CN1237635A

CN1237635A - 棉子糖合酶基因及其应用

Info

Publication number: CN1237635A
Application number: CN99105331A
Authority: CN
Inventors: 渡边英二郎; 大江田宪治
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 1999-12-08
Also published as: TR200100268A2; AR016234A1; BR9902058A; ES2327367T3; DK0953643T3; PL332890A1; AU760702B2; DE69940966D1; EP0953643B1; KR19990083522A; AU2396799A; CA2270504A1; ATE433488T1; TR199900944A2; TR199900944A3; CA2270504C; EP0953643A3; TR200100266A2; US7511191B1; TR200100269A2

Abstract

本发明公开了棉子糖合酶基因及其编码的棉子糖合酶。还公开了检测和扩增含该棉子糖合酶基因的核酸的方法。另外，本发明还涉及获取棉子糖合酶基因和生产棉子糖合酶的方法。

Description

棉子糖合酶基因及其应用

本发明涉及棉子糖合酶基因及其应用。

棉子糖家族寡糖为由下面的通式所表示糖的衍生物：O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)_n-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃果糖苷，并且当n为1时称其为“棉子糖”，当n为2时称其为“水苏糖”，当n为3时称其为“毛蕊糖”，且当n为4时称其为“筋骨草糖”。

已知棉子糖家族寡糖如果以适宜的量存在于食物中时具有提供良好肠道菌群条件的效应。因此，棉子糖家族寡糖已经用作有功能的食品材料用于添加至有些食物中并且用于特定的健康食品领域中。另一方面，棉子糖家族寡糖在哺乳动物如人，中既不被消化也又不被吸收，但由肠道菌同化和分解以产生气体并且导致腹中积气和吸收紊乱。因此，已经存在适当调节食品和饲料中棉子糖家族寡糖的量的必要。

棉子糖家族寡糖由棉子糖家族寡糖生物合成系统由许多植物中的蔗糖开始而合成的。该生物合成系统一般包括经α(1→6)键依次加入来自肌醇半乳糖苷的半乳糖基至附着于蔗糖分子中D-葡萄糖残基6-位置碳原子上的羟基的反应。棉子糖合酶是涉及通过以下方法制备棉子糖反应的酶，即在该生物合成系统的第一步中使来自肌醇半乳糖苷的D-半乳糖基与附着到蔗糖分子中D-葡萄糖残基6-位置碳原子上的羟基形成α(1→6)键。已表明该酶构成了上面合成系统中的限速步骤，并且因此该酶在控制棉子糖家族寡糖生物合成中是相当重要的。

那么，通过利用棉子糖合酶基因控制植物中棉子糖合酶表达水平或活性的方法对于控制植物中棉子糖家族寡糖生物合成系统以增加或减少植物中棉子糖的产量是有效的。因此，可以此方法应用的棉子糖合酶基因已成必要。

本发明的主要目的是提供新的植物棉子糖合酶基因。

通过下面的描述，本发明的该目的以及其它目的和优势对本领域的技术人员将变得显而易见。

在这些条件下，本发明人进行了集中研究并且成功地从不同植物中分离出新的编码棉子糖合酶的基因。这样，本发明得以完成。

即，本发明提供了：

1．棉子糖合酶基因，包括在严格的条件下可与选自下组的核苷酸序列杂交的核苷酸序列：

(a)编码由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(b)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列，

(c)编码由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(d)由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中的236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列，

(e)编码由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(f)由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列，

(g)编码由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列，和

(h)由SEQ ID NO:8所表示核苷酸序列中1位到第1719位核苷酸所表示的核苷酸序列，并且其中的核苷酸序列编码能够经α-(1→6)键结合D-半乳糖基至附着到蔗糖分子中D-葡萄糖残基6-位置碳原子的羟基以形成棉子糖的蛋白。

2．棉子糖合酶基因，包括编码由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

3．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列。

4.棉子糖合酶基因，包括编码由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

5.棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中第236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列。

6．棉子糖合酶基因，包括编码由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

7．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中第134位至2467位核苷酸所表示核苷酸序列。

8．棉子糖合酶基因，包括编码由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

9．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:8所表示核苷酸序列中第1位到第1719位核苷酸所表示核苷酸序列。

10．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列。

11．核酸，包括上面1到10中任一项的棉子糖合酶基因的部分核苷酸序列。

12．用于检测含有棉子糖合酶基因的核酸的方法，包括用标记的上面11的核酸作为探针通过杂交检测所述的核酸。

13．用于扩增含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用上面11的核酸作为引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述的核酸。

14．用于获取棉子糖合酶基因的方法，其包括以下步骤：

用标记的上面11的核酸作为探针通过杂交检测含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和

回收检测到的核酸。

15．用于获取棉子糖合酶基因的方法，其包括以下步骤：

用上面11的核酸作为引物通过PCR扩增含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和

回收扩增的核酸。

16．核酸，包括含有上面1到10中任一项的棉子糖合酶基因的核酸，其被连接到在宿主细胞中表现出启动子活性核酸上。

17．载体，包括上面1到10中任一项的棉子糖合酶基因的核酸。

18．转化子，其中上面1到10中任一项的棉子糖合酶基因被导入宿主细胞中。

19．转化子，其中上面16的核酸被导入宿主细胞中。

20．转化子，其中上面17的载体被导入宿主细胞中。

21．上面1 8到20中任一项的转化子，其中的宿主为微生物。

22．上面18到20中任一项的转化子，其中的宿主为植物。

23．用于制备棉子糖合酶的方法，其包括以下步骤：

培养或繁殖上面18到22中任一项的转化子以制备棉子糖合酶，和

收集该棉子糖合酶。

24．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列。

25．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列。

26．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:5所表示的氨基酸序列。

27．棉子糖合酶，包括由SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列。

这里应用的术语“核酸”意为一般称为“DNA”或“RNA”的寡聚体化合物或高分子化合物。

下述的基因工程技术可以，例如，根据在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社，ISBN0-87969-309-6；“当前分子生物学方法”(1987),John Wile&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X；“当今蛋白科学方法”(1995),John Wile&Sons，公司，ISBN0-471-11184-8中所述的方法完成。

本发明的基因可获自大豆、属于藜科的植物如甜菜等及十字花科如芥菜籽、油菜籽等。本发明基因的具体实例包括含有下面核苷酸序列的那些基因，包括编码由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列、编码由SEQ IDNO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列、编码由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列、编码由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列、由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1位到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列等。

本发明的基因可通过，例如，下面的方法而获取。

即，例如，通过下面的方法可获取源自大豆的本发明基因。

例如，该基因可通过以下步骤获取，包括用具有SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列的核酸作为探针的杂交法以检测大豆DNAs中与该探针杂交的核酸片段，然后分离检测到的核酸。

在该方法中，首先，制备待用作探针的核酸。作为这样的核酸，例如，存在由根据SEQ ID NO:2核苷酸序列通过常规方法化学合成的寡核苷酸所组成的核酸。其具体的实例包括具有由SEQ ID NO:2所表示核苷酸序列中800位到899位核苷酸的核酸。

作为选择，源自大豆的本发明基因可通过下面方法获取。

例如，将大豆(Glycine max)组织冻于液氮中并且用研体或其它方法将其物研磨成细碎的组织碎粉。从该组织碎粉中，通过常规方法提取RNA。商业可得到的RNA提取试剂盒可用于该提取中。通过乙醇沉淀从这样获得的RNA提取物中回收RNA。通过常规方法从这样回收的RNA中分级分离具有Poly-A尾部的RNA。商业上可得到的oligo-dT柱可用于该分级分离中。从通过常规方法这样获得的具有poly-A尾部的RNA中合成cDNA。合成可用商业上可得到的cDNA合成试剂盒完成。用上面获得的cDNA作为模板并且用根据SEQ ID NO:2核苷酸序列命名和合成的引物通过PCR扩增DNA。更为具体地，作为引物，例如，有后面表1中所示的引物11和12。当PCR用这些引物并且用源自大豆的cDNA作为模板进行时，可获取源自大豆的本发明基因，如，“具有编码SEQ ID NO:1氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”和“具有SEQ ID NO:2核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。

可根据，例如，在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社；或“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述的常规方法克隆扩增的DNA。作为选择，例如，可通过应用商业上可得到的克隆试剂盒如TA克隆试剂盒(Invitrogen)和商业上可得到的质粒载体如pBluescript Ⅱ(Stratagene)进行克隆。可通过如F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson在美国自然科学院院报(1977),74,pp.5463-5467中所述的双脱氧终止方法测定该DNA克隆的核苷酸序列。例如，可应用商业可得到的试剂盒如珀金-埃尔默公司生产的ABI PRISM Dye Terminator Cycle测序即用反应试剂盒。

表1引物11:ccaatctgat catgcttgtg ccgaa 25聚体引物12:ggaacaaagt tatgcactat tatttaaggt 30聚体

源自藜科植物如甜菜的本发明基因可通过下面的方法获取。

例如，将藜科植物如甜菜(Beta vulgaris)的组织冻于液氮中并从研体或其它手段物理研磨成细碎的组织碎粉。从这些组织碎粉中，通过常规方法提取RNA。商业上可得到的RNA提取试剂盒可用于此提取中，通过乙醇沉淀从这样获得的RNA提取物中回收RNA。从回收的RNA中，通过常规的方法分级分离具有poly-A尾部的RNA。商业上可得到的oligo-dT柱可用于此分级分离中。通过常规的方法从这样获得的具有poly-A尾部的RNA中合成cDNA。可通过利用商业上可得到的cDNA合成试剂盒完成此合成。用上面获得的cDNA作为模板并且根据SEQ IDNO:4核苷酸序列命名和化学合成的引物通过PCR扩增DNA。更为具体地，作为引物，例如，有后面表2中所示的引物21和22。当用这些引物及源自甜菜的cDNA作为模板进行PCR时，可获取源自甜菜的本发明基因，如，“具有编码SEQ ID NO:3氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有SEQ ID NO:4核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。根据特定的目的，此PCR引物也可根据SEQ ID NO:4的核苷酸序列命名和合成。例如，为了扩增“具有由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中第236位到第2584位核苷酸所表示的核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，优选地，合成具有由下表2中引物23和24所表示核苷酸序列的寡核苷酸并且用作引物。

