JP2000014389A - ラフィノース合成酵素遺伝子 - Google Patents
ラフィノース合成酵素遺伝子Info
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】植物におけるラフィノース合成酵素の発現量や
活性を変化させる技術に利用可能なラフィノース合成酵
素遺伝子等を提供すること。 【解決手段】配列番号2で示される塩基配列のうち塩基
番号134から2467までの塩基で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原
子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1
→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能
力を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるラフィノ
ース合成酵素遺伝子。
活性を変化させる技術に利用可能なラフィノース合成酵
素遺伝子等を提供すること。 【解決手段】配列番号2で示される塩基配列のうち塩基
番号134から2467までの塩基で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原
子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1
→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能
力を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるラフィノ
ース合成酵素遺伝子。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラフィノース合成
酵素遺伝子等に関する。
酵素遺伝子等に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラフィノース類オリゴ糖は、一般式とし
てo-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)n-o-α-D-グルコ
ピラノシル-(1→2)-β-D-フルクトフラノシドで示され
るショ糖の誘導体であり、n=1の場合にはラフィノー
ス、n=2の場合にはスタキオース、n=3の場合にはベルバ
スコース、n=4の場合にはアジュコースと呼ばれる。ラ
フィノース類オリゴ糖は、食品中に適量存在すると腸内
細菌フローラの状態を健全にする効果を示すことが知ら
れている。このため、ラフィノース類オリゴ糖は機能性
食品素材として一部の食品に添加され、特定保健用食品
分野において利用され始めている。一方、ラフィノース
類オリゴ糖は、ヒトなどの哺乳動物において消化・吸収
されずに腸内細菌などの微生物により資化・分解されて
ガスとなり、鼓腸や消化吸収阻害を引き起こす。従っ
て、食品や飼料中のラフィノース類オリゴ糖の量は適量
となるよう調節されることが望まれているこのようなラ
フィノース類オリゴ糖は、多くの植物においてショ糖を
初発とするラフィノース類オリゴ糖生合成系により生成
される。この生合成系は、通常、ショ糖分子中のD-グル
コース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基
に、ガラクチノール由来のガラクトシル基がα(1→6)結
合によって順次付加される反応により構成されている。
該生合成系の最初の段階において、ショ糖分子中のD-グ
ルコース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基
に、ガラクチノール由来のD-ガラクトシル基をα(1→6)
結合させることによりラフィノースを生成させる反応に
関与する酵素がラフィノース合成酵素である。該酵素は
前記生合成系における律速段階となっていることが示唆
されており、該酵素がラフィノース類オリゴ糖の生合成
の制御に重要である。そこで、植物のラフィノース生成
量を増加または減少させるために、植物におけるラフィ
ノース類オリゴ糖の生合成系を制御するには、ラフィノ
ース合成酵素遺伝子を利用して植物中のラフィノース合
成酵素の発現量や活性を制御する方法が有効である。し
かしながら、このような方法に使用できるラフィノース
合成酵素遺伝子の取得は未だ十分とは言い難い。
てo-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)n-o-α-D-グルコ
ピラノシル-(1→2)-β-D-フルクトフラノシドで示され
るショ糖の誘導体であり、n=1の場合にはラフィノー
ス、n=2の場合にはスタキオース、n=3の場合にはベルバ
スコース、n=4の場合にはアジュコースと呼ばれる。ラ
フィノース類オリゴ糖は、食品中に適量存在すると腸内
細菌フローラの状態を健全にする効果を示すことが知ら
れている。このため、ラフィノース類オリゴ糖は機能性
食品素材として一部の食品に添加され、特定保健用食品
分野において利用され始めている。一方、ラフィノース
類オリゴ糖は、ヒトなどの哺乳動物において消化・吸収
されずに腸内細菌などの微生物により資化・分解されて
ガスとなり、鼓腸や消化吸収阻害を引き起こす。従っ
て、食品や飼料中のラフィノース類オリゴ糖の量は適量
となるよう調節されることが望まれているこのようなラ
フィノース類オリゴ糖は、多くの植物においてショ糖を
初発とするラフィノース類オリゴ糖生合成系により生成
される。この生合成系は、通常、ショ糖分子中のD-グル
コース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基
に、ガラクチノール由来のガラクトシル基がα(1→6)結
合によって順次付加される反応により構成されている。
該生合成系の最初の段階において、ショ糖分子中のD-グ
ルコース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基
に、ガラクチノール由来のD-ガラクトシル基をα(1→6)
結合させることによりラフィノースを生成させる反応に
関与する酵素がラフィノース合成酵素である。該酵素は
前記生合成系における律速段階となっていることが示唆
されており、該酵素がラフィノース類オリゴ糖の生合成
の制御に重要である。そこで、植物のラフィノース生成
量を増加または減少させるために、植物におけるラフィ
ノース類オリゴ糖の生合成系を制御するには、ラフィノ
ース合成酵素遺伝子を利用して植物中のラフィノース合
成酵素の発現量や活性を制御する方法が有効である。し
かしながら、このような方法に使用できるラフィノース
合成酵素遺伝子の取得は未だ十分とは言い難い。
【０００３】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討した結果、カラシナおよびナタネ由来
のラフィノース合成酵素遺伝子を見出し、本発明に至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号2で示される塩基配
列のうち塩基番号134から2467までの塩基で表される塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつショ糖分子中のD-グルコース残基
の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクト
シル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを
生成させる能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡから
なるラフィノース合成酵素遺伝子（以下、本発明遺伝子
と記す。）、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、
配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、本発明遺伝子
の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡをプローブに
用いるハイブリダイゼーション法によるラフィノース合
成酵素遺伝子の検出方法、本発明遺伝子の部分塩基配列
を有するプライマーを用いるポリメラーゼチェインリア
クション法によるラフィノース合成酵素遺伝子の増幅方
法、前記検出方法または前記増幅方法を利用するラフィ
ノース合成酵素遺伝子の取得方法、本発明遺伝子を含む
DNAと、宿主細胞においてプロモーター活性を示すＤＮ
Ａとが連結されてなるＤＮＡ、本発明遺伝子が宿主の細
胞に導入されてなる形質転換体、該形質転換体を培養し
ラフィノース合成酵素を産生させることを特徴とするラ
フィノース合成酵素の製造方法、配列番号1で示される
アミノ酸配列を有するラフィノース合成酵素、配列番号
３で示されるアミノ酸配列を有するラフィノース合成酵
素を提供するものである。
明者らは鋭意検討した結果、カラシナおよびナタネ由来
のラフィノース合成酵素遺伝子を見出し、本発明に至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号2で示される塩基配
列のうち塩基番号134から2467までの塩基で表される塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつショ糖分子中のD-グルコース残基
の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクト
シル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを
生成させる能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡから
なるラフィノース合成酵素遺伝子（以下、本発明遺伝子
と記す。）、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、
配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、本発明遺伝子
の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡをプローブに
用いるハイブリダイゼーション法によるラフィノース合
成酵素遺伝子の検出方法、本発明遺伝子の部分塩基配列
を有するプライマーを用いるポリメラーゼチェインリア
クション法によるラフィノース合成酵素遺伝子の増幅方
法、前記検出方法または前記増幅方法を利用するラフィ
ノース合成酵素遺伝子の取得方法、本発明遺伝子を含む
DNAと、宿主細胞においてプロモーター活性を示すＤＮ
Ａとが連結されてなるＤＮＡ、本発明遺伝子が宿主の細
胞に導入されてなる形質転換体、該形質転換体を培養し
ラフィノース合成酵素を産生させることを特徴とするラ
フィノース合成酵素の製造方法、配列番号1で示される
アミノ酸配列を有するラフィノース合成酵素、配列番号
３で示されるアミノ酸配列を有するラフィノース合成酵
素を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。なお、以下に記述された遺伝子工学的方法は、例
えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd
edition」 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,ISBN 0-87969-309-6、「CurrentProtocols In Mole
cular Biology」 (1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN
0-471-50338-X、 Current Protocols In Protein Scie
nce (1995), John Wiley & Sons, Inc.ISBN0-471-11184
-8等の記載に準じて実施可能である。
する。なお、以下に記述された遺伝子工学的方法は、例
えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd
edition」 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,ISBN 0-87969-309-6、「CurrentProtocols In Mole
cular Biology」 (1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN
0-471-50338-X、 Current Protocols In Protein Scie
nce (1995), John Wiley & Sons, Inc.ISBN0-471-11184
-8等の記載に準じて実施可能である。
【０００５】本発明遺伝子は、カラシナ、ナタネ等のア
ブラナ科植物から得ることのできる遺伝子であり、具体
的には例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝
子、配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号134か
ら2467までの塩基で表される塩基配列を有するラフィノ
ース合成酵素遺伝子、配列番号2で示される塩基配列を
有するラフィノース合成酵素遺伝子、配列番号3で示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィ
ノース合成酵素遺伝子、配列番号４で示される塩基配列
のうち塩基番号1から1719までの塩基で表される塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、配列番号4で
示される塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子
等をあげることができる。
ブラナ科植物から得ることのできる遺伝子であり、具体
的には例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝
子、配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号134か
ら2467までの塩基で表される塩基配列を有するラフィノ
ース合成酵素遺伝子、配列番号2で示される塩基配列を
有するラフィノース合成酵素遺伝子、配列番号3で示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィ
ノース合成酵素遺伝子、配列番号４で示される塩基配列
のうち塩基番号1から1719までの塩基で表される塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子、配列番号4で
示される塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子
等をあげることができる。
【０００６】本発明遺伝子は、例えば、ビート等のアカ
ザ科植物から下記の方法により得ることができる。例え
ば、カラシナ(Brassica juncea)、ナタネ(Brassica nap
us)等のアブラナ科植物の組織を液体窒素中で凍結させ
た後、乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細
かい粉末状の組織片とし、該組織片から通常の方法によ
りRNAを抽出する。該抽出操作には、市販のRNA抽出キッ
トを利用することができる。得られたRNA抽出液からエ
タノール沈澱によりRNAを回収し、このRNAから通常の方
法によりポリA鎖を有するRNAを分画する。該分画操作に
は、市販のOligo dTカラムを利用することができる。こ
のようにして得られたポリA鎖を有するRNAから通常の方
法によりcDNAを合成する。該合成操作には、市販のcDNA
合成キットを利用することができる。前記cDNAを鋳型と
して、配列番号2で示される塩基配列を基にして設計さ
れ化学合成されたオリゴヌクレオチドをプライマーに用
いてPCRを行なうことにより、ＤＮＡを増幅する。例え
ば、カラシナ(Brassica juncea)由来のcDNAを鋳型とし
て、例えば、下記リスト１に示されるプライマー3と4を
用いてPCRを行うことにより、本発明遺伝子である「配列
番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するラフィノース合成酵素遺伝子」、より具体的には
「配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号1から26
54までの塩基で表される塩基配列からなるラフィノース
合成酵素遺伝子」のcDNAを増幅し取得することができ
る。この際に用いられるプライマーは、目的に応じて配
列番号2で示される塩基配列を基にして設計し合成する
ことができ、例えば、「配列番号1で示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素
遺伝子」のオープンリーディングフレーム領域をコード
するＤＮＡ、すなわち「配列番号2で示される塩基配列
のうち塩基番号134から2467までの塩基で表される塩基
配列からなるラフィノース合成酵素遺伝子」のＤＮＡ
（以下、本ＤＮＡと記す。）を増幅するには、下記リス
ト１のプライマー5と6で示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを合成しプライマーに用いるとよい。増
幅されたDNAは「Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al 2nd edition」 (1989),Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、 「Current Protocols In Molecular Biolo
gy」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-
X等に記載される通常の方法に準じてサブクローニング
することができる。具体的には、例えば、Invitrogen社
のTAクローニングキットやStratagene社のpBluescriptI
Iなどのプラスミドベクターを用いてクローニングして
もよい。クローニングされたDNAの塩基配列の確認は、
F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of N
ational Academy of Science U.S.A．(1977),74,5463頁
-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティン
グ法により行なうことができる。例えば、市販のパーキ
ンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Seque
ncing Ready Reaction Kitなどを利用するとよい。
ザ科植物から下記の方法により得ることができる。例え
ば、カラシナ(Brassica juncea)、ナタネ(Brassica nap
us)等のアブラナ科植物の組織を液体窒素中で凍結させ
た後、乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細
