ES2327367T3 - Genes de la rafinosa sintasa y su uso. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A GENES DE RAFINOSA SINTASA QUE COMPRENDEN UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA HIBRIDABLE CON UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA SELECCIONADA A PARTIR DEL GRUPO FORMADO POR: (A) UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA LA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 1; (B) LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA REPRESENTADA POR LA SEQ ID NO: 2; (C) UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA LA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 3; (D) LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 4 O POR LOS NUCLEOTIDOS 236 A 2584 EN LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 4; (E) UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA LA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 5; (F) LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 6 O POR LOS NUCLEOTIDOS 134 A 2467 DE LA MISMA; (G) UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA LA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR LA SEQ ID NO: 6; (G) UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA LA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 7; Y (H) LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA REPRESENTADA POR SEQ ID NO: 8 O POR LOS NUCLEOTIDOS 1 A 1719 DE LA MISMA; BAJO CONDICIONES RESTRICTIVAS. DICHOS GENES CODIFICAN PARA UNA PROTEINA CAPAZ DE UNIR EL GRUPO D - GALACTOSILO A TRAVES DE UN ENLACE AL (1-->6), AL GRUPO HIDROXILO U NIDO AL ATOMO DE CARBONO EN POSICION 6 DEL RESIDUO DE D - GLUCOSA EN UNA MOLECULA DE SUCROSA, PARA FORMAR RAFINOSA.
Description
Genes de la rafinosa sintasa y su uso.
La presente invención se relaciona con genes de
la rafinosa sintasa y con su uso.
Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa
son derivados de la sacarosa, los cuales son representados mediante
la fórmula general:
o-\alpha-D-galactopira-nosil-(1\rightarrow6)_{n}-o-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)-\beta-D-fluctofura-nósido,
y se llaman "rafinosa" cuando n es 1, "estaquiosa" cuando
n es 2, "verbascosa" cuando n es 3 y "ajugosa" cuando n
es 4.
Se sabe que los oligosacáridos de la familia de
la rafinosa tienen el efecto de dar buenas condiciones de flora
enterobacteriana si están presentes en una cantidad apropiada en el
alimento. Por lo tanto, los oligosacáridos de la familia de la
rafinosa han sido ya utilizados como material alimenticio funcional
para adición a algunos tipos de alimentos y se han utilizado en el
campo de los alimentos específicos para la salud. Por otra pare,
los oligosacáridos de la familia de la rafinosa no se digieren ni se
absorben en mamíferos, tales como humanos, sino que son asimilados
y descompuestos por las enterobacterias para generar gases y
provocar meteorismo y trastornos de absorción. Por lo tanto, se ha
deseado regular apropiadamente la cantidad de oligosacáridos de la
familia de la rafinosa en alimentos y piensos.
Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa
son sintetizados por el sistema de biosíntesis de oligosacáridos de
la familia de la rafinosa partiendo de sacarosa en muchas plantas.
Este sistema biosintético normalmente incluye una reacción para la
adición secuencial de grupos galactosilo procedentes de galactinol a
través de un enlace \alpha (1\rightarrow6) al grupo hidroxilo
unido al átomo de carbono en la posición 6 del residuo de
D-glucosa en una molécula de sacarosa. La rafinosa
sintasa es la enzima implicada en la reacción para producir
rafinosa al permitir que un grupo D-galactosilo
derivado de galactinol forme el enlace \alpha (1\rightarrow6)
con el grupo hidroxilo unido al átomo de carbono en la posición 6
del residuo de D-glucosa en una molécula de
sacarosa en la primera etapa de este sistema biosintético. Se ha
sugerido que esta enzima constituye una etapa limitante de
velocidad en el sistema sintético anterior y, por lo tanto, esta
enzima es bastante importante en el control de la biosíntesis de
oligosacáridos de la familia de la rafinosa.
Un método para controlar el nivel de expresión o
la actividad de la rafinosa sintasa en plantas utilizando un gen de
rafinosa sintasa es entonces efectivo para controlar un sistema
biosintético de oligosacáridos de la familia de la rafinosa en
plantas con objeto de aumentar o disminuir la producción de rafinosa
en plantas. Así, se ha deseado disponer de un gen de rafinosa
sintasa que pueda ser usado en dicho método.
Se ha descrito una rafinosa sintasa capaz de
sintetizar rafinosa que tiene una actividad proliferadora de
Bacillus bifidus en JP 10.084.973.
El principal objeto de la presente invención es
proporcionar nuevos genes de rafinosa sintasa a partir de
plantas.
Este objeto, así como otros objetos y ventajas
de la presente invención, resultarán aparentes para los expertos en
la técnica gracias a la siguiente descripción.
En estas circunstancias, los presentes
inventores han aislado nuevos genes codificantes de la rafinosa
sintasa a partir de varias plantas.
Así, la presente invención proporciona
un gen de rafinosa sintasa que tiene una
secuencia nucleotídica hibridable en condiciones de estrictez con
una secuencia nucleotídica seleccionada entre el grupo consistente
en:
- (a)
- una secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5,
- (b)
- la secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 134º a 2467º de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 6,
- (c)
- una secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 7 y
- (d)
- la secuencia nucleotídica representada por los nucleotídicos 1º a 1719º de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 8,
y que codifica una proteína capaz de unir el
grupo D-galactosilo a través de un enlace \alpha
(1\rightarrow6) al grupo hidroxilo unido al átomo de carbono en
posición 6 del residuo de D-glucosa en una molécula
de sacarosa para formar rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el gen de rafinosa
sintasa comprende una secuencia nucleotídica codificante de la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5.
\newpage
En otra realización preferida, el gen de la
rafinosa sintasa comprende la secuencia nucleotídica representada
por los nucleótidos 134º a 2467º de la secuencia nucleotídica
representada por la SEC ID Nº: 6.
En otra realización preferida, el gen de la
rafinosa sintasa comprende una secuencia nucleotídica codificante
de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 7.
En otra realización preferida, el gen de la
rafinosa sintasa comprende la secuencia nucleotídica representada
por los nucleótidos 1º a 1719º de la secuencia nucleotídica
representada por la SEC ID Nº: 8.
En otra realización preferida, el gen de la
rafinosa sintasa comprende la secuencia nucleotídica representada
por la SEC ID Nº: 6 o la SEC ID Nº: 8.
La invención se relaciona también con el uso de
(una) una secuencia(s) nucleotídica(s)
parcial(es) de dichos genes de rafinosa sintasa,
específica(s) de dichos genes de rafinosa sintasa, para
detectar/amplificar/obtener dichos genes de rafinosa sintasa.
Otra realización de la invención es un método
para detectar un ácido nucleico que contiene un gen de rafinosa
sintasa, que consiste en detectar dicho ácido nucleico por
hibridación usando dicha secuencia nucleotídica parcial de la
invención en forma marcada a modo de sonda.
Aún otra realización de la invención es un
método para amplificar un ácido nucleico que contiene un gen de
rafinosa sintasa, que consiste en amplificar dicho ácido nucleico
por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando dicha secuencia
nucleotídica parcial como cebador.
La invención se relaciona también con un método
para obtener un gen de rafinosa sintasa, que consiste en las
siguientes etapas:
detectar un ácido nucleico que contiene dicho
gen de rafinosa sintasa por hibridación usando dicha secuencia
nucleotídica parcial marcada como sonda y
recuperar el ácido nucleico detectado.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la invención se relaciona
con un método para obtener un gen de rafinosa sintasa, que consiste
en las siguientes etapas:
amplificar un ácido nucleico que contiene dicho
gen de rafinosa sintasa por PCR usando dicha secuencia nucleotídica
parcial como cebador y
recuperar el ácido nucleico amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Más aún, la presente invención se relaciona con
ácidos nucleicos que comprenden dichos ácidos nucleicos que
contienen el gen de la rafinosa sintasa unidos a un ácido nucleico
que exhibe actividad promotora en una célula huésped.