可根据常规的方法，例如，在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社；或“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50388-X中所述的方法，克隆此扩增出的DNA。作为选择，克隆可通过应用商业上可得到的克隆试剂盒如TA克隆试剂盒(Invitrogen)及商业可得到的质粒载体如pBluescript Ⅱ(Stratagene)进行。例如，可通过如F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson在美国自然科学院院报(1977),74,pp.5463-5467中所述的双脱氧终止方法测定此DNA克隆的核苷酸序列。例如，优选地，可应用商业上可得到的试剂盒如由珀金-埃尔默公司生产的ABI PRISM DyeTerminator Cycle测序即用反应试剂盒。

表2引物21:ctaccaaatt ccacaactta aagttca 27聚体引物22:ggaataataa gcttcacaca tactgtactc tc 32聚体引物23:atggctccaa gctttagcaa ggaaaattcc 30聚体引物24:tcaaaataag tactcaacag tggtaaaacc 30聚体

源自十字花科植物如芥菜(Brassica juncea)和欧洲油菜(Brassica napus)的本发明基因可通过下面的方法获取。

例如，将十字花科植物如芥菜或油菜的组织冻于液氮中并以研体或其它手段物理研磨成细碎的组织碎粉。从运组织碎粉中，通过常规方法提取RNA。商业上可得到的RNA提取试剂盒可用于该提取中。通过乙醇沉淀从这样获得的RNA提取物中回收RNA。通过常规的方法，从这样回收的RNA中分级分离具有poly-A尾部的RNA。商业上可得到的oligo-dT柱可用于此分级分离中。通过常规的方法从这样获得的具有poly-A尾部RNA中合成cDNA。此合成可通过应用商业上可得到的cDNA合成试剂盒完成。用上面获取的cDNA作为模板并用根据SEQ IDNO:6核苷酸序列命名和化学合成的引物通过PCR扩增DNA。例如，当PCR用源自芥菜(Brassica juncea)的cDNA作为模板并且用后面表3中所示引物33和34进行PCR时，可获取本发明源自十字花科植物的基因，如，“具有编码SEQ ID NO:5氨基酸序列核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中第1个到第2654个核苷酸所表示核苷酸序列的棉子糖合酶基因”。根据特定的目的，PCR引物也可根据SEQ ID NO:6核苷酸序列命名和合成。例如，为了扩增编码“具有编码具有SEQ ID NO:5氨基酸序列蛋白核苷酸序列的棉子糖合酶基因”，和“具有SEQ ID NO:6中第134位到第2467位核苷酸所表示核苷酸序列的棉子糖合酶基因开放阅读框区域的DNA，优选地，合成具有由表3中引物35和36所表示核苷酸序列的寡核苷酸并且用作引物。

可根据常规方法，如在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社，或“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆此扩增的DNA。作为选择，例如，可通过应用商业可得到的TA克隆试剂盒(Invitrogen)或商业上可得到的质粒载体如pBluescript Ⅱ(Stratagene)完成克隆。可通过如F.Sanger,S.Nicklen,A.R Coulson，在美国国家科学院院报(1977),74,pp.5463-5467中所述的双脱氧终止方法测定此DNA克隆的核苷酸序列。例如，优选地，可应用商业上可得到的珀金-埃尔默公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle测序即用反应试剂盒。

表3引物31:ttggaagaga agacgccgcc gggaatcgtc 30聚体引物32:ttaagccccg gcgagagctc tggccggaca 30聚体引物33:accaatccaa aatctcatca aataatcgca 30聚体引物34:aaataatagg ggcagtacaa attacaccac 30聚体引物35:atggctccac cgagcgtaat taaatccga 29聚体引物36:ctaaaactca tacttaatag aagacaaacc 30聚体

然后，标记通过上述方法获得的具有本发明基因部分核苷酸序列的核酸(之后称为“基因片段”)且然后用作杂交方法中的探针。该探针可杂交至，例如，源自大豆、藜科植物或十字花科植物的DNA以检测出具有特异性结合到其中探针的核酸，因而检测出具有棉子糖合酶基因的核酸。

作为源自大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜的DNA，例如，可应用这些植物的cDNA文库或基因组DNA文库。此基因文库也可是商业上可得到的基因文库本身或根据常规的文库构建方法。例如，在“分子克隆：室验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社；“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons，公司，ISBN0-471-50338-X中所述方法构建的文库。

作为杂交方法，例如，可利用噬菌斑杂交或菌落杂交，并且它们依据在文库构建中所用载体的种类加以选择。更为具体地，当待用的文库以噬菌体载体构建时，在感染的条件下将适宜的宿主微生物与文库噬菌体混合。将转化子进一步与柔软的琼脂培养基混合，并且将此混合物置于琼脂培养基上。之后，将此混合物于37℃培养直至适宜大小的噬菌斑出现为止。当待用的文库以质粒载体构建时，将质粒导入适宜的宿主微生物以形成转化子。将获得的转化子稀释至适宜的浓度并将稀释液置于琼脂培养基上，然后将其培养于37℃直至适宜大小的菌落出现为止。在上面二种文库的任一情况中，在上面的培养后将滤膜(membranefilter)置于琼脂培养基的表面，从而将噬菌体或转化子转移至该膜上。该膜以碱变性，然后中和，并且例如，当应用尼龙膜时，用紫线光照射此膜，从而噬菌体或转化子的DNA被固定于该膜上。然后将该膜用于杂交方法，其中具有本发明基因部分核苷酸序列并通过常规方法标记的基因片段(之后称为“标记的基因片段”)用作探针。对于该方法，例如，可参照D.M.Glover编，“DNA克隆，实践方法”IRL出版社(1985)，ISBN0-947946-18-7。有多种试剂和温度条件待用于此杂交中。例如，一般地，通过将该滤膜浸于预杂交液〔6×SSC(0.9M NaCl,0.09M柠檬酸)，0.1至1(w/v)％SDS,100μg/ml变性鲑精DNA〕并且于65℃孵育1小时完成预杂交。然后，通过向其中添加和混合标记的基因片段并且于42℃到68℃将此膜孵育4到16小时而完成杂交。

在本发明中，“严格的条件”为在上述杂交中其中的孵育在，例如，65°到68℃完成的那些条件。

杂交后，取出滤膜并以含有0.1到1(w/v)％SDS的2×SSC洗，进一步以含有0.1到1(w/v)％SDS的0.2×SSC冲洗，且然后干燥。例如，通过放射自显影或其它技术分析此膜以检测出探针在膜上的位置，因而检测出具有同源于所用探针核苷酸序列的核酸在滤膜上的位置。在原初琼脂培养基上鉴定相应于这样检测到核酸在滤膜上位置的克隆并且筛选出阳性克隆从而可分离具有此核酸的克隆。重复相同的检测方法以纯化具有此核酸的克隆。

作为选择，可应用商业上可得到的试剂盒如GENE TRAPPERcDNA Positive Section Sysfem试剂盒(GibcoBRL)。在此方法中，首先，将单链DNA文库与生物素化的基因片段(即，探针)杂交，然后加入结合链霉抗生物素蛋白的磁珠并混合从该混合物中，用磁铁收集结合链霉抗生物素蛋白的磁珠，从而收集和检测具有同源于所用探针核苷酸序列并且经该基因片段、生物素和链霉抗生物素蛋白结合到这些小珠上的单链DNA。此收集到的单链DNA可通过用适当的寡核苷酸作为引物与适宜的DNA聚合酶处理而反应双链形式。

如上所述，含有棉子糖合酶基因的核酸可通过以下步骤而获取，包括检测源自大豆、藜科植物或十字花科植物基因文库DNA中可与此基因片段杂交的核酸、纯化具有此核酸的克隆和从该克隆中分离噬菌体或质粒DNA。通过根据常规方法制备这样获得核酸的限制性图谱或测定其核苷酸序列，可确证含有本发明基因的核酸。

例如，来自藜科植物的本发明基因可通过下面的几点加以确证：

由这样测定的核苷酸序列所编码的氨基酸与由SEQ ID NO:3氨基酸序列中103位到208位氨基酸所表示的氨基酸序列具有75％或更高的同源性；

与由SEQ ID NO:3氨基酸序列中255位到271位氨基酸所表示的氨基酸序列有80％或更高的同源性；

与由SEQ ID NO:3氨基酸序列中289位到326位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性；或

与由SEQ ID NO:3氨基酸序列中610到696位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性。

例如，可通过以下几点确证源自十字花科植物的本发明基因：

由该测定的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与由SEQ ID NO:5氨基酸序列中111位到213位氨基酸所表示的氨基酸序列具有75％或更高的同源性；

与由SEQ ID NO:5氨基酸序列中260位到275位氨基酸所表示的氨基酸序列有80％或更高的同源性；

与由SEQ ID NO:5氨基酸序列中293位到325位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性；

与由SEQ ID NO:5氨基酸序列中609位到695位氨基酸所表示的氨基酸序列有70％或更高的同源性。

这里应用的“同源性”意为根据比较二种氨基酸序列中具有类似性的区域，在一个区域中与待比较的不同区域中具有相同氨基酸数目对前者区域中全部氨基酸数目的比例。在这方面具有类似性的区域含有更多的氨基酸是优选的。氨基酸序列的这种同源性可通过用商业上可得到的基因分析软件如GENETIX(Software Kaihatu K.K)加以评价。

