CN1168824C - 用于虾青素生物合成的雨生红球藻β-C-4-加氧酶编码核酸序列 - Google Patents

Abstract

总的来说，本发明涉及生产(3S，3’S)虾青素的生物技术方法。具体地，本发明涉及具有β-C-4-加氧酶活性的肽；编码此肽的DNA片段；编码此肽的RNA片段；含载体和DNA片段的重组DNA分子；含上述重组DNA分子或DNA片段的宿主细胞或生物；以及用宿主生产(3S，3’S)虾青素或含(3S，3’S)虾青素的食品添加剂的生物技术方法。

Description

用于虾青素生物合成的雨生红球藻 β-C-4-加氧酶编码核酸序列

发明领域和背景

总的来说，本发明涉及生产(3S，3’S)虾青素的生物技术方法。具体地，本发明涉及具有β-C-4-加氧酶活性的肽；编码此肽的NDA片段；编码此肽的RNA片段；含载体和DNA片段的重组DNA分子；含上述重组DNA分子或DNA分子或DNA片段的宿主细胞或生物；以及用宿主生产(3S，3’S)虾青素或含(3S，3’S)虾青素的食品添加剂的生物技术方法。

诸如虾青素的类胡萝卜素是决定活体中所见的多种黄、橙和红色的天然色素。类胡萝卜素在自然界分布广泛并在多种生活系统中具有两种主要生物功能：它们在光合作用中充当光捕获色素，并且它们防止光氧化作用损伤。以下将讨论类胡萝卜素的这些和其它生物功能和它们重要的工业作用及其生物合成。

类胡萝卜素作为光捕获天线的一部分，可以吸收光子并将能量转移至叶绿素，由此协助捕获450至570纳米范围内的光[见Cogdell RJ和Frank HA(1987)，在光合细菌中类胡萝卜素如何作用，生物化学生物物理学报895：63-79；Cogdell R(1988)叶绿体中的色素作用，在Goodwin TW(编辑)植物色素中，第183-255页，学院出版社，伦敦；Frank HA，Violette CA，Trautman JK，Shreve AP，Owens TG和Albrecht AC(1991)光合作用中的类胡萝卜素：结构和光化学，纯应用化学63：109-114；Frank HA，Farhoosh R，Decoster B和Christensen RL(1992)控制光合作用中从类胡萝卜素到叶绿纯素能量转移效率的分子特征，于：Murata N(编辑)光合作用研究，第I卷，第125-128页，kluwer，Dordrecht；和Cogdell RJ和Gardiner AT(1993)光合作用中类胡萝卜素的作用，酶学方法214：185-193]。尽管类胡萝卜素是光合作用生物中光捕获天线蛋白-色素复合体必不可少的成分，但它们也是光合作用中心的重要成分。

大多数类胡萝卜素位于光捕获复合体II中[Bassi R，Pineaw B，Dainese P和Marpuqartt J(1993)光系统II的类胡萝卜素结合蛋白，欧洲生物化学杂志212：297-302]。光合活性类胡萝卜素蛋白的特征及其在光捕获系统中的确切位置都是未知的。通过导向样品的线型二色性光谱可观察到嗜热蓝细菌聚球蓝细菌属种类的光化学活性叶绿素-蛋白复合体中的类胡萝卜素[见Breton J和Kato S(1987)光系统II中的色素位置：从聚球蓝细菌分离的叶绿素-蛋白亚基及核心颗粒的低温线型二色性研究，生物化学生物物理学报892：99-107]。这些复合体主要包含紧靠膜平面的在505和470纳米附近吸收的β-胡萝卜素。在无光化学活性的叶绿素-蛋白复合体中，β-胡萝卜素在495和465纳米附近吸收，并且分子垂直于膜平面定位。

已描述了类胡萝卜素与蓝细菌光系统(PS)II相关的证据[见，Suzuki R和Fujita Y(1977)光合反应中心II作用诱导的类胡萝卜素光漂白：DCMU敏感性，植物细胞生理学18：625-631；及Newman PJ和Sherman LA(1987)蓝绿藻雪松聚球蓝细菌的光系统I和II膜颗粒的分离和特征，生物化学生物物理学报，503：343-361]。在PS II反应中心核心中有两个β-胡萝卜素分子[见Ohno T，Satoh K和Katoh S(1986)从嗜热蓝细菌聚球蓝细菌属种类纯化的氧演化的复合体的化学组成，生物化学生物物理学报852：1-8；Gounaris K，Chapman DJ和Barber J(1989)集胞藻PCC 6803的D1/D2/细胞色素b-559复合体的分离和特征，生物化学生物物理学报973：296-301；及Newell RW，van Amerongen H，Barber J和van Grondelle R(1993)用偏振光对光系统II反应中心进行光谱鉴定：PS II反应中心中β-胡萝卜素激发的证据，生物化学生物物理学报1057：232-238]，但其确切作用仍不清楚[如Satoh K(1992)PS II反应中心的结构和功能，于：MurataN(编辑)光合作用研究，第II卷，第3-12页，Kluwer，Dordrecht]。已证实这两个偶联的β-胡萝卜素分子保护分离的PS II反应中心中的叶绿素P680免受光损伤[见De Las Rivas J，Telfer A和Barber J(1993)2个偶联的β-胡萝卜素分子保护分离的PS II反应中心中的P680免受光损伤，生物化学生物物理学报1142：155-164]，并可能与防止PS II的D1亚基降解的保护作用有关[见Sandmann G(1993)参与八氢番茄红素变为番茄红素的去饱和反应的基因和酶(摘要)，第十届国际类胡萝卜素会议，Trondheim CL1-2]。嗜热蓝细菌聚球蓝细菌属种类的高度纯化的氧演化PS II复合体的光捕获色素包含50个叶绿素a和7个β-胡萝卜素，但不含叶黄素分子[见Ohno T，Satoh K和KatohS(1986)从嗜热蓝细菌聚球蓝细菌属种类纯化的氧演化复合体的化学组成，生物化学生物物理学报852：1-8]。已证明β-胡萝卜素在绿藻活性PS II的组装中起作用[见Humbeck K，Romer S和Senger H(1989)活性PS II组装中类胡萝卜素重要作用的证据，植物179：242-250]。

每个P700含40个叶绿素的从浅黄席蓝细菌分离的PS I复合体平均包含1.3个β-胡萝卜素分子[见Thornber JP，Alberte Rs，HunterFA，Shiozawa JA和Kan KS(1976)植物光合作用单位中叶绿素的构成，Brookhaven Symp生物学28：132-148]。在从每个P700含130±5个天线叶绿素分子的聚球蓝细菌属种类菌株PCC6301制备的PS I颗粒中可观察到16个类胡萝卜素分子[见Lundell DJ，Glazer AN，Melis A和Malkin R(1985)蓝细菌光系统I复合体的特征，生物化学杂志260：646-654]。在嗜热蓝细菌细长聚球蓝细菌的PS I色素蛋白复合体中观察到β-胡萝卜素和叶黄素的基本含量及隐黄素和异隐黄素[见Coufal J，Hladik J和Sofrova D(1989)嗜热蓝细菌细长聚球蓝细菌的光系统I色素-蛋白复合体的类胡萝卜素含量，光合作用23：603-616]。含4个多肽(62，60，14和10kDa)的嗜热蓝细菌聚球蓝细菌属种类的亚基蛋白复合体结构每个P700包含约10个β-胡萝卜素分子[见Takahashi Y，Hirota K和Katoh S(1985)聚球蓝细菌属种类的P700-叶绿素a-蛋白复合体的多种形式：铁，醌和类胡萝卜素含量，光合作用研究6：183-192]。此类胡萝卜素专门结合携带有功能的天线叶绿素a的大多肽。这些复合体的荧光激发光谱显示β-胡萝卜素作用为PS I的有效天线。

如上所述，类胡萝卜素的其它重要作用是防止光合器中由叶绿素激发的三重线态引起的光氧化过程。具有π-电子偶联的9个或多个碳-碳双键的类胡萝卜素分子可吸收叶绿素的三重线态能量并由此防止有害单线态氧自由基的形成。聚球蓝细菌属种类中类胡萝卜素的三重线态可在封闭的PS II中心测到并且约25毫微秒增加的动力学是由于来自天线中叶绿素三重线态的能量转移[见Schlodder E和Brettel K(1988)11毫微秒生命期的封闭光系统II中的初级电荷分离，聚球蓝细菌的氧演化光系统II复合体的闪光吸收光谱。生物化学生物物理学报933：22-34]。可以想象与自由基对形成的产率相比，此过程的产率更低，在保护叶绿素免受由于过度激发的损伤中起作用。

通过抑制所有生物中进行有氧光合作用的类胡萝卜素的生物合成的漂白除草剂如达草灭的使用可证明体内类胡萝卜素的保护作用[如Sandmann G和Boger P(1989)，除草剂抑制类胡萝卜素生物合成。于：Boger P和Sandmann G(编辑)除草剂作用的靶位点，第25-44页，CRC出版社，Boca Raton，Florida所综述的]。光照时用达草灭处理引起类胡萝卜素和叶绿素水平下降，而在黑暗中叶绿素水平不受影响。用吡啶酮除草剂、fluridone处理的阿氏颤藻细胞中的光合作用效率的抑制作用是由于蓝藻叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素的相对丰度减少，接着引起叶绿素分子的光氧化作用[见Canto de Loura I，DubacqJP和Thomas JC(1987)氮缺失对蓝细菌色素和脂肪的影响，植物生理学83：838-843]。

已证明在植物中玉米黄素需要以非辐射方式分散天线叶绿素多余的激态能量[见，Demmig-Adams B(1990)植物中的类胡萝卜素和光保护作用：叶黄素玉米黄素的作用，生物化学生物物理学报1020：1-24；及Demmig-Adams B和Adams WWIII(1990)类胡萝卜素玉米黄素和叶绿素荧光的高能态猝灭，光合作用研究25：187-197]。在藻类和植物中，光诱导的紫黄质深度氧化产生玉米黄素与光保护过程有关[由Demmig-Adams B和Adams WWIII(1992)，光保护作用和植物对强光逆境的其它反应，植物生理植物分子生物学年鉴43：599-626综述]。光诱导的紫黄质深度氧化和黑暗中发生的逆反应称作“叶黄素循环”[见Demmig-Adams B和Adams WWIII(1992)光保护作用和植物对强光逆境的其它反应，植物生理植物分子生物学年鉴43：599-626]。不含任何玉米黄素并且可能不能进行非辐射能量逸散的蓝细菌地衣对高光强度敏感；含玉米黄素的藻类地衣对强光逆境更有耐受性[见Demmig-Adams B，Adams WWIII，Green TGA，Czygan FC和Lange OL(1990)形成藻共生的两种地衣对光逆境的敏感性不同，一方有叶黄素循环而另一方式无叶黄素循环。生态学84：451-456；Demmig-Adams B和AdamsWWIII(1993)适光性叶子的叶黄素循环、蛋白更新和强光耐受性，植物生理学103：1413-1420；和Demmig-Adams B(1990)植物中的类胡萝卜素和光保护作用：叶黄素玉米黄素的作用，生物化学生物物理学报1020：1-24]。与藻类和植物相反，蓝细菌不含叶黄素循环。但是，它们的确包含可支持叶绿素光保护作用的充足的玉米黄素和其它叶黄素。

类胡萝卜素还有几种其它功能。由蓝细菌Gloeocapsa alpicola的抗紫外光突变体中β-胡萝卜素的积累可以证明类胡萝卜素保护免受近紫外光辐射产生的各种损伤的可能性[见Buckley CE和HoughtonJA(1976)近紫外光辐射对蓝绿藻Gloeocapsa alpicola色素形成的影响的研究，微生物学学报107：93-97]。在产生类胡萝卜素的大肠杆菌细胞中更进一步地证明了这一点[见Tuveson RW和Sandmann G(1993)大肠杆菌中表达的克隆类胡萝卜素基因的抵抗由近紫外光激活的光毒性分子的保护作用，酶学方法214：323-330]。类胡萝卜素由于其猝灭各种氧自由基的能力而成为有效的抗氧化剂并由此保护细胞免受氧化损伤。实际上在所有生物中类胡萝卜素的这种功能是重要的[见Krinsky NI(1989)类胡萝卜素的抗氧化功能，自由基生物医学7：617-635；和Palozza P和Krinsky NI(1992)体内和体外类胡萝卜素的抗氧化效应——概述，酶学方法213：403-420]。即使间接地，类胡萝卜素也可影响其它细胞功能。尽管蓝细菌中的类胡萝卜素不是趋光性的主要光受体，但是在多变鱼腥蓝细菌中已观察到类胡萝卜素对趋光反应的影响是由于可作为此系统中信号中间物的单态氧自由基的去除[见Nultsch W和Schuchart H(1985)蓝细菌多变鱼腥蓝细菌的趋光反应链模型，微生物学学报142：180-184]。

在花和果实中，类胡萝卜素有利于吸引传粉者和传播种子。后者与农业紧密相关。果实和花中色素形成的种类和程度是许多农作物最重要的特征。这主要是由于这些农作物的颜色常常决定了它们对消费者的吸引力并可由此提高它们的市场价值。

因为类胡萝卜素无毒，所以它们有重要的作为食品工业着色剂的商业用途[见Bauernfeind JC(1981)作为着色剂和维生素A前体的类胡萝卜素，学院出版社，伦敦]。西红柿果实的红色是由果实成熟期间在有色体中积累的番茄红素提供的。全世界商业生产含高含量(超过80％干重)番茄红素的西红柿提取物用作食品着色剂的工业用途。此外，肉、羽毛或鱼卵和鸟蛋呈现提供的食品类胡萝卜素的颜色，于是类胡萝卜素常用作家禽和水产养殖中的食品添加剂。在水产养殖中，培养某些蓝细菌种类如螺旋蓝细菌属种类[见Sommer TR，Potts WT和Morrissy NM(1990)水产养殖中加工微藻的最新进展，水生生物学204/205：435-443]用于生产动物和人类食品添加剂。因此，在生物技术方面，这些蓝细菌中类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素的含量有重要商业潜力。

