CN1653174A - 用于提高植物含油量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过表达优选来自酿酒酵母的酵母甘油－3－磷酸脱氢酶(G3PDH)来提高植物，优选植物种子的含油量的方法。本发明还涉及用于在植物，优选植物种子中表达酵母G3PDH的表达构建体、表达酵母G3PDH的转基因植物、以及所述转基因植物用于生产食品、饲料、种子、药物或精细化学药品的用途，特别是用于生产油的用途。
Description
技术领域
本发明涉及通过表达优选来自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的酵母甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)来提高植物(优选植物种子)的含油量的方法。本发明还涉及用于在植物优选植物种子中表达酵母G3PDH的表达构建体、表达酵母G3PDH的转基因植物、以及所述转基因植物用于生产食品、饲料、种子、药物或精细化学药品，特别是用于生产油的用途。
背景技术
在传统和现代植物育种，特别是植物生物技术中极其感兴趣的是提高植物特别是植物种子的含油量。由于营养或工业应用增加了植物油的消耗，因此增加或修饰植物油的可能性日益成为当前研究的主题(例如Tpfer等人，1995，Science，268：681-686)。其目的尤其在于提高种子油的脂肪酸含量。
同样特别有意义的是可以由植物油获得的脂肪酸。例如，它们可以用作增塑剂、润滑剂、表面活性剂、化妆品等的基质，而且在食品和饲料工业中可以用作有价值的基质。由此，例如，特别感兴趣的是提供具有中等链长脂肪酸的菜籽油，因为它们是表面活性剂生产中特别需要的。
通过重组方法对植物代谢途径定向修饰能够以有利方式修饰植物代谢，而这在使用传统育种方法时只有在经过复杂的过程后才能够实现或根本无法实现。由此，不常见脂肪酸，例如特定的多不饱和脂肪酸，只在某些植物中合成或在植物中根本不合成，因此只能通过在转基因植物中表达相关酶来进行生产(例如Millar等人，2000，Trends Plant Sci，5：95-101)。
三酰甘油酯和其它脂质从脂肪酸合成。脂肪酸生物合成和三酰甘油酯生物合成由于区室化的原因可以看成是分开的生物合成途径，但是从终产物的角度则可以看成是单一的生物合成途径。脂质合成可以分成两部分机制，一部分可以称为“原核机制”，而另一部分可以称为“真核机制”(Browse等人，1986，Biochemical J，235：25-31；Ohlrogge和Browse，1995，Plant Cell，7：957-970)。原核机制定位于质体内，包括游离脂肪酸的生物合成及将它们输出至细胞质，在此处它们以脂肪酸酰基-CoA酯的形式进入真核机制，并由甘油-3-磷酸(G3P)酯化形成磷脂酸(PA)。PA是中性和极性脂质的合成起点。中性脂质在内质网上通过Kennedy途径合成(Voelker，1996，Genetic Engineering(遗传工程)，Setlow编，18：111-113；Shankline和Cahoon，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol，49：611-649；Frentzen，1998，Lipids，100：161-166)。除了三酰甘油酯的生物合成，G3P在甘油合成中也发挥作用(例如出于渗透调节的目的和例如抵抗低温协迫的目的)。
对合成至关重要的G3P由甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)还原磷酸二羟丙酮(DHAP)而合成，G3PDH也称为磷酸二羟丙酮还原酶。通常，NADH担当还原性共底物(EC 1.1.1.8)。另一类甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.99.5)利用FAD作为共底物(cosubstrate)。这类酶催化DHAP转变成G3P的反应。在真核细胞中，这两类酶分布于不同的区室内，依赖NAD的位于细胞质中，而依赖FAD的位于线粒体中(对于酿酒酵母，参阅例如Larsson等人，1998，Yeast，14：347-357)。EP-A 0 353 049描述了来自芽孢杆菌的不依赖NAD的G3PDH。在酿酒酵母中同样鉴定了不依赖NAD的G3PDH(Miyata X、Nagahisa M，1969，Plant Cell Physiol，10(3)：635-643)。
G3PDH是原核细胞和真核细胞中至关重要的酶，除了在脂质生物合成中发挥功能，其还是负责通过作用于NAD+/NADH比率来维持细胞氧化还原状态的酶之一。在酿酒酵母中缺失GPD2基因(这种酵母中的两种G3PDH同种型之一)导致厌氧条件下的生长减缓。另外，G3PDH似乎在酵母的应激反应中发挥作用，并主要针对渗透压协迫起作用。在酿酒酵母中缺失GPD1基因引起对氯化钠的超敏性。
现有技术中已经描述了昆虫(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、Drosophila virilis)、植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata))、哺乳动物(人(Homo sapiens)、小家鼠(Musmusculus)、野猪(Sus scrofa)、褐家鼠(Rattus norvegicus))、鱼(鲑(Salmo salar)、美洲胡瓜鱼(Osmerus mordax))、鸟(Ovis aries)、两栖动物(光滑爪蟾(Xenopus laevis))、线虫(Caenorhabditis elegans)、藻类和细菌的G3PDH序列。
植物细胞具有至少两种G3PDH同种型，一种细胞质同种型和一种质体同种型(Gee RW等人，1988，Plant Physiol，86：98-103；Gee RW等人，1988，Plant Physiol，87：379-383)。在植物中，甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性首先是在马铃薯块茎中发现的(Santora GT等人，1979，ArchBiochem Biophys，196：403-411)。另外，在其它植物诸如豌豆、玉米或大豆中检测到定位于细胞质和质体中的G3PDH活性(Gee RW等人，1988，Plant Physiol，86(1)：98-103)。另外，已经鉴定了来自藻类的G3PDH，诸如来自杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)的两种质体G3PDH同种型和一种细胞质G3PDH同种型(Gee R等人，1993，Plant Physiol，103(1)：243-249；Gee R等人，1989，Plant Physiol，91(1)：345-351)。对于来自披针叶萼距花的植物G3PDH，曾有人建议通过在植物中进行过表达来提高含油量或转变脂肪酸模式(WO 95/06733)。然而，这些效果尚未证实。
已经描述了细菌G3PDH及其功能(Hsu和Fox，1970，J Bacteriol，103：410-416；Bell，1974，J Bacterial，117：1065-1076)。
WO 01/21820描述了用于提高压力耐受性和改变贮藏油的脂肪酸组成进行的突变型大肠杆菌G3PDH异源表达。突变型大肠杆菌G3PDH(gpsA2FR)展示单一氨基酸替代，致使来自G3P的抑制作用降低。gpsA2FR突变体的异源表达产生了C16脂肪酸含量提高且由此C18脂肪酸含量降低的甘油酯。脂肪酸模式的修饰相对较小：观察到16:0脂肪酸提高2-5％，16:3脂肪酸提高1.5-3.5％，而18:2和18:3脂肪酸降低2-5％。总甘油酯含量保持不变。
还描述了来自酵母(子囊菌纲Ascomycetes)的G3PDH，所述酵母为
例如
a)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Pidoux AL等人，1990，Nucleic Acids Res，18(23)：7145；GenBank Acc.-NO.X56162；OhmiyaR等人，1995，Mol Microbiol，18(5)：963-973；GenBank Acc.-NO.D50796、D50797)、
b)Yarrowia lipolytica(GenBank Acc.-NO.AJ250328)、
c)Zygosaccharomyces rouxii(Iwaki T等人，Yeast，2001，18(8)：737-744；GenBank Acc.-NO.AB047394、AB047395、AB047397)、
d)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Albertyn J等人，1994，Mol CellBiol，14(6)：4135-4144；Albertyn J等人，1992，FEBS Lett，308(2)：130-132；Merkel JR等人，1982，Anal Biochem，122(1)：180-185；Wang HT等人，1994，J Bacteriol，176(22)：7091-7095；Eriksson P等人，1995，Mol Microbiol，17(1)：95-107；GenBankAcc.-NO.U04621、X76859、Z35169)、
e)Emericella nidulans(GenBank Acc.-NO.AF228340)、或
f)汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(GenBank Acc.-NO.AF210060)。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于提高植物含油量的候选方法。我们已经发现通过本发明可以实现这个目的。
本发明的第一方面包括提高植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料的总含油量的方法，包括
a)使酵母甘油-3-磷酸脱氢酶在所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中转基因表达，和
b)选择植物生物体，其中所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料的总含油量与起始生物体相比得到了提高。
令人惊讶的是，已经发现酵母蛋白质Gpdlp(来自酿酒酵母的G3PDH；SEQ ID NO：2)在拟南芥种子中的种子特异性异源表达导致三酰甘油酯(贮藏油)含量显著提高。与野生型对照植株相比，含油量提高了大约22％，在一个转基因品系中甚至提高了41％(见图1)。酵母甘油-3-磷酸脱氢酶的转基因表达对转化植株的生长和其它特性没有不利影响。由于G3PDH在所有植物生物体中都是生物合成关键酶，因此，除了作为模式植物的拟南芥以外，依照本发明的方法原则上可以应用于所有植物物种。依照本发明的方法优选应用于天然已具有高油含量和/或用于油的工业生产的油料作物。
“植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料”通常应理解为意指能够进行光合作用的任何单细胞或多细胞生物体或其细胞、组织、部分或繁殖材料(诸如种子或果实)。出于本发明的目的，包括植物界的所有高等和低等植物属和种。优选一年生和多年生的单子叶和双子叶植物。还包括成熟植株、种子、枝条和幼苗，以及部分、繁殖材料(例如块茎、种子或果实)和由它们衍生的培养物，例如细胞培养物或愈伤组织培养物。
出于本发明的目的，“植物”指植物界的所有高等和低等植物属和种。该术语包括成熟植株、种子、枝条和幼苗，以及部分、繁殖材料、植物器官组织、由其衍生的原生质体、愈伤组织和其它培养物，例如细胞培养物，以及产生功能或结构单位的所有其它种类的植物细胞群。成熟植株指幼苗以后的任何发育阶段的植株。幼苗指处于早期发育阶段的幼小未成熟植株。
“植物”包括所有一年生和多年生的单子叶和双子叶植物，并且包括例如，但不限于以下属的植物：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、核桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、Manihot、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、欧白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solarium)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana)、菊苣属(Cichorium.)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、Salpiglossis)、香瓜属(Cucumis)、Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)、云杉属(Picea)和杨属(Populus)。
优选的植物是来自以下科的植物：苋科(Amaranthaceae)、紫菀科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、Papilionoideae、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、Tetragoniaceae、山茶科(Theaceae)、伞形科(Umbelliferae)。
具体而言，优选的单子叶植物选自单子叶作物，诸如禾本科，诸如水稻、玉米、小麦或其它谷类诸如大麦、粟和高粱、黑麦、黑小麦或燕麦、和甘蔗、以及所有草类。
本发明极其特别优选用于双子叶植物生物体。具体而言，优选的双子叶植物选自双子叶作物，诸如
-紫菀科(Asteraceae)，诸如向日葵、万寿菊或金盏花等，
-菊科(Compositae)，尤其是莴苣属(Lactuca)，非常特别的是物种莴苣(L.sativa)等，
-十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属(Brassica)，非常特别的是物种欧洲油菜(B.napus)、芸苔(B.campestris)、卷心菜(B.oleracea cv Tastie)、花椰菜(B.oleracea cv Snowball Y)和椰菜(B.oleracea cv Emperor)和其它甘蓝；和拟南芥属(Arabidopsis)，非常特别的是物种拟南芥(A.thaliana)和水芹或canola等，
-葫芦科(Cucurbitaceae)，诸如甜瓜、南瓜或夏南瓜等，
-豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，非常特别的是物种大豆(G.max)、黄豆、和紫花苜蓿、豌豆、豆类或花生等，
-茜草科(Rubiaceae)，优选Lamiidae亚类，诸如小果咖啡(Coffea arabica)或大果咖啡(Coffea liberica)(咖啡树)等，
-茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，非常特别的是物种番茄(L.esculentum)，茄属(Solanum)，非常特别的是物种马铃薯(S.tuberosum)和茄(S.melongena)和辣椒属(Capsicum)，非常特别的是物种辣椒(C.annuum)和烟草或红辣椒等，
-梧桐科(Sterculiaceae)，优选Dilleniidae亚类，诸如可可树(Theobromacacao)等，
-山茶科(Theaceae)，优选Diileniidae亚类，诸如茶(Camellia sinensis)或Thea sinensis(茶树)等，
-伞形科(Umbelliferae)，特别是胡萝卜属(Daucus)(非常特别的是物种胡萝卜(D.carota))，和Apium属(非常特别的是物种旱芹(A.graveolensdulce))等，
以及亚麻籽、棉花、大麻、亚麻、黄瓜、菠菜、胡萝卜、甜菜和各种树、坚果和葡萄物种，特别是香蕉和猕猴桃。
本发明还包括观赏植物、实用或观赏树、花、切花、灌木或草皮。可以作为非限制性实例提及的植物是被子植物，苔藓植物诸如毛茛科(Hepaticae)(liver flowers)和Musci(藓类)；蕨类植物诸如蕨类、木贼和石松；裸子植物诸如松柏类、苏铁属、银杏和买麻藤亚纲(Gnetatae)，蔷薇科(Rosaceae)诸如玫瑰、杜鹃花科(Ericaceae)诸如北美杜鹃和杜鹃、大戟科(Euphorbiaceae)诸如猩猩木和巴豆、石竹科(Caryophyllaceae)诸如石竹、茄科(Solanaceae)诸如矮牵牛、苦苣苔科(Gesneriaceae)诸如非洲紫罗兰、凤仙花科(Balsaminaceae)诸如凤仙花、兰科(Orchidaceae)诸如兰、鸢尾科(Iridaceae)诸如唐菖蒲、鸢尾、小苍兰和番红花、菊科(Compositae)诸如金盏花、牻牛儿苗科(Geraniaceae)诸如天竺葵、百合科(Liliaceae)诸如龙血树(dracena)、桑科(Moraeeae)诸如榕、天南星科(Araceae)诸如cheeseplant等等。
另外，出于本发明的目的，植物生物体还包括具有光合作用活性的生物体，诸如藻类、蓝细菌和藓类。优选的藻类是绿藻诸如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornatum)、团藻属(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)的藻类。特别优选集胞藻属(Synechocystis)。
最优选的是油料作物。油料作物应理解为天然含油量已较高的和/或可用于油的工业生产的植物。这些植物可以具有高含油量和/或具有工业价值的特定脂肪酸组成。优选的植物是脂质含量为至少1％(以重量计)的那些植物。油料作物包括例如：琉璃苣(Borago officinalis)；芸苔属物种诸如芸苔(B.campestris)、欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)；大麻(Cannabis sativa)；红花(Carthamus tinctorius)；椰子(Cocos nucifera)；海甘蓝(Crambe abyssinica)；萼距花属物种(萼距花属物种产生中等链长脂肪酸，其特别是可用于工业应用)；油棕(Elaeis guinensis)；美洲油棕(Elaeis oleifera)；大豆(Glycine max)；陆地棉(即美洲棉，Gossypiumhirsutum)；海岛棉(Gossypium barbadense)；草棉(Gossypiumherbaceum)；向日葵(Helianthus annuus)；亚麻或亚麻籽(Linumusitatissimum)；月见草(Oenothera biennis)；油橄榄(Olea europaea)；稻(Oryza sativa)；蓖麻(Ricinus communis)；胡麻(Sesamum indicum)；小麦属Triticum物种；玉蜀黍(Zea mays)和各种坚果物种，诸如胡桃或杏。
“总含油量”指所有油类的总和，优选三酰甘油酯的总和。
“油类”包括中性和/或极性脂质及其混合物。可以提及表1中所列的油类作为非限制性实例。
表1：植物脂质的类别
| 中性脂质 | 三酰甘油(TAG) |
| 二酰甘油(DAG) | |
| 单酰甘油(MAG) | |
| 极性脂质 | 单半乳糖二酰甘油(MGDG) |
| 双半乳糖二酰甘油(DGDG) | |
| 磷脂酰甘油(PG) | |
| 磷脂酰胆碱(PC) | |
| 磷脂酰乙醇胺(PE) | |
| 磷脂酰肌醇(PI) | |
| 磷脂酰丝氨酸(PS) | |
| 磺基异鼠李糖基二酰甘油 |
中性脂质优选指三酰甘油酯。中性和极性脂质可以包含各种脂肪酸。可以提及表2中所列的脂肪酸作为非限制性实例。
表2：各种脂肪酸(选择)的概述
1链长：双键数目
*在植物中不天然存在
| 命名1 | 名称 |
| 16:0 | 棕榈酸 |
| 16:1 | 棕榈油酸 |
| 16:3 | Roughanic acid |
| 18:0 | 硬脂酸 |
| 18:1 | 油酸 |
| 18:2 | 亚油酸 |
| 18:3 | 亚麻酸 |
| γ-18:3 | γ-亚麻酸 |
| 20:0 | 花生酸 |
| 22:6 | 二十二碳六烯酸(DHA)* |
| 20:2 | 二十碳二烯酸 |
| 20:4 | 花生四烯酸(AA)* |
| 20:5 | 二十碳五烯酸(EPA)* |
| 22:1 | 芥子酸 |
油类优选涉及种子油。
总含油量“提高”指植物或其部分、组织或器官、优选植物种子器官中的含油量提高。在本文中，在相同条件下，与未实施依照本发明的方法因而未修饰的起始植物相比，含油量提高至少5％、优选至少10％、特别优选至少15％、非常特别优选至少20％、最优选至少25％。本文中的条件指与植物的萌芽、栽培或生长有关的所有条件，诸如土壤条件、气候条件、光照条件、施肥、灌溉、植株保护处理等等。
“酵母甘油-3-磷酸酯脱氢酶”(下文称为“酵母G3PDH”)通常指能够将磷酸二羟丙酮(DHAP)转变成甘油-3-磷酸(G3P)-优选使用诸如NADH等共底物-且在酵母中天然表达的所有酶。
酵母指具有明显细胞壁并形成假菌丝体(与霉菌不同)的单细胞真菌类。它们通过出芽和/或裂殖进行无性繁殖(分别是裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和类酵母属(Saccharomycodes))。
包括拟酵母，优选隐球酵母科(Cryptococcaceae)和掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(包括隐球酵母属(Cryptococcus)、球拟酵母属(Torulopsis)、瓶形酵母属(Pityrosporum)、酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、三角酵母属(Trigonopsis)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula以及掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))；和真酵母(也进行有性繁殖的酵母；子囊)，优选内孢霉科(endomycetaceae)和酵母科(saccharomycetaceae)(包括酵母属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、拟内孢霉属(Endomycopsis)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)。最优选的是物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Zygosaccharomyces rouxii、Yarrowialipolitica、Emericella nidulans、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和汉逊有孢圆酵母(Torulasporahansenii)。
酵母G3PDH尤其指具有下列特征作为“必要特征”的多肽：
a)使用NADH作为共底物将磷酸二羟丙酮转变成甘油-3-磷酸(EC1.1.1.8)，和
b)包含至少一个选自下组的序列基序的肽序列：
i)GSGNWGT(A/T)IAK (SEQ ID NO：22)
ii)CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A (SEQ ID NO：26)
iii)(L/V)FXRPYFXV (SEQ ID NO：27)
优选选自下组的序列基序：
iv)GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN (SEQ ID NO：29)
v)NT(K/R)HQNVKYLP (SEQ ID NO：30)
vi)D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL (SEQ ID NO：31)
vii)RA(I/V)SCLKGFE (SEQ ID NO：32)
viii)CGALSGANLA(P/T)EVA (SEQ ID NO：33)
ix)LFHRPYFHV (SEQ ID NO：34)
x)GLGEII(K/R)FG (SEQ ID NO：35)
肽序列特别优选包含至少2或3种、非常特别优选至少4或5种、最优选所有选自序列基序i)、ii)和iii)或者选自序列基序iv)、v)、vi)、vii)、viii)、ix)和x)的序列基序。(括号中的字母指可能出现于该位置的可选氨基酸；例如(V/I)指缬氨酸或异亮氨酸都可能位于该位置)。
此外，除了上述序列基序i)至x)中的至少一种以外，酵母G3PDH可以任选包含选自下组的其它序列基序：
xi)H(E/Q)NVKYL (SEQ ID NO：23)
xii)(D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)
(SEQ ID NO：24)
xiii)(A/G)(I/V)SC(L/I)KG (SEQ ID NO：25)
xiv)G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)
(SEQ ID NO：28)
最优选的是，酵母G3PDH指SEQ ID NO：2所示酵母蛋白质Gpd1p和其功能等价物或以上的功能等价部分。
功能等价物尤其指SEQ ID NO：2所示酵母蛋白质Gpd1p的天然或人工突变体和与上文定义的酵母G3PDH具有相同必要特征的来自其它酵母的同源多肽。突变包括一个或多个氨基酸残基的替代、添加、缺失、倒位或插入。尤其优选SEQ ID NO：4、5、7、9、11、12、14、16、38或40描述的多肽。
使用例如SEQ ID NO：2所示酵母G3PDH序列或编码前者的SEQ IDNO：1所示核酸序列作为搜索序列或探针，通过搜索数据库或筛选基因或cDNA文库，可以容易地找到本发明范围内有利采用的酵母G3PDH。
所述功能等价物与具有SEQ ID NO：2的蛋白质优选至少60％、特别优选至少70％、特别优选至少80％、最优选至少90％同源。
两种多肽之间的同源性应理解为意指氨基酸序列在整个序列长度上的同一性，它是借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，威斯康星大学，Genetics Computer Group(GCG)，麦迪逊，美国)并设置下列参数进行比较而计算得出的：
缺口加权：8 长度加权：2
平均匹配：2，912 平均错配：-2,003
例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的序列应理解为意指当使用上述程序算法和上述参数设置与序列SEQ IDNO：2进行比较时具有至少80％同源性的序列。
功能等价物还包括由与核酸序列SEQ ID NO：1具有至少60％、特别优选至少70％、特别优选至少80％、最优选至少90％同源性的核酸序列编码的那些蛋白质。
两种核酸序列之间的同源性应理解为意指两种核酸序列在整个序列长度上的同一性，它是借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，威斯康星大学，Genetics Computer Group(GCG)，麦迪逊，美国)并设置下列参数进行比较而计算得出的：
缺口加权：50 长度加权：3
平均匹配：10 平均错配：0
例如，在核酸水平上与序列SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的序列应理解为意指当使用上述程序算法和上述参数设置与序列SEQ ID NO：1进行比较时具有至少80％同源性的序列。
功能等价物还包括由在标准条件下与SEQ ID NO：1所示核酸序列杂交的核酸序列或与其互补的核酸序列或其部分编码的且具有酵母G3PDH的必要特征的那些蛋白质。
“标准杂交条件”应作广义理解，但是优选指严谨杂交条件。这些杂交条件描述于例如Sambrook J、F ritsch EF、Maniatis T等人，《MolecularCloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，实验室指南)，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，第9.31-9.57页；或《Current Protocols inMolecular Biology》(分子生物学通用方案)，John Wiley & Sons，纽约，1989，第6.3.1-6.3.6页。例如，洗涤步骤的条件可以选自高严谨条件的范围(大约0.2X SSC，50℃，优选65℃)(20X SSC：0.3M柠檬酸钠、3M NaCl，pH7.0)。杂交过程中也可以采用变性剂，诸如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺时，优选在42℃进行杂交。
本发明还涉及能够确保酵母G3PDH在植物生物体或所述植物生物体的组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中进行转基因表达的转基因表达构建体。
上文给出的定义适用于酵母G3PDH，特别优选由序列SEQ ID NO：2描述的酵母G3PDH的转基因表达。
在所述转基因表达构建体中，编码酵母G3PDH的核酸分子优选可操作连接至少一种确保在植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中进行表达的遗传调控元件(例如启动子)。
尤其优选转基因表达盒，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的核酸序列为：