Otra realización de la invención son vectores
que contienen dicho gen de rafinosa sintasa.
La invención se relaciona también con
transformantes no humanos, donde se introduce dicho gen de rafinosa
sintasa o dicho ácido nucleico o vector que lo contiene en una
célula huésped.
En una realización preferida de la invención,
dicho huésped transformado es un microorganismo.
En otra realización preferida, dicho huésped
transformado es una planta.
Más aún, la presente invención se relaciona con
un método para producir una rafinosa sintasa, que consiste en las
siguientes etapas:
cultivar o hacer crecer un transformante de la
presente invención para producir la rafinosa sintasa y
recoger la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, la presente invención se relaciona
con rafinosa sintasas que tienen la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 5 ó 7.
El término "ácido nucleico" aquí utilizado
significa un compuesto oligomérico o un compuesto de alto peso
molecular generalmente llamado "ADN" o "ARN".
Se pueden llevar a cabo las técnicas de
ingeniería genética descritas a continuación, por ejemplo, según
los métodos descritos en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2ª edición" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN
0-87969-309-6;
"Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley
& Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X;
"Current Protocols In Protein Science" (1995), John Wiley &
Sons, Inc. ISBN
0-471-11184-8.
Los genes de la presente invención pueden ser
obtenidos de plantas pertenecientes a la familia Cruciferae, tales
como la mostaza, la colza, etc. Como ejemplos específicos de los
genes de la presente invención, se incluyen los que tienen una
secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 5 o la secuencia nucleotídica
representada por la SEC ID Nº: 6 o por los nucleótidos 134º a 2467º
de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 6, una
secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 7 o la secuencia nucleotídica
representada por la SEC ID Nº: 8 o por los nucleótidos 1º a 1719º
de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 8.
Los genes de la presente invención pueden ser
obtenidos, por ejemplo, por el método siguiente.
Los genes de la presente invención derivados de
plantas cruciferas tales como la mostaza (Brassica juncea) y
la colza (Brassica napus) pueden ser obtenidos por el método
siguiente.
Por ejemplo, se congela tejido de una planta
crucífera, tal como mostaza o colza, en nitrógeno líquido y se
tritura físicamente con un mortero u otro medio para obtener un
polvo de restos de tejido finamente dividido. A partir del polvo de
restos de tejido, se extrae el ARN por un método convencional. Se
puede utilizar un kit de extracción de ARN comercial en la
extracción. Se recupera el ARN del extracto de ARN así obtenido por
precipitación con etanol. Se fracciona el ARN con cola de
poli-A a partir del ARN así recuperado por un método
convencional. Se puede utilizar una columna comercial de
oligo-dT en la fraccionación. Se sintetiza ADN a
partir del ARN con cola de poli-A así obtenido por
un método convencional. Se puede llevar a cabo la síntesis usando
un kit de síntesis de ADNc comercial. Se amplifica el ADN por PCR
usando el ADNc antes obtenido como plantilla y cebadores diseñados
y químicamente sintetizados en base a la secuencia nucleotídica de
la SEC ID Nº: 6. Por ejemplo, cuando se lleva a cabo la PCR usando
ADNc derivado de mostaza (Brassica juncea) como plantilla y
los cebadores 33 y 34 mostrados en la Lista 3 que se dará a
continuación, se pueden obtener los genes de plantas crucíferas de
la presente invención, v.g., el "gen de la rafinosa sintasa que
tiene una secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 5" y el "gen de la rafinosa
sintasa que tiene la secuencia nucleotídica representada por los
nucleótidos 1º a 2654º de la secuencia nucleotídica representada
por la SEC ID Nº: 6". Según un fin particular, también se pueden
diseñar y sintetizar los cebadores de PCR en base a la secuencia
nucleotídica de la SEC ID Nº: 6. Por ejemplo, con objeto de
amplificar el ADN codificante de la región del marco abierto de
lectura del "gen de la rafinosa sintasa que tiene una secuencia
nucleotídica codificante de una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 5" y del "gen de la rafinosa
sintasa que tiene la secuencia nucleotídica representada por los
nucleótidos 134º a 2467º de la SEC ID Nº: 6", se sintetizan y
usan como cebadores preferiblemente oligonucleótidos que tengan las
secuencias nucleotídicas representadas por los cebadores 35 y 36 de
la Lista 3.
Se puede clonar el ADN amplificado según un
método convencional, por ejemplo, como se describe en "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición" (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press; o "Current Protocols In Molecular
Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X.
Alternativamente, se puede realizar la clonación, por ejemplo,
utilizando un kit de clonación TA comercial (Invitrogen) o un vector
plasmídico comercial, tal como pBluescript II (Stratagene). Se
puede determinar la secuencia nucleotídica del clon de ADN por el
método de finalización didesoxi, tal como el descrito por F. Sanger,
S. Nicklen y A.R. Coulson, Proceedings of National Academy of
Science U.S.A. (1977), 74, pp. 5463-5467. Por
ejemplo, se puede usar preferiblemente el ABI PRISM Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit comercializado por
Perkin-Elmer.
Lista
3
- Cebador 31:
- ttggaagaga agacgccgcc gggaatcgtc 30mero
- Cebador 32:
- ttaagccccg gcgagagctc tggccggaca 30mero
- Cebador 33:
- accaatccaa aatctcatca aataatcgca 30mero
- Cebador 34:
- aaataatagg ggcagtacaa attacaccac 30mero
- Cebador 35:
- atggctccac cgagcgtaat taaatccga 29mero
- Cebador 36:
- ctaaaactca tacttaatag aagacaaacc 30mero
Se marca entonces un ácido nucleico que tiene
una secuencia nucleotídica parcial específica para el gen de la
presente invención (a la que en adelante se hará aquí referencia
como "el fragmento génico"), que se obtiene mediante el método
antes descrito, y se usa después como sonda en un método de
hibridación. Se puede hibridar la sonda con, por ejemplo, ADN
derivado de una planta crucífera para detectar un ácido nucleico al
que se une específicamente la sonda, detectando así un ácido
nucleico que tiene el gen de la rafinosa sintasa.
Como ADN derivado de una planta crucífera tal
como la mostaza o la colza, se puede usar, por ejemplo, una
librería de ADNc o una librería de ADN genómico de estas plantas. La
librería génica puede ser también una librería génica comercial
como tal o una librería construida según un método convencional de
construcción de librerías, por ejemplo como se describe en
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición" (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press; "Current Protocols In
Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X.
Como método de hibridación, se puede emplear,
por ejemplo, la hibridación de placas o la hibridación de colonias,
y se seleccionan dependiendo del tipo de vector usado en la
construcción de una librería. Más específicamente, cuando la
librería que se ha de usar es construida con vector fago, se mezcla
un microorganismo hospedador adecuado con el fago de la librería en
condiciones infecciosas para obtener transformantes. El
transformante es luego mezclado con un medio de agar blando y se
plaquea la mezcla sobre un medio de agar. A continuación, se
cultiva la mezcla a 37ºC hasta que aparece una placa de un tamaño
apropiado. Cuando la librería que se ha de utilizar es construida
con un vector plasmídico, se introduce el plásmido en un
microorganismo hospedador adecuado para formar transformantes. Se
diluye el transformante obtenido a una concentración adecuada y se
plaquea la dilución sobre un medio de agar, tras de lo cual se
cultiva a 37ºC hasta que aparece una colonia de un tamaño
apropiado. En cualquiera de los casos de las librerías anteriores,
se pone un filtro de membrana sobre la superficie del medio de agar
tras el cultivo anterior, de tal forma que el fago o el
transformante se transfiere a la membrana. Se desnaturaliza esta
membrana con un álcali, seguido de neutralización, y por ejemplo,
cuando se usa una membrana de nylon, se irradia la membrana con luz
ultravioleta, de tal forma que el ADN del fago o del transformante
se fija sobre la membrana. Se somete entonces esta membrana a un
método de hibridación en el que el fragmento génico que tiene una
secuencia nucleotídica parcial específica para el gen de la
presente invención y que está marcado por un método convencional (al
que en adelante se hará aquí referencia como "el fragmento génico
marcado") es usado como sonda. Para este método, se puede hacer
referencia, por ejemplo, a D.M. Glover ed., "DNA cloning, a
practical approach" IRL PRESS (1985), ISBN
0-947946-18-7.
