性标记，并且在插入序列的5′末端加入了Hind III和MFE I位点，在3′末端加入了Kpn I位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图12图示说明了从将UBQ11启动子可操作连接于质粒pBHX503的3′末端制备而成的中间质粒pBHX510，从而使该质粒含有大约4255bpDNA片段，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图13图示说明了由质粒pBI510制备而成的中间质粒pBHX522，它是利用PCR工程设计含有大约13,046bp DNA片段，包括UBQ11启动子控制的nptII标记基因和nos多聚腺苷酰化作用位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图14图示说明了含有大约13,320bp DNA片段的双元质粒pBHX561，其中包括编码嵌合酶的DNA、质粒pBHX544的调控序列以代替β-葡糖醛酸酶编码区(gusA)和质粒pBHX522的nos多聚腺苷酰化作用位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图15图示说明了含有大约12,783bp DNA片段的双元质粒pBHX565，其中包括编码嵌合酶的DNA和质粒pBHX560的调控序列以代替β-葡糖醛酸酶编码区(gusA)、和质粒pBHX522的nos多聚腺苷酰化作用位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图16图示说明了含有大约13,083bp DNA片段的双元质粒pBHX563，其中包括编码嵌合酶的DNA和质粒pBHX562的调控序列以代替β-葡糖醛酸酶编码区(gusA)、和质粒pBHX522的nos多聚腺苷酰化作用位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图17图示说明了含有大约12,546bp DNA片段的双元质粒pBHX566，其中包括编码嵌合酶的DNA和质粒pBHX564的调控序列以代替β-葡糖醛酸酶编码区(gusA)、和质粒pBHX522的nos多聚腺苷酰化作用位点，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图18图示说明了含有大约14,188bp DNA片段的双元质粒pBHX586，其中包括编码RUBISCO(RBCS)/酮酶(雨生红球藻crtW)嵌合多肽的DNA，以及来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图19图示说明了含有大约10259碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX689，其中包括芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、RUBISCO(RBCS)的小亚单位、编码八氢番茄红素合酶(噬夏孢欧文氏菌crtB)多肽的序列、来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、遍在蛋白3启动子、RUBISCO(RBCS)的小亚单位、编码八氢番茄红素去饱和酶(噬夏孢欧文氏菌crtI)多肽的序列、另一个来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、另一个遍在蛋白3启动子、和选择性标记基因nptII，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图20图示说明了含有大约9356碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX691，其中包括芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、RUBISCO(RBCS)的小亚单位、编码酮酶(雨生红球藻crtW)多肽的序列、来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、遍在蛋白3启动子、RUBISCO(RBCS)的小亚单位、编码羟化酶(噬夏孢欧文氏菌crtZ)多肽的序列、另一个来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、另一个遍在蛋白3启动子、和选择性标记基因nptII，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图21图示说明了含有大约13697碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX701，其中包括芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、酮酶编码序列Keto2 cds(夏侧金盏花AdK6)、和来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、遍在蛋白3启动子、和选择性标记基因nptII，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图22图示说明了含有大约4623碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX650，其中包括多个单克隆位点、遍在蛋白3启动子(UBQ3)和选择性标记基因nptII。

图23图示说明了含有大约13611碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX607，其中包括多个单克隆位点(mcs)、遍在蛋白3启动子(UBQ3)和选择性标记基因nptII。

图24图示说明了含有大约11373碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX658，其中包括多个单克隆位点(mcs)、遍在蛋白3启动子(UBQ3)和选择性标记基因nptII。

图25图示说明了含有大约15847碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX749，其中包括芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、酮酶编码序列Keto2 cds(夏侧金盏花AdK6)和来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、酮酶编码序列Keto1 cds(夏侧金盏花AdK1)和来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列、遍在蛋白3启动子、和选择性标记基因nptII，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

图26图示说明了含有大约5627碱基对(bp)DNA片段的质粒pBHX612，其中包括芳樟醇合酶1基因(LIS1)5′端上游的启动子、RUBISCO(RBCS)的小亚单位、编码八氢番茄红素脱氢酶(噬夏孢欧文氏菌crtI)多肽的序列、和来源于农杆菌属Ti-DNA编码胭脂碱合酶(nos)的3′末端序列，以及几个重要的限制性酶位点和它们的位置数。

术语的定义

氨基酸：此处所鉴定的所有氨基酸残基都是天然的L-构型。与标准多肽命名法一致，J.Biol.Chem.，243：3557-59(1969)，氨基酸残基的缩写示于下面对应表格中：

对应表

                          符号

1个字母                  3个字母                      氨基酸

   Y                       Tyr                        L-酪氨酸

   G                       Gly                          甘氨酸

   F                       Phe                        L-苯丙氨酸

   M                       Met                        L-蛋氨酸

   A                       Ala                        L-丙氨酸

   S                       Ser                        L-丝氨酸

   I                       Ile                        L-异亮氨酸

   L                       Leu                        L-亮氨酸

   T                       Thr                        L-苏氨酸

   V                       Val                        L-缬氨酸

   P                       Pro                        L-脯氨酸

   K                       Lys                        L-赖氨酸

   H                       His                        L-组氨酸

   Q                       Gln                        L-谷氨酰胺

   E                       Glu                        L-谷氨酸

   W                       Trp                        L-色氨酸

   R                       Arg                        L-精氨酸

   D                       Asp                        L-天冬氨酸

   N                       Asn                        L-天冬酰胺

   C                       Cys                        L-半胱氨酸

应该注意到所有氨基酸残基序列在此处都用结构式代表，它们由左到右的方向按照惯例是氨基末端到羧基末端的方向。

胡萝卜素：类胡萝卜素色素碳氢化合物，如番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。

表达：细胞内过程的组合，包括转录和翻译，通过结构基因产生多肽。

表达载体：形成调控元件的DNA序列，当在载体内可操作地连接于那些基因上时，可以调节结构基因的表达。

花瓣优先的启动子：是指优先指导可操作连接基因在花瓣中过量表达或产生的启动子。

杂交：当谈及互补核酸链的配对时使用术语“杂交”。一些本领域熟知的因素会影响杂交和杂交的强度(即核酸链之间结合的强度)，包括核酸之间互补的程度、受诸如盐浓度、形成杂合体的T_m值(解链温度)条件影响的条件的严格性、其他成分的存在(如聚乙二醇的存在或缺乏)、杂交链的体积摩尔浓度和核酸链的G∶C含量。

羟化酶：指将羟基加入到类胡萝卜素β-紫罗烯环3-位碳原子上形成玉米黄素或类胡萝卜素生物合成途径较后期的另一种羟基化的中间体的基因和所编码的酶。具体而言，“羟化酶”(或β-胡萝卜素羟化酶)是指将β-胡萝卜素或4-酮-β-胡萝卜素转化为一种或多种在β-紫罗烯环3-位上发生羟基化化合物的酶。

已经鉴定了编码将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为3-羟基-β-紫罗烯环的羟化酶部分的不同的来源。如草生欧文氏菌crtZ基因一样，噬夏孢欧文氏菌crtZ基因也编码羟化酶。(见Misawa等，美国专利号5,419,939；和Ausich等，美国专利号5,684,238)。

整合的：掺入宿主染色体(基因组)的异源DNA序列是整合的。

酮酶：指将酮基(氧代)基团加入到类胡萝卜素β-紫罗烯环4-位碳原子上，在类胡萝卜素生物合成途径较后期形成多种酮类胡萝卜素化合物的基因和所编码的酶(β-胡萝卜素酮酶或β-胡萝卜素加氧酶)。存在编码将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮-β-紫罗烯环的酮酶的基因的几种来源，如crtW基因、bkt基因和crtO基因[见Kajiwara等，Plant MolecularBiology，29：343-352，(1995)；Misawa等，美国专利号5,811,273和5,972,690；Kajiwara等，美国专利号5,910,433；Harker等，FEBS Letters，404：129-134(1997)；Lotan等，FEBS Letters，364：125-128(1995)；和Hirschberg等，美国专利号5,965,795]。

从雨生红球藻分离的2个cDNA分子已经分别表明编码将类胡萝卜素β-环的亚甲基基团转化为酮基(因此行使“酮酶”的作用)的β-胡萝卜素酮酶(β-胡萝卜素加氧酶)。一个基因和基因产物已经称为bkt[见Kajiwara等，美国专利号5,910,433；和Kajiwara等，Plant Mol.Biol.，29：343-352(1995)]。另一个β-胡萝卜素4-加氧酶基因被称为crtO[见Hirschberg等，美国专利号5,965,795；Harker等，FEBS Letters，404：129-134(1997)和Lotan等，FEBS Letters，364：125-128(1995)]。

在海洋细菌橙黄农杆菌和产碱菌PC-1中发现了相应于bkt的基因。这些基因和基因预测物称为crtW，与雨生红球藻bkt基因产物具有大约37％的同一性。

核酸杂交：其它变量还有与序列同一性(同源性)、序列的G+C含量、缓冲液盐浓度、序列长度和双链的解链温度(T_m)有关。[见Maniatis等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)，388页]。高严格条件，例如在含有4X-6X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)水溶液中利用高温度杂交(如65℃到70℃)或在低盐浓度溶液中(如0.1X SSC)，在50％甲酰胺中于40到45℃杂交并结合在高温下(如低于T_m值5℃到25℃)洗涤。中等严格条件一般是在0.2到0.3M NaCl中在大约50℃到大约65℃时进行杂交，并在大约50℃到大约55℃时在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤。低严格条件能够利用较低的杂交温度(如35℃-45℃时在20％-50％甲酰胺中杂交)，并在低中间温度(如40-55℃)且在含有较高盐浓度(如2X-6X SSC)的洗液中洗涤。优选地使用中等严格条件，结合将所公开的多聚核苷酸分子作为探针以鉴定编码本发明的核苷二磷酸激酶的克隆[见Ausich等，美国专利号5,684,238]。

可操作地连接或插入：将载体DNA序列可操作地连接于结构基因DNA序列上，如果这两者以正确的读码框和位置共价连接，从而使启动子DNA序列影响结构基因DNA序列的转录和翻译。

启动子：提供基因表达调控元件的一段DNA序列或一组DNA序列上的识别位点，并且RNA聚合酶特异地结合到它上面并起始该基因的RNA合成(转录)。

重组DNA分子：含有至少2个正常情况下自然界中不一起存在的核苷酸序列的杂合体DNA序列。

相同类型的植物：短语“相同类型的植物”用于此处以描述一种用作比较花瓣类胡萝卜素积累的基础的代表性植物。“相同类型的植物”是相同属和种的植物，并且优选地是与其进行比较的突变体和/或转化植物的亲缘关系(杂交)相同。涉及此种比较用途的植物是常规的可商业获得的杂合体，如金盏花属植物‘Scarletade’，此处用作例证进行说明，并且除非另外声明，它自身既不是突变体，也不是经转化的增加一种或多种类胡萝卜素产量的植物。因此，如此后所见到的，从金盏花属植物‘Scarletade’的花瓣和叶子提取的类胡萝卜素用于与那些从诱变的或转化的万寿菊(T.erecta)金盏花属植物提取的类胡萝卜素进行比较。与广泛同系繁殖的植物相比，杂交同胞之间的等位基因的变化是较小的，可以使用同胞之间的比较或利用几个同胞得到的平均值。否则，优选地将纯系与突变或转化的植物相比较。

在一些比较中，针对不同地诱变或转化的植物，诱变的或转化的植物自身可以是代表性植物，来比较提取的类胡萝卜素。因此，例如，从转化的、以前诱变的植物提取的类胡萝卜素可以与从诱变的植物提取的类胡萝卜素进行比较。

严格性：在谈及温度、离子强度、和其它化合物的存在诸条件时，使用术语“严格性”，在这种条件下进行核酸杂交。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对仅发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间。因此，在期望彼此不完全互补的核酸序列杂交或复性到一起时，通常需要“弱”或“低”严格性条件。本领域熟知大量等效的条件可以被应用于组成低严格性条件。对于本领域的技术人员，杂交条件的选择通常是显而易见的，并且通常受到杂交目的、杂交类型(DNA-DNA或DNA-RNA)和序列之间所预期的相关性水平的指导[见，例如Ausich等，美国专利号5,684,238]。

已知随着错配碱基数量增加，核酸双链体稳定性降低，并且稳定性进一步降低较大或较小的程度是依赖于杂合体双链中错配的相对位置。因此，杂交的严格性可以被用于达到此类双链的最高或最低限度的稳定性。杂交严格性可以通过如下改变：调节杂交温度；调节杂交混合物中螺旋去稳定因子如甲酰胺的百分比；以及调节洗涤溶液的温度和/或盐浓度。对于滤膜杂交，最终的杂交严格性通常是由用于杂交后洗涤的盐浓度和/或温度决定的。总而言之，通过降低杂交液中甲酰胺的百分比，可以降低杂交反应自身的严格性。

例如，高严格条件例如可在含有4-6XSSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)的水溶液中利用高温度杂交(如65℃-68℃)，或者在含50％甲酰胺的低盐浓度(如0.1X SSC)溶液中42℃杂交并结合在高温下(如低于T_m值5℃到25℃)洗涤。低严格条件能够利用较低的杂交温度(如35℃-42℃时在含20％-50％甲酰胺的溶液中)，并在中间温度(如40-60℃)进行洗涤且洗液中含有较高盐浓度(如2X-6X SSC)。中等严格性条件，它能够在0.2-0.3M NaCl中，温度在50℃-65℃之间进行杂交，并于50℃和55℃之间在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤，并且使用中等严格条件能够结合将所公开的多核苷酸分子作为探针以鉴定编码NDPK的克隆。

结构基因：表达为多肽即氨基酸残基序列的DNA序列。

T_m(解链温度)：术语“T_m”用于指“解链温度”。在解链温度下，双链核酸分子总量的50％分离形成单链。计算核酸T_m值的公式在本领域是熟知的。通常利用从1M盐中的杂交分析采纳的公式估计杂合体核酸的T_m值，并通常用于计算PCR引物的T_m值：[(A+T数量)×2℃+(G+C数量)×4℃]。C.R.Newton等， PCR，2^nd Ed.，Springer-Verlag(New York：1997)，p.24。对于长度大于20个核苷酸的引物，发现该公式是不准确的。本领域还存在其他更加复杂的计算方法，这些方法计算T_m值时，还考虑到结构和序列的特性。所计算的T_m值仅是估计值；最适温度通常由经验决定。

载体：能够在细胞中复制的DNA分子和/或另一个DNA片段能够被可操作连接到其上面从而引起所连接的片段复制的DNA分子。质粒是典型的载体。此处使用的符号“::”表示质粒或其它载体中相邻元件之间的融合，如LIS1启动子、crtW类胡萝卜素酶形成基因和nos终止序列之间的融合。

胡萝卜醇：类胡萝卜素色素，其具有存在于一个或两个紫罗烯环中的含氧基团如羟基、酮基或环氧基。

发明详述

概述

一些开花植物(包括但不限于优选的开花植物)在它们的花部分，如它们的花瓣，和/或繁殖部分，含有类胡萝卜素或类胡萝卜素前体。甚至当缺乏β-胡萝卜素时，高等植物能够充当宿主通过生物技术产生含有具4-酮基的β-环的类胡萝卜素化合物，如角黄素和虾青素。

类胡萝卜素，一旦形成，就可以作为沿着生物合成途径的下一个将合成的类胡萝卜素的前体。在所选择的途径中，如果类胡萝卜素与可将类胡萝卜素转化为下一个类胡萝卜素分子的适当的酶共同存在，只要前体类胡萝卜素底物和适当酶存在于花的适当部分，转化通常在途径的每一步骤中都发生。

上述产物作为前体导致在植物中积累一种或多种生物合成反应途径较后形成的类胡萝卜素，而早期形成的前体类胡萝卜素相对积累少或不积累。当α-或β-胡萝卜素、叶黄素或玉米黄素的任意一种是末尾产生的类胡萝卜素时，前体类胡萝卜素积累的相对缺乏特别明显，因为在成熟植物部分如果实中通常观察到少量或没有前体番茄红素。

正如众所周知的那样，生物产生的物质如所涉及的4，4′-二酮类胡萝卜素的相对量受到几个变量的影响，这里包括前体类胡萝卜素的浓度、转化成下一个类胡萝卜素的酶促速率和可能的产物反馈抑制，所产生的类胡萝卜素通过反馈抑制抑制其自身的进一步反应。一些植物还能够产生无功能或功能差的转化酶，从而使随后看起来可产生的类胡萝卜素不产生或仅以相对小的量产生。作用于后期，而非早期转化酶的人造抑制剂也可以在类胡萝卜素积累过程中起作用。

本发明涉及转基因植物和利用该植物及其所产生的产物的方法。可以进行转基因的有用的开花植物包括石蒜科(葱属、水仙属)；夹竹桃科(长春花属)；菊科(Asteraceae)或称为菊科(Compositae)(紫莞属、金盏草、翠菊属、菊苣属、波斯菊、大利花、菊属、杂色菊属、大丁草、向日葵、蜡菊属、莴苣属、金光菊属、万寿菊、百日草属)；凤仙花科(凤仙花属)；秋海棠科(秋海棠属)；石竹科(石竹类属)；藜科(甜菜属、菠菜属)；葫芦科(西瓜属、南瓜属、香瓜属)；十字花科(香雪球、芸苔属、糖芥属、紫罗兰属、萝卡属)；龙胆科(桔梗)；牻牛儿苗科(天竺葵属)；禾本科(Graminae)，或称为禾本科(Poaceae)(燕麦属、大麦属、稻属、黍属、狼尾草属、早熟禾属、甘蔗属、黑麦属、高粱属、小麦属、玉蜀黍属)；大戟科(猩猩木)；唇形科(鼠尾草属)；豆科(大豆属、香豌豆属、苜蓿属、菜豆属、豌豆属)；百合科(百合属)；半边莲科(半边莲属)；锦葵科(秋葵属、棉属、锦葵属)；白花丹科(补血草属)；花荵科(草夹竹桃属)；报春花科(樱草属)；毛茛科(乌头属、银莲花属、耧斗菜属、驴蹄草属、翠雀属、毛茛属)；蔷薇科(蔷薇属)；茜草科(繁星花属)；玄参科(香彩雀属、金鱼草属、蝴蝶草属)；茄科(辣椒属、番茄属、烟草属、矮牵牛属、茄属)；伞形科(芹菜属、胡萝卜属、欧防风属)；马鞭草科(马鞭草属、马缨丹属)；堇菜科(堇菜属)。在以前提到的植物中，万寿菊属植物是优选的，其中万寿菊(金盏花)是特别优选的。

本发明所涉及到的一方面是转化的高等植物(转基因植物)或此种植物的可再生部分，其花部分如花冠或花其它繁殖部分，产生并优选地积累具有β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。该转基因植物含有(a)编码嵌合酮酶的异源基因组DNA序列(转基因)，并含有(b)指导嵌合酶表达的启动子。所编码的嵌合酮酶自身包含两部分：(i)含有融合至(ii)的包含质体转运肽部分的N-末端第一部分；(ii)第二部分，将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分；即crtW基因编码的酶。启动子和质体转运肽优选地为来自不同的物种。在所涉及植物中表达转基因的结果是在花瓣优选地积累4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物。

所涉及的植物在花部分产生β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物。作为例证的β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物包括β-胡萝卜素、玉米黄素、β-玉米黄质、金盏花黄质、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、β-胡萝卜素-4-酮、角黄素和金盏花玉红质。所涉及的包括花繁殖部分的花部分包括：花瓣(花冠)、雄蕊和雌蕊。对于玉米黄素，优选地是产生(3R，3′R)-玉米黄素，而对于虾青素，优选地是产生(3S，3′S)-虾青素。(3S，3′S)-虾青素是通过作为酮酶底物的(3R，3′R)-玉米黄素发生双酮化作用产生的产物。

作为例证的优选的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮-β-紫罗烯环并形成嵌合酶一部分的非高等植物酮酶是以前讨论的那些酮酶和在以下中讨论的酮酶：Kajiwara等，Plant Molecular Biology，29：343-352，(1995)；Misawa等，美国专利号5,811,273和5,972,690；Kajiwara等，美国专利号5,910,433；Harker等，FEBS Letters，404：129-134(1997)；Lotan等，FEBS Letters，364：125-128(1995)；和Hirschberg等，美国专利号5,965,795。

其表达产物可以用于此处的其他酮酶基因在下文中列出，首先是从其中分离基因的生物体的属/种，其中圆括弧内的名称是新的或NCBI命名的其它名称，但可能不被正式公认的名称。基因的名称有时在那些括弧中提供，并且后面是报道基因的引文：夏侧金盏花(Adonis palaestina；酮酶1)WO99/61652；夏侧金盏花(Adonis palaestina；酮酶2)WO99/61652；橙黄农杆菌(副球菌(Paracoccus)MBIC1143)Misawa等(1995)J.Bacteriol.177：6575-6584；产碱菌属中的某些种，Misawa等(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.209：867-876；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)中的ORS278，Hannibal等(2000)J.Bacteriol.182：3850-3853；橙黄短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)WO02/079395 A2；雨生红球藻(crtW)，Kajiwara等(1995)Plant Mol.Biol.29：343-352；念珠藻属PCC 7120(鱼腥藻属的PCC 7120株)，Kaneko等(2001)DNA Res.8：205-213；Paracoccusmarcusii，美国专利号5,935,808；法夫酵母(Phaffia rhodozyma)(Xanthophyllomyces dendrorhous)  (虾青素合成酶)，美国专利号6,365,386；集胞藻属(Synechocystis)中的PCC 6803，Kaneko等(1995)DNA Res.2：163-166和Fernández-González等(1997)J.Biol.Chem.272：9728-9733；Synechococcus sp.WH 8102，GenBank ZP_00115639(推定的蛋白质Synwh1213)；绵长热聚球菌(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(crtZ)，Nakamura等(2002)DNA Res.9：135-148；和红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum)IMS101，GenBank ZP_00070906(推定的蛋白质Tery0029)。编码这些酶的适当的DNA序列也列于上述引文中。

