CN113748990A - 新飘香藤属植物及其制出方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供至今无法制出的有新的色调的花色的新飘香藤属植物。从候选飘香藤属植物的花瓣提取类胡萝卜素色素，在该类胡萝卜素色素提取液中存在新叶黄素或其衍生物时，选定为亲本飘香藤属植物。

Description

新飘香藤属植物及其制出方法
本申请是2016年10月14日提交的同名发明专利申请201680001712.2的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的新飘香藤(Mandevilla)属植物、以及，能与有白色～粉色～红色的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法、及使用该亲本飘香藤属植物的选定方法的飘香藤属杂交植物的产生方法。
【背景技术】
飘香藤属(Genus Mandevilla)植物(也被称为飘香藤(Dipladenia))是属于夹竹桃科(family Apocynaceae)的蔓性的木本或直立的草本，在热带美洲、例如，从墨西哥至阿根廷原生约130种。
在园艺上，在1868年左右，由英国以美丽飘香藤(Mandevilla splendens)作为一方亲本(另一方亲本不明)制出粉红飘香藤(Mandevilla x amabilis(syns.M.amonea))。在1960年，在美国，从被标记为M.amonea的株得到的实生株开花，这成为即使在现在也广泛流通的“Alice du Pont“(日本名“Rose Giant”)(参照以下，非专利文献1、2)。
至2000年左右，园艺上流通的品种无非存在，主要从此“Alice du Pont”及其自然突变的枝代替品种或放任受粉而得的实生株挑选的品种、或者仍来历不明的红花飘香藤(Mandevilla sanderi)及其枝代替或由放任受粉的实生株挑选品种、或者以野生种原样的白花飘香藤(Mandevilla laxa)(Chilean Jasmine)或玻利维亚飘香藤(Mandevillaboliviensis)(参照以下专利文献1)。
三得利花(株)于1998年销售了大轮开类型“白色”(Mandevilla amabilis xboliviensis'Sunmandeho'、品种注册申请第8721号)(参照以下专利文献2)。
另外，三得利花(株)于2003年销售了相同大轮开类型“粉色”(Mandevillahybrida'Sunmandecos'、品种注册申请第14756号)(参照以下专利文献4)。
三得利花(株)于2005年销售了蔓开类型“红色”(Madevilla hybrida'Sunmanderemi')(参照以下专利文献5、品种注册申请第15862号)、“热带桃红色”(Mandevilla hybrida'Sunmandetomi')(参照以下专利文献6、品种注册申请第15863号)，销售了蔓开类型“粉红色”(Sunparagropi)(品种注册申请第24471号)、蔓开类型“红天鹅绒”(Mandevilla hybrida‘Sunpararenga’)(参照以下专利文献14、品种注册申请第23333号)、及蔓开类型(在海外称为Pretty类型)“Sundaville Pretty Rose”(Mandevillahybrida'Sunparaprero')(参照以下专利文献15)。
三得利花(株)于2007年销售了大轮开“深红王”(Mandevilla hybrida'Sunmandecrikin')(参照以下专利文献7、品种注册申请第17409号)。
三得利花(株)在同年销售了早开类型“深红”(Mandevilla hybrida'Sunmandecrim')(参照以下专利文献3、品种注册申请第14755号)。
三得利花(株)也销售了早开类型“胭脂红”(Mandevilla hybrida'Sunmandecripi')(参照以下专利文献8、品种注册申请第23604号)、“乳粉色”(Mandevillahybrida'Sunparapibra')(参照以下专利文献9、品种注册申请第24470号))。
上述大轮开“深红王”和早开类型“深红”是从前没有的真红的飘香藤，随着这些新品种的登场，市场开始扩大，三得利花(株)的各竞争公司也开始育种飘香藤。
在以下的专利文献10(受让人、Syngenta Participations AG)中记载了使与专利文献3中记载的早开类型“深红”相同的在法国作为'Sundaville'(注册商标)Red,'MoulinRouge'提供的品种作为母体、使专利文献1中记载的作为'Helle'记载的作为'My FairLady'TM提供的品种作为父体交配而得的被称为Mandevilla sanderi(Hemsl.)Woodson'Fisrix Pinka'的新品种。
在专利文献11～13(受让人、Floraquest Pty.Ltd.、及Protected PlantPromotions Australia Pty.Ltd.)中记载了使以编号X02.5识别的Mandevilla hybrida作为母体、专利文献3中记载的早开类型“深红”(Mandevilla hybrida'Sunmandecrim')作为父体交配而得的被称为Mandevilla hybrida'Ginger'的新品种。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】美国植物专利第9117号公报
【专利文献2】美国植物专利第11556号公报
【专利文献3】美国植物专利第15539号公报
【专利文献4】美国植物专利第15202号公报
【专利文献5】美国植物专利第16449号公报
【专利文献6】美国植物专利第16363号公报
【专利文献7】美国植物专利第17736号公报
【专利文献8】美国植物专利第18578号公报
【专利文献9】美国植物专利第19649号公报