此外，根据上述相同的方式，可通过用该基因片段作为探针与来自所需生物的DNA杂交以检测出探针特异性结合的核酸而检测出含有棉子糖合酶基因的核酸(之后称为本发明检测方法)。这里应用的基因片段可依据由SEQ ID NO:2、4、6或8所表示的核苷酸序列根据常规的方法化学合成。作为选择，其可用依据由SEQ ID NO:2、4、6或8所表示的核苷酸序列根据常规方法化学合成的寡核苷酸作为引物通过PCR加以制备。

该基因片段可以是棉子糖合酶基因的非翻译区以及其开读框的一部分。例如，与5′-上游端的一部分核苷酸序列如SEQ ID NO:4核苷酸序列的1-235位核苷酸，SEQ ID NO:6核苷酸序列的1-133位核苷酸相同的寡核苷酸；或者与3′-下游端的一部分核苷酸序列如SEQ ID NO:4核苷酸序列的2588-2675位核苷酸，SEQ IDNO:6核苷酸序列的2468-2676位核苷酸相同的寡核甘酸。

当PCR用该基因片段作为引物进行时，从源自所需生物DNA中扩增出含有棉子糖合酶基因的核酸是可能的(之后称为本发明扩增方法)。

更为具体地说，例如，根据常规方法设计和化学合成具有该基因片段核苷酸序列的寡核苷酸。一般来说，从确保退火特异性的角度来看，此核苷酸的数目越多是更为优选的。然而，从引物自身易形成更高级结构导致退火效率的可能破坏以及合成后的纯化中需要复杂的步骤角度来讲，此核苷酸的数目不是太多也是优选的。通常，由15到50个碱基所组成的寡核苷酸是优选的。在运方面，根据显示由密码子编码氨基酸对应性的密码子表，也可通过应用多种碱基混合物而合成引物的混合物，从而根据可编码某一种特定氨基酸的密码子的改变将引物中特定位置的残基变成不同的碱基。作为选择，例如，可以应用碱基如可与多种碱基形成碱基对的肌苷代替上面多种碱基的混合物。

密码子表Phe:UUU,UUC Ser:UCU,UCC,UCA,UCG,AGU,AGCTyr:UAU,UAC Cys:UGU,UGC终止密码子：UAA,UAG,UGA Trp:UGGLeu:UUA,UUG,CUU,CUC,CUA,CUG Pro:CCU,CCC,CCA,CCG His:CAU,CAC Gln:CAA,CAG Arg:CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,AGGIle:AUU,AUC,AUA Thr:ACU,ACC,ACA,ACGAsn:AAU,AAC Lys:AAA,AAGMet:AUGVal:GUU,GUC,GUA,GUG Ala:GCU,GCC,GCA,GCGAsp:GAU,GAC Gly:GGU,GGC,GGA,GGGGlu:GAA,GAG

在上面的密码子表中，每个密码子显示为mRNA中的核苷酸序列并且其左手为5′-端。U表示RNA中的尿嘧啶碱基并且相应于DNA中的胸腺嘧啶。

与本发明基因双链DNA的编码链具有相同核苷酸序列的寡核苷酸称为“有义引物”并且具有与该编码链互补寡核苷酸序列的寡核苷酸称为“反义引物”。

与本发明基因编码链中5′-上游一侧具有相同核苷酸序列的有义引物和具有与该编码链3′-下游一侧核苷酸序列互补的核苷酸序列的反义引物例如，与作为模板的基因文库、基因组DNA或cDNA共同用于PCR反应以扩增DNA。作为待用的基因文库，例如，有源自大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜等的cDNA文库和基因组文库。该基因文库也可为根据常规文库构建方法，例如，在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社；“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述方法构建的文库或商业上可得到的基因文库。作为基因组DNA或cDNA，例如，有从大豆、藜科植物如甜菜或十字花科植物如芥菜或油菜等制备出的基因组DNA或cDNA。例如，通过用上面表3中的引物31和32并且用源自芥菜的cDNA作为模板进行PCR以扩增具有由SEQID NO:6核苷酸序列中749位到1215位核苷酸所表示核苷酸序列的DNA。此外，通过用该引物并且用源自油菜的cDNA作为模板进行PCR以扩增具有由SEQ ID NO:8核苷酸序列中1位到467位核苷酸所表示核苷酸序列的DNA。这样扩增出的核酸可通过常规的电泳加以确证。可根据常规的方法如在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社或“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆该核酸。对于该核酸，通过常规方法制备其限制性图谱或测定其核苷酸序列，从而可鉴定出含有棉子糖合酶基因或其一部分的核酸。当该核酸含有棉子糖合酶的一部分时，可根据其核苷酸序列进行PCR以扩增出含有5′-上游一侧核苷酸序列或3′-下游一侧核苷酸序列的核酸。即，根据上面获得的核酸的核苷酸序列，设计和合成反义引物用于扩增5′-上游一侧的部分，并且设计和合成有义引物用于扩增3′-下游一侧的部分。可通过用运些引物的RACE方法和商业上可得到的试剂盒如Clontech的Marathon Kit测定已获得核苷酸序列5′-上游一侧部分或3′-下游一侧部分的核苷酸序列。可通过根据这样测得核苷酸序列中的二个末端序列合成新的引物并再次进行PCR而获得全长棉子糖合酶基因。

本发明的上述测定方法也可用于植物如大豆、藜科植物或十字花科植物等基因型的分析中。更为具体地说，例如，根据常规方法，例如，在“克隆与测序(植物生物技术实验指南)”Itaru Watanabe监导下编辑(complied),Masahiro Sugiura编(edited),Noson Bunka-sha出版，东京(1989)中所述的方法制备源自大豆、藜科植物或十字花科植物的基因组DNA。以至少数种限制酶消化该基因组DNA，然后电泳。根据常规的方法将电泳过的DNA印迹至滤膜上。将此滤膜与通过常规方法从具有该基因片段DNA中制备的探针杂交，并检测与该探针杂交的DNA。比较特定植物种类不同变种间检测出DNA的长度。这种长度差异使分析这些变种间伴随棉子糖家族寡糖表达的表型特征差异成为可能。此外，当比较同一变种基因重组植物和非基因重组植物之间通过上述方法测得DNA的长度时，通过测定前者植物较后者植物杂交带数目更大或浓度更高而可区分出前者植物与后者植物。此方法可根据RFLP(限制性片段长度多态性)方法，例如在“植物PCR实验方法”KoShimamoto和Takuji Sasaki监导下编辑，Shujun-sha出版，东京(1995),ISBN4-87962-144-7,pp.90-94中所述方法完成。

此外，本发明的扩增方法可用于大豆、藜科植物或十字花科植物等基因的分析。更为具体地说，例如，本发明扩增方法通过应用从大豆、藜科植物或十字花科植物中制备的植物基因组DNA来完成以扩增DNA。将此扩增出的DNA与甲醛溶液混合，然后于85℃加热变性5分钟并且然后于冰上快速冷却。将其样品于，例如，含有0(v/v)％或10(v/v)％甘油的6(w/v)％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。对于该电泳，可应用商业上可得到的电泳仪如用于SSCP(单链构象多态性)的电泳仪并且维持凝胶于恒温，例如，于5℃、25℃、37℃等进行电泳。从该电泳过的凝胶中，例如，通过以商业上可得到的试剂用银染方法测定DNA。根据在被测DNA电泳中不同变种间行为的差异，测定棉子糖合酶基因中的突变，并且分析由该突变所致伴随以棉子糖家族寡糖表达的表型特征的差异。此方法可根据SSCP方法，例如，在“植物PCR实验方法”在KoShimamoto和Takuji Sasaki监导下编辑Shujun-sha出版，东京(1995),ISBN4-87962-144-7,pp.141-146中所述的方法完成。

通过上述测定方法对来自大豆、藜科植物或十字花科植物基因的分析或本发明的扩增方法不仅可用于分析伴随以棉子糖家族寡糖表达的表型特征差异，而且，例如，可用于根据大豆、藜科植物或十字花科植物新的变种的产生而筛选具有所需特征的克隆。此外，其也可用于根据用重组植物产生植物变种而鉴定这样制备的并且具有源自重组植物特征的克隆。

为了本发明基因在宿主细胞中的表达，优选地，可应用包括含有本发明基因核酸片段的核酸和在宿主细胞中具有启动子活性并且连接到前面的核酸片段上的核酸片段(之后称为本发明表达核酸)。

只要其在待转化的宿主中有功能，本发明表达核酸中具有启动子活性的核酸片段不局限于特定的一种。例如，有在大肠杆菌中有功能的合成启动子，如大肠杆菌乳糖操纵子启动子、大肠杆菌色氨酸操纵子启动子和tac启动子等；酵母乙醇脱氢酶基因(ADH)启动子、腺病毒主要晚期(Ad.ML)启动子、SV40早期启动子、杆状病毒启动子等。当宿主为植物时，启动子可包括，例如，T-DNA来源的组成性启动子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)启动子、章鱼氨酸合酶基因(OCS)启动子等；植物病毒来源的启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)来源的19S和35S启动子；可诱导的启动子如苯丙氨酸脱氨酶(PAL)基因启动子、查耳酮合酶(CHS)基因启动子、病理相关蛋白(PR)基因启动子等。此外，也可应用载体pSUM-GY1(参见JP-A06-189777/1994)，其具有导致在特定植物组织中特异性表达的启动子，如大豆来源的种子贮存蛋白大豆球蛋白基因启动子(JP-A6-189777)。

此外，可将具有终止子活性的核酸片段连接到本发明的表达核酸中。在此情况中，构建本发明表达核酸从而将具有终止子活性的核酸片段定位于棉子糖合酶基因的下游一般是优选的。只要其在待转化的宿主细胞中有功能，该待用的终止子没有特别的限制。例如，当宿主是植物时，有T-DNA来源的组成性终止子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)终止子等；植物来源的终止子如洋葱病毒GV1或GV2终止子等。

可根据常规的基因工程技术将本发明的表达核酸导入宿主细胞中以获得转化子。如果必要，依据用于导入该核酸至宿主细胞中的特定转化技术可将本发明的表达核酸插入到具有适宜标记的载体中。