大多数类胡萝卜素包含由8个C₅类异戊二烯单位构建的C₄₀碳氢主链并含有一系列共轭双键。胡萝卜素不含氧原子并且或是线型或含1或2个端环的环状分子。叶黄素是胡萝卜素的氧化衍生物。已鉴定了多种糖基化类胡萝卜素和类胡萝卜素酯。C₄₀主链可进一步延伸形成C₄₅或C₅₀类胡萝卜素，或缩短产生衍类胡萝卜素。一些非光合细菌也合成C₃₀类胡萝卜素。可以在Goodwin TW(1980)类胡萝卜素的生物化学，第1卷，第2版，Chapman和Hall编，New York；和Goodwin TW和Britton G(1988)类胡萝卜素的分布和分析，于：Goodwin TW(编)植物色素，第62-132页，学院出版社，纽约中找到有关类胡萝卜素的一般背景资料。

目前已有640多种不同的天然存在的类胡萝卜素得到鉴定，由此，类胡萝卜素决定了微生物、真菌、藻类、植物和动物中所发现的主要的黄色，橙色和红色的各种深浅。类胡萝卜素由所有光合生物及几种非光合细菌和真菌合成，而且它们经过饲料也广泛分布于动物界。

类胡萝卜素仅在光合生物和一些微生物中从类异戊二烯从头合成，它们典型地在光合膜、细胞膜和细胞壁的蛋白复合体中积累。

如图1中详细描述的，在β-胡萝卜素生物合成途经中，4种酶将中心的类异戊二烯途径的牻儿牻牛儿焦磷酸转变为β-胡萝卜素。类胡萝卜素由类异戊二烯生物合成的一般途径合成。尽管此途径已知几十年，但只有最近主要通过遗传和分子生物学的应用才得以阐明类胡萝卜素生物发生中涉及的一些分子机理。这是由于参与将八氢番茄红素转变成胡萝卜素和叶黄素的大多数酶是不稳定的膜相关蛋白，所以一旦溶解即丧失活性[见Beyer P，Weiss G和Kleinig H(1985)黄水仙有色体的膜结合胡萝卜素生成酶的溶解和重组，欧洲生物化学杂志153：341-346；和Bramley PM(1985)类胡萝卜素的体外生物合成，脂研究进展21：243-279]。然而，已报道了保留部分活性的来自集胞藻属种类株系PCC 6714的胡萝卜素生成酶的溶解作用[见Bramley PM和Sandmann G(1987)隐球蓝细菌的胡萝卜素生成酶的溶解作用，植物化学26：1935-1939]。没有能直接测到酶活性的真正的类胡萝卜素生物合成的体外系统。已经开发了无细胞胡萝卜素生成系统[见ClarkeIE，Sandmann G，Bramley PM和Boger P(1982)应用分离的光合膜的胡萝卜素生物合成  FEBS lett 140：203-206]，并且此酶系统适用于蓝细菌[见Sandmann G和Bramley PM(1985)用偶联布拉克须霉产八氢番茄红素系统的隐球蓝细菌匀浆生物合成类胡萝卜素，植物164：259-263；和Bramley PM和Sandmann G(1985)蓝细菌隐球蓝细菌叶黄素的体外和体内生物合成，植物化学24：2919-2922]。在纯化已在大肠杆菌中表达的多肽后，实现脂质体中聚球蓝细菌属种类菌株PCC7942的八氢番茄红素脱氢酶的重组[见Fraser PD，Linden H和Sandmann G(1993)从过量表达的大肠杆菌菌株纯化和重新活化重组聚球蓝细菌八氢番茄红素脱氢酶，生物化学杂志291：687-692]。

现在参考图1，类胡萝卜素从类异戊二烯前体合成。类异戊二烯生物合成的中心途经可以看作从乙酰辅酶A转变为甲羟戊酸开始。从甲羟戊酸形成C₅分子D³-异戊烯基焦磷酸(IPP)并且此C₅分子是所有长链类异戊二烯合成的基础。在IPP异构化为r，r-二甲丙烯焦磷酸酯(DMAPP)后，结合另外3分子IPP产生C₂₀牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)。由异戊烯转移酶催化这种1’-4缩合反应[见Kleinig H(1989)类异戊二烯生物合成中质体的作用，植物生理学植物分子生物学年鉴40：39-59]。在植物中证实同一种酶GGPP合成酶可完成DMAPP至GGPP的所有反应[见Dogbo O和Camara B(1987)通过亲和层析从辣椒有色体纯化异戊烯基焦磷酸异构酶和牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶，生物化学生物物理学报920：140-148；和Laferriere A和Beyer P(1991)欧白芥白色质体的牻牛儿牻牛儿二磷酸合成酶的纯化，生物化学生物物理学报216：156-163]。

类胡萝卜素生物合成特异的第一步是2分子GGDD的头对头缩合产生前八氢番茄红素焦磷酸(PPPP)。GGPP在去除焦磷酸后转变为无色的C₄₀碳氢分子15-顺-八氢番茄红素。这两步反应由在蓝细菌和植物中都由单基因(crtB)编码的可溶性酶八氢番茄红素合成酶催化[见Chamovitz D，Misawa N，Sandmann G和Hirschberg J(1992)编码类胡萝卜素生物合成酶八氢番茄红素合成酶的蓝细菌基因在大肠杆菌中的分子克隆和表达，FEBS lett 296：305-310；Ray JA，Bird CR，Maunders M，Grierson D和Schuch W(1987)来自番茄的与成熟相关的cDNA，pTOM5的序列，核酸研究15：10587-10588；Camara B(1993)植物八氢番茄红素合成酶复合体-组成的3种酶、免疫学和生物发生，酶学方法214：352-365]。该途经中所有随后的步骤都发生在膜上。4个去饱和(脱氢作用)反应经过六氢番茄红素，ζ-胡萝卜素和四氢番茄红素将八氢番茄红素转变为番茄红素。每次去饱和作用增加2个共轭双键以致共轭双键的数目从八氢番茄红素中的3个增至番茄红素中的11个。

对八氢番茄红素的酶脱氢作用的分子机理的了解相对很少[见Jones BL和Porter JW(1986)高等植物中胡萝卜素的生物合成，CRC植物科学评论3：295-324；和Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中间产物几何异构态是黄水仙有色体中胡萝卜素去饱和作用和环化反应所必需的，欧洲生物化学杂志184：141-150]。已确定在蓝细菌，藻类和植物中前两次去饱和作用由单个膜结合酶八氢番茄红素脱氢酶催化从15-顺-八氢番茄红素到ζ-胡萝卜素[见Jones BL和Porter JW(1986)高等植物中胡萝卜素的生物合成，CRC植物科学评论3：295-324；和Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中间产物几何异构态是黄水仙有色体中胡萝卜素去饱和作用和环化反应所必需的，欧洲生物化学杂志184：141-150]。因为ζ-胡萝卜素产物主要是全反式构型，所以推测在此去饱和步骤中有顺-反式异构作用。蓝细菌中八氢番茄红素脱氢酶多肽的初级结构与藻类和植物的初级结构相比是保守的(超过65％的相同残基)[见Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果实成熟期间催化八氢番茄红素转变成ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966；Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中类胡萝卜素生物合成的分子特征鉴定：番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因，于：MurataN(编)光合作用研究，第III卷，第11-18页，kluwer，Dordrectht]。此外，在两个系统中，相同抑制剂阻遏八氢番茄红素脱氢酶[见Sandmann G和Boger P(1989)除草剂抑制类胡萝卜素的生物合成。于：Boger P和Sandmann G(编)除草剂作用的靶位点，第25-44页，CRC出版社，Boca Raton，Florida]。结果，很可能蓝细菌和植物中催化八氢番茄红素和六氢番茄红素去饱和作用的酶具有相似的生物化学和分子特征，这些特征不同于其它微生物中八氢番茄红素脱氢酶的特征。一个这样的不同之处是荚膜红细菌、欧文氏菌属种类或真菌的八氢番茄红素脱氢酶分别将八氢番茄红素转变为四氢番茄红素、番茄红素或3，4-脱氢番茄红素。

尽管氧不直接参与脱氢反应，但是黄水仙有色体[见Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中间产物几何异构态是黄水仙有色体中胡萝卜素去饱和作用和环化反应所必需的，欧洲生物化学杂志184：141-150]和聚球蓝细菌属种类菌株PCC 7942的无细胞系统[见Sandmann G和Kowalczyk S(1989)体外胡萝卜素生成和组囊蓝细菌中八氢番茄红素脱氢酶反应的特征鉴定，生物化学生物物理研究通讯，163：916-921]中八氢番茄红素去饱和作用依赖于分子氧作为可能最后电子受体。在蓝细菌中脱氢酶-电子转移酶的机理依赖于脱氢酶-单加氧酶的脱氢作用机理[见Sandmann G和Kowalczyk S(1989)体外胡萝卜素生成和组囊蓝细菌中八氢番茄红素脱氢酶反应的特征鉴定，生物化学生物物理研究通讯，163：916-921]。在初级结构已得到分析的所有八氢番茄红素脱氢酶中存在保守的FAD结合模式[见Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果实成熟期间催化八氢番茄红素转变成ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966；PeckerI，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中类胡萝卜素生物合成的分子特征鉴定：番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因，于：Murata N(编)光合作用研究，第III卷，第11-18页，Kluwer，Dordrectht]。已证明辣椒中八氢番茄红素脱氢酶含有蛋白结合的FAD[见Hugueney P，Romer S；Kuntz M和Camara B(1992)催化辣椒有色体中六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素合成的黄素蛋白的特征鉴定和分子克隆，欧洲生物化学杂志209：399-407]。因为八氢番茄红素脱氢酶位于膜上，可以预测另外一种可溶的氧化还原成分。如所证明的，此假设成分可能使用NAD(P)⁺[见Mayer MP，Nievelstein V和Beyer P(1992)水仙有色体的NADPH依赖型氧化还原酶——可能参与胡萝卜素去饱和作用的氧化还原介质的纯化和特征鉴定，植物生理生化30：389-398]或另一种电子和氢载体如醌。用特异性抗体确定集胞藻属种类株系PCC 6714和多变鱼腥蓝细菌菌株ATCC 29413中八氢番茄红素脱氢酶的细胞定位主要(85％)在光合作用类囊体膜上[见Serrano A，Gimenez P，Schmidt A和Sandmann G(1990)光合自养原核生物中八氢番茄红素脱氢酶的免疫化学定位和功能测定，普通微生物学杂志136：2465-2469]。

ζ-胡萝卜素在蓝细菌藻类和植物中经四氢番茄红素转变成番茄红素。对酶机理了解极少，推测由单一酶完成[见Linden H，VioqueA和Sandmann G(1993)通过异源互补从鱼腥藻属PCC 7120分离编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的类胡萝卜素生物合成基因，FEMS Microbiol Lett106：99-104]。鱼腥藻株PCC 7120的ζ-胡萝卜素脱氢酶推测的氨基酸序列包含与八氢番茄红素脱氢酶中所发现的一种双核酸结合模式相似的模式。

两个环化反应将番茄红素转变为β-胡萝卜素。已得到证据，在聚球蓝细菌属种类菌株PCC 7942[见Cunningham FX Jr，Chamovitz D，Misawa N，Gantt E和Hirschberg J(1993)催化β-胡萝卜素生物合成的酶番茄红素环化酶的蓝细菌基因的克隆和在大肠杆菌中的功能性表达，FEBS Lett 328：130-138]和植物中[见Camara B和Dogbo O(1986)来自辣椒有色体膜的番茄红素环化酶的证实和溶解，植物生理学80：172-184]，这种环化作用由单一酶番茄红素环化酶催化。三乙胺化合物CPTA和MPTA抑制这种膜结合酶[见Sandmann G和Boger P(1989)除草剂抑制类胡萝卜素生物合成，于：Boger P和Sandmann G(编)除草剂作用的靶位点，第25-44页，CRC出版社，Boca Raton，FLorida]。蓝细菌仅进行β-环化因而不包含ε-胡萝卜素，δ-胡萝卜素和α-胡萝卜素及它们的氧合衍生物。当在C-6丢失质子之后线型番茄红素分子末端C-1，2双键折叠到C-5，6双键位置时，经过“碳离子”中间产物形成β-环。已报道没有任何环化胡萝卜素中的7，8键不是双键。因此，如在番茄红素中的全去饱和作用或如四氢番茄红素中至少一半分子的去饱和作用是反应必需的。番茄红素的环化涉及不需要氧的脱氢反应。此反应的辅因子未知。在聚球蓝细菌属种类的菌株PCC7942的番茄红素环化酶多肽中发现双核酸结合模式，表明NAD(P)或FAD作为番茄红素环化酶的辅酶。

加入诸如羟基-，甲氧基-，氧-，环氧-，醛，羧酸组分的各种含氧侧基形成各种叶黄素。对叶黄素的形成了解极少。β-胡萝卜素的羟化作用在混合功能氧化酶反应中需要分子氧。

