ES2338864T3 - Modificacion de biosintesis de fructano. - Google Patents

Modificacion de biosintesis de fructano. Download PDF

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Abstract

Un ácido nucleico sustancialmente aislado o purificado fragmento de ácido nucleico que codifica un homólogo de sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) de una especie Lolium y que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de (a) la secuencia mostrada en el Esquema ID No: 11; (b) fragmentos funcionalmente activos de la Secuencia ID No: 11 que tiene un tamaño de por lo menos 20 nucleótidos; y (c) variantes funcionalmente activas de las secuencias citadas en (a) y (b) que tienen por lo menos 95% de identidad con las secuencias citadas en (a) y (b).

Description

Modificación de biosíntesis de fructano.
La presente invención se relaciona con la modificación de biosíntesis de fructano en las plantas y, más particularmente, con enzimas involucradas en la ruta biosintética de fructano y ácidos nucleicos que codifican tales enzimas.
También se describen aquí elementos reguladores y, más particularmente, promotores capaces de originar la expresión de un gen exógeno en células de la planta, tales promotores son un de gen que codifica una enzima involucrada en la ruta biosintética de fructano en las plantas.
La invención también se relaciona con vectores que incluyen los ácidos nucleicos y elementos reguladores de la invención, células de planta, plantas, semillas y otras partes de planta transformadas con los elementos reguladores, ácidos nucleicos y vectores, y métodos para utilizar los ácidos nucleicos, elementos reguladores y vectores.
Los fructanos son una clase de polisacáridos altamente solubles en agua que consisten de cadenas de fructuosa lineal o ramificada adheridas a sacarosa. Representen el principal carbohidrato no estructural en muchas especies de planta.
La síntesis de fructano en gramíneas es compleja. Se involucran tres enzimas (fructosiltransferasas); sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST); fructanofructano 1-fructosiltransferasa (1-FFT); y sacarosa:fructano 6-fructosiltransferasa (6-SFT) que sintetiza los fructanos más complejos que prevalecen en gramíneas y cereales.
Se han encontrado altas cantidades de acumuladas en los raigrás (especie Lolium) y festucas (especie Festuca) en respuesta a las presiones ambientales tales como sequía y frío.
Los fructanos se asocian con características ventajosas en gramíneas de forraje, tal como tolerancia al frío y sequía, la supervivencia de retoño incrementadas, persistencia mejorada, recrecimiento bueno después de corte o pastoreo, recuperación mejorada del estrés y el temprano crecimiento de la primavera.
Adicionalmente, los fructanos en gramíneas forrajeras contribuyen de manera significativa a la energía disponible para la alimentación de los animales de pastoreo de rumiantes. Los procesos de fermentación en el rumen requieren energía considerable fácilmente disponible. La mejora de la energía disponible en el rumen puede aumentar la eficiencia de la digestión del rumiante. Una eficiencia incrementada en la digestión del rumen lleva a una conversión mejorada de la proteína del forraje del alimento al rumiante en carne o leche, y a una reducción de los desechos nitrogenados, como contaminante del medio ambiente.
Así, sería deseable tener métodos para manipular la biosíntesis de fructano en las plantas, incluidas las especies de gramíneas tales como raigrás (especie Lolium) y festuca (especie Festuca), por lo tanto facilitando la producción de por ejemplo gramíneas para pastos con una tolerancia mejorada al estrés abiótico, persistencia mejorada y en un aspectoforraje mejorada, llevando a la producción de pasto mejorado, la producción animal mejorada y contaminación del medio ambiente reducida.
Aunque se han aislado secuencias de ácido nucleico que codifica algunas de las enzimas que participan en la ruta de biosintética de fructano para ciertas especies de plantas, existe una necesidad de los materiales útiles en la modificación de biosíntesis de fructano en las plantas, en particular especies de gramíneas tales como raigrás y fetuscas, y también mediante ingeniería genética la acumulación de fructano en las especies de plantas de especies que son naturalmente que carecen de fructano.
Otros rasgos fenotípicos que pueden ser mejorados mediante manipulación transgénicas de plantas incluyen la resistencia a enfermedades, contenidos de minerales, calidad de los nutrientes y tolerancia a la sequía.
Sin embargo, la manipulación transgénica de los rasgos fenotípicos en las plantas requiere de la disponibilidad de elementos reguladores capaces de originar la expresión de genes exógenos en células de planta.
Es un objeto de la presente invención superar, o por lo menos aliviar, una o más de las dificultades o deficiencias asociadas con la técnica antecedente.
En un aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos sustancialmente purificados o aislados o fragmentos de ácido nucleico que codifican los homólogos de fructosil transferasa de una especie de raigrás.
La especie raigrás (Lolium) puede ser de cualquier tipo, que incluye raigrás italiano o anual, raigrás perene. Preferiblemente la especie raigrás es raigrás perene (Lolium perenne).
El ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico puede ser de cualquier tipo adecuado e incluye ADN (tal como cADN o ADN genómico) y ARN (tal como mARN) que es mono o bicatenario, que opcionalmente contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas y combinaciones de las mismas.
El término "aislado" significa que se remueve el material de su ambiente original (por ejemplo el ambiente natural si es de ocurrencia natural). Por ejemplo, un ácido nucleico de ocurrencia natural presente en una planta viva no es aislado, pero el ácido nucleico separado de alguno o todos los materiales coexistentes del sistema de la naturaleza, es aislado. Tales ácidos nucleicos pueden ser parte de un vector y/o tales ácidos nucleicos pueden ser parte de una composición, y aún ser aislados de tal manera que un vector o composición no es parte de su ambiente natural.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico sustancialmente purificado o aislado codifica un homólogo de sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) a partir de una especie de raigrás (Lolium). El ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico sustancialmente purificado o aislado incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de (a) la secuencia mostrada en la Figura 11 presente (Secuencia ID No: 11); (b) un componente de la secuencia mostrada en la Figura 11 (Secuencia ID No: 11); (c) secuencias anticodificantes a las secuencias citadas en (a) y (b); y (d) fragmentos funcionalmente activos y variantes de las secuencias citadas en (a) y (c).
"Funcionalmente activo" significa que el fragmento o variante (tal como un análogo, derivado o mutante) es capaz para modificar la biosíntesis de fructano en una planta. Tales variantes incluyen variantes alélicas de ocurrencia natural y variantes de ocurrencia no natural. Se contemplan las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los nucleótidos siempre y cuando las modificaciones no resulten en pérdida de la actividad funcional del fragmento o variante. Preferiblemente el fragmento o variante funcionalmente activa tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la parte pertinente de la secuencia anteriormente mencionada, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad. Tales variantes y fragmentos funcionalmente activos incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen cambios de ácido nucleico que resultan en sustituciones de aminoácido conservadoras de uno o más residuos en la secuencia de aminoácido correspondiente. Preferiblemente el fragmento tiene un tamaño de por lo menos 10 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 15 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 20 nucleótidos.
En un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y un terminador; se liga operablemente dicho elemento regulador, ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico y terminator.
"Ligado operablemente" significa que dicho elemento regulador es capaz de originar la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico en una célula de planta y dicho terminador es capaz de terminar la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico en una célula de planta. Preferiblemente, dicho elemento regulador está en la dirección 5' de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico y dicho terminador está en la dirección 3' de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico.