可根据常规的方法，例如，在“分子克隆：实验指南第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社或“当今分子生物学方法”(1987),John Wiley&Sons公司，ISBN0-471-50338-X中所述的方法，将其中插入有本发明表达核酸的载体导入到微生物中。可根据筛选标记如抗生素抗性、营养缺陷等筛选出以该载体转化的微生物。当本发明基因连接到筛选微生物(如大肠杆菌转化子)中可翻译的形式中的可诱导启动子(如，tac启动子)下游时，本发明基因的翻译产物可在常规培养下和可诱导条件下表达并可回收成肽或蛋白。

这样制备的本发明基因翻译产物的棉子糖合酶活性可通过，例如，L.Lehle和W.Tanner，在欧洲生物化学杂志，38,103-110(1973)中描述的方法加以测定以鉴定出具有“经α(1→6)键结合D-半乳糖基至附着到蔗糖分子中D-葡萄糖残基6-位置碳原子上的羟基上能力”的翻译产物。更为具体地说，例如，将本发明基因克隆入pGEX-4T3(发玛西亚)中以获得含有本发明表达核酸的质粒。将得到的质粒导入，例如，大肠杆菌HB101菌株中以获得转化子。将得到的转化子培养过夜并将1ml培养物接种至100ml LB培养基中。将其于37℃孵育约3小时并加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至1mM的终浓度，然后进一步孵育5小时，通过离心从培养基中回收细胞并且通过加入10倍于细胞重量的100mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA、5mM DTT(二硫苏糖醇)、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和1mM苯甲酰胺而将其悬浮。用超声破碎仪(Branson)超声粉悬液以破碎细胞。离心破碎过的细胞悬液以回收可溶性蛋白溶液。将得到的蛋白溶液加入到含有终浓度为100mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM DTT(二硫苏糖醇)、0.01％BSA、200uM蔗糖、5mM肌醇半乳糖苷和31.7uM[¹⁴C]蔗糖的反应混合物中。将该反应混合物于37℃孵育，然后加入1.5倍体积的乙醇并搅拌。通过离心去除不溶性物质，将上清液点样于，例如，HPTLC纤维素薄层层析板(Merch,HPTLC平板纤维素)上且然后将平板用正丁醇-吡啶-水-乙酸(60:40:30:3)展开。干燥展开的平板并用富士胶片公司生产的图像分析仪(FUJIX Film Bio-Image AnalyzerBAS-2000Ⅱ)加以分析以测定产生的[¹⁴C]棉子糖从而测定棉子糖合酶的活性。

此外，按上述制备的翻译产物也可用作制备抗体的抗原。这样制备的抗体可用于，例如，从如植物的生物中制备的粗蛋白提取物中对本发明基因的检测和测定。

当宿主为植物时，可通过常规的方法如农杆菌感染方法(JP-B2-58917和JP-A60-70080)、电穿孔至原生质体(JP-A60-251887和JP-B5-68575)或粒子枪方法(JP-A5-508316和JP-A63-258525)将其中插入有本发明基因的载体导入植物细胞中。通过导入该载体而化的植物细胞可根据筛选标记，例如，对抗生素如卡那霉素或潮霉素的抗性而加以筛选。从这样转化的植物细胞中，可通过常规植物细胞培养方法，例如，在Uchimiya著的“植物基因操作手册(如何制备转基因植物)”，1990,Kodan-sha Scientfic(ISBN4-06-153513-7),pp.27-55中所述的方法再生转化的植物。此外，从该转化的植物中收集种子也使扩增该转化的植物成为可能。此外，该获得的转化植物与非转化植物之间的杂交使制备具有此转化植物特征的子代植物成为可能。

作为在大豆中的基因工程技术，基本上可利用上述常规的技术。更为具体地说，可以利用通过在EP301749中所述“粒子枪基因导入方法转化大豆植物品系”。例如，Torisky,R.S.,Kovacs,L,Avdiushko,S.,Newman,J.D.,Hunt,A.G.和Collins,G.B.，在“根据剧毒(supervirulent)根癌农杆菌Chry5菌株开发用于植物转化的双重载体(binary vector)系统”，植物细胞报告，(1997),17,p.102-108，等中所述的方法。

作为藜科植物中的基因工程技术，基本上可利用上述常规的技术。更为具体地说，可以利用，例如，M.Mannerlof,S.Tuvesson,P.Steen和P.Tenning，在“对草甘膦具有耐受性的转基因甜菜”，Euphytica(1997),94,p83-91中所述的方法，B.K.Konwar，在“根癌农杆菌介导的甜菜(Beta vulgaris L.)的遗传转化”，植物生物化学及生物技术杂志(1994),3,p.37-41中所述的方法。

作为十字花科植物的基因工程技术，基本上可利用上述常规的技术。更为具体地说，基因导入可根据，例如，J.Fry,A.Barnason和R.B.Horsch，在“以基于根癌农杆菌的载体对欧洲油菜(Brassicanapus)的转化”，植物细胞报告(1987),6.321-325中所述的方法完成。

例如，当基因导入通过农杆菌感染方法完成时，首先，将上述的本发明表达核酸插入双重载体中。可将得到的载体导入，例如，已通过氯化钙处理而变成感受态的农杆菌LBA4404菌株中。可根据该载体的筛选标记基因通过适当的筛选方法而筛选转化子，例如，在筛选标记基因为赋予对抗生素如卡那霉素抗性的基因时在含有抗生素的培养基中培养含有载体的菌株。可将得到的转化农杆菌菌株培养于液体培养基，例如，LB培养基中。

大豆、藜科植物或十字花科植物可通过应用这样获得的农杆菌转化子培养基按下述加以转化。例如，将来自大豆、甜菜、油菜或芥菜的种子无菌播种于，例如，含2％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS培养基中。约1周后，用解剖刀无菌切除长出植物的子叶及叶柄并且移植于，例如，含有3％蔗糖、0.7％琼脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D和3.3μMAgNO₃的MS培养基中并培养一天。将这样预培养出的子叶及叶柄转移到上面农杆菌培养基的1000-倍稀释液中并使其静置5分钟。将子叶及叶柄再次转移到与预培养相同的培养基中并培养约3到4天。将这样培养出的子叶及叶柄转移到，例如，含有3％蔗糖、0.7％琼脂、4.5μMBA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO₃和500mg/升头孢噻肟的MS培养基中，然后振动1天以去除微生物细胞。将得到的子叶及叶柄转移到，例如，含有3％蔗糖、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μMAgNO₃t100mg/升头孢噻肟及20mg/升卡那霉素的MS培养基中，然后培养3到4周。然后，将此子叶及叶柄转移至，例如，含有3％蔗糖、0.7％琼脂、4.5μM BA、0.05μM 24-D、100mg/升头孢噻肟及20mg/ml卡那霉素的MS培养基中并培养。以每3到4周传代培养而持续在此培养基中的培养。当再生出嫩枝时，将其传代培养于，例如，含有3％蔗糖、0.7琼脂和20mg/升卡那霉素的MS培养基中3到4周。当该植物产生出根时，将其转移到蛭石-泥炭藓(1:1)中并通过在12小时：12小时=白天时间：晚间的日夜条件下于21到22℃培养而使其适应。随着植物的生长，将其转移到适宜的培养土壤中以培养该植物。根据上述方法从该再生植物的叶子提取基因组DNA并且用具有本发明表达核酸的部分核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR以确证本发明基因插入到植物中。

如上面所述，通过导入本发明基因到植物，例如，大豆、藜科植物或十字花科植物，改变棉子糖合酶在植物中的表达水平和活性以控制棉子糖家族寡糖在该植物中的量是可能的，根据基因同源技术，例如，同源重组技术及反义技术、共抑制技术等，本发明基因在改变棉子糖合酶在大豆、藜科植物或十字花科植物中表达水平和活性的技术中是有用的。

下面的实施例进一步详细说明本发明而不应解释为要限制本发明的范围。

实施例1

大豆cDNA的制备

将大约2g未成熟大豆(Glycine max)Williams82的种子冻于液氮中且然后用研体研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并进一步彻底研磨该混合物。将研磨过的材料转移到离心管中，向其中加入4ml氯仿，并用涡轮混合器搅拌此混合物并且然后以6,500xg于4℃离心10分钟。收集水层，向其中加入100ml异丙醇，并且搅拌混合物且然后以6,500xg于4℃离心10分钟。将得到的沉淀物以10ml70％乙醇洗且然后溶解于1ml洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl/pH7.5,1mMEDTA,0.1％SDS)中。将该溶液于60℃静置10分钟且然后于10,000xg离心1分钟以去除不溶性物质。向得到的上清液中加入等体积的Oligotex-dT30(Takara)，并且搅拌该混合物且然后使其于65℃静置5分钟。此外，将该混合物置于冰上并且使其静置3分钟，向其中加入200μl 5M的NaCl，且混合该混合物且然后使其于37℃静置10分钟。然后以10,000xg于4℃离心该混合物3分钟。收集沉淀物并悬浮于1mlTE缓冲液中，并让此悬液置于冰上且然后使其静置3分钟，然后以10,000xg于4℃离心3分钟以去除沉淀物。

向得到的上清液中加入100μl 3M的醋酸钠和2ml乙醇以沉淀和收集RNA。以70％的乙醇洗收集的RNA两次且然后溶解于20ml无菌水中用于随后的cDNA合成。通过测定260nm处的吸收测定获得的RNA量。