a)序列SEO ID NO：1、3、6、8、10、13、15、37或39，或
b)根据遗传密码的简并性，由序列SEQ ID NO：1、3、6、8、10、13、15、37或39衍生的序列，
c)与序列SEQ ID NO：1具有至少60％同一性的序列。
可操作连接应理解为意指例如启动子与待表达的编码酵母G3PDH的核酸序列(例如SEQ ID NO：1所示序列)和，如果适当，诸如终止子等其它调控元件的顺序排列，此排列使得每一种调控元件在重组表达核酸序列时都能够发挥其功能。这个目的并非必然要求化学意义上的直接连接。诸如增强子序列等遗传控制序列也能够从远距离位置或事实上从其它DNA分子对靶序列发挥它们的功能。优选的排列是将待重组表达的核酸序列置于担当启动子的序列的后面，使得两种序列彼此共价相连。启动子序列与待重组表达的核酸序列之间的距离优选少于200个碱基对，特别优选少于100个碱基对，非常特别优选少于50个碱基对。
可操作连接和转基因表达盒都可以通过常规重组和克隆技术的手段来实现，这些技术描述于例如Maniatis T、Fritsch EF和Sambrook J，1989，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，实验室指南)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Silhavy TJ、Berman ML和Enquist LW，1984，《Experiments with Gene Fusion》(基因融合实验)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel FM等人，1987，《Current Protocols inMolecular Biology》(分子生物学通用方案)，Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience；和Gelvin等人，1990，《Plant Molecular BiologyManual》(植物分子生物学指南)。然而，还可以将例如具有限制酶特异性切割位点的担当接头的序列或信号肽序列等其它序列置于这两种序列之间。此外，序列的插入可能导致融合蛋白的表达。优选的是，由与待表达核酸序列相连的启动子组成的表达盒可以是载体整合形式，而且可以，例如通过转化，插入植物基因组。
然而，转基因表达盒应理解为也意指将编码酵母G3PDH的核酸序列置于内源植物启动子的后面从而使得后者可以引起酵母G3PDH表达的那些构建体。
优选导入转基因表达盒的启动子是在植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中可操作的那些启动子。在植物生物体中可操作的启动子应理解为意指能够在植物或植物部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中控制基因，特别是外来基因表达的任何启动子。在本文中，表达可以是例如组成型、诱导型或发育依赖性的。
优选下列启动子：
a)组成型启动子
“组成型”启动子指确保在许多、优选所有组织中在植物发育的实质阶段、优选植物发育的所有时间表达的那些启动子(Benfey等人，1989，EMBO J，8：2195-2202)。尤其优选使用植物启动子或源自植物病毒的启动子。尤其优选CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录本启动子(Franck等人，1980，Cell，21：285-294；Odell等人，1985，Nature，313：810-812；Shewmaker等人，1985，Virology，140：281-288；Gardner等人，1986，Plant Mol Biol，6：221-228)或CaMV 19S启动子(US 5,352,650；WO 84/02913；Benfey等人，1989，EMBO J，8：2195-2202)。其它合适的组成型启动子是二磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶小亚基(SSU)启动子(US4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank编号X03677)、来自农杆菌的胭脂碱合酶启动子、TR二元启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛素启动子(Holtorf S等人，1995，Plant Mol Biol，29：637-649)、泛素1启动子(Christensen等人，1992，Plant Mol Biol，18：675-689；Bruce等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86：9692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基的启动子、拟南芥腈水解酶-1基因的启动子(GenBank编号U38846，第3862-5325或5342位核苷酸)或来自小麦的富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO91/13991)，以及本领域技术人员知道的在植物中组成型表达的其它基因启动子。特别优选CaMV 35S启动子和拟南芥腈水解酶-1启动子。
b)组织特异性启动子
还优选对种子具有特异性的启动子，诸如菜豆蛋白启动子(US5,504,200；Bustos MM等人，1989，Plant Cell，1(9)：839-853)、2S清蛋白基因的启动子(Joseffson LG等人，1987，J Biol Chem，262：12196-12201)、豆球蛋白启动子(Shirsat A等人，1989，Mol Gen Genet，215(2)：326-331)、USP(未知种子蛋白质)启动子(Bumlein H等人，1991，Mol Gen Genet，225(3)：459-467)、napin基因启动子(US 5,608,152；Stalberg K等人，1996，L Planta，199：515-519)、蔗糖结合蛋白的启动子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Bumlein H等人，1991，Mol Gen Genet，225：121-128；Bumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-239；Fiedler U等人，1995，Biotechnology(纽约)，13(10)：1090f)、拟南芥属(Arabidopsis)油质蛋白启动子(WO 98/45461)、和芸苔属(Brassica)Bce4启动子(WO 91/13980)。
其它合适的种子特异性启动子是编码高分子量麦谷蛋白(HMWG)、麦醇溶蛋白、分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)或淀粉合酶的基因的那些启动子。其它优选的启动子是容许在诸如玉米、大麦、小麦、黑麦、水稻等单子叶植物中进行种子特异性表达的那些启动子。可以有利的采用lpt2或lpt1基因的启动子(WO 95/15389、WO 95/23230)或WO 99/16890中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、oryzin基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、麦谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或secalin基因的启动子)。
c)化学诱导型启动子
表达盒也可以包含化学诱导型启动子(综述：Gatz等人，1997，AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol，48：89-108)，由此可以在特定时间点控制外源基因在植物中的表达。同样可以使用这些启动子，诸如PRP1启动子(Ward等人，1993，Plant Mol Biol，22：361-366)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，Plant J，2：397-404)、脱落酸诱导型启动子(EP 0 335 528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)。同样合适的是谷胱甘肽S转移酶同种型II基因(GST-II-27)的启动子，它可以由外源施用的安全剂，诸如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺激活(WO93/01294)，而且在单子叶植物和双子叶植物的许多组织中都是可操作的。
特别优选组成型启动子，极其特别优选种子特异性启动子，尤其是napin启动子和USP启动子。
另外，可以将能够在其它植物组织或其它生物体诸如大肠杆菌中进行表达的其它启动子可操作地连接到待表达的核酸序列上。原则上，合适的植物启动子是所有上文所述启动子。
可以将依照本发明的转基因表达盒或转基因载体中存在的核酸序列可操作地连接启动子以外的其它遗传控制序列。术语遗传控制序列应作广义理解，指对依照本发明的表达盒的建立或功能有影响的所有那些序列。遗传控制序列在原核或真核生物体中修饰例如转录和翻译。依照本发明的转基因表达盒优选在每个盒中在待重组表达的核酸序列的5′上游包含植物特异性启动子，而且在3′下游包含终止子序列作为额外的遗传控制序列，并且，如果是适当的，在每个盒中将其它常规调控元件可操作地连接到待重组表达的核酸序列上。
遗传控制序列还包括能够修饰表达控制特性的其它启动子、启动子元件或最低限度启动子。由此，遗传控制序列能够例如引起组织特异性表达，该表达同时还依赖于某些协迫因素。现已描述了针对例如水协迫、脱落酸(Lam E和Chua NH，J Biol Chem，1991，266(26)：17131-17135)和热协迫(Schoffl F等人，1989，Mol Gen Genetics，217(2-3)：246-253)的这些元件。
其它有利的控制序列是例如革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2，以及酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
原则上所有天然启动子及其调控序列，像上文所述的那些，都可用于依照本发明的方法。另外，也可以有利的使用合成的启动子。
遗传控制序列还包括基因的5′非翻译区、内含子或3′非编码区，诸如肌动蛋白-1内含子、或Adh1-S内含子1、2和6(一般参考：《The MaizeHandbook》(玉米手册)，第116章，Freeling和Walbot编，Springer，纽约，1994)。已经证明它们在调控基因表达中可以发挥重要作用。由此，已经证明5′非翻译序列能够增强异源基因的瞬时表达。可以提及烟草花叶病毒5′前导序列(Gallie等人，1987，Nucl Acids Res，15：8693-8711)等作为翻译增强子的实例。它们可能还促进组织特异性(Rouster J等人，1998，Plant J，15：435-440)。
瞬时表达盒可以有利的包含一个或多个称为增强子的序列，它们可操作连接启动子，并使得可以增强核酸序列的重组表达。还可以将其它有利序列诸如其它调控元件或终止子插在待重组表达的核酸序列的3′末端。基因构建体中可以存在待重组表达的核酸序列的一个或多个拷贝。
适合作为控制序列的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信号，优选实质上相应于根癌农杆菌T-DNA多聚腺苷酸化信号的那些信号，特别是Ti质粒pTiACHS(Gielen等人，1984，EMBO J，3：835及以下)的T-DNA基因3(章鱼碱合酶)的那些信号或其功能等价物。特别合适的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。
控制序列应理解为也指可以同源重组或插入宿主生物体基因组或从基因组中除去的那些序列。在同源重组的情况中，例如，可以以定向方式将特定内源基因的编码序列交换为编码dsRNA的序列。诸如cre/lox技术等方法容许组织特异性地及可能地可诱导地由宿主生物体的基因组中除去表达盒(Sauer B，1998，Methods，14(4)：381-392)。在这里，向靶基因添加某些侧翼序列(lox序列)，这样稍后可能通过cre重组酶将它们去除。
重组表达盒及由其衍生的重组载体可以包含其它功能元件。术语功能元件应广义理解，指对依照本发明的表达盒、载体或转基因生物体的生成、复制或功能有影响的所有那些元件。
可以提及的非限制性实例是：
a)赋予抗代谢抑制剂诸如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)、抗生素或杀生物剂(优选除草剂)，诸如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、或膦丝菌素等的抗性的选择标记。特别优选的选择标记是赋予除草剂抗性的那些标记。可以提及下列选择标记作为实例：编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的DNA序列和灭活谷氨酰胺合酶抑制剂的DNA序列(pat和bar基因)、赋予抗Glyphosate(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)、编码Glyphosate降解酶(草甘膦氧化还原酶)的gox基因、deh基因(编码灭活茅草枯的脱卤素酶)、灭活碘酰脲和咪唑酮的乙酰乳酸合酶、和编码降解溴苯腈的腈水解酶的bxn基因、赋予抗生素apectinomycin抗性的aasa基因、赋予链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、赋予卡那霉素或geneticidin抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、赋予碘酰脲除草剂抗性的乙酰乳酸合酶基因(ALS)(例如具有例如S4和/或Hra突变的突变型ALS变体)。
b)编码易于计量的蛋白质并能够通过颜色或酶活性来评估转化效率或者表达部位或时间的报道基因。在本文中极其特别优选的是报道蛋白(Schenborn E、Groskreutz D，Mol Biotechnol，1999，13(1)：29-44)，诸如“绿色荧光蛋白”(GFP)(Sheen等人，1995，Plant Journal，8(5)：777-784)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow等人，1986，Science，234：856-859)、水母发光蛋白基因(Prasher等人，1985，BiochemBiophys Res Commun，126(3)：1259-1268)、β-半乳糖苷酶，其中极其特别优选β-半乳糖苷酶(Jefferson等人，1987，EMBO J，6：3901-3907)。
c)容许依照本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中进行复制的复制起点。可以提及的实例是ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等人，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，实验室指南)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
d)由农杆菌介导的植物转化所需要的元件，诸如T-DNA的左边界或右边界、或vir区。
为了选择成功经历同源重组的细胞或成功转化的细胞，通常还需要导入可以赋予成功经历重组的细胞抗杀生物剂(例如除草剂)、代谢抑制剂诸如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素抗性的选择标记。选择标记容许从未转化细胞中选出转化细胞(McCormick等人，1986，PlantCell Report，5：81-84)。
另外，所述重组表达盒或载体可以包含不编码酵母G3PDH但其重组表达可以导致脂肪酸生物合成进一步增强(作为proOIL的后果)的其它核酸序列。作为非限制实例，可以由编码乙酰-CoA羧化酶(ACC酶)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)、二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)和磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的核酸中选择额外重组表达的此proOIL核酸序列。这些序列对于熟练技术人员而言是已知的，而且易于由数据库或相应植物的合适cDNA文库获得。
通过使用其中存在重组表达盒的载体，可以有利的将依照本发明的表达盒导入生物体或其细胞、组织、器官、部分或种子(优选导入植物或植物细胞、组织、器官、部分或种子)。本发明因此还涉及包含酵母G3PDH的重组表达盒的所述重组载体。
例如，载体可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。可以通过合适的限制性切割位点将表达盒导入载体(优选质粒载体)。首先将由此生成的载体导入大肠杆菌。使用熟练技术人员知道的方法选择正确转化的大肠杆菌，培养，并获得重组载体。限制性分析和测序可用于确认克隆步骤。优选载体是可以将表达盒稳定整合到宿主基因组中的那些载体。
本发明还涉及包含上文定义的酵母G3PDH、酵母G3PDH的转基因表达盒或含有这种表达盒的转基因载体的转基因植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料。
这种转基因植物生物体可以例如通过转化或转染的手段使用相应蛋白质或核酸生成。转化生物体(或转化细胞或组织)的生成需要将所涉及的DNA(例如表达载体)、RNA或蛋白质导入所涉及的宿主细胞。称为转化(或转导或转染)的过程可以使用多种方法实现(Keown等人，1990，Methods in Enzymology，185：527-537)。由此，可以例如通过显微注射或用DNA包被的微粒进行轰击直接导入DNA或RNA。还可以通过化学手段透化处理细胞，例如使用聚乙二醇，从而使得DNA可以通过扩散进入细胞。还可以通过原生质体与其它含DNA的单元诸如微细胞、细胞、溶酶体或脂质体的融合来进行DNA导入。电穿孔是另一种用于导入DNA的合适方法；在这里，通过电脉冲使细胞被可逆透化。将植物部分浸泡在DNA溶液中、以及花粉或花粉管转化也是可以的。这些方法已有描述(例如Bilang等人，1991，Gene，100：247-250；Scheid等人，1991，Mol Gen Genet，228：104-112；Guerche等人，1987，Plant Science，52：111-116；Neuhause等人，1987，Theor Appl Genet，75：30-36；Klein等人，1987，Nature，327：70-73；Howell等人，1980，Science，208：1265；Horsch等人，1985，Science，227：1229-1231；DeBlock等人，1989，Plant Physiology，91：694-701；《Methods for Plant Molecular Biology》(用于植物分子生物学的方法)，Weissbach和Weissbach编，Academic出版公司，1988；和《Methods in Plant Molecular Biology》(植物分子生物学中的方法)，Schuler和Zielinski编，Academic出版公司，1989)。
在植物中，对于瞬时或稳定转化，可以利用已经描述的用于转化和由植物组织或植物细胞再生植株的方法。具体而言，合适的方法有：通过由聚乙二醇诱导的DNA摄取实施的原生质体转化、使用基因枪的生物轰击(biolistic)方法、称为微粒轰击的方法、电穿孔、将干胚胎在含DNA的溶液中孵育、和显微注射。
除了这些“直接”转化技术以外，还可以通过细菌感染(利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转移相应重组Ti质粒或Ri质粒)或转基因植物病毒感染来实现转化。由农杆菌介导的转化最适合于双子叶植物的细胞。这些方法描述于例如Horsch RB等人，1985，Science，225：1229f。
在使用农杆菌时，将表达盒整合到特殊质粒，或是穿梭载体或是二元载体中。若转化将使用Ti或Ri质粒，则至少将Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但是在大多数情况中是右边界和左边界，连接到待导入的表达盒作为侧翼区。
优选使用二元载体。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中都能复制。通常，它们包含选择标记基因和接头或多接头，侧翼是T-DNA右和左边界序列。可以将它们直接转化到农杆菌中(Holsters等人，1978，Mol Gen Genet，163：181-187)。选择标记基因，例如赋予卡那霉素抗性的nptII基因，使得可以选择经转化的农杆菌。在这种情况中担当宿主生物体的农杆菌应当已经包含具有vir区的质粒。后者是将T-DNA转移到植物细胞中所需要的。以这种方式转化的农杆菌可用于转化植物细胞。已经深入研究并描述了T-DNA用于转化植物细胞的用途(EP 120 516；Hoekema，《The BinaryPlant Vector System》(二元植物载体系统)，Offsetdrukkerij KantersB.V.、Alblasserdam，第五章；An等人，1985，EMBO J，4：277-287)。已知多种二元载体，其中一些是商品化的，诸如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories公司，美国)。
已经描述了适于在植物中表达的其它启动子(Rogers等人，1987，Methin Enzymol，153：253-277；Schardl等人，1987，Gene，61：1-11；Berge等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86：8402-8406)。
直接转化技术适用于任何生物体和细胞类型。在将DNA或RNA注射或电穿孔到植物细胞中的情况下，所用质粒不必达到任何特定要求。可以使用简单的质粒，诸如pUC系列的质粒。若要由转化细胞再生完整植株，则质粒上必需存在额外选择标记基因。
当选择标记是插入DNA的一部分时，可以由未转化细胞选择稳定转化的细胞，即插入DNA被整合到宿主细胞DNA中的那些细胞。例如，能够赋予抗生素或除草剂(诸如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等等)抗性的任何基因均能够担当标记(见上文)。表达这种标记基因的转化细胞能够在存在杀伤未转化野生型的一定浓度的这种抗生素或除草剂时存活。上文提及了实例，而且优选包括赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(Rathore KS等人，1993，Plant Mol Biol，21(5)：871-884)、赋予卡那霉素抗性的nptII基因、赋予潮霉素抗性的hpt基因、或赋予除草剂草甘膦抗性的EPSP基因。选择标记容许由未转化细胞选择转化细胞(McCormick等人，1986，Plant Cell Reports，5：81-84)。获得的植物能够以常规方式进行繁殖和杂交。应当培养两代或多代以确保基因组整合是稳定的且遗传的。
上述方法描述于例如Jenes B等人，1993，Techniques for GeneTransfer(用于基因转移的技术)，《Transgenic Plant》(转基因植物)，第1卷，Engineering and Utilization(工程和利用)，SD Kung和R Wu编，Academic出版社，第128-132页；和Potrykus，1991，Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol，42：205-225。优选将待表达的构建体克隆到适于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等人，1984，Nucl AcidsRes，12：8711f)。
一旦生成了转化植物细胞，就能够使用熟练技术人员知道的方法获得完整植株。例如，将愈伤组织培养物用作起始材料。可以以已知方式由未分化细胞生物块诱导芽和根的发育。可以将获得的幼苗移植户外并用于育种。
熟练技术人员熟悉用于由植物细胞再生植物部分和完整植株的这些方法。可用于此目的的方法描述于例如Fennell等人，1992，Plant Cell Rep，11：567-570；Stoeger等人，1995，Plant Cell Rep，14：273-278；Jahne等人，1994，Theor Appl Genet，89：525-533。
“转基因”，例如在酵母G3PDH的情况中，指包含所述G3PDH核酸序列的核酸序列、表达盒或载体或者用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体，所有这些构建体都是通过重组方法建立的，其中
a)编码酵母G3PDH的核酸序列或
b)可操作连接a)中所述核酸序列的遗传控制序列，例如在植物生物体中发挥功能的启动子，或
c)a)和b)
并非处于它们的天然遗传环境中或者已经通过重组方法被修饰，修饰有可能是例如一个或多个核苷酸残基的替代、添加、删除、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物体中的天然染色体座位或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况中，优选至少在一定程度上保持核酸序列的天然遗传环境。至少核酸序列的一侧是天然环境，其长度至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，极其特别优选至少5000bp。天然表达盒，例如编码酵母G3PDH的基因的启动子与相应酵母G3PDH基因的天然联合当后者通过非天然的合成(“人工”)方法诸如诱变经过修饰后将成为转基因表达盒。这些方法描述于US 5,565,350；WO 00/15815；还可见上文。
首先，优选作为转基因生物体的宿主或起始生物体是依照上文定义的植物。出于本发明的目的，包括植物界的所有高等和低等植物属和种，特别是用于获得油的植物，诸如油籽油菜、向日葵、芝麻、红花、橄榄树、大豆、玉米、小麦和坚果物种。另外还包括成熟植株、种子、枝条和幼苗，以及由其衍生的部分、繁殖材料和培养物，例如细胞培养物。成熟植株指处于幼苗阶段以后的任何期望的发育阶段的植株。幼苗指处于早期发育阶段的幼小未成熟植株。
可以使用用于生物体转化或转染的上述方法生成转基因生物体。
本发明还涉及依照本发明的转基因生物体以及由其衍生的细胞、细胞培养物、部分-诸如在转基因植物生物体的情况下根、叶等-和转基因繁殖材料诸如种子或果实用于生产食品或饲料、药物或精细化学药品，特别是油、脂肪、脂肪酸或其衍生物的用途。
除了影响含油量，酵母G3PDH在植物中的转基因表达还可以介导其它有利效果，诸如增强对例如渗透压等协迫的抵抗力。通过提高甘油水平，酵母G3PDH赋予针对这种协迫的保护作用，其中甘油担当渗透压保护性物质(osmoprotective substance)。这种渗透压协迫发生于例如盐渍土和盐水中，而且日益成为农业问题。提高协迫耐受力使得可能例如使用常规耕种植物不能茁壮成长的地区用于农业用途。
另外，酵母G3PDH的重组表达能够影响植物生物体中的NADH水平继而影响氧化还原平衡。诸如干旱、高温或低温、紫外线等协迫可以导致NADH水平升高，以及反应性氧(RO)形成增加。酵母G3PDH的转基因表达能够分解在所述协迫条件下积累的过多NADH，从而稳定氧化还原平衡并减轻协迫的影响。
序列简述
1.SEQ ID NO：1
编码酿酒酵母G3PDH(Gpd1p)的核酸序列
2.SEQ ID NO：2
编码酿酒酵母G3PDH(Gpd1p)的蛋白质序列
3.SEQ ID NO：3
编码酿酒酵母G3PDH(Gpd2p)的核酸序列
4.SEQ ID NO：4
编码酿酒酵母G3PDH(Gpd2p)的蛋白质序列
5.SEQ ID NO：5
编码酿酒酵母G3PDH(Gpd2p)且具有第二个可选择起始密码子的蛋白质序列
6.SEQ ID NO：6
编码粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列
7.SEQ ID NO：7
编码粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白质序列
8.SEO ID NO：8
编码粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列
9.SEQ ID NO：9
编码粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白质序列
10.SEQ ID NO：10
编码Yarrowinia lipolytica G3PDH的核酸序列
11.SEQ ID NO：11
编码Yarrowinia lipolytica G3PDH的蛋白质序列
12.SEQ ID NO：12
编码Yarrowinia lipolytica G3PDH且具有第二个可选择密码子的蛋白质序列
13.SEQ ID NO：13
编码Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的核酸序列
14.SEQ ID NO：14