El vector puede ser de cualquier tipo adecuado y puede ser vírico o no vírico. El vector puede ser un vector de expresión. Tales vectores incluyen secuencias de ácido nucleico cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo derivados de virus de plantas; plásmidos bacterianos; derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivados del plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes; ADN fago; cromosomas artificiales de levadura; cromosomas artificiales bacterianos; cromosomas artificiales bacterianos binarios; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre y cuando sea replicable o integrado y/o viable en la célula de planta.
El elemento regulador y terminador puede ser de cualquier tipo adecuado y puede ser endógeno a la célula de planta objetivo o puede ser exógeno, dado que son funcionales en la célula de planta objetivo.
Preferiblemente el elemento regulador es un promotor. Una variedad de promotores que se pueden emplear en los vectores de la presente invención son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los factores que influencian la elección del promotor incluyen la especificidad de tejido deseada del vector, y si se desea expresión constitutiva o inducible y la naturaleza de la célula de planta a ser transformada (por ejemplo monocotiledónea o dicotiledónea). Particularmente los promotores adecuados incluyen el promotor de virus Mosaico de la Coliflor 35S (CaMV 35S), el promotor de Ubiquitina del maíz, el promotor de Actina del arroz, el raigrás endógeno 6-SFT, 1-FFT, y los promotores 1-SST.
Una variedad de terminadores que se pueden emplear en los vectores de la presente invención son también conocidos por aquellos expertos en la técnica. El terminador puede ser del mismo gen como la secuencia promotora o un gen diferente. Particularmente los terminadores adecuados son señales de poliadenilación, tales como el CaMV 35S polyA y otros terminadores de los genes de opalina sintasa (nos) y octopina sintasa (ocs).
El vector, en adición al elemento regulador, el ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de la presente invención y el terminador, pueden incluir elementos adicionales necesarios para la expresión del ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico, en diferentes combinaciones, por ejemplo estructura principal del vector, origen de replicación (ori), sitios de clonación múltiples, secuencias espaciadoras, mejoradores, intrones (tale como el intrón Ubi de Ubiquitina de maíz), genes resistentes a antibióticos y otros genes marcadores seleccionables [tales como el gen de neomicina fosfotransferasa (npt2), el gen de higromicina fosfotransferasa (hph), el gen de fosfinotricina acetiltransferasa (bar o pat)], y genes indicadores (tales como gen beta-glucuronidasa (GUS) (gusA)]. El vector también puede contener un sitio de unión a ribosoma para la iniciación de la traducción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Como una alternativa de uso de un gen marcador seleccionable para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células anfitrionas transformadas, se puede determinar la presencia del vector en células transformada mediante otras técnicas en el arte, tales como PCR (reacción de cadena de polimerasa), transferencia de Southern análisis de hibridación, ensayos GUS histoquímicos, cromatografía de capa delgada (TLC), análisis de hibridación de transferencia de northern y Western.
Aquellos expertos en la técnica apreciaran que los varios componentes del vector se ligan operablemente, con el fin de resultar en la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico. Las técnicas para ligar operablemente los componentes del vector de la presente invención son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de ligadores, tales como ligadores sintéticos, por ejemplo que incluyen uno o más sitios de enzima de restricción.
Se pueden incorporar los vectores de la presente invención en una variedad de plantas, que incluyen monocotiledóneas (tales como gramíneas del género Lolium, Festuca, Paspalum, Pennisetum, Panicum y otras gramíneas forrajeras y de césped, maíz, avena, caña de azúcar, trigo y cebada), dicotiledóneas (tales como arabidopsis, tabaco, leguminosas, trébol blanco, trébol rojo, trébol subterráneo, alfalfa, roble, eucalipto, canola, arce, soya y garbanzo) y gimnospermas. En una realización preferida, se utilizan los vectores para transformar monocotiledóneas, preferiblemente especies gramíneas tal como raigrás (Lolium species) y fetuscas (Festuca species), más preferiblemente raigrás perene (Lolium perenne) que incluyen cultivos de tipo forrajera y de césped y fetusca altas (Festuca arundinacea). En una realización preferida alternativa, se pueden utilizar los vectores para transformar dicotiledóneas, preferiblemente especie de leguminosa forrajera tales como tréboles (Trifolium species) y medicargos (Medicago species), más preferiblemente trébol blanco (Trifolium repens), trébol rojo (Trifolium pratense), trébol subterráneo (Trifolium subterraneum) y alfalfa (Medicago sativa). Otras plantas objetivo clave incluyen plantas que carecen naturalmente de fructano, tal como papa, remolacha azucarera y maíz.
Las técnicas que incorporan los vectores de la presente invención en las células de planta (por ejemplo mediante transducción, transfección o transformación) son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas incluyen introducción mediada por Agrobacterium, electroporación a tejidos, células y protoplastos, fusión de protoplasto, inyección en órganos reproductivos, inyección en embriones inmaduros e introducción de proyectil a alta velocidad a células, tejidos, callos, embriones inmaduros y maduros. La elección de la técnica dependerá grandemente del el tipo de planta a ser transformada.
Se puede seleccionar las células que incorporan el vector de la presente invención, como se describió anteriormente, y luego cultivar en medio apropiado para regenerar las plantas transformadas, utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH y similares, serán evidentes a la persona experta en la técnica. Se pueden reproducir las plantas resultantes, ya sea sexual o asexualmente, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, para producir generaciones sucesivas de plantas transformadas.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta, que incluye, por ejemplo transformada con, un vector de la presente invención.
La célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta puede ser de cualesquier especies adecuadas, que incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas y gimnospermas. En una realización preferida la célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta puede ser de una monocotiledónea, preferiblemente a especies gramíneas, más preferiblemente un raigrás (Lolium species) o fetusca (Festuca species), aún más preferiblemente un raigrás, más preferiblemente raigrás perene que incluye cultivos de forraje y de césped. En una realización preferida alterna la célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta es de una dicotiledónea, preferiblemente especie de leguminosa forrajera tal como tréboles (Trifolium species) y medicargos (Medicago species), más preferiblemente trébol blanco (Trifolium repens), trébol rojo (Trifolium pratense), trébol subterráneo (Trifolium subterraneum) y alfalfa (Medicago sativa). Otras plantas objetivo clave incluyen plantas que carecen naturalmente de fructano, tal como tabaco, papa, remolacha azucarera y maíz.
La presente invención también proporciona una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una célula de planta de la presente invención.
La presente invención también proporciona una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una planta de la presente invención.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para modificar la biosíntesis de fructano en una planta, dicho método incluye introducir en dicha planta una cantidad efectiva de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico y/o un vector de acuerdo con la presente invención.