【专利文献10】美国植物专利第20644号公报
【专利文献11】美国植物专利第20776号公报
【专利文献12】美国植物专利第20777号公报
【专利文献13】美国植物专利第20919号公报
【专利文献14】美国植物专利第20542号公报
【专利文献15】美国植物专利第19399号公报
【非专利文献】
【非专利文献1】The New York Botanical Garden Illustrated Encyclopediaof Horticulture,Vol.6,p.2129-2130,Garland Publishing,Inc.(1981)
【非专利文献2】Mbberley's Plant-book,Third Edition,p.520,CambridgeUniversity Press(2008)
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
飘香藤属植物的销售品种以往仅是有白色、粉色、红色的花色的品种。存在有黄色的花色的野生种，近年虽也有黄色的花色的品种(Opale Citrine)在卖，但由于这些无法与有白色、粉色、红色系的花色的品种杂交，以有黄色的花色的品种作为交配亲本的杂交植物至今尚未制出。因此，还未能实现有黄色的花色的品种与以往的有白色～粉色～红色系的花色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的品种杂交产生的新的色表现。本发明要解决的课题在于提供以往未能制出的有新的色调的花色的新飘香藤属植物。
【解决课题的技术方案】
本发明人，此番，在将红色品种与白色品种交配的实生株之中取得具有特别的色调的系统09M111-1，在进行花瓣的色素分析时，发现虽然微量但有特有的类胡萝卜素色素。令人惊讶地，当使该有特有的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物与有白色、粉色、红色系的花色的飘香藤属植物的品种交配时，得到杂交种子，由此成功制出以往未能制出的有新的色调的花色的杂交植物。
具体而言，本发明如下。
[1]花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是新叶黄素或其衍生物。
[2][1]所述的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素或这些的组合。
[3]花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物。
[4]飘香藤属植物，其中花瓣中含新叶黄素合酶。
[5][1]～[4]之任一项所述的飘香藤属植物，其特征在于，在CIE L*a*b*表色系中，有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色。
[6][5]所述的飘香藤属植物，其中在CIE L*a*b*表色系中，有0～30的a*值、及0～5的b*值的花色以外的花色。
[7][1]～[4]之任一项所述的飘香藤属植物，其中在CIE L*a*b*表色系中，有-5～20的a*值、及3～70的b*值的花色、或者50～70的a*值、及5～70的b*值的花色。
[8][1]～[7]之任一项所述的飘香藤属植物，其中每1g新鲜花瓣含0.02mg以上的花青苷色素。
[9][8]所述的飘香藤属植物，其中上述花青苷色素是花青素。
[10]飘香藤属植物，其为09M111-1(保藏号：FERM BP-22298)。
[11][1]～[10]之任一项所述的飘香藤属植物的后代。
[12][1]～[10]之任一项所述的飘香藤属植物或其后代的营养繁殖体、植物体的一部分、组织、或者细胞。
[13][1]～[10]之任一项所述的飘香藤属植物或其后代的切花、或者由该切花制成的加工品。
[14]能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中，作为类胡萝卜素色素存在新叶黄素或其衍生物时，选定为亲本飘香藤属植物。
[15][14]所述的方法，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素或这些的组合。
[16]能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中，作为类胡萝卜素色素存在相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物时，选定为亲本飘香藤属植物。
[17]能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中存在新叶黄素合酶时，选定为亲本飘香藤属植物。
[18][14]～[17]之任一项所述的方法，其中在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-10～70，并且b*值是0～80时，选定为亲本飘香藤属植物。
[19][18]所述的方法，其中上述a*值是0～30，并且b*值是0～5时，从亲本飘香藤属植物的选定除外。
[20][14]～[17]之任一项所述的方法，其中在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-5～20，并且b*值是3～70时，或者a*值是50～70，并且b*值是5～70时，选定为亲本飘香藤属植物。
[21][14]～[20]之任一项所述的方法，其中测定候选飘香藤属植物的花瓣中的花青苷色素的量，在每1g新鲜花瓣含0.02mg以上的花青苷色素时，选定为亲本飘香藤属植物。
[22][21]所述的方法，其中上述花青苷色素是花青素。
[23][14]～[22]之任一项所述的方法，其中作为亲本飘香藤属植物选定09M111-1(保藏号：FERM BP-22298)。