已从紫色光合细菌荚膜红细菌[见Armstrong GA，Alberti M，Leach F和Hearst JE(1989)荚膜红细菌的类胡萝卜素生物合成基因簇的核苷酸序列、组成和蛋白产物的性质，普通分子遗传学216：254-268]和非光合细菌草生欧文氏菌[见Sandmann G，Woods WS和Tuveson RW(1990)草生欧文氏菌和转化的大肠杆菌菌株中类胡萝卜素的鉴定，FEMS Microbiol Lett 71：77-82；Hundle BS，Beyer P，Kleinig H，Englert H和Hearst JE(1991)草生欧文氏菌的类胡萝卜素和携带草生欧文氏菌类胡萝卜素基因簇的大肠杆菌HB101菌株，光化学和光生物学54：89-93；和Schnurr G，Schmidt A和SandmannG(1991)草生欧文氏菌的胡萝卜素生成基因簇的图谱及六个基因的功能鉴定，FEMS Microbiol Lett 78：157-162]及噬夏孢欧文氏菌[见Misawa N，Nakagawa M，Kobayashi K，Yamano S，Izawa I，NakamuraK和Harashima K(1990)通过大肠杆菌中基因产物的功能分析来阐明噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素生物合成途径，细菌学杂志172：6704-6712]克隆了编码整个途径酶的基因簇。已从真菌粗糙脉孢菌中克隆两种基因，编码GGPP合成酶的al-3[见Nelson MA，Morelli G，Carattoli A，Romano N和Macino G(1989)蓝光调节的粗糙脉孢菌类胡萝卜素生物合成基因(albino-3)的分子克隆和白色菌环基因产物，分子细胞生物学9：1271-1276；和Carattoli A，Romano N，Ballario P，Morelli G和Macino G(1991)粗糙脉孢菌类胡萝卜素生物合成基因(albino 3)，生物化学杂志266：5854-5859]和编码八氢番茄红素脱氢酶的al-1[见Schmidhauser TJ，Lauter FR，RussoVEA和Yanofsky C(1990)粗糙脉孢菌的类胡萝卜素生物合成基因al-1的克隆测序和光调节、分子细胞生物学10：5064-5070]。然而，由于缺少足够的序列相似性，用这些基因作为异源分子探针从蓝细菌或植物克隆相应基因的尝试并不成功。

已用分子遗传方法从蓝细菌克隆了类胡萝卜素合成酶的第一个“植物型”基因。在克隆八氢番茄红素脱氢酶基因的第一步中，在聚球蓝细菌属种类的菌株PCC7942中分离了对八氢番茄红素-脱氢酶特异的抑制剂达草灭有抗性的许多突变体[见Linden H，Sandmann G，Chamovitz D，Hirschberg J和Boger P(1990)所选的抗漂白除草剂达草灭的聚球蓝细菌突变体的生化特征鉴定，农药生化生理学36：46-51]。然后通过将野生型菌株转化为除草剂抗性来克隆赋予抗达草灭抗性的基因[见Chamovitz D，Pecker I和Hirschberg J(1991)对除草剂达草灭抗性的分子基础，植物分子生物学16：967-974；Chamovitz D，Pecker I，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1990)克隆蓝细菌中达草灭抗性基因，Z.Naturforsch 45：482-486]。几组证据表明先前称为pds现在称为crtP的克隆基因编码八氢番茄红素脱氢酶。最确定的一个证据是转化的大肠杆菌细胞中八氢番茄红素脱氢酶活性的功能性表达[见Linden H，Misawa N，Chamovitz D，PeckerI，Hirschberg J和Sandmann G(1991)不同的八氢番茄红素脱氢酶基因在大肠杆菌中的功能互补和积累的胡萝卜素的分析，ZNaturforsch 46c：1045-1051；和Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果实成熟期间催化八氢番茄红素转变成ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966]。也用相似方法从集胞藻属种类的株系PCC6803中克隆了crtP基因[见Martinez-Ferez IM和Vioque A(1992)集胞藻属种类的菌株PCC 6803的八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列及具有对除草剂达草灭抗性的新突变体的特征鉴定，植物分子生物学18：981-983]。

随后蓝细菌crtP基因用作从藻类[见Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物类胡萝卜素生物合成的分子特征鉴定：番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因，于：Murata N(编)光合作用研究，第III卷，第11-18页，Kluwer，Dordrectht]和高等植物[见Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolink PA(1991)编码类胡萝卜素生物合成途径的酶八氢番茄红素脱氢酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合细菌中的表达，美国国家科学院院报88：6532-6536；和Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄成熟期间催化八氢番茄红素转变为ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966]克隆同源基因的分子探针。聚球蓝细菌属种类的菌株PCC 7942和集胞藻属种类的株系PCC 6803的八氢番茄红素脱氢酶分别由474个和467个氨基酸残基组成，其序列高度保守(74％相同，86％相似)。计算的分子量是51kDa，尽管它略微疏水(水疗法指数-0.2)，但不包括长度足以跨越脂双层膜的疏水区。蓝细菌八氢番茄红素脱氢酶的初级结构与来自绿藻Dunalliela bardawil(61％相同，81％相似)[见Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中类胡萝卜素生物合成的分子特征鉴定：番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因，于：Murata N(编)光合作用研究，第III卷，第11-18页，Kluwer，Dordrectht]、番茄[见Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果实成熟期间催化八氢番茄红素转变为ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966]、辣椒[见HugueneyP，Romer S，Kuntz M和Camara B(1992)催化辣椒有色体中六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素合成的黄素蛋白的特征鉴定和分子克隆，欧洲生物化学杂志209：399-407]和大豆[见Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)编码类胡萝卜素生物合成途径酶八氢番茄红素脱氢酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合细菌中的表达，美国国家科学院院报88：6532-6536](62-65％相同及～79％相似)[见Chamovitz D(1993)蓝细菌类胡萝卜素生物合成早期步骤的分子分析：八氢番茄红素合成酶和八氢番茄红素脱氢酶，博士论文，The Hebrew University of Jerusalem]的酶相比是高度保守的。真核生物八氢番茄红素脱氢酶多肽与蓝细菌酶大小相比较大(64kDa)；但是当其进入质体时被加工成成熟形式。

荚膜红细菌、欧文氏菌属种类和粗糙脉孢菌的类胡萝卜素酶包括crtI基因产物八氢番茄红素脱氢酶中有高度结构相似性[在Armstrong GA，Hundle BS和Hearst JE(1993)光合生物和非光合生物类胡萝卜素生物合成基因产物的进化保守和结构相似性，酶学方法214：297-311]。如上述指出的，八氢番茄红素脱氢酶的初级结构的高度保守也存在于氧合光合生物中。但是，除了氨基末端FAD结合序列，植物型”crtP基因产物和“细菌型”八氢番茄红素脱氢酶(crtI基因产物)间的序列相似性很少(19-23％相同，42-47％相似)。已猜想crtP和crtI不是来源同一个原始基因，它们经过趋同进化独立起源[见Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄成熟期间催化八氢番茄红素转变为ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966]。两种类型的酶催化的不同脱氢作用序列和它们对抑制剂的不同敏感性支持此假设。

尽管不象以八氢番茄红素脱氢酶为例那么明确，但也看到在蓝细菌和植物及蓝细菌和其它微生物之间在八氢番茄红素合成酶结构上的相似区别。在聚球蓝细菌属种类的菌株PCC7942的基因组中鉴定了编码八氢番茄红素合成酶的crtB基因(以前是psy)紧邻crtP并在同一个操纵子中[见Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)编码类胡萝卜素生物合成途径酶八氢番茄红素脱氢酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合细菌中的表达，美国国家科学院院报88：6532-6536]。此基因编码307个氨基酸的36kDa多肽，疏水指数为0.4。蓝细菌八氢番茄红素合成酶的推测氨基酸序列与番茄八氢番茄红素合成酶相比高度保守[57％相同和70％相似；Ray JA，Bird CR，Maunders M，Grierson D和Schuch W(1987)番茄的与成熟相关的cDNA，pTOM5序列，核酸研究15：10587-10588]，但与其它细菌的crtB序列相比保守性更低(在以10个间隙的匹配中有29-32％相同和48-50％相似)。两种酶都包含在不同生物的异戊烯转移酶中发现的2个保守序列模式[见Bartley GE，Viitanen PV，PeckerI，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)编码类胡萝卜素生物合成途径酶八氢番茄红素脱氢酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合细菌中的表达，美国国家科学院院报88：6532-6536；CarattoliA，Romano N，Ballario P，Morelli G和Macino G(1991)粗糙脉孢菌类胡萝卜素生物合成基因(albino3)，生物化学杂志266：5854-5859；Armstrong GA，Hundle BS和Hearst JE(1993)光合生物和非光合生物类胡萝卜素生物合成基因产物的进化保守和结构相似性，酶学方法214：297-311；Math SK，Hearst JE和Poulter CD(1992)编码牻牛儿牻牛儿二磷酸合成酶的草生欧文氏菌的crtE基因，美国国家科学院院报89：6761-6764；和Chamovitz D(1993)蓝细菌类胡萝卜素生物合成早期步骤的分子分析：八氢番茄红素合成酶和八氢番茄红素脱氢酶，博士论文，The Hebrew University of Jerusalem]。可以想象在2个GGPP分子缩合期间，多肽中的这些区域参与焦磷酸的结合和/或去除。

通过在携带欧文氏菌crtB和crtE基因及蓝细菌crtP基因的大肠杆菌细胞中筛选蓝细菌基因组DNA的表达文库从鱼腥蓝细菌属种类的菌株PCC7120克隆编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的crtQ基因(以前是2ds)[见Linden H，Vioque A和SandmannG(1993)通过异源互补从鱼腥蓝细菌PCC7120分离编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的类胡萝卜素生物合成基因，FEMS Microbiol Lett 106：99-104]。因为这些大肠杆菌细胞产生ζ-胡萝卜素，所以可以在产生ζ-胡萝卜素细胞的黄色背景上鉴定产生番茄红素的棕红色菌落。推测的鱼腥蓝细菌属种类的菌株PCC7120的ζ-胡萝卜素脱氢酶是含499个氨基酸残基的56kDa多肽。令人惊奇地是，它的初级结构与“植物型”(crtP基因产物)八氢番茄红素脱氢酶相比不保守，却与细菌型酶(crtI基因产物)有相当的序列相似性[见Sandmann G(1993)参与八氢番茄红素到番茄红素的去饱和氢反应的基因和酶(摘要)，第10次国际类胡萝卜素大会，TrondheimCL1-2]。有可能蓝细菌crtQ基因和其它微生物的crtI基因是由共同祖先进化起源的。

利用基本上与crtP相同的克隆策略从聚球蓝细菌属种类的菌株PCC7942克隆编码番茄红素环化酶的crtL基因(以前是lcy)。通过使用番茄红素环化酶抑制剂2-(4-甲基苯氧)-三乙胺盐酸(MPTA)，通过将野生型转化成除草剂抗性型分离此基因[见Cunningham FX Jr，Chamovitz D，Misawa N，Gantt E和Hirschberg J(1993)催化β-胡萝卜素生物合成的酶蓝细菌番茄红素环化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的功能表达，FEBS Lett 328：130-138]。番茄红素环化酶是单基因产物并催化番茄红素至β-胡萝卜素的双环化反应。聚球蓝细菌属种类的菌株PCC7942中的crtL基因产物是含411个氨基酸残基的46kDa多肽。它与噬夏孢欧文氏菌或草生欧文氏菌的crtY基因产物(番茄红素环化酶)无序列相似性。

已从草生欧文氏菌[见Hundle B，Alberti M，Nievelstein V，Beyer P，Kleinig H，Armstrong GA，Burke DH和Hearst JE(1994)大肠杆菌中表达的草生欧文氏菌Eho10类胡萝卜素基因的功能性重组，普通分子遗传学254：406-416；Hundle BS，Obrien DA，AlbertiM，Beyer P和Hearst JE(1992)草生欧文氏菌玉米黄素葡糖转移酶的功能性表达和推测的双磷酸结合位点，美国国家科学院院报89：9321-9325]和噬夏孢欧文氏菌[见Misawa N，Nakagawa M，KobayashiK，Yamano S，Izawa I，Nakamurak和Harashima K(1990)通过大肠杆菌中基因产物的功能分析来阐明噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素生物合成途径，细菌学杂志172：6704-6712]克隆了β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)和玉米黄素糖化酶基因(crtX)。

首先描述了水生甲壳动物中酮类胡萝卜素虾青素(3，3′-双羟基-β，β-胡萝卜素-4，4′-二酮)作为β-胡萝卜素的一种氧化形式。后来发现虾青素在许多海洋动物和藻类中非常普遍。但是，仅少数动物可以从其它类胡萝卜素从头合成虾青素，而大多数动物从它们的食物中获得虾青素。在植物界，虾青素主要存在于一些种类的蓝细菌、藻类和地衣中。但是，在高等植物种类的花瓣中很少发现虾青素[见Goodwin TW(1980)类胡萝卜素的生物化学，第1卷，第2版，Chapman和Hall，London和New York]。

已证实虾青素在动物中作为强抗氧化剂的功能[见Miki W(1991)动物类胡萝卜素的生物功能和活性，纯应用化学63：141]。虾青素是脂过氧化的强抑制剂并已证明在保护生物膜免受氧化损伤中起重要作用[见Palozza P和Krinsky NI(1992)体内和体外类胡萝卜素的抗氧化效应——概述，酶学方法213：403-420；Kurashige M，Okimasu E，Inove M和Utsumi K(1990)虾青素抑制生物膜的氧化损伤，生理化学和生理医学方法NMR 22：27]。也已调查了虾青素的化学预防效应，已证明其中虾青素明显降低小鼠中诱导的膀胱癌的发生[见Tanaka T，Morishita Y，Suzui M，Kojima T，Okumura A和Mori H(1994)天然存在的类胡萝卜素虾青素对小鼠膀胱致癌作用的化学预防，致癌作用15：15]。也证实虾青素通过提高抗体产量发挥免疫调节作用[见Jyonouchi H，Zhang L和Tomita Y(1993)类胡萝卜素免疫调节作用研究。II.虾青素提高针对T-依赖型抗原的体内抗体产量而不促进多克隆B细胞的活化，营养癌症19：269；和Jyonouchi H，Hill JR，Yoshifumi T和Good RA(1991)类胡萝卜素免疫调节作用研究I.β-胡萝卜素和虾青素对小鼠淋巴细胞功能和体外培养系统中细胞表面标记物表达的影响，营养癌症16：93]。虾青素的完整生物医学特征还有待阐明，但最初结果显示虾青素在癌症和肿瘤预防及引发免疫系统正反应中起重要作用。