所涉及的嵌合体的N-末端部分包含通过肽键融合到嵌合体酮酶部分的质体转运肽。转运肽部分的C-末端被融合到酮酶部分的N-末端。

质体转运肽本质上可以是任意来源的，并且一般包括大约30到大约80个氨基酸残基。作为例证的有用肽公布于von Heijne等，Eur.J.Biochem.，180：535-545(1989)；和Clark等，J.Biol.Chem.，264(29)：17544-17550(1989)。更多的质体特异(叶绿体)的转运肽更概述性地讨论于della-Cioppa等，Plant Physiol.，84：965-968(1987)中。

作为例证的转运肽包括菠菜铁硫蛋白(ferrodoxin)还原酶、Rieske Fe-S蛋白、蝇子草属(silene)铁硫蛋白、豌豆热休克蛋白、Gln合酶和芸苔酰基载体蛋白转运肽。von Heijne等在其出版物中(见上)提供了这些转运肽的氨基酸残基序列及其他内容。优选的质体转运肽是烟草RUBISCO、矮牵牛EPSP合酶和胡椒PSY基因转运肽之一。

如Romer等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，196(3)：1414-1421(1993)所报道，与PSY基因相连的胡椒植物转运肽基因可以融合到或可操作连接于一个先前提到的酮酶编码基因上，以建立所涉及的与转化植物异源的嵌合多肽共轭物。还可以使用矮牵牛杂交体(MP4-G)转运肽基因，如Shah等，Science，233：478-481(1986)中所公开，它编码EPSP合酶的72个密码子(216bp)的转运肽。

特别优选的质体转运肽是由Mazur等，Nucl.Acids Res.，13：2343-2386(1985)报道的烟草(Nicotiana tabacum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(RUBISCO；RBSC)信号(转运)肽修饰后的肽。基因内频繁的修饰在5′末端导入一个NcoI位点并在碱基73和74之间插入NarI位点。两个修饰都没改变氨基酸残基序列。

所得到的质体转运肽基因含有177个碱基对(bp)。该基因优选地被用作可以连接到先前所述的酮酶基因上的177bp Sal I-Sph I片段。此种连接产生编码含有N-末端转运肽的异源(嵌合)多肽的基因(大约900到大约1200bp)，N-末端转运肽的C-末端连接于呈现酮酶活性的多肽的N-末端。Hauptmann等的美国专利号5,618,988中论述的质粒pATC1616(ATCC 40806)含有编码RUBISCO转运肽的Sal I-Sph I 177bp DNA。

所涉及的DNA序列(转基因)不仅编码所涉及的嵌合多肽，还包括调控序列，调控序列含有指导或控制嵌合体在指定的花部分表达的启动子，并且在嵌合体编码序列之后，即嵌合体编码序列下游或3′-端，还优选地包括终止密码子/多聚腺苷酰化作用序列。通过所使用的启动子可以控制在花部分优先表达或位点特异表达，如在花瓣中或花其他繁殖部分。此种启动子此处是指花瓣优先表达的启动子。

通过使用所谓的矮牵牛查耳酮合酶(CHS)基因，其仅在花瓣中强烈作用，可以得到典型的花瓣优选表达(van der Meer等，Plant Mol.Biol.，15：95-109，1990)。其他目的启动子可能包括仙女扇芳樟醇合酶1(LIS1)基因的5′端上游大约1千碱基对(kb)的片段[见Cseke等，Mol.Biol.Evol.，15(11)：1491-1498(1998)]、APETALA3的启动子[见Hill等，Development125：1711-1721(1998)]和来源于欧洲油菜(Brassica napus)的花瓣优先植物启动子(见Institut National De La Recherche Agronomique INRA，Fr2768746)。此外，通过植物启动子或病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子及其衍生物、增强型35S启动子(“E35S”)、玄参花叶病毒启动子等等，可以控制用于外源基因转录的组成型启动子。[见Gruber等，植物分子生物学和生物技术方法一书中的“用于植物转化的载体”，Glick等(编辑)，CRC出版社，89-119(1993)；Odell等，Nature313：810(1985)；和Kay等，Science 236：1299(1987)]。来自于拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)的多聚遍在蛋白基因启动子，UBQ3、UBQ10和UBQ11，对于指导花瓣中的基因表达是有用的。[见Norris等，Plant Molecular Biology21：895-906(1993)]。此处LIS1或UBQ启动子是优选的。LIS1启动子是花瓣优先的，而UBQ启动子是组成型的。在这两种情况下，目的4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物均在花部分积累。关于LIS1启动子，花部分积累的原因被认为是因为花部分是通过启动子表达的位置。关于组成型的UBQ31启动子，目的4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物在花部分的积累是因为酶的类胡萝卜素底物定位于花部分，而不是整株植物。

如图1中所示，目的4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物，如虾青素，是类胡萝卜素生物合成途径的几个步骤已经完成之后所形成的产物。那些必需的步骤一般仅在所涉及的宿主植物的花部分中完成。因此，不必要仅在花部分表达4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物形成酶，因为植物其他部位表达的酶不导致形成4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物产物，这是由于在除了花之外的植物其他部分，基本上都缺乏必需的前体底物和酶。

所利用的每个启动子序列基本上不受细胞内类胡萝卜素量的影响。如此处所使用的，术语“基本上不受影响”意思是启动子不对在转化细胞或转基因植物中积累的类胡萝卜素的直接反馈控制(抑制作用)做出反应。

终止/多聚腺苷酰化序列也是众所周知的。此处所用的示例性的终止密码子/多聚腺苷酰化序列包括编码胭脂碱合酶(nos)的农杆菌Ti-DNA的3′端终止序列，以及章鱼碱合酶(ocs)的3′端序列、CaMV 35S RNA基因、和β-伴大豆球蛋白、查耳酮合酶和RUBISCO小亚基的3′端序列。[见美国专利号5,618,988；Fujiwara等，Plant Mol.Biol.，20：1059(1992)；van denMeer等，Plant Cell，4：253(1992)；Tieman等，Plant Cell，4：667(1992)；和Mazur等，Nucleic Acids Res.，13(7)：2373-2386(1985)]。nos序列是一个特别优选的3′端终止序列。

本发明优选的实施方案包括可操作连接到指导金盏花花瓣表达的DNA片段上的编码嵌合酮酶多肽共轭物的DNA。金盏花花瓣产生β-胡萝卜素，并且是玉米黄素和叶黄素的天然来源，因此如果存在的β-胡萝卜素或玉米黄素的量足以提供大量虾青素，就能够提供生产虾青素的优良宿主。然而，商业获得的金盏花仅含有大约5％到大约7％的玉米黄素、大约90％或更多的叶黄素和少于大约1％的β-胡萝卜素。此类植物是不适当的宿主由于花瓣中玉米黄素或β-胡萝卜素的相对低含量。

通过诱变种子的杂交繁殖，已经生长出比正常植株具有更大的(增加的)玉米黄素对叶黄素百分比或几乎全部是玉米黄素(仅少量甚至无叶黄素)，或含有高浓度β-胡萝卜素的金盏花，并且在下文中作为例证进行说明。对于编码类胡萝卜素β-紫罗烯环酮酶DNA的插入而言，这些具有玉米黄素相对叶黄素高百分比的突变体金盏花植物是优选的宿主植物。对于编码类胡萝卜素β-酮酶的DNA的插入而言，另一种金盏花突变体是优选的宿主植物，它表现出异常高的β-胡萝卜素比叶黄素比率。

酮酶基因转化之前，作为例证阐述的宿主突变体或经转化金盏花植物的玉米黄素比率大于大约1∶10，并优选地大于大约2∶10。更加优选地是，玉米黄素至少占胡萝卜醇的大约70％，并且最优选地是至少大约90％。因此，相对于同类型的非突变体或非转化植物，玉米黄素可以大约10倍到20倍的增加度存在于所涉及的花瓣中。玉米黄素和叶黄素一般以脂肪酸酯类存在于花瓣中，尽管已经从几种突变体金盏花植物中分离得到了相当量的游离玉米黄素。在另一个实施方案中，宿主突变体或经转化金盏花植物表现出β-胡萝卜素比率至少大于约1∶10，更加优选地是大于约2∶10，直到大约为1(一)。因此，相对于同类型的非突变体或非转化植物中存在的量，β-胡萝卜素能够以大约5到大约200倍的增加度存在。在进一步的实施方案中，相对于同类型的非突变体或非转化植物中存在的量，玉米黄素和β-胡萝卜素之一或两者能够增加至上面所讨论的两种限度之一或两者的水平。

所涉及的宿主植物的花瓣在转化之前通常含有可测量的ζ-胡萝卜素，一般为至少1％或更多。在金盏花花瓣中，通常未发现ζ-胡萝卜素，而它的存在是一种或多种类胡萝卜素色素异常表达的实例。

“玉米黄素比率”被定义为存在于花瓣中的玉米黄素的量除以存在于该花瓣中的玉米黄素加上叶黄素的量[玉米黄素/(叶黄素+玉米黄素)]。金盏花花瓣中通常的玉米黄素比率是从大约1∶15到1∶25，以至于当仅玉米黄素和叶黄素的量用于计算时，玉米黄素占叶黄素+玉米黄素总量的大约5％到大约7％。这里所涉及的花瓣中的优选的玉米黄素比率甚至更大，大约大于1∶10并且优选地是大约大于2∶10，直到1(一)。

Quackenbush等，J.Assoc.Off.Agri.Chem.，55：617-621(1972)的论文中报道了美洲黄万寿菊金盏花花瓣中玉米黄素对叶黄素的比率，其不寻常地高达约1∶4.4，而那些花瓣中胡萝卜醇的总浓度不寻常地低于约0.4mg/g干重。由那些作者所述的墨西哥变种，当测量冻干花瓣时，含有11.1％的玉米黄素，而当测量新鲜花瓣时，含有3.8％的玉米黄素。较高的数值并不与其他剩余的数据保持一致，而且被认为是不正确的。

“β-胡萝卜素比率”同样是这样定义的；即β-胡萝卜素/(叶黄素+β-胡萝卜素)，此处提到的任意其他“比率”也是如此。非突变体植物中，对于花瓣，β-胡萝卜素比率一般大约小于0.007。在所涉及的突变体金盏花中，该比率大约为1∶10，并且在花瓣中优选地大于约2∶10。然而更加优选地是，所涉及的金盏花植物花瓣的β-胡萝卜素比率大于大约3∶10。最优选地是，该比率大于5∶10，并且可以是约1(一)。

如在下文中所论述的那样，花瓣提取物发生皂化作用后，通过高效液相层析(HPLC)测定这些量，从而使叶黄素和玉米黄素的每一个发生皂化作用后存在的醇形式进行测定，而不是以新鲜花瓣中存在的酯化形式进行测定。用于测定植物提取物中类胡萝卜素水平在工业中的标准分析法是AOAC 1984，Official Methods of Analysis(14^th ed)，the Association ofOfficial Analytical Chemists，Arlington，VA，USA中的方法，它们测定的结果与此处所得到的结果相似。

所涉及的金盏花植物是亲本品系的突变体。也就是，用诱变剂(致诱变的)处理第一代品系或杂交物或种子，以提供典型的一次或多次自花授粉(自交)的经诱变植物。此处所涉及的植物能够从诱变自身产生，从自交系产生或从诱变植物或子代与另一诱变或非诱变植物杂交产生。因此，此类植物是相同类型的。

基本上任意一种诱变剂都可以用于产生所涉及的植物，并且在下文中讨论了作为例证的诱变剂。尽管一些所涉及的突变体金盏花其表型明显不同于邻近生长的非突变体金盏花亲本植物，但其他一些所涉及的突变体呈现出基本上与邻近生长的非突变体金盏花亲本植物相同的表型，除了关于类胡萝卜素的表型特性之外。对于后述植物具体地说，当比较亲本与突变体植物的植物特性，如植物高度、植物直径、花头部直径、花头部高度、开花时间、分枝数、分枝长度、花柄长度、下胚轴长度、子叶长度、子叶宽度时，对于一些所涉及到的突变体植物，这些特性的值每一个都在亲本植物的值的大约90％之内，包括测量中的标准差。更加优选地是，突变体的这些特性的值在亲本植物的大约95％之内，并且最优选地是，这些值是相同的，在标准差之内。另一方面，其他突变体植物在一个或多个表型特性方面差别很大。

在亲本与突变体植物之间类胡萝卜素相关的表型差异是从突变体的花中获得的胡萝卜醇或胡萝卜素色素的量。亲本植物，如“Scarletade”或“Deep Orangeade”，一般含有大约10-大约18mg/g干的全部花头部重量的可提取胡萝卜醇色素，而含有非常少量的胡萝卜素。所涉及的含有高比率玉米黄素的突变体植物在花瓣中优选地是含有大约相同数量的类胡萝卜素，但是可含有如大约4mg/g干重那样少，特别是在玉米黄素对叶黄素的比率非常高，如大约9∶1或更大时。其它突变体可含有很少量胡萝卜醇和相对大量的一种或多种胡萝卜素。如前所指出，在金盏花花瓣中通常缺乏β-胡萝卜素。

在邻近生长的植物之间进行表型比较。如此处所使用，术语“邻近生长”用于指生长于所能够获得相似的光照、热、生长培养基、湿度和营养物的条件下的植物，以至于生长条件不支配表型。对于温室生长的植物，“邻近生长”是指在相同台面上尽可能相似的条件下生长的植物。对于田地生长的植物，“邻近生长”是指在相同或相邻的田地中尽可能相似的条件下生长的植物。

用于改变植物的诱变剂在本领域中是众所周知的，使用此类试剂的方法也是众所周知。作为例证的化学诱变剂包括亚硝基甲脲(NMU)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯、二乙基硫酸盐、亚硝基胍和乙基亚硝基脲，其中EMS在此处是优选的。如Cetl等，Folia Fac.Sci.Nat.Univ.Purkynianae Brun.Biol.，21(1)：5-56(1980)论述可以使用NMU，而EMS一般以大约0.25％到大约1％体积比(v/v)被利用，并且优选地是大约0.2％到0.8％。当伽马射线以200到大约2000rads的剂量用于照射种子时也是有用的诱变剂。

除了化学突变体，还可以利用电离辐射如通过γ射线或中子，和重组DNA技术对植物进行突变。因此，电离辐射和重组DNA技术如基因沉默也可以用于实现类胡萝卜素谱的改变。因此，这些植物可以分别被称为化学诱导、电离辐射诱导和重组诱导突变体。结果，突变体宿主植物，如优选的金盏花，此处被定义为通过化学诱导突变、电离辐射诱导突变或重组诱导突变获得的金盏花植物。

因此，γ射线和快中子轰击已经用于其它植物以引起一个或多个基因的缺失。基因沉默可通过表达基因的有意链导致经被称为共抑制的机制下调而实现。对于类胡萝卜素产生途径中存在的一种或多种酶，表达反义基因也能够实现下调。其它技术对于本领域技术人员也是熟知的。

不管所使用的诱变剂，大多数所得到的突变体植物的表型，包括类胡萝卜素相关性状，如花瓣中玉米黄素比率和胡萝卜醇的量，通常基本上与亲本的形状相同，以至于非常大百分比的所获得的突变体是无用的。此外，看起来具有与亲本相同的表型的植物需要经筛选以找出目的突变体植物。这些筛选尽管繁杂却是常规开展的，并且涉及对来自于一个或多个单一花瓣或叶子或两者的类胡萝卜素色素的分析。因此，目的突变体的制备是相对稀少，但可重复的事件。例如，在此处的一个研究中，从所检测的几乎22,000个突变体植物中，仅得到的23个有用的突变体，它们的玉米黄素比率为大约1∶10或更多，在这23个有用的突变体中仅2株植物玉米黄素比率大于约9∶1。在另一个研究中，大约8200株所检测的植物中约43个突变体呈现出约为1∶10或更大的玉米黄素比率。

如已经指出的，所涉及的植物可以是从诱变的种子生长成的植物，或者是自交或杂交的植物。在一个优选的实施方案中，所涉及的植物宿主，如金盏花，是通过两株植物的花进行杂交形成的杂合体，这两株植物来源于从独立的M₁植物(M₁×M₁)产生的不同诱变植物。在另一个实施方案中，所涉及的金盏花宿主是通过将来自于一株诱变植物的花与非诱变植物的花杂交所形成的杂合体。又在另一个实施方案中，所涉及的植物是通过将杂合体与其一个直接亲本的花进行回交所形成的杂合体。如涉及杂合体自交的产物一样，还涉及两种不同杂合体植物杂交的产物。

如已经提到的那样，所涉及的宿主植物它自身可以是突变事件的直接产物，如突变过程后产生的种子的产物。该植物也可以是一个突变体与另一个突变体或与突变体自身一次或多次杂交的产物。所涉及的植物还可以是突变体和非突变体亲本植物之间杂交的结果。筛选所产生的植物并选择所预期的类胡萝卜素谱。

所涉及的宿主植物可以是从诱变的种子生长来的植物或者是自交系或杂交系。在一个优选的实施方案中，所涉及的金盏花是通过两株植物的花进行杂交形成的F₁杂合体，其中所述这两株植物来源于两个不同的诱变植物(M₁×M₁)。在另一个实施方案中，所涉及的金盏花是F₁杂合体，它来源于一株诱变植物的花与非诱变植物的花杂交。也是在另一个实施方案中，所涉及的植物是这样的杂合体，它是通过F₁杂合体与其直接的一个或另一个亲本的花回交形成的。如涉及F₁杂合体自交产物一样，也涉及两株不同的F₁杂合体植物杂交的产物。

使用具有β-胡萝卜素或玉米素黄素丰富的花瓣的金盏花植物突变体作为宿主植物进行转化以产生角黄素和虾青素之一或两者是商业有价值的和有效的。金盏花提供了具有经济学优点的宿主，因为在生长此类植物产生叶黄素的领域中具有丰富的经验。转基因金盏花还提供了易于分离虾青素的高效的来源。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码嵌合酮酶多肽共轭物的DNA片段的插入和编码嵌合羟化酶肽共轭物的DNA片段的插入，如此处已经论述的那样，这两种酶都利用类胡萝卜素β-紫罗烯环作为底物来分别产生4-酮β-紫罗烯环和3-羟基β-紫罗烯环。编码酮酶和羟化酶任意一种的DNA可独立地可操作连接于花瓣优先启动子上。

以前已经论述了作为例证编码有用的羟化酶的基因(crtZ)，它们来自于噬夏孢欧文氏菌(见美国专利号5,429,939)，草生欧文氏菌(见美国专利号5,684,238)，雨生红球藻(见美国专利号5,811,273和5,972,690)，以及橙黄农杆菌和产碱菌PC-1[见Misawa等，J.Bacteriol.，177：6575-6584(1995)]。

如上面所论述的那些羟化酶和酮酶可以插入到其花瓣产生适当的含有β-紫罗烯环的类胡萝卜素前体如β-胡萝卜素的高等植物中。在一些实施方案中，非高等植物羟化酶是优选的。于是β-胡萝卜素可以转化为虾青素。在β-胡萝卜素和虾青素之间至少存在8种含β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物中间体，包括玉米黄素、β-玉米黄质、金盏花黄质、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、β-胡萝卜素-4-酮、角黄素和金盏花玉红质。其表达由花瓣优先启动子控制的羟化酶和酮酶嵌合酶能够导致在高等植物花瓣中产生角黄素，然后形成虾青素。从β-胡萝卜素或其它类胡萝卜素前体通过多种类胡萝卜素转化为4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物，然后转化为3-羟基-4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物，最终形成角黄素和虾青素。由于羟化酶和酮酶来源于除了高等植物外的物种，所以不能观察到当转化的基因与已经存在于宿主植物中的基因相同时所能够观察到的共抑制现象。

本发明一个不同的方面包括其花通常不产生类胡萝卜素的转基因植物

(也就是，“正常”的非转基因植物的花不产生可测量的β-胡萝卜素及其类胡萝卜素家族)，此类植物的例子是长春花属和洋桔梗(lisianthus)。编码催化从共同的前体产生角黄素和虾青素类胡萝卜素的中间体的酶的基因组或基因簇能够被转化入此类植物，从而使花瓣产生虾青素。基因组包括足以产生β-胡萝卜素的酶以及羟化酶和酮酶之一或两者，以将β-胡萝卜素转化形成玉米黄素或角黄素，并转化形成虾青素。

上述基因组包括编码酮酶和羟化酶的基因，以及编码将普遍存在的前体如牻牛儿基焦磷酸和焦磷酸法呢酯转化为GGPP，并将GGPP转化为β-胡萝卜素的酶的基因。Ausich等的美国专利号5,684,238中公布了适当的方法、草生欧文氏菌核酸序列并保藏了含草生欧文氏菌DNA的细胞，以在转化的宿主植物中形成GGPP，并将GGPP转化为八氢番茄红素、八氢番茄红素转化为番茄红素和番茄红素转化为β-胡萝卜素。该专利还教授了方法、草生欧文氏菌核酸序列和保藏的含草生欧文氏菌DNA的细胞，以在宿主植物中将β-胡萝卜素转化为玉米黄素。将宿主植物转化成表达这些基因中的每一基因，并且表达先前所述的酮酶基因，每一基因编码含有N-末端转运肽序列的嵌合酶，可以提供在花瓣中产生虾青素的转基因植物。

更加具体的是，含有定义为草生欧文氏菌酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶结构基因的至少850个碱基对的核苷酸序列的DNA片段，可以用于产生GGPP。作为例证的DNA片段存在于选自以下的质粒中：ATCC登录号为No.40755的质粒pARC417BH、ATCC登录号为No.40758的质粒pARC489B和ATCC登录号为No.40757的质粒pARC489D。

含有定义为草生欧文氏菌八氢番茄红素合酶结构基因的至少1000个碱基对的核苷酸序列的DNA片段，可以用作产生番茄红素的一组基因中的另一个基因。作为例证的DNA片段存在于ATCC登录号为No.40756的质粒pARC285或ATCC登录号为No.40754的质粒pARC140N中。