[24]产生在CIE L*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色(例如，黄色～杏黄色～橙色、特别，象牙色、浅黄色、黄色、杏黄色、橙粉色、橙红色、橙色)的花瓣的飘香藤属植物的方法，其包括：
由[14]～[23]之任一项所述的方法选定第1飘香藤属亲本植物的工序、及使选定的第1飘香藤属亲本植物和第2飘香藤属亲本植物杂交的工序。
[25][24]所述的方法，其中上述第2飘香藤属亲本植物有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣。
【发明效果】
由本发明使得通过至今未能杂交的有白色～粉色～红色系的花色的飘香藤属植物的品种与具有黄色色素的品种的杂交，制作有以往不存在的新的色调的花瓣的新的飘香藤属植物变得可能。
【附图说明】
【图1】是本发明的飘香藤属植物(4990)花瓣的丙酮提取物的HPLC-PDA(450nm)的层析谱。
【图2】是本发明的飘香藤属植物(09M111-1)花瓣的丙酮提取物的HPLC-PDA(450nm)的层析谱。
【图3】是以往的飘香藤属植物(Opale Citrine)花瓣的丙酮提取物的HPLC-PDA(450nm)的层析谱。
【图4】是本发明的飘香藤属植物品种与既有的飘香藤属植物品种的花色的分光测色计数据。
【图5】是本发明的飘香藤属植物(09M111-1)及既有的飘香藤属植物(OpaleCitrine)的HPLC-PDA(450nm)的层析谱。
【图6】是在本发明的飘香藤属植物(09M111-1)的HPLC-PDA(450nm)层析谱中观察到的峰的表观吸收光谱。
【图7】是本发明的飘香藤属植物(09M111-1)的1H-NMR光谱(5.3-6.9ppm)。
【图8】是既有的飘香藤属植物(Opale Citrine)的1H-NMR光谱(5.3-6.9ppm)。
【图9】是本发明的飘香藤属植物(09M111-1)的高分解能质量提取离子层析谱((a)m/z 1021.81-1021.83；(b)m/z 1049.84-1049.86；(c)m/z 1077.87-1077.89)。
【图10】是既有的飘香藤属植物(Opale Citrine)的高分解能质量提取离子层析谱((a)m/z 1021.81-1021.83；(b)m/z 1049.84-1049.86；(c)m/z 1077.87-1077.89)。
【图11】是既有的飘香藤属植物(Opale Citrine)的高分解能质量提取离子层析谱((a)m/z 1005.82-1005.83；(b)m/z 1033.85-1033.87；(c)m/z 1061.88-1061.90)。
【实施方式】
在本发明的第1实施方式中，提供花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物。
类胡萝卜素色素是显示黄色、橙色、红色等的天然色素的一组，至今从动植物单离－鉴定出极多种类的类胡萝卜素。类胡萝卜素作为有一般8个异戊二烯单位键合而构成的化学式C40H56的基本骨架的萜类的一种被知，被分类为四萜。类胡萝卜素由其分子结构中的共价双键，在400～500nm之间显示具有极大的不同的吸收光谱，由此，呈现黄色～橙色～红色的色。
本发明人经进一步锐意探讨的结果，成功鉴定出相当于这些的峰的化合物，得到相当于这些峰的化合物有新叶黄素的基本骨架的惊人的见解。
从而，在本发明的进一步的实施方式中，提供花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是新叶黄素或其衍生物。
新叶黄素是植物激素脱落酸的生物合成中的中间体，从堇黄素由新叶黄素合酶合成，有以下的化学结构。
【化1】
Figure BDA0003274562290000051
新叶黄素及堇黄素均是类胡萝卜素来源的黄色的色素的叶黄素的一种，但如下述的实施例所示，堇黄素衍生物在既有的飘香藤属植物(Opale Citrine)中也存在，与此相比，新叶黄素衍生物仅在本发明的飘香藤属植物(09M111-1)中存在，这是极其意外的。
作为新叶黄素衍生物，例如，可举出新叶黄素的脂肪酸酯。作为形成脂肪酸酯的脂肪酸，例如，可举出酪酸、缬草酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、珠光脂酸、硬脂酸、油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、桐酸、花生酸、米德酸、花生四烯酸、山嵛酸、木蜡酸、神经酸、蜡酸、褐煤酸、蜜蜡酸等，但不限于这些。新叶黄素衍生物优选为新叶黄素的3位及3’位的羟基上各自结合脂肪酸的新叶黄素二酯，特别优选为，二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素。
另外，本发明的飘香藤属植物因为在花瓣中含新叶黄素或其衍生物作为类胡萝卜素色素，考虑含作为与其生物合成相关的酶，新叶黄素合酶。新叶黄素合酶是向堇黄素导入丙二烯基而将其转变为新叶黄素的酶，以堇黄素作为底物而生成新叶黄素。从而，在本发明的进一步的实施方式中，提供花瓣中含新叶黄素合酶的飘香藤属植物。
本发明的飘香藤属植物也可在CIE L*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色。此时，适宜地，有0～30的a*值、及0～5的b*值的花色以外的花色。最适地，有-5～20的a*值、及3～70的b*值的花色、或者50～70的a*值、及5～70的b*值的花色。
CIE L*a*b*表色系是在国际照明委员会(CIE)标准化的表色系，作为表示色调的表示法广泛被知，也被称为CIE1976(L*a*b*)表色系。在L*a*b*表色系中，亮度用L*表示，进而显示色相和彩度的色度用a*和b*表示。a*和b*各自表示色的方向，a*表示红色方向、-a*表示绿色方向、b*表示黄色方向、进而-b*表示蓝色方向。L*、a*及b*的各值可由三刺激值X、Y、Z根据以下的等式得出。