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"Una cantidad efectiva" significa una cantidad suficiente que resulta en un rasgo fenotípico identificable en dicha planta, o una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de la misma. Se pueden determinar fácilmente tales cantidades por una persona apropiadamente experta, tomando en cuenta el tipo de planta, la ruta de administración y otros factores pertinentes. Tal una persona será capaz fácilmente de determinar una cantidad adecuada y método de administración. Ver, por ejemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
Utilizando los métodos y materiales de la presente invención, se puede incrementar la biosíntesis de fructano en la planta, disminuir o de otra forma modificar relativamente a una planta de control no transformada. Se puede incrementar o de otra forma modificar, por ejemplo, al incorporar copias adicionales de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico codificante de la presente invención. Se puede disminuir, por ejemplo, al incorporar un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico anticodificante de la presente invención. En adición, se puede manipular el número de copias de genes que codifican para diferentes enzimas en la ruta biosintética de fructano para modificar la cantidad relativa de cada molécula sintetizada, alterando por lo tanto la composición de fructanos producida. También, se pueden utilizar los materiales y métodos de la presente invención para construir mediante ingeniería acumulación de fructano en plantas que carecen de fructano, particularmente plantas para forraje, tales como tréboles y alfalfa. Esto puede a su vez proporcionar calidad mejorada y/o tolerancia a estrés abiótico.
En todavía un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, y/o información de secuencia de nucleótido del mismo, como un marcador genético molecular.
Más particularmente, se pueden utilizar los ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y/o información de secuencia de nucleótido de los mismos; como un marcador genético molecular para los locus de rasgo cualitativo (QTL) etiquetado, mapeo QTL, huella genética y selección asistida de marcador, y se puede utilizar como genes candidatos o marcadores perfectos, particularmente en raigrás y fetuscas. Aún más particularmente, se pueden utilizar los ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, y/o información de secuencia de nucleótido de los mismos, como marcadores genéticos moleculares en la mejora de gramínea forrajera y de césped, por ejemplo etiquetados QTL para la digestibilidad de la materia seca, calidad de forraje, palatabilidad, regeneración después del corte y pastoreo, tolerancia al frío, tolerancia a la sequía, supervivencia del retoño y persistencia de la planta.
En todavía un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un homólogo de fructosil transferasa sustancialmente purificado o aislado de un especie raigrás (Lolium). El homólogo de fructosil transferasa es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las enzimas 1-SST y homólogos de las mismas.
La especie raigrás (Lolium) puede ser de cualquier tipo, que incluye raigrás Italiano o anual, y raigrás perene. Preferiblemente la especie es a raigrás perene (L. perenne).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el homólogo 1-SST sustancialmente purificado o aislado incluye una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la secuencia mostrada en la Figura 11 aquí (Secuencia ID No: 12); y fragmentos y variantes funcionalmente activos de los mismos.
"Funcionalmente activo" en este contexto significa que el fragmento o variante tiene un o más de las propiedades biológicas de las proteínas 1-SST y homólogos de las mismas, respectivamente. Se contemplan las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los aminoácidos siempre y cuando las modificaciones do no resulten de la pérdida de la actividad funcional del fragmento o variante. Preferiblemente el fragmento o variante tiene por lo menos aproximadamente 60% de identidad con la parte pertinente de la secuencia anteriormente mencionada, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% de identidad, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad. Tales variantes y fragmentos funcionalmente activos incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen sustituciones de aminoácido conservadoras de uno o más residuos en la secuencia de aminoácido correspondiente. Preferiblemente el fragmento tiene un tamaño de por lo menos 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 20 aminoácidos.
En una realización adicional de este aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido producido recombinantemente a partir de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Las técnicas para producir recombinantemente los polipéptidos son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
Se puede utilizar la presente invención como se define en las reivindicaciones para proporcionar un fructano o fructano sustancialmente modificado o parcialmente purificado o aislado a partir de una planta, semilla de planta u otra parte de la planta de la presente invención.
Se pueden modificar tales fructanos a partir de fructanos de ocurrencia natural en términos de longitud, el grado de polimerización (número de unidades de fructosa), grado de ramificación y/o naturaleza de enlaces entre unidades de fructosa.
Se pueden aislar tales fructanos a partir de plantas, semillas de planta u otras partes de planta de plantas que son naturalmente acumuladoras de fructano pero tienen acumulación de fructano manipulada (tal como raigrás, cebolla, alcachofa) o a partir de plantas, semillas de planta u otras partes de planta de plantas que naturalmente carecen de fructano que se han manipulado para producir fructanos (tales como tabaco, remolacha azucarera, papa, maíz, tréboles, alfalfa).
Estos fructanos pueden tener usos industriales importantes, por ejemplo como endulzantes bajos en caloría.
Un elemento regulador aislado capaz de originar expresión de un gen exógeno en las células de planta puede ser una molécula de ácido nucleico, que incluye ADN (tal como cADN o ADN genómico) y ARN (tal como mARN) que es mono o bicatenario, que opcionalmente contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas y combinaciones de las mismas.
Preferiblemente el elemento regulador incluye un promotor, más preferiblemente un promotor de homólogo de fructosil transferasa, aún más preferiblemente un promotor de 1-FFT, 1-SST, 1-FFT un homólogos de los mismos. Preferiblemente, el promotor es de un raigrás (Lolium), más preferiblemente raigrás perene (Lolium perenne).
En una realización particularmente preferida de este aspecto de la invención, el elemento regulador incluye un promotor de los homólogos cADN 6-SFT Lp6SFT1 y Lp6SFT3 de raigrás perene.
Preferiblemente el elemento regulador incluye una secuencia de nucleótido que incluye la primera aproximadamente 5700 nucleótidos de la secuencia mostrada en la Figura 10 - presente (Secuencia ID No: 9); la primera aproximadamente 1600 nucleótidos de la secuencia mostrada en la Figura 11 presente (Secuencia ID No: 11); o un fragmento o variante funcionalmente activa del mismo.
"Funcionalmente activo" en este contexto significa que el fragmento o variante (tal como un análogo, derivado o mutante) es capaz de originar expresión de un transgen en las células de planta. Tales variantes incluyen variantes alélicas de ocurrencia natural y variantes de ocurrencia no natura. Se contemplan adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los nucleótidos siempre y cuando las modificaciones no resulten en pérdida de la actividad funcional del elemento regulador. Preferiblemente el fragmento o variante funcionalmente activa tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la parte pertinente de la secuencia anterior, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad. Preferiblemente el fragmento tiene un tamaño de por lo menos 100 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 150 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 200 nucleótidos.
En una realización particularmente preferida de este aspecto de la invención, el elemento regulador incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste del fragmento HindIII-EcoRI de Lp6SFT1 mostrado en la Figura 12 aquí; y el fragmento XbaI-EcoRI de Lp6SFT1 mostrado en la Figura 12 aquí; o un fragmento o variante funcionalmente activa del mismo.
Un "gen exógeno" significa un gen no ligado naturalmente a dicho elemento regulador. En ciertas realizaciones de la presente invención el gen exógeno también no se encuentra naturalmente en la planta o célula de planta pertinente.