编码Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的蛋白质序列
15.SEQ ID NO：15
编码Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的核酸序列
16.SEQ ID NO：16
编码Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的蛋白质序列
17.SEQ ID NO：17
用于酿酒酵母G3PDH的基于pSUN-USP的表达载体(Gpd1p；1017-2190bp插入片段)
18.SEQ ID NO：18寡核苷酸引物ONP1
5′-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′
19.SEQ ID NO：19寡核苷酸引物ONP2
5′-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3′
20.SEQ ID NO：20寡核苷酸引物ONP3
5′-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′
21.SEQ ID NO：21寡核苷酸引物ONP4
5′-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3′
22-35.SEQ ID NO：22至35：酵母G3PDH的序列基序；指出了可能的序列变异。用基序的变异可以在每种情况中单独存在，但是也可以以不同的相互组合形式存在。
36.SEQ ID NO：36
用于酿酒酵母G3PDH的基于pGPTV-napin的表达载体pGPTV-gpd1
(Gpd1p；gdp1插入片段：第11962-13137bp位；nos终止子：13154
-13408；napin启动子：10807-11951)。
37.SEQ ID NO：37
编码Emericella nidulans G3PDH的核酸序列
38.SEQ ID NO：38
编码Emericella nidulans G3PDH的氨基酸序列
39.SEQ ID NO：39
编码汉逊德巴利酵母G3PDH的核酸序列(部分)
40.SEQ ID NO：40
编码汉逊德巴利酵母G3PDH的氨基酸序列(部分)
附图简述
图1：转基因GPD1p株系的含油量
测量包含酿酒酵母Gpd1p基因的转基因拟南芥株系(G2至G30)T2种子中的TAG含量。测定了相应未转化植株(野生型植株；W1至W10)中的含量用于进行比较。鉴定了含油量显著提高的8个拟南芥株系。所述偏差在每个情况中为3次独立测量的结果。
图2：T3代种子含油量的测定
所示数据是各拟南芥株系的含油量(mg脂质/g干物质(DM))。每个柱代表每个独立株系的6株植株的平均值。每株植株平行分析三次。误差条指示所有数值的标准差。对照植株以“col”标识。下表还显示了各个数据的数值(将对照设置成100％含油量)：
| 株系 含油量(mg/g) 标准差 相对提高％对照 278.1 12.2 100#11 304.6 18.3 110#12 301.4 19.0 108#13 275.2 89.7 99#21 323.2 77.0 116#24 268.9 15.1 97#25 293.6 23.0 106#27 285.6 18.4 103#41 316.1 19.1 114#53 260.3 16.4 94#67 292.0 13.8 105#71 244.1 11.6 88#82 295.6 16.8 106 |
脂质含量在统计学上显著提高的株系以黑柱表示(#11、#21、#41和#67株系)。
图3：对照(“col”)和gdp1转化植株中G3PDH活性的测定
如实施例8中所述测定了各株系的G3PDH活性，并以nmol G3P/分/g鲜重(FW)表示。
| col#11#12#13#21#24#25#27#41#53#67#71#82 | G3PDH活性6.6833743211.89586359.142261248.82107689.884354445.893785955.141793486.7730372520.83256367.4579494712.76700159.047485349.37260033 | STD0.717852291.679416042.254118782.195197771.047985661.260057691.228454093.222209355.420185312.255738160.746783531.598291852.1356558 |
G3PDH活性在统计学上显著提高的株系以黑柱表示(#11、#21、#41和#67株系)。可以看到G3PDH活性提高与脂质含量提高相关。
实施例
一般方法：
除非另外说明，所有化学制剂均来自Fluka(Buchs)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司。限制酶、DNA修饰酶和分子生物学试剂盒来自Amersham-Pharmacia(Freiburg)、Biometra(Gttingen)、Roche(Mannheim)、New England Biolabs(Schwalbach)、Novagen(麦迪逊，威斯康星州，美国)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Qiagen(Hilden)、Stratagen(阿姆斯特丹，荷兰)、Invitrogen(Karlsruhe)和Ambion(剑桥郡，英国)公司。依照制造商的说明书使用所用试剂。
例如，可以以已知方式使用亚磷酰胺法化学合成寡核苷酸(Voet，Voet，第二版，纽约，Wiley出版社，第896-897)。出于本发明的目的而进行的克隆步骤，如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移至硝酸纤维素和尼龙膜、DNA片段的连接、大肠杆菌细胞的转化、细菌培养、噬菌体的增殖和重组DNA的序列分析，如文献所述进行：Sambrook等人，1989，冷泉港实验室出版社，ISBN0-87969-309-6。重组DNA分子使用ABI激光荧光DNA测序仪遵循Sanger法进行测序(Sanger等人，1977，Proc Natl Acad Sci USA，74：5463-5467)。
实施例1：一般方法
植物拟南芥属于高等植物(有花植物)。此植物不但与诸如油菜等十字花科的其它植物物种密切相关，而且与双子叶植物的其它科密切相关。由于其DNA序列或多肽序列的高度同源性，拟南芥可以用作其它植物物种的模式植物。
a)拟南芥植物的培养
将植物在补充0.5％蔗糖的Murashige-Skoog培养基(Ogas等人，1997，Science，277：91-94)或土壤(Focks和Benning，1998，Plant Physiol，118：91-101)中进行培养。为了实现统一的发芽和开花时间，首先将种子放置在培养基上或散播在土壤上，然后于4℃层积保藏两天。开花后标记荚果。然后依照这些标记收获开花后6-20天的荚果。
实施例2：酵母Gpd1基因的克隆
遵循下文描述的方法由酿酒酵母菌株S288C(MatαSUC2 mal melgal2 CUP1 flol flo8-1；Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国)分离基因组DNA：
将100ml培养物于30℃培养至光密度达到1.0。取60ml培养物以3000g离心3分钟。将沉淀重悬于6ml重蒸水，将悬浮液分装于1.5ml小管，并离心弃上清。将沉淀涡旋震荡重悬于200μl溶液A、200μl酚/氯仿(1∶1)和0.3g玻璃珠中，然后进行裂解。在添加200μl pH8.0 TE缓冲液后，将裂解物离心5分钟。向上清液中加入1ml乙醇进行乙醇沉淀。沉淀后，将产生的沉淀溶于添加30μg/ml RNase A的400μl pH8.0 TE缓冲液中。于37℃保温5分钟后，加入18μl pH4.8的3M乙酸钠溶液和1ml乙醇，然后离心收集沉淀的DNA。将DNA沉淀溶于25μl重蒸水中。通过其在260nm处的吸收值确定基因组DNA的浓度。
溶液A：
2％ Triton-X100
1％ SDS
0.1M NaCl
0.01M Tris-HCl pH 8.0
0.001M EDTA
为了克隆Gpd1基因，将分离得到的酵母DNA和寡核苷酸引物ONP1和ONP2用于PCR反应。
ONP1：5’-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3’(SEQ ID NO：18)
ONP2：5’-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3’(SEQ ID NO：19)
PCR反应液(50μl)的组成如下：
5.00μl 5μg基因组酵母DNA
5.00μl 10X缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2
5.00μl 2mM dNTP
1.25μl 各引物(10pmol/μL)
0.50μl Advantage聚合酶
所用Advantage聚合酶来自Clontech公司。
PCR程序：
95℃预变性2分钟，然后进行35个循环：95℃45秒，55℃45秒和72℃2分钟。最后72℃延伸5分钟。
遵循制造商的说明书将PCR产物克隆到载体Pcr2.1-TOPO(Invitrogen)中，得到载体Pcr2.1-gpd1，然后测序证实其序列。
克隆到agro转化载体Pgptv中包括将0.5μg载体Pcr2.1-gpd1与限制酶XhoI(New England Biolabs)保温2小时，随后与Klenow片段(New EnglandBiolabs)保温15分钟。与SpeI保温2小时后，通过凝胶电泳分离DNA片段。从凝胶中切下与载体(3.9kb)毗连的gpd1序列区段1185bp，用Qiagen的“凝胶纯化”试剂盒遵循制造商的说明书进行纯化，用50μl洗脱缓冲液洗脱。将0.1μg载体Pgptv首先用限制性酶SacI消化1小时，然后与Klenow片段(New England Biolabs)保温15分钟。将10μl gpd1片段洗脱液与10ng处理过的Pgptv载体于16℃连接过夜(T4连接酶，New England Biolabs)。然后遵循制造商的说明书将连接产物转化到TOP10细胞(Stratagene)中并进行恰当的选择，得到载体Pgptv-gpd1。测序并使用引物ONP1和ONP2进行PCR以验证阳性克隆。
为了产生载体Psun-USP-gpd1，使用引物ONP3和ONP4对载体Pcr2.1-gpd1进行PCR。
ONP3：5′-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′(SEQ ID NO：20)
ONP4：5′-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3′(SEQ ID NO：21)
PCR反应液(50μl)的组成如下：
5μg pCR2.1-gpd1质粒DNA
5.00μl 10X缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2
5.00μl 2mM dNTP
1.25μl 各种引物(10pmol/μL)
0.50μl Advantage聚合酶
所用Advantage聚合酶来自Clontech公司。
PCR程序：
95℃预变性2分钟，然后进行35个循环：95℃45秒，55℃45秒和72℃2分钟。最后72℃延伸5分钟。
用限制酶NotI消化1190bp的PCR产物24小时。将载体pSUN-USP用NotI消化2小时，然后与碱性磷酸酶(New England Biolabs)一起保温15分钟。将100ng已预处理的gpd1片段和10ng已处理的pGPTV于16℃连接过夜(来自New England Biolabs的T4连接酶)。然后遵循制造商的说明书将连接产物转化到TOP10细胞(Stratagene)并进行恰当的选择，得到载体pSUN-usp-gpd1。测序并使用引物ONP3和ONP4进行PCR以验证阳性克隆。
实施例3：用于植物转化的质粒
诸如pBinAR等二元载体可用于植物的转化(Hfgen和Willmitzer，1990，Plant Science，66：221-230)。可以通过以有义和反义方向将cDNA连接到T-DNA中来构建二元载体。位于cDNA 5′端的植物启动子激活cDNA的转录。多聚腺苷酸化序列位于cDNA的3′端。
用组织特异性启动子获得组织特异性表达。例如，可以通过将napin或LeB4-或USP启动子克隆到cDNA的5′端来获得种子特异性表达。也可以使用任何其它种子特异性启动子元件。CaMV 35S启动子可用于在整株植株中的组成型表达。
其它二元载体实例是载体pSUN-USP和pGPTV-napin，其中克隆了实施例2的片段。载体pSUN-USP包含USP启动子和OCS终止子。载体pGPTV-napin包含截短形式的napin启动子和nos终止子。
将实施例2的片段分别克隆到载体pSUN-USP和pGPTV-napin的多克隆位点中，使gdp1基因的种子特异性表达成为可能。相应的构建体pSUN-USP-gpd1用SEQ ID NO：17描述，而pGPTV-napin(pGPTV-gpd1)中的G3PDH构建体则用SEQ ID NO：36描述。
实施例4：农杆菌的转化
由农杆菌介导的植物转化可以使用例如根癌农杆菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol Gen Genet，204：383-396)或LBA4404(Clontech)来进行。转化可以使用标准转化技术(Deblaere等人，1984，Nucl Acids Res，13：4777-4788)。
实施例5：植物的转化
可以使用标准的转化和再生技术来实现由农杆菌介导的植物转化(Gelvin SB、Schilperoort R，《Plant Molecular Biology Manual》(植物分子生物学指南)，第2版，多德雷赫特，Kluwer学术出版社，1995，in Sect.，Ringbuch Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick BR、Thompson JE，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》(植物分子生物学和生物技术中的方法)，伯克莱屯，CRC出版社，1993，第360页，ISBN 0-8493-5164-2)。
使用Bechthold等人，1993，C.R.Acad Sci Ser III Sci Vie，316：1194-1199的方法通过农杆菌进行了拟南芥转化。
例如，可以通过子叶或下胚轴转化法转化油籽油菜(Moloney等人，1989，Plant Cell Report，8：238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol，91：694-701)。使用抗生素选择农杆菌和植物取决于转化所用的二元载体和农杆菌菌株。油籽油菜的选择通常使用卡那霉素作为植物选择标记来进行。
可以使用例如Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report，13：282-285中描述的技术由农杆菌介导将基因转移到亚麻籽(Linumusitatissimum)中。可以使用例如EP-A-0 0424 047(Pioneer Hi-BredInternational)或EP-A-0 0397 687、US 5,376,543、US 5,169,770(Toledo大学)中描述的方法转化大豆。
使用粒子轰击、由聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳酸硅纤维技术进行的植物转化描述于例如Freeling和Walbot，《The Maize Handbook》(玉米手册)，1993，ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag，纽约。
实施例6：研究经转化生物体中的重组基因产物的表达
在转录和/或翻译水平检测经转化宿主生物体中的重组基因产物的活性。
测定基因转录水平(指示可用于翻译成基因产物的RNA量)的合适方法是如下文所述进行的RNA印迹(参阅Ausubel等人，1988，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学通用方案)，Wiley，纽约，或上文实施例部分)，其中用可检测的标记物(通常是放射性标记或化学发光标记)标记为结合目的基因而设计的引物，以便于当生物体培养物的总RNA被提取、在凝胶上分离、转移至稳定的基质并与此探针保温时，探针的结合和结合程度可以显示此基因mRNA的存在和量。此信息表明了转化基因的转录程度。可以使用多种方法由细胞、组织或器官制备细胞总RNA，所有这些方法都是本领域已知的，例如Bormann，E.R.等人，1992，Mol Microbiol，6：317-326的方法。
Northern杂交：
为了进行RNA杂交，遵循Amasino，1986，Anal Biochem，152：304描述的方法，在添加甲醛的1.25％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分离20μg总RNA或1μg poly(A)+RNA，通过毛细引力使用10xSSC将RNA转移至带正电荷的尼龙膜(Hybond N+，Amersham，Brunswick)上，通过紫外光固定，并用杂交缓冲液(10％硫酸葡聚糖w/v，1M NaCl，1％SDS，100mg鲱鱼精子DNA)于68℃预杂交3小时。在预杂交过程中利用Highprime DNA标记试剂盒(Roche，曼海姆，德国)用α-32P-dCTP(Amersham Pharmacia，不伦瑞克，德国)标记DNA探针。添加标记好的DNA探针后在同一缓冲液中于68℃杂交过夜。于68℃用2xSSC洗两次15分钟，再用1xSSC、1％SDS洗两次30分钟。将密封好的滤膜于-70℃曝光1-14天。
为了研究由此mRNA翻译的蛋白质的存在及其相对量，可以使用诸如Western印迹等标准方法(参阅，例如，Ausubel等人，1988，Current Protocolin Molecular Biology(分子生物学通用方案)，Wiley，纽约)。在此方法中，提取并通过凝胶电泳的手段分离细胞总蛋白，将之转移至诸如硝酸纤维素的基质上并与诸如抗体等与期望蛋白质特异结合的探针一起保温。此探针通常携带便于检测的化学发光或比色标记。所观察到的标记的存在和量表明了细胞中出现的期望突变蛋白质的存在和量。
实施例7：分析重组蛋白对期望产物生产的影响
可以通过在合适的条件(如上所述)下培养已修饰的微生物或已修饰的植物并检测培养基和/或细胞组分中是否有增加的期望产物(即脂质或脂肪酸)产量，从而确定遗传修饰在植物、真菌、藻类、纤毛虫中的作用或对期望化合物(如脂肪酸)产生的影响。这些分析技术是熟练技术人员已知的，包括分光光度法、薄层层析、各种染色方法、酶学和微生物学方法以及高效液相色谱等分析性色谱法(参阅，例如，Ullmann，Encyclopediaof Industrial Chemistry(Ullmann氏工业化学百科全书)，卷A2，第89-90页和第443-613页，VCH，Weinheim，1985；Fallon A等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry(HPLC在生化中的应用)，《Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology》(生化和分子生物学实验室技术)，第17卷；Rehm等人，1993，Biotechnology(生物技术)，第3卷，第3章，“产物回收及纯化”，第469-714页，VCH，Weinheim；Belter PA等人，1988，Bioseparations：downstream processingfor Biotechnology(生物分离：生物技术中的下游加工)，John Wiley & Sons；Kennedy JF和Cabral JMS，1992，Recovery processes for biologicalMaterials(生物学材料的回收方法)，John Wiley & Sons；Shaeiwitz JA和Henry JD，1988，Biochemical Separations(生化分离)，《Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry》(Ullmann氏工业化学百科全书)，卷B3，第11章，第1-27页，VCH，Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，生物技术中的分离和纯化技术，Noyes出版社)。
除了上述方法以外，还可以如Cahoon等人，1999，Proc Natl Acad SciUSA，96(22)：12935-12940，和Browse等人，1986，Analytic Biochemistry，152：141-145所述由植物材料提取植物脂质。脂质或脂肪酸的定性和定量分析描述于如下文献中：Christie，William W，Advances in LipidMethodology(脂质方法学进展)，埃尔/苏格兰，Oily出版社(Oily PressLipid Libary；2)；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide(气相色谱和脂质，应用指南)，埃尔/苏格兰，Oily出版社，1989，Repr.1992，IX，第307页(Oily Press Lipid Library；1)；Progress in Lipid Research(脂质研究中的进展)，牛津，Pergamon出版社，1(1952)-16(1977)，题为：脂肪和其它脂质化学的进展，CODEN。
为了确定化合物生产的总体功效，除了检测发酵终产物外，还可以分析用于产生期望化合物的代谢途径的其它组分，诸如中间产物和次级产物。分析方法包括培养基中营养物量的检测(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)、生物质组成的测定和生长状况的检测、生物合成途径常规代谢物产量的分析和发酵过程中产生的气体的测定。用于这些检测的标准方法参见Applied Microbial Physiology；A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编，IRL出版社，第103-129页、131-163页和165-192页(ISBN：0199635773)及其中引用的参考文献。
其中的一个实例是脂肪酸分析(缩写：FAME，脂肪酸甲酯；GC-MS，气-液色谱/质谱；TAG，三酰基甘油；TLC，薄层层析)。
存在脂肪酸产物的明确证据可以通过Christie及其引用的参考文献中描述的标准分析方法，即GC、GC-MS或TLC对重组生物体的分析来获得(1997，Advances on Lipid Methodology(脂质方法学上的进展)，第4版，Christie，Oily出版社，敦提，119-169；1998，气相色谱/质谱方法，Lipide，33：343-353)。
可以通过超声波、玻璃研磨器中碾磨、液氮和碾磨或其它可用方法破碎待分析材料。破碎后，必须将材料离心。将沉淀物重悬于蒸馏水，于100℃加热10分钟，冰上冷却并再次离心，然后在含0.5M硫酸的甲醇中用2％二甲氧基丙烷于90℃萃取1小时，从而得到水解的油和转甲基化脂质形式的脂质化合物。在石油醚中萃取这些脂肪酸甲酯，最后用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25mm，0.32mm)于170℃-240℃温度梯度进行GC分析20分钟，于240℃进行GC分析5分钟。必须使用可购买获得的(即Sigma)标准品鉴定获得的脂肪酸甲酯的身份。
以下方案被用于对经Gpd1基因转化的拟南芥植物进行定量油分析：
使用Bligh和Dyer，1959，Can J Biochem Physiol，37：911中的方法由种子提取脂质。为此目的，使用Sartoriius(Gottingen)微量天平称取5mg拟南芥种子，置于1.2ml Qiagen微量离心管(Qiagen，Hilden)中。在Retsch(Haan)的MM300 Retsch研钵中将种子材料与500μl氯仿/甲醇(2∶1；含Sigma的单-C17-甘油作为内部标准)一起匀浆并于室温放置20分钟。添加500μl pH7.5 50mM磷酸钾后分离各相。由有机相中取出50μl，用1500μl氯仿稀释，将5μl加到Iatroscan的Chromarods SIII毛细管(SKS，Bechenheim)中。添加样品后，首先在用6∶2∶2氯仿∶甲醇∶甲苯饱和的薄层室中分离15分钟。然后，将毛细管于室温干燥4分钟，然后在用7∶3正己烷∶二乙酯饱和的薄层室中放置22分钟。于室温进一步干燥4分钟后，使用Fraser和Taggart，1988，J Chromatogr，439：404中的方法在IatroscanMK-5(SKS，Bechenheim)中分析样品。为此检测设定以下参数：限幅宽(slice width)50msec，阈值20mv，噪音30，滤噪比(skim ratio)0。利用ChromStar软件(SKS，Beichenheim)，参照内部标准品单-C17-甘油(Sigma)和通过三-C17-甘油(Sigma)建立的校准曲线量化这些数据。
分析含构建体pSUN-USP-gpd1或pGPTV-gpd1的数个独立转基因株系的T2种子以定量测定含油量。用每株系的种子库进行三次独立的提取，分别检测提取物。三次独立的检测值用于计算平均值和标准差。
对含构建体pGPTV-gpd1的株系进行检测的结果显示，与10株野生型植株的测定值相比，在数个(10)转基因株系中含油量显著提高(图1)。对于构建体pSUN-USP-gpd1也检测到了相似的含油量(未显示)。
上述株系的平均含油量为34.86±1.56％，而野生型植株的平均值为27.75±2.64％。这相当于含油量有了7.1％的绝对提高(相对值：25.6％)。
为了证实gpd1效应(含油量提高)的遗传性，种植来自含油量提高的株系的种子和来自含油量未改变的株系的种子。在各个情况下，每个株系种植6株植物，分析种子的含油量和酶活性。用上述方法学测定含油量。所获数据显示于图2中。Col-0和C24拟南芥生态型用作对照。C24是一种以含油量较Col-0高为区别特征称的生态型。这可以表征含油量超过Col-0的株系。由此证明了作为gpd1基因表达结果的含油量提高的遗传性。
实施例8：甘油-3-磷酸脱氢酶活性的测定
另一个目的是证明酶在转基因植物中引起的除了提高含油量以外的其它直接效应。为了测定甘油-3-磷酸脱氢酶活性，每株植物收获两个拟南芥种子荚果，用Geigenberger和Stitt的方法(1993，Planta，189：329-339)进行提取。为此目的，将荚果在液氮下置于研钵中研磨，溶于200μl pH7.4的50mM HEPES、5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、0.1％(w/w)牛血清白蛋白、2mM苯甲脒、2mM氨基-正己酸、0.5mM苯甲基磺酰、0.1％Triton X-100和10％(w/w)甘油，离心5分钟，将上清液分装成等分试样。检测从底物DHAP(磷酸二羟丙酮)和NADH产生的G3P(甘油-3-磷酸)产量以确定G3PDH活性。为此目的，在340nm波长处监测NADH的氧化。
用于活性测定的反应混合物包含pH7.450mM HEPES、4mM DHAP、0.2mM NADH和10μl提取混合物，终体积100μl。室温放置30分钟后，加热终止反应(95℃20分钟)。在对照反应中，通过加热立即终止反应。
甘油-3-磷酸“循环测定法”：将10μl反应混合物加入含200mMTricin、5mM MgCl2(pH8.5)的45μl溶液中，加热(95℃20分钟)破坏剩余的DHAP。将上清液转移到96孔微量滴定板中，用含2个单位G3Pox、130个单位过氧化氢酶、0.4个单位G3PDH和0.12μmol NADH的混合液45μl进行处理。反应于30℃进行，并在Anthos htII微量滴定板读数器中监测340nm处产生的吸收值。用Biolise软件，基于吸收值(mOD*min-1)的下降计算反应速度(gibon Y等人，2002，Plant J，30(2)：221-235)。
转基因株系#11、#21、#41和#67中的酶活性明显高于对照植株中的酶活性(图3)。含油量提高的植物与酶活性提高的植物相关。因此证明了含油量的提高可归因于DHAP转变成G3P的增加，而G3P是油合成的前体。
序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Science GmbH)
<120>用于提高植物含油量的方法
<130>NAE 2166/2002
<140>
<141>
<160>40
<170>PatentIn Ver.2.1
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Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn
1 5 10 15
gct ggt aga aag aga agt tcc tct tct gtt tct ttg aag gct gcc gaa 96
Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu
20 25 30
aag cct ttc aag gtt act gtg att gga tct ggt aac tgg ggt act act 144
Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr
35 40 45