L*＝116(Y/Y0)1/3-16；
a*＝500[(X/X0)1/3-(Y/Y0)1/3]；及
b*＝200[(Y/Y0)1/3-(Z/Z0)1/3]
但是，X/X0、Y/Y0及Z/Z0是>0.008856，式中，X0、Y0及Z0表示标准光源的三刺激值。
再者2个不同的色、L*1、a*1及b*1和L*2、a*2及b*2的色差ΔE可由以下式求出。
ΔE＝√(L*2-L*1)2+(a*2-a*1)2+(b*2-b*1)2
利用CIE L*a*b*表色系的色的解析可由积分球型的分光测色计简便地进行，例如可使用市售的分光光度计(CM-2022,柯尼卡美能达)。
另外，本发明的飘香藤属植物每1g新鲜花瓣可含0.02mg以上的花青苷色素，适宜地含0.05mg以上、最适0.07mg以上的花青苷色素。
花青苷色素已知在植物中含有，呈红色、蓝色、紫色的花色。根据作为苷元的花青素部位的B环的羟基的数，被分类为天竺葵色素、花青素及飞燕草素的3系。已知显色团在苷元部分，天竺葵色素呈鲜红色、花青素呈红紫色、飞燕草素呈紫红色。本发明的飘香藤属植物中所含的主要的花青苷色素是花青素。
本发明的飘香藤属植物只要满足上述要件，就不特别限定，但适宜地可举出以09M111-1、及09M111-1作为亲本植物的杂交植物。09M111-1的培养苗于2015年10月9日基于布达佩斯条约保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利生物保藏中心(NITE-IPOD)(也即，日本国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心)(千叶县木更津市上总镰足2-5-8、120号室)(保藏号：FERM BP-22298)。
本发明包含上述飘香藤属植物的后代。这样的后代优选有与上述飘香藤属植物相同的期望的表征。本发明也包含上述飘香藤属植物或其后代的营养繁殖体(插枝、种子等)、植物体的一部分(花、茎、枝、叶、根等)、组织、或者细胞。再者，本发明也包含上述飘香藤属植物或其后代的切花、或者由该切花制成的加工品。
在本发明的第2实施方式中，提供能与有白色～粉色～红色的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，从候选飘香藤属植物的花瓣提取类胡萝卜素色素，在该类胡萝卜素色素提取液中，作为类胡萝卜素色素存在相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物(具体而言，上述新叶黄素或其衍生物)、或者新叶黄素合酶时，选定为亲本飘香藤属植物。新叶黄素合酶的确认可通过本领域技术人员常规的方法、例如，由PCR法的新叶黄素合酶基因的鉴定或由质谱分析的新叶黄素合酶的直接的鉴定实施。
飘香藤属植物花的结构特殊，通过人为的受粉的人工交配在技术上难。尽管存在约130种以上的原种，但园艺上利用的不过10数种。因此，尽管存在有黄色的花色的野生种，但以有黄色的花色的以往的品种作为交配亲本的杂交飘香藤属植物以往未能制出，未能实现有黄色的花色的飘香藤品种与以往的有白色～粉色～红色系的花色的飘香藤品种的杂交产生的新的色表现。但是，通过本发明的方法变得作为亲本植物容易地选定能与有白色～粉色～红色的花瓣的飘香藤属植物杂交的，有类胡萝卜素系的花色的飘香藤属植物。
在上述本发明的亲本飘香藤属植物的选定方法中，在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-10～70，并且b*值是0～80时，也可选定为亲本飘香藤属植物。此时，适宜地，a*值是0～30，并且b*值是0～5时，从亲本飘香藤属植物的选定除外。最适地，在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-5～20，并且b*值是3～70时，或者a*值是50～70，并且b*值是5～70时，选定为亲本飘香藤属植物。
另外，在上述本发明的亲本飘香藤属植物的选定方法中，测定候选飘香藤属植物的花瓣中的花青苷色素的量，每1g新鲜花瓣含0.02mg以上、适宜地0.05mg以上、最适地0.07mg以上的花青苷色素时，也可选定为亲本飘香藤属植物。花青苷色素适宜地是花青素。
亲本飘香藤属植物只要是在上述本发明的选定方法中得到的，就不特别限定，但适宜地可举出，以09M111-1、及09M111-1作为亲本植物的杂交植物。
再者，本发明也包括用于产生花瓣中含类胡萝卜素色素的飘香藤属植物的方法，其包括：通过上述本发明的亲本飘香藤属植物的选定方法，选定第1飘香藤属亲本植物的工序、及使上述第1飘香藤属亲本植物和第2飘香藤属亲本植物杂交的工序。
第2飘香藤属亲本植物只要能与第1飘香藤属亲本植物杂交，就不特别限制，但优选为有白色～粉色～红色的花瓣的飘香藤属植物。例如，可举出大轮开“深红王”(Mandevilla hybrida'Sunmandecrikin')、大轮开类型“白色”(Mandevilla amabilis xboliviensis'Sunmandeho')及蔓开类型“热带桃红色”(Mandevilla hybrida'Sunmandetomi')。
杂交通过自然交配或人工交配进行。在飘香藤属植物中，种子的成熟期间是6个月左右，这相比通常的植物非常地长，所以，交配后，在种子成熟至某种程度的期间、不切断该花柱而维持变得重要。
由本发明能制出有以往未能制出的新的色调、特别是黄色～杏黄色～橙色(例如，象牙色、浅黄、黄、杏黄色、橙粉色、橙红、橙)的花色的新飘香藤属植物。
【实施例】
【例1.飘香藤属植物的制出】