含有编码草生欧文氏菌八氢番茄红素脱氢酶-4H结构基因的核苷酸序列的DNA片段，对于产生番茄红素也是有用的。作为例证的DNA片段存在于选自以下的质粒中：ATCC登录号为No.40803的质粒pARC496A、ATCC登录号为No.40801的质粒pARC146D、ATCC登录号为No.40802的质粒pATC228和ATCC登录号为No.40806的质粒pATC1616。

含有编码草生欧文氏菌番茄红素环化酶的结构基因的核苷酸序列的DNA片段，可以用于制备β-胡萝卜素。作为例证的DNA片段存在于选自以下的质粒中：ATCC登录号为No.40850的质粒pARC1509、ATCC登录号为No.40851的质粒pARC1510和ATCC登录号为No.40852的质粒pARC1520。

含有编码草生欧文氏菌酶β-胡萝卜素羟化酶的结构基因的核苷酸序列的DNA片段，可以用于制备玉米黄素。作为例证的DNA片段存在于选自以下的质粒中：pARC406BH、pARC429BH和pARC145H。

一个或多个上述DNA片段的DNA变体与上述基因之一具有至少80％的同一性，并且在中等的高严格条件下与上述基因杂交，其中所述高严格条件包括在大约50℃到大约65℃的温度下，在6×SSC中杂交，并且还可以使用最后在68℃时，用1-3×SSC洗涤。

应该理解，每一个上面所述的草生欧文氏菌基因或变体编码含有如前所述的N-末端转运肽的嵌合酶，并且每个基因被提供如前所述的嵌合体花瓣优先表达的启动子所调控。

还应该理解，来自于如前所述的噬夏孢欧文氏菌、橙黄农杆菌、产碱菌属中的某些种、橙黄农杆菌和产碱菌属中的某些种或夹膜红细菌，或如前所述的变体的适当基因的且编码具有N-末端质体转运肽的嵌合酶的DNA序列，可以用于代替来自于草生欧文氏菌的DNA序列。宿主植物也可能还含有基因混合物，其序列于对应于多种来源的基因。

当一株植物在其花瓣中通常不产生有色类胡萝卜素时；即，非转化植物，利用花瓣特异的启动子而不是组成型启动子来指导有色类胡萝卜素的表达是优选的。因此，对于催化番茄红素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和叶黄素产生的酶的表达，利用花特异启动子是优选的，尽管如已经论述的那样，产生4-酮-β-紫罗烯环的酶可以利用组成型启动子进行表达。

包含可操作性的连接到异源基因组DNA序列(转基因)的载体中的重组DNA分子(a)编码嵌合酮酶并(b)含有指导嵌合酶表达的启动子。嵌合酮酶包含(i)融合至(ii)的包含质体转运肽部分的N-末端第一部分，(ii)第二部分，将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分。启动子和质体转运肽优选的是来源于不同的物种。在所涉及的植物中，表达转基因的结果是4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物的花优先的积累。结构基因具有前述的核苷酸碱基序列。

在活生物体中，蛋白质或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码直接与编码该蛋白质的结构基因的脱氧核糖核苷酸序列(DNA)相关。结构基因可以根据它所编码的氨基酸残基序列，即蛋白质或多肽，进行定义。

因此，通过众所周知的遗传密码的简并性，可以制备编码相同氨基酸残基序列的其它DNA和相应的RNA序列，但是它们与先前所述的基因序列有显著的不同，从而使两个序列不能以高严格性杂交，但是能以中等的高严格性杂交。因此，例如，体外诱变可以用于改变DNA序列，以致于可以利用一个或多个不同的密码子表达所表达酶的相同残基。此外，当希望插入或缺失特异限制性核酸内切酶位点的位点时，利用相同的技术能够将一个氨基酸残基改变成为另一个氨基酸残基。而且，结构基因的等位基因变体可以存在于其它有用的生物体中，但它们仅在中等的高严格性下形成杂合双链分子。

通过对所保藏的质粒剪切并可操作地连接适当的限制性片段，或利用众所周知的方法，对此处其他部分所述的那些DNA进行PCR，制备含有与启动子可操作连接的编码质体转运肽和酮酶或所涉及的其它酶的DNA片段，其中质体转运肽的DNA连接于编码酮酶或所涉及的其它酶的DNA片段的5′端。通过这种方式产生的此处有用的DNA分子一般具有粘性末端；即，延伸出分子双链部分之外的“突出”单链部分。用于本发明的DNA分子存在粘性末端是优选的，尽管也涉及到具有钝末端的分子。

通过将载体与所涉及的分离的DNA片段可操作地连接形成质粒，例如此处所述的那些质粒，可以产生此处有用的重组DNA分子。特别优选的重组DNA分子在下面的实施例中进行详细论述。能够指导基因表达的载体此处称为“表达载体”。

上述的表达载体含有表达调控元件，包括启动子。嵌合多肽编码基因被可操作连接于表达载体上，以允许启动子序列调控RNA聚合酶结合和目的多肽编码基因的表达。用于表达多肽编码基因的启动子是如Poszkowski等，EMBO J.，3：2719(1989)和Odell等，Nature，313：810(1985)所述的可诱导的、病毒的、合成的、组成型的启动子，以及Chua等，Science，244：174-181(1989)所给出的时间调控的、空间调控的和时空调控的启动子。

所用表达载体和最终多肽编码基因被可操作连接于其上的预选启动子的选择直接依赖于所预期的功能特性，如表达效率、蛋白质表达位置和时间，以及待转化的宿主细胞。在构建重组DNA分子领域中，这些是固有的众所周知的限制。然而，用于整合入宿主高等植物基因组中的本发明载体能够指导可操作连接的DNA片段中所包含的嵌合多肽编码基因的复制和表达。众所周知，并非全部表达载体整合入宿主植物基因组，而是仅仅一部分整合。但是，为了易于文中意思的表达，将被称为载体整合。

在一个优选的实施方案中，载体包括原核复制子；即，具有指导所转化的原核宿主细胞中染色体外重组DNA分子的自主复制和维持能力的DNA序列。在本领域中，此类复制子是众所周知的。

那些包含原核复制子的载体还可包括能够指导载体所转化的宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)中八氢番茄红素合酶共轭物基因表达的原核启动子区域。与细菌宿主兼容的启动子序列一般在质粒载体中提供，这些质粒载体含有一个或多个适合的限制性酶切位点以插入本发明的DNA片段。典型的此类载体质粒是从Gibco BRL，Gaithersburg，Md获得的pUC18、pUC19和pBR322，以及从Pharmacia，Piscataway，N.J获得的pPL和pKK223-3。这些载体能够用于合成存在于整合表达载体中的DNA片段。

用于在高等植物中基因表达的典型载体在本领域中是众所周知的，并且包括来源于Rogers等，Meth.in Enzymol.，153：253-277(1987)所述的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)癌诱导(Ti)质粒的载体。这些载体是植物整合载体，因为转化时，这些载体将部分载体DNA整合入宿主植物基因组。对于基于Ti质粒的整合载体，整合入宿主植物染色体的区域是Ti质粒右和左边界之间的区域。

此处作为例证的有用的根癌农杆菌载体是Schardl等，Gene，61：1-11(1987)和Berger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：8402-8406(1989)中所述的质粒pKYLX6和pKYLX7。质粒pKYLX6是为中间体构建设计的大肠杆菌载体，而质粒pKYLX7是为了整合所克隆的基因而设计的根癌农杆菌载体。修饰后的载体pKYLX61和pKYLX71含有Hind III、Xho I、BamHI、Pst I和Sst I位点，以代替原来的Hind III-Sst I片段多克隆位点区域。此处另一个有用的载体是从Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA获得的质粒pBI101.2。质粒pKYLX7、pKYLX71和pB7101.2是双元载体，它们与另一个具有vir基因的载体一起用于根癌农杆菌中。

另一个植物转化系统基于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，转化后它诱导形成毛状根而不是瘤块。申请PCT/US87/02512(1988年4月7日公布的WO 88/02405)描述了发根农杆菌A4株的用途，并且它的Ri质粒与根癌农杆菌载体pARC8或pARC16一起转化黄瓜属Cucumissativas L.，cv，Straight Eight，并形成再生的黄瓜属植物。

还涉及到逆转录病毒表达载体形成本发明重组DNA的用途。如此处所使用，术语“逆转录病毒表达载体”是指包含来源于逆转录病毒基因组长末端重复(LTR)区的启动子序列。由于一些类胡萝卜素产物可能与食品工业和染色业有关系，逆转录病毒表达载体优选地是在真核细胞中不完全复制。Verma，PCT公开号WO 87/00551和Cocking等，Science，236：1259-62(1987)中已经描述了逆转录病毒载体的构建和使用。

在一个优选的实施方案中，用于表达嵌合编码基因的载体含有在植物细胞中有效的选择性标记，优选的是药物抗性选择标记。一种优选的药物抗性标记是其表达导致卡那霉素抗性的基因；即，Rogers等，在 植物分子 生物学方法一书中，A.Weissbach和H.Weissbach编辑，Academic PressInc.，San Diego，CA(1988)所叙述的含有胭脂碱合酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合酶3′端非翻译区的嵌合基因。另一个优选的标记是来自转座子Tn9的可检测的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。

已经研发了许多种通过互补的粘性末端和钝末端将DNA可操作连接于载体的方法。例如，互补的同聚核苷酸序列段可以加到将要插入的DNA片段上和加到载体上。然后，通过互补的同聚核苷酸尾之间的氢键将载体和DNA片段连到一起形成重组DNA分子。

作为选择，含有一个或多个限制性核酸内切酶位点的合成接头能够用于将DNA片段连接到整合表达载体上。在存在能够催化钝末端DNA分子连接的酶如细菌噬菌体T4 DNA连接酶时，通过将钝末端DNA片段与大量过量的合成接头分子一起孵育，将合成接头连接于钝末端DNA片段上。这样，反应产物为在它们的末端携带有合成接头序列的DNA片段。然后，用适当的限制性核酸内切酶切割这些DNA片段，并连接入已经用产生与合成接头末端相兼容的末端的酶切割的整合表达载体中。从大量来源，包括New England BioLabs，Beverly，MA，可以买到含有多种限制性核酸内切酶位点的合成接头。

本发明还涉及上述重组DNA分子的RNA等同物。

将多肽编码基因导入多细胞高等开花植物的方法包括农杆菌属介导的植物和愈伤组织转化、原生质体转化、基因转移入花粉、注射入繁殖器官和注射入未成熟的胚。每种方法具有不同的优点和缺点。因此，一种将基因导入特定植物物种的特殊方法没必要对另一种植物物种是最有效的，但是众所周知该方法对于特定植物物种是有用的。

对于将基因导入植物细胞，农杆菌属介导的转移是广泛应用的系统，因为该系统能够将DNA导入全部植物组织，从而不需要从原生质体形成完整植物的再生过程。农杆菌属介导的表达载体通过Ti-DNA将DNA导入植物细胞的用途在本领域中是众所周知的。例如，见Fraley等，Biotechnology，3：629(1985)和Rogers等，Methods in Enzymology，153：253-277(1987)所述的方法。而且，Ti-DNA的整合作用是相对精确的过程，仅导致少量重排。被转移的DNA的区域是由边界序列定义的，并且如Spielmann等，Mol.Gen.Genet.，205：34(1986)和Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，207：471(1987)所描述的那样，插入DNA通常被插入到植物基因组中。

诸如以前所讨论的那些最新的农杆菌属转化载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制，并允许进行如Klee等在 Plant DNA Infectious Agents一书中(T.Hohn和J.Schell编辑，Springer-Verlag，New York(1985))179-203页所述的适当操作。

而且，农杆菌属介导基因转移载体方面最近的技术进展已经改进了基因和限制性酶切位点在载体中的排列，以易于构建能够表达多种多肽编码基因的载体。Rogers等，Methods in Enzymology，153：253(1987)所叙述的载体具有适当的多接头区域，在多接头区域侧翼为启动子和多聚腺苷酸位点，以指导所插入的多肽编码基因的表达，并且适于本发明的目的。

在那些农杆菌属介导转化有效的植物物种中，由于基因转移易于进行和确定的特性而成为经常选择的方法。然而，对于农杆菌几乎没有单子叶植物是天然的宿主，尽管如Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345(1987)所述的那样，利用农杆菌载体已经在芦笋中产生了转基因植物。

叶盘和其它组织如愈伤组织的农杆菌介导的转化表现出仅限于农杆菌天然感染的植物物种。因此，农杆菌介导的转化在双子叶植物中是最有效的。尽管，如上面所提及，也能够完成利用农杆菌的芦笋的转化。

利用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔，以及这些处理的组合的方法，能够完成植物原生质体的转化。[见例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199：183(1985)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.，199：178(1985)；Fromm等，Nature，319：791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.，204：204(1986)；Callis等，Genes and Development，1：1183(1987)；Marcotte等，Nature，335：454(1988)；Wang等，Bio/Technology，10：691-696(1992)；和Fennell等，Plant Cell Reports，11：567-570(1992)]。

针对不同植物物种这些系统的应用依赖于特定的植物物种从原生质体再生的能力。为了转化那些不能成功地从原生质体再生的植物物种，还可以利用其它将DNA导入完整细胞或组织的方法。

例如，可以利用“基因枪”或高速微粒技术。如Klein等，Nature，327：70(1987)；Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8502(1988)；和McCabe等，Biotech nology，6：923(1988)；和Vasil等，Bio/Technology，9：667-674(1992)所述的那样，使用此种技术，携带于小金属颗粒表面的DNA穿过细胞壁并进入细胞质。金属颗粒可以用先前所述的全部或部分载体所包被，如使用通常用于农杆菌介导转化的载体包被。因此，颗粒是用于携带载体进入植物细胞的而不是细菌。一旦进入细胞，农杆菌介导的转化载体的作用方式与当用农杆菌实现转化时其作用方式非常相同。

由于金属颗粒可穿过几层细胞进行，因此允许对组织外植体内的细胞进行转化。组织外植体转化不需要通过原生质体阶段，因此加速了转基因植物的产生。

如Zhou等，Methods in Enzymology，101：433(1983)；D.Hess，InternRev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等，Plant Mol.Biol.Reporter，6：165(1988)所述，还能够通过直接将DNA转移入花粉而将DNA导入植物。如Pena等，Nature，325：274(1987)所述，通过将DNA注射入植物的繁殖器官，能够获得多肽编码基因的表达。如Neuhaus等，Theor.Apl.Genet.，75：30(1987)；和Benbrook等，在 Proceedings Bio Expo.一书中(1986，Butterworth，Stoneham，Mass.)27-54页(1986)所述，还可以将DNA直接注射入未成熟胚和再次水化的干燥胚的细胞中。

植物从单一原生质体或各种外植体的再生在本领域中是众所周知的。[见例如， Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach和H.Weissbach编辑，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1988)]。这种再生和生长过程包括转化细胞和芽体的选择、转化芽体生根和幼小植物在土壤中生长的步骤。

如Horsch等，Science，227：1229-1231(1985)所述，能够实现通过农杆菌导入的含外源基因的植物从叶外植体的再生。在这个过程中，如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983)所述，转化株生长于存在选择剂并且诱导转化植物物种中芽体再生的培养基中。该过程一般在2到4周内产生芽体，然后将这些转化芽体转移入适当的含有选择剂和防止细菌生长的抗生素的根诱导培养基中。

存在选择剂的环境中生根的转化株芽体形成小苗，然后将这些苗移栽到土壤中或其它允许产生根的生长培养基中。这些过程依照所应用的特定植物物中而不同，此类变化在本领域中是众所周知的。

此处还涉及来自于如前所述的杂交或自交的种子。此种种子当在适宜的环境中种植时可生长成熟产生转基因植物，如其花瓣含有虾青素的转基因金盏花。

本发明还涉及所涉及的转基因植物的花粉和胚珠。所涉及的转基因植物的再生部分也就是所涉及的它本身并且包括选自以下部分的细胞，包括胚、子叶、下胚轴、分生组织、花粉、叶、花药、根、根尖和花，或源于它们的原生质体或愈伤组织。从细胞产生可再生植物的方法对于本领域的技术人员是熟知的，并且双子叶植物如金盏花对于此种再生时特别敏感的。

本发明所涉及的另一方面，是含有角黄素或虾青素的转基因花部分，如金盏花花瓣，其中虾青素一般以诸如月桂酸、棕榈酸和豆蔻酸的虾青素脂肪酸酯存在。这些花瓣通常是干燥的并且是磨碎形式的。

还涉及含有角黄素和虾青素脂肪酸酯之一或两者的含油树脂。如在本领域众所周知的那样，含油树脂是植物组织的固体提取物，它包含植物色素如游离的未结合形式的角黄素和此处酯化形式的虾青素酯，有时伴有少量其它植物产物和色素如其它胡萝卜醇酯类，以及少量提取溶剂如己烷或丙酮。所涉及的转基因植物优选金盏花的含油树脂包含角黄素和虾青素之一或两者，和其它存在于所涉及转基因植物花瓣中的胡萝卜醇脂肪酸酯。含油树脂是商业产品并且可以卖给加工商以进一步处理加工成人类或其它动物的食品添加剂、医疗滋养食品、抗氧化剂等产品。

在阐述的转基因金盏花含油树脂制品中，游离胡萝卜醇和胡萝卜醇酯包括虾青素酯和其它可能的胡萝卜醇酯或胡萝卜素，是用己烷、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂从干的转基因金盏花花中提取的。按照本领域熟知的方法进行提取。去除溶剂，最终产生含有高水平游离胡萝卜醇和胡萝卜醇酯的提取物并且占大约99％且优选的为大约99.9％；及，用于提取的有机溶剂占少于大约1％并优选的少于大约0.1％的重量百分比。所得到的无溶剂提取物被称为转基因金盏花含油树脂或更多地被称为含虾青素的金盏花含油树脂。

还涉及到适于用作人或其它动物如像鸡和火鸡这样的家禽、像鳟鱼和鲑鱼这样的鱼类和像虾、龙虾和蟹这样的有甲动物的食品添加剂的组合物。所涉及的食品添加剂能够用于给动物的肉或皮肤以及此类动物特别是鸡的蛋提供颜色。食品添加剂包含存在于金盏花含油树脂中的一种或多种角黄素和虾青素脂肪酸酯的混合物，并且可含有胡萝卜素和其它存在于含油树脂中的胡萝卜醇脂肪酸酯。该脂肪酸酯混合物溶于或分散于食物介质中。通过对先前所述的含油树脂的适当纯化，如通过溶解和过滤，然后在恰当的食物介质如可食用植物油中溶解或分散纯花的混合酯，来制备食品添加剂。

在一些实施方案中，食物介质是可食用的甘油三酯油类。混合物中作为游离胡萝卜醇的含4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素(例如含角黄素或虾青素酯的胡萝卜醇酯或两者)一般的重量百分比为大约0.2-40％，并且优选的是大约2-20重量百分比。作为例证的可食用油类包括小烛树油、椰子油、鳕鱼肝油、棉籽油、油鲱油、橄榄油、棕榈油、谷物油、豆油、花生油、罂粟籽油、红花油、向日葵油。使用含有相对高浓度的不饱和脂肪酸的油类是优选的；即优选的是使用碘值大约为100-150的油类。如众所周知的那样，利用高切断混合器进行混合。如在美国专利号5,382,714中指出的那样，也可分别存在共溶剂和添加剂如乙醇和α-生育酚。

含有4-酮-β-紫罗烯环的组合物(例如角黄素、虾青素或两者的混合物)还通常以含有0.5％到大约20％，并且优选的是大约1％到大约4％的游离角黄素、虾青素、含游离虾青素的类胡萝卜醇的球形丸的形式提供，而作为虾青素酯或含角黄素和虾青素的类胡萝卜醇酯的混合物通常被称为“小球珠”。这些小球珠能够用于以预期的量混合入人类食物如方便食用的谷类，如美国专利号5,270,063中公开的那样，或者混合入小鸡或其它动物食物如在美国专利号5,849,345、5,695,794、5,605,699和5,043,170中公开的作为食品添加剂的小球珠或其它颗粒。

如美国专利号4,670,247所公开的那样，作为例证的小球珠是不溶于水的，并且是通过交联明胶或藻酸盐如藻酸钠，通过包封含4-酮-β-紫罗烯环的组合物而制备的。通过形成含有类胡萝卜素、水、明胶和糖的乳剂来制备含有目的类胡萝卜素的水不溶性小球珠。乳剂被转化成小滴，小滴通常被分别收集于大量淀粉粉末中，通过此种方式来源于小滴的颗粒彼此保持分离直到它们的微粒子形式永久建立。从淀粉收集粉末分离含类胡萝卜素的颗粒，并且在温度为大约90℃到大约180℃时进行热处理。热处理步骤通过糖的羰基与明胶分子的游离氨基之间的反应固化小球珠的明胶基质。所得到的小球珠是水不溶性的并且呈现出对于饲料制粒机的压力提高了的稳定性。交联过程利用应用于制备小球珠的成分，并且不需要向组合物中加入交联剂或添加物。

美国专利号5,695,794公开了另一种形式的小球珠，它适合用于此处作为动物饲料的添加剂。因此直径大约30至55微米的小球珠通过喷雾含有预期量的含虾青素胡萝卜醇酯的氢化蔬菜油的熔化溶液制备的，氢化蔬菜油如氢化棉籽油、麦芽油、红花油、豆油等，它也可含有单酸甘油酯或甘油二酯，如从氢化的豆油单酸甘油酯或甘油二酯、棉籽油单酸甘油酯或甘油二酯等制备的，以及作为抗氧化剂的柠檬酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。如众所周知的那样，也能够使用其它抗氧化剂，如乙氧喹(ethoxiquin)、维生素E等。在大约160°F(大约70℃)的温度下，将熔化的混合物喷雾进入喷雾冷却器如购自Niro，Inc.，Columbia，MD的气旋气流以产生冷却固化的小球珠。如众所周知的那样，用抗结块剂，如火成二氧化硅、磷酸钙、粉末状淀粉或纤维素，将冷却的小球珠粉末化，以形成被优选的加入到食物中作为添加剂的小球珠。作为例证的小球珠每克含有大约10-100毫克含虾青素的胡萝卜醇(mg/g)并且优选的是大约10-50mg/g。