为了cDNA合成，应用用于RT-PCR的第一条链合成试剂盒(Amersham)和cDNA合成试剂盒(Takara)，并且所有的操作均根据附于试剂盒中的方法完成。

实施例2

从大豆cDNA中克隆棉子糖合酶基因

通过用从实施例1中未成熟大豆(Glycine max)Williams82的种子中获得的cDNA作为模板和根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列设计的引物，即，具有下表4中所示核苷酸序列的引物进行PCR以扩增DNA片段。用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA试剂盒以珀金埃尔默公司的Gene Amp PCR Systems2400和DNA热循环仪480型进行PCR。通过重复维持于94℃1分钟、50℃3分钟且然后于72℃3分钟的循环40次以完成反应而扩增出该DNA片段。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆该扩增出的DNA片段，然后进行用珀金-埃尔默的ABI PRISM Dye Terminator Cycle测序即用反应试剂金的测序反应和以ABI的373S DNA测序仪对该核苷酸序列进行分析。根据此序列，合成具有示于下表5中核苷酸序列的引物。该cDNA合成用从实施例中大豆Williams82叶子中获得的mRNA以Clontech的Marathon试剂盒完成。将此获得的cDNA用连接酶连接到该试剂盒中所含的衔接子上。这些操作根据附着于该试剂盒中的方法完成。通过应用这样制备的连接到衔接子上的cDNA，根据上述相同的方式用示于下表5中的引物进行PCR。根据附于Clontech Marathon试剂盒中的方法分析该基因末端区域中的核苷酸序列。结果，测定了SEQ ID NO:2的核苷酸序列

表44-5-F引物：cgatggatgg giaaittiat icaiccigai tgggaiatgt t 41聚体4-6-RV引物：ggccacatit tiacia(ag)icc iatiggigci aa 32聚体

表55-SC-2:tgttactagg cgaaacaaga gtagctctga 30聚体

实施例3

藜科植物cDNA的制备

将大约2g甜菜(Beta vulgaris:haming)叶子冻于液氮中且然后用研体研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并将该混合物进一步彻底研磨。将研磨过的材料转移到离心管中，向其中加入4ml氯仿，并以涡轮混合器搅拌混合物且然后以6,500xg于4℃离心10分钟。收集水层，向其中加入10ml异丙醇，并且搅拌该混合物且然后以6,500g于4℃离心10分钟。以10ml70％的乙醇洗得到的沉淀物且然后溶解于1 80μl DEPC处理的无菌水。让该溶液于55℃静置5分钟并向其中加入20μl 5M NaCl。用BIOMAG mRNA纯化试剂盒(PerSeptiveBiosystems：目录号：8-MB4003K)纯化得到的溶液。

向得到的mRNA溶液中加入3M乙酸钠和乙醇，并沉淀和收集RNA。收集到的RNA用70％乙醇洗2次且然后溶解于20μl无菌水中，用于后面的cDNA合成。通过测定260nm处的吸收测定获得RNA的量。

为了cDNA合成，应用SMART PCR cDNA合成试剂盒(Clontech)，并且所有的操作根据附于试剂盒中的方法完成。

实施例4

藜科植物棉子糖合酶基因核苷酸序列的分析

合成具有示于下表6中核苷酸序列的合成DNA引物。PCR方法用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA试剂盒以珀金-埃尔默公司的Gene Amp PCR系统2400和DNA热循仪480型完成。用上述引物和在上面实施例3中获得甜菜cDNA通过重复维持于94℃1分钟、50℃3分钟且然后于72℃3分钟40个循环而进行PCR。结果，联合应用引物6-3-F和6-8-RV与引物6-10-F和6-6-RV分别扩增出大约0.3kb和0.6kb的带。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆此扩增出的DNA片段，然后用珀金-埃尔默公司的ABI PRISM DyeTerminator Cycle测序即用试剂盒进行测序反应并以ABI的373S DNA测序仪分析核苷酸序列。根据得到的核苷酸序列，制备具有示于下表7中核苷酸序列的合成DNA引物并且以上述相同的方式用实施例3中从甜菜获得的cDNA进行PCR。结果，最终从甜菜cDNA中获得具有SEQ IDNO:4核苷酸序列的DNA。

表66-3-F：cgaggiggit gicciccigg ittigtiati atigaigaig gitggca 47聚体6-8-RV：at(t/c)tt(a/g)tcia cigcia(a/g)(a/g)tc (t/c)tccatigt 29聚体6-10-F：ggiacitait gg(c/t)ticaigg itgicaiatg gticaitg 38聚体6-6-RV：ggccacatit tiacia(a/g)icc iatiggigci aa 32聚体

表77-Sb-1：atctatttgt catgacgatg atccga 26聚体7-Sb-2RV：ggccctcatt cccatattgg gatgatcctc 30聚体7-Sb-3RV：aagcatgcca aacatacaca tgctcaacag 30聚体7-Sb-4RV：agacccgggg aaagctttgg ggttactact 30聚体7-Sb-5：tggatgggaa actttataca ccctgact 28聚体7-Sb-6：gacatgttcc catctacaca cccttgtg 28聚体7-Sb-7：ccaatttatg ttagtgatgt tgttggcaag 30聚体7-Sb-8RV：tcgactccca gggtagaatt gtcatc 26聚体

实施例5

十字花科植物cDNA的制备

将大约2g芥菜(Brassica juncea)叶子冻于液氮中且然后用研体研磨，向其中加入20ml Isogen(Nippon Gene)，并将混合物进一步彻底研磨。将磨碎的材料转移至离心管中，向其中加入4ml氯仿，并且用旋涡振荡混合器搅拌该混合物且然后以6,500xg于4℃离心10分钟。收集水层，向其中加入10ml异丙醇，并且搅拌混合物且然后以6,500xg于4℃离心10分钟。以10ml70％的乙醇洗得到的沉淀物且然后溶解于1 80μl DEPE-处理过的无菌水中，让该溶液于55℃静置5分钟并且向其中加入10μl 5M的NaCl。用BIOMAG mRNA纯化试剂盒(PerSeptive Biosystems：目录号：8-MB4003K)纯化得到的溶液。

向得到的mRNA溶液中加入3M乙酸钠和乙醇，并沉淀和收集RNA。以70％的乙醇洗收集到的RNA2次且然后溶解于20μl无菌水中，用于后面的cDNA合成。通过测定260nm处的吸收测定获得RNA的量。

为了cDNA合成，应用SMART PCR cDNA合成试剂盒(Clontech)，并且所有的操作根据附于该试剂盒的方法完成。

从上述相同的方式，从未成熟油菜Westar(Brassica napus)的种子纯化mRNA并合成cDNA。

实施例6

十字花科植物棉子糖合酶基因的分离及核苷酸序列分析

合成具有示于下表8中核苷酸序列的DNA引物。用Clontech的Advantage KlenTaq cDNA试剂盒从珀金-埃尔默公司的Gene AmpPCR Systems2400和DNA热循环仪480型进行PCR。用上述引物和在实施例5中获得的芥菜cDNA通过重复维持于94℃1分钟，50℃3分钟且然后于72℃3分钟40个循环而完成PCR。通过琼脂糖凝胶电泳分析此反应产物。结果，检测到大约1.2kb条带的扩增。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆此扩增出的DNA片段，然后用珀金-埃尔默公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle测序即用反应试剂盒进行测序反应并且用ABI的373 S DNA测序仪进行核苷酸序列分析。根据得到的核苷酸序列，制备具有示于下表9中核苷酸序列的合成引物并且用在实施例5中获得的芥菜(Brassica juncea)欧洲油菜Westar(Brassicanapus)的cDNA根据上述相同的方式进行PCR。结果，最终分别从芥菜(Brassica juncea)和欧洲油菜Westar(Brassica napus)的cDNA中检测到由SEQ ID NO:6的第749个到第1215个核苷酸所表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO:8的1位到467位核苷酸所表示的核苷酸序列。

表88-#1：cgattiaaig titggtggac iacicaitgg gtigg 35聚体8-#l0RV：caitgiacca titgicaicc itgia(ag)ccai taigticc 38聚体

表99-引物-1：gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30聚体9-引物-2RV：caacggcgag atcttgcatc gtcaac 26聚体

实施例7

十字花科植物棉子糖合酶全长基因核苷酸序列的分析

根据在实施例6中获得的核苷酸序列，合成具有示于下表10中核苷酸序列的DNA引物。将与实施例5中所述相同方式获得的芥菜(Brassicajuncea)和欧洲油菜Westar(Brassica napus)的cDNA连接到Clontech的Marathon试剂盒中带有的衔接子上，通过应用这样制得的连接上衔接子的cDNA以示于表10中的引物进行PCR。10-B-2RV、10-B-3RV和10-B-4RV引物用于5′-末端的核苷酸分析，并且10-B-1、10-B-8、10-B-7和10-B-6引物用于3′-末端的核苷酸分析。根据附于Clontech Marathon试剂盒的方法分析此核苷酸序列。结果，分别从芥菜(Brassica juncea)和欧洲油菜Westar(Brassica napus)中检测到SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

表1010-B-2RV：ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30聚体10-B-3RV：ccacgtgcac cacccgaact tatcgac 27聚体10-B-4RV：aacatcgata ccatcggagt catgtccaat 30聚体10-B-1：gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30聚体10-B-8：tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29聚体10-B-7：gttgacgtca tccacatatt ggagatgttg t 31聚体10-B-6：gttatcgcta gcatggagca ctgtaatga 29聚体

实施例8

用于十字花科植物棉子糖合酶基因的植物表达载体的构建

根据在实施例7中获得的芥菜棉子糖合酶基因的核苷酸序列，制备具有示于表11中核苷酸序列的DNA引物。通过应用芥菜的cDNA，以与实施例6中相同的方式进行PCR。以SacI消化该扩增出的DNA片段。通过用连接试剂盒(Takara)将这样消化过的DNA片段连接到预先以SacI消化的载体pBI121(-)中。用BamHI和SacI消化质粒pBI121(Clontech)，并连接到示于表12中的接头(Ginker)上以制备载体pBI121(-)。通过限制性图谱和用具有示于表13中核苷酸序列的引物的PCR分析这样获得的载体，并且确证插入的棉子糖合酶基因的方向。将其中的芥菜棉子糖合酶基因从可表达的方向插入的载体命名为BjRS-Sac(+)-121并将其中的芥菜棉子糖合酶基因以相反方向插入的载体命名为BjRS-Sac(-)-121。