于2009年5月在三得利花(株)全球繁殖&资源中心(东近江市)温室内实施作为交配用原料而以三得利花(株)保有的花色红色的品种MR-7(其后枯死)作为母本、以花色白色的Sunparasol纯白(注册品种名：Sunparacoho)作为父本的交配。于2009年11月收获交配种子。于2009年11月在温室内播种。自发芽的实生株挑选生长良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16℃管理的温室内育苗之后，于2010年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)全球繁殖&资源中心内的室外田地进行栽培试验。于2010年9月以花色的新颖性、生长力、耐暑性作为指标挑选开花株，挑选具有杏黄色的花色(L*＝81.8、a*＝11.7、b*＝28.3)的09M111-1。
于2010年10月在三得利花(株)全球繁殖&资源中心温室内实施09M111-1的自交交配。于2011年5月收获自交种子。于2011年11月在温室内播种。从发芽的实生株挑选生长良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16度管理的温室内育苗之后，于2012年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)室外田地进行栽培试验。于2012年9月从开花株挑选以花色作为指标而强列示黄色味的个体09M111-1self-1。其后，于2013年5月在三得利花(株)全球繁殖&资源中心温室内实施以09M111-1作为母本、以09M111-1self-1作为父本的交配。于2013年11月收获交配种子。于2013年11月在温室内播种。从发芽的实生株挑选生长良好的100株、移植到9cm罐，在夜最低16度管理的温室内育苗之后，于2014年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)全球繁殖&资源中心内的室外田地进行栽培试验。于2014年9月从开花株以花色的新颖性、生长力、耐暑性作为指标挑选，挑选具有黄色的花色(L*＝82.4、a*＝8.6、b*＝48.0)的#4990。
于2013年5月，在三得利花(株)全球繁殖&资源中心内的室外田地，使09M111-1self-1和花瓣花青素含量高的多个红色系接近配置，实施放任授粉。于2013年11月收获以09M111-1self-1作为母本的结实种子。于2013年11月在温室内播种。从发芽的实生株挑选生长良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16度管理的温室内育苗之后，于2014年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)室外田地管理。于2014年9月从开花株以花色的新颖性、生长力、耐暑性作为指标挑选，挑选具有橙红的花色(L*＝36.2、a*＝54.0、b*＝41.4)的#4891。
【例2.类胡萝卜素色素的分析】
作为飘香藤属植物品种，对于4990、09M111-1及Opale Citrine的花瓣中的类胡萝卜素色素，如以下一样进行而作为含有成分的定量。
通过能利用可良好地分析黄色色素的光电二极管阵列检测器(PDA)的检测的高效液相层析分离-PDA系统(HPLC-PDA)进行定量分析。
检液的调制方法是，在玻璃瓶中秤量进行冷冻干燥处理的干燥花瓣5mg，添加丙酮0.5mL，于25℃用超声波清洗器(ASONE,AS52GTU)进行20分钟超声波照射而进行黄色色素成分的提取操作。通过将提取黄色色素成分的上清0.3mL用细孔尺寸0.45μm的滤器(NACALAITESQUE、Cosmonice滤器S(溶剂系统))过滤而进行HPLC-PDA的检液。
高效液相层析分离-光电二极管阵列检测器(HPLC-PDA)的机器构成是，送液单位LC泵使用Nexera LC-30AD(岛津制作所)、PDA检测器使用Prominence SPD-M20A(岛津制作所)，分离柱使用Develosil C30-UG-3 2.0×100mm(野村化学)。LC移动相的送液是，移动相A使用甲醇/水(80/20,vol/vol)、移动相B使用t-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2,vol/vol/vol)，使二元梯度经15分钟将移动相B浓度从0％变化为100％，以0.4mL/分的流速而进行。注入10μL从花瓣提取的检液。
PDA检测器的吸光度测定在200-800nm的范围内进行，特别关注了作为黄色系的补色的蓝色系的吸收带440-490nm。定量值使用从450nm的LC-PDA得到的各峰的吸光度。
结果示于图1～图3。
【例3.类黄酮的分析】
采集飘香藤的花瓣后，冷冻干燥，用含有0.1％三氟醋酸(TFA)的50％乙腈(v/v)从花瓣提取类黄酮。其中分取0.2ml而使其干燥之后，溶解于6N HCl 0.2ml，通过于100℃处理20分钟而得到花青素。将其用0.2ml的1-戊醇提取，供试于HPLC分析。使用ODS-A312柱(15cm_6mm；YMC)，用等度溶剂(AcOH：MeOH：H2O,15：20：65,v/v/v)，以1ml/1分钟流速进行分析。
接下来，如上述调整的花瓣提取液之中，分取200μl而干燥后，溶解于含6单位的β-葡萄糖苷酶(Sigma,St.Louis,MO,USA)及1单位的柚皮苷酶(Sigma)的0.1M磷酸钾缓冲液0.2ml而于30℃处理16小时，由酶解得到黄酮醇。向其中加含有0.1％TFA的90％(v/v)乙腈200μl，停止反应后，供试于HPLC分析。用Shim-pack FC-ODS柱(15cm_4.6mm；岛津制作所)，以0.6ml/分流速，使用溶剂A(H2O：TFA,99.9：0.1,v/v)及溶剂B(H2O：乙腈：TFA,9.9：90：0.1,v/v)进行分析。梯度分析的条件如下。
0分：溶剂B 20％
0-10分钟：溶剂B 70％
10-16分钟：溶剂B 70％
16-17分钟：溶剂B 20％
17-28分钟：溶剂B 20％
使用光电二极管阵列检测器(SPD-M20A,岛津制作所)，以250-400nm的吸光度检测花青素及黄酮醇。
结果示于以下的表。
【表1】
Figure BDA0003274562290000081