att gcc aag gtg gtt gcc gaa aat tgt aag gga tac cca gaa gtt ttc 192
Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe
50 55 60
gct cca ata gta caa atg tgg gtg ttc gaa gaa gag atc aat ggt gaa 240
Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu
65 70 75 80
aaa ttg act gaa atc ata aat act aga cat caa aac gtg aaa tac ttg 288
Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu
85 90 95
cct ggc atc act cta ccc gac aat ttg gtt gct aat cca gac ttg att 336
Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile
100 105 110
gat tca gtc aag gat gtc gac atc atc gtt ttc aac att cca cat caa 384
Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln
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ttt ttg ccc cgt atc tgt agc caa ttg aaa ggt cat gtt gat tca cac 432
Phe Leu Pro Arq Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His
130 135 140
gtc aga gct atc tcc tgt cta aag ggt ttt gaa gtt ggt gct aaa ggt 480
Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly
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gtc caa ttg cta tcc tct tac atc act gag gaa cta ggt att caa tgt 528
Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys
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Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His
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tgg tct gaa aca aca gtt gct tac cac att cca aag gat ttc aga ggc 624
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gag ggc aag gac gtc gac cat aag gtt cta aag gcc ttg ttc cac aga 672
Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg
210 215 220
cct tac ttc cac gtt agt gtc atc gaa gat gtt gct ggt atc tcc atc 720
Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile
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tgt ggt gct ttg aag aac gtt gtt gcc tta ggt tgt ggt ttc gtc gaa 768
Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu
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ggt cta ggc tgg ggt aac aac gct tct gct gcc atc caa aga gtc ggt 816
Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly
260 265 270
ttg ggt gag atc atc aga ttc ggt caa atg ttt ttc cca gaa tct aga 864
Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg
275 280 285
gaa gaa aca tac tac caa gag tct gct ggt gtt gct gat ttg atc acc 912
Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr
290 295 300
acc tgc gct ggt ggt aga aac gtc aag gtt gct agg cta atg gct act 960
Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr
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tct ggt aag gac gcc tgg gaa tgt gaa aag gag ttg ttg aat ggc caa 1008
Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln
325 330 335
tcc gct caa ggt tta att acc tgc aaa gaa gtt cac gaa tgg ttg gaa 1056
Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu
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aca tgt ggc tct gtc gaa gac ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac caa 1104
Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln
355 360 365
atc gtt tac aac aac tac cca atg aag aac ctg ccg gac atg att gaa 1152
Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu
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gaa tta gat cta cat gaa gat tag 1176
Glu Leu Asp Leu His Glu Asp
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<213>酿酒酵母
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Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe
50 55 60
Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu
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Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu
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Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His
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Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile
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Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu
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Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly
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cat ccg gtg tta tat act cgt cgt gca tat aaa att ttg cct tca aga 96
His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg
20 25 30
tct act ttc cta aga aga tca tta tta caa aca caa ctg cac tca aag 144
Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys
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acc atc gcc aaa gtc att gcg gaa aac aca gaa ttg cat tcc cat atc 336
Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile
100 105 110
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115 120 125
gaa aat ctg acg gat atc ata aat aca aga cac cag aac gtt aaa tat 432
Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr
130 135 140
cta ccc aat att gac ctg ccc cat aat cta gtg gcc gat cct gat ctt 480
Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu
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tta cac tcc atc aag ggt gct gac atc ctt gtt ttc aac atc cct cat 528
Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His
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Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro
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cat gta agg gcc atc tcg tgt cta aaa ggg ttc gag ttg ggc tcc aag 624
His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys
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Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln
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Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu
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Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser
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Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val
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Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu
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Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile
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Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala
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Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys
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His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys
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Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln
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Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His
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275 280 285
Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val
290 295 300
Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu
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Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser
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Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile
340 345 350
Thr Thr Cys Ser Gly Gly ArgAsn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala
355 360 365
Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly
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Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu
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Gin Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu
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Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp
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<213>酿酒酵母
<400>5
Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp
1 5 10 15
His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys
20 25 30
Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr
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Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile
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Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp
65 70 75 80
Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr
85 90 95
Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu
100 105 110
Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His
115 120 125
Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro
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His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys
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Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln
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Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu
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His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln
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Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His
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Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser
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Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val
245 250 255
Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu
260 265 270
Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser
275 280 285
Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile
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305 310 315 320
Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly
325 330 335
Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu
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Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu
355 360 365
Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp
370 375 380
<210>6
<211>1122
<212>DNA
<213>粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1119)
<223>编码G3PDH
<400>6
atg act gtg gct gct ttg aac aaa ctc agc gct ctc tcc gga agt att 48
Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Lys Leu Ser Ala Leu Ser Gly Ser Ile
1 5 10 15
caa aaa tct ttt tca cct aaa ctt att tct gtt ggt atc atc gga tca 96
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Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Cys Gly Glu Asn Ala Lys
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gct cat cct gat att ttc cat cct caa gta cac atg tgg atg tat gaa 192
Ala His Pro Asp Ile Phe His Pro Gln Val His Met Trp Met Tyr Glu
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gag aag att caa cat gag gga aaa gag tgc aat ctc acg gaa gtt ttt 240
Glu Lys Ile Gln His Glu Gly Lys Glu Cys Asn Leu Thr Glu Val Phe
65 70 75 80
aac act act cat gaa aac gtt aaa tat ctc aaa ggt atc aaa tgc cct 288
Asn Thr Thr His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Lys Gly Ile Lys Cys Pro
85 90 95
tct aac gtc ttc gca aac ccg gac att cgt gat gta ggt tca cgt agc 336
Ser Asn Val Phe Ala Asn Pro Asp Ile Arg Asp Val Gly Ser Arg Ser
100 105 110
gac att ctg gta tgg gtt ctc cct cac cag ttc gtt gtg cgt att tgc 384
Asp Ile Leu Val Trp Val Leu Pro His Gln Phe Val Val Arg Ile Cys
115 120 125
aat caa ttg aag gga tgc cta aag aag gat gct gtt gca att tca tgc 432
Asn Gln Leu Lys Gly Cys Leu Lys Lys Asp Ala Val Ala Ile Ser Cys
130 135 140
atc aaa ggt gta tct gtc acc aag gac cgt gtt cgc ctc ttt tct gat 480
Ile Lys Gly Val Ser Val Thr Lys Asp Arg Val Arg Leu Phe Ser Asp
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att atc gaa gaa aac acg gga atg tat tgt ggc gtt ctc tct ggc gcc 528
Ile Ile Glu Glu Asn Thr Gly Met Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala
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gga tat ttg cct aat agt tct gtt aat ccc cgc tat act cct aag act 624
Gly Tyr Leu Pro Asn Ser Ser Val Asn Pro Arg Tyr Thr Pro Lys Thr
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atc caa gct ttg ttt aac cgt ccc tac ttc cgt gtc aac att gtt gag 672
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Asp Val Pro Gly Val Ala Leu Gly Gly Ala Leu Lys Asn Ile Val Ala
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Val Ala Ala Gly Ile Ile Asp Gly Leu Glu Leu Gly Asp Asn Thr Lys
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tct gct gtt atg cgc att ggc ctt ctg gaa atg cag aaa ttc ggc agg 816
Ser Ala Val Met Arg Ile Gly Leu Leu Glu Met Gln Lys Phe Gly Arg
260 265 270
atg ttt ttc gat tgt aag cct ctt act atg agc gag gaa tct tgt ggc 864
Met Phe Phe Asp Cys Lys Pro Leu Thr Met Ser Glu Glu Ser Cys Gly
275 280 285
ata gcc gat tta att aca act tgc tta ggc ggc cgt aac cac aaa tgc 912
Ile Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys Leu Gly Gly Arg Asn His Lys Cys
290 295 300
gct gtg gca ttt gtc aag aca gga aag ccc atg cat gtt gtt gaa caa 960
Ala Val Ala Phe Val Lys Thr Gly Lys Pro Met His Val Val Glu Gln
305 310 315 320
gaa ctt ctt gat ggt cag aag ttg caa ggt gca gct acc gcg aag gag 1008
Glu Leu Leu Asp Gly Gln Lys Leu Gln Gly Ala Ala Thr Ala Lys Glu
325 330 335
gtt tat gag ttc ctt gat aac cag aat aag gta agc gaa ttc cca ttg 1056
Val Tyr Glu Phe Leu Asp Asn Gln Asn Lys Val Ser Glu Phe Pro Leu
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ttt aca gct gtt tat cgc att gtt tat gag gga ctt cca cct aat aag 1104
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atg gtc ggt ctc att cgc cct ggt gcc gtt ggt att tcc tgt atc aag 432
Met Val Gly Leu Ile Arg Pro Gly Ala Val Gly Ile Ser Cys Ile Lys
130 135 140
ggt gtt gct gtc agc aag gaa ggc tcg ctt tac tct gag gtt atc agc 480