虾青素是鲑鱼和虾的主要类胡萝卜素色素并赋予卵、肉和皮肤中有吸引的色素[见Torrisen OJ，Hardy RW，Shearer KD(1989)鲑鱼中鲑类胡萝卜素色素沉积和代谢，Crit Rev Aquatic Sci 1：209]。1991年全世界鲑捕获量约为720,000MT，其中25-30％是在各种水产养殖场所生产的[见Meyers SP(1994)世界水产养殖的发展、饲料配方和类胡萝卜素作用，纯应用化学66：1069]。预计到2000年可增加到460,000MT[见Bjorndahl T(1990)鲑鱼水产养殖经济，BlackwellScientific，Oxford、第1页]。鲑鱼肉的红色能吸引消费者因而影响最终产品的价格。动物不能合成类胡萝卜素并且它们需要经过食物链从初级生产者-海洋藻类和浮游植物获得色素。强化培养中生长的动物通常会有较差的颜色。因此，在水产养殖中人为加入含类胡萝卜素的食品，对生产者来说有相当的费用。

虾青素是最昂贵的商用类胡萝卜素化合物(现在1995年市场价值是每千克2,500至3,500美元)。主要用作向多种水生动物提供色素的营养添加剂。在远东也用于饲养家禽以产生小鸡的典型色素形成。它也是食品工业中受欢迎的有效的无毒性着色剂并用在化妆品中。近来报道虾青素是人类中潜在的抗氧化剂，因此是可用的食品添加剂。

只有有限的天然(3S，3’S)虾青素可以得到。商业上从一些甲壳动物中提取虾青素[见Torrisen OJ，Hardy RW，Shearer KD(1989)鲑鱼中鲑类胡萝卜素色素沉积和代谢，Crit Rev Aquatic Sci 1：209]。从Phaffa[一种酵母，见Andrewes AG，Phaff HJ和Starr MP(1976)产红色素酵母Phaffia rhodozyma的类胡萝卜素，光化学，第15卷，第1003-1007页]生产虾青素的(3R，3’R)立体异构体。现在Hoffman-LaRoche生产含(3S，3’S)-，(3S，3’R)-和(3R，3’R)-异构体的1∶2∶1混合物的合成虾青素并以“CAROPHYLL Pink”的名称高价(每千克2，5000加元)出售[见Mayer H(1994)对类胡萝卜素合成的思考，纯应用化学，第66卷，第931-938页]。最近，从产生诸如虾青素的酮类胡萝卜素的海洋细菌橙黄琼脂杆菌和产碱菌PC-1中分离了参与酮化合物生物合成的称为crtW的新基因。当将crtW基因导入由于欧文氏菌胡萝卜素生成基因而积累β-胡萝卜素的已加工的大肠杆菌时，大肠杆菌转化子合成虾青素合成途径中角黄素的前体[见Misawa N，Kajiwara S，Kondo K，Yokoyama A，Satomi Y，Saito T，Miki W和Ohtani T(1995)通过单基因将烃β-胡萝卜素中亚甲基转变为酮基的角黄素生物合成，第209卷，第867-876页]。因此需要找到相对廉价的(3S，3’S)虾青素来源用作水产养殖的饲料添加剂和各种其它工业用途的有用化学制剂。

虽然虾青素在多种细菌、真菌和藻类中合成，但是与化学合成相比，其生产所用生物系统的主要限制是低产量高消耗的提取方法。解决这些问题的一种方法是用重组DNA技术增加生物系统中虾青素合成的产量。这样可以在易生长易提取的遗传工程宿主如高等植物中生产虾青素。此外，遗传工程宿主中虾青素的生产使得可以通过选择适当宿主以将合成的虾青素用于例如水产养殖而无需提取。

因而广泛认识到需要编码将β-胡萝卜素转变为角黄素的β-C-4-加氧酶的核酸片段，含有根据本发明所述的核酸序列的重组载体分子以及用这些载体分子或DNA片段转化或转染的用于生物技术生产(3S，3’S)虾青素的宿主细胞或转基因生物，得到这些是非常有益的。

从以下描述和权利要求书中可以看到本发明的其它特征和优势。

发明概述

本发明的总目的是提供生产(3S，3’S)虾青素的生物技术方法。

本发明的具体目的是提供具有β-C-4-加氧酶活性的肽和编码此肽的DNA片段以进行虾青素和其它叶黄素的生物技术生产。

本发明的另一目的是提供编码包含对应于上述肽的氨基酸序列的多肽的RNA片段。

本发明的另一目的是提供包含如上所述DNA片段和载体的重组DNA分子。

本发明的另一目的是提供含有上述重组DNA分子的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供在其细胞中含有上述重组DNA分子或上述DNA片段的转基因宿主生物。

本发明的另一目的是提供在含有叶绿体和/或有色体的组织中表达β-C-4-加氧酶活性的转基因宿主生物。

本发明的另一目的是提供包含上述宿主细胞或转基因生物的动物或人类消费的食品添加剂。

本发明的另一目的是提供用上述宿主细胞或转基因生物生产虾青素的方法。

本发明的另一目的是提供用上述宿主细胞或转基因生物生产角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、隐黄素、异隐黄素、羟基-β-胡萝卜素-4-酮、玉米黄素、adonirubin和/或adonixanthin的方法。

从以下描述，本发明的其它方面和优势将更清楚。

在一个实施方案中，本发明涉及编码含有对应于雨生红球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽的DNA片段。

在另一实施方案中，本发明涉及编码含有对应于雨生红球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽的RNA片段。

在另一实施方案中，本发明涉及含有对应于雨生红球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽。

在另一实施方案中，本发明涉及含有载体和编码对应于雨生红球藻crtO基因的多肽的DNA片段的重组DNA分子。

在另一实施方案中，本发明涉及含有上述重组DNA分子或DNA片段的宿主细胞。

在另一实施方案中，本发明涉及在其细胞中含有上述重组DNA分子或上述DNA片段的转基因宿主生物。

在另一实施方案中，本发明涉及用上述宿主细胞或转基因生物生产虾青素的方法。

在另一实施方案中，本发明涉及生产其它叶黄素的方法。

在另一实施方案中，本发明涉及在植物中，特别是在含有色体的细胞中获得转基因的高表达的方法。

在另一实施方案中，本发明涉及向有色体输入转基因编码的类胡萝卜素生物合成酶的方法。

附图简述

此处参照下列附图通过实施例描述本发明，其中：

图1是β-胡萝卜素生物合成的一般生化途径，途径中所有分子以全反式构型表示，其中IPP是异戊烯基焦磷酸，DMAPP是二甲基焦磷酸，GPP是牻牛儿焦磷酸，FPP是法呢基焦磷酸，GGPP是牻牛儿牻牛儿焦磷酸及PPPP是前八氢番茄红素焦磷酸；

图2是本发明的crtO cDNA(CRTOA.SEQ)和Kajiwara等克隆的cDNA(CRTOJ.SEQ)[见Kajiwara S，Kakizono T，Saito T，KondoK，Ohtani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生红球藻虾青素生物合成和大肠杆菌中虾青素合成的新cDNA的分离和功能鉴定，植物分子生物学29：343-352]的核苷酸序列之间的相同性图示，用GCG软件，其中(：)表示相同，(-)表示缺口，核苷酸编号根据对于CRTOA.AMI的SEQ ID No：4和Kajiwara等的CRTOJ.AMI；

图3是本发明的crtO cDNA编码的氨基酸序列(CRTOA.AMI)与Kajiwara等克隆的cDNA编码的氨基酸序列(CRTOJ.AMI)[见，Kajiwara S，Kakizono T，Saito T，Kondo K，O htani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生红球藻虾青素生物合成和大肠杆菌中虾青素合成的新cDNA的分离和功能鉴定，植物分子生物学29：343-352]之间的相同性图示，用GCG软件，其中(：)表示相同，(-)表示缺口，氨基酸编号根据对于CRTOA.AMI的SEQ ID No：4和Kajiwara等的CRTOJ.AMI；

图4是命名为pBCAR的pACYC184衍生的质粒图示，包含草生欧文氏菌的crtE、crtB、crtI和crtY基因，这些基因是大肠杆菌细胞中合成β-胡萝卜素所必需的；

图5是命名为pZEAX的pACYC184衍生的质粒图示，包含草生欧文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ基因，这些基因是大肠杆菌细胞中合成玉米黄素所必需的；

图6是命名为pHPK的pBluescript Sk^-衍生的质粒图示，包含编码雨生红球藻β-胡萝卜素C-4-加氧酶的全长cDNA插入，此cDNA命名为crtO并在SEQ ID No：1中列出，通过大肠杆菌颜色互补作用得到鉴定；

图7是命名为pCANTHA的pACYC184衍生的质粒图示，该质粒是通过插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含从图6质粒pHPK分离的并插入图5质粒pZEAX的crtZ基因编码序列的PstI位点的编码雨生红球藻β-C-4-加氧酶的cDNA；此重组质粒携带草生欧文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY基因和雨生红球藻的crtO基因，所有这些基因都是大肠杆菌细胞中合成角黄素所必需的；

图8是命名为pASTA的pACYC 184衍生的质粒图示，该质粒是通过插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含从图6质粒pHPK分离的并插入图5质粒pZEAX中位于crtE基因下游600bp的PstI位点的编码雨生红球藻β-C-4-加氧酶的cDNA；此重组质粒携带雨生红球藻的crtO基因和草生欧文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ基因，所有这些基因都是大肠杆菌细胞中合成虾青素所必需的。

图9是命名为PAN3.5-KETO的pBR328衍生的质粒图示，该质粒是通过插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含从图6质粒pHPK分离的并插入质粒pPAN35D5中位于β-内酰胺酶基因中的PstI位点的编码雨生红球藻β-C-4-加氧酶的cDNA[描述见HirschbergJ，OhadN，Pecker I和Rahat A(1987)蓝细菌聚球蓝细菌R2.中抗除草剂突变体的分离和鉴定，Z.Naturforsch 42c：102-112]；此重组质粒携带雨生红球藻的crtO基因，此基因是聚球蓝细菌PCC7942细胞中合成虾青素所必需的。

图10是命名为pBIB的Ti双元质粒(大肠杆菌，土壤杆菌)T-DNA区的图示[Becker D(1990)允许植物选择标记和报告基因交换的二型载体，核酸研究18：230]，此质粒是Ti质粒pBI101的衍生物[Jefferson AR，Kavanagh TA和Bevan WM(1987)，GUS融合：β-葡糖苷酸酶作为高等植物中敏感通用的基因融合标记，The EMBOJ.6：3901-3907]，其中B_R和B_L分别是T-DNA区的右边界和左边界，pAg7是土壤杆菌Ti质粒基因7的聚腺苷酸化位点，pAnos是含土壤杆菌胭脂氨酸合成酶基因聚腺苷酸位点的250bp长DNA片段NPTII是编码卡那霉素抗性的1800bp长的DNA片段，pnos是含土壤杆菌胭脂氨酸合成酶基因启动子序列的300bp长DNA片段，而pAnos是含土壤杆菌胭脂氨酸合成酶基因聚腺苷酸化位点的300bp长DNA片段；

图11是命名为pPTBIB的Ti双元质粒(大肠杆菌，土壤杆菌)T-DNA区的图示，通过克隆番茄(Lycopersicon esculentum)标记的PT的基因组DNA序列(如公开于Mann V，Pecker I和Hirschberg J(1994)，番茄(Lycopersicon esculentum)的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的克隆和鉴定，植物分子生物学24：429-434中的Pds基因的核苷酸1至1448)来制备此质粒，此DNA序列包含Pds基因的启动子和多肽PDS氨基末端区域的编码序列，多肽PDS作为进入叶绿体和有色体的中间肽，将此DNA序列插入图10的双元质粒载体pBIB的HindIII-SmaI位点，其中B_R和B_L，pAg7，pAnos，NPTII，pnos和pAnos为如上定义；

图12是命名为pPTCRTOBIB的Ti双元质粒(大肠杆菌，土壤杆菌)T-DNA区，该质粒通过将雨生红球藻crtO的cDNA的1110核苷酸长的Eco47III-Nco I片段(SEQ ID No：1的核苷酸211至1321)克隆入图11质粒pPTBIB的Sma I位点来制备，使PDS氨基末端的编码核苷酸序列位于crtO相同阅读框架，其中B_R和B_L，pAg7，pAnos，NPT II，pnos和pAnos如上定义，PT是番茄Pds启动子和转运肽编码序列，CRTO是雨生红球藻crtO的核苷酸序列(SEQ ID No：1的核苷酸211至1321)。

图13表示从野生型(WT)和命名为2，3，4，6，9和10的crtO转基因烟草植物提取的HindIII消化的基因组DNA的Southern DNA印迹分析，根据本发明，基本上按Sambrook等，分子克隆；实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.1989所述，使用crtO cDNA作为放射性探针，其中左侧按千碱基对(kb)表示标记(M)的DNA片段大小以及从含crtO cDNA序列的图12所示的pPTPDSBIB序列推测的内部T-DNAHindIII片段的预测位置(箭头)；