El gen exógeno puede ser de cualquier tipo. El gen exógeno puede ser un ácido nucleico tal como ADN (por ejemplo cADN o ADN genómico) o ARN (por ejemplo mARN) que es mono o bicatenario, que opcionalmente contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas, y combinaciones de las mismas. El gen exógeno puede corresponder a un gen objetivo, por ejemplo un gen capaz de influenciar la resistencia a enfermedad, digestibilidad de la hierba, calidad de nutriente, contenido mineral o tolerancia a la sequía o ser un fragmento o variante (tal como un análogo, derivado o mutante) del mismo que es capaz de modificar la expresión de dicho gen objetivo. Tales variantes incluyen secuencias de ácido nucleico que son antisentido a dicho gen objetivo o un análogo, derivado, mutante o fragmento del mismo. El transgen puede codificar para un proteína o secuencia de ARN que depende de la condición objetivo y si se requiere regulación ascendente de la expresión de gen. Preferiblemente, se selecciona el gen objetivo de secuencias codificantes endógenas que codifican para mARN para una proteína, esta proteína puede ser de origen bacteriano (tal como enzimas involucradas en la modificación de la pared celular y el metabolismo de pared celular, biosíntesis de citocina), o origen eucariótico (tal como polipéptidos farmacéuticamente activos) o de origen vegetal (tal como enzimas involucradas en la síntesis de los compuestos fenólicos, síntesis de metabolismo de pared celular de fructanos, metabolismo de azúcar, biosíntesis de lignina). Preferiblemente, el gen objetivo se selecciona del grupo que comprende 1-SST, 1-FFT, 6-SFT, O-metiltransferasa, 4 coumarato CoA-ligasa, cinnamoil CoA reductasa, cinnamil alcohol deshidrogenasa, cinnamato 4 hidroxilasa, fenolasa, laccasa, peroxidasa, coniferol glucosil transferasa, coniferin beta-glucosidasa, fenillalanina amoniaco liasa, ferulato 5-hidroxilasa, quitinasa, glucanasa, isopenteniltransferasa, xilanasa.
Las células de planta, en las que el elemento regulador de la presente invención es capaz de originar expresión de un gen exógeno, pueden ser de cualquier tipo. Las células de planta puede ser de monocotiledóneas (tales como gramíneas del género Lolium, Festuca, Paspalum, Pennisetum, Panicum y otras gramíneas forrajeras y de césped, maíz, avena, caña de azúcar, trigo y cebada), dicotiledóneas (tales como arabidopsis, tabaco, leguminosas, alfalfa, roble, eucalipto y arce) y gimnospermas. Preferiblemente las células de planta son de una monocotiledónea, más preferiblemente las especies gramíneas tales como una especie raigrás (Lolium) o fetusca (Festuca), aún más preferiblemente un raigrás, más preferiblemente raigrás perene (Lolium perenne). Otras plantas objetivo clave incluyen plantas que carecen naturalmente de fructano, tal como tabaco, papa, remolacha azucarera y maíz.
Se puede utilizar el elemento regulador de acuerdo con la presente invención para expresar genes exógenos a los que es se te liga operablemente en la producción de plantas transgénicas.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un vector que incluye un elemento regulador de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector puede incluir un elemento regulador de acuerdo con la presente invención, un gen exógeno como se describe aquí, y un terminador; dicho elemento regulador, gen exógeno y terminador se liga de forma operable, tal que dicho elemento regulador es capaz de originar expresión de dicho gen exógeno en las células de planta. Preferiblemente, dicho elemento regulador está en la dirección 5' de dicho gen exógeno y dicho terminador está en la dirección 3' de dicho gen exógeno.
El vector puede ser de cualquier tipo adecuado y puede ser vírico o no vírico. El vector puede ser un vector de expresión. Tales vectores incluyen secuencias de ácido nucleico cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo derivados de virus de plantas; plásmidos bacterianos; derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivados del plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes; ADN fago; cromosomas artificiales de levadura; cromosomas artificiales bacterianos; cromosomas artificiales bacterianos binarios; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre y cuando este sea replicable o integrador o viable en la célula de planta.
El terminador puede ser de cualquier tipo adecuado e incluye por ejemplo señales de poliadenilación, tal como el virus Mosaico de la Coliflor 35S polyA (CaMV 35S polyA) y otros terminadores de los genes de nopalina sintasa (nos) y octopina sintasa (ocs).
El vector, en adición al elemento regulador, el ácido nucleico exógeno y el terminador, puede incluir elementos adicionales necesarios para la expresión del ácido nucleico, en diferentes combinaciones, por ejemplo estructura principal del vector, origen de replicación (ori), sitios de clonación múltiples, secuencias espaciadoras, mejoradores, intrones (tales como el intrón Ubi de Ubiquitina de maíz), genes resistentes a antibióticos y otros genes marcadores seleccionables [tal como el gen de neomicina fosfotransferasa (npt2), en gel higromicina fosfotransferasa (hph), el gen de fosfinotricina acetiltransferasa (bar o pat)], y genes indicadores (tales como gen beta-glucuronidasa (GUS) (gusA)]. El vector también puede contener un sitio de unión a ribosoma para la iniciación de la traducción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
También se puede utilizar el elemento regulador de la presente invención con otros promotores completos o elementos promotores parciales.
Como un alternativa de uso de un gen marcador seleccionable para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células anfitrionas transformadas, se puede determinar la presencia del vector en células transformadas mediante otras técnicas bien conocidas en el arte, tales como PCR (reacción de cadena de polimerasa), transferencia de Southern análisis de hibridación, ensayos GUS histoquímicos, análisis de hibridación de transferencia de northern y Western.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los varios componentes del vector se ligan operablemente, con el fin de resultar en la expresión de dicho trnagen. Las técnicas para ligar operablemente los componentes del vector de la presente invención son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de ligadores, tal como ligadores sintéticos, por ejemplo que incluyen uno o más sitios de restricción.
Se pueden incorporar los vectores de la presente invención en una variedad de plantas, que incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas y gimnospermas. En una realización preferida se utilizan los vectores para transformar monocotiledóneas, preferiblemente especies gramíneas tal como raigrás (Lolium species) y fetuscas (Festuca species), más preferiblemente raigrás perene (Lolium perenne) que incluyen cultivos de forraje y de césped.
Las técnicas que incorporan los vectores de la presente invención en las células de planta (por ejemplo mediante transducción, transfección o transformación) son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas incluyen introducción mediada por Agrobacterium, electroporación a tejidos, células y protoplastos, fusión de protoplasto, inyección en órganos reproductivos, inyección en embriones inmaduros e introducción de proyectil a alta velocidad a células, tejidos, callos, embriones inmaduros y maduros. La elección de la técnica dependerá grandemente del el tipo de planta a ser transformada.
Se pueden seleccionar las células que incorporan el vector de la presente invención, como se describió anteriormente, y luego cultivar en un medio apropiado para regenerar las plantas transformadas, utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH y similares, serán evidentes a la persona experta en la técnica. Se pueden reproducir las plantas resultantes, ya sea sexual o asexualmente, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, para producir generaciones sucesivas de plantas transformadas.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta, que incluye, por ejemplo transformada con, un vector de la presente invención.
La célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta pueden ser de cualesquier especies adecuadas, que incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas y gimnospermas. En una realización preferida la célula de planta, planta, semilla de planta u otra parte de la planta es de una monocotiledónea, preferiblemente a especie gramínea, más preferiblemente un raigrás (Lolium species) o fetusca (Festuca species), aún más preferiblemente raigrás perene (Lolium perenne), que incluye cultivos de forraje y de césped.
La presente invención también proporciona una planta, semilla de planta, u otra parte de la planta derivada de una célula de planta de la presente invención.
La presente invención también proporciona una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una planta de la presente invención.
En todavía un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un genoma de planta recombinante que incluye un elemento regulador de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención el gen de planta recombinante incluye un gen exógeno ligado operablemente a dicho elemento regulador.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para expresar un gen exógeno en las células de planta, dicho método incluye introducir en dichas células de planta una cantidad efectiva de un elemento regulador y/o un vector de acuerdo con la presente invención.