将所涉及的4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素组合物(例如角黄素、虾青素、含虾青素的胡萝卜醇酯的混合物或两者的混合物)加入到动物饲料中在本领域中是众所周知的。上面提到的美国专利号5,849,345、5,695,794、5,605,699和5,043,170提供了对于禽类特别有用的作为例证的饲料。美国专利5,935,624和2,918,370进一步提供了示例性的禽类饲料。

美国专利号5,258,189教授了将β-胡萝卜素添加到对于人类方便食用的谷类产品中，其中β-胡萝卜素与分散于蔬菜油中或以干燥形式存在的经烹饪谷类产品混合。能够在预期的水平使用含4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素的组合物以代替相似食物产品中的β-胡萝卜素。

适宜用作食物添加剂的另一种组合物包含溶于或分散于食物介质中的含有4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素的组合物。该组合物含有角黄素和水解的含4-酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素组合物如与存在于金盏花含油树脂中的酯类相比无乙醇(或酮)化合物的含虾青素胡萝卜醇中之一或两者。

用于皂化金盏花含油树脂以提供游离胡萝卜醇的方法是众所周知的。见，例如Tcyczkowski等，Poultry Sci.70(3)：651-654，1991；和美国专利号5,382,714，通过加入有机溶剂，从皂化的金盏花含油树脂结晶出叶黄素。

此外，Ausich等美国专利号5,648,564教授了通过将金盏花含油树脂与含有丙二醇和水溶性碱优选的是氢氧化钾的组合物混合以形成含油树脂和丙二醇一起组成的至少75％重量百分比的反应混合物，从金盏花油树脂中产生结晶叶黄素。将所形成的反应混合物在温度为大约65℃到大约80℃维持一段时间(一般是至少3小时)，以足以皂化胡萝卜醇酯并形成结晶形式的含有游离胡萝卜醇的皂化反应混合物。将皂化提取物与稀释量的水混合以溶解水溶性的杂质并降低反应混合物的粘度。轻轻混合稀释的混合物直到均匀，然后过滤收集胡萝卜醇结晶。用温水洗涤所收集的胡萝卜醇结晶并干燥。用丙二醇而不使用其它有机溶剂从含胡萝卜醇酯的含油树脂中分离和纯化胡萝卜醇。所形成的干燥胡萝卜醇结晶一般与食物介质如上述的甘油三酯混合。混合物中胡萝卜醇含量一般约0.1％到大约35％的重量百分比，并优选约1％-约10％。

皂化(水解)虾青素酯以提供游离胡萝卜醇的方法是众所周知的。见，例如Kamata和Simpson，Comp.Biochem.Physiol.86B(3)：587-591，1987；和Yuan和Chen，J.Agric.Food Chem.47：31-35，1999，它们都教授了在氮存在条件下虾青素酯的皂化作用。

对于脂肪酸分析，在氮存在条件下，Kamata和Simpson利用0.1 N甲醇化KOH并加热到100℃40分钟使从夏侧金盏花得到的纯化的虾青素二酯皂化。皂化作用后，加入0.5 N HCl使样本变酸，并且用石油醚提取虾红素，其中所述虾红素是虾青素的一种结构转化。

Yuan和Chen(见上)鉴定了水解雨生红球藻色素提取物中的虾青素酯，而没有虾青素显著的降解或结构转化的皂化方法。对于不同浓度(10-100mg/l)的提取物，在氮存在的黑暗条件下，利用0.018M甲醇化NaOH，在6小时内完成虾青素酯的完全水解。当用较高浓度的甲醇化NaOH溶液时，水解反应速率提高，但发生显著的虾青素降解。

不用进一步的创造性劳动，根据上面的描述，认为本领域的技术人员能够最大限度地利用本发明。因此，以下优选的特定实施方案仅作为阐述的目的给出，并不以任何方式限制本公开。

实施例1：β-胡萝卜素酮酶(β-胡萝卜素加氧酶)表达载体的构建

A.来自于雨生红球藻的β-胡萝卜素酮酶

利用由Dr.Toshihiro Toguri，Kirin Brewery Co.，Ltd获得的基因克隆作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)，制备来自雨生红球藻的β-胡萝卜素酮酶基因(crtW)[见Kajiwara等，Plant Mol Biol.，29(2)：343-352(1995)]。使用特异引物在基因的3′末端导入Kpn I限制性酶切位点(crtW-L28：GCCAGTGCCAA GGTACCTCTGTCATGCC；SEQ IDNO：1)，并且在5′末端导入Nde I位点(crtW-U28：CCGGGGATCCTCTACATATGCACGTCGC；SEQ ID NO：2)。用KpnI和Nde I消化后将crtW基因连接入含有胭脂碱合酶多聚腺苷酸信号的质粒pBHX533(图2)中。将所得到的载体命名为pBHX539(图3)。

使用在5′末端导入Xma I位点(rbcsU30：CTCGTCGAC辣CCGGGATGGC TTCCTCAGTTC；SEQ ID NO：3)并在3′末端导入NdeI位点(rbcsL30：CCCATATGTTGCACTCTTCCGCCGTTGCTG；SEQID NO：4)的引物，通过PCR制备来源于烟草(Nicotiana tabacum)的核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的转运肽(RUBISCO；rbcs)[见MaZur等，Nucleic Acids Res.，13(7)：2373-2386(1985)]。将转运肽序列连接入pBHX539的Nde I和Xma I限制酶切位点之间。将所得到的载体命名为pBHX543(图4)。

使用在5′末端导入Hind III和Sal I位点(UBQ3U37：ACAAGCTTTCAGAGTCGACTTCGGATTTGGAGCCAAG；SEQ ID 5)并在3′末端导入Xma I位点(UBQ3L28：TCATCCCCGGGATGTGAAAGA GAGAGTC；SEQ ID 6)的引物，通过PCR制备来源于拟南芥菜遍在蛋白3(UBQ3)的基因启动子。将UBQ3 PCR产物连接入pBHX543中Hind III和Xma I限制酶切位点之间。将所得到的质粒命名为pBHX546(图5)。

质粒pBHX544

用Hind III和EcoR I消化，从pBHX657(图10；见实施例2)中去除含有全部LIS1::rbcs::crtW::nos表达盒的大约2.4kb片段。将该片段连接入pUC19的Hind III和EcoR I位点之间。将所得到的质粒命名为pBHX544(图6)。该质粒含有在LIS1启动子控制下的表达雨生红球藻crtW基因的完整表达盒。

B.来自于拟南芥菜的启动子

质粒pBHX560

利用在5’末端加入Hind III位点(UBQ11U30：CAAAGCTTCAGACTAGTCGACTTGCCTCAA；SEQ ID NO：7)并在3’末端加入Xma I位点(UBQ11L30：CAATTCGATGGGGCCCGGGATCTTGATCAC；SEQID NO：8)的引物，通过PCR制备来自于拟南芥菜遍在蛋白11(UBQ11)基因的上游(启动子)区域[见Callis等，Genetics，139(2)：921-939(1995)；和Sun等，Plant J.，11(5)：1017-1027(1997)]。用Hind III和Xma I消化质粒pBHX544以去除LIS1启动子并且将UBQ11启动子连接入这些位点。所得到的质粒含有在UBQ11启动子控制下的雨生红球藻crtW完整的表达盒，并且该质粒被命名为pBHX560(图7)。

C.来自于橙黄农杆菌的β-胡萝卜素酮酶

质粒pBHX562

利用基因的克隆(从Dr.Toshihiro Toguri，Kirin Brewery Co.，Ltd.获得的)作为模板，通过PCR制备来自于橙黄农杆菌的crtW基因[见Misawa等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209(3)：867-876(1995)；Misawa等，J.Bacteriol.，177(22)：6575-6584(1995)]。至于雨生红球藻基因，使用特异引物在基因的3’末端导入Kpn I限制性酶切位点(Ag-crtWL24：CCAGTGCCAAGCT GGTACCGTCAT；SEQ ID NO：9)并且在5’末端导入Nde I限制性酶切位点(Ag-crtWU26：GGGGATCCTCTACATATGAGCGCACA；SEQ ID NO：10)。用Kpn I和Nde I消化质粒pBHX544以去除雨生红球藻crtW基因，并将橙黄农杆菌基因连接入那些位点。所得到的质粒含有在LIS1启动子控制下的橙黄农杆菌crtW基因表达的完整表达盒，并且该质粒被命名为pBHX562(图8)。

质粒pBHX564

利用相似的步骤，用Kpn I和Nde I消化质粒pBHX560以去除雨生红球藻crtW基因，并将橙黄农杆菌基因连接入那些位点。所得到的质粒含有在UBQ11启动子控制下的橙黄农杆菌crtW基因表达的完整表达盒，并且该质粒被命名为pBHX564(图9)。

质粒pBHX650

通过修饰商业载体pUC18构建了biolistic(通过轰击转化)转化的通用克隆载体。

用Kpn I消化质粒pBHX598(见上)，并用T4 DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Hind III消化质粒以释放含有UBQ3启动子和nptII编码序列的DNA片段。将该片段连接入已经用Nde I消化并用T4 DNA聚合酶处理产生钝末端，然后用Hind III消化的质粒pUC18。所得到的质粒命名为pBHX650(图22)

D.大肠杆菌产生虾青素

pBHX611

构建了在大肠杆菌中表达雨生红球藻β-胡萝卜素酮酶的质粒。用KpnI消化质粒pBHX543(见实施例1)，并用T4 DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Nde I消化该质粒以释放含有crtW基因的DNA片段。将该片段连接入已经用BamH I消化并用T4 DNA聚合酶处理产生钝末端然后用Nde I消化的商业质粒pET15b(Novagen，Madison，WI)。所得到的质粒命名为pBHX611。

将质粒pBHX611转化入产生玉米黄素的大肠杆菌菌株[pAC-ZEAX；Lotan等，FEBS Letters，364：125-128(1995)]和产生β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株[pAC-BETA；Cunningham等，Plant Cell 8：1613-1626(1996)]。转化的pAC-BETA菌株的HPLC分析显示出存在70.7％的角黄素、9.9％β-胡萝卜素和其它未鉴定的假定的酮-类胡萝卜素。转化的pAC-ZEAX菌株的HPLC分析显示出存在70.8％的虾青素、11.8％的玉米黄素和3.3％的β-胡萝卜素。这些结果与上述Lotan等的文章中报道的结果相矛盾，该文章中所述的相似研究不产生虾青素并且得出玉米黄素不是所编码的酮酶的底物的结论。

实施例2：双元载体

质粒pBHX103

含有仙女扇LIS1基因5’侧翼区的质粒是从密歇根大学的Dr.EranPichersky获得的。使用引物：BHX30：CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(SEQ ID NO：11)和BHX36：CAGCCC GGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(SEQ ID NO：12)通过PCR合成含LIS1 5’侧翼区的大约1kb的片段。这些引物被设计成能够在一个末端和3’末端的5’非翻译前导区与5’侧翼区退火。用分别在片段的5’和3’末端切割的限制性酶Hind III和Sma I消化PCR产物。将所消化的片段进行凝胶纯化并随后插入到Hind III和Sma I消化的含有多克隆位点区域(MCS)和其后含有nos polyA信号区的质粒中，产生LIS1::MCS::nos转基因(命名为质粒pBHX103)。

质粒pBHX107

将来自质粒pATC921(美国专利号5,618,988；含有crtB基因，其中rbcs转运肽融合到crtB蛋白质编码区的N末端)的1.5kb Hinc II片段以有意方向插入到定位于质粒pBHX103的LIS1启动子和nos片段之间的Sma I位点处以产生质粒pBHX107。

质粒pBHX112

用Hind III和EcoR I消化质粒pBHX107以释放含有LIS1::rbcs::crtB::nos转基因的片段。然后将该片段连接入预先用Hind III和EcoR I消化了的T-DNA双元载体以产生质粒pBHX112。

质粒pBHX113

如前所述，利用在5′末端导入Hind III位点(LIS1U29：CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC；SEQ ID NO：13)并在3′末端导入Sma I位点(LIS1L31：CAGCCCGGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG；SEQ ID NO：14)的引物通过PCR制备含有仙女扇LIS1基因启动子启动子区域的Hind III-EcoR I片段。融合于GFP基因(包含于从Arabidopsis Biological Resource Center in Columbus，OH获得的质粒pCD3-327中的sm-RSGFP形式)的LIS1 PCR产物和nospolyA信号含有区是分离的。然后将该片段连接入预先用Hind III和EcoRI消化的T-DNA市售双元载体pBI101[见Jefferson等，EMBO J.，6(13)：3901-3907(1987)]以产生pBHX113。

质粒pBHX567

用限制性酶Sma I和EcoR I消化质粒pBHX546以释放含有RUBISCO转运肽、crtW基因和nos多聚腺苷酸信号的DNA片段。用SmaI和EcoR I消化质粒pBHX113并用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理，去除GFP基因序列和nos多聚腺苷酸信号。通过连接将来自于pBHX546的DNA片段插入到消化后的双元载体pBHX113以产生质粒pBHX567(图10)。该植物表达双元载体含有由芳樟醇合酶1(LIS1)启动子驱动的雨生红球藻β-胡萝卜素酮酶(crtW)。

质粒pBHX522

通过修饰商业载体pBI101构建通用双元克隆载体[见Jefferson等，EMBO J.，6(13)：3901-3907(1987)]。利用在5’末端加入Hind III和Mfe I位点(nptU38：GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT；SEQ ID NO：15)并在3’端加入Kpn I位点(nptL32：CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA；S EQ ID NO：16)的引物，通过PCR制备新霉素磷酸转移酶II(nptII)选择性标记基因。将该PCR产物连接入已经用Hind III和Kpn I消化了的载体pBHX533(图2)。所得到的载体命名为pBHX503(图11)。用Hind III和EcoR I消化来自pSAN237的UBQ11启动子[见Norris等，Plant Mol.Biol.，21：895-906(1993)]并将其连接入用Hind III和Mfe I消化后的质粒pBHX503中。将所得到的质粒命名为pBHX510(图12)。

用EcoR I消化质粒pBHX510并用Klenow DNA聚合酶加dNTPs处理以产生钝末端。然后用Hind III消化该质粒以释放含有UBQ11启动子、nptII基因和胭脂碱合酶多聚腺苷酸信号(nos)的DNA片段。将该片段连接入已经用EcoR I和Pme I消化去除了抗生素抗性盒的质粒pBI101(见上)中。将所得到的质粒命名为pBHX522(图13)。

用Hind III和EcoR I消化载体pBHX522以去除β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码区和胭脂碱合酶多聚腺苷酸信号。通过用Hind III和EcoR I消化移去来自于上述的每一非双元载体的crtW表达盒，并将其连接入消化后的质粒pBHX522中。

质粒pBHX544的双元形式(LIS1/雨生红球藻crtW)被命名为质粒pBHX561(图14)。质粒pBHX560的双元形式(UBQ11/雨生红球藻crtW)被命名为质粒pBHX565(图15)。质粒pBHX562的双元形式(LIS1/橙黄农杆菌crtW)被命名为质粒pBHX563(图16)。质粒pBHX564的双元形式(UBQ11/橙黄农杆菌crtW)被命名为质粒pBHX566(图17)。在与pBHX567相同的区域构建第二个LIS1/雨生红球藻crtW双元载体并且命名为pBHX586(图18)。

质粒pBHX689

用Hind III和EcoR I消化含有类胡萝卜素表达盒LIS1::rbcs::crtI::nos的双元载体pBI101以分离该表达盒。用Hind III和EcoR I消化载体pUC19并将其与类胡萝卜素表达盒连接。将所得到的质粒命名为质粒pBHX612(图26)。用Sma I和Kpn I消化质粒pBHX612以去除crtI编码序列。用Sma I和Kpn I消化含有部分类胡萝卜素盒rbcs::crtB::nos的载体pUC19以分离crtB编码序列，然后将该序列连接入消化后的质粒pBHX612中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX663。

用Sal I和EcoR I消化含有类胡萝卜素表达盒UBQ3::rbcs::crtI::nos的双元载体pBI101以分离表达盒。通过用Xho I和EcoR I消化使质粒pBHX663线性化，然后与所分离的crtI表达盒连接。将所得到的质粒命名为质粒pBHX671。

通过用Hind III和EcoR I消化，从载体pBHX671中分离双类胡萝卜素盒，然后将其连接入用相同的两种酶消化的通用植物转化载体pBHX650中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX689(图19)。

质粒pBHX607

通过修饰商业载体pBI101构建通用双元克隆载体[见Jefferson等，EMBO J.，6(13)：3901-3907(1987)]。利用在5’末端加入Hind III和Mfe I位点(nptU38：GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT；SEQ ID NO：15)并在3’末端加入Kpn I位点(nptL32：CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA；SEQ ID NO：16)的引物，通过PCR制备新霉素磷酸转移酶II(nptII)选择性标记基因。将该PCR产物连接入已经用Hind III和Kpn I消化了的载体pBHX533(图2)中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX520。用Hind III和EcoR I消化来自pSAN155的UBQ3启动子[见Norris等，Plant Mol.Biol.，21：895-906(1993)]，并将其连接入用Hind III和Mfe I消化的质粒pBHX520中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX598。

用Kpn I消化质粒pBHX598并用T4 DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Hind III消化该质粒以释放含有UBQ3启动子和nptII编码序列的DNA片段。将该片段连接入已经用EcoR I和Pme I消化去除了抗生素抗性盒的质粒pBI101(见上)中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX607(图23)  。

质粒pBHX658

通过修饰商业载体pBI101构建通用双元克隆载体[见Jefferson等，EMBO J.，6(13)：3901-3907(1987)]。利用在5’末端加入Hind III和Mfe I位点(nptU38：GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT；SEQ ID NO：15)并在3’末端加入Kpn I位点(nptL32：CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA；SEQ ID NO：16)的引物，通过PCR制备新霉素磷酸转移酶II(nptII)选择性标记基因。将该PCR产物连接入已经用Hind III和Kpn I消化了的载体pBHX533(图2)中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX520(图XX)。用Hind III和EcoR I消化来自于pSAN155的UBQ3启动子[见Norris等，Plant Mol.Biol.，21：895-906(1993)]，并将其连接入用Hind III和Mfe I消化了的质粒pBHX520中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX598。

用Kpn I消化质粒pBHX598并用T4 DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Hind III消化该质粒以释放含有UBQ3启动子和nptII编码序列的DNA片段。将该片段连接入已经用Dra III消化并用T4 DNA聚合酶处理以产生钝末端的质粒pBI101(见上)中，然后用Hind III进行消化以去除抗生素抗性盒。将所得到的质粒命名为质粒pBHX654。

利用加入Pme III位点((pUC19mcsL24 CACGTTTAAACTACCGCACAGATG；SEQ ID NO：17)并保留Hind III位点(pUC19mcsU20GGCCGCATACAGGCTGTCAG；SEQ ID NO：18)的引物，通过PCR制备来自pUC19的多克隆位点。将该PCR产物连接入已经用Hind III和Pme I消化去除了所存在的npt II可选择标记的载体pBHX654中。将所得到的质粒命名为pBHX658(图24)。

质粒pBHX691

用Sma I和Kpn I消化含有类胡萝卜素表达盒LIS1::rbcs::crtI::nos的双元载体pBI101以去除crtI编码序列。用Sma I和Kpn I消化含有部分类胡萝卜素表达盒rbcs::crtW::nos的载体pUC19以分离crtW编码序列，然后将该序列连接入消化了的质粒pBI101载体中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX586。通过用Hind III和EcoR I消化从质粒pBHX586中去除类胡萝卜素表达盒，然后将其连接入也已经用Hind III和EcoR I消化了的双元载体pBHX607中。将所得到的载体命名为pBHX665。

利用在5’末端加入Nde I位点(crtZU30 CGGGGATCCTCTACATATGACCAATTTCCT；SEQ ID NO：19)并在3’末端加入Kpn I位点(crtZL30 CGACGGCCGGTACCAAGCTAGATCTGTCAC；SEQID NO：20)的引物，通过PCR制备噬夏孢欧文氏菌crtZ基因。用Nde I和Kpn I消化该PCR产物，并将其连接入已经用相同酶消化去除了crtI基因且含有类胡萝卜素盒UBQ3::rbcs::crtI::nos的pUC19载体。将所得到的载体命名为质粒pBHX667。

通过用Hind III和Sal I消化，使载体pBHX667线性化。通过用HindIII和Xho I消化，从质粒pBHX665中去除了类胡萝卜素表达盒，然后将该表达盒连接入质粒pBHX667形成双类胡萝卜素表达盒。将所得到的双类胡萝卜素表达载体命名为质粒pBHX683。

通过用Hind III和EcoR I消化从质粒pBHX683中去除双类胡萝卜素表达盒，并将其连接入用相同的两种酶消化了的植物表达载体pBHX650中。将所得到的质粒命名为质粒pBHX691(图20)。

质粒pBHX701

利用在5’末端加入Nde I位点(ketoU28 GAAACCTCATATGGCAGCAGCAATTTCA；SEQ ID NO：21)并在3’末端加入Kpn I位点(ketoL32 CACGGTACCTTCAGGTAGATGGTTGCGTTCGT；SEQID NO：22XX)的引物，通过对夏侧金盏花基因组DNA进行PCR制备夏侧金盏花酮酶基因。将未消化的PCR产物连接入商业载体pGEM-TEasy^TM中。筛选到经鉴定含有侧金盏花(Adonis)酮酶1(AdK1)的编码序列的克隆(质粒pBHX604)和侧金盏花酮酶2编码序列AdK6的克隆(质粒pBHX603)。