かい粉末状の組織片とし、該組織片から通常の方法によ
りRNAを抽出する。該抽出操作には、市販のRNA抽出キッ
トを利用することができる。得られたRNA抽出液からエ
タノール沈澱によりRNAを回収し、このRNAから通常の方
法によりポリA鎖を有するRNAを分画する。該分画操作に
は、市販のOligo dTカラムを利用することができる。こ
のようにして得られたポリA鎖を有するRNAから通常の方
法によりcDNAを合成する。該合成操作には、市販のcDNA
合成キットを利用することができる。前記cDNAを鋳型と
して、配列番号2で示される塩基配列を基にして設計さ
れ化学合成されたオリゴヌクレオチドをプライマーに用
いてPCRを行なうことにより、ＤＮＡを増幅する。例え
ば、カラシナ(Brassica juncea)由来のcDNAを鋳型とし
て、例えば、下記リスト１に示されるプライマー3と4を
用いてPCRを行うことにより、本発明遺伝子である「配列
番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するラフィノース合成酵素遺伝子」、より具体的には
「配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号1から26
54までの塩基で表される塩基配列からなるラフィノース
合成酵素遺伝子」のcDNAを増幅し取得することができ
る。この際に用いられるプライマーは、目的に応じて配
列番号2で示される塩基配列を基にして設計し合成する
ことができ、例えば、「配列番号1で示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素
遺伝子」のオープンリーディングフレーム領域をコード
するＤＮＡ、すなわち「配列番号2で示される塩基配列
のうち塩基番号134から2467までの塩基で表される塩基
配列からなるラフィノース合成酵素遺伝子」のＤＮＡ
（以下、本ＤＮＡと記す。）を増幅するには、下記リス
ト１のプライマー5と6で示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを合成しプライマーに用いるとよい。増
幅されたDNAは「Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al 2nd edition」 (1989),Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、 「Current Protocols In Molecular Biolo
gy」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-
X等に記載される通常の方法に準じてサブクローニング
することができる。具体的には、例えば、Invitrogen社
のTAクローニングキットやStratagene社のpBluescriptI
Iなどのプラスミドベクターを用いてクローニングして
もよい。クローニングされたDNAの塩基配列の確認は、
F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of N
ational Academy of Science U.S.A．(1977),74,5463頁
-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティン
グ法により行なうことができる。例えば、市販のパーキ
ンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Seque
ncing Ready Reaction Kitなどを利用するとよい。
【０００７】 （リスト１） プライマー1 TTGGAAGAGA AGACGCCGCC GGGAATCGTC 30mer プライマー2 TTAAGCCCCG GCGAGAGCTC TGGCCGGACA 30mer プライマー3 ACCAATCCAA AATCTCATCA AATAATCGCA 30mer プライマー4 AAATAATAGG GGCAGTACAA ATTACACCAC 30mer プライマー5 ATGGCTCCAC CGAGCGTAAT TAAATCCGA 29mer プライマー6 CTAAAACTCA TACTTAATAG AAGACAAACC 30mer
【０００８】次いで、前記のようにして取得することが
できる本ＤＮＡを標識しこれをハイブリダイゼーション
法におけるプローブとして例えばアブラナ科植物由来の
ＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結
合するＤＮＡを検出することにより、ラフィノース合成
酵素遺伝子を含むＤＮＡを検出することができる。アブ
ラナ科植物由来のＤＮＡとしては、例えば、カラシナ、
ナタネ等のアブラナ科植物のcDNAライブラリーやgenomi
cDNAライブラリー等を使用することができる。このよう
な遺伝子ライブラリーには、市販の遺伝子ライブラリー
をそのまま用いることもできるし、また「Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold
Spring Harbor Laboratory Pressや「Current Protoco
ls In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,
Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のライブラ
リー作製法に従って作製されたライブラリーを用いるこ
ともできる。ハイブリダイゼーション法としては、プラ
ークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼ
ーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用
いられたベクターの種類に応じて選択する。具体的に
は、使用されるライブラリーがファージベクターを用い
て構築された場合には、まずライブラリーのファージを
適当な宿主微生物と感染可能な条件下で混合して形質転
換体を得た後、該形質転換体を軟寒天培地と混合し、寒
天培地上にまく。その後適当な大きさのプラークが現れ
るまで37℃で培養を行う。また、使用されるライブラリ
ーがプラスミドベクターで構築された場合には、まずラ
イブラリーのプラスミドを適当な宿主微生物に導入し、
形質転換体を得る。得られた形質転換体を適当に希釈し
て寒天培地にまき、適当な大きさのコロニーが現れるま
で37℃で培養を行う。いずれのライブラリーの場合も上
記の培養後、寒天培地の表面にメンブレンフィルターを
のせ、ファージまたは形質転換体をメンブレンに転写す
る。このメンブレンをアルカリによる変性処理後、中和
処理し、例えばナイロンメンブレンの場合には該メンブ
レンに紫外線を照射することにより、ファージまたは形
質転換体のDNAをメンブレン上に固定する。次にこのメ
ンブレンについて、通常の方法により標識された本ＤＮ
Ａをプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を
行う。この方法については、例えば、D M Glover編「DN
A cloning,a practical approach.」 IRL PRESS （198
5） ISBN 0-947946-18-7を参考にするとよい。ハイブリ
ダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在
するが、一般的には例えば、プレハイブリダイゼーショ
ンは、プレハイブリダイゼーション溶液[6×SSC(0.9M N
aCl,0.09Mクエン酸)、0.1〜1(w/v)%SDS、100μg/ml変性
サケ精巣DNA]にメンブレンを浸して65℃で1時間インキ
ュベートする。次に、ここへ標識された本ＤＮＡを加え
て混合し、42〜68℃で4〜16時間保温することによりハ
イブリダイゼーションを行う。尚、本発明において「ス
トリンジェントな条件」としては、前記のハイブリダイ
ゼーションにおいて、例えば、65〜68℃にて保温するよ
うな条件をあげることができる。ハイブリダイゼーショ
ン終了後メンブレンを取り出し、これを0.1〜1(w/v)%SD
Sを含む2×SSCで洗浄し、さらに0.1〜1(w/v)%SDSを含む
0.2×SSCですすいだ後乾かす。このメンブレンを、例え
ば、オートラジオグラフィーなどにより解析してメンブ
レン上のプローブの位置を検出することにより、用いた
プローブと相同性のある塩基配列を有するDNAのメンブ
レン上の位置を検出することができる。このようにして
検出されたDNAのメンブレン上の位置に相当するクロー
ンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することによ
り、当該DNAを有するクローンを単離することができ、
さらに、同様の検出操作を繰り返すことで当該DNAを有
するクローンを純化することができる。また、市販のGi
bcoBRL社のGENE TRAPPER cDNA Positive Selection Sys
temキットのような検出の方法を用いることもできる。
この方法では、まず一本鎖化したDNAライブラリーとビ
オチン化した本ＤＮＡ（プローブ）とをハイブリダイズ
させた後、これにストレプトアビジン結合マグネットビ
ーズを加えて混合し、この混合物からストレプトアビジ
ン結合マグネットビーズを磁石で回収することで、本Ｄ
ＮＡ、ビオチンおよびストレプトアビジンを介して該ビ
ーズに結合した１本鎖DNA、すなわち、用いたプローブ
と相同性のある塩基配列を有する１本鎖DNAを回収す
る。尚、回収された１本鎖DNAは適当なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてDNAポリメラーゼを反応させる
ことにより２本鎖化することができる。
できる本ＤＮＡを標識しこれをハイブリダイゼーション
法におけるプローブとして例えばアブラナ科植物由来の
ＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結
合するＤＮＡを検出することにより、ラフィノース合成
酵素遺伝子を含むＤＮＡを検出することができる。アブ
ラナ科植物由来のＤＮＡとしては、例えば、カラシナ、
ナタネ等のアブラナ科植物のcDNAライブラリーやgenomi
cDNAライブラリー等を使用することができる。このよう
な遺伝子ライブラリーには、市販の遺伝子ライブラリー
をそのまま用いることもできるし、また「Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold
Spring Harbor Laboratory Pressや「Current Protoco
ls In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,
Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のライブラ
リー作製法に従って作製されたライブラリーを用いるこ
ともできる。ハイブリダイゼーション法としては、プラ
ークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼ
ーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用
いられたベクターの種類に応じて選択する。具体的に
は、使用されるライブラリーがファージベクターを用い
て構築された場合には、まずライブラリーのファージを
適当な宿主微生物と感染可能な条件下で混合して形質転
換体を得た後、該形質転換体を軟寒天培地と混合し、寒
天培地上にまく。その後適当な大きさのプラークが現れ
るまで37℃で培養を行う。また、使用されるライブラリ
ーがプラスミドベクターで構築された場合には、まずラ
イブラリーのプラスミドを適当な宿主微生物に導入し、
形質転換体を得る。得られた形質転換体を適当に希釈し
て寒天培地にまき、適当な大きさのコロニーが現れるま
で37℃で培養を行う。いずれのライブラリーの場合も上
記の培養後、寒天培地の表面にメンブレンフィルターを
のせ、ファージまたは形質転換体をメンブレンに転写す
る。このメンブレンをアルカリによる変性処理後、中和
処理し、例えばナイロンメンブレンの場合には該メンブ
レンに紫外線を照射することにより、ファージまたは形
質転換体のDNAをメンブレン上に固定する。次にこのメ
ンブレンについて、通常の方法により標識された本ＤＮ
Ａをプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を
行う。この方法については、例えば、D M Glover編「DN
A cloning,a practical approach.」 IRL PRESS （198
5） ISBN 0-947946-18-7を参考にするとよい。ハイブリ
ダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在
するが、一般的には例えば、プレハイブリダイゼーショ
ンは、プレハイブリダイゼーション溶液[6×SSC(0.9M N
aCl,0.09Mクエン酸)、0.1〜1(w/v)%SDS、100μg/ml変性
サケ精巣DNA]にメンブレンを浸して65℃で1時間インキ
ュベートする。次に、ここへ標識された本ＤＮＡを加え
て混合し、42〜68℃で4〜16時間保温することによりハ
イブリダイゼーションを行う。尚、本発明において「ス
トリンジェントな条件」としては、前記のハイブリダイ
ゼーションにおいて、例えば、65〜68℃にて保温するよ
うな条件をあげることができる。ハイブリダイゼーショ
ン終了後メンブレンを取り出し、これを0.1〜1(w/v)%SD
Sを含む2×SSCで洗浄し、さらに0.1〜1(w/v)%SDSを含む
0.2×SSCですすいだ後乾かす。このメンブレンを、例え
ば、オートラジオグラフィーなどにより解析してメンブ
レン上のプローブの位置を検出することにより、用いた
プローブと相同性のある塩基配列を有するDNAのメンブ
レン上の位置を検出することができる。このようにして
検出されたDNAのメンブレン上の位置に相当するクロー
ンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することによ
り、当該DNAを有するクローンを単離することができ、
さらに、同様の検出操作を繰り返すことで当該DNAを有
するクローンを純化することができる。また、市販のGi
bcoBRL社のGENE TRAPPER cDNA Positive Selection Sys
temキットのような検出の方法を用いることもできる。
この方法では、まず一本鎖化したDNAライブラリーとビ
オチン化した本ＤＮＡ（プローブ）とをハイブリダイズ
させた後、これにストレプトアビジン結合マグネットビ
ーズを加えて混合し、この混合物からストレプトアビジ
ン結合マグネットビーズを磁石で回収することで、本Ｄ
ＮＡ、ビオチンおよびストレプトアビジンを介して該ビ
ーズに結合した１本鎖DNA、すなわち、用いたプローブ
と相同性のある塩基配列を有する１本鎖DNAを回収す
る。尚、回収された１本鎖DNAは適当なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてDNAポリメラーゼを反応させる
ことにより２本鎖化することができる。
【０００９】上記のように本ＤＮＡとハイブリダイズす
るＤＮＡをアブラナ科植物由来の遺伝子ライブラリーの
ＤＮＡから検出し、当該ＤＮＡを保有するクローンを純
化して該クローンからファージまたはプラスミドＤＮＡ
を単離することにより、ラフィノース合成酵素遺伝子を
含むＤＮＡを取得することができる。このようにして得
られたＤＮＡについて通常の方法により制限酵素地図を
作成するかまたは塩基配列を決定することにより、本発
明遺伝子を含むＤＮＡを確認することができる。例え
ば、決定された塩基配列にコードされるアミノ酸配列
が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の111番目から2
13番目までのアミノ酸からなるアミノ酸配列と75%以上
の相同性を有すること、配列番号１で示されるアミノ酸
配列の260番目から275番目のアミノ酸からなるアミノ酸
配列と80%以上の相同性を有すること、配列番号１で示
されるアミノ酸配列の293番目から325番目までのアミノ
酸からなるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するこ
と、配列番号１で示されるアミノ酸配列の609番目から6
95番目までのアミノ酸からなるアミノ酸配列と70%以上
の相同性を有すること等から、本発明遺伝子であること
を確認することができる。尚、ここで述べる相同性と
は、比較する2つのアミノ酸配列間に類似性の見られる
領域において、該領域全体のアミノ酸数に対して、2つ
のアミノ酸配列間で一致するアミノ酸の数が占める割合
のことである。ここで、類似性の見られる領域のアミノ
酸数は多い方が好ましい。例えば、このようなアミノ酸
配列の相同性は、GENETIX(ソフトウェア開発株式会社
製)などの遺伝子解析ソフトを用いることにより評価す
ることができる。
るＤＮＡをアブラナ科植物由来の遺伝子ライブラリーの
ＤＮＡから検出し、当該ＤＮＡを保有するクローンを純
化して該クローンからファージまたはプラスミドＤＮＡ
を単離することにより、ラフィノース合成酵素遺伝子を
含むＤＮＡを取得することができる。このようにして得
られたＤＮＡについて通常の方法により制限酵素地図を
作成するかまたは塩基配列を決定することにより、本発
明遺伝子を含むＤＮＡを確認することができる。例え
ば、決定された塩基配列にコードされるアミノ酸配列
が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の111番目から2
13番目までのアミノ酸からなるアミノ酸配列と75%以上
の相同性を有すること、配列番号１で示されるアミノ酸
配列の260番目から275番目のアミノ酸からなるアミノ酸
配列と80%以上の相同性を有すること、配列番号１で示
されるアミノ酸配列の293番目から325番目までのアミノ
酸からなるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するこ
と、配列番号１で示されるアミノ酸配列の609番目から6
95番目までのアミノ酸からなるアミノ酸配列と70%以上
の相同性を有すること等から、本発明遺伝子であること
を確認することができる。尚、ここで述べる相同性と
は、比較する2つのアミノ酸配列間に類似性の見られる
領域において、該領域全体のアミノ酸数に対して、2つ
のアミノ酸配列間で一致するアミノ酸の数が占める割合
のことである。ここで、類似性の見られる領域のアミノ
酸数は多い方が好ましい。例えば、このようなアミノ酸
配列の相同性は、GENETIX(ソフトウェア開発株式会社
製)などの遺伝子解析ソフトを用いることにより評価す
ることができる。
【００１０】さらに、本発明遺伝子の部分塩基配列を有
するＤＮＡをプローブとして上記と同様に所望の生物由
来のＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的
に結合するＤＮＡを検出することにより、ラフィノース
合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを検出する（以下、本発明