Figure BDA0003274562290000091
【例4.色彩测定】
利用分光光度计(CM2022、美能达)，使用D65照明测定本发明中制出的品种及既有的品种的花冠平开部的色彩值。测定值根据CIE L*a*b*表色系(C.I.E.，1986；Gonnet·Hieu,1992；McLaren,1976)数值化。对于各品种测定3个个别的花，将其平均值作为代表值。用以色度a*、b*作为坐标轴的分布图2维地显示花色的分布，确认每色组的分布。
结果示于图4。
【例5.黄色色素的分析】
通过09M111-1与Opale Citrine的比较实施特征性的黄色色素成分的解析。
赋于本发明中的花瓣特征的黄色色素成分的结构解析如下所述，基于(i)利用高效液相层析(HPLC)-光电二极管阵列检测器(PDA)的吸收光谱、(ii)质子核磁共振光谱(1H-NMR)及(iii)高分解能质谱分析光谱(HRMS)进行。
(i)利用高效液相层析(HPLC)-光电二极管阵列检测器(PDA)的黄色色素成分的检测
利用联机分离和可取得紫外可见光光度数据的高效液相层析-光电二极管阵列检测器(HPLC-PDA)，取得含有数种的黄色色素成分的吸收光谱。PDA有必要得到呈现黄色系的400～500nm的范围的吸收光谱。实际的PDA数据的取得在200～800nm的范围进行。
检液的调制方法是在玻璃瓶中秤量进行冷冻干燥处理的干燥花瓣各自5.0mg，作为提取溶剂添加丙酮0.5mL、其后用超声波清洗器(ASONE,AS52GTU)于25℃的设定温度照射超声波20分钟而进行黄色色素成分的提取。检液是将提取黄色色素成分的上清液0.3mL用细孔尺寸0.45μm的滤器(NACALAI TESQUE、Cosmonice滤器S(溶剂系统))进行过滤。
作为HPLC的条件，分离柱优选使用将十八烷基(C18)及三十基(C30)化学修饰的逆相系统柱、移动相优选使用在300nm～600nm的范围不成为吸收光谱的妨碍的叔-丁基甲基醚/甲醇/水系的混合溶液。
HPLC-PDA的机器构成是，送液单位LC泵使用Nexera LC-30AD(岛津制作所)、PDA检测器使用Prominence SPD-M20A(岛津制作所)，分离柱使用Develosil C30-UG-3(2.0×100mm)(野村化学)。LC移动相的送液是，移动相A使用甲醇/水(80/20vol/vol)、移动相B使用叔-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2vol/vol/vol)，使二元梯度经15分钟将移动相B浓度从0％变化为100％，以0.4mL/分流速进行。分析中注入10μL花瓣提取液。
图5显示09M111-1及Opale Citrine的PDA 450nm的层析谱。
比较光谱，得知图中的峰A(保持时间12.0分钟)、峰C(保持时间12.2分钟)、峰D(保持时间12.4分钟)的峰含在09M111-1中，但未含在Opale Citrine中。将对应于峰的用PDA检测器取得的吸收光谱示于图6。在全部的峰的表观吸收光谱中，在类胡萝卜素化合物中观测到特征性的3条的峰(419,443,470nm)。由3条的吸收极大波长，这些被推定为在骨架上具有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、堇黄素、新叶黄素等的类胡萝卜素及它们的酯体。
(ii)黄色色素的1H-NMR分析
为了进行图5中在09M111-1中特征性地见到的峰A、C、D的类胡萝卜素骨架的化学结构确定，进行给出多种化学结构信息的1H-NMR测定。
为了得到对于1H-NMR测定必要的样品量1mg左右，需要干燥花瓣3g左右，需要浓缩操作等。类胡萝卜素由于容易发生异构化或氧附加等的反应，在二丁基羟基甲苯(BHT)等的氧附加防止剂的存在下、样品保存优选在氮封入遮光条件下进行。另外，一般而言，类胡萝卜素的1H-NMR测定多在重氯仿中进行，但重氯仿分解会生成盐酸，从而有时酸不稳定的C-5,6环氧类胡萝卜素被酸变化为C-5,8环氧基。由于09M111-1及Opale Citrine均在重氯仿中变色，得知含有环氧化叶黄素或堇黄素、新叶黄素等的C-5,6环氧类胡萝卜素。
样品调制的详细内容记载于下述(1)黄色色素成分的提取、(2)利用中压液相层析的黄色色素级分的分取、(3)由皂化的酯键脂肪链和三酰基甘油的除去、(4)溶解于重苯的样品的分析。
(1)黄色色素成分的提取
将进行冷冻干燥处理的干燥花瓣各自2.97g浸渍于含1％二丁基羟基甲苯(BHT)的丙酮100mL中，于室温搅拌1小时而进行黄色色素成分的提取。其后，在减压下进行20至mL程度浓缩。
(2)利用中压液相层析的黄色色素级分的分取
为了从浓缩的待测样品浓缩黄色色素成分，用中压液相层析(MPLC)进行纯化。MPLC的机器构成是，装置本体使用Smart Flash EPCLC AI-580S(山善)、分离柱使用HI-FLASH ODS-SM(50μm Size L 26×100mm 35g)(山善)。LC移动相的送液是，移动相A使用甲醇、移动相B使用丙酮，二元梯度0～3分钟是，移动相B是40％、其后经24分钟将移动相B浓度设为100％，以20ml/分流速进行。回收观测到450nm的吸收波长的溶出级分18～23分钟的溶出液、其后干燥。
(3)由皂化的酯键脂肪链和三酰基甘油的除去
在上述(1)及(2)的操作中，花瓣中所含有的三酰基甘油或类胡萝卜素酯的脂肪链给由NMR的类胡萝卜素骨架的解析造成妨碍的信号。由皂化进行酯的水解。
皂化是，向在(2)中干燥的样品加5％KOH甲醇10ml，于室温进行反应20分钟。各加10ml水和二氯甲烷，将二氯甲烷层用水及饱和生理盐水清洗后，于30℃、在减压下馏去溶剂。进而，为了得到高纯度的1H-NMR用样品而用HPLC进行纯化。HPLC纯化的条件是，送液单位LC泵使用LC-10A(岛津制作所)、UV-vis检测器使用SPD-10A(岛津制作所)，分离柱使用CAPCELL PAK C18 UG120(20×250mm)(资生堂)。LC移动相的送液是将90％乙腈水溶液以10mL/分流速进行。一边观测UV-vis检测器、450nm，一边分级分离可确认吸收的范围的溶出液、进行干燥固化而作为1H-NMR用样品。