"Una cantidad efectiva" significa una cantidad suficiente que resulta en un cambio fenotípico identificable en dichas células de planta o una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivadas de las mismas. Se pueden determinar tales cantidades fácilmente por una persona apropiadamente experta, tomando en cuenta el tipo de célula de planta, la ruta de administración y otros factores pertinentes. Tal una persona será capaz fácilmente de determinar una cantidad adecuada y método de administración. Ver, por ejemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
La presente invención se describirá ahora más completamente con referencia a los Ejemplos y dibujos acompañantes. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción es solo ilustrativa y no se debe tomar en ninguna forma como una restricción en la generalidad de la invención descrita anteriormente.
En las Figuras
La Figura 1 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 1) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 2) de Lp6SFT1.
La Figura 2 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 3) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 4) de Lp6SFT2.
La Figura 3 muestra un análisis de hibridación northern de ARN total aislado de diferentes órganos y etapas de desarrollo de raigrás perene y probadas con Lp6SFT1 (mancha superior) y Lp6SFT2 (mancha inferior). Las líneas 1-10 contienen ARN de: plántulas-raíces de 1 cm (línea 1), brotes (línea 5); plántulas -raíces 4-6 cm (línea 2), brotes (línea 6); plántulas- raíces 6 semanas (línea 3), brotes (línea 7), tallo (línea 9); plántulas- raíces 10 semanas (línea 4), brotes (línea 8), tallo (línea 10). Las líneas 11 y 12 contienen ARN de tejido de planta completa, madura de Phalaris y Festuca.
La Figura 4 muestra análisis de hibridación Southern. Se separa 10 \mug de ADN genómico de raigrás perene digerido en 1.0% de un gel de agarosa, se transfiere a membrana Hybond N y luego se hibrida con una sonda Lp6SFT1 (mancha izquierda) y Lp6SFT2 (mancha derecha) respectivamente.
La Figura 5 muestra los cADN que codifican Lp6SFT1, Lp6SFT2 y la cebada Hv6SFT menos la señal objetivada 5' clonada en el plásmido secretor de transformación de levadura pPICZ\alphaC.
La Figura 6 muestra trazas de cromatografía de intercambio de anión de alto desempeño (HPAEC) de vector de vacío, control positivo Hv6SFT que corresponde a la cebada 6-SFT (Hv6SFT), y Lp6SFT1 incubado con 50 mM de sacarosa y 50 mM de 1-cestosa durante 48 h a 4ºC. Los picos representan Glucosa (G), Fructosa (F), Sacarosa (S), 1-Cestosa (1-K), y fructano DP4.
La Figura 7 muestra A) pPic\alphaLp6SFT2 (vector de transformación de levadura para Lp6SFT2 de la Figura 5) expresado en Pichia pastoris durante 48 horas, se agrega 15 \mug de proteína total a 50 mM de sacarosa y 50 mM de 1-Cestosa y se incuba 6 horas a 4ºC. Se diluye la muestra 4x, se filtra y se analiza utilizando HPAEC. B) pPic\alpha(vector de vacío) expresado en Pichia pastoris durante 48 horas, se agrega una alícuota de sobrenadante a 50 mM de sacarosa y 50 mM de 1-Cestosa y se incuba durante 6 horas a 4ºC. Se diluye la muestra 4x, se filtra y se analiza utilizando HPAEC.
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La Figura 8 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 5) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 6) de clon de cADN Lp4Ad parcial.
La Figura 9 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 7) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 8) de clon de cADN Lp6Cb parcial.
La Figura 10 - muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 9) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 10) de clon genómico Lp6SFT1 de raigrás perene.
La Figura 11 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 11) y secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 12) de clon genómico Lp6SFT3 de raigrás perene.
La Figura 12 muestra un gen gusA quimérico bajo el control del promotor Lp6SFT1 (secuencia promotora de la Secuencia ID No: 9).
La Figura 13 muestra A) se transforman protoplastos de tabaco con los vectores que llevan el promotor L p6SFT1 o L p6SFT3 fusionado a el gen gusA. B) análisis de PCR 5 transformantes y controles positivos (SR1) y negativos (H2O). C) Análisis de hibridación Southern de ADN a partir de 5 transformantes utilizando parte del promotor L p6SFT1 como la sonda. D) Análisis de hibridación Southern de ADN a partir de 5 transformantes utilizando parte del gen gusA como la sonda. E) Teñido histoquímico de tejido de planta para actividad de la proteína gusA para evaluar la expresión del promotor Lp6SFT1.
La Figura 14 muestra el nucleótido (Secuencia ID No: 13) y las secuencias de aminoácido (Secuencia ID No: 14) de Lp6SFT4.
La Figura 15 muestra vectores de transformación Lp6SFT1 y Lp6FT2 codificante y anticodificante bajo el control del promotor CaMV 35S y el promotor de Ubiquitina del maíz.
La Figura 16 muestra análisis molecular de tabaco transgénico que lleva el transgen Lp6SFT1 codificante. A) mapa de plásmido de vector de transformación que lleva un gen Lp6SFT1 codificante quimérico bajo el control del promotor CaMV 35S; B) análisis PCR de 14 clones de tabaco transgénicos independientes con un gen de neomicina fosfotransferasa (npt2) quimérico y un gen Lp6SFT1 quimérico; C-D) análisis de hibridación Southern de 14 plantas de tabaco transgénicas independientes de B) utilizando una sonda de hibridación específica Lp6SFT1; E) análisis de hibridación Northern de 5 plantas de tabaco transgénicas independientes de CD) utilizando una sonda de hibridación específica Lp6SFT1. SRI = control de tabaco negativo no transformado, + = control positivo de ADN de plásmido, - = control negativo de agua.
La Figura 17 muestra análisis molecular de tabaco transgénico que lleva el transgen Lp6SFT2 codificante. A) Mapa de plásmido de transformación vector que lleva un gen Lp6SFT2 codificante quimérico bajo el control del promotor CaMV 35S; B) análisis PCR de clones de tabaco transgénicos independientes transformados con el gen Lp6SFT2 quimérico de A); C) análisis de hibridación Southern de plantas de tabaco transgénicas independientes de B) utilizando una sonda de hibridación específica Lp6SFT2; D) análisis de hibridación Northern de plantas de tabaco transgénicas independientes utilizando una sonda de hibridación específica Lp6SFT2. SRI = control de tabaco negativo no transformado, + = control positivo de ADN de plásmido, - = control negativo de agua.
La Figura 18 muestra A) análisis de hibridación Northern de tabaco plantas transgénicas T1 utilizando una sonda de hibridación específica Lp6SFT2 2 kb y ARN aislado de seudotallos de raigrás como control positivo; B) se aíslan carbohidratos solubles en agua de callos de plantas de tabaco T1 transgénicas anticodificantes y codificantes Lp6SFT2 que crecen en la oscuridad durante 1 mes: (i) se extraen los azúcares de una planta de tabaco transgénica codificante positiva northern, (ii) se extraen los azúcares de una planta de tabaco transgénica de control anticodificante. Se analizan los extractos mediante HPAEC y se verifican los tiempos de retención contra los estándares puros y las preparaciones de fructano de raigrás.