検出方法と記す。）ことができる。ここで用いられる本
発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、
配列番号２または配列番号４で示される塩基配列に基づ
いて通常の方法で化学合成してもよく、また、配列番号
２または配列番号４で示される塩基配列に基づいて通常
の方法で化学合成されたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーに用いてPCR法により調製してもよい。
するＤＮＡをプローブとして上記と同様に所望の生物由
来のＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的
に結合するＤＮＡを検出することにより、ラフィノース
合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを検出する（以下、本発明
検出方法と記す。）ことができる。ここで用いられる本
発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、
配列番号２または配列番号４で示される塩基配列に基づ
いて通常の方法で化学合成してもよく、また、配列番号
２または配列番号４で示される塩基配列に基づいて通常
の方法で化学合成されたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーに用いてPCR法により調製してもよい。
【００１１】本発明遺伝子の部分塩基配列を有するプラ
イマーを用いるPCR法により、所望の生物由来のＤＮＡ
からラフィノース合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅す
る（以下、本発明増幅方法と記す。）ことが可能であ
る。具体的には、例えば、本発明遺伝子の部分塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを設計し、通常の合成方法
によりこれを化学合成する。オリゴヌクレオチドの長さ
としては、一般的に、アニーリングの特異性が確保され
る点からは塩基数が多い方がよく、プライマー自身が高
次構造を取り易くアニーリング効率が悪くなる恐れがあ
る点や合成後の精製時に煩雑な操作が必要となる点から
は塩基数が多すぎない方がよく、通常、塩基数が15以上
50以下が好ましい。このとき、コドン表(図1)に基づ
き、１つのアミノ酸をコードしうるコドンのバリエーシ
ョンに応じて、プライマーの特定の位置の残基の合成に
複数の塩基の混合物を使用し、該残基が異なる塩基から
なるプライマーの混合物を合成することもできる。ま
た、例えば、複数の塩基と対合できるイノシンなどの塩
基を、前記の複数の塩基の混合物の代わりに用いること
もできる。尚、ここで、２本鎖ＤＮＡからなる本発明遺
伝子のコーディング鎖と同じ塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドをセンスプライマー、該コーディング鎖の塩
基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をアンチセンスプライマーと呼ぶ。本発明遺伝子のコー
ディング鎖の５’上流側の塩基配列を有するセンスプラ
イマーと、３’下流側の塩基配列と相補的な塩基配列を
有するアンチセンスプライマーとを組み合わせて用い
て、例えば、遺伝子ライブラリー、ゲノムＤＮＡまたは
ｃＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行いＤＮＡを増幅す
る。ここで用いられる遺伝子ライブラリーとしては、例
えば、カラシナ、ナタネなどのアブラナ科植物等のcDNA
ライブラリーやgenomicDNAライブラリー等をあげること
ができる。該遺伝子ライブラリーとしては、「Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」 (198
9),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや「Current
Protocols InMolecular Biology」 (1987),John Wiley
& Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のラ
イブラリー作製法に従って作製されたライブラリーを用
いることもできるし、また市販の遺伝子ライブラリーを
そのまま用いることもできる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡとしては、例えば、アブラナ科植物等から調製され
たgenomicDNAやcDNAをあげることができる。例えば、上
記のリスト１に示されるプライマー１と2とを用いてカ
ラシナ由来のcDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、
配列番号２の塩基番号749〜1215で示される塩基配列を
有するＤＮＡを増幅することができ、該プライマーを用
いてナタネ由来のcDNAを鋳型としてPCRを行うことによ
り、配列番号４の塩基番号1〜467で示される塩基配列を
有するＤＮＡを増幅することができる。このようにして
増幅されたDNAは通常の電気泳動法により確認すること
ができ、該DNAは、「Molecular Cloning:A Laboratory
Manual 2nd edition」 (1989),Cold Spring Harbor Lab
oratory Press、 「CurrentProtocols In Molecular Bi
ology」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-503
38-X等に記載される通常の方法に準じてクローニングす
ることができる。該DNAについて通常の方法により制限
酵素地図を作成するかまたは塩基配列を決定することに
より、ラフィノース合成酵素遺伝子またはその一部を含
むＤＮＡを確認することができる。該ＤＮＡがラフィノ
ース合成酵素遺伝子の一部を含む場合は、その塩基配列
に基づき、該塩基配列の５’末端より上流の塩基配列を
含むDNA、または該塩基配列の３’末端より下流の塩基
配列を含むDNAの増幅をPCR法で行うことができる。すな
わち、上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列に基
づいて、5’末端側上流部分の増幅にはアンチセンスプ
ライマーを、3’末端側下流部分の増幅にはセンスプラ
イマーをそれぞれ設計し合成する。これらのプライマー
を用いて、例えば、Clontech社のMarathon Kit等の市販
のキットを用いてRACE法を行うことにより、ラフィノー
ス合成酵素遺伝子の既得部分の５’末端より上流、また
は、既得部分の３’末端より下流の塩基配列を明らかに
することができる。このようにして明らかにされた塩基
配列に基づいて、完全長のラフィノース合成酵素遺伝子
の末端部分の塩基配列からなるプライマーを合成し再度
PCRを行うことにより、完全長のラフィノース合成酵素
遺伝子を取得することができる。
イマーを用いるPCR法により、所望の生物由来のＤＮＡ
からラフィノース合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅す
る（以下、本発明増幅方法と記す。）ことが可能であ
る。具体的には、例えば、本発明遺伝子の部分塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを設計し、通常の合成方法
によりこれを化学合成する。オリゴヌクレオチドの長さ
としては、一般的に、アニーリングの特異性が確保され
る点からは塩基数が多い方がよく、プライマー自身が高
次構造を取り易くアニーリング効率が悪くなる恐れがあ
る点や合成後の精製時に煩雑な操作が必要となる点から
は塩基数が多すぎない方がよく、通常、塩基数が15以上
50以下が好ましい。このとき、コドン表(図1)に基づ
き、１つのアミノ酸をコードしうるコドンのバリエーシ
ョンに応じて、プライマーの特定の位置の残基の合成に
複数の塩基の混合物を使用し、該残基が異なる塩基から
なるプライマーの混合物を合成することもできる。ま
た、例えば、複数の塩基と対合できるイノシンなどの塩
基を、前記の複数の塩基の混合物の代わりに用いること
もできる。尚、ここで、２本鎖ＤＮＡからなる本発明遺
伝子のコーディング鎖と同じ塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドをセンスプライマー、該コーディング鎖の塩
基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をアンチセンスプライマーと呼ぶ。本発明遺伝子のコー
ディング鎖の５’上流側の塩基配列を有するセンスプラ
イマーと、３’下流側の塩基配列と相補的な塩基配列を
有するアンチセンスプライマーとを組み合わせて用い
て、例えば、遺伝子ライブラリー、ゲノムＤＮＡまたは
ｃＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行いＤＮＡを増幅す
る。ここで用いられる遺伝子ライブラリーとしては、例
えば、カラシナ、ナタネなどのアブラナ科植物等のcDNA
ライブラリーやgenomicDNAライブラリー等をあげること
ができる。該遺伝子ライブラリーとしては、「Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」 (198
9),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや「Current
Protocols InMolecular Biology」 (1987),John Wiley
& Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のラ
イブラリー作製法に従って作製されたライブラリーを用
いることもできるし、また市販の遺伝子ライブラリーを
そのまま用いることもできる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡとしては、例えば、アブラナ科植物等から調製され
たgenomicDNAやcDNAをあげることができる。例えば、上
記のリスト１に示されるプライマー１と2とを用いてカ
ラシナ由来のcDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、
配列番号２の塩基番号749〜1215で示される塩基配列を
有するＤＮＡを増幅することができ、該プライマーを用
いてナタネ由来のcDNAを鋳型としてPCRを行うことによ
り、配列番号４の塩基番号1〜467で示される塩基配列を
有するＤＮＡを増幅することができる。このようにして
増幅されたDNAは通常の電気泳動法により確認すること
ができ、該DNAは、「Molecular Cloning:A Laboratory
Manual 2nd edition」 (1989),Cold Spring Harbor Lab
oratory Press、 「CurrentProtocols In Molecular Bi
ology」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-503
38-X等に記載される通常の方法に準じてクローニングす
ることができる。該DNAについて通常の方法により制限
酵素地図を作成するかまたは塩基配列を決定することに
より、ラフィノース合成酵素遺伝子またはその一部を含
むＤＮＡを確認することができる。該ＤＮＡがラフィノ
ース合成酵素遺伝子の一部を含む場合は、その塩基配列
に基づき、該塩基配列の５’末端より上流の塩基配列を
含むDNA、または該塩基配列の３’末端より下流の塩基
配列を含むDNAの増幅をPCR法で行うことができる。すな
わち、上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列に基
づいて、5’末端側上流部分の増幅にはアンチセンスプ
ライマーを、3’末端側下流部分の増幅にはセンスプラ
イマーをそれぞれ設計し合成する。これらのプライマー
を用いて、例えば、Clontech社のMarathon Kit等の市販
のキットを用いてRACE法を行うことにより、ラフィノー
ス合成酵素遺伝子の既得部分の５’末端より上流、また
は、既得部分の３’末端より下流の塩基配列を明らかに
することができる。このようにして明らかにされた塩基
配列に基づいて、完全長のラフィノース合成酵素遺伝子
の末端部分の塩基配列からなるプライマーを合成し再度
PCRを行うことにより、完全長のラフィノース合成酵素
遺伝子を取得することができる。
【００１２】上述の本発明検出方法をアブラナ科植物等
の遺伝子型の解析に利用してもよい。具体的には、例え
ばアブラナ科植物由来のゲノムDNAを、例えば、渡辺格
監修、杉浦昌弘編集:「クローニングとシークエンス(植
物バイオテクノロジー実験マニュアル)」、農村文化
社、東京(1989)などに記載された通常の方法に従って調
製し、少なくとも数種類の制限酵素で切断し電気泳動し
た後、泳動されたＤＮＡを通常の方法に従ってフィルタ
ーにブロッティングする。このフィルターに、本発明遺
伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡから通常の方法で調
製されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行
ない、該プローブがハイブリダイズするDNAを検出す
る。検出されたDNAの長さを異なる品種について比較
し、その長さの違いから、品種間のラフィノース類オリ
ゴ糖発現に伴う表現形質の差を解析することができる。
また、上記の方法により検出されたDNAの長さを遺伝子
組換え植物と同種の非遺伝子組換え植物とで比較しても
よい。遺伝子組換え植物において非遺伝子組換え植物よ
りもハイブリダイズするバンドが数多くまたは濃く検出
された場合、該植物が遺伝子組換え植物であると判別す
ることができる。この方法は、例えば、島本功、佐々木
卓治監修:「植物のPCR実験プロトコール」、秀潤社、東
京(1995)、ISBN4-87962-144-7、90-94頁に記載されるRF
LP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法に準
じて行なうことができる。
の遺伝子型の解析に利用してもよい。具体的には、例え
ばアブラナ科植物由来のゲノムDNAを、例えば、渡辺格
監修、杉浦昌弘編集:「クローニングとシークエンス(植
物バイオテクノロジー実験マニュアル)」、農村文化
社、東京(1989)などに記載された通常の方法に従って調
製し、少なくとも数種類の制限酵素で切断し電気泳動し
た後、泳動されたＤＮＡを通常の方法に従ってフィルタ
ーにブロッティングする。このフィルターに、本発明遺
伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡから通常の方法で調
製されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行
ない、該プローブがハイブリダイズするDNAを検出す
る。検出されたDNAの長さを異なる品種について比較
し、その長さの違いから、品種間のラフィノース類オリ
ゴ糖発現に伴う表現形質の差を解析することができる。
また、上記の方法により検出されたDNAの長さを遺伝子
組換え植物と同種の非遺伝子組換え植物とで比較しても
よい。遺伝子組換え植物において非遺伝子組換え植物よ
りもハイブリダイズするバンドが数多くまたは濃く検出
された場合、該植物が遺伝子組換え植物であると判別す
ることができる。この方法は、例えば、島本功、佐々木
卓治監修:「植物のPCR実験プロトコール」、秀潤社、東
京(1995)、ISBN4-87962-144-7、90-94頁に記載されるRF
LP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法に準
じて行なうことができる。
【００１３】また、本発明増幅方法をアブラナ科植物等
の遺伝子の解析に利用してもよい。具体的には、例え
ば、アブラナ科植物から調製した植物ゲノムDNAを鋳型
として、本発明増幅方法を行ない、ＤＮＡを増幅させ
る。増幅されたＤＮＡをホルムアルデヒド溶液と混合
し、85℃で5分間加熱変性処理を行った後、氷上で急冷
する。このサンプルをグリセロールを0(v/v)%または10
(v/v)%含む、例えば6(w/v)%ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動に供する。この電気泳動には市販のSSCP(Singl
e Strand Conformation Polymorphism)用の電気泳動装
置を用いることができ、例えば5℃、25℃、37℃等にゲ
ルの温度を一定に保って電気泳動を行なう。電気泳動し
たゲルから、例えば、市販の試薬による銀染色法等の方
法によりDNAを検出する。検出されたDNAの電気泳動にお
ける挙動の品種間の差からラフィノース合成酵素遺伝子
内の変異を検出し、該変異に基づいて生じる、ラフィノ
ース類オリゴ糖発現に伴う表現形質における品種間の差
を解析する。この方法は、例えば、島本功、佐々木卓治
監修:「植物のPCR実験プロトコール」、秀潤社、東京(1
995)、ISBN4-87962-144-7、141-146頁に記載されるSSCP
法に準じて行うことができる。
の遺伝子の解析に利用してもよい。具体的には、例え
ば、アブラナ科植物から調製した植物ゲノムDNAを鋳型
として、本発明増幅方法を行ない、ＤＮＡを増幅させ
る。増幅されたＤＮＡをホルムアルデヒド溶液と混合
し、85℃で5分間加熱変性処理を行った後、氷上で急冷
する。このサンプルをグリセロールを0(v/v)%または10
(v/v)%含む、例えば6(w/v)%ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動に供する。この電気泳動には市販のSSCP(Singl
e Strand Conformation Polymorphism)用の電気泳動装
置を用いることができ、例えば5℃、25℃、37℃等にゲ
ルの温度を一定に保って電気泳動を行なう。電気泳動し
たゲルから、例えば、市販の試薬による銀染色法等の方
法によりDNAを検出する。検出されたDNAの電気泳動にお
ける挙動の品種間の差からラフィノース合成酵素遺伝子
内の変異を検出し、該変異に基づいて生じる、ラフィノ
ース類オリゴ糖発現に伴う表現形質における品種間の差
を解析する。この方法は、例えば、島本功、佐々木卓治
監修:「植物のPCR実験プロトコール」、秀潤社、東京(1
995)、ISBN4-87962-144-7、141-146頁に記載されるSSCP
法に準じて行うことができる。
【００１４】上述の本発明検出方法または本発明増幅方
法によるアブラナ科植物の遺伝子解析法は、植物品種の
ラフィノース類オリゴ糖生合成に伴う表現形質の差の解
析のみに有効なだけでなく、例えばアブラナ科植物の新
品種の作出の際に目的の形質を持つクローンの選択にも
利用できる。また、組換え体植物を利用して品種作出を
行う場合に、作出されたクローンが組換え体植物由来の
形質を保持しているか否かの判別にも利用できる。
法によるアブラナ科植物の遺伝子解析法は、植物品種の