用Not I和Hind III消化质粒pBHX612并连接至复性的寡核苷酸对(LisAd 1 GGCCGCAAGCTTGAGGAGGTCGAC；SEQ ID NO：23，和LisAd 2 AGCTGTCGACCTCCTCAAGCTTGC；SEQ ID NO：24)。这恢复了Not I和Hind III位点并在Hind III位点的下游加入了Sal I位点。将所得到的载体命名为质粒pBHX669。

用EcoR I消化质粒pBHX603并用Klenow DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Kpn I消化该质粒并连接入用Sma I和Kpn I消化了的载体pBHX669中。将所得到的质粒，含有LIS1启动子驱动的并用胭脂碱合酶多聚腺苷酸序列终止的侧金盏花酮酶2基因AdK6的质粒命名为pBHX685。

用Hind III和EcoR I消化质粒pBHX685以分离酮酶表达盒，该表达盒被连接入已经用相同的两种酶消化了的双元表达载体pBHX607中。将所得到的表达质粒命名为质粒pBHX701(图21)。

质粒pBHX749

用EcoR I消化质粒pBHX604并用Klenow DNA聚合酶处理以产生钝末端。然后用Kpn I部分消化该质粒并将其连接入用Sma I和Kpn I消化了的质粒pBHX669中。将所得到的质粒，含有LIS1启动子驱动的并用胭脂碱合酶多聚腺苷酸序列终止的侧金盏花酮酶1基因AdK1的质粒命名为pBHX687。

用Hind III和EcoR I消化质粒pBHX685(见上)以分离酮酶表达盒，然后将该表达盒连接入已经用相同的两种酶消化了的biolistic表达载体pBHX650中。将所得到的酮酶2表达质粒命名为质粒pBHX743。

通过用EcoR I和Xho I消化使载体pBHX743线性化。通过用EcoR I和Sal I消化从质粒pBHX687(见上)中移去酮酶1表达盒，然后将该表达盒连接入载体pBHX743中。将所得到的双酮酶表达载体命名为pBHX747。

用Hind III和EcoR I消化质粒pBHX747以分离双酮酶表达盒，然后将其连接入已经用相同的两种酶消化了的双元表达载体pBHX658中。将所得到的表达质粒命名为pBHX749(图25)。

实施例3：万寿菊‘Scarletade’的EMS处理

用甲磺酸乙酯(EMS，从Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO 63178商业获得)处理命名为‘Scarletade’的万寿菊胡萝卜醇金盏花(从PanAmerican Seed Co.622 Town Road，West Chicago，IL 60185商业获得)的种子。将大约2,500粒种子加入到400ml 0.4％(v/v)或0.8％(v/v)EMS中，并在室温轻轻搅拌8小时。在EMS处理后的4小时期间内，将种子洗涤16次，每次用400ml蒸馏水连续搅拌洗涤。然后将所处理的种子，定义为M₁种子，播种于含有无土陶瓷混合物的盘中。

几个星期后，将秧苗移植入含有无土陶瓷混合物的罐中，并养殖在温室中。由这些植物产生的花天然自花授粉。从大约2,300株植物中收获所得到的种子，定义为M₂种子。在这2,300株植物中，大约1,500株是由0.4％EMS处理的种子生长而来的，而大约800株是由0.8％EMS处理的种子生长而来的。为了易于鉴定突变体植物，将来自于50株M₁植物中每一株的M₂种子混合为一堆，结果产生总共47堆种子。在2000的夏天，将来自于47堆种子的每一堆的500粒种子播种并且得到的植物是在Santa Paula，CA93060的Pan merican Seed Co的田间生长的。

实施例4：EMS-处理的万寿菊‘Scarletade’的HPLC筛选

EMS-处理的‘Scarletade’植物是在Santa Paula，CA 93060的Panmerican Seed Co的田间生长的，并且通过HPLC筛选改变的玉米黄素比率。选择大约98％完全开放的花用于分析。从每朵花中取每个花瓣距花中央三分之一距离处的部分并放置于含有大约5克玻璃珠的3.5″×0.75″小玻璃瓶中。用干冰将小玻璃瓶包裹直至储存于-80℃。

对于分析，溶剂递送和小份去除都由自动系统完成，自动系统包括一个单一注射器阀Gilson 232XL和一个402 2S1V稀释加液器[Gilson，Inc.USA，3000W.Beltline Highway，Middleton，WI]。对于皂化作用，将3ml50％氢氧化钾的乙醇水溶液(4份水∶1份乙醇)加入到每个小玻璃瓶中，随后加入3ml辛醇。皂化作用处理是在室温进行的，在IKA HS 501水平振荡器[Labworld-online，Inc.，Wilmington，NC]上的小玻璃瓶中，以250转/分钟持续进行15小时，随后静置大约1小时。

皂化作用之后，用0.9ml甲醇稀释上清液。在保证样本均匀性的压力下加入甲醇。使用0.25ml注射器，取出0.1ml小份液体转移至HPLC小瓶进行分析。

对于HPLC分析，使用Hewlett Packard 1100 HPLC，它全部具有四个一组的泵、真空除气系统、六道注射阀门、温度调节的自动取样器、柱加热炉和光敏二极管阵列检波器[通过Ultra Scientific Inc.，250 SmithStreet，North Kingstown，RI获得的Agilent技术]。柱子是WatersYMC30，5微米，4.6×250毫米并具有相同材料的防护柱[Waters，34 MapleStreet，Milford，MA]。移动相的溶剂是81份甲醇∶4份水∶15份由0.2％BHT(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)稳定的四氢呋喃(THF)。注射量为20μl。在30℃，1.7ml/分钟流速时，均等地分离。通过447nm处的吸光率测定峰值反应。

利用这个方法，将来自第一批2,546个样本的结果进行统计学分析，以确定叶黄素和玉米黄素含量的平均值。由于这是半定量的分析筛选，所以使用峰面积的值。为了鉴定具有高于平均叶黄素和/或玉米黄素浓度的突变体，计算大于平均值的三个标准差的值。所计算的峰面积平均值、标准差和玉米黄素比率示于表1，见下。

                            表1

               叶黄素和玉米黄素置信区间计算

统计的	叶黄素峰面积	玉米黄素峰面积	比率(％)
				平均值	775.0	41.6	5.03
标准差(sd)	263.2	16.4	0.71
				平均值+3sd	1564.6	90.9	7.16

基于上面的值，选择叶黄素峰面积大于1565和/或玉米黄素峰面积大于91的样本。还选择仅有高叶黄素峰面积的样本，和仅玉米黄素比率大于10％的样本。利用这些选择参数，从21,754株测定样本中鉴定出总共88个突变体。由每一EMS种子处理所得的突变体的总数示于表2，见下。

                            表2

          EMS处理的‘Scarletade’突变体的相关性

选择参数	0.4％EMS处理	0.8％EMS处理	植物总数
				玉米黄素比率＞10％	10	13	23
叶黄素＞1566并且玉米黄素＞91	18	10	28
				叶黄素＞1566并且玉米黄素＜91	20	7	27
叶黄素＜1566并且玉米黄素＞91	7	3	10

关于叶黄素和玉米黄素分析的更加具体的结果示于表3，见下。

                                     表3

                         所鉴定的‘Scarletade’突变体

植物标记号	叶黄素面积	玉米黄素面积	玉米黄素百分比	所用的EMS百分率
					124-257	2.115	55.635	96.34	0.4
119-494	9.254	131.036	93.40	0.8
					112-263	8.095	35.273	81.33	0.4
118-036	11.441	31.691	73.47	0.8
					088-452	2.94	6.689	69.47	0.4
118-035	11.289	23.951	67.97	0.8
					114-334	58.24	97.968	62.72	0.4
117-185	39.002	44.027	53.03	0.8
					108-108	13.424	10.155	43.07	0.4
088-425	8.959	4.394	32.91	0.4
					094-238	7.285	3.063	29.60	0.4
110-308	46.753	14.248	23.36	0.4
					132-346	31.036	8.856	22.20	0.8
100-334	282.987	54.298	16.10	0.8
					101-331	246.402	46.467	15.87	0.8
100-198	119.381	21.449	15.23	0.8
					101-190	139.027	23.125	14.26	0.8
114-315	351.524	56.898	13.93	0.4
					100-470	189.703	27.743	12.76	0.8
117-348	369.903	43.315	10.48	0.8
					132-266	374.096	43.8	10.48	0.8
123-310	60.743	6.818	10.09	0.4
					116-106	453.538	50.287	9.98	0.8

大约21,700株植物呈现出典型的玉米黄素比率为大约4％-大约7％(大约1∶25-大约1∶15)。以上数据表明所预期的突变相对稀少，并且几乎相等数量的植物呈现出降低的玉米黄素水平。该数据也没显示出使用一种水平诱变剂相对此处所用的另一种诱变剂的优先性。

实施例5：万寿菊13819的EMS处理

用甲磺酸乙酯(EMS，从Sigma Chemical Co.St.Louis，MO 63178商业获得)处理命名为13819的万寿菊胡萝卜醇金盏花(PanAmerican SeedCo.622 Town Road，West Chicago，IL 60185的繁殖选择品系)的种子。将大约7,000粒种子加入到600ml 0.2％(v/v)或0.4％(v/v)的EMS中，并在室温轻轻搅拌8小时。在EMS处理后的4小时期间内，将种子洗涤16次，每次用600ml蒸馏水持续搅拌洗涤。

然后，将处理的种子定义为M₁种子，播种于含有无土陶瓷混合物的盘中。3-4周后，将幼苗移植入田间。将由这些植物产生的花包起来以防止交叉授粉，并同时允许自花授粉。从大约2,391株植物收获所得到的种子定义为M₂种子。在这些植物中，大约951株是由用0.2％EMS处理种子生长而来的，大约1,440株是由用0.4％EMS处理种子生长而来的。

为了易于突变体植物的鉴定，将来自于50株植物中每一株的M₂种子合并为一堆。这种分组最终形成了总共48个种子堆。

从2000年10月末到11月中旬，播种来自于0.4％EMS处理的15堆种子的每一堆的1000粒种子，并且每一堆的700株植物在Seaview Nurseryin El Rio，CA 93060的温室中生长。此外，在2000年10月末播种来自于全部48堆的1,500粒种子，并且来自于这些堆的每一堆的765株植物在Semillas Pan American Chile LTDA，in Pichidegua，Chile的田间生长。

实施例6：EMS处理的万寿菊13819的HPLC筛选

EMS处理的13819 M₂植物分别在Seaview Nursery in El Rio，CA93060的温室生长和在Semillas PanAmerican Chile LTDA，in Pichidegua，Chile的田间生长，并对改变了的玉米黄素比率进行筛选。选择大约98％全部开放的花进行分析。从这些花中取距花中央三分之一距离处的花瓣。将大约100mg花瓣组织放置于塑料袋并冰冻储存直至分析。测量放置于含有约5克玻璃珠的3.5″×0.75″小玻璃瓶中的两组花瓣的干重。

对于分析，用含有一个单一注射器阀Gilson 232XL和一个402 2S1V稀释加液器完成溶剂递送和小份液体去除。对于皂化作用，将3ml50％氢氧化钾的水-乙醇溶液(4份水∶1份乙醇)加入到每个小玻璃瓶中，随后加入3ml辛醇。皂化作用处理是在室温进行的，在IKA HS 501水平振荡器上的小玻璃瓶中，以250转/分钟持续进行15小时，随后静置大约1小时。

皂化作用之后，用0.9ml甲醇稀释上清液。在保证样本均匀性的压力下加入甲醇。使用0.25ml注射器，取出0.1ml小份液体转移至HPLC小瓶进行分析。

对于HPLC分析，使用Hewlett Packard 1100 HPLC，它全部具有四个一组的泵、真空除气系统、六道注射阀门、温度调节的自动取样器、柱加热炉和光敏二极管阵列检波器。柱子是Waters YMC30，5微米，4.6×250毫米并具有相同材料的防护柱。从DHI-Water & Environment，DK-2970Horsholm，Denmark和Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO 63178获得标准。移动相的溶剂是81份甲醇∶4份水∶15份由0.2％BHT稳定的四氢呋喃。注射量为20μl。在30℃，1.7ml/分钟流速时，均等地分离。通过447nm处的吸光率测定峰值反应。

利用这个方法，将来自第一批507个样本的结果进行统计学分析，以确定叶黄素和玉米黄素含量的平均值。为了鉴定含有高于或低于叶黄素和玉米黄素浓度平均值的突变体，计算大于或少于平均值的三个标准差的值。所计算的平均值、标准差和玉米黄素比率示于表4，见下。

                            表4

                叶黄素和玉米黄素置信区间计算

统计的	叶黄素mg/g鲜重	玉米黄素mg/g鲜重	叶黄素+玉米黄素mg/g鲜重	比率(％)
					平均值	0.64	0.04	0.68	5.98
标准差	0.14	0.01	0.147	1.1
					平均值+3sd	1.06	0.07	1.12	9.28
平均值-3sd	0.22	0.007	0.24	2.68

根据上面的值，选择玉米黄素比率高于10％的样本、叶黄素和玉米黄素合并含量大于1.12mg/g鲜重的样本、叶黄素和玉米黄素合并含量小于0.24mg/g鲜重的样本。利用这些选择参数，从8192个样本中鉴定出了总共347个样本叶黄素加玉米黄素的和大于1.12mg/g的突变体，43个样本的玉米黄素比率大于10％的突变体。从每组EMS种子处理所得到的突变体的总数示于表5，见下。

                              表5

                 13819突变体与EMS处理的相关性

选择参数	0.2％EMS处理	0.4％EMS处理	植株总数
				玉米黄素比率＞10％	2	41	43
叶黄素+玉米黄素＞1.12mg/g干重	6	341	347
				叶黄素+玉米黄素＜0.24mg/g干重	2	175	177

在玉米黄素比率大于大约10％玉米黄素的突变体中，大约47％其比率在10％和低于13％之间，而53％呈现出13％或更大的比率。

实施例7：选择的金盏花花瓣中的类胡萝卜素组合物

对‘Scarletade’野生型和通过实施例4的筛选过程所鉴定出来的突变体样本测定了类胡萝卜素组合物。将花瓣样本处于-80℃冷藏库直至突变体被鉴定。将样本冻干并且将冻干组织在氩存在条件下贮藏于-80℃直至进行分析。

在红光下进行提取过程。将干花瓣研磨以通过No.40筛的网孔。将研磨的样本精确称重并转移入100ml红色容量瓶中。将500微升(μl)H2O加入到样本中，并将混合物涡旋搅拌1分钟。加入30ml提取溶剂(10ml己烷+7ml丙酮+6ml无水酒精+7ml甲苯)，并将烧瓶于160转/分钟振荡10分钟。

对于皂化作用，将2ml40％甲醇KOH加入到烧瓶中，然后涡旋振荡1分钟。将烧瓶于56℃水浴20分钟。加上空气冷凝器防止溶剂的损失。在黑暗中将样本用所连有的冷凝器冷却1小时。冷却后，加入30ml己烷，并将烧瓶于160转/分钟振荡10分钟。

用10％硫酸钠溶液将振荡后的样本稀释至一定体积(100ml)并剧烈振荡1分钟。将样本保持于黑暗中至少30分钟。从大约50ml上层相中取出35ml一份的液体，并转移入样本杯。在烧瓶中额外加入30ml己烷并于160转/分钟振荡10分钟。大约1小时后将上层相合并。对于HPLC分析，将10ml一份的液体在氮存在条件下干燥并在氩存在条件下贮于-80℃。

HPLC仪器包括Alliance 2690，它装备有冷却自动加样器，柱加热器和Waters光敏二极管阵列996监测器(Waters Corp.，34 Maple StreetMilford，MA 01757)。用具有相同材料防护柱的YMC30柱，3μm，2.0×150mm进行分离。标准品来自于ICC Indofine Chemicals Somerville，NewJersey 088876和DHI-Water & Environment，DK-2970 Horsholm，Denmark。

将干燥的突变体样本重悬于四氢呋喃和甲醇中至总体积为200μl并过滤，而对照不进行额外的浓缩。用梯度方法分离类胡萝卜素。最初的梯度条件是90％甲醇∶5％水∶5％甲基叔丁基醚，流速为每分钟0.4毫升(ml/min)。从0-15分钟内，改变流动相从最初的条件至80甲醇∶5水∶15甲基叔丁基醚，并且从15-60分钟阶段内，改变为20甲醇∶5水∶75甲基叔丁基醚。对于随后的10分钟，将流动相返回到最初的条件并且每个柱子额外平衡10分钟。柱温度保持在27℃，且流速为0.4ml/分钟。上样量为10μl。在450nm波长处测量主要的峰反应值，并且从286、348、400和472nm提取通道中加入额外的面积。

所选择的突变体的类胡萝卜素谱的值示于表6a、6b和6c，见下，使用峰面积作为总面积的百分比。所指示的化合物的鉴定是基于从每个色谱图的主峰中的提取谱和在乙醇中的最大吸收值(λmax；ETOH)，其中一些是通过已知标准品的保留时间验证的。一些值结合了相同化合物的可能异构体。一些化合物可能含有少量杂质。Quackenbush等，J.Assoc.Off.Anal.Chem.，55(3)：617-621(1972)，所提到的黄色美洲金盏花(黄色金盏花)的数值也包括于表中。对于不能够用此处使用的方法分离的新黄质/堇菜黄质和菊黄质/毛莨黄素化合物对，表6a-6c中使用了单个条目。

                                                                  表6a

                                           在万寿菊和突变体的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择
												黄色金盏花	‘Scarletade’	13819	117-185	124-257	119-494	112-263	118-035	088-425	325-444
		八氢番茄红素	276，286，297	2.4	0.3	0.3	6.8	7.0	1.0	11.0	12.3											34.3	30.9
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367											2.6	0.5	0.4	4.0	4.2	0.9	7.5	7.4	17.8	13.3
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	nf*	＜0.1	＜0.1	5.6	5.3	1.3	6.9	6.8											18.2	17.1
四氢番茄红素	416，440，470											nr**	＜0.1	＜0.1	0.1	0.2	＜0.1	＜0.1	＜0.1	3.5	3.5
		番茄红素	447，472，504	nr	＜0.1	＜0.1	0.5	1.3	＜0.1	＜0.1	＜0.1											1.0	2.8
α-胡萝卜素	423，444，473											0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	0.8	1.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	0.5	＜0.1	＜0.1	4.4	6.8	2.3	0.6	0.3											2.3	4.8
新黄质	415，439，467											0.8	1.5	4.1	13.3	12.8	16.7	4.3	3.5	0.7	1.1
		堇菜黄质	419，440，470	nr
花药黄质	422，444，472				0.1	3.1	5.5	12.5	14.4	19.2	4.1	4.5										0.9	1.5
		叶黄素	420，445，475	72.3									84.9	81.7	13.3	1.3	＜0.1	0.6	7.1	2.0	4.9

玉米黄素α-玉米黄质	428，450，478421，446，475	16.40.8	4.7＜0.1	5.9＜0.1	21.3＜0.1	30.6＜0.1	35.7＜0.1	16.532.2	18.226.9	2.0＜0.1	4.00.2
												β-玉米黄质	428，450，478	0.5	＜0.1	＜0.1	0.5	0.6	0.8	0.2	0.4	1.9	1.8
β-玉米胡萝卜素	406，428，454	0.5	未鉴定
												菊黄质	400，421，448	0.8	＜0.1	＜0.1	2.3	1.5	4.5	0.8	0.5	0.2	0.2
毛莨黄素	400，421，448	1.3
			金黄质	380，401，426	0.1	未鉴定
在450nm处有吸收的其它化合物		0.8													5.0	2.1	15.3	14.0	17.6	15.1	12.0	14.3	12.7

^*nf＝未发现

^**nr＝未报导

                                                    表6b

                            在万寿菊和突变体的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择
										金黄色盏花	‘Scarletade’	13819	100-198	100-334	100-470	101-190	114-315
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	2.4	0.3	0.3	4.8	3.9	6.1									3.4	5.2
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367									2.6	0.5	0.4	3.2	3.2	3.8	3.2	3.3
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	nf*	＜0.1	＜0.1	4.8	4.0	4.4									3.6	3.2
四氢番茄红素	416，440，470									Nr**	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1
		番茄红素	447，472，504	nr	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1									＜0.1	＜0.1
α-胡萝卜素	423，444，473									0.1	＜0.1	＜0.1	0.3	0.4	0.2	0.4	0.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	0.5	＜0.1	＜0.1	0.8	0.7	0.5									0.8	0.5
新黄质	415，439，467									0.8	1.5	4.1	＜0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		堇菜黄质	419，440，470	nr
花药黄质	422，444，472				0.1	3.1	5.5	＜0.2	＜0.2	＜0.2								＜0.2	＜0.2
		叶黄素	420，445，475	72.3							84.9	81.7	68.0	70.7	67.5	71.1	71.6
玉米黄素	428，450，478				16.4	4.7	5.9	14.8	13.4	13.1								13.6	12.3
		α-玉米黄质	421，446，475	0.8							＜0.1	＜0.1	0.6	0.6	0.5	0.6	0.4
δ-胡萝卜素	431，456，489				nr	＜0.1	＜0.1	0.5	0.2	0.8								0.4	0.5
		β-玉米黄质	428，450，478	0.5							＜0.1	＜0.1	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
β-玉米胡萝卜素	406，428，454				0.5	未鉴定
		菊黄质	400，421，448	0.8									＜0.1	＜0.1	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
毛莨黄素	400，421，448				1.3
		金黄质	380，401，426	0.1		未鉴定
在450nm处有吸收的其它化合物					0.8								5.0	2.1	2.1	2.6	2.9	2.8	2.7