Existen diversos reactivos y condiciones de temperatura para uso en
la hibridación. Por ejemplo, en general se realiza una
prehibridación por inmersión de la membrana en una solución de
prehibridación [SSC 6x (0,9 M NaCl, 0,09 M ácido cítrico), SDS 0,1
a 1% (p/v), 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado] e incubación a 65ºC durante 1 hora. Se lleva a
cabo entonces la hibridación por adición y mezcla del fragmento
génico marcado e incubación de la membrana a una temperatura de 42 a
68ºC durante 4 a 16 horas.
En la presente invención, las "condiciones
estrictas" son aquéllas en las que se realiza la incubación, por
ejemplo, a una temperatura de 65 a 68ºC en la anterior
hibridación.
Después de la hibridación, se extrae la membrana
y se lava con SSC 2x que contiene de un 0,1 a un 1% (p/v) de SDS,
se aclara después con SSC 0,2x que contiene de un 0,1 a un 1% (p/v)
de SDS y se seca luego. Se analiza la membrana, por ejemplo, por
autorradiografía u otras técnicas para detectar la posición de la
sonda sobre la membrana, detectando así la posición sobre la
membrana de un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica
homóloga a la de la sonda usada. Se identifica el clon
correspondiente a la posición del ácido nucleico así detectado
sobre la membrana en el medio de agar original y se selecciona el
clon positivo de tal forma que el clon que tiene el ácido nucleico
pueda ser aislado. Se repiten los mismos procedimientos de
detección para purificar el clon que tiene el ácido nucleico.
Alternativamente, se puede usar un kit
comercial, tal como el GENE TRAPPER ADNc Positive Section System
kit (GibcoBRL). En este método, se hibrida primeramente una librería
de ADN de una sola hebra con el fragmento génico biotinilado (es
decir, sonda), seguido de adición de perlas magnéticas unidas a
estreptoavidina y mezcla. Se recogen de esta mezcla las perlas
magnéticas unidas a estreptoavidina con un imán, de tal forma que se
recoge y detecta ADN de una sola hebra que tiene una secuencia
nucleotídica homóloga a la de la sonda usada, que se ha unido a
estas perlas a través del fragmento génico, biotina y
estreptoavidina. Se puede convertir el ADN de una sola hebra
recogido en una forma de doble hélice por reacción con una ADN
polimerasa adecuada usando un oligonucleótido adecuado como
cebador.
Como se ha descrito anteriormente, se puede
obtener un ácido nucleico que contenga el gen de la rafinosa
sintasa detectando un ácido nucleico hibridable con el fragmento
génico en ADN de una librería génica derivada de una planta
crucífera, purificando un clon que tenga el ácido nucleico y
aislando el ADN de fago o plásmido del clon. Preparando el mapa de
restricción o determinando la secuencia nucleotídica del ácido
nucleico así obtenido según un método convencional, se puede
confirmar el ácido nucleico que contiene el gen de la presente
invención.
El gen de la presente invención procedente de
una planta crucífera puede ser confirmado, por ejemplo, por el
punto siguiente:
- \quad
- La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica determinada tiene un 75% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 111º a 213º de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5;
- \quad
- un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 260º a 275º de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5;
- \quad
- un 70% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 293º a 325º de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5; o
- \quad
- un 70% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 609º a 695º de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5.
La "homología" utiliza aquí significa la
proporción del número de aminoácidos en una región que son
idénticos a los de una región diferente que se ha de comparar con el
número de todos los aminoácidos de la primera región, comparando
regiones que tienen similitud en dos secuencias de aminoácidos. En
este sentido, se prefiere que la región que tiene similitud
contenga más aminoácidos. Se puede evaluar dicha homología de
secuencias de aminoácidos usando un programa de análisis génico
comercial, tal como GENETIX (Software Kaihatu K.K.).
Además, del mismo modo que como se ha descrito
con anterioridad, se puede detectar un ácido nucleico que contenga
el gen de la rafinosa sintasa por hibridación con ADN del organismo
deseado usando el fragmento génico como sonda para detectar un
ácido nucleico al que la sonda se une específicamente (a lo que se
hará aquí referencia en adelante como el método de detección de la
presente invención). El fragmento génico aquí utilizado puede ser
químicamente sintetizado según un método convencional en base a la
secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 6 ó 8.
Alternativamente, se puede preparar por PCR usando como cebadores
oligonucleótidos químicamente sintetizados según un método
convencional en base a la secuencia nucleotídica representada por
la SEC ID Nº: 6 ó 8.
El fragmento génico puede ser una parte de la
región no traducida del gen de la rafinosa sintasa, así como su
marco abierto de lectura. Por ejemplo, se puede usar como sonda un
oligonucleótido que tenga la misma secuencia nucleotídica como
parte del lado secuencia arriba 5', tal como los nucleótidos 1º a
133º de la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº: 6, o como parte
del lado secuencia abajo 3', tal como los nucleótidos 2468º a 2676º
de la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº: 6.
Cuando se lleva a cabo la PCR usando los
fragmentos génicos como cebadores, es posible amplificar un ácido
nucleico que contenga el gen de la rafinosa sintasa a partir de ADN
derivado del organismo deseado (a lo que se hará aquí referencia en
adelante como el método de amplificación de la presente
invención).
Más específicamente, por ejemplo, se diseñan y
sintetizan químicamente oligonucleótidos que tengan las secuencias
nucleotídicas del fragmento génico según un método convencional. En
general, se prefiere que el número de nucleótidos sea mayor, desde
el punto de vista de que la especificidad de la hibridación quede
asegurada. También se prefiere, sin embargo, que el número de
nucleótidos no sea tan alto, desde los puntos de vista de que es
probable que los propios cebadores tengan una estructura superior
que dé un posible deterioro de la eficiencia de la hibridación y de
que se requieren procedimientos complicados en la purificación
después de la síntesis. Normalmente, se prefieren oligonucleótidos
compuestos por 15 a 50 bases. En este sentido, en base a la tabla
de codones que muestra la correspondencia de aminoácidos codificados
por codones, se puede sintetizar también una mezcla de cebadores
usando una mezcla de varias bases, de tal forma que un residuo en
una posición especificada de un cebador cambie a diferentes bases
según la variación de codones que pueden codificar un determinado
aminoácido. Alternativamente, por ejemplo, se puede usar una base,
tal como la inosina, que pueda formar un par de bases con varias
bases, en lugar de la anterior mezcla de varias bases.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En la anterior tabla de codones, se muestra cada
codón como la secuencia nucleotídica en el ARNm y su lado derecho
es el extremo 5'. U representa la base uracilo en el ARN y
corresponde a la base timina en el ADN.
Se denomina a un oligonucleótido que tiene la
misma secuencia nucleotídica que la hebra codificante del ADN de
doble hebra del gen de la presente invención "cebador sentido"
y se denomina a la que tiene una secuencia nucleotídica
complementaria a la hebra codificante "cebador
antisentido".