表1111-SacI-BjN：aacgagctca atccaaaatc tcatcaaata atcgc 35聚体11-SacI-BjintRV：acaatagttg agggcggaag agtag 25聚体

表1212-BamSac-(+)接头：gatcgagctc gtgtcggatc cagct 25聚体12-BamSac-(-)接头：ggatccgaca cgagctc 17聚体

表1313-35S-3：cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 30聚体13-B-2RV：ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30聚体13-B-8：tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29聚体

实施例9

用十字花科植物棉子糖合酶基因的转化

将实施例8中制备的载体BjRS-Sac(+)-121和BiRS-Sac(-)-121通过农杆菌感染方法用于芥菜(Brassica juncia)的转化。分别用在实施例8中制备的二种质粒BjRS-Sac(+)-121和BjRS-Sac(-)-121转化预先用氯化钙处理而转变为感受态的根癌农杆菌(具有利福平和链霉素抗性的菌株LBA4404)。通过利用由导入质粒卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶，NPTII)赋予的卡那霉素抗性特征在含有50μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子。

将获得的转化子农杆菌(根癌农杆菌LBA4404菌株：具有利福平和链霉素抗性)于28℃培养于含有50μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中完整的一天一夜，并通过下述方法将该培养物用于转化芥菜。

将芥菜的种子无菌种植于含有2％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS培养基。一周后，以解剖刀切下发芽植物的子叶和叶柄，并且转移至含有3％蔗糖、0.7％琼脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D和3.3μM AgNO₃的MS培养基中，然后预培养1天。将预培养的子叶和叶柄转移到农杆菌培养基的100倍稀释液中并使其静置5分钟。再次将子叶和叶柄转移至与预培养中所用相同的培养基中。并培养3到4天。将培养出的子叶和叶柄转移至含有3％蔗糖、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3,3μMAgNO₃和500m/l头孢噻肟的MS培养基中，且然后振荡1天以去除微生物细胞。将这样处理过的子叶和叶柄转移到含有3％蔗糖、0.7％琼脂、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3,3μM AgNO₃、100mg/l头孢噻肟和20mg/l卡那霉素的MS培养基中，并且培养。通过以3到4周的间隔传代培养而持续在该培养基上的培养。当嫩枝开始再生时，将这些嫩枝传代培养于含有3％蔗糖、0.7％琼脂和20mg/l卡那霉素的MS培养基中，并培养3到4周。将生根的植物转移到蛭石：泥炭藓=1∶1，并且从白天/晚上=12小时：12小时的循环于21℃到22℃培养。随着植物体生长的进行，将这些植物种植于培养土壤中。

序列简述

SEQ ID NO:1显示了由本发明棉子糖合酶基因所编码的棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2显示了本发明棉子糖合酶基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3显示了由从甜菜中获得棉子糖合酶基因所编码的棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4显示了从甜菜中获得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。

SEQ ID NO:5显示了由从芥菜中获得棉子糖合酶基因所编码棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6显示了从芥菜中获得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。

SEQ ID NO:7显示了由从油菜中获得棉子糖合酶基因所编码棉子糖合酶蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8显示了从油菜中获得棉子糖合酶基因的cDNA核苷酸序列。

表1：

显示于表1中的核苷酸序列为用于扩增具有棉子糖合酶基因DNA片段中典型引物的实例。所有这些序列依据SEQ ID NO:2的核苷酸序列。引物11为有义引物且引物12为反义引物。根据目的，适当的限制性酶识别序列可被添加到这些核苷酸序列的5′-末端。

表2：

显示于表2中的核苷酸序列为用于扩增棉子糖合酶基因cDNA中典型引物的实例。引物21为相应于甜菜来源的棉子糖合酶合酶基因的5′-端的有义引物。引物22为相应于3′-端的反义引物。根据目的，适当限制性酶的识别序列可添加到这些核苷酸序列的5′-端。

引物23为相应于开放阅读框N-端的有义引物，且引物24为相应于C-端的反义引物。

表3：

在表3中所显示的核苷酸序列中，引物31和32为用于扩增具有棉子糖合酶基因部分核苷酸序列的DNA中的典型引物。引物31为用于扩增具有来自芥菜和油菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列的DNA中的正义引物并且引物32为反义引物。根据目的，适当限制性酶的识别序列可添加到这些核苷酸序列的5′-端。

引物33和34为用于扩增芥菜棉子糖合酶基因cDNA中的典型引物。引物33和34均依据非翻译区中棉子糖合酶基因的核苷酸序列。引物33为相应于来源于芥菜的棉子糖合酶基因5′-端非翻译区的有义引物。引物34为相应于3′-端非翻译区的反光引物。

引物35和36为用于扩增在棉子糖合酶基因cDNA中编码棉子糖合酶蛋白氨基酸序列开放阅读框中的典型引物。引物35为相应于上面开放阅读框5′-端的有义引物。引物36为相应于3′-端的反义引物。根据目的，适当限制酶的识别序列可添加到这些核苷酸序列的5′-端。

表4：

显示于表4中核苷酸序列为用于克隆具有本发明棉子糖合酶基因DNA片段中的引物。由符号“i”表示的碱基为肌苷。显示于括号中的碱基意为这些碱基的混合物用于合成中。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表5：

显示于表5中的核苷酸序列为用于分析本发明棉子糖合酶基因核苷酸序列中的引物。5-SC-2用于分析3′-端区域中本发明的核苷酸序列。

表6：

显示于表6中的核苷酸序列为用于分析本发明甜菜棉子糖合酶基因中的引物。由符号“i”所表示的碱基“i”为肌苷。显示于括号中的碱基意为这些碱基的混合物用于合成中。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表7：

显示于表7中的核苷酸序列为根据甜菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列而合成的引物。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表8：

显示于表8中的核苷酸序列为用于分析芥菜棉子糖合酶基因cDNA核苷酸序列中的引物。由符号“i”所表示的碱基为肌苷。显示于括号中的碱基意为这些碱基的混合物。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表9：

显示于表9中的核苷酸序列为根据芥菜棉子糖合酶基因部分核苷酸序列而合成的引物。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表10：

显示于表10中的核苷酸序列为用于分析芥菜和油菜棉子糖合酶基因核苷酸序列中的引物。引物号后所用的符号“RV”意为由该符号所指的引物具有反义序列。

表11：

显示于表11中的核苷酸序列为用于扩增芥菜棉子糖合酶基因5′端区域中的引物，11-SacI-BjN为其中的SacI限制性位点添加到由SEQID NO:6中4位到第29位核苷酸所表示核苷酸序列上的引物。11-SacI-Bjint RV为具有相应于由SEQ ID NO:6中第1164个到1188个核苷酸所表示核苷酸序列的核苷酸序列的反义引物。

表12：

显示于表12中的核苷酸序列为添加到芥菜cDNA上的衔接子。当混合到一起时这些合成DNA采取双链的形式因为它们是互补的链。该衔接子两个末端均具有用于限制酶BamHI和SacI切割位点的粘性末端，并且在双链区域中含有用于限制酶BamHI和SacI的限制性位点。

表13：

显示于表13中的核苷酸序列为用于确证来源于芥菜棉子糖合酶基因插入方向中的引物。13-35S-3为相应于35S启动子的引物。13-B-2RV为具有由SEQ ID NO:6第593个到第622个核苷酸所表示核苷酸序列的反义引物，13-B-8为具有由SEQ ID NO:6中第1110位到1138位核苷酸所表示核苷酸序列的有义引物。

如上所述，根据本发明，提供可用于改变棉子糖合酶在植物中表达水平和活性技术中的棉子糖合酶基因是可能的。

无文本序列表

SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:20：为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22：为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物，n为i,r是a或g。

SEQ ID NO:23：为获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27：为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物，n为i,y为t或c,r是a或g。

SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35：为了获得棉子糖合酶设计的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37：为了获得棉子糖合酶而设计的寡核苷酸引物，n为i,r是a或g。

SEQ ID NO:38到SEQ ID NO:48：为了获得棉子糖合酶而设计的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50：为了获得棉子糖合酶而设计的寡核苷酸接头。

SEQ ID NO:51到SEQ ID NO:53：为了确认插入的棉子糖合酶基因的方向而设计的寡核苷酸引物。

序列表<110>Eijiro WATANABE等.；住友化学工业株式会社<120>棉子糖合酶基因及其应用<150>JP10/120550<151>1998-04-30<150>JP10/120551<151>1998-04-30<150>JP10/345590<151>1998-12-04<150>JP10/351246<151>1998-12-10<160>53<210>1<211>265<212>PRT<213>大豆<400>1Gln Ser Asp His Ala Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala Ile

5 10 15Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys His Asn Phe

20 25 30Lys Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Cys

35 40 45Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Val Asp Pro Leu

50 55 60His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys Cys Ser65 70 75 80Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys Pro Val

85 90 95Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Ser His Ser Val Thr Cys

100 105 110Phe Ala Ser Pro Gln Asp Ile Glu Trp Gly Lys Gly Lys His Pro Val

115 120 125Cys Ile Lys Gly Val Asp Val Phe Ala Val Tyr Met Phe Lys Asp Asp

130 135 140Lys Leu Lys Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Leu Glu145 150 155 160Pro Phe Ser Cys Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro Val Val Ile Leu Pro

165 170 175Arg Lys Ser Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met Leu Asn

180 185 190Ser Gly Gly Ser Ile Met Ser Leu Glu Phe Asp Gln Gln Glu Asn Leu

195 200 205Ala Arg Ile Gly Val Arg Gly His Gly Glu Met Arg Val Phe Ala Ser210 215 220Glu Lys Pro Glu Ser Val Lys Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Phe Asp225 230 235 240Tyr Val Asp Arg Thr Val Arg Leu Gln Val Ser Trp Pro Cys Ser Ser