(4)溶解于重苯的样品的1H-NMR分析
将皂化处理后的黄色色素成分溶解于重苯而进行NMR测定。1H-NMR数据取得用AVANCE III HD400(Bruker)进行。图7显示09M111-1的400MHz 1H-NMR光谱的5.3～6.9ppm的范围的扩大图。呈现了类胡萝卜素的共价双键的次甲基(＝CH-)的化学结构信息。在6.06ppm观测到特征性的信号。此信号显示新叶黄素结构图中的8丙二烯结构(C＝C＝C)的部分结构。一方面，从Opale Citrine的NMR光谱(图8)在6.0～6.1ppm的范围观测不到信号，观测到相当于图8中的7(5.91ppm)、4’(5.53ppm)、7’(5.45ppm)的信号。由此信号推定含有环氧化叶黄素的可能性。
(iii)由LC-APCI-HRMS的，酯链长的鉴定
为了鉴定相当于各自的峰的类胡萝卜素酯，由精密质谱分析测定确定求出的化学组成。来自花瓣的提取物中由于含有三酰基甘油等的黄色色素以外的化合物、再者数种的类胡萝卜素酯，在质谱分析上联机结合液相层析分离忒成为有效的方法。质谱分析的离子化法用有类胡萝卜素的质谱分析的报告的大气压化学离子化法(APCI)进行。质量分离部为了与三酰基甘油的质量分离或高精度确定化学组成，用作为得到在分解能60,000以上的质量光谱的电场型傅里叶变换型的质谱分析计的Orbitrap MS进行。
精密质量的测定中使用的检液的调制方法是，在玻璃瓶中秤量进行冷冻干燥处理的干燥花瓣各自50.0mg，作为提取溶剂添加丙酮1.0mL、其后，用超声波清洗器(ASONE,AS52GTU)于25℃的设定温度照射超声波30分钟，进行黄色色素成分的提取操作。检液是将提取到黄色色素成分的上清液0.3mL用细孔尺寸0.45μm的滤器(NACALAI TESQUE、Cosmonice滤器S(溶剂系统))进行过滤。
高效液相层析-大气压化学离子化精密质谱分析(HPLC-APCI-HRMS)的机器构成是，送液单位LC泵使用Nexera LC-30AD(岛津制作所)、分离柱使用Develosil C30-UG-3(2.0×100mm)(野村化学)。LC移动相的送液是，移动相A使用甲醇/水(80/20vol/vol)、移动相B使用叔-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2vol/vol/vol)，使二元梯度经15分钟将移动相B浓度从0％变化为100％，以0.4mL/分流速进行。分析中注入10μL花瓣提取液。质谱分析部使用设置APCI离子源的Orbitrap Elite MS(ThermoFisherScientific)。质谱分析测定是以正离子测定模式、设定分解能60,000、在m/z 150～2000的范围进行测定。
来自质谱分析数据的类胡萝卜素化合物的鉴定由相当于质子附加离子的精密质量的理论值的离子的质量提取离子层析谱进行，所述质子附加离子的精密质量的理论值由在从(i)由HPLC-PDA的吸收光谱及(ii)用1H-NMR的解析推测的类胡萝卜素骨架上修饰月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸等的脂肪酸之时的化学组成求出。图9显示09M111-1、图10显示Opale Citrine的新叶黄素二酯及同质量的堇黄素二酯的脂肪酸相当于肉豆蔻酸、棕榈酸的高分解能质量提取离子层析谱(a)m/z1021.81～1021.83(b)m/z 1049.84～1049.86(c)m/z 1077.87～1077.89。在图9的09M111-1的层析谱中检测到二肉豆蔻酸新叶黄素、肉豆蔻酸棕榈酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素、二肉豆蔻酸堇黄素、肉豆蔻酸棕榈酸堇黄素、二棕榈酸堇黄素。一方面，在图10的Opale Citrine的高分解能质量提取离子层析谱中仅检测到二肉豆蔻酸堇黄素、肉豆蔻酸棕榈酸堇黄素、二棕榈酸堇黄素。
图11(参考数据)：Opale Citrine的高分解能质量提取离子层析谱层析谱、(a)m/z1005.82～1005.83(b)m/z 1033.85～1033.87(c)m/z 1061.88～1061.90。检测到的峰相当于环氧化叶黄素二酯。
结果：通过(i)利用高效液相层析(HPLC)-光电二极管阵列检测器(PDA)的吸收光谱、(ii)质子核磁共振光谱(1H-NMR)、(iii)高分解能质谱分析光谱(HRMS)的结构解析鉴定出，峰A是有组成式C68H108O6的二肉豆蔻酸新叶黄素，峰C是有组成式C70H112O6的3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素或3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素，进而，峰D是有组成式C72H116O6的二棕榈酸新叶黄素。
本说明书还包括下列内容：
1.花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是新叶黄素或其衍生物。
2.实施方式1所述的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素或这些的组合。
3.花瓣中含至少1种以上的类胡萝卜素色素的飘香藤属植物，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物。
4.飘香藤属植物，其中花瓣中含新叶黄素合酶。
5.实施方式1～4之任一项所述的飘香藤属植物，其特征在于，在CIE L*a*b*表色系中，有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色。