ラフィノース類オリゴ糖生合成に伴う表現形質の差の解
析のみに有効なだけでなく、例えばアブラナ科植物の新
品種の作出の際に目的の形質を持つクローンの選択にも
利用できる。また、組換え体植物を利用して品種作出を
行う場合に、作出されたクローンが組換え体植物由来の
形質を保持しているか否かの判別にも利用できる。
【００１５】本発明遺伝子を宿主の細胞で発現させるに
は、本発明遺伝子とプロモーターとが連結されてなるＤ
ＮＡ（以下、本発明発現ＤＮＡと記す。）を利用すると
よい。該ＤＮＡにおいてプロモーターは、該ＤＮＡが導
入され形質転換される宿主の細胞内で機能可能なもので
あれば特に制限はない。例えば、大腸菌のラクトースオ
ペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロ
ンのプロモーター、tacプロモーター等の大腸菌内で機
能可能な合成プロモーター、酵母のアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデノウイルス
・メジャーレート（Ad.ML）プロモーター、SV40の初期
プロモーター、バキュロウイルスプロモーターなどがあ
げられる。また、宿主が植物である場合には、例えば、
ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)プロモーター、オクトピ
ン合成酵素遺伝子(OCS)プロモーターなどのT-DNA由来の
構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(C
aMV)由来の19S及び35Sプロモーターなどの植物ウイルス
由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ(PAL)遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ(CH
S)遺伝子のプロモーター、Pathogenesis-related prote
in(PR)遺伝子のプロモーターなどの誘導プロモーターな
どをあげることができる。また、特定の植物組織で特異
的に発現するようなプロモーター、例えば、ダイズ由来
種子貯蔵蛋白質グリシニン遺伝子のプロモーターを持つ
ベクターpSUM-GY1（特開平06-189777）などを使用する
こともできる。さらに、本発明発現ＤＮＡにターミネー
ターを連結させてもよい。この場合、発現させようとす
るラフィノース合成酵素遺伝子の下流にターミネーター
が位置するように連結すると一般的によい。用いられる
ターミネーターは、形質転換される宿主の細胞内で機能
可能なものであれば特に制限はないが、例えば宿主が植
物の場合には、ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)ターミネ
ーターなどのT-DNA由来の構成型ターミネーター、ニン
ニクウイルスGV1、GV2のターミネーターなどの植物由来
のターミネーターなどをあげることができる。
は、本発明遺伝子とプロモーターとが連結されてなるＤ
ＮＡ（以下、本発明発現ＤＮＡと記す。）を利用すると
よい。該ＤＮＡにおいてプロモーターは、該ＤＮＡが導
入され形質転換される宿主の細胞内で機能可能なもので
あれば特に制限はない。例えば、大腸菌のラクトースオ
ペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロ
ンのプロモーター、tacプロモーター等の大腸菌内で機
能可能な合成プロモーター、酵母のアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデノウイルス
・メジャーレート（Ad.ML）プロモーター、SV40の初期
プロモーター、バキュロウイルスプロモーターなどがあ
げられる。また、宿主が植物である場合には、例えば、
ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)プロモーター、オクトピ
ン合成酵素遺伝子(OCS)プロモーターなどのT-DNA由来の
構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(C
aMV)由来の19S及び35Sプロモーターなどの植物ウイルス
由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ(PAL)遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ(CH
S)遺伝子のプロモーター、Pathogenesis-related prote
in(PR)遺伝子のプロモーターなどの誘導プロモーターな
どをあげることができる。また、特定の植物組織で特異
的に発現するようなプロモーター、例えば、ダイズ由来
種子貯蔵蛋白質グリシニン遺伝子のプロモーターを持つ
ベクターpSUM-GY1（特開平06-189777）などを使用する
こともできる。さらに、本発明発現ＤＮＡにターミネー
ターを連結させてもよい。この場合、発現させようとす
るラフィノース合成酵素遺伝子の下流にターミネーター
が位置するように連結すると一般的によい。用いられる
ターミネーターは、形質転換される宿主の細胞内で機能
可能なものであれば特に制限はないが、例えば宿主が植
物の場合には、ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)ターミネ
ーターなどのT-DNA由来の構成型ターミネーター、ニン
ニクウイルスGV1、GV2のターミネーターなどの植物由来
のターミネーターなどをあげることができる。
【００１６】かかる本発明発現ＤＮＡを通常の遺伝子工
学的方法に準じて宿主の細胞に導入することにより形質
転換体を得ることができる。尚、宿主の細胞に導入する
ための形質転換方法に応じて、必要であれば、本発明発
現ＤＮＡを適当な選抜マーカー遺伝子を有するベクター
に挿入して使用するとよい。本発明発現ＤＮＡが挿入さ
れたベクターは、例えば、宿主が微生物の場合には、
「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd editio
n」 (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや
「Current Protocols In Molecular Biology」 (1987),
John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載さ
れる通常の手段により微生物に導入することができ、該
ベクターにより形質転換された微生物は抗生物質耐性や
栄養要求性等の選抜マーカーにより選抜される。選抜さ
れた微生物、例えば形質転換大腸菌などで誘導型のプロ
モーター、例えばtacプロモーターなどの下流に本発明
遺伝子を翻訳可能な形で結合してある場合には通常の培
養、誘導条件下で本発明遺伝子の翻訳産物を発現させ、
ペプチド、あるいは蛋白質として回収することが可能で
ある。このようにして調製される本発明遺伝子の翻訳産
物について、例えば、L．Lehle and W．Tanner，Eu
r．J．Biochem．，38，103頁-110頁（1973）に記載され
る方法によりラフィノース合成活性を測定することによ
り、該翻訳産物が「ショ糖分子中のD-グルコース残基の6
位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル
基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成
させる能力」を有するか否かを判定することができる。
具体的には、例えば、本発明遺伝子をpGEX-4T3(Pharmac
ia社)またはpGEX-4T3(Pharmacia社)にクローニングし、
本発明発現DNAを保有するプラスミドを得る。得られた
プラスミドを例えば大腸菌HB101株に導入し、形質転換
株を得る。得られた形質転換株の終夜培養液1mlを100ml
のLB培地に植菌し、37℃で約3時間培養した後、終濃度1
mMのIPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)を添加し、
さらに5時間培養する。該培養液から遠心分離により菌
体を回収し、得られた菌体に菌体重量の10倍量の100mM
Tris-HCl(pH7．4)、1mM EDTA、5mM DTT(Dithiothreito
l)、1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)、1mM b
enzamideを加え、懸濁する。この懸濁液を超音波破砕機
(Branson社)で超音波処理し、菌体を破砕する。得られ
た菌体破砕液を遠心分離し、可溶性蛋白質溶液を回収す
る。得られた蛋白質溶液を、終濃度で100mM Tris-HCl(p
H7．4)、5mM DTT(Dithiothreitol)、0．01% BSA、200μ
M sucrose、5mM ガラクチノール、31．7μM [14C]sucro
seとなる反応液に加える。該反応液を37℃で保温した
後、これに1．5倍容のエタノールを加えて攪拌する。不
溶物を遠心分離により除いた後、上清を例えばHPTLCセ
ルロース薄層クロマトプレート(Merck社HPTLC plates c
ellulose)にスポットし、n-ブタノール：ピリジン：
水：酢酸=60：40：30：3で展開する。展開したプレート
を乾燥した後、イメージングアナライザー(富士フィル
ム社FUJIXバイオ・イメージングアナライザーBAS-2000I
I)で分析し、生成した[14C]ラフィノースを定量するこ
とでラフィノース合成活性を測定することができる。ま
た、前述のようにして調製した翻訳産物は、抗体を作製
する際の抗原として用いることもでき、このようにして
調製された抗体は、例えば植物などの生物から調製した
粗蛋白質抽出物中における本発明遺伝子の翻訳産物の検
出・定量に用いることもできる。
学的方法に準じて宿主の細胞に導入することにより形質
転換体を得ることができる。尚、宿主の細胞に導入する
ための形質転換方法に応じて、必要であれば、本発明発
現ＤＮＡを適当な選抜マーカー遺伝子を有するベクター
に挿入して使用するとよい。本発明発現ＤＮＡが挿入さ
れたベクターは、例えば、宿主が微生物の場合には、
「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd editio
n」 (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや
「Current Protocols In Molecular Biology」 (1987),
John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載さ
れる通常の手段により微生物に導入することができ、該
ベクターにより形質転換された微生物は抗生物質耐性や
栄養要求性等の選抜マーカーにより選抜される。選抜さ
れた微生物、例えば形質転換大腸菌などで誘導型のプロ
モーター、例えばtacプロモーターなどの下流に本発明
遺伝子を翻訳可能な形で結合してある場合には通常の培
養、誘導条件下で本発明遺伝子の翻訳産物を発現させ、
ペプチド、あるいは蛋白質として回収することが可能で
ある。このようにして調製される本発明遺伝子の翻訳産
物について、例えば、L．Lehle and W．Tanner，Eu
r．J．Biochem．，38，103頁-110頁（1973）に記載され
る方法によりラフィノース合成活性を測定することによ
り、該翻訳産物が「ショ糖分子中のD-グルコース残基の6
位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル
基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成
させる能力」を有するか否かを判定することができる。
具体的には、例えば、本発明遺伝子をpGEX-4T3(Pharmac
ia社)またはpGEX-4T3(Pharmacia社)にクローニングし、
本発明発現DNAを保有するプラスミドを得る。得られた
プラスミドを例えば大腸菌HB101株に導入し、形質転換
株を得る。得られた形質転換株の終夜培養液1mlを100ml
のLB培地に植菌し、37℃で約3時間培養した後、終濃度1
mMのIPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)を添加し、
さらに5時間培養する。該培養液から遠心分離により菌
体を回収し、得られた菌体に菌体重量の10倍量の100mM
Tris-HCl(pH7．4)、1mM EDTA、5mM DTT(Dithiothreito
l)、1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)、1mM b
enzamideを加え、懸濁する。この懸濁液を超音波破砕機
(Branson社)で超音波処理し、菌体を破砕する。得られ
た菌体破砕液を遠心分離し、可溶性蛋白質溶液を回収す
る。得られた蛋白質溶液を、終濃度で100mM Tris-HCl(p
H7．4)、5mM DTT(Dithiothreitol)、0．01% BSA、200μ
M sucrose、5mM ガラクチノール、31．7μM [14C]sucro
seとなる反応液に加える。該反応液を37℃で保温した
後、これに1．5倍容のエタノールを加えて攪拌する。不
溶物を遠心分離により除いた後、上清を例えばHPTLCセ
ルロース薄層クロマトプレート(Merck社HPTLC plates c
ellulose)にスポットし、n-ブタノール：ピリジン：
水：酢酸=60：40：30：3で展開する。展開したプレート
を乾燥した後、イメージングアナライザー(富士フィル
ム社FUJIXバイオ・イメージングアナライザーBAS-2000I
I)で分析し、生成した[14C]ラフィノースを定量するこ
とでラフィノース合成活性を測定することができる。ま
た、前述のようにして調製した翻訳産物は、抗体を作製
する際の抗原として用いることもでき、このようにして
調製された抗体は、例えば植物などの生物から調製した
粗蛋白質抽出物中における本発明遺伝子の翻訳産物の検
出・定量に用いることもできる。
【００１７】宿主が植物の場合には、本発明発現ＤＮＡ
が挿入されたベクターは、アグロバクテリウム感染方法
(特公平2-58917および特開昭60-70080)、プロトプラス
トへのエレクトロポレーション方法(特開昭60-251887お
よび特開平5-68575)、またはパーティクルガン方法(特
開平5-508316および特開昭63-258525)などの通常の手段
により植物細胞に導入することができる。該ベクターの
導入により形質転換された植物細胞は、カナマイシンま
たはハイグロマイシン等の抗生物質耐性などの選抜マー
カーにより選抜される。このようにして形質転換された
植物細胞から、例えば内宮著、「植物遺伝子操作マニュ
アル(トランスジェニック植物の作り方)」1990年、講談
社サイエンティフィック(ISBN4-06-153513-7)、27-55頁
に記載される通常の植物細胞培養方法により形質転換体
植物を再生させることができる。さらに、得られた形質
転換体植物から種子を得ることにより該形質転換体植物
の増殖を行うこともできる。また、得られた形質転換体
植物と非形質転換体植物とを交雑することで該形質転換
体の形質をもつ子孫植物を作製することもできる。
が挿入されたベクターは、アグロバクテリウム感染方法
(特公平2-58917および特開昭60-70080)、プロトプラス
トへのエレクトロポレーション方法(特開昭60-251887お
よび特開平5-68575)、またはパーティクルガン方法(特
開平5-508316および特開昭63-258525)などの通常の手段
により植物細胞に導入することができる。該ベクターの
導入により形質転換された植物細胞は、カナマイシンま
たはハイグロマイシン等の抗生物質耐性などの選抜マー
カーにより選抜される。このようにして形質転換された
植物細胞から、例えば内宮著、「植物遺伝子操作マニュ
アル(トランスジェニック植物の作り方)」1990年、講談
社サイエンティフィック(ISBN4-06-153513-7)、27-55頁
に記載される通常の植物細胞培養方法により形質転換体
植物を再生させることができる。さらに、得られた形質
転換体植物から種子を得ることにより該形質転換体植物
の増殖を行うこともできる。また、得られた形質転換体
植物と非形質転換体植物とを交雑することで該形質転換
体の形質をもつ子孫植物を作製することもできる。
【００１８】例えば、アブラナ科植物における遺伝子導
入には基本的に上記の一般的手法が適用できる。具体的
には例えば、J．Fry，A．Barnason，R．B．Horsch
著、”Transformation of Brassica napus with Agroba
cterium tumefaciens based vectors”、Plant Cell Re
ports (1987)，6，321頁-325頁に記載される遺伝子導入
法に準じて実施が可能である。例えば、アグロバクテリ
ウム法による遺伝子導入を行う場合、まず、先に述べた
本発明発現DNAをバイナリーベクターに挿入する。得ら
れたベクターは例えば、塩化カルシウム処理でcompeten
tな状態にしたAgrobacterium tumefaciens LBA4404株な
どに導入することができる。導入されたベクターが有す
る選抜マーカー遺伝子に応じた選抜方法により、例えば
選抜マーカー遺伝子がカナマイシンなどの抗生物質に対
する耐性を付与する遺伝子である場合は該抗生物質を含
む培地でベクター導入株を培養することにより、形質転
換体を選抜することができる。得られたアグロバクテリ
ウムの形質転換体は例えばLB培地などの液体培地で培養
し、増殖させることができる。このように調製したアグ
ロバクテリウムの形質転換体の培養液を用いて、以下に
記載されるような方法によりアブラナ科植物を形質転換
することができる。例えば、ナタネ、またはカラシナの
種子を例えば2% sucrose、0.7% agarを含む1/2MS培地に
無菌播種する。約1週間後、発芽した植物の子葉と葉柄
を無菌的にメスで切り取り、例えば3% sucrose、0.7% a
gar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3を含むM
S培地に移し、1日間培養する。このようにして前培養し
た子葉と葉柄とを、上記のアグロバクテリウムの培養液
の1000倍希釈液に移し、5分間放置する。この子葉と葉
柄を前培養と同じ培地に再び移し、3から4日間程度培養
する。培養した子葉と葉柄は例えば3% sucrose、4.5μM
BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、500mg/l cefotaxi
mを含むMS培地に移し、１日間振盪して除菌する。除菌
した子葉と葉柄は例えば3% sucrose、0.7% agar、4.5μ
M BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、100mg/l cefotax
im、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移し、3から4
週間培養する。次に子葉と葉柄を例えば3% sucrose、0.