^*nf＝未发现

^**nr＝未报导

                                                      表6c

                                 在万寿菊和突变体的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择
									黄色金盏花	‘Scarletade’	13819	126-415	098-240	098-394	115-004
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	2.4	0.3	0.3	11.8	10.0								8.6	13.0
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367								2.6	0.5	0.4	9.1	5.8	5.4	9.6
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	nf*	＜0.1	＜0.1	5.0	3.6								3.5	10.3
四氢番茄红素	416，440，470								nr**	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1
		番茄红素	447，472，504	nr	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1								＜0.1	＜0.1
α-胡萝卜素	423，444，473								nr	＜0.1	＜0.1	0.5	0.4	0.4	0.6
		β-胡萝卜素	425，451，478	0.5	＜0.1	＜0.1	0.1	0.1								0.1	＜0.1
新黄质	415，439，467								0.8	1.5	4.1	0.3	0.4	0.4	＜0.1
		堇菜黄质	419，440，470	nr
花药黄质	422，444，472				0.1	3.1	5.5	1.7	1.9							2.2	1.9
		叶黄素	420，445，475	72.3						84.9	81.7	61.7	70.1	71.0	52.3
玉米黄素	428，450，478				16.4	4.7	5.9	2.5	2.8							3.4	1.8
		α-玉米黄质	421，446，475	0.8						＜0.1	＜0.1	0.7	0.6	0.4	0.2
δ-胡萝卜素	431，456，489				nr	＜0.1	＜0.1	1.6	0.4							0.3	5.2
		β-玉米黄质	428，450，478	0.1						＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1

β-玉蜀黍属胡萝卜素	406，428，454	0.5	未鉴定
									菊黄质	400，421，448	0.8	＜0.1	＜0.1	＜0.1	0.1	0.1	＜0.1
毛莨黄素	400，421，448	1.4
			金黄质	380，401，426	0.1	未鉴定
在450nm处有吸收的其它化合物		0.8										5.0	2.1	4.9	3.7	4.19	4.8

^*nf＝未发现

^**nr＝未报导

实施例8：选择的金盏花叶子中的类胡萝卜素组合物

将几株金盏花植物的叶子用于分析所存在的有色类胡萝卜素的相对浓度。来自‘Scarletade’和13819的叶子用作对照，以与突变体植物的叶子进行比较。如实施例5进行测定并将结果示于表7a和7b，见下，对于不能够用此处使用的方法分离的新黄质/堇菜黄质和菊黄质/毛莨黄素化合物对使用单个条目。从在不同条件下生长的不同组植物收集到的数据列于表7a和7b中。

                                              表7a

                        在万寿菊和突变体的叶子中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
								‘Scarletade’	13819	124-257	119-494	117-185	186-013
		八氢番茄红素	276，286，297	0.1	0.4	0.5	0.2							0.2	0.5
新黄质	415，439，467							9.2	17.6	36.3	22.7	26.8	11.6
		堇菜黄质	419，440，470
花药黄质	422，444，472			2.8	4.3	8.4	7.7							9.1	2.9
		叶黄素	420，445，475					44.3	37.8	0.5	＜0.1	1.6	34.0
玉米黄素	428，450，478			6.6	3.8	4.6	27.5							10.6	4.1
		β-胡萝卜素	425，451，478					22.6	26.5	34.1	25.0	32.7	35.8
α-胡萝卜素	423，444，473			0.5	0.3	＜0.1	＜0.1							＜0.1	0.2
		菊黄质	400，421，448					1.1	1.0	0.9	4.1	3.2	0.5
毛莨黄素	400，421，448
		在450nm处有吸收的其它化合物		12.8	8.3	14.7	12.7							15.8	10.4

                                                表7b

                         在万寿菊和突变体叶子中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
								‘Scarletade’	100-198	100-334	100-470	100-190	114-315
		八氢番茄红素	276，286，297	不充分的峰分离
新黄质	415，439，467									20.4	＜0.1	0.3	＜0.1	3.1	＜0.1
		堇菜黄质	419，440，470
花药黄质	422，444，472			1.6	1.7	1.8	1.6	5.4	1.1
		叶黄素	420，445，475							48.3	24.7	27.6	28.8	27.7	24.3
玉米黄素	428，450，478			0.4	46.3	43.1	44.0	32.3	48.2
		β-胡萝卜素	425，451，478							15.9	14.5	17.3	14.5	19.6	13.8
α-胡萝卜素	423，444，473			＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1
		菊黄质	400，421，448							1.0	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1	＜0.1
毛莨黄素	400，421，448
		β-玉米黄质	428，450，478	0.3	0.3	0.3	0.6	0.3	0.9
在450nm处有吸收的其它化合物										12.1	12.4	9.5	10.5	11.5	11.7

实施例9：通过突变体繁殖制备具有低叶黄素和高玉米黄素、八氢番茄 红素、番茄红素或β-胡萝卜素水平的金盏花

与野生型相比呈现增加的玉米黄素对叶黄素比率的金盏花突变体选择株124-257进行自交，并保存所得到的种子。来自于金盏花选择株124-257自交的植物用作雄性亲本，与雌性亲本PanAmerican Seed繁殖品系F9Ap(85368-4)杂交。从该杂交中所产生F₁植株自交产生F₂群体。

使用薄层层析(TLC)对来自于F₂杂交的15株幼苗进行叶黄素缺乏分析。来自于每株幼苗的大约50mg新鲜叶组织进行称重，放入含有5玻璃珠的100×13mm有螺旋盖的管中。将密封的小玻璃瓶贮存于-20℃。

对于分析，加入500μl提取溶剂(10ml己烷+7ml丙酮+6ml无水酒精+7ml甲苯)，并将密封管涡旋振荡至少45分钟。涡旋振荡后，将溶液转移入4ml琥珀瓶中并在氮存在条件下蒸发。将样本重悬于125μl上述的提取溶剂中，并取10μl点在19道的硅胶板上。将板干燥大约10分钟，然后在含有100ml 2∶1乙酸乙酯∶己烷溶液的两道25cm的展开槽中展开25分钟。当移开后，将样本用于评价叶黄素缺乏。

从这种筛选中，鉴定了F₂金盏花选择株14649-3。将该选择株用作雌性亲本与突变体101-190和100-198进行杂交，其中与野生型相比，这两个突变株显示除具有降低的环氧类胡萝卜素(例如，新黄质和堇菜黄质)外，还呈现出增加的玉米黄素比叶黄素比率。

金盏花突变体选择株100-198进行自交并保存所得到的种子。将来自金盏花选择株100-198自交的植株用作雄性亲本与上述的雌性亲本选择株14649-3进行杂交。从这种杂交中收集F₁种子并将其中的30粒种子进行种植。将所得到的11株植物进行自交。从这种杂交中收集到F₂种子并将其中的400粒种子进行种植和生长。

如上所述，将151株幼苗的叶子用于TLC分析。基于典型的突变选择株100-198降低的环氧类胡萝卜素产量，鉴定出了32株植物。将剩余的TLC提取物用高效液相色谱(HPLC)进行分析，按照实施例5修改的步骤进行。修改包括如下方面：将干样本重悬于甲基叔丁基醚和甲醇中，所有的梯度条件使用增加至6％的水而甲醇相应的降低1％，且柱温度维持在25℃。

分析证实32株植物中的7株植物呈现出增加的玉米黄素比叶黄素比率，典型的是突变选择株124-257。提取7个选择株的花瓣和叶子样本，并依照进行了上述修改的实施例5的步骤进行分析。花瓣的结果示于表8，见下，叶子的结果示于其后的表9。此外，分析未皂化的花瓣样本以测定非酯化玉米黄素(如果有的话)的百分比。这些数据显示于表10。

将金盏花突变体选择株101-190自交并保存所得的种子。将金盏花选择株101-190用作雄性亲本与上述的雌性亲本选择株14649-3进行杂交。从这种杂交中，收集到F₁种子并将其中的30粒种子进行种植。将所得到的植株中的6株进行自交。从后者的杂交中，收集到F₂种子并进行种植和生长。

已经确信目前的TLC分析方法对于该种群是不确定的。因此，基于具有橙色萼片表型，选择大约30株植物进行HPLC分析。

提取样本用于TLC分析；然而，也进行HPLC分析。发现30个选择株中的10株有降低的环氧类胡萝卜素产量，典型的是突变选择株101-190，此外还具有增加的玉米黄素比叶黄素比率，典型的是选择株124-257。

提取10个选择株的花瓣和叶子样本并依照进行上述修改的实施例5的步骤进行分析。花瓣的结果示于表8b和8c，并且叶子的结果示于表9b和9c。此外，分析非皂化花瓣样本以测定非酯化玉米黄素的百分比。这些数据显示于表10。

                                                          表8a

                                   在万寿菊和突变体杂交株的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
												‘Scarletade’	124-257	100-198	27772-029	27772-036	27772-100	27772-109	27772-123	27772-130	27772-134
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	0.5	3.9	4.5	4.9	9.2	7.0	5.1	5.6											5.7	11.7
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367											0.7	3.6	4.4	4.6	7.2	5.7	4.6	5.3	5.0	8.2
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	＜0.2	3.3	4.1	4.8	10.6	5.2	4.5	5.0											4.4	7.4
四氢番茄红素	416，440，470											＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.2	0.4	0.3	＜0.2	0.2	0.3	0.4
		番茄红素	447，472，504	＜0.2	0.5	＜0.2	0.3	1.4	0.9	＜0.2	0.6											0.3	0.9
α-胡萝卜素	423，444，473											＜0.2	＜0.2	0.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	＜0.2	7.4	1.3	6.3	6.1	4.9	4.5	4.2											5.0	4.8
新黄质	415，439，467											0.5	3.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		堇菜黄质	419，440，470	0.7	12.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2											0.2	＜0.2
花药黄质	422，444，472											1.6	17.5	0.6	0.5	0.4	0.6	0.5	0.5	0.7	0.3

叶黄素	420，445，475	91.0	2.3	68.1	0.5	0.5	0.5	0.4	0.4	0.6	0.4
												玉米黄素	428，450，478	3.3	29.8	14.3	73.8	60.0	70.3	76.5	74.3	72.4	62.0
α-玉米黄质	421，446，475	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
												δ-胡萝卜素	431，456，489	＜0.2	＜0.2	0.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.3	＜0.2
β-玉米黄质	428，450，478	＜0.2	1.0	＜0.2	1.1	1.0	1.1	1.4	1.1	1.1	1.1
												β-玉米胡萝卜素	406，428，454	未鉴定
菊黄质	400，421，448	＜0.2	1.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
												毛莨黄素	400，421，448
金黄质	380，401，426													未鉴定
		在450nm处有吸收的其它化合物		1.7	12.9	1.6	2.8	3.2	3.5	2.4	2.7	4.2	2.8

                                                 表8b

                         在万寿菊和突变体杂交株的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
										‘Scarletade	124-257	101-190	27773-006	27773-030	27773-087	27773-107	27773-128
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	0.5	3.9	3.9	3.2	5.9	6.8									8.3	4.9
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367									0.7	3.6	4.6	3.8	5.8	7.2	7.3	4.9
		ζ-胡萝卜素)(顺/反异构体)	377，399，425	＜0.2	3.3	5.1	4.4	5.0	10.4									8.6	5.0
四氢番茄红素	416，440，470									＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		番茄红素	447，472，504	＜0.2	0.5	＜0.2	0.2	0.4	0.8									＜0.2	0.4
α-胡萝卜素	423，444，473									＜0.2	＜0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	＜0.2	7.4	1.6	9.8	8.9	11.7									8.0	7.1
新黄质	415，439，467									0.5	3.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		堇菜黄质	419，440，470	0.7	12.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2									＜0.2	＜0.2
花药黄质	422，444，472									1.6	17.5	0.6	1.9	1.8	0.9	0.8	2.1
		叶黄素	420，445，475	91.0	2.3	63.8	0.8	0.6	0.9									0.7	0.6
玉米黄素	428，450，478									3.3	29.8	16.8	69.4	67.9	58.5	62.4	70.3
		α-玉米黄质	421，446，475	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2									＜0.2	＜0.2
δ-胡萝卜素	431，456，489									＜0.2	＜0.2	0.2	0.9	＜0.2	0.2	0.4	＜0.2
		β-玉米黄质	428，450，478	＜0.2	1.0	0.2	1.1	1.2	1.1									1.5	1.3
β-玉米胡萝卜素	406，428，454									未鉴定

菊黄质	400，421，448	＜0.2	1.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
										毛莨黄素	400，421，448
金黄质	380，401，426											未鉴定
		在450nm处有吸收的其它化合物		1.7	12.9	2.8	4.1	2.2	1.5	1.7	3.2

                                                     表8c

                            在万寿菊和突变体杂交株的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
										‘Scarletade’	124-257	101-190	27774-008	27774-050	27774-064	27774-076	27774-123
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	0.5	3.9	3.9	4.4	5.2	7.0									8.8	5.6
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367									0.7	3.6	4.6	4.6	5.7	6.0	8.8	5.5
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	＜0.2	3.3	5.1	4.2	8.5	6.0									9.8	5.9
四氢番茄红素	416，440，470									＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.2	＜0.2	0.3	0.3	＜0.2
		番茄红素	447，472，504	＜0.2	0.5	＜0.2	0.4	0.6	0.4									1.5	0.2
α-胡萝卜素	423，444，473									＜0.2	＜0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	＜0.2	7.4	1.6	7.0	9.5	5.8									9.9	10.1
新黄质	415，439，467									0.5	3.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		堇菜黄质	419，440，470	0.7	12.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2									＜0.2	＜0.2
花药黄质	422，444，472									1.6	17.5	0.6	2.5	＜0.2	1.5	1.9	2.5
		叶黄素	420，445，475	91.0	2.3	63.8	0.8	0.8	0.7									0.6	0.8
玉米黄素	428，450，478									3.3	29.8	16.8	71.2	66.9	67.8	54.3	64.3
		α-玉米黄质	421，446，475	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2									＜0.2	＜0.2
δ-胡萝卜素	431，456，489									＜0.2	＜0.2	0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		β-玉米黄质	428，450，478	＜0.2	1.0	0.2	1.1	1.0	1.6									1.3	1.3
β-玉米胡萝素	406，428，454									未鉴定
		菊黄质	400，421，448	＜0.2	1.7	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2									＜0.2	＜0.2

毛莨黄素	400，421，448
										金黄质	380，401，426	未鉴定
在450nm处有吸收的其它化合物		1.7	12.9	2.8	3.6	1.3	2.9	2.4	3.4

                                                     表9a

                            在万寿菊和突变体杂交株的叶子中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
												‘Scarletade’	124-257	100-198	27772-029	27772-036	27772-100	27772-109	27772-123	27772-130	27772-134
		八氢番茄红素	276，286，297	不充分的峰分离
新黄质	415，439 ，467													9.4	9.6	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		堇菜黄质	419，440，470	7.1	26.3	0.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
花药黄质	422，444，472													1.1	7.7	2.6	1.7	1.8	3.1	3.4	2.5	2.2	1.5
		叶黄素	420，445，475	44.7	0.4	34.8	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
玉米黄素	428，450，478													0.3	4.8	29.6	59.1	59.9	59.0	61.4	60.4	61.1	67.0
		β-胡萝卜素	425，451，478	26.9	37.9	22.1	29.0	28.4	28.5	28.0	29.6	28.2	24.3
α-胡萝卜素	423，444，473													0.8	＜0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	1.1	＜0.2	＜0.2

菊黄质	400，421，448	0.7	1.5	＜0.2	＜0.2	0.6	0.4	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
												毛莨黄素	400，421，448
β-玉米黄质	428，450，478													0.2	0.3	0.5	＜0.2	0.6	＜0.2	0.5	＜0.2	＜0.2	0.4
		在450nm处有吸收的其它化合物		8.8	11.5	9.4	10.2	8.7	9.0	6.8	6.4	8.6	6.9

                                                      表9b

                         在万寿菊和突变体杂交株的叶子中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
										‘Scarletade’	124-257	101-190	27773-006	27773-030	27773-087	27773-107	27773-128
		八氢番茄红素	276，286，297	不充分的峰分离
新黄质	415，439，467											9.4	9.6	7.6	6.2	5.0	4.6	3.7	6.9
		堇菜黄质	419，440，470	7.1	26.3	3.9	2.9	1.8	1.7	0.9	4.7
花药黄质	422，444，472											1.1	7.7	7.9	8.7	8.1	6.6	6.6	13.9
		叶黄素	420，445，475	44.7	0.4	37.6	0.9	0.4	＜0.2	0.4	0.7
玉米黄素	428，450，478											0.3	4.8	9.2	43.2	44.9	47.8	48.5	30.3
		β-胡萝卜素	425，451，478	26.9	37.9	25.2	30.9	32.3	31.8	31.6	32.2
α-胡萝卜素	423，444，473											0.8	＜0.2	0.5	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		菊黄质	400，421，448	0.7	1.5	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.5
毛莨黄素	400，421，448
		β-玉米黄质	428，450，478									0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	0.7
在450nm处有吸收的其它化合物				8.8	11.5	8.1	7.3	7.6	7.5	8.3	10.2

                                                           表9c

                                 在万寿菊和突变体杂交株的叶子中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
										‘Scarletade’	124-257	101-109	27774-008	27774-050	27774-064	27774-076	27774-123
		八氢番茄红素	276，286，297	不充分的峰分离
新黄质	415，439，467											9.4	9.6	7.6	4.7	5.7	4.7	5.2	6.2
		堇菜黄质	419，440，470	7.1	26.3	3.9	1.4	2.9	1.6	1.7	3.3
花药黄质	422，444，472											1.1	7.7	7.9	7.4	11.4	7.2	7.8	11.7
		叶黄素	420，445，475	44.7	0.4	37.6	1.2	0.5	0.5	0.4	0.8
玉米黄素	428，450，478											0.3	4.8	9.2	48.2	41.5	49.0	48.3	40.5
		β-胡萝卜素	425，451，478	26.9	37.9	25.2	27.5	29.9	27.4	28.4	27.2
α-胡萝卜素	423，444，473											0.8	＜0.2	0.5	1.1	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		菊黄质	400，421，448	0.7	1.5	＜0.2	0.5	0.4	0.5	＜0.2	0.3
毛莨黄素	400，421.448
		β-玉米黄质	428，450，478									0.2	0.3	＜0.2	＜0.2	0.5	＜0.2	＜0.2	0.5
在450nm处有吸收的其它化合物				8.8	11.5	8.1	8.0	7.3	9.2	8.3	9.5

                表10在万寿菊和突变体杂交株的花瓣中非酯化玉米黄素的相对百分比

金盏花选择株	％非酯化玉米黄素
		‘Scarletade’	0
124-257	1.1
		100-198	2.2
101-190	1.6
		27772-029	6.8
27772-036	5.8
		27772-100	7.9
27772-109	13.0
		27772-123	7.3
27772-130	6.4
		27772-134	5.0
27773-006	8.1
		27773-030	3.2
27773-087	13.6
		27773-107	19.3
27773-128	7.4
		27774-008	3.9
27774-050	9.1
		27774-064	6.3
27774-076	4.5
		27774-123	6.8

将与野生型相比具有玉米黄素比叶黄素比率增加特性的突变体选择株119-494(表6a)进行自交并保存所得到的种子。将与野生型相比具有八氢番茄红素比叶黄素比率增加特性的突变体选择株115-004(表6c)进行自交并保存所得到的种子。

将自交选择株115-004用作雌性亲本与自交的雄性亲本119-494进行杂交。从这种杂交中，产生F₁植物并进行自交产生F₂群体。与野生型万寿菊相比呈现增加的番茄红素异构体积累的F₂植物在温室种植时由于它们的红颜色而被注意到。分析结果确认了番茄红素积累以及八氢番茄红素和β-胡萝卜素水平增加。根据上面所概述的HPLC步骤分析样本，除了不进行第二次己烷提取。来自命名为33457-1、33458-1、33459-1、33456-2、33458-2和33461-1的六个选择株的数据报导于表11，见下。

随后还注意了番茄红素、八氢番茄红素和β-胡萝卜素的额外积累。选择株27774-105是由本实施例先前所述的雌性亲本14649-3和雄性亲本101-190(表8b)杂交形成的。将花瓣进行上述的分析并将数据报导于表11。

选择株23012-3是F₃植物，它来自于作为雌性亲本的大双花PanAmerican种子繁殖品系85394-2和作为雄性亲本的124-257之间的杂交。自交之后，通过TLC方法鉴定的具有降低的叶黄素水平特性的F₂选择株，并且将所得到的F₃种子播种于位于PanAmerican Seed Santa Paula，CA的田间。在该种群中，通过其红色花瓣鉴定出选择株23012-3。将花瓣进行上述的分析并将数据报导于表11。

                                                            表11

                                    在万寿菊和突变体的花瓣中类胡萝卜素相对百分比分布

类胡萝卜素	EtOH中波长(nm)	金盏花选择株
												‘Scarletade’	124-257	33457-1	33458-1	33459-1	33456-2	33458-2	33461-1	23012-3	27774-105
		八氢番茄红素(异构体)	276，286，297	0.5	3.9	25.7	15.9	24.7	16.8	17.0	14.9											10.5	8.6
六氢番茄红素(异构体)	331，348，367											0.7	3.6	15.4	8.6	14.3	13.6	13.1	11.4	5.8	8.4
		ζ-胡萝卜素(顺/反异构体)	377，399，425	＜0.2	3.3	10.0	5.4	10.4	10.2	10.6	8.4											6.3	4.0
四氢番茄红素	416，440，470											＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		番茄红素	447，472，504	＜0.2	0.5	3.5	3.2	3.9	5.6	6.3	8.5											13.6	6.8
α-胡萝卜素	423，444，473											＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
		β-胡萝卜素	425，451，478	＜0.2	7.4	3.8	3.8	3.8	16.1	12.4	9.8											9.9	10.5
新黄质	415，439，467											0.5	3.4	2.0	3.0	3.3	3.1	2.9	4.1	1.3	1.2