图14表示虾青素的生物合成途径；

图15表示野生型烟草植物的花和根据本发明所述的转基因烟草植物的花。

优选实施方案描述

总的来说，本发明是关于生产(3S，3’S)虾青素的生物技术方法。具体地，本发明涉及具有β-C-4加氧酶活性的肽；编码此肽的DNA片段；编码此肽的RNA片段；含载体和DNA片段的重组DNA分子；含上述重组DNA分子或DNA片段的宿主细胞或生物；以及用宿主生产(3S，3’S)虾青素或含(3S，3’S)虾青素的食品添加剂的生物技术方法。

单细胞淡水绿藻雨生红球藻在面对不利的生长条件或适应不同的环境逆境如磷酸盐或氮饥饿、生长培养基中的高浓度盐或高光强度时积累大量的(3S，3’S)虾青素[见，Yong YYR和Lee YK(1991)Phycologia 30：257-261；Droop MR(1954)Arch Microbiol20：391-397；和Andrews A.G，Borch G，Liaaen-Jensen S和SnatzkeG(1974)Acta Chem Scand B28：730-736]。藻类的营养细胞在此过程中形成孢囊并从绿色变为红色。本发明公开了命名为crtO的雨生红球藻cDNA的克隆，此cDNA编码将β-胡萝卜素转变为角黄素的β-C-4-加氧酶，并且在表达β-胡萝卜素羟化酶(例如草生欧文氏菌crtZ基因产物)的异源系统中表达，导致(3S，3’S)虾青素的合成。

crtO cDNA及其编码的具有β-C-4-加氧酶活性的肽分别是新的核酸和氨基酸序列。crtO cDNA的克隆方法利用了已在其中转染和表达了雨生红球藻的cDNA文库经遗传加工合成β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株。目测筛选棕红色大肠杆菌细胞鉴定为产生角黄素的转化子。由此，克隆的cDNA已在两个异源系统(大肠杆菌和聚球蓝细菌PCC7942细胞)中表达，两者都能产生β-胡萝卜素并进一步含有加工的(单生欧文氏菌crtZ基因产物)或内源的β-胡萝卜素羟化酶活性，并且已证明在两个系统中都能合成(3S，3’S)虾青素。

crtO cDNA或其蛋白产物与从合成诸如虾青素的酮胡萝卜素的海洋细菌agrobacterium auranticacun和产碱菌PC-1分离的crtW及其蛋白产物的核酸或氨基酸序列相比没有有意义的核酸或氨基酸序列相似性[见Misawa N，Kajiwara S，Kondo k，Yokoyama A，Satomi Y，Saito T，Miki W和Ohtani T(1995)通过由单个基因将碳氢β-胡萝卜素中亚甲基转变为酮基的角黄素生物合成，生物化学和生物物理研究通讯，第209卷，第867-876页]。

但是，crtO cDNA的核酸序列及其蛋白产物的氨基酸序列与最近克隆的从雨生红球藻分离的编码具有β-胡萝卜素加氧酶活性的320个氨基酸蛋白产物的cDNA的核酸和氨基酸序列基本相同[见KajiwaraS，Kakizono T，Saito T，Kondo K，Ohtani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生红球藻虾青素生物合成和大肠杆菌虾青素的合成的新cDNA的分离和功能鉴定，植物分子生物学29：343-352]。然而，如用GCG软件所确定的，如图2中所示，crtO cDNA(图2的CRTOA.SEQ)和Kajiwara等所述的cDNA(图2的CRTOJ.SEQ)[见上参考文献]间序列相同性程度是75.7％；如图3所示，crtO cDNA蛋白产物(图3的CRTOA.AMI)和Kajiwara等所述的蛋白(图3的CRTOJ.AMI)间的序列相同性程度是78％。

如下面将详细描述的，可用crtO cDNA使用生物技术在易于生长并可直接用作鱼类食品添加剂的系统或允许简便低耗提取虾青素的系统中生产(3S，3’S)虾青素。

在一个实施方案中，本发明涉及编码含有对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异及其有功能的天然存在的和/或人诱导的变体的氨基酸序列的多肽的DNA片段。此处和下面权利要求书中所用的术语“等位和种变异及其有功能的天然存在的和/或人诱导的变体”是指DNA(或如下所述的RNA)的来源或本领域已知的获得它的方法。但是，术语“变异”和“变体”是指存在序列不相似(即变异)。此处和以下权利要求书中本发明的序列变异是77-80％，优选地80-85％，更优选地85-90％，最优选地90-100％的相同核苷酸。在优选实施方案中，DNA片段包含如SEQ ID No：1中所列出的序列。在另一优选实施方案中，DNA片段编码如SEQ ID No：4中所列出的氨基酸序列。

本发明也包括纯化的DNA片段，其特征在于包含在高严格条件下[例如，按Sambrook等，分子克隆；实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.1989所述]与核酸探针杂交的序列，此探针包含SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的至少15个，优选地至少50个，更优选地至少100个，甚至更优选地至少200个，甚至更优选地至少500个连续核苷酸。选择性地，本发明的DNA片段可以以能在低严格条件下与含有SEQ IDNo：1或SEQ ID No：2的编码序列(核苷酸166至1152)的核酸探针杂交为特征。这种低严格条件的例子按Sambrook等所述，用低杂交温度，例如比如上面所述的高严格杂交条件所用温度低20℃。

本发明的DNA片段也可以以能在高严格条件下与含有SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的编码序列(核苷酸166至1152)的核酸探针杂交为特征。

本发明也包括能与SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的至少10个核苷酸片段杂交的合成法合成的寡核苷酸(例如寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸及其类似物)。

在另一实施方案中，本发明涉及编码含有对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异及其有功能的天然存在的和/或人诱导的变体的氨基酸序列的多肽的RNA片段。在一个优选实施方案中，RNA片段包含如SEQ ID No：2中所列出的序列。在另一个优选实施方案中，RNA片段编码如SEQ ID No：4中所列出的氨基酸序列。

本发明也包括纯化的RNA，其特征在于包含在高严格条件下与核酸探针杂交的序列，此探针包含SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的至少至少15个，优选地至少50个，更优选地至少100个，甚至更优选地至少200个，甚至更优选地至少500个连续核苷酸。选择性地，本发明的RNA可以以能在低严格条件下与含有SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的编码序列(核苷酸166至1152)的核酸探针杂交为特征。此外，本发明的RNA可以以能在高严格条件下与含有SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的编码序列(核苷酸166至1152)核酸探针杂交为特征。

在另一实施方案中，本发明涉及含有对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异及其有功能的天然存在的和/或人诱导的变体的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，多肽包含如SEQ ID No：4中所列出的氨基酸序列。

应当注意本发明包括任何与上述多肽同源(即80-85％，优选地85-90％，较优选地90-100％的相同氨基酸)的肽。此处和下面权利要求书中所用的术语“同源的”是指两个肽之间的序列相同性。当两个对比序列中的一个位置由相同的氨基酸单体亚单位占据时，在此位置就是同源的。两个序列间的同源性是两个序列中同源位置数目的函数。例如，如果两个序列中10个位置有8个位置由相同氨基酸占据，那么这两个序列是80％的同源。

本发明中所包括的其它多肽是等位变异、其它种同系物、天然突变体、诱导突变体以及在高或低严格条件(见上面)下与SEQ ID No：1或SEQ ID No：2编码区(核苷酸166至1152)杂交的DNA编码的肽。

在另一实施方案中，本发明涉及含有载体(例如质粒或病毒载体)和编码如上所述多肽的DNA片段的重组DNA分子。在优选实施方案中，载体中存在的DNA片段与启动子可操作地连接。

在另一实施方案中，本发明涉及含上述重组DNA分子或DNA片段的宿主细胞。适当的宿主细胞包括原核生物(如细菌，包括大肠杆菌)和低等真核生物(例如酵母)及高等真核生物(例如藻类、植物或动物细胞)。用本领域已知方法例如但不限于转染、转化、微注射、基因轰击等将重组分子导入细胞。可以使这样制备的含有上述重组DNA分子的细胞生长形成菌落或分化形成分化的生物。重组DNA分子可以暂时包含在细胞中(例如通过本领域已知的暂时转染方法)，但是优选的是重组DNA分子稳定包含在细胞中(例如通过本领域已知的稳定转染方法)。在优选实施方案中，细胞可以内源合成或通过遗传工程方法使细胞合成β-胡萝卜素，并且细胞包含内源的或遗传加工的β-胡萝卜素羟化酶活性。这种细胞可以用作动物(例如鲑鱼)和人类消费的食品添加剂。此外，如下描述的，这种细胞可用于提取虾青素和/或其它叶黄素。

在另一实施方案中，本发明涉及在其细胞中含有上述重组DNA分子或上述DNA片段的转基因宿主生物(例如高等植物或动物)。用本领域已知方法可以将重组分子或DNA片段导入转基因宿主生物。在优选实施方案中还可以内源合成或通过遗传工程方法使细胞合成β-胡萝卜素，并且优选地宿主生物也包含内源的或遗传加工的β-胡萝卜素羟化酶活性。这种生物可用作动物(例如鲑鱼)和人类消费的食品添加剂。此外，如下描述的，这种生物可用于提取虾青素和/或其它叶黄素。

在另一实施方案中，本发明涉及用上述宿主细胞或转基因生物生产虾青素的方法。在另一实施方案中，本发明涉及用上述宿主细胞或转基因生物生产叶黄素如角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、隐黄素、异隐黄素、羟基-β-胡萝卜素-4-酮、玉米黄素、adonirubin、3-羟基-β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基-β-胡萝卜素-4-酮和/或adonixanthin的方法。提供如上所述的细胞或转基因生物用于这些目的。使宿主细胞或生物在利于产生和通过本领域已知方法提取叶黄素和上面所列的其它叶黄素的条件下生长。

在另一实施方案中，本发明涉及表达编码包含对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异或其有功能的天然存在的或人诱导的变体的氨基酸序列的多肽的转基因的转基因植物。优选地在含有色体组织中表达最高。

在另一实施方案中，本发明涉及包括编码将蛋白导入植物叶绿体或有色体的多肽的第一个DNA片段(例如来自番茄Pds基因)和编码包含对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异或其有功能的天然存在的和人诱导的变体的氨基酸序列的多肽第二个框架内DNA片段的重组DNA载体。

在另一实施方案中，本发明涉及包括包含可在植物含叶绿体或有色体的组织中高度表达的启动子的第一个DNA片段(例如来自番茄Pds基因)和编码包含对应于雨生红球藻crtO基因、其等位和种变异或其有功能的天然存在的和人诱导的变体的氨基酸序列的多肽第二个DNA片段的重组DNA载体。

目前由以下实施例和上面描述一起阐明本发明。

实施例

在实施例中指出的下列方法和实验细节是：

藻类和生长条件    雨生红球藻(菌株34/7来自藻类和原生生物培养保藏中心，Windermere，UK)由利物浦John Moores大学AndrewYoung博士慷慨提供。藻类的悬浮培养物在如Nichols和Bold所述的液体培养基中生长[见Nichols HW，Bold HC(1964)Trichsarcinapolymorpha藻类学杂志1：34-39]。收获细胞，用水冲洗并重新悬浮在去氮培养基中用于虾青素生物合成的诱导。将培养物在连续光照(光子通量75μE/m²/S)下，于25℃在80rpm摇床上保留在250毫升Erlenmeyer培养瓶中。

cDNA文库的构建在Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters364：125-128中详细描述了从雨生红球藻中构建cDNA文库。简要地说，从在缺氮条件下生长5天的藻类细胞(细胞颜色棕红)中提取总RNA。从50毫升培养基收获细胞并用Tri试剂提取RNA(分子研究中心，INC)。通过在寡脱氧胸苷酸纤维素(Boehringer)上的两次分级分离循环分离多聚腺苷酸化RNA。终产量为总RNA的1.5％。用ZAP-cDNA合成试剂盒将cDNA文库构建在Uni^- ZAP^TM XR载体中(都来自Stratagene)。用菌株XL1-Blue MRF′(Stratagene)的大肠杆菌细胞扩增cDNA文库。

质粒和大肠杆菌菌株    从Tuveson处获得含有细菌草生欧文氏菌类胡萝卜素生物合成必需基因的质粒pPL376[关于质粒pPL376的进一步细节见Tuveson RW，Larson RA和Kagan J(1988)大肠杆菌中表达的克隆类胡萝卜素基因在保护免受由近紫外光和特异的光毒性分子引起的失活中的作用，细菌学杂志170：4675-4680]。携带质粒pPL376的大肠杆菌菌株JM109细胞积累了浅黄色类胡萝卜素，玉米黄素糖苷。在第一步中，从此质粒中删除1.1kb Sal I-Sal I片段使编码玉米黄素糖苷转移酶的基因crtX失活。在第二步中，在自身连接后质粒DNA的BamHI部分切割删除0.8kb片段，使编码β-胡萝卜素羟化酶的crtZ失活。Bgl II部分切割产生7.4kb片段，将此片段克隆到质粒载体pACYC184的BamHI位点。如图4所示，得到的携带基因crtE、crtB、crtI和crtY的重组质粒命名为pBCAR[Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters 364：125-128]。

将质粒pBCAR转染入大肠杆菌SOLR菌株细胞(Stratagene)。在含氯霉素的Luria Broth(LB)培养基上出现的菌落(在Sambrook等，分子克隆；实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中描述]携带此质粒并由于β-胡萝卜素的积累而发展成深黄-橙色。

如图5所示，构建命名为pZEAX的另一质粒，此质粒允许在大肠杆菌中合成和积累玉米黄素[Lotan和Hirschberg(1995)FEBSLetters 364：125-128中详细描述了此质粒]。大肠杆菌SOLR菌株的细胞用作pZEAX质粒的宿主。大肠杆菌细胞在LB培养基(见上)上于37℃在225rpm的摇床上避光生长。向培养基中加入氯苄青霉素(50微克/毫升)和/或氯霉素(30微克/毫升)(两者都来自Sigma)以挑选适当转化的细胞。