7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、100mg/l cefotax
im、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移し、培養す
る。この培地での培養を、3から4週間毎に植え継ぎしな
がら継続する。シュートが再生してきたら、シュートを
例えば3% sucrose、0.7% agar、20mg/l カナマイシンを
含むMS培地に植え継ぎ、3から4週間培養する。植物体が
発根したら、例えばバーミキュライト:ピートモス=1:1
に移し、21から22℃で12時間:12時間=昼/夜の条件で培
養することにより馴化する。植物体の成長に伴い、適宜
培養土に移して栽培する。再生した植物体の葉から上記
の方法に従ってゲノムDNAを抽出し、本発明発現DNAの部
分塩基配列を有するプライマーを用いたPCRを行なうこ
とにより、本発明遺伝子の植物体ゲノムへの挿入を確認
することができる。
入には基本的に上記の一般的手法が適用できる。具体的
には例えば、J．Fry，A．Barnason，R．B．Horsch
著、”Transformation of Brassica napus with Agroba
cterium tumefaciens based vectors”、Plant Cell Re
ports (1987)，6，321頁-325頁に記載される遺伝子導入
法に準じて実施が可能である。例えば、アグロバクテリ
ウム法による遺伝子導入を行う場合、まず、先に述べた
本発明発現DNAをバイナリーベクターに挿入する。得ら
れたベクターは例えば、塩化カルシウム処理でcompeten
tな状態にしたAgrobacterium tumefaciens LBA4404株な
どに導入することができる。導入されたベクターが有す
る選抜マーカー遺伝子に応じた選抜方法により、例えば
選抜マーカー遺伝子がカナマイシンなどの抗生物質に対
する耐性を付与する遺伝子である場合は該抗生物質を含
む培地でベクター導入株を培養することにより、形質転
換体を選抜することができる。得られたアグロバクテリ
ウムの形質転換体は例えばLB培地などの液体培地で培養
し、増殖させることができる。このように調製したアグ
ロバクテリウムの形質転換体の培養液を用いて、以下に
記載されるような方法によりアブラナ科植物を形質転換
することができる。例えば、ナタネ、またはカラシナの
種子を例えば2% sucrose、0.7% agarを含む1/2MS培地に
無菌播種する。約1週間後、発芽した植物の子葉と葉柄
を無菌的にメスで切り取り、例えば3% sucrose、0.7% a
gar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3を含むM
S培地に移し、1日間培養する。このようにして前培養し
た子葉と葉柄とを、上記のアグロバクテリウムの培養液
の1000倍希釈液に移し、5分間放置する。この子葉と葉
柄を前培養と同じ培地に再び移し、3から4日間程度培養
する。培養した子葉と葉柄は例えば3% sucrose、4.5μM
BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、500mg/l cefotaxi
mを含むMS培地に移し、１日間振盪して除菌する。除菌
した子葉と葉柄は例えば3% sucrose、0.7% agar、4.5μ
M BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、100mg/l cefotax
im、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移し、3から4
週間培養する。次に子葉と葉柄を例えば3% sucrose、0.
7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、100mg/l cefotax
im、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移し、培養す
る。この培地での培養を、3から4週間毎に植え継ぎしな
がら継続する。シュートが再生してきたら、シュートを
例えば3% sucrose、0.7% agar、20mg/l カナマイシンを
含むMS培地に植え継ぎ、3から4週間培養する。植物体が
発根したら、例えばバーミキュライト:ピートモス=1:1
に移し、21から22℃で12時間:12時間=昼/夜の条件で培
養することにより馴化する。植物体の成長に伴い、適宜
培養土に移して栽培する。再生した植物体の葉から上記
の方法に従ってゲノムDNAを抽出し、本発明発現DNAの部
分塩基配列を有するプライマーを用いたPCRを行なうこ
とにより、本発明遺伝子の植物体ゲノムへの挿入を確認
することができる。
【００１９】本発明遺伝子を上記のように植物、例えば
アブラナ科植物に導入し発現させることにより、植物に
おけるラフィノース合成酵素の発現量や活性を変化させ
ることができ、該植物のラフィノース類オリゴ糖含量が
制御され得る。本発明遺伝子は、遺伝子の相同性に基づ
いてアブラナ科植物のラフィノース合成酵素の発現量や
活性を変化させる技術、例えば相同組換えやアンチセン
ス技術、コサプレッション等の技術において有用であ
る。
アブラナ科植物に導入し発現させることにより、植物に
おけるラフィノース合成酵素の発現量や活性を変化させ
ることができ、該植物のラフィノース類オリゴ糖含量が
制御され得る。本発明遺伝子は、遺伝子の相同性に基づ
いてアブラナ科植物のラフィノース合成酵素の発現量や
活性を変化させる技術、例えば相同組換えやアンチセン
ス技術、コサプレッション等の技術において有用であ
る。
【００２０】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるもの
ではない。
明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるもの
ではない。
【００２１】実施例1 （cDNAの作成） カラシナ(Brassica juncea)の葉約2gを液体窒素で凍結
し、乳鉢で粉砕した。Isogen(ニッポンジーン社)を20ml
加え、さらに良くすりつぶした。該破砕物を遠心管に移
し、4mlのクロロホルムを加え、ボルテックスで撹拌し
た後、これを4℃で6，500ｘｇ、10分間遠心分離し、水
層を回収した。回収された水層に10mlのイソプロパノー
ルを加えて撹拌した後、4℃にて6，500ｘｇ 10分間遠心
分離した。得られた沈殿を10mlの70%エタノールで洗浄
した後、これを180μlのDEPC-処理済み滅菌水で溶解し
た。該溶解物を55℃で5分間おいた後、該溶解物に10μl
の5M NaClを加えた。得られた溶液はBIOMAG mRNA PURIF
ICATION KIT(PerSeptive Biosystems社:Catalog No．8-
MB4003K)を用いて精製した。得られたmRNA溶液に3M酢酸
ナトリウムとエタノールを加え、RNAをエタノール沈澱
し、これを回収した。回収されたRNAを70%エタノールで
2回洗浄し、これを20μlの滅菌水に溶解し、cDNA合成に
用いた。得られたRNAは260nmの吸光度を測定し、定量し
た。cDNA合成には、Clontech社のSMART PCR cDNA Synth
esis Kitを用い、すべての操作はキットに添付のプロト
コールに従った。ナタネWestar(Brassica napus)の未熟
種子からも上記と同様にしてmRNAを精製し、cDNA合成を
行った。
し、乳鉢で粉砕した。Isogen(ニッポンジーン社)を20ml
加え、さらに良くすりつぶした。該破砕物を遠心管に移
し、4mlのクロロホルムを加え、ボルテックスで撹拌し
た後、これを4℃で6，500ｘｇ、10分間遠心分離し、水
層を回収した。回収された水層に10mlのイソプロパノー
ルを加えて撹拌した後、4℃にて6，500ｘｇ 10分間遠心
分離した。得られた沈殿を10mlの70%エタノールで洗浄
した後、これを180μlのDEPC-処理済み滅菌水で溶解し
た。該溶解物を55℃で5分間おいた後、該溶解物に10μl
の5M NaClを加えた。得られた溶液はBIOMAG mRNA PURIF
ICATION KIT(PerSeptive Biosystems社:Catalog No．8-
MB4003K)を用いて精製した。得られたmRNA溶液に3M酢酸
ナトリウムとエタノールを加え、RNAをエタノール沈澱
し、これを回収した。回収されたRNAを70%エタノールで
2回洗浄し、これを20μlの滅菌水に溶解し、cDNA合成に
用いた。得られたRNAは260nmの吸光度を測定し、定量し
た。cDNA合成には、Clontech社のSMART PCR cDNA Synth
esis Kitを用い、すべての操作はキットに添付のプロト
コールに従った。ナタネWestar(Brassica napus)の未熟
種子からも上記と同様にしてmRNAを精製し、cDNA合成を
行った。
【００２２】実施例2 （ラフィノース合成酵素遺伝子
の単離とその塩基配列の解析） 下記リスト２で示される塩基配列からなるDNAプライマ
ーを合成した。PCRは、Clontech社のAdvantage KlenTaq
cDNA Kitを用いてパーキンエルマー社のGene Amp PCR
Systems 2400とDNA Thermal Cycler Model 480で行なっ
た。上記プライマーを用い、実施例1により得られたカ
ラシナのcDNAを用いてPCR反応を行った。反応は94℃1分
間、次いで50℃3分間、さらに72℃3分間の保温を１サイ
クルとして、この反応を40サイクル行った。反応産物を
アガロースゲル電気泳動で分析した。その結果、約1.2k
bのバンドの増幅が検出された。増幅されたDNAをTAクロ
ーニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パー
キンエルマー社のABI PRISM Dye Terminater Cycle Seq
uencing Ready Reaction Kitを用いてシークエンス反応
を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで塩基配列の
解析を行った。その結果得られた塩基配列をもとにリス
ト３で示される塩基配列からなる合成DNAプライマーを
作成し、実施例1で得られたカラシナ(Brassica juncea)
とナタネWestar(Brassica napus)のcDNAを用いて上記と
同様のPCRを行った。その結果、最終的にカラシナ(Bras
sica juncea)のcDNAから配列番号2の塩基番号749〜1215
で示される塩基配列が、ナタネWestar(Brassica napus)
のcDNAから配列番号4の塩基番号1〜467で示される塩基
配列が明らかになった。
の単離とその塩基配列の解析） 下記リスト２で示される塩基配列からなるDNAプライマ
ーを合成した。PCRは、Clontech社のAdvantage KlenTaq
cDNA Kitを用いてパーキンエルマー社のGene Amp PCR
Systems 2400とDNA Thermal Cycler Model 480で行なっ
た。上記プライマーを用い、実施例1により得られたカ
ラシナのcDNAを用いてPCR反応を行った。反応は94℃1分
間、次いで50℃3分間、さらに72℃3分間の保温を１サイ
クルとして、この反応を40サイクル行った。反応産物を
アガロースゲル電気泳動で分析した。その結果、約1.2k
bのバンドの増幅が検出された。増幅されたDNAをTAクロ
ーニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パー
キンエルマー社のABI PRISM Dye Terminater Cycle Seq
uencing Ready Reaction Kitを用いてシークエンス反応
を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで塩基配列の
解析を行った。その結果得られた塩基配列をもとにリス
ト３で示される塩基配列からなる合成DNAプライマーを
作成し、実施例1で得られたカラシナ(Brassica juncea)
とナタネWestar(Brassica napus)のcDNAを用いて上記と