堇菜黄质	419，440，470	0.7b	12.7	4.4	9.6	4.4	4.0	4.7	5.4	5.9	4.0
												花药黄质	422，444，472	1.6	17.5	6.7	13.7	5.7	5.6	6.2	6.7	10.4	11.3
叶黄素	420，445，475	91.0	2.3	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	2.1	1.7
												玉米黄素	428，450，478	3.3	29.8	14.9	23.0	10.2	11.9	12.8	18.0	18.5	32.0
α-玉米黄质	421，446，475	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
												δ-胡萝卜素	431，456，489	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2	＜0.2
β-玉米黄质	428，450，478	＜0.2	1.0	0.5	0.7	0.4	0.5	0.5	0.5	0.6	1.1
												β-玉米胡萝卜素	406，428，454	未鉴定
菊黄质	400，421，448	＜0.2	1.7	1.1	1.9	1.0	0.8	0.9	0.7	1.	1.0
												毛莨黄素	400，421，448
金黄质	380，401，426													未鉴定
		在450nm处有吸收的其它化合物		1.7	12.9	12.1	11.2	17.9	11.7	12.8	11.7	13.3	9.4

^*对某些峰没有进行表征并且上面所列的许多峰和其它峰可能是番茄红素异构体。

实施例10：用于在万寿菊中产生改变的类胡萝卜素谱的可选择的方法除了使用化学诱变产生具有改变的类胡萝卜素谱的万寿菊之外，还能够利用其它可选择的方法提供改变的类胡萝卜素谱。作为例证说明的可选择的方法包括使用电离辐射和使用重组DNA技术的基因沉默。

更加具体的是，电离辐射已经用于通过缺失突变来修饰基因表达。已经报导γ-射线在下述观赏物种中改变花的颜色，所述观赏物种包括菊属(Dendranthema)、唐菖蒲属和百日草[见Datta等，Zeitschrift furPflanzen.，120(1)：91-92(2001)；Masakazu，等，J.Japanese Soc.For Hort.Sci.，70(1)：126-128(2001)和Venkatachalam等，Ind.Jour.Gen.& PlantBreed.，57(3)：255-261(1997)]。快中子已经有效地用于在植物中产生缺失突变。因此，对于来自51,840株植物的突变鼠耳芥属的84％的靶基因座已经获得了缺失突变体[见Li等，The Plant Journal，27(3)：235-242(2001)]，而Love等，Amer.Soc.Hort.Sci.，88：627-630(1966)在鞘蕊花属(Coleus)植物中制备了树叶花青苷突变。最近，报道了大丽花属的花色突变体[见Abe等，In Vitro Cell.& Dev.Bio.38：93A(2002)]。

为了制备预期的表型，如改变的花色素沉着谱，基因沉默也能够用于失活靶基因。此类方法包括在转录水平和转录后水平的基因沉默。

重组诱导、稳定整合的转基因以及可复制的DNA和RNA病毒能介导沉默事件。转录水平的基因沉默来自于通过启动子甲基化和/或染色质凝聚而产生的转录起始功能缺损。含有红棕色花葵素花色素沉着的转基因矮牵牛的纯合子代出乎意料地得到了具有CaMV 35S启动子超甲基化的白色变种[见Meyer等，Plant Journal 4(1)：89-100(1993)]。

当产生异常的有意、反义或双链形式的RNA时，由于mRNA降解产生了转录后基因沉默，其中发生转录但是RNA不能积累。在矮牵牛中，编码黄酮类化合物生物合成途径中的查耳酮合酶的重组导入的可转录有意转基因能够下调同源的内源基因和转基因RNA的表达，该现象称为共抑制。不仅所编码的酶没有产生预期增加的产量，而且42％的转基因植物具有白色的花和/或有白色参与组成的花[见Napoli等，Plant Cell，2(4)：279-289(1990)]。

发现共抑制以前，通过反义转基因实现内源基因的下调。通过有意和反义查耳酮合酶转基因矮牵牛的比较，鉴定出75％的有意转基因和82％的反义转基因具有改变的花色素沉着[见Jorgensen等，Plant Mol.Biol.，31(5)：957-973(1996)]。

通过加工双链RNA、小干扰RNA(siRNA)，已经表明它们在植物中能有效地引起基因沉默[见Hamilton等，Science，286(5441)：950-952(1999)]。在共抑制的矮牵牛植物中，鉴定出了RNA降解的中间体[见Metzlaff等，Cell 88(6)：845-854(1997)]。所产生的RNA能够形成双链的转化载体，在拟南芥菜中引起四花或分生组织相关基因的特异且可遗传的遗传干扰[见Chuang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，97(9)：4985-4990(2000)]。

此外，通过设计表达能够剪切RNA的核酶的载体，能够实现转录后基因沉默。被称为‘小核酶’的一组核酶包括发夹状核酶和锤头状核酶。在广泛地植物物种中也证明了利用编码自身互补发夹RNA的构建体进行有效的基因沉默。含有内含子的构建体通常导致90-100％的呈现基因沉默的独立的转基因植物[见Wesley等，Plant Journal，27(6)：581-590(2001)]。表达针对马铃薯纺锤块茎病类病毒RNA的锤头状核酶的转基因马铃薯植物显示对其复制的高抗性。这种抗性可以稳定地遗传给后代[见Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：4861-4865(1997)]。

在本发明中，提供重组的转基因用于基因沉默的载体包括含有编码万寿菊植物类胡萝卜素产生所必需的酶的一个或多个序列的表达载体。将表达载体导入植物组织的方法包括直接基因转移法，如微发射介导的递送、DNA注射、电穿孔等[见Gruber等，见下文；Miki等，在 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(Glick等编辑，CRC Press，BocaRaton，FL)一书中的67-88页(1993)；Klein等，Biotechnology 10：268(1992)]。通过直接感染或植物组织与根癌农杆菌共培养，也可以将表达载体导入植物组织[见Horsch等，Science 227：1229(1985)]。农杆菌载体系统的描述和农杆菌介导基因转移的方法见Gruber等，″Vectors for PlantTransformation，″在Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology(Glick等编辑)一书中的89-119页(CRC Press，1993)，Miki等，见上文，以及Moloney等，Plant Cell Reports 8：238(1989)。

实施例11：在其花瓣中具有酮类胡萝卜素的矮牵牛

为了确定酮类胡萝卜素是否在矮牵牛中产生，用LIS1::crtW::nos构建体，pBHX586(实施例2)，转化PanAmerican种子矮牵牛繁殖品系6923-1。将转基因矮牵牛植物进行再生，并且利用HPLC分析对，命名为586-3401-1-1和586-2901-1-1的两个品系进行评价。将花瓣组织冻干，并且根据在干植物材料中胡萝卜素和胡萝卜醇提取的正式方法，通过加入第二次己烷提取物进行提取(见Official Methods of Analysis(1980)13^th Ed.，AOAC，Arlington，VA，sec.43.018-43.023)。在提取过程中组织不被皂化。

HPLC设备包括Waters Alliance 2690，它装备有冷却自动加样器、Cera 250柱加热器/冷却器和Waters光敏二极管阵列996监测器(WatersCorp.，Milford，MA)。用带有相同材料的防护柱的YMC30柱，3μm，2.0×150mm获得分离。标准品来自于ICC Indofine Chemicals(Somerville，NJ)，Sigma Chemicals(St.Louis，MO)和DHI-Water & Environment(Horsholm，Denmark)。将干样本重悬于乙酸乙酯和甲醇，加样量为10μl。

利用梯度法分离类胡萝卜素。最初的梯度为91％甲醇∶4％水∶5％乙酸乙酯(体积比)。从0-15分钟内，改变流动相从最初的梯度至81％甲醇∶4％水∶15％乙酸乙酯，并且在15-60分钟之间，改变至21％甲醇∶4％水∶75％乙酸乙酯。对于随后的10分钟内，将流动相重新返回最初的条件，并将柱子额外平衡10分钟。柱温度维持在15℃并且流速自始至终为0.40ml/分钟。

所选突变株的改变的类胡萝卜素谱的值用正态化的474nm处的峰面积显示，并且结合了同一化合物可能的异构体。一些化合物可能含有少量杂质。

如下面表12所示，转基因矮牵牛品系86-3401-1-1和586-2901-1-1含有酮类胡萝卜素虾青素、金盏花玉红质和角黄素，它们在对照矮矮牵牛瓣中是不存在的。

                              表12

                  转基因矮牵牛中的酮类胡萝卜素

474nm处类胡萝卜素正态化的峰面积	矮牵牛选择系
				6923-1	586-2901-1-1	586-3401-1-1
	花药黄质	686	409				343
虾青素				0	176	217
	叶黄素	7503	8954				5375
金盏花玉红质				0	954	1604
	玉米黄素	2272	1708				1462
角黄素				0	2148	2926
	β-胡萝卜素	5276	7559				5037

对于总共6组独立的杂交，转基因矮牵牛品系586-3401-1-1和586-2901-1-1每个都可被用作雄性或雌性亲本。在杂交中另一个亲本选自可选择的繁殖研究，该研究使用了一组用LIS1::rbcs::crtB::nos(pBHX112)构建体转化了的‘Mitchell，矮牵牛品系[Ausubel等，Plant Mol Biol Rep 1：26-32(1980)]。crtB基因编码八氢番茄红素合酶。在该研究中，选择45株植物用于HPLC分析。花瓣组织提取方法、HPLC设备和所用的标准品如上所述。

将干样本重悬于甲基叔丁基醚和甲醇至总体积为200微升(μl)并过滤。利用梯度法分离类胡萝卜素。最初的梯度条件为90％甲醇∶5％水∶5％甲基叔丁基醚，且流速为0.4毫升每分钟。从0-15分钟内，改变流动相从最初的条件至80甲醇∶5水∶15甲基叔丁基醚，并且在15-60分钟之间，改变至20甲醇∶5水∶75甲基叔丁基醚。对于随后的10分钟内，将流动相重新返回最初的条件，并将柱子额外平衡15分钟。柱温度维持在27℃。加样量为10μL。

来自于10株最高β-胡萝卜素的积累株数据示于下面的表13。将类胡萝卜素值用峰面积表示为450nm处总面积的百分数。根据谱的信号确定八氢番茄红素，并且从最大图中决定八氢番茄红素面积。将数据表示为正态化峰面积并且括弧内的数代表每种类胡萝卜素化合物占总类胡萝卜素峰面积的百分数。与‘Mitchell’对照相比，从这些转基因植物中观察到β-胡萝卜素水平提高了大约5倍到大约10倍。在转基因植物花瓣中也观察到了八氢番茄红素的存在，而在对照花瓣组织中未检测到八氢番茄红素。

                                     表13

                          矮牵牛中增加的β-胡萝卜素

矮牵牛选择株	正态化的峰面积
					β-胡萝卜素	八氢番茄红素	玉米黄素	叶黄素
	‘Mitchell’对照*	378(9)	0(0)	398(10)					1119(27)
112A-3200-1-29					3962(48)	385(4)	47(1)	1603(20)
	112A-3200-1-31	3830(46)	2500(18)	0(0)					1765(21)
112A-3200-1-43					2749(24)	375(2)	337(3)	2939(26)
	112A-3200-1-41	2492(52)	1536(18)	126(3)					1168(24)
112A-3200-1-53					2483(36)	2159(17)	158(2)	1557(23)
	112A-3200-1-45	2350(39)	1331(15)	118(2)					1701(28)
112A-3200-1-25					2202(39)	453(5)	191(3)	1226(21)
	112A-3200-1-10	2055(25)	606(5)	446(5)					2264(27)
112A-3200-1-58					1931(29)	399(4)	304(5)	1693(25)
	112A-3200-1-04	1797(38)	572(7)	260(6)					1167(25)

^*3次上样的平均值

在crtB繁殖研究中，转化体与PanAmerican种子矮牵牛繁殖品系6923-1杂交。将所得到的植物进行自交，收集种子，播种并将所得到的植物生长成熟并开花。从该群体中，命名为13021-1、13023-1、13040-1和13041-2的植物被用作与586-3401-1-1或586-2901-1-1杂交时的另一个亲本。从这些杂交物中，收集种子，播种并将所得到的植物生长至开花。从该隔离的种群，基于花颜色变化选择27株植物进行HPLC分析。

将花瓣组织冻干并进行如上述的提取，除了不进行第二次己烷提取。利用梯度法分离类胡萝卜素。最初的条件为92％甲醇∶3％水∶5％乙酸乙酯(体积比)。从0-13分钟内，将流动相维持在最初的条件，并且在13-45分钟内改变为32％甲醇∶3％水∶65％乙酸乙酯，并且维持该条件45-50分钟。在随后的10分钟内，将流动相重新返回最初的条件，并且将柱子额外平衡10分钟。柱温度维持在15℃并且流速自始至终为0.40ml/分钟。

将转化品系586-3401-1-1和586-2901-1-1的最初品系，即PanAmerican种子矮牵牛繁殖品系6923-1用作对照。此外，在分析中包括一个亲本，为品系586-3401-1-1。如下面表14所示，在隔离的转基因群体中的几种矮牵牛品系含有虾青素、金盏花玉红质和角黄素，它们在对照矮矮牵牛瓣组织中是不存在的。

已知标准品在保留时间内不被洗脱下来的大量的峰具有UV-可见光谱，这清楚地表明它们具有一种或多种4-酮-β-紫罗烯环。它们还没有被完全认识，但是可能包括3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮，以及虾青素、金盏花玉红质、金盏花黄质、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮和3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮的单酯或双酯。

                                                    表14

                                         转基因矮牵牛的中酮类胡萝卜素

矮牵牛选择株	类胡萝卜素(正态化的峰面积)
									花药黄质	虾青素	叶黄素	金盏花玉红质	玉米黄素	角黄素	β-胡萝卜素	额外的酮燎胡萝卜素
	586-3401-1-1**	995	439	16962	3410	2139	6368	28396									5491
6923-1**									1325	0	17915	0	3597	0	23107	nf*
	11780-1	367	0	11206	0	845	0	34928									nf
11788-2									301	474	5104	2299	567	4109	1938	2559
	11788-3	800	0	12350	0	1581	0	48262									nf
11789-1									1350	0	12961	0	1839	0	79792	nf
	11789-2	1086	0	12567	0	1838	0	7490									nf
11790-2									504	1117	11527	4189	1031	5941	4750	9043
	11790-3a	493	1548	8424	4211	1014	4762	4615									10396
11790-3b									499	957	8744	3966	1115	8468	6110	12800
	11791-1	1240	0	17534	0	2374	0	19042									nf
11791-2									833	0	14068	0	2021	0	11450	nf
	11792-1	506	0	10866	0	967	0	27538									nf
11792-3									900	0	19885	0	1724	0	66884	nf
	11793-1	401	1383	9018	7209	670	17441	33479									10755
11794-1									965	0	12590	0	1693	0	41003	nf
	11795-1	1376	0	14720	0	2129	0	66331									nf
11795-3									901	514	10581	4218	1625	12385	6869	9691

11796-1	950	0	13755	0	1883	0	33373	nf
									11796-2	1182	0	11371	0	2101	0	36772	nf
11797-1	678	338	10993	3819	1321	14536	36429	5982
									11797-2	960	458	11890	3459	1729	8757	33121	6202
11798-1	798	253	12218	3050	1751	9074	23863	4211
									11798-2	743	0	12671	0	2216	0	32206	nf
11798-4	519	476	8604	3786	1806	8193	5238	6823
									11798-5	516	933	12397	5851	1161	20570	30630	8717
11798-7	475	205	8280	2015	1127	4529	3486	3834
									11798-8	593	366	10298	2974	1878	7005	6084	5498
11799-2	640	0	10652	0	2310	0	6203	nf

^*nf＝未发现

^**亲本品系对照

PanAmerican种子繁殖品系2088-2是用LIS1::AdK6::nos::-LIS1::AdK1::nos构建体pBHX749转化而来的。从这种转化体中获得了一株开花植物。利用上述的HPLC分析，将在450nm处测量时类胡萝卜素具有与虾青素相同保留时间的矮牵牛转基因品系鉴定出来。

实施例12：在其花瓣中具有酮类胡萝卜素的金盏花

用LIS1::rbcs::crtW::nos构建体pBHX586转化PanAmerican种子繁殖品系13819，并将所得的转化植物生长成熟并开花。从大约200株开花植物的种群中，基于花色变化选择了26株植物进行薄层层析(TLC)筛选。将品系13819用作对照。

将来自于每个成熟单个花的大约100mg新鲜花瓣组织称重，放入含有5玻璃珠的100×13mm螺旋盖管。将密封的小瓶处于-80℃。为了分析，加入1ml提取溶剂，己烷∶丙酮∶乙醇∶甲苯10∶7∶6∶7(v∶v)，并将密封的管涡旋振荡1小时。涡旋振荡后，将溶液转移入4ml琥珀瓶中并在氮存在条件下蒸发至干燥。使用30分钟涡旋振荡重复该步骤，并将提取物混合。将样本重悬于125μl上述提取溶剂中并取10μl点样在19道硅胶板上(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。将板干燥大约5分钟，然后在含有100ml己烷∶丙酮4∶1(v∶v)的两道25cm展开槽中展开大约20分钟。

将来自金盏花转基因品系的结果与夏侧金盏花进行比较酮类胡萝卜素的存在。夏侧金盏花是具有深红花色的植物物种，这部分是由于虾青素和其它酮类胡萝卜素的积累。命名为586-3201-1-12和586-3701-1-22A的两个品系鉴定为具有酮类胡萝卜素。

品系586-3201-1-12被用作雌性亲本与雄性亲本124-257进行杂交，雄性亲本124-257是实施例4中鉴定出来的与野生型相比呈现增加的玉米黄素比叶黄素比率的突变体。收集种子并播种。将所得到的26株植物生长至完全开花。

所有植物都是杂合子；因此，没有一株植物具有隐性突变体类胡萝卜素谱。使用124-257和13819作为对照，并用夏侧金盏花作为酮类胡萝卜素参考，进行花的初步TLC筛选。然后进行上述相同的步骤，其中除了涡旋振荡最少1小时30分钟且不重复涡旋振荡。命名为F₁-1到F₁-6的6个品系被鉴定为含有酮类胡萝卜素。

为了定量转基因植物中酮类胡萝卜素的水平，从品系F₁-1至F₁-6、586-3201-1-12和586-3701-1-22A和对照品系13819中收获花瓣，冻干并在氩存在条件下贮于-80℃直至分析。干的花瓣材料进行研磨至通过No.40筛网孔，并将精确称重的50mg样本转移入含5玻璃珠的100×13mm螺旋盖管中。如上述加入2毫升提取溶剂，并将密封的管涡旋振荡1小时。涡旋振荡后，将样本离心5分钟，将提取溶液转移至4ml琥珀玻璃瓶中并在氮存在条件下蒸发至干燥。将该过程重复3-5次直至提取溶液变成无色。在氩环境中将干样本贮存于-80℃。

利用密度测定法，比较夏侧金盏花参考曲线对样本进行定量。对于这种分析，将样本重悬于1.5μl上述的提取溶剂中并涡旋振荡。为了产生虾青素酯的参考曲线，从夏侧金盏花提取物制备从0.2％到10.0％的10次稀释物。通过具棉栓的5点5英寸的巴斯德吸量管对样本进行过滤并转移入2ml配有卡盖的自动加样瓶中。

使用CAMAG自动TLC取样器4(CAMAG Scientific Inc.，515Cornelius Harnett Drive，Wilmington，NC 28401)，每个样本6μl进行喷雾，作为硅胶60F 254，20×10cm板(E.MERCK KgaA)的8mm带。铺板的溶剂被蒸发并且在CAMAG双槽小室中进行展开。将10毫升己烷∶丙酮4∶1(v∶v)铺到小室的每一侧并将板展开至60mm。移出后，将溶剂蒸发，并用CAMAG TLC扫描仪3对板进行扫描并且用CAMAG Reprostar^TM3纪录板的图像。

在侧金盏花属提取物中，在Rf0.37、Rf0.28和Rf0.54的吸收值分别对应着虾青素、金盏花玉红质和金盏花黄质的波谱信号。在金盏花样本中，Rf0.38的吸收值对应着虾青素的波谱信号。这些不同被认为由于加入了不同的脂肪酸部分。将虾青素和金盏花玉红质的值计算为夏侧金盏花参照的百分数。数据显示于下面的表15。所检测的对照13819的最小吸收值不对应酮类胡萝卜素化合物。在所用转基因的测试中，金盏花黄质的值都高于夏侧金盏花的参照。从所计算的吸收值，具有3个最高观察值的植物由最高到最低的顺序是F₁-3、586-3201-1-12和F₁-5。

                   表15

        转基因金盏花中的酮类胡萝卜素

选择株	虾青素(在侧金盏花属中的％)	金盏花玉红质(在侧金盏花属中的％)
			13819	＜0.45	未检测
586-3201-1-12	2.04	6.7
			586-3701-1-22A	1.22	4.1
F1-1	1.74	5.9
			F1-2	1.71	5.3
F1-3	2.11	6.0
			F1-4	1.44	4.8
F1-5	2.09	7.0
			F1-6	1.23	5.4

上述分析的植物F₁-1到F₁-6被用作雌性亲本与雄性亲本124-257(实施例4中鉴定的突变体)进行独立的回交。收集种子并播种。植物生长至完全开花并且在类胡萝卜素突变体和野生型谱中都鉴定出了转基因分离。

除了在过滤之前从1.5ml重新组建的样本中去除150μl的步骤外，使用与上述相同的密度测定法步骤，评价既包括突变体也包括野生型类胡萝卜素谱的59株植物。最高的20个酮类胡萝卜素生产株的数据显示于下面的表16。应该注意到，两个最高的虾青素生产株是从具有增加的玉米黄素比叶黄素比率的突变株124-257而来的。如上所报道的，在所有测试的转基因植物中金盏花黄质的值都高于夏侧金盏花参考。从所计算的吸收值，具有三个所观察到的最高值的植物由最高到最低的顺序是F₂#3-4、F₂#1-37和F₂#1-20。