Gly Val Ala Val Ser Lys Glu Gly Ser Leu Tyr Ser Glu Val Ile Ser
145 150 155 160
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cgt ggt ttg ttg gag atg caa aag ttt gct act acc ttc ttc gac tct 816
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Asp Pro Arg Thr Met Val Glu Gln Ser Cys Gly Ile Ala Asp Leu Val
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caa ctt ctt caa gga gct gcc act tcc aag gat gtt cat gaa ttc ctt 1008
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ctc acc aag gat atg gtc aag gat ttc ccc ttg ttc act gcc gtt tat 1056
Leu Thr Lys Asp Met Val Lys Asp Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr
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aac att tcc tat gaa gac atg gat ccc aag gat ttg atc atc gtc ctt 1104
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<213>粟酒裂殖酵母
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Val Arg Glu Glu Lys Val Asn Gly Lys Asn Leu Thr Asp Ile Phe Asn
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
atc atc gtc ttc aac ctg ccc cat cag ttc ctg gct ggt gtc tgc aag 432
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130 135 140
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Gln Leu Lys Gly His Val Asn Pro Lys Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu
145 150 155 160
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Lys Gly Leu Asp Val Thr Pro Gln Gly Val Tyr Leu Leu Ser Asp Val
165 170 175
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260 265 270
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Lys Ala Ala Ile Met Arg Arg Gly Met Leu Glu Met Ile Asn Phe Ser
275 280 285
aag cga ttc ttc ccc gaa act gat att aac act ctt aca gtc gag tct 912
Lys Arg Phe Phe Pro Glu Thr Asp Ile Asn Thr Leu Thr Val Glu Ser
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Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Ser Cys Ala Gly Gly Arg Asn Phe
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aag gtc ggc cga gca ttc gga aag gag agc ggc tcc ggc aag acc atc 1008
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<213>Zygosaccharomyces rouxii
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Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser Gln
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tct atg aag aag acc gac tca tca atg tca gtc gtt acc gct gag aat 96
Ser Met Lys Lys Thr Asp Ser Ser Met Ser Val Val Thr Ala Glu Asn
20 25 30
cca tac aaa gtt tcc gtc gtc ggc tct ggt aac tgg ggt acc acc atc 144
Pro Tyr Lys Val Ser Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile
35 40 45
gcc aag gtc gtt gcc gaa aac acc aag gaa aag cca gaa ttg ttc caa 192
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50 55 60
gaa cgt gtg gac atg tgg gtg ttt gaa gaa cag atc gac ggt act cca 240
Glu Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro
65 70 75 80
ttg gcc caa atc atc aac acc aag cac cag aac gtg aaa tac ttg cca 288
Leu Ala Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
85 90 95
aac atc gac ctt ccg gac aat ttg gtc gct aac cca gac ttg att gcc 336
Asn Ile Asp Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ala
100 105 110
acc acg aag gac gcc gat gtg att gtt ttc aac gtt ccc cat caa ttt 384
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
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Leu Gly Arg Ile Val Ala Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Thr Ala
130 135 140
cgt gcg gtc tcc tgt cta aag ggt ttc gaa gtt ggt cca aag ggt gtg 480
Arg Ala Val Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
145 150 155 160
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Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Glu Cys Gly
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Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro
210 215 220
tac ttc cac gtg aat gtg att gac gat gtt gct ggt atc tcc atc gca 720
Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240
ggt gca ttg aag aac gtg gtc gcc ttg ggt tgc ggt ttc gtt acc ggt 768
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
245 250 255
cta ggt tgg ggt aac aac gcc gcc gcc gcc atc caa cgt gtc ggt ttg 816
Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu
260 265 270
ggt gaa atc atc aag ttc ggt agg atg ttc ttc cca gaa tcc aag gtg 864
Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
275 280 285
gag act tac tac caa gaa tcc gca ggt gtt gct gac ttg atc acc acc 912
Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
290 295 300
tgt tcc ggt ggt aga aac gtc cgt gtt gcc acc gaa atg gcc aag act 960
Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
305 310 315 320
ggt aag agc ggt gag caa gtc gaa aaa gac atc ttg aac ggt caa tcc 1008
Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser
325 330 335
gct caa ggt ttg gtc acc tgt aag gaa gtt cac cag tgg tta gaa tct 1056
Ala Gln Gly Leu Val Thr Cys Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser
340 345 350
agt gga aac acc gaa gac ttc cca ttg ttc gag gct gtc tac cag atc 1104
Ser Gly Asn Thr Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile
355 360 365
act tac gaa aac gtg ccc atg aag gag ttg cca tct atg atc gaa gaa 1152
Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu
370 375 380
ttg gat atc gat agc aca tcg aag tgc gta ttg agt tac aag atg ggt 1200
Leu Asp Ile Asp Ser Thr Ser Lys Cys Val Leu Ser Tyr Lys Met Gly
385 390 395 400
ctc tag 1206
Leu
<210>14
<211>401
<212>PRT
<213>Zygosaccharomyces rouxii
<400>14
Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ser Met Lys Lys Thr Asp Ser Ser Met Ser Val Val Thr Ala Glu Asn
20 25 30
Pro Tyr Lys Val Ser Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile
35 40 45
Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln
50 55 60
Glu Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro
65 70 75 80
Leu Ala Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
85 90 95
Asn Ile Asp Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ala
100 105 110
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
Leu Gly Arg Ile Val Ala Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Thr Ala
130 135 140
Arg Ala Val Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
145 150 155 160
Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Glu Cys Gly
165 170 175
Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp
180 185 190
Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Asp Asp Phe Lys Gly Asp
195 200 205
Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro
210 215 220
Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
245 250 255
Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu
260 265 270
Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
275 280 285
Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser
325 330 335
Ala Gln Gly Leu Val Thr Cys Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser
340 345 350
Ser Gly Asn Thr Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile
355 360 365
Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu
370 375 380
Leu Asp Ile Asp Ser Thr Ser Lys Cys Val Leu Ser Tyr Lys Met Gly
385 390 395 400
Leu
<210>15
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<213>Zygosaccharomyces rouxii
<220>
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<222>(1)..(1167)
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Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser His
1 5 10 15
tct atg aag aag act gat acc tca atg tca att gtt acc gct gag aat 96
Ser Met Lys Lys Thr Asp Thr Ser Met Ser Ile Val Thr Ala Glu Asn
20 25 30
cct tac aag gtc gct gtt gtc ggt tct ggt aac tgg ggt acc act atc 144
Pro Tyr Lys Val Ala Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile
35 40 45
gct aag gtt gtt gcc gaa aac acc aaa gaa aag cca gag ttg ttc caa 192
Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln
50 55 60
gga cgt gtg gac atg tgg gtt ttc gaa gaa caa atc gat ggt act cca 240
Gly Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro
65 70 75 80
ttg act caa atc atc aac acc aaa cac caa aac gtc aaa tac ctt cca 288
Leu Thr Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
85 90 95
aac atc gat ctt ccg ggg aat ttg gtc gct aac cca gat ttg atc tct 336
Asn Ile Asp Leu Pro Gly Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ser
100 105 110
act acc aag gac gct gat gtc atc gtt ttc aac gtt cct cac caa ttt 384
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
ttg ggc cgt atc gtt tct caa atg aag ggt caa atc aaa cca gat gct 432
Leu Gly Arg Ile Val Ser Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Asp Ala
130 135 140
cgt gcc atc tcc tgt cta aag ggt ttc gaa gtt ggt cca aag ggt gtc 480
Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
145 150 155 160
caa cta ctt tct gac tac gtc act caa gaa tta ggt atc caa tgt ggt 528
Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly
165 170 175
gcc cta tct ggt gct aac ttg gct cca gaa gtc gcc aag gaa cac tgg 576
Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp
180 185 190
tcc gaa act acc gtc gct tac caa gtc cca gat gac ttc aag ggt gaa 624
Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Val Pro Asp Asp Phe Lys Gly Glu
195 200 205
ggt aaa gat atc gac cac cgt gtc ttg aaa caa ttg ttc cac aga cca 672
Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro
210 215 220
tac ttc cac gtc aat gtg atc gac gat gtt gct ggt att tct atc gca 720
Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240
ggt gca ttg aag aac gtg gtt gcc ttg ggt tgc ggt ttc gtc acc ggt 768
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
245 250 255
cta ggc tgg ggt aac aac gct gcc gcc gcc atc caa cgt gtt ggt ttg 816
Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu
260 265 270
ggt gaa atc atc aag ttc ggt aga atg ttc ttc cca gaa tcc aag gtg 864
Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
275 280 285
gaa act tac tac caa gaa tct gca ggt gtt gct gat ttg atc act acc 912
Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
290 295 300
tgt tcc ggt ggt aga aac gtt cgt gtc gcc act gaa atg gcc aag act 960
Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
305 310 315 320
ggt aag agc ggt gaa caa gtc gaa aag gac atc ttg aac ggt caa tcc 1008
Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser
325 330 335
gct caa ggt ttg att act gct aag gaa gtc cac caa tgg ttg gaa tcc 1056
Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser
340 345 350
agc ggt cac acc gaa gaa tac cca ttg ttt gaa gcc gtc tac caa atc 1104
Ser Gly His Thr Glu Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile
355 360 365
act tac gaa aac gtg ccc atg aag gag ttg cca tcc atg atc gaa gaa 1152
Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu
370 375 380
ttg gat atc gta gaa taa 1170
Leu Asp Ile Val Glu
385
<210>16
<211>389
<212>PRT
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<400>16
Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser His
1 5 10 15
Ser Met Lys Lys Thr Asp Thr Ser Met Ser Ile Val Thr Ala Glu Asn
20 25 30
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35 40 45
Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln
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100 105 110
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165 170 175
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195 200 205
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Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
245 250 255
Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu
260 265 270
Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
275 280 285
Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser
325 330 335
Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser
340 345 350
Ser Gly His Thr Glu Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile
355 360 365
Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu
370 375 380
Leu Asp Ile Val Glu
385
<210>17
<211>8809
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：含有酵母属G3PDH的表达载体pSUN-USP
<220>
<221>misc_feature
<222>(1017)..(2189)
<223>编码G3PDH
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aatattcaaa caaacacata cagcgcgact tatcatggac atacaaatgg acgaacggat 60
aaaccttttc acgccctttt aaatatccga ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg 120
tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca 180
atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt 240
cgactctaga ctagtggatc cgatatcgcc cgggctcgag gtaccgagct cgaattcggc 300
gcgccgagct cctcgagcaa atttacacat tgccactaaa cgtctaaacc cttgtaattt 360
gtttttgttt tactatgtgt gttatgtatt tgatttgcga taaattttta tatttaatac 420
taaatttata acacctttta tgctaacgtt tgccaacact tagcaatttg caagttgatt 480
aattgattct aaattatttt tgtcttctaa atacatatac taatcaactg gaaatgtaaa 540
tatttgctaa tatttctact ataggagaat taaagtgagt gaatatggta ccacaaggtt 600
tggagattta attgttgcaa tgatgcatgg atggcatata caccaaacat tcaataattc 660
ttgaggataa taatggtacc acacaagatt tgaggtgcat gaacgtcacg tggacaaaag 720
gtttagtaat ttttcaagac aacaatgtta ccacacacaa gttttgaggt gcatgcatgg 780
atgccctgtg gaaagtttaa aaatattttg gaaatgattt gcatggaagc catgtgtaaa 840
accatgacat ccacttggag gatgcaataa tgaagaaaac tacaaattta catgcaacta 900
gttatgcatg tagtctatat aatgaggatt ttgcaatact ttcattcata cacactcact 960
aagttttaca cgattataat ttcttcatag ccagcccacc gcggtgggcg gccgccatgt 1020