同様のPCRを行った。その結果、最終的にカラシナ(Bras
sica juncea)のcDNAから配列番号2の塩基番号749〜1215
で示される塩基配列が、ナタネWestar(Brassica napus)
のcDNAから配列番号4の塩基番号1〜467で示される塩基
配列が明らかになった。
【００２３】（リスト２） #1 35mer CGATTIAAIG TITGGTGGAC IACICAITGG GTIGG #10RV 38mer CAITGIACCA TITGICAICC ITGIA(AG)CCAI TAIGTICC
【００２４】（リスト３） primer-1 30mer GTTAGGGTTC ATATGAACAC CTTCAAGCTC primer-2RV 26mer CAACGGCGAG ATCTTGCATC GTCAAC
【００２５】実施例3 （ラフィノース合成酵素遺伝子
の全長塩基配列の解析） 実施例2で得られた塩基配列に基づき、下記リスト４で
示される塩基配列からなるDNAプライマーを合成した。
実施例1と同様の操作によりカラシナ(Brassicajuncea)
とナタネWestar(Brassica napus)の葉から得られたcDNA
を、リガーゼによりClontech社のMarathon Kitに含まれ
るアダプターと結合した。このようにして調製したアダ
プターが結合されたcDNAを用いて、リスト４に示される
プライマーによるPCRを行った。5’-末端の塩基配列の
解析には、B-2RV、B-3RV、B-4RV primerを、3’-末端の
塩基配列の解析にはB-1、B-8、B-7、B-6 primerを用い
た。この塩基配列の解析はClontech社のMarathon Kitの
プロトコールに準じて行った。その結果、カラシナ(Bra
ssica juncea)からは配列番号2で示される配列が、ナタ
ネWestar(Brassica napus)からは配列番号4で示される
配列が明らかとなった。
の全長塩基配列の解析） 実施例2で得られた塩基配列に基づき、下記リスト４で
示される塩基配列からなるDNAプライマーを合成した。
実施例1と同様の操作によりカラシナ(Brassicajuncea)
とナタネWestar(Brassica napus)の葉から得られたcDNA
を、リガーゼによりClontech社のMarathon Kitに含まれ
るアダプターと結合した。このようにして調製したアダ
プターが結合されたcDNAを用いて、リスト４に示される
プライマーによるPCRを行った。5’-末端の塩基配列の
解析には、B-2RV、B-3RV、B-4RV primerを、3’-末端の
塩基配列の解析にはB-1、B-8、B-7、B-6 primerを用い
た。この塩基配列の解析はClontech社のMarathon Kitの
プロトコールに準じて行った。その結果、カラシナ(Bra
ssica juncea)からは配列番号2で示される配列が、ナタ
ネWestar(Brassica napus)からは配列番号4で示される
配列が明らかとなった。
【００２６】（リスト４） B-2RV 30mer GGATTCGACA CAAACCGCCA CGTCATCGTC B-3RV 27mer CCACGTGCAC CACCCGAACT TATCGAC B-4RV 30mer AACATCGATA CCATCGGAGT CATGTCCAAT B-1 30mer GTTAGGGTTC ATATGAACAC CTTCAAGCTC B-8 29mer TCTACGTCTG GCACGCGCTT TGCGGCTAC B-7 31mer GTTGACGTCA TCCACATATT GGAGATGTTG T B-6 29mer GTTATCGCTA GCATGGAGCA CTGTAATGA
【００２７】実施例4 （カラシナ由来のラフィノース
合成酵素遺伝子の植物での発現ベクターの構築） 実施例3で得られたカラシナ由来のラフィノース合成酵
素遺伝子の塩基配列に基づいてリスト５で示される塩基
配列のDNAプライマーを合成した。PCRは実施例2と同様
にカラシナのｃＤＮＡを用いて行った。増幅されたＤＮ
ＡをSacIで切断し、同じくSacIで切断したベクターpBI1
21(-)と前記ＤＮＡとを、Ligation Kit(宝酒造社)を用
いてライゲーションした。ベクターpBI121(-)は、プラ
スミドpBI121(Clontech社)をBamHIとSacIとで切断し、
リスト６で示される塩基配列からなるリンカーとライゲ
ーションして作製した。得られたベクターは、制限酵素
の切断地図と、リスト７で示される塩基配列からなるプ
ライマーを用いたPCRにより分析し、ラフィノース合成
酵素遺伝子の挿入方向について確認した。カラシナ由来
のラフィノース合成酵素遺伝子のオープンリーディング
フレームが、ベクターの35Sプロモーターに対して転写
可能な方向に挿入されたベクターをBjRS-Sac(+)-121と
名づけ、逆方向に挿入されたベクターをBjRS-Sac(-)-12
1と名づけた。
合成酵素遺伝子の植物での発現ベクターの構築） 実施例3で得られたカラシナ由来のラフィノース合成酵
素遺伝子の塩基配列に基づいてリスト５で示される塩基
配列のDNAプライマーを合成した。PCRは実施例2と同様
にカラシナのｃＤＮＡを用いて行った。増幅されたＤＮ
ＡをSacIで切断し、同じくSacIで切断したベクターpBI1
21(-)と前記ＤＮＡとを、Ligation Kit(宝酒造社)を用
いてライゲーションした。ベクターpBI121(-)は、プラ
スミドpBI121(Clontech社)をBamHIとSacIとで切断し、
リスト６で示される塩基配列からなるリンカーとライゲ
ーションして作製した。得られたベクターは、制限酵素
の切断地図と、リスト７で示される塩基配列からなるプ
ライマーを用いたPCRにより分析し、ラフィノース合成
酵素遺伝子の挿入方向について確認した。カラシナ由来
のラフィノース合成酵素遺伝子のオープンリーディング
フレームが、ベクターの35Sプロモーターに対して転写
可能な方向に挿入されたベクターをBjRS-Sac(+)-121と
名づけ、逆方向に挿入されたベクターをBjRS-Sac(-)-12
1と名づけた。
【００２８】（リスト５） SacI-BjN 35mer AACGAGCTCA ATCCAAAATC TCATCAAATA ATCGC SacI-BjintRV 25mer ACAATAGTTG AGGGCGGAAG AGTAG
【００２９】（リスト６） BamSac-(+)linker 25mer GATCGAGCTCGTGTCGGATCCAGCT BamSac-(-)linker 17mer GGATCCGACACGAGCTC
【００３０】（リスト７） 35S-3 30mer CCTCCTCGGA TTCCATTGCC CAGCTATCTG B-2RV 30mer GGATTCGACA CAAACCGCCA CGTCATCGTC B-8 29mer TCTACGTCTG GCACGCGCTT TGCGGCTAC
【００３１】実施例5 （カラシナラフィノース合成酵
素遺伝子によるカラシナの形質転換） 実施例4で作製したベクターBjRS-Sac(+)-121とBjRS-Sac
(-)-121を用いてアグロバクテリウム感染方法によりカ
ラシナ(Brassica juncia)の形質転換を行った。実施例4
で作製した2種類のプラスミドBjRS-Sac(+)-121とBjRS-S
ac(-)-121各々によって、あらかじめ塩化カルシウム処
理でcompetentな状態にしたAgrobacterium tumefaciens
(LBA4404株:リファンピシン、ストレプトマイシン耐性)
を形質転換した。形質転換体は、導入されたプラスミド
が有するカナマイシン耐性遺伝子(neomycin phosphotra
nsferase:NPTII)により付与されるカナマイシンに対す
る耐性の形質を利用してリファンピシン50μl/ml、カナ
マイシン25μl/mlを含むLB培地で選択することにより得
られた。得られたアグロバクテリウムの形質転換体(Agr
obacterium tumefaciens LBA4404株:RifR，SmR)をリ
ファンピシン50μl/ml、カナマイシン25μl/mlを含むLB
培地で28℃で一昼夜培養し、得られた菌液を以下に記載
される方法によるカラシナの形質転換に用いた。カラシ
ナ種子を2% sucrose、0.7% agarを含む1/2MS培地に無菌
播種した。1週間後、発芽した植物の子葉と葉柄をメス
で切り取り、3% sucrose、0.7% agar、4.5μM BA、0.05
μM 2.4-D、3.3μM AgNO3を含むMS培地に移し、1日間前
培養した。このように前培養した子葉と葉柄を、上記の
アグロバクテリウムの培養液の1000倍希釈液に移し、5
分間放置した。この子葉と葉柄を前培養と同じ培地に再
び移し、3から4日間培養した。培養した子葉と葉柄は3%
sucrose、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、
500mg/l cefotaximを含むMS培地に移し、１日間振盪し
ながら除菌した。除菌した子葉と葉柄は3% sucrose、0.
7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、1
00mg/l cefotaxim、20mg/l カナマイシンを含むMS培地
に移し、3から4週間培養した。次に子葉と葉柄を3% suc
rose、0.7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、100mg/l
cefotaxim、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移
し、培養した。3から4週間毎に植え継ぎしながらこの培
地での培養を継続した。シュートが再生してきたら、シ
ュートを3% sucrose、0.7% agar、20mg/l カナマイシン
を含むMS培地に植え継ぎ、3から4週間培養する。植物体
が発根したらこれをバーミキュライト:ピートモス=1:1
に移し、21から22℃で12時間:12時間=昼/夜の条件で培
養する。植物体の成長に伴い、培養土で栽培する。
素遺伝子によるカラシナの形質転換） 実施例4で作製したベクターBjRS-Sac(+)-121とBjRS-Sac
(-)-121を用いてアグロバクテリウム感染方法によりカ
ラシナ(Brassica juncia)の形質転換を行った。実施例4
で作製した2種類のプラスミドBjRS-Sac(+)-121とBjRS-S
ac(-)-121各々によって、あらかじめ塩化カルシウム処
理でcompetentな状態にしたAgrobacterium tumefaciens
(LBA4404株:リファンピシン、ストレプトマイシン耐性)
を形質転換した。形質転換体は、導入されたプラスミド
が有するカナマイシン耐性遺伝子(neomycin phosphotra
nsferase:NPTII)により付与されるカナマイシンに対す
る耐性の形質を利用してリファンピシン50μl/ml、カナ
マイシン25μl/mlを含むLB培地で選択することにより得
られた。得られたアグロバクテリウムの形質転換体(Agr
obacterium tumefaciens LBA4404株:RifR，SmR)をリ
ファンピシン50μl/ml、カナマイシン25μl/mlを含むLB
培地で28℃で一昼夜培養し、得られた菌液を以下に記載
される方法によるカラシナの形質転換に用いた。カラシ
ナ種子を2% sucrose、0.7% agarを含む1/2MS培地に無菌
播種した。1週間後、発芽した植物の子葉と葉柄をメス
で切り取り、3% sucrose、0.7% agar、4.5μM BA、0.05
μM 2.4-D、3.3μM AgNO3を含むMS培地に移し、1日間前
培養した。このように前培養した子葉と葉柄を、上記の
アグロバクテリウムの培養液の1000倍希釈液に移し、5
分間放置した。この子葉と葉柄を前培養と同じ培地に再
び移し、3から4日間培養した。培養した子葉と葉柄は3%
sucrose、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、
500mg/l cefotaximを含むMS培地に移し、１日間振盪し
ながら除菌した。除菌した子葉と葉柄は3% sucrose、0.