La Figura 19 muestra el protocolo para la producción independiente de cultivo en suspensión de plantas de raigrás perene transgénicas. A) embriones cigóticos aislados, se colocan en medio MSM5, día 0; B) Formación y proliferación de callo embriogénico, 6-8 semanas después de aislamiento de embrión; C) Callos embriogénicos dispuestos en MSM3 osmótico más medio antes de transformación biolística; D) Ensayo Gus histoquímico que muestra focus que expresan GUS 3-4 días post-bombardeo de gen gusA quimérico; E) Selección de callos embriogénicos en medio MSM3 que contienen 100 mg/l de paromomicina (\mum), 2 semanas después de bombardeo microproyectil; F) Regeneración de brotes resistentes a Pm en medio MSK que contiene 100 mg/l de Pm, 4 semanas después de bombardeo microproyectil; G) En regeneración de planta in Vitro de callos embriogénicos resistentes a PM, 6 semanas después de bombardeo microproyectil; H) Plantas de raigrás perene transgénicas 28 semanas después de aislamiento de embrión.
La Figura 20 muestra la ubicación del mapa de Lp6SFT1 y Lp6SFT2 (en sangre) dentro del mapa de enlaces genéticos de raigrás perene.
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Ejemplo 1 El aislamiento de clones de cADN que codifican para enzimas biosintéticas de fructano de raigrás perene
Se utiliza una colección de cADN preparada a partir de ARN extraído de plántulas de raigrás perene para aislar homólogos de fructosiltransferasa Lp6SFT1 y Lp6SFT2. Estos clones de cADN se aíslan de la colección de cADN de raigrás perene utilizando el gen de cebada 6SFT como una sonda. Las secuencias de gen completo de los homólogos de raigrás perene de fructosiltransferasa se muestran en las Figuras 1 y 2.
Más particularmente, se selecciona una colección de cADN de plántula de raigrás perene con un fragmento 1,200 bp PstI aislado de un clon de cADN de cebada 6-SFT. Se aíslan doce cADNs y se separan en cuatro grupos mediante análisis de digestión de restricción. Se detectan dos clones de longitud completa Lp6SFT1 y Lp6SFT2 para caracterización adicional.
Se determina la secuencia completa del clon Lp6SFT1. El clon cADN tiene cola poly(A) típica, un codón inicio y de detención. El marco de lectura abierto (ORF) del clon codifica para una proteína putativa de 651 aminoácidos.
Se determina la secuencia completa del segundo homólogo de cADN 6SFT L. perenne (Lp6SFT2). El clon de longitud completa tiene una cola poly(A) típico, codón de inicio y de detención y 2013 bp ORF codificado por una proteína de 671 aminoácidos.
Un análisis de hibridación Northern con muestras de ARN aislado de raigrás perene en etapas de desarrollo hibridan a Lp6SFT1 (Figura 3, mancha superior) y Lp6FST2 (Figura 3, mancha inferior) se desarrolla para determinar los patrones de expresión de órgano y de desarrollo. Ambas sondas se hibiridan a una especie de mARN mnocatenaria de aproximadamente 2.3 kb y 2.4 kb respectivamente. Se encuentra que la transcripción Lp6SFT1 y Lp6SFT2 se acumula en brotes y raíces jóvenes y tejido de tallo maduro (Figura 3).
Un análisis de hibridación Southern utilizando ADN, aislado de una planta de raigrás perene de doble haploide, digerido con DraI, BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII y XbaI se híbrida con un alta rigor con una sonda Lp6SFT1 y Lp6SFT2 respectivamente. El patrón de hibridación revela que ambos Lp6SFT1 (Figura 4, mancha izquierda) y Lp6SFT2 (Figura 4, mancha derecha) corresponden a un gen de copia monocatenaria (Figura 4).
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Ejemplo 2 Análisis funcional de fructosiltransferasas de raigrás
Se ha determinado la funcionalidad de los homólogos del raigrás fructosiltransferasa cADN Lp6SFT1 y Lp6SFT2 mediante la expresión en la levadura de la cepa Pichia pastoris. Se encuentra que la actividad de enzima de las proteínas recombinantes Lp6SFT1 y Lp6SFT2 secretadas tienen actividad de fructosiltransferasa cuando se incuban con sacarosa y el trisacárido 1-cestosa. Estos datos funcionales demuestran que las Lp6SFT1 y Lp6SFT2 son fructosiltransferasas adecuadas para manipular reservas de fructano en raigrás transgénico.
Para determinar la funcionalidad de los homólogos de cADN de fructosiltransferasa de raigrás, se han clonado los cADN que codifican Lp6SFT1, Lp6SFT2 y la cebada de control Hv6SFT menos la secuencia de señal objetivada 5'en los plásmidos secretores de transformación de levadura pPICZ\alphaC (vectores disponibles para la producción de proteína recombinante) (Figura 5). Se ha transformado la cepa de levadura Pichia pastoris con los plásmidos anteriores y el vector progenitor de vacío como un control. Se analiza la actividad de enzima de la proteína recombinante Lp6SFT1, Lp6SFT2 y Hv6SFT secretada para actividad de fructosiltransferasa al incubar con sacarosa y el trisacárido 1-cestosa.
La Pichia pastoris transformada con Lp6SFT1 produce y secreta una proteína funcional que tiene actividad de fructosiltransferasa, similar a la actividad de la proteína Hv6SFT recombinante. Ambas producen un fructano DP4 y pequeñas cantidades de fructanos DP mayores están ausentes en el vector de control (Figura 6).
La Pichia pastoris transformada con Lp6SFT2 produce y secreta una proteína que tiene actividad de fructosiltransferasa y alguna actividad invertasa. La actividad de la proteína recombinante Lp6SFT2 en la presencia de sacarosa y 1-cestosa produce DP4 y fructanos mayores, que están ausentes en el vector de control cuando se incuban bajo las mismas condiciones (Figura 7).
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Ejemplo 3
Se aíslan clones de cADN parciales como se describió previamente para Lp6SFT1 y Lp6SFT2 utilizando la Cebada 6SFT (Hv6SFT) como una sonda. Estas fructosiltransferasas parciales (4Ad y 6Cb; ver Figuras 8 y 9, respectivamente) tienen alta homología de aminoácido con ambos Lp6SFT1 y Lp6SFT2 (ver tabla adelante). Se han utilizado para aislar fructosiltransferasas adicionales tales como los clones genómicos Lp6SFT3 y Lp6SFT4. La alta homología de estas secuencias de nucleótido parciales con otras las hacen excelentes candidatos para el aislamiento de cADN adicional y clones genómicos que codifican las fructosiltransferasas en las plantas.
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TABLA % homología de aminoácido de fructosiltransferasas de raigrás parciales a Lp6SFT1 y Lp6SFT2
1 
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Ejemplo 4 El aislamiento y caracterización de clones genómicos de fructosiltransferasa y promotores
Se han aislado clones y promotores genómicos de Lp6FST1 y Lp6SFT3 de una colección genómica de raigrás perene. Se han secuenciado completamente ambos clones (Figuras 10 y 11).
Más particularmente, una colección de genómica de Lolium perenne se detecta con un fragmento de cADN parcial diseñado Lp6SFT3. Se aísla un fragmento genómico 4819 bp, se clona en pBluescript y se secuencia completamente. Se encuentra el fragmento 4.8kb por contener el gen Lp6SFT3 completo y 1.6kb de secuencia promotora. La secuencia genómica Lp6SFT3 que incluye organización exón-intrón se ilustra en la Figura 11.