Se usan un cebador sentido que tiene la misma
secuencia nucleotídica que la del lado secuencia arriba 5' en la
hebra codificante del gen de la presente invención y un cebador
antisentido que tiene una secuencia nucleotídica complementaria de
la secuencia nucleotídica del lado secuencia abajo 3' en esta hebra
codificante en combinación para la reacción de PCR, por ejemplo con
una librería génica, ADN genómico o ADNc como plantilla para
amplificar el ADN. Como librería génica a utilizar, por ejemplo,
existen una librería de ADNc y una librería genómica derivadas de
una planta crucífera, tal como la mostaza o la colza, etc. La
librería génica puede ser también una librería construida según un
método de construcción de librerías convencional, por ejemplo como
se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; "Current
Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons,
Inc. ISBN
0-471-50338-X, o una
librería génica comercial como tal. Como ADN genómico o ADNc, por
ejemplo, están los preparados a partir de una planta crucífera, tal
como la mostaza o la colza, etc. Por ejemplo, se lleva a cabo una
PCR usando los cebadores 31 y 32 de la anterior Lista 3 y, como
plantilla, ADNc derivado de mostaza para amplificar ADN que tiene
la secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 749º a
1215º de la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº: 6. Además, se
lleva a cabo una PCR usando los cebadores y, como plantilla, ADNc
derivado de colza para amplificar ADN que tiene la secuencia
nucleotídica representada por los nucleótidos 1º a 467º de la
secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº: 8. Se puede confirmar el
ácido nucleico así amplificado por electroforesis convencional. Se
puede clonar el ácido nucleico según un método convencional, tal
como el descrito en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, o
"Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley
& Sons, Inc., ISBN
0-471-50338-X. Para
el ácido nucleico, se prepara su mapa de restricción o se determina
su secuencia nucleotídica por un método convencional, de tal forma
que se puede identificar el ácido nucleico que contiene el gen de la
rafinosa sintasa o una parte del mismo. Cuando el ácido nucleico
contiene una parte de la rafinosa sintasa, se puede llevar a cabo la
PCR en base a su secuencia nucleotídica para amplificar el ácido
nucleico que contiene la secuencia nucleotídica del lado secuencia
arriba 5' o la secuencia nucleotídica del lado secuencia abajo 3'.
Es decir, en base a la secuencia nucleotídica del ácido nucleico
antes obtenido, se diseña y sintetiza un cebador antisentido para
amplificación de la parte del lado secuencia arriba 5' y se diseña y
sintetiza un cebador sentido para amplificación de la parte del
lado secuencia abajo 3'. Se puede determinar la secuencia
nucleotídica de la parte del lado secuencia arriba 5' o la parte
del lado secuencia abajo 3' de la secuencia nucleotídica ya
obtenida por el método RACE usando estos cebadores y un kit
comercial, tal como el Marathon Kit de Clontech. Se puede obtener
el gen de la rafinosa sintasa de longitud completa sintetizando
nuevos cebadores en base a ambas secuencias terminales de la
secuencia nucleotídica así determinada y realizando de nuevo una
PCR.
También se puede usar el anterior método de
detección de la presente invención en el análisis de genotipos de
una planta, tal como una planta crucífera, etc. Más específicamente,
por ejemplo, se prepara un ADN genómico derivado de una planta
crucífera según un método convencional, por ejemplo como se describe
en "Cloning and Sequence (Plant Biotechnology Experiment
Manual)", preparado bajo la supervisión de Itaru Watanabe,
editado por Masahiro Sugiura, publicado por Noson Bunkasha, Tokyo
(1989).
Se digiere el ADN genómico con al menos varios
tipos de enzimas de restricción, seguido de electroforesis. Se
transfiere el ADN sometido a electroforesis a un filtro según un
método convencional. Se somete este filtro a hibridación con una
sonda preparada a partir de ADN que tiene el fragmento génico por un
método convencional y se detecta el ADN con el que se hibrida la
sonda. Se comparan los ADN detectados en cuanto a longitud entre
diferentes variedades de una especie de planta especificada. Las
diferencias de longitud hacen posible el análisis de las
diferencias en las características fenotípicas junto con la
expresión de oligosacáridos de la familia de la rafinosa entre
estas variedades. Más aún, cuando se comparan los ADN detectados por
el método anterior en cuanto a longitud entre la planta con el gen
recombinante y la planta que no tiene el gen recombinante de la
misma variedad, se puede distinguir la primera planta de la segunda
planta por detección de bandas de hibridación mayores en número o
superiores en concentración para la primera planta que para la
segunda planta. Este método puede ser llevado a cabo según el
método RFLP ("restriction fragment length polymorphism"), por
ejemplo, descrito en "Plant PCR Experiment Protocols",
preparado bajo la supervisión de Ko Shimamoto y Takuji Sasaki,
publicado por Shujun-sha, Tokyo (1995), ISBN
4-87962-144-7, pp.
90-94.
Además, se puede emplear el método de
amplificación de la presente invención para un análisis de genes de
una planta crucífera, etc. Más específicamente, por ejemplo, se
lleva a cabo el método de amplificación de la presente invención
utilizando ADN genómico de la planta preparado a partir de una
planta crucífera para amplificar ADN. Se mezcla el ADN amplificado
con una solución de formaldehído, seguido de desnaturalización por
calor a 85ºC durante 5 minutos y luego enfriamiento rápido sobre
hielo. Se somete una muestra del mismo a electroforesis sobre, por
ejemplo, un gel de poliacrilamida al 6% (p/v) que contiene un 0%
(v/v) o un 10% (v/v) de glicerol. Para esta electroforesis, se
puede usar un aparato de electroforesis comercial, tal como el
utilizado para el SSCP ("Single Strand Conformation
Polymorphism"), y se puede realizar la electroforesis
manteniendo el gel a una temperatura constante, por ejemplo a 5ºC,
25ºC, 37ºC, etc. A partir del gel sometido a electroforesis, se
detecta el ADN, por ejemplo, por un método tal como el método de
tinción con plata con un reactivo comercial. A partir de las
diferencias de comportamiento entre las variedades en la
electroforesis del ADN detectado, se detecta una mutación en el gen
de la rafinosa sintasa y se lleva a cabo un análisis para las
diferencias causadas por la mutación en las características
fenotípicas junto con la expresión de oligosacáridos de la familia
de la rafinosa. Se puede llevar a cabo este método según el método
SSCP, por ejemplo como se describe en "Plant PCR Experiment
Protocols", preparado bajo la supervisión de Ko Shimamoto y
Takuji Sasaki, publicado por Shujun-sha, Tokyo
(1995), ISBN
4-87962-144-7, pp.
141-146.
Se puede utilizar el análisis del gen vegetal de
una planta crucífera por el método de detección o el método de
amplificación anterior de la presente invención no sólo para el
análisis de las diferencias en las características fenotípicas
junto con la expresión de oligosacáridos de la familia de la
rafinosa, sino también, por ejemplo, para la selección de clones
que tienen las características deseadas al producir una nueva
variedad de una planta crucífera. Además, también se puede usar para
la identificación de un clon así producido y que tiene las
características derivadas de una planta recombinante al producir una
variedad de planta usando la planta recombinante.
Para la expresión del gen de la presente
invención en células de un hospedador, se puede usar preferiblemente
un ácido nucleico que comprende un fragmento de ácido nucleico que
contiene el gen de la presente invención y un fragmento de ácido
nucleico que tiene una actividad promotora en las células huésped y
que está unido al primer fragmento de ácido nucleico (al que en
adelante se hará aquí referencia como el ácido nucleico de
expresión de la presente invención).
El fragmento de ácido nucleico que tiene
actividad promotora en el ácido nucleico de expresión de la
presente invención no se limita a uno específico, en la medida en
que pueda funcionar en un huésped que haya de ser transformado. Por
ejemplo, hay promotores sintéticos con capacidad para funcionar en
Escherichia coli, tales como el promotor del operón de
lactosa de E. coli, el promotor del operón del triptófano de
E. coli y el promotor tac, etc.; el promotor del gen de la
alcohol deshidrogenasa (ADH) de levaduras, el promotor tardío mayor
de adenovirus (Ad.ML), el promotor temprano de SV40, el promotor de
baculovirus y similares. Cuando el hospedador es una planta, el
promotor puede incluir, por ejemplo, promotores constitutivos
derivados de ADN-T, tales como el promotor del gen
de la nopalina sintasa (NOS), el promotor del gen de la octopina
sintasa (OCS), etc.; promotores derivados de virus de plantas, tales
como los promotores 19S y 35S derivados del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV); promotores inducibles, tales como el promotor del
gen de la fenilalanina amonio-liasa (PAL), el
promotor del gen de la chalcona sintasa (CHS), el promotor del gen
de la proteína relacionada con la patogenia (PR), etc. Más aún,
también se puede usar el vector pSUM-GY1 (véase
JP-A 06-189.777/1994), el cual tiene
un promotor que da una expresión específica en un tejido vegetal
especificado, v.g., un promotor del gen de la proteína glicinina de
almacenamiento en semillas derivadas de soja (JP-A
6-189.777).