ctgctgctgc tgatagatta aacttaactt ccggccactt gaatgctggt agaaagagaa 1080
gttcctcttc tgtttctttg aaggctgccg aaaagccttt caaggttact gtgattggat 1140
ctggtaactg gggtactact attgccaagg tggttgccga aaattgtaag ggatacccag 1200
aagttttcgc tccaatagta caaatgtggg tgttcgaaga agagatcaat ggtgaaaaat 1260
tgactgaaat cataaatact agacatcaaa acgtgaaata cttgcctggc atcactctac 1320
ccgacaattt ggttgctaat ccagacttga ttgattcagt caaggatgtc gacatcatcg 1380
tcttcaacat tccacatcaa tttttgcccc gtatctgtag ccaattgaaa ggtcatgttg 1440
attcacacgt cagagctatc tcctgtctaa agggttttga agttggtgct aaaggtgtcc 1500
aattgctatc ctcttacatc actgaggaac taggtattca atgtggtgct ctatctggtg 1560
ctaacattgc cactgaagtc gctcaagaac actggtctga aacaacagtt gcttaccaca 1620
ttccaaagga tttcagaggc gagggcaagg acgtcgacca taaggttcta aaggccttgt 1680
tccacagacc ttacttccac gttagtgtca tcgaagatgt tgctggtatc tccatctgtg 1740
gtgctttgaa gaacgttgtt gccttaggtt gtggtttcgt cgaaggtcta ggctggggta 1800
acaacgcttc tgctgccatc caaagagtcg gtttgggtga gatcatcaga ttcggtcaaa 1860
tgtttttccc agaatctaga gaagaaacat actaccaaga gtctgctggt gttgctgatt 1920
tgatcaccac ctgcgctggt ggtagaaacg tcaaggttgc taggctaatg gctacttctg 1980
gtaaggacgc ctgggaatgt gaaaaggagt tgttgaatgg ccaatccgct caaggtttaa 2040
ttacctgcaa agaagttcac gaatggttgg aaacatgtgg ctctgtcgaa gacttcccat 2100
tatttgaagc cgtataccaa atcgtttaca acaactaccc aatgaagaac ctgccggaca 2160
tgattgaaga attagatcta catgaagatt aggcggccgc ctgcagtcta gaaggcctcc 2220
tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 2280
tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 2340
ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 2400
ttactgattg tccgtcgacg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac 2460
aggaggcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 2520
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 2580
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 2640
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 2700
attgccaaat gtttgaacga tcggggatca tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa 2760
tatccgaacg cagcaagatc tagagcttgg gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc 2820
gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 2880
cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 2940
agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 3000
ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 3060
tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 3120
gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 3180
tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 3240
cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 3300
gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 3360
cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 3420
tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 3480
ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 3540
tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg 3600
atccagatcc ggtgcagatt atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc 3660
gaggggaatt tatggaacgt cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata 3720
gtgaccttag gcgacttttg aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat 3780
taaactccag aaacccgcgg ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa 3840
acgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc 3900
cgctcatgat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat 3960
cactgcttgg taataattgt cattagattg tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc 4020
caattttaga caagtatcaa acggatgtta attcagtaca ttaaagacgt ccgcaatgtg 4080
ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc 4140
caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac gcgtctaaaa aggtgatgtg 4200
tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 4260
aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 4320
aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 4380
tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 4440
tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 4500
cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 4560
cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 4620
ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 4680
acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 4740
cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 4800
ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 4860
tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga 4920
ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 4980
agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 5040
tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 5100
accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 5160
ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 5220
aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 5280
cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 5340
gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 5400
gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagacgcc 5460
ccggtgaatc gtggcaaggg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 5520
cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 5580
ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 5640
tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 5700
ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 5760
tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 5820
acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 5880
ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 5940
acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 6000
gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 6060
tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 6120
tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 6180
gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 6240
aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 6300
ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 6360
tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 6420
agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 6480
tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 6540
ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 6600
aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 6660
tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 6720
ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gcctatgcgg 6780
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 6840
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6900
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6960
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7020
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7080
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7140
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7200
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7260
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7320
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7380
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7440
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 7500
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 7560
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 7620
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcatgat 7680
atatctccca atttgtgtag ggcttattat gcacgcttaa aaataataaa agcagacttg 7740
acctgatagt ttggctgtga gcaattatgt gcttagtgca tctaacgctt gagttaagcc 7800
gcgccgcgaa gcggcgtcgg cttgaacgaa tttctagcta gacattattt gccgactacc 7860
ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 7920
aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 7980
tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 8040
gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 8100
cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 8160
tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 8220
cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 8280
gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 8340
cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 8400
tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 8460
tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 8520
tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 8580
acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc ccccatgatg 8640
tttaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct ccataacatc 8700
aaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg cccgaggcat agactgtacc 8760
ccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg cgttccatg 8809
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>18
actagtatgt ctgctgctgc tgatag 26
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>19
ctcgagatct tcatgtagat ctaatt 26
<210>20
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>20
gcggccgcca tgtctgctgc tgctgatag 29
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>21
gcggccgcat cttcatgtag atctaatt 28
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(8)
<223>Thr
<400>22
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys
1 5 10
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)
<223>Gln
<400>23
His Glu Gln Asn Val Lys Tyr Leu
1 5
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)
<223>Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)
<223>Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>(5)
<223>Trp
<220>
<221>VARIANT
<222>(6)
<223>Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)
<223>Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>(12)
<223>Leu或Ile
<400>24
Asp Ile Leu Val Phe Val Leu Pro His Gln Phe Val
1 5 10
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)
<223>Gly
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>VARIANT
<222>(5)
<223>Ile
<400>25
Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly
1 5
<210>26
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)
<223>Ala
<220>
<221>VARIANT
<222>(9)
<223>Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>(13)
<223>Ile
<400>26
Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Xaa Glu Val Ala
1 5 10
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)
<223>Val
<400>27
Leu Phe Xaa Arg Pro Tyr Phe Xaa Val
1 5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)
<223>Met
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)
<223>Gly
<220>
<221>VARIANT
<222>(5)
<223>Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>(6)
<223>Gln
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)
<223>Lys或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>(9)
<223>Ser或Ala
<400>28
Gly Leu Leu Glu Met Ile Arg Phe Gly
1 5
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(13)
<223>Ile
<400>29
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn
1 5 10 15
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)
<223>Arg
<400>30
Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
1 5 10
<210>31
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)
<223>Val
<400>31
Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu
1 5 10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)
<223>Val
<400>32
Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu
1 5 10
<210>33
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(11)
<223>Thr
<400>33
Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala
1 5 10
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<400>34
Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val
1 5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT
<222>(7)
<223>Arg
<400>35
Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly
1 5
<210>36
<211>13718
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：表达载体pGPTV-gpd1
<220>
<221>启动子
<222>(10807)..(11951)
<223>napin启动予
<220>
<221>终止子
<222>(13154)..(13408)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(11962)..(13137)
<223>编码酵母G3PDH(gpd1)
<400>36
gatctggcgc cggccagcga gacgagcaag attggccgcc gcccgaaacg atccgacagc 60
gcgcccagca caggtgcgca ggcaaattgc accaacgcat acagcgccag cagaatgcca 120
tagtgggcgg tgacgtcgtt cgagtgaacc agatcgcgca ggaggcccgg cagcaccggc 180
ataatcaggc cgatgccgac agcgtcgagc gcgacagtgc tcagaattac gatcaggggt 240
atgttgggtt tcacgtctgg cctccggacc agcctccgct ggtccgattg aacgcgcgga 300
ttctttatca ctgataagtt ggtggacata ttatgtttat cagtgataaa gtgtcaagca 360
tgacaaagtt gcagccgaat acagtgatcc gtgccgccct ggacctgttg aacgaggtcg 420
gcgtagacgg tctgacgaca cgcaaactgg cggaacggtt gggggttcag cagccggcgc 480
tttactggca cttcaggaac aagcgggcgc tgctcgacgc actggccgaa gccatgctgg 540
cggagaatca tacgcattcg gtgccgagag ccgacgacga ctggcgctca tttctgatcg 600
ggaatgcccg cagcttcagg caggcgctgc tcgcctaccg cgatggcgcg cgcatccatg 660
ccggcacgcg accgggcgca ccgcagatgg aaacggccga cgcgcagctt cgcttcctct 720
gcgaggcggg tttttcggcc ggggacgccg tcaatgcgct gatgacaatc agctacttca 780
ctgttggggc cgtgcttgag gagcaggccg gcgacagcga tgccggcgag cgcggcggca 840
ccgttgaaca ggctccgctc tcgccgctgt tgcgggccgc gatagacgcc ttcgacgaag 900
ccggtccgga cgcagcgttc gagcagggac tcgcggtgat tgtcgatgga ttggcgaaaa 960
ggaggctcgt tgtcaggaac gttgaaggac cgagaaaggg tgacgattga tcaggaccgc 1020
tgccggagcg caacccactc actacagcag agccatgtag acaacatccc ctcccccttt 1080
ccaccgcgtc agacgcccgt agcagcccgc tacgggcttt ttcatgccct gccctagcgt 1140
ccaagcctca cggccgcgct cggcctctct ggcggccttc tggcgctctt ccgcttcctc 1200
gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260
ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttt 1560
ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 1620
tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 1680
ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 1740
ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 1800
ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga 1860
agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa 1920
aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca 1980
aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc 2040
tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt 2100
tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg 2160
gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa 2220
aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc 2280
gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag gcaagaccga gcgcctttgc 2340
gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa 2400
cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc gttgtggata 2460
cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc 2520
cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg 2580
gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat 2640
gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac 2700
tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc 2760
gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt 2820
ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat 2880
aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg 2940
tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctaacgcggg cctcccatcc ccccaggggc 3000
tgcgcccctc ggccgcgaac ggcctcaccc caaaaatggc agcgctggca gtccttgcca 3060
ttgccgggat cggggcagta acgggatggg cgatcagccc gagcgcgacg cccggaagca 3120
ttgacgtgcc gcaggtgctg gcatcgacat tcagcgacca ggtgccgggc agtgagggcg 3180
gcggcctggg tggcggcctg cccttcactt cggccgtcgg ggcattcacg gacttcatgg 3240
cggggccggc aatttttacc ttgggcattc ttggcatagt ggtcgcgggt gccgtgctcg 3300
tgttcggggg tgcgataaac ccagcgaacc atttgaggtg ataggtaaga ttataccgag 3360
gtatgaaaac gagaattgga cctttacaga attactctat gaagcgccat atttaaaaag 3420
ctaccaagac gaagaggatg aagaggatga ggaggcagat tgccttgaat atattgacaa 3480
tactgataag ataatatatc ttttatatag aagatatcgc cgtatgtaag gatttcaggg 3540
ggcaaggcat aggcagcgcg cttatcaata tatctataga atgggcaaag cataaaaact 3600
tgcatggact aatgcttgaa acccaggaca ataaccttat agcttgtaaa ttctatcata 3660
attgggtaat gactccaact tattgatagt gttttatgtt cagataatgc ccgatgactt 3720
tgtcatgcag ctccaccgat tttgagaacg acagcgactt ccgtcccagc cgtgccaggt 3780
gctgcctcag attcaggtta tgccgctcaa ttcgctgcgt atatcgcttg ctgattacgt 3840
gcagctttcc cttcaggcgg gattcataca gcggccagcc atccgtcatc catatcacca 3900
cgtcaaaggg tgacagcagg ctcataagac gccccagcgt cgccatagtg cgttcaccga 3960
atacgtgcgc aacaaccgtc ttccggagac tgtcatacgc gtaaaacagc cagcgctggc 4020
gcgatttagc cccgacatag ccccactgtt cgtccatttc cgcgcagacg atgacgtcac 4080
tgcccggctg tatgcgcgag gttaccgact gcggcctgag ttttttaagt gacgtaaaat 4140
cgtgttgagg ccaacgccca taatgcgggc tgttgcccgg catccaacgc cattcatggc 4200
catatcaatg attttctggt gcgtaccggg ttgagaagcg gtgtaagtga actgcagttg 4260
ccatgtttta cggcagtgag agcagagata gcgctgatgt ccggcggtgc ttttgccgtt 4320
acgcaccacc ccgtcagtag ctgaacagga gggacagctg atagacacag aagccactgg 4380
agcacctcaa aaacaccatc atacactaaa tcagtaagtt ggcagcatca cccataattg 4440
tggtttcaaa atcggctccg tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga 4500
aaaagctgtt ttctggtatt taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt 4560
cttgttataa ttagcttctt ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa 4620
taaatggcta aaatgagaat atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc 4680
gtaaaagata cggaaggaat gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa 4740
aacctatatt taaaaatgac ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg 4800
gaaaaggaca tgatgctatg gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt 4860
gaacggcatg atggctggag caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg 4920
gaagagtatg aagatgaaca aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc 4980
aggctctttc actccatcga catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc 5040
ttagccgaat tggattactt actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg 5100
gaagaagaca ctccatttaa agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag 5160
cccgaagagg aacttgtctt ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa 5220
gatggcaaag taagtggctt tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat 5280
gacattgcct tctgcgtccg gtcgatcagg gaggatatcg gggaagaaca gtatgtcgag 5340
ctattttttg acttactggg gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta 5400
ctggatgaat tgttttagta cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg 5460
caccgacttc ttccgcatca agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt 5520
gggcaagggg tcgctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga 5580
cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa 5640
ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat 5700
cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat 5760
cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc 5820
gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga 5880
gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg 5940
ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg 6000
aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag 6060
cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct 6120
ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc 6180
ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa 6240
ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc 6300
cgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg 6360
cgagccgatc accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg 6420
ccggtattac acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt 6480
cacgtccgac cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct 6540
ggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct 6600
gtttgctggc gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac 6660
ggcccgacgg atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga 6720
aaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt 6780
cggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga 6840
tgacctggtg cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc 6900
agccagcgct ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc 6960
tcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa 7020
ttgacaattg tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc 7080
cgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag 7140
cacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttc gctgaacggt tgcgagatgc cgtggcattc 7200
ggcgcctaca tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc 7260
aaggacgctc acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga 7320
ggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc 7380
cgacagattc caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt 7440
tcgctattct ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg 7500
acggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc 7560
ccgatacgat tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg 7620
gtgttgacac caaacgcagc gctagatcct gtcggcgtcg cagcgggcct ggcgggggcg 7680
gtttccatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc 7740
acctttaccg cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg 7800
tttgatccgc caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc 7860
ctgatcggag cgggtttaac ctacttcctt tggttccggg ggatctcgcg actcgaacct 7920
acagttgttt ccttactggg ctttctcagc cccagatctg gggtcgatca gccggggatg 7980
catcaggccg acagtcggaa cttcgggtcc ccgacctgta ccattcggtg agcaatggat 8040
aggggagttg atatcgtcaa cgttcacttc taaagaaata gcgccactca gcttcctcag 8100
cggctttatc cagcgatttc ctattatgtc ggcatagttc tcaagatcga cagcctgtca 8160
cggttaagcg agaaatgaat aagaaggctg ataattcgga tctctgcgag ggagatgata 8220
tttgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga 8280
tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat 8340
gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct 8400
gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg 8460
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 8520
gacgttttta atgtactggg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat 8580
tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca 8640
gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa 8700
agaatagccc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa 8760
gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg 8820
tgaaccatca cccaaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa 8880
ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa 8940
ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 9000
gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 9060
gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 9120
aattaattcc catcttgaaa gaaatatagt ttaaatattt attgataaaa taacaagtca 9180
ggtattatag tccaagcaaa aacataaatt tattgatgca agtttaaatt cagaaatatt 9240
tcaataactg attatatcag ctggtacatt gccgtagatg aaagactgag tgcgatatta 9300
tgtgtaatac ataaattgat gatatagcta gcttagctca tcgggggatc cgtcgaagct 9360
agcttgggtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 9420
tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 9480
tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg 9540
ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 9600
tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac 9660
agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 9720
gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 9780
gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 9840
gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag 9900
tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc 9960
agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc 10020
ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag 10080
ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa 10140
cctgcgtgca atccatcttg ttcaatccaa gctcccatgg gccctcgact agagtcgaga 10200
tctggattga gagtgaatat gagactctaa ttggataccg aggggaattt atggaacgtc 10260
agtggagcat ttttgacaag aaatatttgc tagctgatag tgaccttagg cgacttttga 10320
acgcgcaata atggtttctg acgtatgtgc ttagctcatt aaactccaga aacccgcggc 10380
tgagtggctc cttcaacgtt gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaacgg cttgtcccgc 10440
gtcatcggcg ggggtcataa cgtgactccc ttaattctcc gctcatgatc ttgatcccct 10500
gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac 10560
cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca 10620
gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt 10680
ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg 10740
actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca 10800
gcgtgaagct ttcttcatcg gtgattgatt cctttaaaga cttatgtttc ttatcttgct 10860
tctgaggcaa gtattcagtt accagttacc acttatattc tggactttct gactgcatcc 10920
tcatttttcc aacattttaa atttcactat tggctgaatg cttcttcttt gaggaagaaa 10980
caattcagat ggcagaaatg tatcaaccaa tgcatatata caaatgtacc tcttgttctc 11040
aaaacatcta tcggatggtt ccatttgctt tgtcatccaa ttagtgacta ctttatatta 11100
ttcactcctc tttattacta ttttcatgcg aggttgccat gtacattata tttgtaagga 11160
ttgacgctat tgagcgtttt tcttcaattt tctttatttt agacatgggt atgaaatgtg 11220
tgttagagtt gggttgaatg agatatacgt tcaagtgaat ggcataccgt tctcgagtaa 11280
ggatgaccta cccattcttg agacaaatgt tacattttag tatcagagta aaatgtgtac 11340
ctataactca aattcgattg acatgtatcc attcaacata aaattaaacc agcctgcacc 11400
tgcatccaca tttcaagtat tttcaaaccg ttcggctcct atccaccggg tgtaacaaga 11460
cggattccga atttggaaga ttttgactca aattcccaat ttatattgac cgtgactaaa 11520
tcaactttaa cttctataat tctgattaag ctcccaattt atattcccaa cggcactacc 11580
tccaaaattt atagactctc atcccctttt aaaccaactt agtaaacgtt ttttttttta 11640
attttatgaa gttaagtttt taccttgttt ttaaaaagaa tcgttcataa gatgccatgc 11700
cagaacatta gctacacgtt acacatagca tgcagccgcg gagaattgtt tttcttcgcc 11760
acttgtcact cccttcaaac acctaagagc ttctctctca cagcacacac atacaatcac 11820
atgcgtgcat gcattattac acgtgatcgc catgcaaatc tcctttatag cctataaatt 11880
aactcatccg cttcactctt tactcaaacc aaaactcatc aatacaaaca agattaaaaa 11940
catacacgag gatccactag tatgtctgct gctgctgata gattaaactt aacttccggc 12000
cacttgaatg ctggtagaaa gagaagttcc tcttctgttt ctttgaaggc tgccgaaaag 12060
cctttcaagg ttactgtgat tggatctggt aactggggta ctactattgc caaggtggtt 12120
gccgaaaatt gtaagggata cccagaagtt ttcgctccaa tagtacaaat gtgggtgttc 12180
gaagaagaga tcaatggtga aaaattgact gaaatcataa atactagaca tcaaaacgtg 12240
aaatacttgc ctggcatcac tctacccgac aatttggttg ctaatccaga cttgattgat 12300
tcagtcaagg atgtcgacat catcgtcttc aacattccac atcaattttt gccccgtatc 12360
tgtagccaat tgaaaggtca tgttgattca cacgtcagag ctatctcctg tctaaagggt 12420
tttgaagttg gtgctaaagg tgtccaattg ctatcctctt acatcactga ggaactaggt 12480
attcaatgtg gtgctctatc tggtgctaac attgccactg aagtcgctca agaacactgg 12540
tctgaaacaa cagttgctta ccacattcca aaggatttca gaggcgaggg caaggacgtc 12600
gaccataagg ttctaaaggc cttgttccac agaccttact tccacgttag tgtcatcgaa 12660
gatgttgctg gtatctccat ctgtggtgct ttgaagaacg ttgttgcctt aggttgtggt 12720
ttcgtcgaag gtctaggctg gggtaacaac gcttctgctg ccatccaaag agtcggtttg 12780
ggtgagatca tcagattcgg tcaaatgttt ttcccagaat ctagagaaga aacatactac 12840
caagagtctg ctggtgttgc tgatttgatc accacctgcg ctggtggtag aaacgtcaag 12900