                         表16

             转基因金盏花中的酮类胡萝卜素

选择株	虾青素(在侧金盏花属中的％)	金盏花玉红质(在侧金盏花属中的％)
			F2#1-20*	4.1	＞7.7
F2#3-4*	3.5	6.5
			F2#3-2	3.1	5.6
F2#1-18	3.1	6.0
			F2#6-19	2.9	7.0
F2#1-37	2.9	＞7.7
			F2#3-1*	2.8	5.0
F2#1-30*	2.8	4.9
			F2#-31*	2.7	5.2
F2#2-34	2.5	7.2
			F2#1-27	2.4	5.3
F2#1-23	2.4	4.4

F2#2-24	2.4	5.3
			F2#5-17	2.4	5.0
F2#3-38	2.4	4.4
			F2#5-25*	2.3	＞7.7
F2#1-22*	2.3	＞7.7
			F2#2-35	2.3	4.2
F2#3-41	2.3	5.2
			F2#1-9	2.2	5.0

^*突变体类胡萝卜素谱

用LIS1::AdK6::nos构建体pBHX701转化PanAmerican种子繁殖品系13819，并将所得到的转化植物生长成熟并开花。AdK6序列编码转运肽和酮酶。从61个开花植物的群体中，基于花色改变选择它们中的一株，即品系701-2502-1-35，进行薄层层析(TLC)筛选。然后进行上述相同的非定量筛选步骤，除了涡旋振荡为至少1小时30分钟且不重复涡旋振荡。将品系13819用作对照。基于与夏侧金盏花酮类胡萝卜素参考的视觉比较，将金盏花转基因品系鉴定为具有酮类胡萝卜素。

实施例14：用类胡萝卜素转基因粒子轰击转化矮牵牛

为了进一步检测矮牵牛中酮类胡萝卜素产量，用质粒pBHX689UBQ3::nptII::LIS1::rbcs::crtB::nos::UBQ3::rbcs::crtI::nos或质粒pBHX691UBQ3::nptII::LIS1::rbcs::crtW::nos::UBQ3::rbcs::crtZ::nos转化Easy Wave^TM white，由PanAmerican Seed Co.，622 Town Road，WestChicago，IL 60185商业获得。转化系统是对叶来源原生质体的粒子轰击。矮牵牛原生质体分离和再生的技术在本领域中是众所周知的[见Binding，Mongr Theor Appl Genet，9：123-132(1984)]。

在本研究中，选择温室生长四分之三至全部伸展的叶子进行原生质体分离。在原生质体分离之前，在含有几滴Tween20的12％Clorox溶液中将整个叶子表面消毒大约12分钟。表面消毒之后，用无菌蒸馏水将叶子漂洗4次。然后将叶子剪成大约0.2-0.5mm的条，并转移入大约25ml质壁分离液并允许孵育大于40分钟。质壁分离液含有溶于100ml称为CPW的盐溶液中的13克甘露醇，CPW盐溶液本身含有0.272mg/l KH₂PO₄、1.01mg/l KNO₃、2.46mg/l MgSO₄.5H₂O、0.0016mg/l KI、0.00025mg/lCuSO₄.2H₂O和148.0mg/l CaCl₂.2H₂O。对于质壁分离液，在高压灭菌之前将pH值调到5.7。

孵育作用之后，去除质壁分离液并加入消化酶溶液。消化酶溶液含有溶于100ml CPW盐溶液中的500mg纤维素酶R10(Yakuit Honsha Co.，Tokyo，Japan)和100mg软化酶(macerase)(CalBiochem，La Jolla，CA)，如上所述，在过滤除菌之前将pH值调至5.7。将组织放于振荡的振荡器上并孵育大约14小时。

然后将原生质体转移入50ml圆锥形离心管中并通过45×g离心10分钟进行沉淀，之后用原生质体洗涤培养基进行洗涤。原生质体洗涤培养基含有没有氮的Murashige和Skoog基础盐培养基M531(PhytoTechnologyLaboratories LLC，Shawnee Mission，KS)，具有以下添加剂：1.9g/l KNO₃、100mg/l谷氨酰胺、20mg/l酪蛋白水解产物、10mg/l硫胺素HCl、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l尼克酸、0.1mg/l丝氨酸、2g/l肌醇和90g/l山梨糖醇。在高压灭菌之前将培养基pH值调到5.7。

为了纯化，将原生质体沉淀并重悬于5ml上述的原生质体洗涤培养基，并覆盖于15ml圆锥形离心管中的7ml密度梯度溶液上。通过将8.56g蔗糖溶于50ml上述CPW盐溶液和25ml histopaque(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中制备密度梯度。以过滤除菌之前将密度梯度溶液pH值调到5.7。以95×g旋转混合物12分钟并收集界面处的原生质体。

纯化作用之后，将原生质体沉淀并重悬于修饰的含有K427(PhytoTechnology Laboratories LLC，Shawnee Mission，KS)的Kao和Michayluk液体培养基，它具有以下添加剂：250mg/l酪蛋白水解产物、20ml/l椰子汁、17.1g/l蔗糖、63.8g/l甘露醇、2g/l肌醇、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/l 1-萘醋酸和0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤。

在过滤除菌之前，将培养基pH值调到5.7。然后将原生质体悬液铺于改良的含有M531的Murashige和Skoog固体培养基上，见上，它具有以下添加剂：1.9g/l KNO₃、100mg/l谷氨酰胺、20mg/l酪蛋白水解产物、10mg/l硫胺素HCl、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l尼克酸、0.1mg/l丝氨酸、2g/l肌醇、17.1g/l蔗糖、31.9g/l甘露醇、31.5g/l葡萄糖、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/l1-萘醋酸和0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤。在加入5g/l洗过的琼脂并高压灭菌之前，将培养基pH值调到5.7。

对于培养，将大约4ml上述经改良的Kao和Michayluk液体培养基覆盖于上述经改良的Murashige和Skoog固体培养基上面，然后将大约1ml原生质体悬液轻轻转移至液体培养基。然后将培养的细胞置于黑暗培养条件，温度大约为23-24℃。最初培养后的大约8-10天，将原生质体来源的细胞铺到含有K427的经改良Kao和Michayluk固体培养基上，它含有如下添加剂：250mg/l酪蛋白水解产物、20ml/l椰子汁、103g/l蔗糖、2g/l肌醇、1mg/l 1-萘醋酸和0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤。在加入5g/l纯化的琼脂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)并高压灭菌之前，将培养基pH值调到5.7。

在铺在固体培养基上三天后，用Biolistic颗粒递送系统，model PDS1000(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，对培养物进行轰击。轰击条件包括900psi安全膜(rupture disk)、在停止屏与培养物表面之间9cm的距离、每次轰击用大约800ng包被于0.6μm金颗粒上的DNA载体。

每个培养板进行两次轰击处理。轰击处理之后，立即将培养板放置于黑暗条件48小时，温度大约为23-24℃。这段时间之后，将培养物转移入上述的改良Kao和Michayluk固体培养基中，它含有降低至80g/l的蔗糖、增加至7g/l的琼脂并加入了100mg/l过滤除菌的卡那霉素。在另外的8-14天之后，将培养物转移入含有100mg/l过滤除菌的卡那霉素的再生培养基中。该再生培养基含有如下添加剂：30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤和1mg/l吲哚-3-醋酸。在加入8g/l琼脂并高压灭菌之前，将培养基pH值调到5.7。将形成的克隆每3-4周一次传代培养于含有100mg/l卡那霉素的再生培养基中直到再生出芽体。建立起生根的植物并在温室中生长至开花。

利用质粒pBHX689构建体，它具有编码八氢番茄红素合酶(使从牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸形成八氢番茄红素)的基因crtB和编码八氢番茄红素去饱和酶(将八氢番茄红素转化为番茄红素)的crtI，在温室中建立了225株植物。在这些植物中，5株植物具有可见的表型，包括在花的管颈处的橙色着色。基于以前的工作，已知该表型与β-胡萝卜素增加有关。不能用这个构建体来预期酮类胡萝卜素的产量。

使用质粒pBHX691构建体，它具有β-胡萝卜素酮酶(它将在β-胡萝卜素4-位上未取代的类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为具有4-酮基团β-紫罗烯环的类胡萝卜素)的crtW基因和β-胡萝卜素羟化酶(它将3-位上未取代的类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为具有3-羟基的β-紫罗烯环的类胡萝卜素)的crtZ基因，在温室建立了219株植物。这些植物中，没有一株呈现出酮类胡萝卜素产生的表型证据。由于不希望受任何理论的束缚，应该相信这些结果反映了本研究的这组植物中有限的底物β-胡萝卜素的利用度。

每篇专利和文章此处引用作为参考。文中所用的“a”或“an”用于包括一个或多个。2003年3月20日申请的共同拥有的专利申请序列号未知，其题目为“植物表达盒”的内容也在此处引用作为参考。

从上面所叙述，可以理解在不脱离本发明的真正精髓和范围下可以进行多种改变和变化。应该理解特定的实施例不用于限制或作出推论。本公用后附的权利要求书进行覆盖，对其所作的改变落在本权利要求书的范围内。

序列表

<110>鲍尔园艺公司

<120>花瓣中的4-酮类胡萝卜素

<130>7513/88582

<140>NOT YET ASSIGNED

<141>2003-03-20

<150>60/366,444

<151>2002-03-21

<150>10/325,265

<151>2002-12-19

<160>24

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮酶基因(crtW)的3’端导入Kpn I限制性位点的引物

<400>1

gccagtgcca aggtacctct gtcatgcc                                     28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自雨生红球藻的β-胡萝卜素酮酶基因(crtW)的5’端导入Nde I限制性位点的引物

<400>2

ccggggatcc tc tacatatg cacgtcgc                               28

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自烟草(Nicotiana tabacum)核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的转运肽的5’端导入Xma I限制性位点的引物

<400>3

c tcgtcgacc cgggatggct tcctcagttc                             30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自烟草核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的转运肽的3’端导入Nde I限制性位点的引物

<400>4

cccatatgtt gcactcttcc gccgttgctg                              30

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的遍在蛋白3(UBQ3)基因启动子的5’端导入Hind III位点和Sal I位点的引物

<400>5

acaagctttc agagtcgact tcggatttgg agccaag                      37

<210>6

<211>   。8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自拟南芥菜的遍在蛋白3(UBQ3)基因启动子的3’端导入Xma I位点的引物

<400>6

tcatccccgg gatgtgaaag agagagtc                                28

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自拟南芥菜遍在蛋白11(UBQ11)基因上游(启动子)区域的5’端导入Hind

III位点的引物

<400>7

caaagcttca gactagtcga cttgcctcaa                              30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在来自拟南芥菜遍在蛋白11(UBQ11)基因上游(启动子)区域的3’端导入Xma I

位点的引物

<400>8

caattcgatg gggcccggga tcttgatcac                              30

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于雨生红球藻基因的3’端导入Kpn I限制性位点的引物

<400>9

ccagtgccaa gctggtaccg tcat                                    24

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于雨生红球藻基因的5’端导入Nde I限制性位点的引物

<400>10

ggggatcctc tacatatgag cgcaca                                  26

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于合成含有仙女扇(Clarkia brewerii)LIS1基因的LIS1 5’-侧翼区约1kb片段的引物

<400>11

ccaagcttat ctaataatgt atcaaaatc                               29

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于合成含有仙女扇LIS1基因的LIS1 5’-侧翼区约1kb片段的引物

<400>12

cagcccggga tggttgtctt gtttaaggtg g                            31

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在5’端导入Hind III位点的引物，以制备含有仙女扇LIS1基因启动子区的Hind

III-EcoR I片段

ccaagcttat ctaataatgt atcaaaatc                               29

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在3’端导入Sma I位点的引物，以制备含有仙女扇LIS1基因启动子区的Hind

III-EcoR I片段

<400>14

cagcccggga tggttgtctt gtttaaggtg g                            31

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在新霉素磷酸转移酶II选择性标记基因的5’端添加Hind III和Mfe I位点的引物

<400>15

gcacaagctt tggatcgcaa ttgatgattg aacaagat                     38

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在新霉素磷酸转移酶II选择性标记基因的3’端添加Kpn I位点的引物

<400>16

cccaggtacc cgctcagaag aactcgtcaa ga                           32

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于添加Pme III位点的引物，以制备来自pUC19的多克隆位点

<400>17

cacgtttaaa ctaccgcaca gatg                                    24

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于保留Hind III位点的引物，以制备来自pUC19的多克隆位点

<400>18

ggccgcatac aggctgtcag                                         20

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)crtZ基因的5’端添加Nde I位点的引物

<400>19

cggggatcct ctacatatga ccaatttcct                              30

<210>20

<211>30

<213>人工序列

<220>

<223>用于在噬夏孢欧文氏菌crtZ基因的3’端添加Kpn I位点的引物

<400>20

cgacggccgg taccaagcta gatctgtcac                              30

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在夏侧金盏花基因组DNA的5’端添加Nde I位点的引物，以制备夏侧金盏花

(Adonis aestivalis)酮酶基因

<400>21

gaaacctcat atggcagcag caatttca                                28

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在夏侧金盏花基因组DNA的3’端添加Kpn I位点的引物，以制备夏侧金盏花酮

酶基因

<400>22

cacggtacct tcaggtagat ggttgcgttc gt                           32

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>一对退火的寡核苷酸之一，用于制备质粒pBHX612

<400>23

ggccgcaagc ttgaggaggt cgac                                    24

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>一对退火的寡核苷酸之一，用于制备质粒pBHX612

<400>24

agc tgtcgac ctcctcaagc ttgc                                   24

Claims (42)

1.转基因植物或其可再生部分，其基因组含有编码嵌合酮酶多肽的转基因，所述嵌合酮酶多肽具有两部分：(i)融合至(ii)的包含质体转运肽的N-末端第一部分；(ii)第二酮酶部分，其将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮β-紫罗烯环，所述转基因被可操作地连接至调控所述转基因表达的启动子，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型植物的花瓣产生含有不具有4-位取代的β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物，并且其中所述转基因植物的花瓣积累具有4-酮β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。

2.根据权利要求1所述的植物，其中具有4-酮-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物是4，4′-二酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物。

3.根据权利要求1所述的植物，其中所述4，4′-二酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物是角黄素。

4.根据权利要求1所述的植物，其中所述4，4′-二酮-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物是虾青素。

5.根据权利要求1所述的植物，其中所述质体转运肽部分是RUBISCO转运肽。

6.根据权利要求1所述的植物，其基因组包括编码第二嵌合多肽的第二转基因，所述第二嵌合多肽含有(i)融合至(ii)的N-末端质体转运肽；(ii)将类胡萝卜素β-紫罗烯环化合物转化为类胡萝卜素3-羟基-β-紫罗烯环化合物的羟化酶，并且所述第二转基因被可操作地连接至调控所述第二具有转基因表达的启动子。

7.根据权利要求6所述的植物，其中所述具有3-羟基-β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物是3，3′-二羟基-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物。

8.根据权利要求7所述的植物，其中所述3，3′-二羟基-β-紫罗烯环类胡萝卜素化合物是玉米黄素。

9.根据权利要求6所述的植物，其中所述质体转运肽部分是RUBISCO转运肽。

10.根据权利要求1所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分是β-胡萝卜素-4-加氧酶，它是由存在于选自以下一种或多种生物体的基因编码的，所述生物体选自：夏侧金盏花(Adonis aestivalis)、橙黄农杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)、产碱菌属中的某些种(Alcaligenes sp.)、慢生根瘤菌属中的某些种(Bradyrhizobium sp.)、橙黄短波单胞菌(Brevundimonasaurantiaca)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、念珠藻属中的某些种(Nostoc sp.)、Paracoccus marcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、集胞藻属中的某些种(Synechocystis sp.)、绵长热聚球藻(Thermosynechococcus elongates)、红海束毛藻(Trichodesmiumerythraeum)。

11.根据权利要求1所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分是由雨生红球藻的bkt基因和crtO基因之一或两者编码的，或者是由橙黄农杆菌的crtW基因编码的。

12.根据权利要求1所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分是由夏侧金盏花的AdK1基因和AdK6基因之一或两者编码的。

13.根据权利要求1所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分是由产碱菌PC-1的crtW基因编码的。

14.根据权利要求7所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素3-羟基-β-紫罗烯环的羟化酶部分是由噬夏孢欧文氏菌和草生欧文氏菌的crtZ基因之一或两者编码的。

15.根据权利要求1所述的植物，其中调控所述转基因表达的启动子是花瓣优先的启动子。

16.根据权利要求1所述的植物，其中在未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的植物花瓣产生的含有不具有4-位取代的β-紫罗烯环的类胡萝卜素是β-胡萝卜素和玉米黄素之一或两者。

17.根据权利要求16所述的植物，其中将未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的所述植物用编码一种或多种形成类胡萝卜素的酶而不是酮酶的一个或多个DNA片段转化。

18.根据权利要求1所述的植物，它还进一步包括选自以下的一个或多个进一步的转基因：(a)噬夏孢欧文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ基因或(b)草生欧文氏菌的GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶(4H)、番茄红素环化酶和β-胡萝卜素羟化酶基因，其中每一所述进一步的转基因(i)可操作地连接至指导所述转基因花瓣优先表达的启动子上，和(ii)表达含有N-末端质体转运肽部分的嵌合多肽酶。

19.根据权利要求1所述的植物选自石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、菊科(Compositae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、十字花科(Cruciferae)、龙胆科(Gentinaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Graminae)、大戟科(Euphorbiaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、百合科(Liliaceae)、半边莲科(Lobeliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、报春花科(Primulaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、伞形科(Umbelliferae)、马鞭草科(Verbenaceae)和堇菜科(Violaceae)。

20.转基因植物或其可再生部分，其基因组含有编码嵌合酮酶多肽的转基因，所述嵌合酮酶多肽具有两部分：(i)融合至(ii)的包含质体转运肽的N-末端第一部分；(ii)第二酮酶部分，其将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮β-紫罗烯环，所述转基因被可操作地连接至调控所述转基因表达的启动子，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型植物的花瓣产生β-胡萝卜素和玉米黄素之一或两者，并且其中所述转基因植物的花瓣积累具有4-酮β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。

21.根据权利要求20所述的植物，其中β-胡萝卜素产生于未用所述嵌合酮酶转化的相同类型植物的花瓣中。

22.根据权利要求21所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产β-胡萝卜素植物是突变体或相对于相同类型的非突变体或非转化植物而言以约5倍到约200倍增加量在花瓣中积累β-胡萝卜素的不同经转化的转基因植物。

23.根据权利要求22所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产β-胡萝卜素植物是突变体植物。

24.根据权利要求23所述的植物，其中所述突变体植物的花瓣表现出β-胡萝卜素比率的量大约是1∶10到大约1的比率。

25.根据权利要求24所述的植物，其中突变体植物是金盏花。

26.根据权利要求22所述的转基因植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产β-胡萝卜素植物是不同转化的转基因植物。

27.根据权利要求26所述的植物，其中所述不同转化的转基因植物含有编码并表达一种或多种异源类胡萝卜素形成酶的一个或多个DNA片段。

28.根据权利要求27所述的植物，其中转基因植物是矮牵牛。

29.根据权利要求20所述的植物，其中调控所述转基因表达的所述启动子是花瓣优先的启动子。

30.根据权利要求20所述的植物，其中玉米黄素产生于未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的植物的花瓣中。

31.根据权利要求30所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产玉米黄素植物是突变体或相对于相同类型的非突变体或非转化植物而言以约10倍到约20倍增加量在花瓣中积累玉米黄素的不同转化的转基因植物。

32.根据权利要求30所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产玉米黄素植物是突变体或在花瓣中积累玉米黄素并表现出玉米黄素比率为约1∶10到约1的不同转化的转基因植物。

33.根据权利要求31所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产玉米黄素植物是突变体植物。

34.根据权利要求33所述的植物，其中所述突变体植物的花瓣表现出玉米黄素的量比玉米黄素的量加叶黄素的量的比率为约1∶10到约1.0。

35.根据权利要求34所述的植物，其中突变体植物是金盏花。

36.根据权利要求20所述的植物，其中所述质体转运肽和所述启动子来自于不同的物种。

37.转基因植物或其可再生部分，其基因组含有编码嵌合酮酶多肽的转基因，所述嵌合酮酶多肽具有两部分：(i)融合至(ii)的包含质体转运肽的N-末端第一部分；(ii)第二酮酶部分，其将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为4-酮β-紫罗烯环，所述转基因被可操作地连接至调控所述转基因表达的花瓣优先的启动子上，并且所述启动子与所述质体转运肽来自于不同的物种，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型植物的花瓣产生β-胡萝卜素和玉米黄素之一或两者，并且其中所述转基因植物的花瓣积累具有4-酮β-紫罗烯环的类胡萝卜素化合物。

38.根据权利要求37所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产β-胡萝卜素或玉米黄素的植物是突变体或者为在花瓣中积累玉米黄素和β-胡萝卜素之一或两者并表现出相对于相同类型的非突变体或非转化植物而言以大约10倍到大约20倍的玉米黄素增加量和大约5倍到大约200倍β-胡萝卜素增加量之一或两者的不同转化的转基因植物。

39.根据权利要求37所述的植物，其中所述的将类胡萝卜素β-紫罗烯环转化为类胡萝卜素4-酮-β-紫罗烯环的酮酶部分是由选自以下的基因编码的：雨生红球藻的bkt基因和crtO基因之一或两者、夏侧金盏花的AdK1基因和AdK6基因之一或两者、橙黄农杆菌的crtW基因和产碱菌PC-1的crtW基因，以及它们的混合物。

40.根据权利要求39所述的植物，其中未用所述嵌合酮酶转化的相同类型的产玉米黄素或β-胡萝卜素的植物是突变体植物。

41.根据权利要求40所述的植物，其中所述突变体植物的花瓣表现出玉米黄素和β-胡萝卜素比率之一或两者大约为1∶10到大约为1。

42.根据权利要求41所述的植物，其中所述突变体植物是金盏花。

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