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Ejemplo 5 Análisis de patrones de expresión de promotores fructosiltransferasa de raigrás
Se han aislado clones y promotores genómicos de Lp6FST1 y Lp6SFT3 de una colección genómica raigrás perene. Se ha secuenciando completamente ambos clones. Se han fusionado promotores el gen indicador gusA (Figura 12) y se introduce en tabaco mediante transferencia de gen directa para análisis de patrón en plantas. Se ensaya histoquímicamente el material de la planta para actividad \beta-glucuronidasa (GUS) para determinar los patrones de expresión del promotor Lp6SFT1 en el sistema heterólogo, tabaco. Se detecta actividad GUS débil en la base de la hoja y en el tejido vascular de hoja (Figura 13).
Este ejemplo demuestra el uso de secuencias promotoras de fructosiltransferasa de para expresión de gen objetivada en las plantas.
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Ejemplo 6 (Ejemplo comparativo)
Aislamiento de clon genómico para el raigrás fructosiltransferasa Lp6SFT4
Se aísla Lp6SFT4 de una colección genómica raigrás perene utilizando el clon parcial de fructosiltransferasa 4Ad (de la Figura 8) como una sonda de hibridación. El clon genómico Lp6SFT4 contiene 966 bp de secuencia promotora la la secuencia que codifica el gen completa. Se ilustra la secuencia genómica Lp6SFT4 que incluye una organización exón-intrón en la Figura 14.
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Ejemplo 7 (Ejemplo comparativo)
Desarrollo de vectores codificantes y anticodificantes con secuencias de fructosiltransferasa
Para determinar la funcionalidad de los homólogos Lp6SFT1 y Lp6SFT2 de fructosiltransferasa y para regular la expresión de estas enzimas clave en la biosíntesis de fructanos en L. perenne se ha generado un conjunto vectores codificantes y anticodificantes. Se han generado los vectores de transformación con secuencias cADN Lp6SFT1 y Lp6SFT2 en la orientación codificante y anticodificante bajo el control de promotor CaMV 35S y promotor de ubiquitina de maíz (Figura 15).
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Ejemplo 8 (Ejemplo comparativo)
Producción y caracterización de plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen fructosiltransferasa Lp6SFT1 de raigrás
Se han desarrollado experimentos de transformación, que utilizan vectores que llevan los genes fructosiltransferasa de raigrás Lp6SFT1 en orientación codificante y anticodificante bajo el control del promotor CaMV 35S, en tabaco, una planta que carece de fructano, para evaluar la funcionalidad de Lp6SFT1.
Se detecta un conjunto de plantas de tabaco transgénicas generadas utilizando el vector de transformación codificante Lp6SFT1 mediante PCR y se analizan mediante hibridaciones Southern y northern (Figura 16A, B, C, D, E).
La detección por PCR se lleva a cabo utilizando cebadores específicos npt2 y Lp6SFT1 para la identificación de las plantas transgénicas (Figura 16B). Se identifican plantas transgénicas independientes que se contransforman con el marcador seleccionable (neomicinfosfotransferasa npt2) y el gen fructosiltransferasa Lp6SFT1 de raigrás.
Se desarrolla análisis de hibridación Southern con muestras de ADN de las plantas transgénicas positivas a PCR con el fin de demostrar la integración del transgen Lp6SFT1. Se digiere el ADN genómico con EcoRI y se analiza mediante análisis de hibridación Southern (Figura 16C, D). Se observa hibridación a una banda del tamaño esperado (transgen más promotor y terminador) en plantas transformadas. También se encuentran las bandas más grandes y más pequeñas adicionales que corresponden copias de transgén redispuestas múltiples en plantas transgénicas individuales (Figura 16C, D). Se detectan bandas no hibridizantes en el control negativo de tabaco no transformado (SR1).
El análisis de hibridación Northern de ARN total aislado de plantas de tabaco transgénicas Lp6SFT1 positivas a Southern y probadas con un fragmento específico Lp6SFT1 revelan que el transgen Lp6SFT1 se expresa en 1 de las 5 plantas transgénicas Lp6SFT1 probadas (Figura 16E).
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Ejemplo 9 (Ejemplo comparativo)
Producción y caracterización de plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen de fructosiltransferasa de raigrás Lp6SFT2
Se han desarrollado experimentos de transformación, utilizando vectores que llevan los genes fructosiltransferasa de raigrás Lp6SFT2 en orientación codificante y anticodificante bajo el control del promotor CaMV 35S, en tabaco, una planta que carece de fructano, para evaluar la funcionalidad de Lp6SFT2.
Se detecta un conjunto de plantas de tabaco transgénicas generado utilizando el transformación vector codificante Lp6SFT2 mediante PCR y y se analiza mediante hibridaciones Southern y northern (Figura 17A, B, C, D).
Se lleva a cabo la detección PCR utilizando cebadores específicos npt2 y Lp6SFT2 para la identificación de las plantas transgénicas (Figura 17A). Se identifican las plantas transgénicas independientes que se cotransforman con el marcador seleccionable (neomicinfosfotransferasa not2) y el gen de fructosiltransferasa de raigrás Lp6SFT2 (Figura 17B).
Se desarrolla análisis de hibridación Southern con muestras de ADN de las plantas transgénicas positivas a PCT con el fin de demostrar la integración del transgen Lp6SFT2. Se digiere el ADN genómico con EcoRI y se analiza mediante análisis de hibridación Southern (Figura 17C). Se observa hibridación a una banda del tamaño esperado (transgen más promotor y terminador) en plantas transformadas. También se encuentran las bandas más grandes y más pequeñas adicionales que corresponden copias de transgén redispuestas múltiples en plantas transgénicas individuales (Figura 17D). Se detectan bandas no hibridizantes en el control negativo de tabaco no transformado (SR1).
El análisis de hibridación Northern de ARN total aislado de plantas de tabaco transgénicas Lp6SFT2 positivas a Southern y probadas con un gen específico Lp6SFT2 revelan que el transgen Lp6SFT2se expresa en todas las 4 plantas transgénicas Lp6SFT2 probadas (Figura 17D).
Se obtienen las progenies (plantas T1) de las plantas de tabaco transgénicas principales que expresan el gen Lp6SFT2 quimérico. Se detecta el callo generado a partir de estas plantas T1 mediante análisis de hibridación Northern (Fig. 18A). Se hacen crecer los callos en medio mofo MS en la oscuridad durante 1 mes. Se aíslan carbohidratos solubles de plantas transgénicas y controles negativos anticodificantes y se analizan los productos de azúcar mediante cromatografía de intercambio de anión de alto desempeño (HPAEC) (Fig 18Bi y 18Bii). Se detecta la cestosa o fructano DP 3 y se identifica en el callo Lp6SFT2 (Fig. 18Bi) y está ausente en las muestras de control negativas (Fig. 18Bii), lo que demuestra actividad de fructosiltransferasa en las muestras de callo de plantas de tabaco transgénicas que expresan Lp6SFT2 bajo estas condiciones.
Este ejemplo demuestra el uso de secuencias de gen de fructosiltransferasa de raigrás para expresión en las plantas que llevan acumulación de fructano manipulada.