Más aún, se puede unir un fragmento de ácido
nucleico que tenga actividad finalizadora al ácido nucleico de
expresión de la presente invención. En este caso, se prefiere, en
general, construir el ácido nucleico de expresión de la presente
invención de tal modo que el fragmento de ácido nucleico que tiene
actividad finalizadora esté situado secuencia abajo del gen de la
rafinosa sintasa. El finalizador que se ha de usar no
particularmente limitado, en la medida en que pueda funcionar en
células de un hospedador que haya de ser transformado. Por ejemplo,
cuando el hospedador es una planta, existen finalizador
constitutivos derivados de ADN-T, tales como el
finalizador del gen de la nopalina sintasa (NOS), etc.;
finalizadores derivados de plantas, tales como los finalizadores
GV1 o GV2 del virus de Allium, y similares.
El ácido nucleico de expresión de la presente
invención puede ser introducido en una célula huésped según una
técnica convencional de ingeniería genética para obtener un
transformante no humano. Si es necesario, se puede insertar el
ácido nucleico de expresión de la presente invención en un vector
que tenga un marcador adecuado dependiendo de una técnica de
transformación para introducción del ácido nucleico en una célula
huésped.
Se puede introducir un vector en el que esté
insertado el ácido nucleico de expresión de la presente invención
en un microorganismo según un método convencional, por ejemplo como
se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, o en
"Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley
& Sons, Inc., ISBN
0-471-50338-X. Se
puede seleccionar el microorganismo transformado con el vector en
base a un marcador de selección, tal como resistencia a
antibióticos, auxotrofia o similares. En caso de que el gen de la
presente invención esté unido a la región secuencia debajo de un
promotor inducible (v.g., promotor tac) en la forma que puede ser
traducida en el microorganismo seleccionado (v.g., transformante
E. coli), se puede expresar un producto traducido del gen de
la presente invención bajo condiciones de cultivo e inducibles
convencionales y se puede recuperar como un péptido o una
proteína.
La actividad rafinosa sintasa del producto
traducido del gen de la presente invención así preparado puede ser
medida, por ejemplo, por un método descrito en L. Lehle y W. Tanner,
Eur. J. Biochem., 38, 103-110 (1973), para
identificar el producto traducido que tiene la "capacidad de unir
el grupo D-galactosilo a través de un enlace
\alpha (1\rightarrow6) al grupo hidroxilo unido al átomo de
carbono en posición 6 del residuo de D-glucosa en
la molécula de sacarosa". Más específicamente, por ejemplo, el
gen de la presente invención es clonado en pGEX-4T3
(Pharmacia) para obtener un plásmido que contiene el ácido nucleico
de expresión de la presente invención. Se introduce el plásmido
resultante en, por ejemplo, la cepa de E. coli HB101 para
obtener un transformante. Se cultiva el transformante resultante
durante la noche y se inocula 1 ml del cultivo en 100 ml de medio
de cultivo LB. Se incuba a 37ºC durante aproximadamente 3 horas y se
añade IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactósido)
a una concentración final de 1 mM, seguido de nueva incubación
durante 5 horas. Se recuperan las células del caldo de cultivo por
centrifugación y se suspenden por adición de 10 veces el peso
celular de Tris-HCl 100 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, DTT
(ditiotreitol) 5 mM, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 1 mM y
benzamida 1 mM. Se sonica la suspensión con un disruptor
ultrasónico (Branson) para romper las células. Se centrifuga la
suspensión de células rotas para recuperar una solución de proteína
soluble. Se añade la solución de proteína resultante a una mezcla
de reacción que contiene concentraciones finales de 100 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de DTT (ditiotreitol),
0,01% de BSA, 200 \muM de sacarosa, 5 mM de galactinol y 31,7
\muM de [^{14}C]sacarosa. Se incuba la mezcla de
reacción a 37ºC, seguido de adición de 1,5 veces en volumen de
etanol y agitación. Se eliminan los materiales insolubles por
centrifugación, se deposita el sobrenadante sobre, por ejemplo, una
placa de cromatografía en capa fina de celulosa HPTLC (Merch,
celulosa para placas HPTLC) y se revela luego la placa con
n-butanol-piridina-agua-ácido
acético (60:40:30:3). Se seca la placa revelada y se analiza con un
analizador de imagen (FUJIX Bio-Image Analyzer
BAS-2000II, fabricado por Fuji Film), para
determinar la [^{14}C]rafinosa producida con objeto de
medir la actividad rafinosa sintasa.
Además, también se puede usar el producto
traducido antes preparado como antígeno para producir un
anticuerpo. El anticuerpo así producido puede ser usado, por
ejemplo, para la detección y la determinación del gen de la
presente invención en un extracto de proteína bruta preparado a
partir de un organismo, tal como una planta.
Cuando el hospedador es una planta, el vector en
el que se inserta el gen de la presente invención puede ser
introducido en las células de la planta por un medio convencional,
tal como el método de infección con Agrobacterium
(JP-B 2-58.917 y
JP-A 60-70.080), la electroporación
en protoplastos (JP-A 60-251.887 y
JP-B 5-68.575) o el método de
pistola de partículas (JP-A
5-508.316 y JP-A
63-258.525). La célula vegetal transformada
mediante la introducción del vector puede ser seleccionada en base a
un marcador de selección, por ejemplo la resistencia a un
antibiótico, tal como kanamicina o higromicina. A partir de la
célula vegetal así transformada, se puede regenerar una planta
transformada por un método convencional de cultivo de células
vegetales, por ejemplo como se describe en "Plant Gene
Manipulation Manual (How to Produce Transgenic Plants)", escrito
por Uchimiya, 1990, Kodan-sha Scientific (ISBN
4-06-153513-7), pp.
27-55. Más aún, la recogida de semillas de la
planta transformada también hace posible la proliferación de la
planta transformada. Además, el cruce entre la planta transformada
obtenida y la planta no transformada hace posible producir una
progenie de plantas con las características de la planta
transformada.
Como técnicas de ingeniería genética en una
planta crucífera, se pueden emplear básicamente las técnicas
generales anteriores. Más específicamente, se puede realizar la
introducción del gen según un método, por ejemplo, descrito en J.
Fry, A. Barnason y R.B. Horsch, "Transformation of Brassica napus
with Agrobacterium tumefaciens based vectors", Plant Cell
Reports (1987), 6, 321-325.
Por ejemplo, cuando se realiza la introducción
del gen por el método de infección con Agrobacterium, en
primer lugar se inserta el ácido nucleico de expresión antes
descrito de la presente invención en un vector binario. El vector
resultante puede ser introducido en, por ejemplo, la cepa de
Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 convertida a un estado
competente por tratamiento con cloruro de calcio. Se puede
seleccionar un transformante por un método de selección apropiado
según el gen marcador de selección del vector, por ejemplo, cultivo
de una cepa que contiene el vector en un medio de cultivo que
contiene un antibiótico en caso de que el gen marcador de selección
sea el que da resistencia al antibiótico, tal como la kanamicina. La
cepa de Agrobacterium transformada resultante puede ser
cultivada en un medio de cultivo líquido, por ejemplo el medio
LB.