245 250 255Arg Leu Ser Val Val Glu Tyr Leu Phe

260 265<210>2<211>928<212>DNA<213> 大豆<220><221>CDS<222>(2)…(799)<400>2c caa tct gat cat gct tgt gcc gaa ttc cac gct gct tct aga gcc 46Gln Ser Asp His Ala Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala

5 10 15att tct ggt gga cca att tat gta agc gac tct gtt gga aaa cac aac 94Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys His Asn

20 25 30ttc aag ttg ctt aag aag ctt gtt cta cct gat ggc tcc att ttg cgg 142Phe Lys Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg

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115 12 125gtt tgc atc aaa ggg gtg gac gta ttt gct gtg tac atg ttt aag gac 430Val Cys Ile Lys Gly Val Asp Val Phe Ala Val Tyr Met Phe Lys Asp

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145 150 155gag cct ttt agt tgt gag ctt ttg acc gtt tct cca gtg gtg atc tta 526Glu Pro Phe Ser Cys Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro Val Val Ile Leu160 165 170 175ccc aga aaa tca atc caa ttt gcc cca att gga ttg gta aac atg ctc 574Pro Arg Lys Ser Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met Leu

180 185 190aac tct ggg ggc tct att atg tca ttg gaa ttt gat caa cag gaa aat 622Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Ser Leu Glu Phe Asp Gln Gln Glu Asn

195 200 205ttg gcg agg att ggg gtg aga gga cat ggg gaa atg agg gta ttt gca 670Leu Ala Arg Ile Gly Val Arg Gly His Gly Glu Met Arg Val Phe Ala

210 215 220tca gag aag cca gag agt gtc aag att gat gga gaa tct gtg gaa ttt 718Ser Glu Lys Pro Glu Ser Val Lys Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Phe

225 230 235gat tat gtt gat aga acc gtg agg ctc caa gtc tcg tgg cct tgt tct 766Asp Tyr Val Asp Arg Thr Val Arg Leu Gln Val Ser Trp Pro Cys Ser240 245 250 255tcg agg ttg tcc gta gtc gag tat ttg ttc tga atcatgattt ggtgtccgag 819Ser Arg Leu Ser Val Val Glu Tyr Leu Phe

260 265agagccgtgt aatgttcaca taaactgact taagtgcatt aagcaaatcc accttaaata 879atagtgcata actttgttcc aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaa 928<210>3<211>783<212>PRT<213>甜菜<400>3Met Ala Pro Ser Phe Ser Lys Glu Asn Ser Lys Thr Cys Asp Glu Val

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20 25 30Ser Asn Phe Met Val Asn Gly His Val Ile Leu Ser Gln Val Pro Ser

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50 55 60Phe Asp Ala Pro Glu Pro Lys Ala Arg His Val Val Ser Val Gly Gln65 70 75 80Leu Lys Gly Ile Pro Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp

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100 105 110Gln Ile Leu lle Leu Asp Lys Ser Asp Glu Gly Leu Gly Arg Pro Tyr

115 120 125Ile Val Ile Leu Pro Leu Ile Glu Gly Pro Phe Arg Ala Ser Leu Gln

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165 170 175Gly Pro Asp Pro Phe Lys Leu Ile Lys Asp Thr Met Lys Glu Val Gln

180 185 190Ala His Leu Gly Thr Phe Lys Leu Leu Asp Asp Lys Thr Pro Pro Gly

195 200 205Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys

210 215 220Val Glu Pro Tyr Gly Val Trp Glu Gly Val Lys Gly Leu Val Glu Asn225 230 235 240Gly Val Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile

245 250 255Cys His Asp Asp Asp Pro Ile Thr Asp Gln Glu Gly Ile Asn Arg Thr

260 265 270Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Ile Lys Tyr Glu Glu Asn

275 280 285Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Lys Ser Pro Asn Ile Met Gly His Glu Asp

290 295 300His Pro Asn Met Gly Met Arg Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu305 310 315 320Phe Lys Thr Val Glu His Val Tyr Val Trp His Ala Phe Thr Gly Tyr

325 330 335Trp Gly Gly Val Arg Pro Asn Val Pro Gly Leu Pro Glu Ala Gln Val

340 345 350Val Thr Pro Lys Leu Ser Pro Gly Leu Glu Met Thr Met Glu Asp Leu

355 360 365Ala Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Ile Gly Leu Val Gln Pro Asp

370 375 380Lys Ala Gln Glu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Glu Asn Cys385 390 395 400Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Met

405 410 415Ala Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Lys Thr Tyr Tyr Lys

420 425 430Ala Ile Thr Glu Ser Val Arg Lys His Phe Lys Gly Asn Gly VaL Ile

435 440 445Ala Ser Met Glu Gln Cys Asn Asp Phe Met Leu Leu Gly Thr Glu Thr

450 455 460Ile Cys Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Pro Thr Asp Pro Ser465 470 475 480Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His

485 490 495Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile His Pro Asp Trp

500 505 510Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser

515 520 525Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Val Val Gly Lys

530 535 540His Asn Ile Pro Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Ser Ile545 550 555 560Leu Arg Cys Glu Tyr His Ala Leu Pro Thr Lys Asp Cys Leu Phe Val

565 570 575Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn

580 585 590Lys Tyr Asn Gly Val Leu Gly Val Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp

595 600 605Ser Arg Glu Ser Arg Lys Asn Leu Cys Phe Ser Glu Tyr Ser Lys Pro

610 615 620Ile Ser Cys Lys Thr Ser Pro Lys Asp Val Glu Trp Glu Asn Gly His625 630 635 640Lys Pro Phe Pro Ile Lys Gly Val Glu Cys Phe Ala Met Tyr Phe Thr

645 650 655Lys Glu Lys Lys Leu Ile Leu Ser Gln Leu Ser Asp Thr Ile Glu Ile

660 665 670Ser Leu Asp Pro Phe Asp Tyr Glu Leu Ile Val Val Ser Pro Met Thr

675 680 685Ile Leu Pro Trp Glu Ser Ile Ala Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn

690 695 700Met Leu Asn Ala Gly Gly Ala Val Lys Ser Leu Asp Ile Ser Glu Asp705 710 715 720Asn Glu Asp Lys Met Val Gln Val Gly Ile Lys Gly Ala Gly Glu Met

725 730 735Met Val Tyr Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Cys Arg Val Asn Gly Glu

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755 760 765Trp Asn His Asn Ser Gly Gly Phe Thr Thr Val Glu Tyr Leu Phe

770 775 780 783<210>4<211>2690<212>DNA<213>甜菜<220><221>CDS<222>(236)…(2587)<400>4ctaccaaatt ccacaactta aagttcacct caatctttat tccatttttc ctccctaaac 60ttcattgtta agattttgta attgaattca aattcttaat tctgaatttt gtcatttttt 120ttgtggggat atttataact atcatattat ttgtgtagat cattctacaa aaaagagagt 180gagttttttt agctcttatt tcctaagaaa ttaatagcaa aagttttgca taact atg 238

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355 360 365gtg gat aaa att gtt aat aat ggt att ggg ctt gtc cag cct gat aag 1390Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Ile Gly Leu Val Gln Pro Asp Lys370 375 380 385gcc caa gaa ctt tat gaa ggg ttg cat tct cat ttg gaa aat tgt ggg 1438Ala Gln Glu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Glu Asn Cys Gly

390 395 400att gat gga gtc aaa gtt gat gtc atc cat ttg ttg gag atg atg gca 1486Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Met Ala

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435 440 445agc atg gag cag tgc aac gat ttc atg ctc ctt ggt act gag acc att 1630Ser Met Glu Gln Cys Asn Asp Phe Met Leu Leu Gly Thr Glu Thr Ile450 455 460 465tgt ctt ggt cgc gtt ggg gat gac ttt tgg cca act gat ccg tct gga 1678Cys Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Pro Thr Asp Pro Ser Gly

470 475 480gat ata aat ggt aca tat tgg ctc caa ggc tgt cat atg gtg cat tgt 1726Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys

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515 520 525gcg att tct ggt gga cca att tat gtt agt gat gtt gtt ggc aag cat 1870Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Val Val Gly Lys His530 535 540 545aac atc ccc ttg ctc aaa agg ctc gtc ttg gct gat ggt tcg atc ctt 1918Asn Ile Pro Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Ser Ile Leu

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5 10 15Asp Leu Ser Gly Lys Pro Leu Phe Arg Leu Glu Gly Ser Asp Leu Leu

20 25 30Ala Asn Gly His Val Val Leu Thr Asp Val Pro Val Asn Val Thr Val

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115 120 125Gly Ser Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Glu Gly Ser

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165 170 175Val Tyr Val His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Lys Leu Val Lys Asp Ala

180 185 190Met Lys Val Val Arg Val His Met Asn Thr Phe Lys Leu Leu Glu Glu

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260 265 270Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Leu Lys

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290 295 300Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu Phe305 310 315 320Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp

325 330 335Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser Thr Ile Val

340 345 350Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln Asp Leu Ala

355 360 365Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser Pro Asp Met

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485 490 495Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp Trp Asp

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515 520 525Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val Gly Gln His

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595 600 605Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val Asn Thr Leu

610 615 620Thr Ala Thr Thr Asn Pro Lys Asp Val Glu Trp Asn Ser Gly Asn Asn625 630 635 640Pro Ile Ser Val Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe Leu Ser Gln

645 650 655Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Pro Asn Asp Asp Leu Glu Ile Thr

660 665 670Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro Val Val Thr

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740 745 750Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser Ala Pro Glu

755 760 765Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Glu Phe

770 775 777<210>6<211>2690<212>DNA<213>芥菜<220><221>CDS<222>(134)…(2467)<400>6accaatccaa aatctcatca aataatcgca attaggggaa gtttacaaga ttcatcatct 60ccgttactat ataactacgc tcttcttcct tcgcctaatc caacttaacc taaaaaccac 120tctatcagcg aaa atg gct cca ccg agc gta att aaa tcc gat gct gca 169