7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO3、1
00mg/l cefotaxim、20mg/l カナマイシンを含むMS培地
に移し、3から4週間培養した。次に子葉と葉柄を3% suc
rose、0.7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、100mg/l
cefotaxim、20mg/l カナマイシンを含むMS培地に移
し、培養した。3から4週間毎に植え継ぎしながらこの培
地での培養を継続した。シュートが再生してきたら、シ
ュートを3% sucrose、0.7% agar、20mg/l カナマイシン
を含むMS培地に植え継ぎ、3から4週間培養する。植物体
が発根したらこれをバーミキュライト:ピートモス=1:1
に移し、21から22℃で12時間:12時間=昼/夜の条件で培
養する。植物体の成長に伴い、培養土で栽培する。
【００３２】（配列の簡単な説明） １．配列番号1：配列番号1で示される配列は、カラシナ
より取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードさ
れるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示
す。 ２．配列番号2：配列番号2で示される配列は、カラシナ
より取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの塩
基配列を示す。 ３．配列番号3：配列番号3で示される配列は、ナタネよ
り取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされ
るラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ４．配列番号4：配列番号4で示される配列は、ナタネよ
り取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの塩基
配列を示す。 ５．リスト１：リスト１に示される配列のうち、プライ
マー１と２は、ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基
配列を有するDNAの増幅に用いられるプライマーの塩基
配列の一例を示す。プライマー1はカラシナ及びナタネ
由来ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有す
るDNAを増幅するためのセンスプライマー、プライマー2
はアンチセンスプライマーである。目的に応じて適当に
これらの塩基配列の5'-末端に適当な制限酵素の認識配
列を加えることができる。プライマー3と4は、カラシナ
のラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの増幅に用いられ
るプライマーの塩基配列の一例を示す。プライマー3と4
はいずれもラフィノース合成酵素遺伝子の非翻訳領域の
塩基配列に基づいている。プライマー3はカラシナ由来
ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの5'-末端非翻訳領
域に相当するセンスプライマー、プライマー4は3'-末端
非翻訳領域に相当するアンチセンスプライマーである。
プライマー5と6はカラシナのラフィノース合成酵素遺伝
子のcDNAのラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列
をコードしているオープンリーディングフレームの増幅
に用いられるプライマーの塩基配列の一例を示す。プラ
イマー5は前記オープンリーディングフレームの5'-末端
領域に相当するセンスプライマー、プライマー6は3'-末
端領域に相当するアンチセンスプライマーである。目的
に応じて適当にこれらの塩基配列の5'-末端に適当な制
限酵素の認識配列を加えることができる。 ６．リスト２：リスト２に示される配列は、カラシナの
ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列の解析の際
に用いたプライマーの塩基配列を示す。Iはイノシンを
示す。また、括弧で括られた塩基はこれらの混合物をDN
A合成の際に用いたことを示す。なお、プライマー番号
の後に記載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの
配列であることを示す。 ７．リスト３：リスト３に示される配列は、カラシナの
ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列に基づいて
合成されたプライマーである。プライマー番号の後に記
載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの配列であ
ることを示す。 ８．リスト４：リスト４に示される配列は、カラシナと
ナタネのラフィノース合成酵素遺伝子の塩基配列の解析
に用いられたプライマーである。プライマー番号の後に
記載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの配列で
あることを示す。 ９．リスト５：リスト５に示される配列はカラシナ由来
ラフィノース合成酵素遺伝子の5’上流部分の増幅に用
いられたプライマーである。SacI-BjNは配列番号２にお
ける塩基番号4から29で示される塩基配列にSacI認識配
列を付加した塩基配列からなるプライマーである。SacI
-BjintRVは配列番号２における塩基番号1164から1188に
相当する塩基配列からなるアンチセンスプライマーであ
る。 １０．リスト６：リスト６に示される配列は、カラシナ
ｃＤＮＡに付加したアダプターの塩基配列を示す。これ
らの合成DNAは相補鎖のため、混合することで二本鎖Ｄ
ＮＡとなる。このアダプターは両端に制限酵素BamHIとS
acIの切断部位の付着末端を有し、二本鎖ＤＮＡ領域にB
amHIとSacIの認識配列を持つ。 １１．リスト７：リスト７に示される配列は、ベクター
にクローニングしたカラシナ由来ラフィノース合成酵素
遺伝子の挿入方向の確認に用いたプライマーである。35
S-3は35Sプロモーターに対するセンスのプライマーであ
る。B-2RVは配列番号２の塩基番号593から622までに示
される塩基配列からなるアンチセンスプライマー、B-8
は配列番号２の塩基番号1110から1138までに示される塩
基配列からなるセンスプライマーである。
より取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードさ
れるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示
す。 ２．配列番号2：配列番号2で示される配列は、カラシナ
より取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの塩
基配列を示す。 ３．配列番号3：配列番号3で示される配列は、ナタネよ
り取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされ
るラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ４．配列番号4：配列番号4で示される配列は、ナタネよ
り取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの塩基
配列を示す。 ５．リスト１：リスト１に示される配列のうち、プライ
マー１と２は、ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基
配列を有するDNAの増幅に用いられるプライマーの塩基
配列の一例を示す。プライマー1はカラシナ及びナタネ
由来ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有す
るDNAを増幅するためのセンスプライマー、プライマー2
はアンチセンスプライマーである。目的に応じて適当に
これらの塩基配列の5'-末端に適当な制限酵素の認識配
列を加えることができる。プライマー3と4は、カラシナ
のラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの増幅に用いられ
るプライマーの塩基配列の一例を示す。プライマー3と4
はいずれもラフィノース合成酵素遺伝子の非翻訳領域の
塩基配列に基づいている。プライマー3はカラシナ由来
ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAの5'-末端非翻訳領
域に相当するセンスプライマー、プライマー4は3'-末端
非翻訳領域に相当するアンチセンスプライマーである。
プライマー5と6はカラシナのラフィノース合成酵素遺伝
子のcDNAのラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列
をコードしているオープンリーディングフレームの増幅
に用いられるプライマーの塩基配列の一例を示す。プラ
イマー5は前記オープンリーディングフレームの5'-末端
領域に相当するセンスプライマー、プライマー6は3'-末
端領域に相当するアンチセンスプライマーである。目的
に応じて適当にこれらの塩基配列の5'-末端に適当な制
限酵素の認識配列を加えることができる。 ６．リスト２：リスト２に示される配列は、カラシナの
ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列の解析の際
に用いたプライマーの塩基配列を示す。Iはイノシンを
示す。また、括弧で括られた塩基はこれらの混合物をDN
A合成の際に用いたことを示す。なお、プライマー番号
の後に記載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの
配列であることを示す。 ７．リスト３：リスト３に示される配列は、カラシナの
ラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列に基づいて
合成されたプライマーである。プライマー番号の後に記
載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの配列であ
ることを示す。 ８．リスト４：リスト４に示される配列は、カラシナと
ナタネのラフィノース合成酵素遺伝子の塩基配列の解析
に用いられたプライマーである。プライマー番号の後に
記載の「RV」はこのプライマーがアンチセンスの配列で
あることを示す。 ９．リスト５：リスト５に示される配列はカラシナ由来
ラフィノース合成酵素遺伝子の5’上流部分の増幅に用
いられたプライマーである。SacI-BjNは配列番号２にお
ける塩基番号4から29で示される塩基配列にSacI認識配
列を付加した塩基配列からなるプライマーである。SacI
-BjintRVは配列番号２における塩基番号1164から1188に
相当する塩基配列からなるアンチセンスプライマーであ
る。 １０．リスト６：リスト６に示される配列は、カラシナ
ｃＤＮＡに付加したアダプターの塩基配列を示す。これ
らの合成DNAは相補鎖のため、混合することで二本鎖Ｄ
ＮＡとなる。このアダプターは両端に制限酵素BamHIとS
acIの切断部位の付着末端を有し、二本鎖ＤＮＡ領域にB
amHIとSacIの認識配列を持つ。 １１．リスト７：リスト７に示される配列は、ベクター
にクローニングしたカラシナ由来ラフィノース合成酵素
遺伝子の挿入方向の確認に用いたプライマーである。35
S-3は35Sプロモーターに対するセンスのプライマーであ
る。B-2RVは配列番号２の塩基番号593から622までに示
される塩基配列からなるアンチセンスプライマー、B-8
は配列番号２の塩基番号1110から1138までに示される塩
基配列からなるセンスプライマーである。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、ラフィノース合成酵素の
植物における発現量や活性を変化させる技術に利用可能
なラフィノース合成酵素遺伝子等を提供することが可能
となる。
植物における発現量や活性を変化させる技術に利用可能
なラフィノース合成酵素遺伝子等を提供することが可能
となる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Raffinose synthetase genes <130> P149843 <150> JP 10/120551 <151> 1998-4-30 <160> 4 <210> 1 <211> 777 <212> PRT <213> Brassica juncea <400> 1 Met Ala Pro Pro Ser Val Ile Lys Ser Asp Ala Ala Val Asn Gly Ile 5 10 15 Asp Leu Ser Gly Lys Pro Leu Phe Arg Leu Glu Gly Ser Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Asn Gly His Val Val Leu Thr Asp Val Pro Val Asn Val Thr Val 35 40 45 Thr Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Asp Lys Asp Gly Glu Pro Val Asp Ala 50 55 60 Ser Ala Gly Ser Phe Ile Gly Phe Asn Leu Asp Gly Glu Pro Arg Ser 65 70 75 80 Arg His Val Ala Ser Ile Gly Lys Leu Arg Asp Ile Arg Phe Met Ser 85 90 95 Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Ser Lys 100 105 110 Gly Ser Asp Ile Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ile Ile Leu Glu Asn Ser 115 120 125 Gly Ser Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Glu Gly Ser 130 135 140 Phe Arg Ser Ser Phe Gln Pro Gly Glu Asp Asp Asp Val Ala Val Cys 145 150 155 160 Val Glu Ser Gly Ser Thr Gln Val Thr Gly Ser Glu Phe Arg Gln Val 165 170 175 Val Tyr Val His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Lys Leu Val Lys Asp Ala 180 185 190 Met Lys Val Val Arg Val His Met Asn Thr Phe Lys Leu Leu Glu Glu 195 200 205 Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp 210 215 220 Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys Gly Val Lys 225 230 235 240 Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp 245 250 255 Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile Asp Val Glu Gly 260 265 270 Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Leu Lys 275 280 285 Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro Lys Asp Lys 290 295 300 Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu Phe 305 310 315 320 Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp 325 330 335 Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser Thr Ile Val 340 345 350 Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln Asp Leu Ala 355 360 365 Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser Pro Asp Met 370 375 380 Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln Asn Val Gly 385 390 395 400 Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu Met Leu Cys 405 410 415 Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr Phe Lys Ala 420 425 430 Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Gly Val Ile Ala 435 440 445 Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr Glu Ala Ile 450 455 460 Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp Pro Ser Gly 465 470 475 480 Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys 485 490 495 Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp Trp Asp 500 505 510 Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg 515 520 525 Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val Gly Gln His 530 535 540 Asp Phe Asp Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu 545 550 555 560 Arg Cys Glu His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu Phe Glu Asp 565 570 575 Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys 580 585 590 Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys 595 600 605 Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val Asn Thr Leu 610 615 620 Thr Ala Thr Thr Asn Pro Lys Asp Val Glu Trp Asn Ser Gly Asn Asn 625 630 635 640 Pro Ile Ser Val Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe Leu Ser Gln 645 650 655 Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Pro Asn Asp Asp Leu Glu Ile Thr 660 665 670 Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro Val Val Thr 675 680 685 Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met 690 695 700 Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His Glu Glu Ser 705 710 715 720 Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val Tyr Ala Ser 725 730 735 Arg Lys Pro Ala Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Val Val Glu Phe Gly 740 745 750 Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser Ala Pro Glu 755 760 765 Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Glu Phe 770 775 777 <210> 2 <211> 2690 <212> DNA <213> Brassica juncea <220> <221> CDS <222> (134)...(2467) <400> 2 accaatccaa aatctcatca aataatcgca attaggggaa gtttacaaga ttcatcatct 60 ccgttactat ataactacgc tcttcttcct tcgcctaatc caacttaacc taaaaaccac 120 tctatcagcg aaa atg gct cca ccg agc gta att aaa tcc gat gct gca 169 Met Ala Pro Pro Ser Val Ile Lys Ser Asp Ala Ala 5 10 gtc aac ggc att gac ctc tcc gga aag ccg ctt ttc cgg cta gag ggt 217 Val Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Lys Pro Leu Phe Arg Leu Glu Gly 15 20 25 tcc gat ctc cta gcc aat ggt cac gtt gtc tta acc gat gta ccg gtt 265 Ser Asp Leu Leu Ala Asn Gly His Val Val Leu Thr Asp Val Pro Val 30 35 40 aac gtg act gtc act gct tca cct tac cta gct gac aaa gac gga gaa 313 Asn Val Thr Val Thr Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Asp Lys Asp Gly Glu 45 50 55 60 ccg gtt gac gcc tcc gct ggt tca ttc atc ggg ttt aat ctc gac ggt 361 Pro Val Asp Ala Ser Ala Gly Ser Phe Ile Gly Phe Asn Leu Asp Gly 65 70 75 gag cca cga agc cgc cac gtg gcg tcc atc ggt aaa ctc agg gat att 409 Glu Pro Arg Ser Arg His Val Ala Ser Ile Gly Lys Leu Arg Asp Ile 80 85 90 cga ttc atg agc ata ttc cgt ttc aag gtt tgg tgg act act cac tgg 457 Arg Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp 95 100 105 gtc ggt tcc aaa gga tcc gac atc gag aac gag acc cag atc atc atc 505 Val Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ile Glu Asn Glu Thr Gln Ile Ile Ile 110 115 120 ctc gag aac tcc ggg tcg ggt cgt cct tat gtt ctt ctt ctg ccg ctt 553 Leu Glu Asn Ser Gly Ser Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Leu 125 130 135 140 ctt gaa ggc tct ttc cgt tca tcc ttt cag cct ggg gaa gac gat gac 601 Leu Glu Gly Ser Phe Arg Ser Ser Phe Gln Pro Gly Glu Asp Asp Asp 145 150 155 gtg gcg gtt tgt gtc gaa tcc ggg tcg acc cag gtg acc ggg tcg gag 649 Val Ala Val Cys Val Glu Ser Gly Ser Thr Gln Val Thr Gly Ser Glu 160 165 170 ttt cgt caa gtt gtg tat gtt cac gcc gga gac gat ccg ttc aag ctc 697 Phe Arg Gln Val Val Tyr Val His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Lys Leu 175 180 185 gtg aaa gac gcg atg aag gtg gtt agg gtt cat atg aac acc ttc aag 745 Val Lys Asp Ala Met Lys Val Val Arg Val His Met Asn Thr Phe Lys 190 195 200 ctc ttg gaa gag aag acr ccg ccg gga atc gtc gat aag ttc ggg tgg 793 Leu Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp 205 210 215 220 tgc acg tgg gat gcg ttt tat ttg acg gtg aac cct gac gga gtt cat 841 Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His 225 230 235 aag ggt gtt aag tgt ctc gtc gac ggt ggt tgt ccg ccg gga ttg gtc 889 Lys Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val 240 245 250 cta atc gac gac ggt tgg caa tcg att gga cat gac tcc gat ggt atc 937 Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile 255 260 265 gat gtt gaa ggg atg agt tgt acc gtc gcc ggg gag caa atg cct tgc 985 Asp Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys 270 275 280 agg ctt ctg aaa ttt caa gag aac ttc aag ttc aga gac tac gtc tct 1033 Arg Leu Leu Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser 285 290 295 300 ccg aaa gac aaa aac gaa gtc ggg atg aaa gct ttc gtc aga gat ctg 1081 Pro Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu 305 310 315 aaa gaa gaa ttc tcc acc gtt gat tac atc tac gtc tgg cac gcg ctt 1129 Lys Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu 320 325 330 tgc ggc tac tgg ggt ggt ctt cgt ccc gga gct cct act ctt ccg ccc 1177 Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro 335 340 345 tca act att gtc cgg cca gag ctc tcg ccg ggg ctt aag ttg acg atg 1225 Ser Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met 350 355 360 caa gat ctc gcc gtt gat aag att gtc gat acc gga atc gga ttc gtc 1273 Gln Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val 365 370 375 380 tcg ccg gac atg gcg aat gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt 1321 Ser Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu 385 390 395 caa aac gtc ggt att gac ggc gtt aaa gtt gac gtc atc cac ata ttg 1369 Gln Asn Val Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu 400 405 410 gag atg ttg tgc gag aaa tat ggc ggg aga gta gac ttg