6.实施方式5所述的飘香藤属植物，其中在CIE L*a*b*表色系中，有0～30的a*值、及0～5的b*值的花色以外的花色。
7.实施方式1～4之任一项所述的飘香藤属植物，其中在CIE L*a*b*表色系中，有-5～20的a*值、及3～70的b*值的花色、或者50～70的a*值、及5～70的b*值的花色。
8.实施方式1～7之任一项所述的飘香藤属植物，其中每1g新鲜花瓣含0.02mg以上的花青苷色素。
9.实施方式8所述的飘香藤属植物，其中所述花青苷色素是花青素。
10.飘香藤属植物，其为09M111-1(保藏号：FERM BP-22298)。
11.实施方式1～10之任一项所述的飘香藤属植物的后代。
12.实施方式1～10之任一项所述的飘香藤属植物的营养繁殖体、植物体的一部分、组织、或者细胞。
13.实施方式1～10之任一项所述的飘香藤属植物的切花、或者由该切花制成的加工品。
14.能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中，作为类胡萝卜素色素存在新叶黄素或其衍生物时，选定为亲本飘香藤属植物。
15.实施方式14所述的方法，其特征在于，上述类胡萝卜素色素是二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3’-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3’-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素或这些的组合。
16.能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的、花瓣中含类胡萝卜素色素的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中，作为类胡萝卜素色素存在相当于图1、2及5所示的层析谱中的峰A、峰C或峰D的化合物时，选定为亲本飘香藤属植物。
17.能与有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飘香藤属植物杂交的亲本飘香藤属植物的选定方法，其特征在于，
在候选飘香藤属植物的花瓣中存在新叶黄素合酶时，选定为亲本飘香藤属植物。
18.实施方式14～17之任一项所述的方法，其中在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-10～70，并且b*值是0～80时，选定为亲本飘香藤属植物。
19.实施方式18所述的方法，其中所述a*值是0～30，并且b*值是0～5时，从亲本飘香藤属植物的选定除外。
20.实施方式14～17之任一项所述的方法，其中在CIE L*a*b*表色系中，测定候选飘香藤属植物的花瓣的色调，在a*值是-5～20，并且b*值是3～70时，或者a*值是50～70，并且b*值是5～70时，选定为亲本飘香藤属植物。
21.实施方式14～20之任一项所述的方法，其中测定候选飘香藤属植物的花瓣中的花青苷色素的量，在每1g新鲜花瓣含0.02mg以上的花青苷色素时，选定为亲本飘香藤属植物。
22.实施方式21所述的方法，其中所述花青苷色素是花青素。
23.实施方式14～22之任一项所述的方法，其中作为亲本飘香藤属植物选定09M111-1(保藏号：FERM BP-22298)。
24.用于产生在CIE L*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色的花瓣的飘香藤属植物的方法，其包括：
由实施方式14～23之任一项所述的方法选定第1飘香藤属亲本植物的工序，及
使选定的第1飘香藤属亲本植物和第2飘香藤属亲本植物杂交的工序。
25.实施方式24所述的方法，其中所述第2飘香藤属亲本植物有白色～粉色～红色(在CIE L*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣。

Claims (7)

1.用于产生在CIE L*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色的花瓣的飘香藤属植物的方法，其特征在于，使用：
保藏号为FERM BP-22298的09M111-1、或
具有在花瓣中作为类胡萝卜素色素而含新叶黄素或其衍生物的性状的其后代。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类胡萝卜素色素是：二肉豆蔻酸新叶黄素、3-O-肉豆蔻酸-3'-O-棕榈酸新叶黄素、3-O-棕榈酸-3'-O-肉豆蔻酸新叶黄素、二棕榈酸新叶黄素或这些的组合。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代在CIE L*a*b*表色系中具有a*值是-10～70、且b*值是0～80的花瓣的色调。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述后代排除具有a*值是-0～30、且b*值是0～5的花瓣的色调的飘香藤属植物。
5.权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述后代在CIE L*a*b*表色系中具有：
a*值是-5～20、且b*值是3～70的花瓣的色调、或者
a*值是50～70、且b*值是5～70的花瓣的色调。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代在每1g新鲜花瓣含0.02mg以上的花青苷色素。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述花青苷色素是花青素。
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