Se puede transformar una planta crucífera usando
el caldo de cultivo de transformantes de Agrobacterium así
obtenido como se describe a continuación. Por ejemplo, se siembran
asépticamente semillas de colza o de mostaza en, por ejemplo, medio
1/2 MS que contiene un 2% de sacarosa y un 0,7% de agar. Después de
aproximadamente 1 semana, se cortan los cotiledones y los pecíolos
de la planta germinada con un escalpelo asépticamente y se
trasplantan a, por ejemplo, medio MS que contiene un 3% de sacarosa,
un 0,7% de agar, BA 4,5 \muM, 2,4-D 0,05 \muM y
AgNO_{3} 3,3 \muM y se cultivan durante un día. Se transfieren
los cotiledones y los pecíolos así precultivados a una dilución
diluida 1.000 veces del anterior caldo de cultivo de
Agrobacterium y se deja reposar durante 5 minutos. Se
transfieren de nuevo los cotiledones y los pecíolos al mismo medio
que el del precultivo y se cultivan durante aproximadamente 3 a 4
días. Se transfieren los cotiledones y los pecíolos así cultivados
a, por ejemplo, medio MS que contiene un 3% de sacarosa, BA 4,5
\muM BA, 2,4-D 0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM
y 500 mg/litro de cefotaxima, seguido de agitación durante 1 día
para eliminar las células microbianas. Se transfieren los
cotiledones y pecíolos resultantes a, por ejemplo, medio MS que
contiene un 3% de sacarosa, un 0,7% de agar, BA 4,5 \muM BA,
2,4-D 0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM y 100
mg/litro de cefotaxima y 20 mg/litro de kanamicina, seguido de
cultivo durante 3 a 4 semanas. Se transfieren luego los cotiledones
y los pecíolos a, por ejemplo, medio MS que contiene un 3% de
sacarosa, un 0,7% de agar, BA 4,5 \muM BA, 2,4-D
0,05 \muM, 100 mg/litro de cefotaxima y 20 mg/litro de kanamicina
y se cultivan. Se continúa el cultivo en este medio con subcultivo
cada 3 a 4 semanas. Cuando se regenera un brote, se subcultiva éste
en, por ejemplo, medio MS que contiene un 3% de sacarosa, un 0,7% de
agar y 20 mg/litro de kanamicina durante 3 a 4 semanas. Cuando la
planta produce raíces, se transfiere a
vermiculita-serrín de turba (1:1) y se aclimata por
cultivo a una temperatura de 21 a 22ºC en condiciones de luz y
obscuridad de 12 horas:12 horas = día:noche. Al crecer la planta,
se transfiere a una tierra de cultivo apropiada para cultivar la
planta. Se extrae el ADN genómico de la hoja de la planta
regenerada según el método anterior y se lleva a cabo una PCR
usando cebadores que tienen secuencias nucleotídicas parciales del
ácido nucleico de expresión de la presente invención para confirmar
la inserción del gen de la presente invención en la planta.
Como se ha descrito aquí con anterioridad,
introduciendo el gen de la presente invención en una planta, por
ejemplo una planta crucífera, es posible variar el nivel de
expresión y la actividad de la rafinosa sintasa en la planta para
controlar la cantidad de oligosacáridos de la familia de la rafinosa
en la planta. El gen de la presente invención es útil en técnicas
para variar el nivel de expresión y la actividad de la rafinosa
sintasa en una planta crucífera en base a la homología génica, por
ejemplo técnicas tales como la recombinación homóloga y la técnica
antisentido, la cosupresión y similares.
Se congelaron aproximadamente 2 g de hojas de
mostaza (Brassica juncea) en nitrógeno líquido y se
trituraron luego con un mortero, al que se añadieron 20 ml de Isogen
(Nippon Gene), y se volvió a triturar la mezcla a conciencia. Se
transfirió el material triturado a un tubo de centrifugación, al que
se añadieron 4 ml de cloroformo, y se agitó la mezcla con una
mezcladora vórtex y se centrifugó después a 6.500 x g durante 10
minutos a 4ºC. Se recogió la capa acuosa, a la que se añadieron 10
ml de isopropanol, y se agitó la mezcla y se centrifugó después a
6.500 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se lavó el precipitado
resultante con 10 ml de etanol al 70% y luego se disolvió en 180
\mul de agua esterilizada tratada con DEPC. Se dejó que la
solución reposara a 55ºC durante 5 minutos y se le añadieron 20
\mul de NaCl 5 M. Se purificó la solución resultante usando el
KIT DE PURIFICACIÓN de ARNm BIOMAG (PerSeptive Biosystems: Nº
Catálogo 8-MB4003K).
Se añadieron a la solución resultante de ARNm
acetato de sodio 3 M y etanol y se precipitó y recogió el ARN. Se
lavó el ARN recogido dos veces con etanol al 70% y se disolvió
después en 20 \mul de agua esterilizada y se utilizó para la
posterior síntesis de ADNc. Se determinó la cantidad de ARN obtenido
por medición de la absorbancia a 260 nm.
Para la síntesis de ADNc, se usó el SMART PCR
ADNc Synthesis Kit (Clontech) y se realizaron todas las operaciones
según el protocolo adjunto al kit.
Del mismo modo que como se ha descrito
anteriormente, se purificó el ARNm de semillas inmaduras de colza
Westar (Brassica napus) y se sintetizó el ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron cebadores de ARN que tenían las
secuencias nucleotídicas mostradas en la Lista 8 siguiente. Se
llevó a cabo una PCR con el Gene Amp PCR Systems 2400 y el DNA
Thermal Cycler Modelo 480 de Perkin-Elmer usando el
Advantage KlenTaq ADNc Kit de Clontech. Se realizó la PCR con los
cebadores anteriores y ADNc de mostaza obtenido en el Ejemplo 1
repitiendo el ciclo de mantenimiento a 94ºC durante 1 minuto, a 50ºC
durante 3 minutos y luego a 72ºC durante 3 minutos 40 veces. Se
analizaron los productos de la reacción por electroforesis en gel
de agarosa. Como resultado, se detectó una amplificación de
aproximadamente las bandas de 1,2 kb. Se clonó el fragmento de ADN
amplificado con el kit de clonación TA (Invitrogen), seguido de una
reacción de secuenciación usando el ABI PRISM Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer y de
un análisis de secuencia nucleotídica con un secuenciador de ADN
373S de ABI. En base a la secuencia nucleotídica resultante, se
prepararon cebadores sintéticos que tenían las secuencias
nucleotídicas mostradas en la Lista 9 siguiente y se llevó a cabo
la PCR usando ADNc de mostaza (Brassica juncea) y colza
Westar (Brassica napus) obtenidos en el Ejemplo 1 del mismo
modo que antes. Como resultado, se determinaron finalmente las
secuencias nucleotídicas representada por los nucleótidos 749º a
1215º de la SEC ID Nº: 6 y por los nucleótidos 1º a 467º de la SEC
ID Nº: 8 para el ADNc de mostaza (Brassica juncea) y de colza
Westar (Brassica napus), respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
8
\vskip1.000000\baselineskip
En base a las secuencias nucleotídicas obtenidas
en el Ejemplo 2, se sintetizaron cebadores de ADN que tenían las
secuencias nucleotídicas mostradas en la Lista 10 siguiente. Se
ligaron los ADNc de mostaza (Brassica juncea) y colza Westar
(Brassica napus) obtenidos del mismo modo que como se
describe en el Ejemplo 1 a los adaptadores contenidos en el
Marathon Kit de Clontech. Utilizando los ADNc ligados a adaptadores
así preparados, se llevó a cabo una PCR con los cebadores mostrados
en la Lista 10. Se utilizaron los cebadores
10-B-2RV,
10-B-3RV y
10-B-4RV para el análisis de
nucleótidos de los extremos 5' y se utilizaron los cebadores
10-B-1,
10-B-8,
10-B-7 y
10-B-6 para el análisis de
nucleótidos de los extremos 3'. Se analizaron las secuencias
nucleotídicas según el protocolo adjunto al Marathon Kit de
Clontech. Como resultado, se determinaron las secuencias
nucleotídicas de la SEC ID Nº: 6 y de la SEC ID Nº: 8 de mostaza
(Brassica juncea) y colza Westar (Brassica napus),
respectivamente.