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255 260 265gat gtt gaa ggg atg agt tgt acc gtc gcc ggg gag caa atg cct tgc 985Asp Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys

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350 355 360caa gat ctc gcc gtt gat aag att gtc gat acc gga atc gga ttc gtc 1273Gln Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val365 370 375 380tcg ccg gac atg gcg aat gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt 1321Ser Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu

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115 120 125ggy tac tgg ggw ggt ctt cgt ccc gga gct cct act ctt ccg ccs tcr 432Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser

130 135 140act att gtc cgr cca gag ctc tcg ccg ggg ctt aag ttg acg atg caa 480Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln145 150 155 160gat ctc gcc gtt gat aag atc atc gat acc gga atc gga ttc gtc tcg 528Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Ile Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser

165 170 175ccg gac atg gcg aac gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt caa 576Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln

180 185 190aac gtc ggc att aac ggc gtt aaa gtt gac gtt ate cac ata ctg gag 624Asn Val Gly Ile Asn Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu

195 200 205atg ttg tgc gag aaa tat ggc ggg aga gtt gac ttg gct aaa gct tac 672Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr

210 215 220ttc aag gcg tta acg tcg tca gtg aat aag cat ttt gac ggc aac gcc 720Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Ala225 230 235 240gtt atc gcc agc atg gag cac tgt aat gac ttc atg ttc ctt gga acc 768Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr

245 250 255gaa gcc atc tct cta ggt cgt gtc ggt gat gac ttt tgg tgc acg gat 816Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp

260 265 270cca tct ggc gac att aac ggc acg tat tgg ctg caa gga tgt cac atg 864Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met

275 280 285gtc cac tgt gcc tac aac agt ctt tgg atg gga aat ttc atc cag cct 912Val His Cys Ala Tyr Asa Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro

290 295 300gat tgg gac atg ttt cag tcc aca cat cct tgt gct gag ttc cat gct 960Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala305 310 315 320gct tca cgt gcc atc tcc ggt ggg ccc att tac atc agc gat tgt gtg 1008Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val

325 330 335ggc cag cac gat ttc gat ctc ttg agg aga ctc gtt ttg cct gac ggt 1056Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Arg Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly

340 345 350tcg att ttg agg tgt gag tac tat gct ctc cca act cgt gac cgt ctc 1104Ser Ile Leu Arg Cys Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu

355 360 365ttt gaa gac cct ctt cat gat ggc aaa acc atg ctc aag att tgg aac 1152Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn

370 375 380ttg aac aag tac act gga atc atc gga gca ttc aac tgt caa gga gga 1200Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly385 390 395 400gga tgg tgc aga gaa act cga cgc gac caa tgc ttc tcc caa tgc gtt 1248Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asp Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val

405 410 415aac acg tta acc gcc aca aca aat cct aat gac gtt gaa tgg aac agt 1296Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Asn Asp Val Glu Trp Asn Ser

420 425 430ggg aac aac ccg atc tcc att gaa aac gtt gaa gag ttt gct ttg ttc 1344Gly Asn Asn Pro Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe

435 440 445ttg tct caa tcc aag aag ctt gtg ttg tcc ggg caa aac gat gat ctc 1392Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Gln Asn Asp Asp Leu

450 455 460gag atc aca tta gag ccc ttc aag ttc gag ctc atc act gtc tca cca 1440Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro465 470 475 480gtt gtc acc att gag ggc agt tcg gtt cag ttt gct cca atc gga ttg 1488Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu

485 490 495gtt aac atg ctt aac act agc ggt gcg att cga tcc ttg gtt tat cat 1536Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His

500 505 510gag gaa tcc gtt gag atc ggt gtt cgt ggt gct gga gaa ttc agg gtt 1584Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val

515 520 525tat gca tcg aag aaa cct gtg agc tgc aag att gat ggt gaa gat gtt 1632Tyr Ala Ser Lys Lys Pro Val Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Asp Val

530 535 540gag ttt ggg tac gaa gag tca atg gtg atg gtt caa gtg cct tgg tct 1680Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser545 550 555 560gca cca gag ggt ttg tct tct att aag tat ttg ttt tag agttatttaa 1729Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Leu Phe

565 570ggtgcttaat tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1762<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>9ccaatctgat catgcttgtg ccgaa 25<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>10ggaacaaagt tatgcactat tatttaaggt 30<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>11ctaccaaatt ccacaactta aagttca 27<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>12ggaataataa gcttcacaca tactgtactc tc 32<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>13atggctccaa gctttagcaa ggaaaattcc 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>14tcaaaataag tactcaacag tggtaaaacc 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>15ttggaagaga agacgccgcc gggaatcgtc 30<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>16ttaagccccg gcgagagctc tggccggaca 30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>17accaatccaa aatctcatca aataatcgca 30<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>18aaataatagg ggcagtacaa attacaccac 30<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>19atggctccac cgagcgtaat taaatccga 29<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>20ctaaaactca tacttaatag aagacaaacc 30<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的引物

n是i.<400>21cgatggatgg gnaanttnat ncanccngan tggganatgt t 41<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i,r是a或g。<400>22ggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa 32<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>23tgttactagg cgaaacaaga gtagctctga 30<210>24<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i.<400>24cgaggnggnt gnccnccngg nttngtnatn atngangang gntggca 47<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i,y是t或c,r是a或g。<400>25atyttrtcna cngcnarrtc ytccatngt 29<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i,y是t或c.<400>26ggnacntant ggytncangg ntgncanatg gtncantg 38<210>27<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i,r是a或g。<400>27ggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa 32<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>28atctatttgt catgacgatg atccga 26<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>29ggccctcatt cccatattgg gatgatcctc 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>30aagcatgcca aacatacaca tgctcaacag 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>31agacccgggg aaagctttgg ggttactact 30<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>32tggatgggaa actttataca ccctgact 28<210>33<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>33gacatgttcc catctacaca cccttgtg 28<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>34ccaatttatg ttagtgatgt tgttggcaag 30<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>35tcgactccca gggtagaatt gtcatc 26<210>36<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i.<400>36cgattnaang tntggtggac nacncantgg gtngg 35<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物

n是i,r是a或g。<400>37cantgnacca tntgncancc ntgnarccan tangtncc 38<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>38gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>39caacggcgag atcttgcatc gtcaac 26<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>40ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>41ccacgtgcac cacccgaact tatcgac 27<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>42aacatcgata ccatcggagt catgtccaat 30<210>43<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>43gttagggttc atatgaacac cttcaagctc 30<210>44<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>44tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29<210>45<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>45gttgacgtca tccacatatt ggagatgttg t 31<210>46<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>46gttatcgcta gcatggagca ctgtaatga 29<210>47<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>47aacgagctca atccaaaatc tcatcaaata atcgc 35<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>248acaatagttg agggcggaag agtag 25<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>49gatcgagctc gtgtcggatc cagct 25<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>50ggatccgaca cgagctc 17<210>51<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>51cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 30<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>52ggattcgaca caaaccgcca cgtcatcgtc 30<210>53<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了获得棉子糖合酶基因而设计的寡核苷酸引物<400>53tctacgtctg gcacgcgctt tgcggctac 29

Claims

1．棉子糖合酶基因，包括在严格的条件下可与选自如下的核苷酸序列杂交的核苷酸序列：

(a)编码由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(b)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列，

(c)编码由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(d)由SEQ ID NO:4所表示核苷酸序列中由236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列，

(e)编码由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列，

(f)由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列中由134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列，

(g)编码由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列，和

(h)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列，并且编码的蛋白能够经α-(1→6)键结合D-半乳糖基到附着于蔗糖分子中D-葡萄糖残基6-位碳原子上的羟基上以形成棉子糖。

2．棉子糖合酶基因，包括编码SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列。

4．棉子糖合酶基因，包括编码SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

5．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列中由236位到2584位核苷酸所表示的核苷酸序列。

6．棉子糖合酶基因，包括编码SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

7．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:6所表示核苷酸序列中134位到2467位核苷酸所表示的核苷酸序列。

8．棉子糖合酶基因，包括编码SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的核苷酸序列。

9．棉子糖合酶基因，包括由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列中1位到1719位核苷酸所表示的核苷酸序列。

11．核酸，包括权利要求1到10中任一项的棉子糖合酶基因的部分核苷酸序列。

12．用于检测含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用标记的权利要求11的核酸作为探针通过杂交检测所述的核酸。

13．用于扩增含有棉子糖合酶基因核酸的方法，包括用权利要求11的核酸作为引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述的核酸。

14．用于获取棉子糖合酶基因的方法，包括以下的步骤：

用标记的权利要求11的核酸作为探针通过杂交检测含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和

回收检测到的核酸。

15．用于获取棉子糖合酶基因的方法，包括以下的步骤：

用权利要求11的核酸作为引物通过PCR扩增含有所述棉子糖合酶基因的核酸，和

回收扩增的核酸。

16．核酸，包括含有权利要求1到10中任一项的棉子糖合酶基因的核酸，其被连接到在宿主细胞中表现出启动子活性的核酸上。

17．载体，包括权利要求1到10中任一项的棉子糖合酶基因。

18．转化子，其中权利要求1到10中任一项的棉子糖合酶基因被导入宿主细胞中。

19．转化子，其中权利要求16的核酸被导入宿主细胞中。

20．转化子，其中权利要求17的载体被导入宿主细胞中。

21．权利要求18到20中任一项的转化子，其中的宿主为微生物。

22．权利要求18到20中的任一项的转化子，其中的宿主为植物。

23．用于制备棉子糖合酶的方法，包括以下的步骤：

培养或种植权利要求18到22中任一项的转化子以制备棉子糖合酶，和

收集该棉子糖合酶。

24．包括由SEQ ID NO:1所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。

25．包括由SEQ ID NO:3所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。

26．包括由SEQ ID NO:5所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。

27．包括由SEQ ID NO:7所表示氨基酸序列的棉子糖合酶。