如图6所示，Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters364：125-128(见下面描述)所描述的，通过颜色互补鉴定包含β-胡萝卜素C-4-加氧酶全长cDNA的质粒pHPK。从质粒pHPK分离含雨生红球藻β-C-4 加氧酶cDNA的1.2kb Pst I-Pst I DNA片段并插入质粒pZEAX的crtZ基因编码序列中的Pst I位点。此重组质粒命名为pCANTHA并在图7中表示。

也将同一个1.2kb Pst I-Pst I片段插入存在于质粒pZEAX中crtE基因600bp下游的Pst I位点。得到的重组质粒命名为pASTA并在图8中表示。

也将同一个1.2kb Pst I-Pst I片段插入存在于带有质粒载体pBR328中的蓝细菌聚球蓝细菌PCC 7942的psbA1基因[Hirschberg J，Ohad N，Pecker I和Rahat A(1987)蓝细菌聚球蓝细菌R2中除草剂抗性突变体的分离和特征鉴定，Z Naturforsch 42c：102-112]的质粒pPAN35D5中的β-内酰胺酶基因中的Pst I位点[Hirschberg J，OhadN，Pecker I和Rahat A(1987)蓝细菌聚球蓝细菌R2中的除草剂抗性突变体的分离和特征鉴定，Z.Naturforsch 42c：102-112]。此质粒命名为PAN3.5-KETO并在图9中表示。按照Golden所述方法将此质粒用于转化聚球蓝细菌PCC7942细胞[Golden SS(1988)通过经典基因转移方法诱变蓝细菌，酶学方法167：714-727]。

噬菌体文库的切割及β-胡萝卜素加氧酶基因的筛选    用携带质粒pBCAR的大肠杆菌SOLR菌株细胞中ExAssit辅助噬菌体(Stratagene)对按上述方法制备的cDNA文库进行大量切割。将以噬菌粒的切割文库转染入大肠杆菌XL1-Blue菌株的细胞并将细胞铺在含1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，50微克/毫升氨苄青霉素和30微克/毫升氯霉素的LB平板上，密度为每个平板产生约100至150个菌落。将平板37℃过夜培养并在室温下进一步培养两天以上。然后4℃保存平板直到筛选菌落颜色变化。

有色体中高度表达crtO的质粒    如图10-11所示，将含Pds基因启动子和作为进入叶绿体和有色体转运肽的多肽PDS氨基末端区编码序列的番茄(Lycopersicon esculentum)基因组DNA序列(Pds基因的核苷酸1至1448)[如Mann V，Pecker I和Hirschberg J(1994)，番茄(Lycopersicon esculentum)八氢番茄红素脱氢酶基因(Pds)的克隆和特征鉴定，植物分子生物学24：429-434中公开的]克隆进入图10所示的双元质粒载体pBIB[描述于Becker D(1990)，允许植物选择标记基因和报告基因交换的双元载体，核酸研究18：230]的HindIII-Sma I位点。重组质粒命名为pPTBIB并在图11中表示。

如图12所示，将含雨生红球藻crtO的cDNA(SEQ ID No：1的核苷酸211至1321)的1，110核苷酸长的Eco47III-Nco I片段亚克隆入质粒pPTBIB的SmaI位点(图11)使得Pds氨基末端编码核苷酸序列与crtO处于同一阅读框架中。重组质粒命名为pPTCRTOBIB。

转基因高等植物的形成    从大肠杆菌细胞中提取pPTCRTOBIB的DNA并用电穿孔方法按对大肠杆菌所述的[Dower JW，Miller FJ和Ragdsale WC(1988)通过高压电穿孔高效转化大肠杆菌，核酸研究18：6127-6145]将其转移至根瘤土壤杆菌菌株EHA 105的细胞中[描述于Hood EE，Gelvin SB、Melchers LS和Hoekema A(1993)，转基因研究2：208-218]。土壤杆菌细胞于28℃在补充了作为选择剂的50微克/毫升链霉素和50微克/毫升卡那霉素的LB培养基上生长。在生长稳定期时从上清培养物中收集携带pPTCRTOBIB的土壤杆菌细胞并如Horsch RB，Fry JE，Hoffmann NL，Eicholtz D，Rogers SG和FraleyRT，将基因转入植物的简单通用方法，科学(1985)227：1229-1231；和Jefferson AR，Kavanagh TA和Bevan WM(1987)GUS融合：β-葡糖苷酸酶作为高等植物的敏感和通用基因融合标记，The EMBO J.6：3901-3907所述的用于转化。

用转化的土壤杆菌细胞感染烟草株NN的叶外植体并按照上面引用的Horsch等(1985)和Jefferson等(1987)所述方法再生卡那霉素抗性转基因植物。

目前参照图13，通过DNA-DNA印迹分析测定全面发育的再生植物中crtO基因构建体DNA序列的存在。为此目的，从叶中提取DNA[根据Kanazawa和Tsutsumi(1992)，从Nelumbo属植物提取限制性DNA，植物分子生物学报告10：316-318所述方法]，用限制性内切酶HindIII消化，通过凝胶电泳按大小分离这些片段并与放射标记的crtO序列(SEQ ID No：1)杂交。

已确定所检查的每个转基因植物包含至少1个crtO DNA序列拷贝，产生源自pPTCRTOBIB T-DNA内部HindIII-HindIII片段的1.75kb条带(箭头)、其它源自部分消化的条带、其它大小随植物基因组中插入位置变化的条带和源自烟草植物本身也出现在阴性对照野生型泳带中的1.0kb条带。

序列分析    通过双脱氧方法进行DNA序列分析[见Sanger F，Nicklen S & Coulsen AR(1977)用链终止反应抑制剂进行DNA测序，美国国家科学院院报74：5463-5467]。

分析类胡萝卜素    将生长在LB液体培养基中的大肠杆菌细胞以13,000g离心10分钟，在水中洗一次后再离心。除去水后，将细胞重新悬浮在70微升丙酮中并于65℃培养15分钟。将样品再在13,000g离心10分钟并将含类胡萝卜素的上清液放入干净试管。在氮气(N₂)气流下吹干类胡萝卜素提取物并在-20℃保存直到需要分析。将0.5-1.0gr植物组织和100微升丙酮混合，65℃培养15分钟，然后按上述方法处理样品就可从植物组织中提取类胡萝卜素。

用酸化反相C18柱Spherisorb ODS-2(硅5微米，4.6毫米×250毫米)(Phenomenex^)进行类胡萝卜素提取物的高效液相色谱(HPLC)。通过三相Merck-HitachiL-6200A高压泵以流速1.5毫升/分钟泵入流动相。流动相由包含己烷/二氯甲浣/异丙醇/三乙胺(88.5∶10∶1.5∶0.1，体积/体积)的无梯度溶剂系统组成。用Waters 996光电二极管系统探测仪测定470纳米处的峰。与化学纯β-胡萝卜素、玉米黄素、β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、adonirubin和虾青素的标准样品(后四种由利物浦John Moores大学Andrew Young博士慷慨提供)比较，通过它们的保留时间和它们的典型吸收谱来鉴定每个类胡萝卜素。

用乙酸乙酯/苯(7∶3，体积/体积)作为洗脱液，用硅胶60 F254板(Merck)进行薄层色谱(TLC)。用Shimadzu UV-160A分光光度计记录可见光吸收光谱。所有光谱在丙酮中记录。以％III/II的方式表示光谱细微结构[Britton，G.(1995)紫外线/可见光光谱学，于：类胡萝卜素，第IB卷，光谱学，Britton G，Liaaen-Jensens和Pfander H.Birkhauser Verlag编辑，Basel.第13-62页]。

对从大肠杆菌细胞提取的类胡萝卜素的分离和鉴定进行处理以增加TLC硅板上吸附(降低R_f值)。类胡萝卜素结构和虾青素生物合成途径在图14中给出。下列细节是指图14中编号1至9的类胡萝卜素。

β-胡萝卜素(1).与真正的(1)不可分的R_f0.92，R_t.可见λ_最大纳米：(428)，452，457，％III/II＝0。

β-胡萝卜素-4-酮(2).与真正的(2)不可分的R_f0.90，R_t.VISλ_最大纳米：455，％III/II＝0。

角黄素(3).与真正的(3)不可分的R_f0.87，R_t.可见λ_最大纳米：470.％III/II＝0。

β-玉米黄素(4).R_f0.83.R_t.可见λ_最大纳米：(428)，451，479，％III/II＝0。

Adonirubin(5).与真正的(5)不可分的R_f0.82.R_t.可见λ_最大纳米：476，％III/II＝0。

虾青素(6).与真正的(6)不可分的R_f0.79.R_t.可见λ_最大纳米：477，％III/II＝0。

Adonixanthin(7).R_f0.72.R_t.可见λ_最大纳米：464，％III/II＝0。

玉米黄素(8).与真正的(8)不可分的R_f0.65.R_t.可见λ_最大纳米：(428)，451，483，％III/II＝27。

羟基-β-胡萝卜素-4-酮(9)，R_f0.80，R_t，3.0.可见λ_最大纳米：464，％III/II＝0。

手性构型    通过虾青素的衍生的非对映异构camphanate的HPLC测定虾青素的手性构型[Renstrom B，Borch G，Skulberg M和Liaaen-Jensen S(1981)雨生红球藻的(3S，3’S)虾青素的光学纯度，光化学20：2561-2565]。分析证实大肠杆菌细胞合成纯的(3S，3’S)虾青素。

实施例1  克隆β-C-4-加氧酶基因

在λZAPII载体上从如上所述通过氮缺失诱导合成虾青素的雨生红球藻细胞的多聚腺苷酸化RNA构建cDNA文库，。将完整文库切割插入携带质粒pBCAR的大肠杆菌菌株SOLR的积累β-胡萝卜素的细胞(见图4)。根据直径大小为3毫米的菌落颜色来筛选β-胡萝卜素加氧酶基因。虾青素和β-胡萝卜素氧化形式(即叶黄素)具有不同的较深颜色因而可从黄色β-胡萝卜素背景中分辨。筛选包括约100,000个菌落，这些菌落生长在含有用于选择以质粒繁殖形式的λZAPII载体和pBCAR质粒的氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基平板上。几个菌落表现有不同色调但仅有一个菌落表现显著的棕红色。挑选这个推测含有叶黄素生物合成基因的菌落用于下面实施例中所述的进一步分析。

实施例2分析大肠杆菌中β-C-4-加氧酶活性

将推测含有叶黄素生物合成基因的棕红色菌落(见上面实施例1)划线并作进一步分析。首先，通过从棕红色菌落中制备质粒DNA，将其转染入大肠杆菌菌株XL1-Blue的细胞并在含氨苄青霉素的培养基上筛选来分离携带负责大肠杆菌中叶黄素合成的cDNA克隆的重组ZAPII质粒。将命名为pHPK的这个质粒(pHPK是含有从棕红色菌落分离的插入的入ZAPII载体)用于转化产生β-胡萝卜素的大肠杆菌细胞(大肠杆菌SOLR菌株携带图4所示的质粒pBCAR)，得到棕红色菌落。用丙酮从转化子和宿主细胞(作为对照)提取类胡萝卜素并用HPLC分析。

合成β-胡萝卜素的宿主细菌(携带图4中所示质粒pBCAR的大肠杆菌SOLR菌株)的类胡萝卜素HPLC分析与棕红色菌落相比，揭示了在转化细胞中仅观察到微量的β-胡萝卜素，然而出现了新的角黄素主峰和另一个β-胡萝卜素-4-酮的小峰[详述见Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters 364：125-128]。这些结果表明命名为crtO的质粒pHPK中的cDNA编码有β-C-4-加氧酶活性的酶，此酶经β-胡萝卜素-4-酮将β-胡萝卜素转变为角黄素(见图14)。因此，可以断定单个酶通过分别对β-胡萝卜素β’-环的C₄和C₄′的对称作用来催化这个两步酮化转变。

实施例3大肠杆菌细胞中虾青素的合成

将分离的雨生红球藻crtO cDNA和草生欧文氏菌crtZ基因一起在大肠杆菌细胞中表达以测定β-胡萝卜素羟化酶(例如草生欧文氏菌crtZ基因产物)是否将产生的角黄素转变为虾青素和/或由β-胡萝卜素羟化酶作用从β-胡萝卜素转化来的玉米黄素是否由β-C-4-加氧酶催化转变为虾青素。为此目的，用如图8所示含crtZ和crtO的质粒pASTA单独或选择性地用如图6所示含crtO的pHPK和如图5所示含crtZ的pZEAX两个质粒转化大肠杆菌菌株SOLR的细胞。提取所得转化细胞中的类胡萝卜素并如上述方法用HPLC分析。表1中给出的结果表明从含质粒pASTA的细胞提取的类胡萝卜素的组成。在携带pHPK和pZEAX的大肠杆菌细胞中发现了相似的类胡萝卜素组成。

                表1

类胡萝卜素	总类胡萝卜素组成的百分数(％)
		β-胡萝卜素	8.0
β-胡萝卜素-4-酮	1.7
		β-隐黄素	4.2
角黄素	4.2
		玉米黄素	57.8
Adonirubin	1.0
		Adonixanthin	17.9
虾青素	5.2

表1所示结果证明，具有β-端基或4-酮-β-端基的类胡萝卜素在碳原子C-3和C-3′处作用为crtZ基因产物催化的羟化反应底物。β-胡萝卜素和角黄素的羟化作用分别产生玉米黄素和虾青素。这些羟化作用导致虾青素和中间酮类胡萝卜素，3-羟基-β-胡萝卜素-4-酮、adonixanthin和adonirubin的合成。这些结果进一步证实，通过表达基因crtO和编码β-胡萝卜素羟化酶的基因可以在异源细胞中产生虾青素。