\newpage
Lista
10
\vskip1.000000\baselineskip
En base a la secuencia nucleotídica del gen de
la rafinosa sintasa de mostaza obtenido en el Ejemplo 3, se
prepararon cebadores de ADN que tenían las secuencias nucleotídicas
mostradas en la Lista 11. Utilizando ADNc de mostaza, se llevó a
cabo una PCR del mismo modo que como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se digirió el fragmento de ADN amplificado con SacI. Se ligó el
fragmento de ADN así digerido al vector pBI121(-) previamente
digerido con SacI utilizando el Ligation Kit (Takara). Se digirió el
plásmido pBI121 (Clontech) con BamHI y SacI y se ligó a los
conectores mostrados en la Lista 12 para preparar el vector
pBI121(-). Se analizó el vector así obtenido por medio de un mapa
de restricción y de PCR usando cebadores que tenían las secuencias
nucleotídicas mostradas en la Lista 13 y se confirmó la dirección
del gen de rafinosa sintasa insertado. El vector cuyo gen de
rafinosa sintasa procedente de la mostaza estaba insertado en la
dirección expresable fue designado como
BjRS-Sac(+)-121 y aquél cuyo gen de
rafinosa sintasa procedente de la mostaza estaba insertado en la
dirección inversa fue designado como
BjRS-Sac(-)-121.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
11
Lista
12
\newpage
Lista
13
Se usaron los vectores
BjRS-Sac(+)-121 y
BjRS-Sac(-)-121 preparados en el
Ejemplo 4 para la transformación de la mostaza (Brassica
juncia) por el método de infección con Agrobacterium.
Se transformó Agrobacterium tumefaciens
(cepa LBA4404, con resistencia a rifampicina y estreptomicina),
previamente convertido en un estado competente por tratamiento con
cloruro de calcio, independientemente con dos plásmidos
BjRSSac(+)-121 y
BjRS-Sac(-)-121 preparados en el
Ejemplo 4. Se seleccionaron los transformantes en medio LB que
contenía 50 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de kanamicina
utilizando el carácter resistente a la kanamicina conferido por el
gen resistente a la kanamicina (neomicina fosfotransferasa, NPTII)
de los plásmidos introducidos.
Se cultivó el Agrobacterium transformante
obtenido (Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404: resistente
a rifampicina y estreptomicina) en medio LB que contenía 50
\mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de kanamicina a 28ºC
durante todo un día y una noche y se usó el cultivo para la
transformación de la mostaza por el método que se describe a
continuación.
Se sembraron asépticamente las semillas de
mostaza sobre medio 1/2 MS que contenía un 2% de sacarosa y un 0,7%
de agar. Al cabo de una semana, se cortaron los cotiledones y los
pecíolos de las plantas germinadas con un escalpelo y se
transfirieron a medio MS que contenía un 3% de sacarosa, un 0,7% de
agar, BA 4,5 \muM, 2,4-D 0,05 \muM y AgNO_{3}
3,3 \muM, seguido de precultivo durante 1 día. Se transfirieron
los cotiledones y los pecíolos precultivados a una dilución 1.000
veces diluida del caldo de cultivo de Agrobacterium y se
dejó que reposaran durante 5 minutos. Se transfirieron de nuevo los
cotiledones y los pecíolos al mismo medio que el utilizado en el
precultivo y se cultivaron durante 3 a 4 días. Se transfirieron los
cotiledones y los pecíolos cultivados a medio MS que contenía un 3%
de sacarosa, BA 4,5 \muM, 2,4-D 0,05 \muM,
AgNO_{3} 3,3 \muM y 500 mg/l de cefotaxima y se agitaron
durante 1 día para eliminar las células microbianas. Se
transfirieron los cotiledones y los pecíolos así tratados a medio MS
que contenía un 3% de sacarosa, un 0,7% de agar, BA 4,5 \muM,
2,4-D 0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM, 100 mg/l
de cefotaxima y 20 mg/l de kanamicina y se cultivaron durante 3 a 4
semanas. Se transfirieron los cotiledones y los pecíolos a medio MS
que contenía un 3% de sacarosa, un 0,7% de agar, BA 4,5 \muM,
2,4-D 0,05 \muM, 100 mg/l de cefotaxima y 20 mg/l
de kanamicina y se cultivaron. Se continuó el cultivo en este medio
con subcultivos a intervalos de 3 a 4 semanas. Cuando los brotes
comienzan a regenerarse, se subcultivan estos brotes en medio MS que
contiene un 3% sacarosa, un 0,7% de agar y 20 mg/l de kanamicina y
se cultivan durante 3 a 4 semanas. Se transfieren las plantas
enraizadas a vermiculita:serrín de turba = 1:1 y se cultivan a una
temperatura de 21ºC a 22ºC en un ciclo de día/noche = 12 horas:12
horas. Al progresar el crecimiento del cuerpo de la planta, se
cultivan las plantas con tierra de cultivo.
La SEC ID Nº: 5 muestra una secuencia de
aminoácidos de una proteína rafinosa sintasa codificada por el gen
de la rafinosa sintasa obtenido de la mostaza.
La SEC ID Nº: 6 muestra una secuencia
nucleotídica de ADNc del gen de la rafinosa sintasa obtenido de la
mostaza.
La SEC ID Nº: 7 muestra una secuencia de
aminoácidos de una proteína rafinosa sintasa codificada por el gen
de la rafinosa sintasa obtenido de la colza.
La SEC ID Nº: 8 muestra una secuencia
nucleotídica de ADNc del gen de la rafinosa sintasa obtenido de la
colza.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
3
Entre las secuencias nucleotídicas mostradas en
la Lista 3, los cebadores 31 y 32 son cebadores típicos usados en
la amplificación de un ADN que tiene la secuencia nucleotídica
parcial de un gen de rafinosa sintasa. El cebador 31 es un cebador
sentido usado en la amplificación de un ADN que tiene la secuencia
nucleotídica parcial de un gen de rafinosa sintasa de mostaza y
colza y el cebador 32 es un cebador antisentido. Dependiendo del
objetivo, se pueden añadir secuencias de reconocimiento para enzimas
de restricción adecuadas a los extremos 5' de estas secuencias
nucleotídicas.
Los cebadores 33 y 34 son los cebadores típicos
usados en la amplificación de un ADNc de un gen de rafinosa sintasa
de mostaza. Los cebadores 33 y 34 se basan ambos en la secuencia
nucleotídica de un gen de rafinosa sintasa en la región no
traducida. El cebador 33 es un cebador sentido correspondiente a la
región no traducida 5'-terminal del gen de rafinosa
sintasa derivado de mostaza. El cebador 34 es un cebador antisentido
correspondiente a la región no traducida
3'-terminal.
Los cebadores 35 y 36 son cebadores típicos
usados en la amplificación de un marco abierto de lectura que
codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína rafinosa
sintasa en el ADNc de un gen de rafinosa sintasa. El cebador 35 es
un cebador sentido correspondiente al extremo 5' del anterior marco
abierto de lectura. El cebador 36 es un cebador antisentido
correspondiente al extremo 3'. Dependiendo del objetivo, se pueden
añadir secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción
adecuadas a los extremos 5' de estas secuencias nucleotídicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
8
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 8 son de los cebadores usados en el análisis de la secuencia
de nucleótidos de ADNc de un gen de rafinosa sintasa de mostaza. La
base representada por el símbolo "i" es la inosina. Las bases
mostradas entre paréntesis significan una mezcla de esas bases. El
símbolo "RV", tal como se utiliza después del número del
cebador, significa que el cebador al que se hace referencia
mediante este símbolo tiene una secuencia antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
9
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 9 son de los cebadores sintetizados sobre las secuencias
nucleotídicas parciales del gen de la rafinosa sintasa de mostaza.