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Ejemplo 10 (Ejemplo comparativo)
Producción de plantas de raigrás transgénicas para expresión transgénica de fructosiltransferasas
Para investigar los efectos de la sobreexpresión y regulación descendente de la fructosiltransferasas en raigrás perene a través de la tecnología codificante y anticodificante, se utilizan vectores de transformación que llevan genes de fructosiltransferasa quiméricos en orientación codificante y anticodificante para la transformación biolística de callos embriogénicos derivados de embriones semilla maduros. Se utiliza un procedimiento vigoroso y fiable para la recuperación de plantas de raigrás perene transgénicas.
El procedimiento utiliza callos embriogénicos producidos a partir de embriones derivados de semillas maduras como objetivos directos para la transformación biolística sin requerir el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas. El protocolo, sin embargo depende de un suministro continuo de embriones cigotos aislados para la inducción de callo. Se regeneran las plantas de raigrás transgénicas 24-28 semanas después de aislamiento del embrión. Se colocan en placas los embriones aislados en medio MSM5 para producir callos embriogénicos adecuados como objetivos para transformación biolística dentro de 8 semanas. Se seleccionan los callos embriogénicos tratados con medio altamente osmótico SM3Plus antes de bombardeo microproyectil, en medio MSM3 que contiene 100 mg/l de paromomicina (Pm) durante 2 semanas antes de ser transferidos en MSK con 100 mg/l de Pm durante 4 semanas adicionales hasta diferenciación de brotes resistentes a Pm (Figura 19). Se genera un conjunto de plantas transgénicas para sobreexpresión y regulación descendente de fructosiltransferasas utilizando genes quiméricos Lp6SFT1 y Lp6SFT2 codificantes y anticodificantes.
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Ejemplo 11 (Ejemplo comparativo)
Mapeo genético de fructosiltransferasas de raigrás
Se amplifican por PCR los clones Lp6SFT1 y Lp6SFT2 y se radioetiquetan para uso como sondas para detectar los polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs). Se mapean los RFLP utilizando 110 individuos de progenie de la población de referencia de raigrás perene p150/112 restringida con la enzima HindIII. Los locus Lp6SFT1 y Lp6SFT2 se mapean a grupos de enlace LG7 y LG6, respectivamente (Figura 20). Estas ubicaciones gen se puede utilizar ahora como genes candidatos para rasgos cuantitativos de locus para la biosíntesis de fructano asociada a rasgos tales como la calidad del forraje, la sequía y la tolerancia al frío y componentes del crecimiento vegetal.
Se entenderá también que el término "comprende" (o sus variantes gramaticales) como se utiliza en esta especificación es equivalente con el término "incluye" y no se debe tomar como que excluye la presencia de otros elementos o características.
Los documentos citados en esta especificación son solo para propósitos de referencia y su inclusión no es un reconocimiento de que forman parte de los conocimientos generales comunes en la técnica relevante.
<110> Molecular Plant Breeding Nominees Ltd
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<120> Homólogos de fructosil transferasa de césped inglés (Lolium) y especies (Festuca)
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 80424437
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/AU01/00705
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<141> 200-06-14
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> PQ8155
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<151> 2000-06-14
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<160> 14
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<221> misc_feature
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<222> (9260)..(9260)
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<223> Cualquier nucleótido
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (9471)..(9471)
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<223> Cualquier nucleótido
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<400> 9
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17
18
19
20 
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<210> 10
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<211> 554
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<212> PRT
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<213> Lolium perenne 
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (66)..(66)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (111)..(111)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (160)..(160)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC FEATURE
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<222> (194)..(194)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (233)..(233)
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<223> Cualquier amino ácido
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (236)..(236)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (259)..(259)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (286)..(286)
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<223> Cualquier amino ácido
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<221> M ISC_FEATU RE
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<222> (291)..(291)
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<223> Cualquier amino ácido
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<222> (297)..(297)
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<223> Cualquier amino ácido
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<222> (306)..(306)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<222> (388)..(388)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (434)..(434)
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<223> Cualquier amino ácido
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<222> (442)..(442)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (489)..(489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier amino ácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
21
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4820
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Lolium perenne 
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1903)..(1903)
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<223> Cualquier nucleótido
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (4023)..(4028)
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<223> Cualquier nucleótido
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (4286)..(4286)
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<223> Cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
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<222> (4448)..(4448)
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<223> Cualquier nucleótido
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (4466)..(4466)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4468)..(44S8)
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<223> Cualquier nucleótido
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<221> misc_feature
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<222> (4684)..(4684)
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<223> Cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
24
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lolium perenne 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (493)..(493)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier amino ácido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (579)..(579)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier amino ácido
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<220>
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<222> (633)..(633)
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<223> Cualquier amino ácido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (639)..(639)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier amino ácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
26
27
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lolium perenne 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6782)..(6782)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier nucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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29
30
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Lolium perenne 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
32
33
34

Claims (10)

1. Un ácido nucleico sustancialmente aislado o purificado fragmento de ácido nucleico que codifica un homólogo de sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) de una especie Lolium y que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de
(a)
la secuencia mostrada en el Esquema ID No: 11;
(b)
fragmentos funcionalmente activos de la Secuencia ID No: 11 que tiene un tamaño de por lo menos 20 nucleótidos; y
(c)
variantes funcionalmente activas de las secuencias citadas en (a) y (b) que tienen por lo menos 95% de identidad con las secuencias citadas en (a) y (b).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha especie Lolium es Lolium perenne.
3. Un ácido nucleico sustancialmente purificado o aislado o fragmento de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de
(a)
un componente de la secuencia mostrada en el Esquema ID NO: 11;
(b)
secuencias anticodificantes a la secuencia mostrada en el Esquema ID NO: 11;
(c)
fragmentos funcionalmente activos de las secuencias citadas en (b) que tiene un tamaño de por lo menos 20 nucleótidos; y
(d)
variantes funcionalmente activas de las secuencias citadas en (b) y (c), que tienen por lo menos 95% de identidad con las secuencias citadas en (b) y (c).
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un vector que incluye un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 4 que incluye adicionalmente un promotor y un terminador, dicho promotor, ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico y terminador se liga de forma operativa.
6. Un célula de planta, planta, semilla u otra parte de la planta transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Un método para modificar la biosíntesis de fructano en una planta, dicho método incluye introducir en dicha planta una cantidad efectiva de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y/o un vector de acuerdo con la reivindicación 5.
8. Uso de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y/o información de secuencia de nucleótido del mismo, como un marcador genético molecular.
9. Un homólogo 1-SST sustancialmente purificado a partir de una especie Lolium que incluyen una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de
(a)
la secuencia mostrada en el Esquema ID No: 12;
(b)
fragmentos funcionalmente activos de la secuencia mostrada en el Esquema ID No: 12 que tiene un tamaño de por lo menos 20 aminoácidos; y
(c)
variantes funcionalmente activas de las secuencias citadas en (a) y (b) que tienen por lo menos 90% de identidad con las secuencias citadas en (a) y (b).
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un homólogo A 1-SST de acuerdo con la reivindicación 9 en donde dicha especie Lolium es Lolium perenne.
ES01942880T 2000-06-14 2001-06-14 Modificacion de biosintesis de fructano. Expired - Lifetime ES2338864T3 (es)

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