实施例4  β-胡萝卜素C-4-加氧酶基因的序列分析

将通过多聚腺苷酸尾的存在所确定的质粒pHPK中的全长cDNA插入(1771个碱基对)用于核苷酸序列分析。1995年5月1日将SEQ IDNo：1中所列出的序列及SEQ ID No：3(329个氨基酸)中所列出的其翻译成的氨基酸序列保存在EMBL数据库中并分别得到录入号X86782和X86783。

在此序列中鉴定了825个核苷酸(SEQ ID No：3中核苷酸166至1152)的开放阅读框架(ORF)。如大肠杆菌细胞(见上面实施例3)中其功能性表达所证实的，此ORF编码具有SEQ ID No：4中所列出的329个氨基酸的β-胡萝卜素C-4-加氧酶。编码此酶的基因命名为crtO。

实施例5  用crtO转化蓝细菌

根据Golden所述方法[Golden SS(1988)通过经典方法和基于基因转移方法诱变蓝细菌，酶学方法167：714-727]，将图9所示的pPAN3.5-KETO质粒DNA转染入聚球蓝细菌PCC7942的细胞中。将蓝细菌细胞在含氯霉素的BG11培养基的培养皿上铺板。对10日后出现的氯霉素抗性聚球蓝细菌PCC7942的菌落分析其类胡萝卜素含量。如下面表2中所详述的，这些细胞的HPLC分析表明细胞的主要类胡萝卜素成分是β-胡萝卜素、β-胡萝卜素-4-酮、角黄素、adonirubin和虾青素。对用其中crtO基因逆向的质粒转染的因此不能合成活性蛋白的聚球蓝细菌PCC7942和野生型细胞的相似分析表明不能产生β-胡萝卜素-4-酮，角黄素、adonirubin和虾青素。

这些结果证明雨生红球藻的crtO可在蓝细菌中表达并且其表达提供了β-胡萝卜素转变为角黄素所需的β-C-4-加氧酶酶促活性。这一结果进一步证实聚球蓝细菌PCC7942的内源β-胡萝卜素羟化酶能够将这样生成的角黄素转变为虾青素。因为所有绿色光合作用生物的类胡萝卜素生物合成途径相似[见图1和10，及Pecker I，ChamovitzD，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果实成熟期间催化八氢番茄红素转变ζ-胡萝卜素的单一多肽受到转录调控，美国国家科学院院报89：4962-4966]，所以可以推测，在任何组织中也表达内源β-胡萝卜素羟化酶的藻类和高等植物中可以通过表达crtO生产虾青素。进一步推测，只要生物包含内源的或加工的β-胡萝卜素生物合成途径，通过在表达内源或遗传工程的β-胡萝卜素羟化酶的任一组织中表达crtO就可以通过任一生物生产虾青素。

                表2

类胡萝卜素	总类胡萝卜素组成的百分数(％)
		β-胡萝卜素	31.5
β-胡萝卜素-4-酮	18.5
		角黄素	16.1
玉米黄素	22.3
		adonirubin	6.0
虾青素	5.6

实施例6测定异源系统中民的虾青素的手性构型

通过虾青素衍生的非对映异构camphanate的HPLC测定如实施例3所述的大肠杆菌细胞产生的虾青素及如实施例5中所述的聚球蓝细菌PCC7942细胞产生的虾青素的手性构型[Renstrom B，Borch G，Skulberg M和Liaaen-Jensen S(1981)雨生红球藻的(3S，3’S)虾青素的光学纯度，光化学20：2561-2565]。分析证明上述大肠杆菌和聚球蓝细菌PCC7942细胞合成纯的(3S，3’S)虾青素。

实施例7  用crtO转化高等植物

在高等植物中生产天然虾青素有两个预期的益处。首先，虾青素作为纯化学品广泛用作鱼类饲料添加剂。它是潜在的适于人类消费的食品着色剂并在化妆品工业中有潜在用途。其次，诱导花和果实中虾青素生物合成可以提供增强其外表和/或营养价值的吸引人的粉红/红色。

在花和果实中，类胡萝卜素一般在典型含色素的质体有色体中合成并积累至高浓度，于是向这些器官提供典型的深色。诱导有色体中虾青素的合成确保了高浓度酮类胡萝卜素的积累。导致叶绿体中类胡萝卜素浓度增加的类胡萝卜素生物合成基因的过度表达或叶绿体中类胡萝卜素组成的其它变化可能损伤类囊膜，削弱光合作用并因此对植物有害。相反，类胡萝卜素浓度的增加或有色体中类胡萝卜素组成的变化不影响植物生存力及果实和花的产量。

因此，使用基因转移技术将所述的从藻雨生红球藻分离的crtO基因以使其尤其在含有色体细胞中的表达受正调控某种方式移入高等植物。

为此目的，在大肠杆菌中组装图12所示的含T-DNA的双元质粒载体，将启动子和由来自番茄种类(Nicotiana tabacum NN)的Pds基因编码的转过肽的编码DNA序列与雨生红球藻crtO的编码DNA序列连接。按上述方法将此DNA构建体经土壤杆菌介导的转化作用稳定转移入烟草(烟草NN)植株以形成转基因植物，植物获得了尤其在花组织(含有色体细胞)中产生酮类胡萝卜素的能力。应当注意Pds基因启动子能够指导植物叶绿体和/或含有色体组织中的转录和表达。应进一步注意部分Pds编码序列编码的转运肽能够指导结合(即框架内)蛋白进入植物有色体和/或叶绿体。

如图15所示，例如在烟草花的蜜腺组织的含有色体细胞中，此DNA构建体诱导虾青素和其它酮类胡萝卜素积累至较高水平而将正常黄色变为红色。

测定转基因植物中如叶的含叶绿体组织和如花的含有色体组织中类胡萝卜素的浓度和组成并与正常的非转化植物比较。

如上所述通过薄层色谱(TLC)和高压液相色谱(HPLC)测定野生型和转基因烟草植物的叶(含叶绿体组织)和花的蜜腺组织(含有色体组织)中类胡萝卜素的组成。

下面表3中总结了野生型和转基因烟草植物的叶(含叶绿体组织)和花的蜜腺组织(含有色体组织)中总类胡萝卜素浓度。

下面表4中总结了野生型和转基因烟草植物的叶中类胡萝卜素组成的百分数。

下面表5中总结了野生型和转基因烟草植物的花蜜腺组织中类胡萝卜素组成的百分比。

表3每克鲜重中的类胡萝卜素(微克)

	野生型	用crtO转基因的
			叶(叶绿体)	200	240
蜜腺组织(有色体)	280	360

表4含叶绿体组织(叶)中总类胡萝卜素组成的百分数(％)

	野生型	转基因的
			β-胡萝卜素	29.9	26.7
新叶黄素	5.0	5.9
			紫黄质	11.6	18.1
环氧玉米黄素	4.9	2.6
			叶黄二醇	43.9	41.4
玉米黄素	4.7	4.3
			虾青素+adonirubin	0.0	1.0

表5含有色体组织(花)中总类胡萝卜素组成的百分数(％)

	野生型	转基因
			β-胡萝卜素	58.1	21.0
紫黄质	40.3	1.5
			叶黄二醇	0.0	1.1
玉米黄素	1.6	1.0
			羟基β-胡萝卜素-4-酮	0.0	13.7
3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮	0.0	4.1
			adonirubin	0.0	22.4
adonixanthin	0.0	8.7
			虾青素	0.0	26.5

请注意特别是在转基因烟草植物含有色体组织中羟基β-胡萝卜素-4-酮、3′-羟基β-胡萝卜素-4-酮、adonirubin、adonixanthin和虾青素的浓度增高。

于是，本发明通过提供具有β-C-4-加氧酶活性的肽；编码此肽的DNA片段；编码此肽的RNA片段；含载体和DNA片段的重组DNA分子；含上述重组DNA分子或DNA片段的宿主；以及用宿主生产(3S，3’S)虾青素或含(3S，3’S)虾青素的食品添加剂的生物技术方法使(3S，3′S)虾青素的相对低耗的生物技术生产成为可能从而成功地克服了目前已知构型的不足之处。

虽然本发明已就有限的几个实施方案进行了描述，但是应当理解可以对本发明进行一些变化、修改和其它应用。

                         序列表

(1)基本信息

  (i)申请人：Joseph Hirschberg，tamer Lotan and Marker

  (ii)发明名称：

  (iii)序列数：4

  (iv)联系地址：

     (A)名称：Mark M.Friedman c/o Robert Sheinbein

     (B)街道：2940 Birchtree space lane

     (C)城市：Siver Spring

     (D)州名：Maryland

     (E)国家：美国

     (F)邮政编号：20906

  (v)计算机可读形式：

     (A)介质类型：1.44兆，3.5”软盘

     (B)计算机：Twinhead Slimnote-890TX

     (C)操作系统：MS-DOS版本6.2

                   Windows版本3.11

     (D)软件：Word for Windows版本2.0

  (vi)目前申请资料：

     (A)申请号：

     (B)递交日：

     (C)分类

  (vii)在先申请资料：

     (A)申请号：

     (B)递交日：

  (viii)律师/代理人信息

     (A)名称：Friedmam，mark M.

     (B)登记号：33,883

     (C)参考/著录号：325/5

  (ix)电信信息：

     (A)电话：972-3-562553

     (B)传真：972-3-562554

     (C)电传：

(2)关于SEQ ID NO：1的信息

  (i)序列特征

     (A)长度：1771个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：双链

     (D)拓扑结构：线型

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GGC ACG AGC TTG CAC GCA AGT CAG CGC GCG CAA GTC AAC ACC TGC CGG      48

TCC ACA GCC TCA AAT AAT AAA GAG CTC AAG CGT TTG TGC GCC TCG ACG      96

TGG CCA GTC TGC ACT GCC TTG AAC CCG CGA GTC TCC CGC CGC ACT GAC     144

TGC CAT AGC ACA GCT AGA CGA ATG CAG CTA GCA GCG ACA GTA ATG TTG     192

GAG CAG CTT ACC GGA AGC GCT GAG GCA CTC AAG GAG AAG GAG AAG GAG     240

GTT GCA GGC AGC TCT GAC GTG TTG CGT ACA TGG GCG ACC CAG TAC TCG     288

CTT CCG TCA GAA GAG TCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CTG AAG AAT GCC     336

TAC AAG CCA CCA CCT TCC GAC ACA AAG GGC ATC ACA ATG GCG CTA CGT     384

GTC ATC GGC TCC TGG GCC GCA GTG TTC CTC CAC GCC ATT TTT CAA ATC     432

AAG CTT CCG ACC TCC TTG GAC CAG CTG CAC TGG CTG CCC GTG TCA GAT     480

GCC ACA GCT CAG CTG GTT AGC GGC ACG AGC AGC CTG CTC GAC ATC GTC     528

GTA GTA TTC TTT GTC CTG GAG TTC CTG TAC ACA GGC CTT TTT ATC ACC     576

ACG CAT GAT GCT ATG CAT GGC ACC ATC GCC ATG AGA AAC AGG CAG CTT     624

AAT GAC TTC TTG GGC AGA GTA TGC ATC TCC TTG TAC GCC TGG TTT GAT     672

TAC AAC ATG CTG CAC CGC AAG CAT TGG GAG CAC CAC AAC CAC ACT GGC     720

GAG GTG GGC AAG GAC CCT GAC TTC CAC AGG GGA AAC CCT GGC ATT GTG     768

CCC TGG TTT GCC AGC TTC ATG TCC AGC TAC ATG TCG ATG TGG CAG TTT     816

GCG CGC CTC GCA TGG TGG ACG GTG GTC ATG CAG CTG CTG GGT GCG CCA     864

ATG GCG AAC CTG CTG GTG TTC ATG GCG GCC GCG CCC ATC CTG TCC GCC     912

TTC CGC TTG TTC TAC TTT GGC ACG TAC ATG CCC CAC AAG CCT GAG CCT     960

GGC GCC GCG TCA GGC TCT TCA CCA GCC GTC ATG AAC TGG TGG AAG TCG    1008

CGC ACT AGC CAG GCG TCC GAC CTG GTC AGC TTT CTG ACC TGC TAC CAC    1056

TTC GAC CTG CAC TGG GAG CAC CAC CGC TGG CCC TTC GCC CCC TGG TGG    1104

GAG CTG CCC AAC TGC CGC CGC CTG TCT GGC CGA GGT CTG GTT CCT GCC    1152

TAG CTG GAC ACA CTG CAG TGG GCC CTG CTG CCA GCT GGG CAT GCA GGT    1200

TGT GGC AGG ACT GGG TGA GGT GAA AAG CTG CAG GCG CTG CTG CCG GAC    1248

ACG CTG CAT GGG CTA CCC TGT GTA GCT GCC GCC ACT AGG GGA GGG GGT    1296

TTG TAG CTG TCG AGC TTG CCC CAT GGA TGA AGC TGT GTA GTG GTG CAG    1344

GGA GTA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CTT GCA GGA GAT GTC TTG CGT CGG    1392

GAG GAG TGT TGG GCA GTG TAG ATG CTA TGA TTG TAT CTT AAT GCT GAA    1440

GCC TTT AGG GGA GCG ACA CTT AGT GCT GGG CAG GCA ACG CCC TGC AAG    1488

GTG CAG GCA CAA GCT AGG CTG GAC GAG GAC TCG GTG GCA GGC AGG TGA    1536

AGA GGT GCG GGA GGG TGG TGC CAC ACC CAC TGG GCA AGA CCA TGC TGC    1584

AAT GCT GGC GGT GTG GCA GTG AGA GCT GCG TCA TTA ACT GGG CTA TGG    1632

ATT GTT TGA GCA GTC TCA CTT ATT CTT TGA TAT AGA TAC TGG TCA GGC    1680

AGG TCA GGA GAG TGA GTA TGA ACA AGT TGA GAG GTG GTG CGC TGC CCC    1728

TGC GCT TAT GAA GCT GTA ACA ATA AAG TGG TTC                        1771

(2)关于SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征

     (A)长度：1771核苷酸

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线型

 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GGC ACG AGC UUG CAC GCA AGU CAG CGC GCG CAA GUC AAC ACC UGC CGG      48