El símbolo "RV", tal como se utiliza después del número del
cebador, significa que el cebador al que se hace referencia mediante
este símbolo tiene una secuencia
antisentido.
antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
10
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 10 son de los cebadores usados en el análisis de las
secuencias nucleotídicas del gen de la rafinosa sintasa de mostaza y
de colza. El símbolo "RV", tal como se utiliza después del
número del cebador significa que el cebador al que se hace
referencia mediante este símbolo tiene una secuencia
antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
11
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 11 son de los cebadores usados en la amplificación de la
región 5'-terminal de un gen de rafinosa sintasa de
mostaza. 11-SacI-BjN es un cebador
cuyo sitio de restricción SacI es añadido a la secuencia
nucleotídica representada por los nucleótidos 4º a 29º en la SEC ID
Nº: 6. 11-SacI-BjintRV es un cebador
antisentido que tiene una secuencia nucleotídica correspondiente a
la secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 1164º a
1188º en la SEC ID Nº: 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
12
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 12 son de los adaptadores añadidos a un ADNc de mostaza.
Estos ADN sintéticos adoptan una forma de doble hélice cuando se
mezclan entre sí, ya que son hebras complementarias. Este adaptador
tiene extremos cohesivos de sitios de escisión para las enzimas de
restricción BamHI y SacI en ambos extremos y contiene los sitios de
restricción para las enzimas de restricción BamHI y SacI en la
región de doble hélice.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
13
Las secuencias nucleotídicas mostradas en la
Lista 13 son de los cebadores usados en la confirmación de la
dirección de inserción del gen de rafinosa sintasa derivado de
mostaza. 13-35S-3 es un cebador de
sentido al promotor 35S. 13-B-2RV
es un cebador antisentido que tiene la secuencia nucleotídica
representada por los nucleótidos 593º a 622º de la SEC ID Nº: 6,
13-B-8 es un cebador sentido que
tiene la secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos
1110º a 1138º en la SEC ID Nº: 6.
\newpage
Tal como se ha descrito aquí con anterioridad,
según la presente invención, es posible proporcionar genes de
rafinosa sintasa que pueden ser utilizados en técnicas para variar
el nivel de expresión y la actividad de la rafinosa sintasa en
plantas.
SEC ID Nº: 9 a SEC ID Nº: 20: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa.
SEC ID Nº: 21 y SEC ID Nº: 22: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa, n es i y r es a o g.
SEC ID Nº: 23: Cebador oligonucleotídico
designado para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
SEC ID Nº: 24 a SEC ID Nº: 27: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa, n es i, y es t o c y r es a o g.
SEC ID Nº: 28 a SEC ID Nº: 35: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa.
SEC ID Nº: 36 y SEC ID Nº: 37: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa, n es i y r es a o g.
SEC ID Nº: 38 a SEC ID Nº: 48: Cebador
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa.
SEC ID Nº: 49 y SEC ID Nº: 50: Conector
oligonucleotídico diseñado para obtener el gen de la rafinosa
sintasa.
SEC ID Nº: 51 a SEC ID Nº: 53: Cebador
oligonucleotídico diseñado para confirmar la dirección del gen de la
rafinosa sintasa insertado.
<110> Eijiro WATANABE y col.; Sumitomo
Chemical Company Limited
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes de rafinosa sintasa y su
uso
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/120.550
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-04-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/120.551
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-04-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/345.590
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/351.246
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 265
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 928
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)... (799)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 783
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Beta vulgaris L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2690
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Beta vulgaris L.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (236)... (2587)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica juncea
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2690
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica juncea
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (134) ... (2467)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (1719)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 13
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 14
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 15
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 16
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 17
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 18
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 18
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\hskip1cm
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<210> 19
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 30
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<212> ADN
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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\hskip1cm
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<210> 21
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i.
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<400> 21
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\hskip1cm
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i y r es a o g.
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<400> 23
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<210> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i.
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i, y es t o c y r
es a o g.
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<400> 25
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i e y es t o c.
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i y r es a o g.
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<212> ADN
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i.
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa, n es i y r es a o g.
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para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 45
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\hskip1cm
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<210> 46
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 47
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<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Conector oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Conector oligonucleotídico diseñado
para obtener el gen de la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para confirmar la dirección del gen de rafinosa sintasa
insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para confirmar la dirección del gen de rafinosa sintasa
insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico diseñado
para confirmar la dirección del gen de rafinosa sintasa
insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un gen de rafinosa sintasa que comprende una
secuencia nucleotídica hibridable en condiciones estrictas con una
secuencia nucleotídica seleccionada entre el grupo consistente
en:
(a) una secuencia nucleotídica codificante de la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5,
(b) la secuencia nucleotídica representada por
los nucleótidos 134º a 2467º de la secuencia nucleotídica
representada por la SEC ID Nº: 6,
(c) una secuencia nucleotídica codificante de la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 7 y
(d) la secuencia nucleotídica representada por
los nucleótidos 1º a 1719º de la secuencia nucleotídica representada
por la SEC ID Nº: 8,
y que codifica una proteína capaz de unir el
grupo D-galactosilo a través de un enlace \alpha
(1\rightarrow6) al grupo hidroxilo unido al átomo de carbono en
posición 6 del residuo de D-glucosa en una molécula
de sacarosa para formar rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un gen de rafinosa sintasa que comprende una
secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 5.
3. Un gen de rafinosa sintasa que comprende la
secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 134º a
2467º de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº:
6.
4. Un gen de rafinosa sintasa que comprende una
secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 7.
5. Un gen de rafinosa sintasa que comprende la
secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 1º a 1719º
de la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 8.
6. Un gen de rafinosa sintasa que comprende la
secuencia nucleotídica representada por la SEC ID Nº: 6 o la SEC ID
Nº: 8.
7. Uso de (una) secuencia(s)
nucleotídica(s) parcial(es) específica(s) para
cualquiera de los genes de rafinosa sintasa de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para detectar/amplificar/obtener los genes de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un método para detectar un ácido nucleico que
contiene un gen de rafinosa sintasa, que consiste en detectar dicho
ácido nucleico por hibridación usando el ácido nucleico marcado de
la reivindicación 7 como sonda.
9. Un método para amplificar un ácido nucleico
que contiene un gen de rafinosa sintasa, que consiste en amplificar
dicho ácido nucleico por reacción en cadena de polimerasa (PCR)
usando el ácido nucleico de la reivindicación 7 como cebador.
10. Un método para obtener un gen de rafinosa
sintasa que consiste en las siguientes etapas:
detectar un ácido nucleico que contiene dicho
gen de rafinosa sintasa por hibridación usando el ácido nucleico
marcado de la reivindicación 7 como sonda y
recuperar el ácido nucleico detectado.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un método para obtener un gen de rafinosa
sintasa, que consiste en las siguientes etapas:
amplificar un ácido nucleico que contiene dicho
gen de rafinosa sintasa por PCR usando el ácido nucleico de la
reivindicación 7 como cebador y
recuperar el ácido nucleico amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un ácido nucleico consistente en un ácido
nucleico que contiene el gen de la rafinosa sintasa de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6 y que está unido a un ácido nucleico
que exhibe actividad promotora en una célula huésped.
13. Un vector que incluye el gen de la rafinosa
sintasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
\newpage
14. Un transformante no humano, donde se
introduce el gen de la rafinosa sintasa de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en una célula huésped.
15. Un transformante no humano, donde se
introduce el ácido nucleico de la reivindicación 12 en una célula
huésped.
16. Un transformante no humano, donde se
introduce el vector de la reivindicación 13 en una célula
huésped.
17. Un transformante de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, donde el hospedador es un
microorganismo.
18. El transformante de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, donde el hospedador es una planta.
19. Un método para producir una rafinosa sintasa
que consiste en las siguientes etapas:
cultivar o hacer crecer el transformante de
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 para producir la rafinosa
sintasa y
recoger la rafinosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Una rafinosa sintasa que comprende la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5.
21. Una rafinosa sintasa que comprende la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 7.
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