gttgctaggc taatggctac ttctggtaag gacgcctggg aatgtgaaaa ggagttgttg 12960
aatggccaat ccgctcaagg tttaattacc tgcaaagaag ttcacgaatg gttggaaaca 13020
tgtggctctg tcgaagactt cccattattt gaagccgtat accaaatcgt ttacaacaac 13080
tacccaatga agaacctgcc ggacatgatt gaagaattag atctacatga agattagctc 13140
gacgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 13200
tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 13260
taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 13320
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 13380
cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attcagatcg gctgagtggc tccttcaacg 13440
ttgcggntct gtcagtncca aacgtaaaac gggttggtcc gcggnatcgg gcggggggcc 13500
ttaaccgtgn actnccntna ttnctccggc ttcantgnnn agaattggnc ntttccccgn 13560
cntcagttta aactatcagg tgtttgacag gatatatttg gcgggtaaac ctaaganaaa 13620
agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggccgn gaaaaggttt atcccttccg 13680
tccatttgta tgngcatgcc naccaccagg gttcccca 13718
<210>37
<211>1254
<212>DNA
<213>Emericella nidulans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<223>编码G3PDH
<400>37
atg ggc tct ctt gga ccg tat aag caa aag cac aag gtg act gtg gtg 48
Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val
1 5 10 15
gga tcg ggt aac tgg ggc acc gct ata gcc aaa atc gtc gcc gag aat 96
Gly Set Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn
20 25 30
act gcc agc aac cct gcg gtc ttt gag aag gat gtt cag atg tgg gtt 144
Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val
35 40 45
ttc gag gaa aag gtc gag att ccg aaa tcg tcg aag cat tat gat cct 192
Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro
50 55 60
gcc tct tct ctt tgc cag ggc ccg cag aat ctg aca gat att atc aac 240
Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn
65 70 75 80
cat acc cat gag aat atc aag tac ctc ccc gga att acc ctt ccg gaa 288
His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu
85 90 95
aac ttg att gcc aat cca tcg cta gtc gac gcg gtt caa gac agc act 336
Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr
100 105 110
atc ctc gtc ttc aac cta ccc cat caa ttc atc atc aat att tgt gaa 384
Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu
115 120 125
cag atc aag ggc aag att gtc cca tac gcg cgt gga att tct tgc ata 432
Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile
130 135 140
aag ggc gtg gat gtg aat gag gaa gga gtc cac ctg ttt tcc gaa aca 480
Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr
145 150 155 160
att gga aag att ctc ggg atc tac tgt ggc gcc ctg tcc ggt gcc aac 528
Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn
165 170 175
atc gcg aat gag gtc gcc cag gaa aag tgg tcc gag tct agc att ggt 576
Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly
180 185 190
tat gat cca ccg cat ttt gac tct aaa gcc cct tct cct ccc aac cga 624
Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg
195 200 205
tcc cct tcc gca tcg act gac aat atc ctg cac ttc gag cac aaa gac 672
Set Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp
210 215 220
gtt tcg ggt caa ctt tcg cgg gta aag cta cag gct cta cct tcc gaa 720
Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu
225 230 235 240
ttt cct ccc atc gac cat gcc ctt ctc aag tcg cta ttc cac cgt cct 768
Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro
245 250 255
tac ttc cat att ggt gtg gta agt gac gtc gca ggt gtt tcg tta gga 816
Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly
260 265 270
ggt gcc ctt aag aat gtc gtt gct gtc gcg gca ggg tgg gtt gtg ggc 864
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly
275 280 285
aaa gga tgg gga gac aat gcg aag gct gca att atg cga gtt ggg ctt 912
Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu
290 295 300
ttg gaa atg gtg aag ttc ggc gaa cag ttt ttc ggt gct acc atc aac 960
Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn
305 310 315 320
act cgc acc ttc act gaa gaa agt gct ggt gtt gcc gat cta atc acg 1008
Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr
325 330 335
agt tgc agt ggc gga cga aac ttc cgc tgc gca aag ctt agc att gaa 1056
Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu
340 345 350
aga aac cag ccg att gag aaa atc gag gag aca gag ttg aac ggc cag 1104
ArgAsn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln
355 360 365
aag ctg caa ggc act ttg act gca gtc gaa gtc aac agt ttc ttg aaa 1152
Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys
370 375 380
aag caa ggt tta gaa gaa gag ttc cca ttg ttt act gca gtc tac cga 1200
Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg
385 390 395 400
gtt ctt caa ggc acc atg tct gtg gac gag att cct tct ttc att gag 1248
Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu
405 410 415
cgg taa 1254
Arg
<210>38
<211>417
<212>PRT
<213>Emericella nidulans
<400>38
Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn
20 25 30
Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val
35 40 45
Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro
50 55 60
Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn
65 70 75 80
His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu
85 90 95
Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr
100 105 110
Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu
115 120 125
Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile
130 135 140
Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr
145 150 155 160
Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn
165 170 175
Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly
180 185 190
Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg
195 200 205
Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp
210 215 220
Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro
245 250 255
Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly
260 265 270
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly
275 280 285
Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu
290 295 300
Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn
305 310 315 320
Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr
325 330 335
Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu
340 345 350
Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln
355 360 365
Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys
370 375 380
Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg
385 390 395 400
Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu
405 410 415
Arg
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<212>DNA
<213>汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)
<220>
<221>CDS
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<223>编码G3PDH(部分)
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gga tct ggt aac tgg ggt act gct gtt gct aag atc gta tct gaa aac 48
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn
1 5 10 15
acg gct gaa aaa cca gaa gtg ttc gaa aag caa gtg aac atg tgg gtt 96
Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val
20 25 30
ttt gaa gaa gaa gtt gac gga caa aag ttg act gaa atc atc aac gcc 144
Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala
35 40 45
aaa cac gaa aac gtt aag tac ttg cca gaa gtc aag ttg ccg gaa aac 192
Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn
50 55 60
ttg gtt gca aac cca gac gtt gtt gac act gtc aag gat gca gac tta 240
Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu
65 70 75 80
tta att ttt aac att cca cat caa ttc tta cca aga gtg tgt aag caa 288
Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln
85 90 95
ttg gtt ggc cat gtc aag cca tct gcc aga gcc atc tcc tgt ttg aag 336
Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys
100 105 110
ggt ttg gaa gtt ggc cca gaa ggt tgt aag ttg tta tcg caa tct atc 384
Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile
115 120 125
aac gat act tta ggt gtc cac tgt ggt gtc tta tct ggt gcc aac att 432
Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile
130 135 140
gcc aac gaa gtt gcc aga gaa aga tgg tct gaa acc acc att gcc tac 480
Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr
145 150 155 160
aac att cca gaa gat ttc aga ggt aag ggt aga gat atc gac gaa tac 528
Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr
165 170 175
gtc tta aag caa tta ttc cac aga acc tac ttc cat gtc aga gtc atc 576
Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile
180 185 190
aac gac atc ata ggt gct tct ttc gct ggt gct ttg aag aat gtt gtt 624
Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val
195 200 205
gcc tgt gct gtt ggt ttc gtt atc ggt gcc ggc tgg ggt gac aac gct 672
Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala
210 215 220
aag gcc gct atc atg aga atc ggt atc aga gaa atc atc cac ttt gcc 720
Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala
225 230 235 240
tct tac tac caa aag ttc ggt gtc aag ggt cca gct cca gaa tcc act 768
Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr
245 250 255
act ttc act gag gaa tct gcc ggt gtc gct gac tta atc acc act tgt 816
Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys
260 265 270
tcc ggt ggt aga aat gtc aag gtt gct aga tac atg att gaa aac aac 864
Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn
275 280 285
gtt gac gct tgg gaa gcc gaa aag att gtc tta aag ggt caa tct tct 912
Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser
290 295 300
caa ggt atc tta act gcc aag gaa gtc cac gaa ttg tta act aac tac 960
Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr
305 310 315 320
aac tta tcg aat gaa ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac 999
Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val
325 330
<210>40
<211>332
<212>PRT
<213>汉逊德巴利酵母
<400>40
GIy Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn
1 5 10 15
Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val
20 25 30
Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala
35 40 45
Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn
50 55 60
Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu
65 70 75 80
Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln
85 90 95
Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys
100 105 110
Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile
130 135 140
Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr
145 150 155 160
Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr
165 170 175
Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile
180 185 190
Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val
195 200 205
Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala
225 230 235 240
Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr
245 250 255
Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys
260 265 270
Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn
275 280 285
Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser
290 295 300
Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr
305 310 315 320
Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val
325 330
Claims (16)
1.提高植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中的总含油量的方法，包括：
a)使酵母甘油-3-磷酸脱氢酶在所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中转基因表达，和
b)选择植物生物体，其中，与起始生物体相比，所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中的总含油量得到提高。
2.权利要求1的方法，其中甘油-3-磷酸脱氢酶来自选自以下属的酵母：隐球酵母属、球拟酵母属、瓶形酵母属、酒香酵母属、假丝酵母属、克勒克酵母属、三角酵母属、丝孢酵母属、红酵母属、掷孢酵母属、布勒弹孢酵母属、酵母属、德巴利酵母属、油脂酵母属、汉逊酵母属、拟内孢霉属、毕赤酵母属和有孢汉逊酵母属。
3.权利要求1或2的方法，其中甘油-3-磷酸脱氢酶来自选自以下种的酵母：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、Zygosaccharomyces rouxii、Yarrowia lipolitica、Emericellanidulans、构巢曲霉、汉逊德巴利酵母和汉逊有孢圆酵母。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶使用NADH作为共底物将磷酸二羟丙酮转化成甘油-3-磷酸，而且其具有包含至少一个选自下组的序列基序的肽序列：
i) GSGNWGT(A/T)IAK
ii) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A
iii)(L/V)FXRPYFXV。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶使用NADH作为共底物将磷酸二羟丙酮转化成甘油-3-磷酸，而且其具有包含至少一个选自下组的序列基序的肽序列：
iv) GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN
v) NT(K/R)HQNVKYLP
vi) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL
vii) RA(I/V)SCLKGFE
viii)CGALSGANLA(P/T)EVA
ix) LFHRPYFHV
x) GLGEII(K/R)FG。
6.权利要求4或5的方法，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶还包含至少一个选自下组的序列基序：
xi) H(E/Q)NVKYL
xii) (D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)
xiii)(A/G)(I/V)SC(L/I)KG
xiv) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中酵母甘油-3-磷酸脱氢酶是：
a)SEQ ID NO：2、4、5、7、9、11、12、14、16、38或40的序列，或
b)与序列SEQ ID NO：2具有至少60％同一性的a)的功能等价物。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中植物是油料作物。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中植物种子中的总含油量得到提高。
10.包含处于启动子控制下的编码权利要求2-7任一项中定义的酵母甘油-3-磷酸脱氢酶的核酸序列的转基因表达盒，其中所述启动子在植物生物体或其组织、器官、部分或细胞中发挥功能。
11.权利要求10的转基因表达盒，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的核酸序列是：
a)序列SEQ ID NO：1、3、6、8、10、13、15、37或39，或
b)根据遗传密码的简并性，由序列SEQ ID NO：1、3、6、8、10、13、15、37或39衍生的序列，或
c)与序列SEQ ID NO：1具有至少60％同一性的序列。
12.权利要求10或11的转基因表达盒，其中启动子是种子特异性启动子。
13.包含权利要求10-12任一项的表达盒的转基因载体。
14.包含权利要求2-7任一项中定义的酵母甘油-3-磷酸脱氢酶或权利要求10-12任一项中定义的表达盒或权利要求13中定义的载体的转基因植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料。
15.权利要求14的转基因植物生物体，其中所述植物生物体是选自下组的油料作物：琉璃苣、芸苔、欧洲油菜、芜菁、大麻、红花、椰子、海甘蓝、萼距花属物种、油棕、美洲油棕、大豆、陆地棉、海岛棉、草棉、向日葵、亚麻、月见草、油橄榄、稻、蓖麻、胡麻、小麦属物种、玉蜀黍、胡桃和杏。
16.权利要求14或15的转基因植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料用于生产油、脂肪、游离脂肪酸或其衍生物的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20050810 |