UCC ACA GCC UCA AAU AAU AAA GAG CUC AAG CGU UUG UGC GCC UCG ACG      96

UGG CCA GUC UGC ACU GCC UUG AAC CCG CGA GUC UCC CGC CGC ACU GAC     144

UGC CAU AGC ACA GCU AGA CGA AUG CAG CUA GCA GCG ACA GUA AUG UUG     192

GAG CAG CUU ACC GGA AGC GCU GAG GCA CUC AAG GAG AAG GAG AAG GAG     240

GUU GCA GGC AGC UCU GAC GUG UUG CGU ACA UGG GCG ACC CAG UAC UCG     288

CUU CCG UCA GAA GAG UCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CUG AAG AAU GCC     336

UAC AAG CCA CCA CCU UCC GAC ACA AAG GGC AUC ACA AUG GCG CUA CGU     384

GUC AUC GGC UCC UGG GCC GCA GUG UUC CUC CAC GCC AUU UUU CAA AUC     432

AAG CUU CCG ACC UCC UUG GAC CAG CUG CAC UGG CUG CCC GUG UCA GAU     480

GCC ACA GCU CAG CUG GUU AGC GGC ACG AGC AGC CUG CUC GAC AUC GUC     528

GUA GUA UUC UUU GUC CUG GAG UUC CUG UAC ACA GGC CUU UUU AUC ACC     576

ACG CAU GAU GCU AUG CAU GGC ACC AUC GCC AUG AGA AAC AGG CAG CUU     624

AAU GAC UUG UUG GGC AGA GUA UGC AUC UCC UUG UAC GCC UGG UUU GAU     672

UAC AAC AUG CUG CAC CGC AAG CAU UGG GAG CAC CAC AAC CAC ACU GGC     720

GAG GUG GGC AAG GAC CCU GAC UUC CAC AGG GGA AAC CCU GGC AUU GUG     768

CCC UGG UUU GCC AGC UUC AUG UCC AGC UAC AUG UCG AUG UGG CAG UUU     816

GCG CGC CUC GCA UGG UGG ACG GUG GUC AUG CAG CUG CUG GGU GCG CCA     864

AUG GCG AAC CUG CUG GUG UUC AUG GCG GCC GCG CCC AUC CUG UCC GCC     912

UUC CGC UUG UUC UAC UUU GGC ACG UAC AUG CCC CAC AAG CCU GAG CCU     960

GGC GCC GCG UCA GGC UCU UCA CCA GCC GUC AUG AAC UGG UGG AAG UCG    1008

CGC ACU AGC CAG GCG UCC GAC CUG GUC AGC UUU CUG ACC UGC UAC CAC    1056

UUC GAC CUG CAC UGG GAG CAC CAC CGC UGG CCC UUC GCC CCC UGG UGG    1104

GAG CUG CCC AAC UGC CGC CGC CUG UCU GGC CGA GGU CUG GUU CCU GCC    1152

UAG CUG GAC ACA CUG CAG UGG GCC CUG CUG CCA GCU GGG CAU GCA GGU    1200

UGU GGC AGG ACU GGG UGA GGU GAA AAG CUG CAG GCG CUG CUG CCG GAC    1248

ACG CUG CAU GGG CUA CCC UGU GUA GCU GCC GCC ACU AGG GGA GGG GGU    1296

UUG UAG CUG UCG AGC UUG CCC CAU GGA UGA AGC UGU GUA GUG GUG CAG    1344

GGA GUA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CUU GCA GGA GAU GUC UUG CGU CGG    1392

GAG GAG UGU UGG GCA GUG UAG AUG CUA UGA UUG UAU CUU AAU GCU GAA    1440

GCC UUU AGG GGA GCG ACA CUU AGU GCU GGG CAG GCA ACG CCC UGC AAG    1488

GUG CAG GCA CAA GCU AGG CUG GAC GAG GAC UCG GUG GCA GGC AGG UGA    1536

AGA GGU GCG GGA GGG UGG UGC CAC ACC CAC UGG GCA AGA CCA UGC UGC    1584

AAU GCU GGC GGU GUG GCA GUG AGA GCU GCG UGA UUA ACU GGG CUA UGG    1632

AUU GUU UGA GCA GUC UCA CUU AUU CUU UGA UAU AGA UAC UGG UCA GGC    1680

AGG UCA GGA GAG UGA GUA UGA ACA AGU UGA GAG GUG GUG CGC UGC CCC    1728

UGC GCU UAU GAA GCU GUA ACA AUA AAG UGG UUC                        1771

(2)关于SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征

    (A)长度：1771个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线型

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GGC ACG AGC TTG CAC GCA AGT CAG CGC GCG CAA GTC AAC ACC TGC CGG     48

TCC ACA GCC TCA AAT AAT AAA GAG CTC AAG CGT TTG TGC GCC TCG ACG     96

TGG CCA GTC TGC ACT GCC TTG AAC CCG CGA GTC TCC CGC CGC ACT GAC    144

TGC CAT AGC ACA GCT AGA CGA ATG CAG CTA GCA GCG ACA GTA ATG TTG    192

                            Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu

                                              5

GAG CAG CTT ACC GGA AGC GCT GAG GCA CTC AAG GAG AAG GAG AAG GAG    240

Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu

 10                  15                  20                  25

GTT GCA GGC AGC TCT GAC GTG TTG CGT ACA TGG GCG ACC CAG TAC TCG    288

Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser

                 30                  35                  40

CTT CCG TCA GAA GAG TCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CTG AAG AAT GCC    336

Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala

             45                  50                  55

TAC AAG CCA CCA CCT TCC GAC ACA AAG GGC ATC ACA ATG GCG CTA CGT    384

Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Arg

         60                  65                  70

GTC ATC GGC TCC TGG GCC GCA GTG TTC CTC CAC GCC ATT TTT CAA ATC    432

Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile

     75                  80                  85

AAG CTT CCG ACC TCC TTG GAC CAG CTG CAC TGG CTG CCC GTG TCA GAT    480

Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp

 90                  95                 100                 105

GCC ACA GCT CAG CTG GTT AGC GGC ACG AGC AGC CTG CTC GAC ATC GTC    528

Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val

                110                 115                 120

GTA GTA TTC TTT GTC CTG GAG TTC CTG TAC ACA GGC CTT TTT ATC ACC    576

Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr

            125                 130                 135

ACG CAT GAT GCT ATG CAT GGC ACC ATC GCC ATG AGA AAC AGG CAG CTT     624

Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu

        140                 145                 150

AAT GAC TTC TTG GGC AGA GTA TGC ATC TCC TTG TAC GCC TGG TTT GAT     672

Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp

    155                 160                 165

TAC AAC ATG CTG CAC CGC AAG CAT TGG GAG CAC CAC AAC CAC ACT GGC     720

Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly

170                 175                 180                 185

GAG GTG GGC AAG GAC CCT GAC TTC CAC AGG GGA AAC CCT GGC ATT GTG     768

Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val

                190                 195                 200

CCC TGG TTT GCC AGC TTC ATG TCC AGC TAC ATG TCG ATG TGG CAG TTT     816

Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe

            205                 210                 215

GCG CGC CTC GCA TGG TGG ACG GTG GTC ATG CAG CTG CTG GGT GCG CCA     864

Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro

        220                 225                 230

ATG GCG AAC CTG CTG GTG TTC ATG GCG GCC GCG CCC ATC CTG TCC GCC     912

Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala

    235                 240                 245

TTC CGC TTG TTC TAC TTT GGC ACG TAC ATG CCC CAC AAG CCT GAG CCT     960

Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro

250                 255                 260                 265

GGC GCC GCG TCA GGC TCT TCA CCA GCC GTC ATG AAC TGG TGG AAG TCG    1008

Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser

                270                 275                 280

CGC ACT AGC CAG GCG TCC GAC CTG GTC AGC TTT CTG ACC TGC TAC CAC    1056

Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His

            285                 290                 295

TTC GAC CTG CAC TGG GAG CAC CAC CGC TGG CCC TTC GCC CCC TGG TGG    1104

Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp

        300                 305                 310

GAG CTG CCC AAC TGC CGC CGC CTG TCT GGC CGA GGT CTG GTT CCT GCC    1152

Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala

    315                 320                 325

TAG CTG GAC ACA CTG CAG TGG GCC CTG CTG CCA GCT GGG CAT GCA GGT    1200

TGT GGC AGG ACT GGG TGA GGT GAA AAG CTG CAG GCG CTG CTG CCG GAC    1248

ACG CTG CAT GGG CTA CCC TGT GTA GCT GCC GCC ACT AGG GGA GGG GGT    1296

TTG TAG CTG TCG AGC TTG CCC CAT GGA TGA AGC TGT GTA GTG GTG CAG    1344

GGA GTA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CTT GCA GGA GAT GTC TTG CGT CGG    1392

GAG GAG TGT TGG GCA GTG TAG ATG CTA TGA TTG TAT CTT AAT GCT GAA    1440

GCC TTT AGG GGA GCG ACA CTT AGT GCT GGG CAG GCA ACG CCC TGC AAG    1488

GTG CAG GCA CAA GCT AGG CTG GAC GAG GAC TCG GTG GCA GGC AGG TGA    1536

AGA GGT GCG GGA GGG TGG TGC CAC ACC CAC TGG GCA AGA CCA TGC TGC    1584

AAT GCT GGC GGT GTG GCA GTG AGA GCT GCG TGA TTA ACT GGG CTA TGG    1632

ATT GTT TGA GCA GTC TCA CTT ATT CTT TGA TAT AGA TAC TGG TCA GGC    1680

AGG TCA GGA GAG TGA GTA TGA ACA AGT TGA GAG GTG GTG CGC TGC CCC    1728

TGC GCT TAT GAA GCT GTA ACA ATA AAG TGG TTC                        1771

(2)关于SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征

    (A)长度：329个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

   (C)拓扑结构：线型

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

                            Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu

                                              5

Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu

 10                  15                  20                  25

Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser

                 30                  35                  40

Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala

             45                  50                  55

Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Arg

         60                  65                  70

Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile

     75                  80                  85

Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp

 90                  95                 100                 105

Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val

                110                 115                 120

Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr

            125                 130                 135

Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu

        140                 145                 150

Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp

    155                 160                 165

Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly

170                 175                 180                 185

Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val

                190                 195                 200

Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe

            205                 210                 215

Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro

        220                 225                 230

Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala

    235                 240                 245

Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro

250                 255                 260                 265

Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser

                270                 275                 280

Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His

            285                 290                 295

Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp

        300                 305                 310

Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala

    315                 320                 325

Claims (17)

1.含有与SEQ ID NO：1或2至少85％相同的核苷酸序列的分离核酸，其中所述核苷酸序列编码具有β-胡萝卜素C-4加氧酶活性的多肽。

2.如权利要求1所述的分离核酸，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO：1和2中166至1152位核苷酸所列出的序列。

3.一种具有β-胡萝卜素C-4-加氧酶活性的分离多肽，其中包含由与SEQ ID NO：1或2至少85％相同的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

4.权利要求3的分离多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列至少90％相同。

5.含有如权利要求1所述核酸的重组载体DNA分子。

6.含有如权利要求5所述的重组载体DNA分子的重组宿主细胞。

7.含有如权利要求1所述的核酸的重组宿主细胞。

8.一种生产叶黄素的方法，所述叶黄素选自虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、隐黄素、异隐黄素、羟基-β-胡萝卜素-4-酮、玉米黄素、adonirubin、adonixanthin或其组合，该方法包括以下步骤：

(a)提供如权利要求6所述的重组宿主细胞，该宿主细胞具有β-胡萝卜素生物合成；

(b)培养所述宿主细胞；及

(c)从所述宿主细胞中提取叶黄素。

9.一种生产叶黄素的方法，所述叶黄素选自虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、隐黄素、异隐黄素、羟基-β-胡萝卜素-4-酮、玉米黄素、adonirubin、adonixanthin或其组合，该方法包括以下步骤：

(a)提供如权利要求7所述的重组宿主细胞，该宿主细胞具有β-胡萝卜素生物合成；

(b)培养所述宿主细胞；及

(c)从所述宿主细胞中提取该叶黄素。

10.一种食品添加剂，其中含有如权利要求6所述的宿主细胞。

11.一种食品添加剂，其中含有如权利要求7所述的宿主细胞。

12.一种转基因植物细胞，其表达包含与SEQ ID NO：1或2至少85％相同的核苷酸序列的转基因，所述核苷酸序列编码具有β-胡萝卜素C-4-加氧酶活性的多肽。

13.如权利要求12所述的转基因植物细胞，其中所述表达在含有色体的组织中最高。

14.一种重组DNA载体，其中包含编码将蛋白质指导进入植物叶绿体或有色体的多肽的第一多核苷酸，以及符合读框的、与SEQ IDNO：1或2至少85％相同的第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码具有β-胡萝卜素C-4-加氧酶活性的多肽。

15.如权利要求14所述的重组DNA载体，其中所述第一多核苷酸衍生自番茄的Pds基因。

16.一种重组DNA载体，其中包含编码可指导蛋白质进入植物叶绿体或有色体的多肽的第一多核苷酸，以及符合读框的第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码与SEQ ID NO：4至少90％相同、并且具有β-胡萝卜素C-4-加氧酶活性的多肽。

17.如权利要求16所述的重组DNA载体，其中所述第一多核苷酸衍生自番茄的Pds基因。

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