gct aaa gct 1417 Glu Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala 415 420 425 tac ttc aag gcg tta act tcc tca gtg aat aag cat ttt gac ggt aac 1465 Tyr Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn 430 435 440 ggc gtt atc gct agc atg gag cac tgt aat gat ttc atg ttc ctt gga 1513 Gly Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly 445 450 455 460 acc gaa gcc atc tct cta ggt cgt gtc ggt gat gac ttt tgg tgc acg 1561 Thr Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr 465 470 475 gat cca tca ggc gac ata aac ggc aca tat tgg ctg caa gga tgc cac 1609 Asp Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His 480 485 490 atg gtc cac tgt gcc tac aac agt ctt tgg atg gga aat ttc atc cag 1657 Met Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln 495 500 505 cct gat tgg gac atg ttt cag tcc aca cat cct tgt gct gag ttc cat 1705 Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His 510 515 520 gct gct tct cgt gcc atc tcc ggt ggg ccc att tac atc agc gat tgt 1753 Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys 525 530 535 540 gtg ggc cag cac gat ttc gat ctc ttg aag cga ctc gtc ttg cct gac 1801 Val Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Lys Arg Leu Val Leu Pro Asp 545 550 555 ggt tcg att ttg agg tgt gag cac tat gca ctc cca act cgt gac cgt 1849 Gly Ser Ile Leu Arg Cys Glu His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg 560 565 570 ctc ttt gaa gac cct ctt cat gat ggc aaa acc atg ctc aag att tgg 1897 Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp 575 580 585 aac ttg aac aag tac act gga att att gga gca ttc aac tgc caa gga 1945 Asn Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly 590 595 600 gga gga tgg tgc aga gaa acc cga cgc aac caa tgc ttc tcc caa tgc 1993 Gly Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Cys 605 610 615 620 gtt aac acg tta acc gcc aca aca aat cct aag gac gtt gaa tgg aac 2041 Val Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Lys Asp Val Glu Trp Asn 625 630 635 agt ggg aac aac cca atc tcc gtt gaa aac gtt gaa gag ttt gct ttg 2089 Ser Gly Asn Asn Pro Ile Ser Val Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu 640 645 650 ttc ttg tct cag tct aag aag ctt gtg ttg tct gga cca aac gat gat 2137 Phe Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Pro Asn Asp Asp 655 660 665 ctc gag atc act ttg gag cct ttc aag ttt gag cta atc act gtc tca 2185 Leu Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser 670 675 680 cca gtt gtc act att gag ggt agt tcg gtt cag ttt gct cca atc gga 2233 Pro Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly 685 690 695 700 ttg gtt aac atg cta aac act agc ggt gca att cga tcc ttg gtg tat 2281 Leu Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr 705 710 715 cat gag gaa tcc gtt gag att gga gtt cgt ggt gct gga gag ttc agg 2329 His Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg 720 725 730 gtt tat gca tca agg aaa cct gcg agc tgc aaa att gat ggt gaa gtt 2377 Val Tyr Ala Ser Arg Lys Pro Ala Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Val 735 740 745 gtt gag ttt gga tac gaa gag tca atg gtg atg gtt caa gtg cct tgg 2425 Val Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp 750 755 760 tct gca ccc gag ggt ttg tct tct att aag tat gag ttt tag agtttccga 2476 Ser Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Glu Phe 765 770 775 aggtgcttat ttgtatcctt ctaaactcct taattatgag ctccgtgccg tttctttttc 2536 tatatggttt ctgagagtga acatctaata tttacccact agggtataat tattggcttt 2596 taagtgattt gtttttgaac tgtttttagt ggtgtaattt gtactgcccc tattattttt 2656 catatttatt tgtgaaagat aaaaaaaaaa aaaa 2690 <210> 3 <211> 577 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 3 Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys 5 10 15 Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys 20 25 30 Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu 35 40 45 Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile Asp 50 55 60 Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg 65 70 75 80 Leu Pro Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro 85 90 95 Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys 100 105 110 Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys 115 120 125 Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser 130 135 140 Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln 145 150 155 160 Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Ile Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser 165 170 175 Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln 180 185 190 Asn Val Gly Ile Asn Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu 195 200 205 Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr 210 215 220 Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Ala 225 230 235 240 Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr 245 250 255 Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp 260 265 270 Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met 275 280 285 Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro 290 295 300 Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala 305 310 315 320 Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val 325 330 335 Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Arg Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly 340 345 350 Ser Ile Leu Arg Cys Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu 355 360 365 Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn 370 375 380 Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly 385 390 395 400 Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asp Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val 405 410 415 Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Asn Asp Val Glu Trp Asn Ser 420 425 430 Gly Asn Asn Pro Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe 435 440 445 Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Gln Asn Asp Asp Leu 450 455 460 Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro 465 470 475 480 Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu 485 490 495 Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His 500 505 510 Glu Glu Ser Val Glu Ile Gly Val Arg Gly Ala Gly Glu Phe Arg Val 515 520 525 Tyr Ala Ser Lys Lys Pro Val Ser Cys Lys Ile Asp Gly Glu Asp Val 530 535 540 Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Met Val Met Val Gln Val Pro Trp Ser 545 550 555 560 Ala Pro Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Leu Phe 565 570 572 <210> 4 <211> 1762 <212> DNA <213> Brassica napus <220> <221> CDS <222> (1)...(1719) <400> 4 ttg gaa gaa aaa acg ccg ccg gga atc gtc gat aag ttc ggg tgg tgc 48 Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys 5 10 15 acg tgg gat gcg ttt tat ttg acg gtg aac cct gac gga gtt cat aag 96 Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val Asn Pro Asp Gly Val His Lys 20 25 30 ggt gtt aag tgt ctc gtc gac ggt ggt tgt ccg ccg gga ttg gtc cta 144 Gly Val Lys Cys Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu 35 40 45 atc gac gac ggt tgg caa tcg att gga cat gac tcc gat ggt atc gat 192 Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Gly Ile Asp 50 55 60 gtt gaa ggg atg agt tgt acc gtc gcc ggg gag caa atg cct tgc agg 240 Val Glu Gly Met Ser Cys Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg 65 70 75 80 ctt ccg aaa ttt caa gag aac ttc aag ttc aga gac tac gtc tct ccg 288 Leu Pro Lys Phe Gln Glu Asn Phe Lys Phe Arg Asp Tyr Val Ser Pro 85 90 95 aaa gac aaa aac gaa gtc ggg atg aaa gct ttc gtc aga gat ctg aaa 336 Lys Asp Lys Asn Glu Val Gly Met Lys Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys 100 105 110 gaa gaa ttc tcc acc gtt gat tac atc tac gtc tgg cac gcg ctt tgc 384 Glu Glu Phe Ser Thr Val Asp Tyr Ile Tyr Val Trp His Ala Leu Cys 115 120 125 ggy tac tgg ggw ggt ctt cgt ccc gga gct cct act ctt ccg ccs tcr 432 Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ser 130 135 140 act att gtc cgr cca gag ctc tcg ccg ggg ctt aag ttg acg atg caa 480 Thr Ile Val Arg Pro Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Leu Thr Met Gln 145 150 155 160 gat ctc gcc gtt gat aag atc atc gat acc gga atc gga ttc gtc tcg 528 Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Ile Asp Thr Gly Ile Gly Phe Val Ser 165 170 175 ccg gac atg gcg aac gag ttt tac gaa ggt ctt cac tct cat ctt caa 576 Pro Asp Met Ala Asn Glu Phe Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu Gln 180 185 190 aac gtc ggc att aac ggc gtt aaa gtt gac gtt atc cac ata ctg gag 624 Asn Val Gly Ile Asn Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Ile Leu Glu 195 200 205 atg ttg tgc gag aaa tat ggc ggg aga gtt gac ttg gct aaa gct tac 672 Met Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr 210 215 220 ttc aag gcg tta acg tcg tca gtg aat aag cat ttt gac ggc aac gcc 720 Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Asn Lys His Phe Asp Gly Asn Ala 225 230 235 240 gtt atc gcc agc atg gag cac tgt aat gac ttc atg ttc ctt gga acc 768 Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr 245 250 255 gaa gcc atc tct cta ggt cgt gtc ggt gat gac ttt tgg tgc acg gat 816 Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp 260 265 270 cca tct ggc gac att aac ggc acg tat tgg ctg caa gga tgt cac atg 864 Pro Ser Gly Asp Ile Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met 275 280 285 gtc cac tgt gcc tac aac agt ctt tgg atg gga aat ttc atc cag cct 912 Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro 290 295 300 gat tgg gac atg ttt cag tcc aca cat cct tgt gct gag ttc cat gct 960 Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala 305 310 315 320 gct tca cgt gcc atc tcc ggt ggg ccc att tac atc agc gat tgt gtg 1008 Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ser Asp Cys Val 325 330 335 ggc cag cac gat ttc gat ctc ttg agg aga ctc gtt ttg cct gac ggt 1056 Gly Gln His Asp Phe Asp Leu Leu Arg Arg Leu Val Leu Pro Asp Gly 340 345 350 tcg att ttg agg tgt gag tac tat gct ctc cca act cgt gac cgt ctc 1104 Ser Ile Leu Arg Cys Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Arg Leu 355 360 365 ttt gaa gac cct ctt cat gat ggc aaa acc atg ctc aag att tgg aac 1152 Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn 370 375 380 ttg aac aag tac act gga atc atc gga gca ttc aac tgt caa gga gga 1200 Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Ile Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly 385 390 395 400 gga tgg tgc aga gaa act cga cgc gac caa tgc ttc tcc caa tgc gtt 1248 Gly Trp Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asp Gln Cys Phe Ser Gln Cys Val 405 410 415 aac acg tta acc gcc aca aca aat cct aat gac gtt gaa tgg aac agt 1296 Asn Thr Leu Thr Ala Thr Thr Asn Pro Asn Asp Val Glu Trp Asn Ser 420 425 430 ggg aac aac ccg atc tcc att gaa aac gtt gaa gag ttt gct ttg ttc 1344 Gly Asn Asn Pro Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Glu Phe Ala Leu Phe 435 440 445 ttg tct caa tcc aag aag ctt gtg ttg tcc ggg caa aac gat gat ctc 1392 Leu Ser Gln Ser Lys Lys Leu Val Leu Ser Gly Gln Asn Asp Asp Leu 450 455 460 gag atc aca tta gag ccc ttc aag ttc gag ctc atc act gtc tca cca 1440 Glu Ile Thr Leu Glu Pro Phe Lys Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro 465 470 475 480 gtt gtc acc att gag ggc agt tcg gtt cag ttt gct cca atc gga ttg 1488 Val Val Thr Ile Glu Gly Ser Ser Val Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu 485 490 495 gtt aac atg ctt aac act agc ggt gcg att cga tcc ttg gtt tat cat 1536 Val Asn Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr His 500 505 510 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【図１】図1は、塩基配列にコードされるアミノ酸の対
応を示すコドン表である。コドンは、5’-末端が左側に
くるように示し、mRNAにおける塩基配列を示している。
UはRNAにおけるウラシル塩基を示しており、DNAにおい
てはチミン塩基に相当する。
応を示すコドン表である。コドンは、5’-末端が左側に
くるように示し、mRNAにおける塩基配列を示している。
UはRNAにおけるウラシル塩基を示しており、DNAにおい
てはチミン塩基に相当する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年１２月１４日（１９９８．１２．
１４）
１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】本発明遺伝子は、例えば、下記の方法によ
り得ることができる。例えば、カラシナ(Brassica junc
ea)、ナタネ(Brassica napus)等のアブラナ科植物の組
織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などを用いて物理
的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とし、該
組織片から通常の方法によりRNAを抽出する。該抽出操
作には、市販のRNA抽出キットを利用することができ
る。得られたRNA抽出液からエタノール沈澱によりRNAを
回収し、このRNAから通常の方法によりポリA鎖を有する
RNAを分画する。該分画操作には、市販のOligo dTカラ
ムを利用することができる。このようにして得られたポ
リA鎖を有するRNAから通常の方法によりcDNAを合成す
る。該合成操作には、市販のcDNA合成キットを利用する
ことができる。前記cDNAを鋳型として、配列番号2で示
される塩基配列を基にして設計され化学合成されたオリ
ゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行なうこと
により、ＤＮＡを増幅する。例えば、カラシナ(Brassic
a juncea)由来のcDNAを鋳型として、例えば、下記リス
ト１に示されるプライマー3と4を用いてPCRを行うこと
により、本発明遺伝子である「配列番号1で示されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合
成酵素遺伝子」、より具体的には「配列番号2で示される
塩基配列のうち塩基番号1から2654までの塩基で表され
る塩基配列からなるラフィノース合成酵素遺伝子」のcD
NAを増幅し取得することができる。この際に用いられる
プライマーは、目的に応じて配列番号2で示される塩基
配列を基にして設計し合成することができ、例えば、
「配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のオープンリ
ーディングフレーム領域をコードするＤＮＡ、すなわち
「配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号134から
2467までの塩基で表される塩基配列からなるラフィノー
ス合成酵素遺伝子」のＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記
す。）を増幅するには、下記リスト１のプライマー5と6
で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成
しプライマーに用いるとよい。増幅されたDNAは「Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」 (19
89),Cold Spring Harbor Laboratory Press、 「Curren
t Protocols In Molecular Biology」 (1987),John Wil
ey & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常
の方法に準じてサブクローニングすることができる。具
体的には、例えば、Invitrogen社のTAクローニングキッ
トやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベ
クターを用いてクローニングしてもよい。クローニング
されたDNAの塩基配列の確認は、F.Sanger,S.Nicklen,A.
R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Sc
ience U.S.A．(1977),74,5463頁-5467頁等に記載される
ダイデオキシターミネーティング法により行なうことが
できる。例えば、市販のパーキンエルマー社のABI PRIS
M Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction K
itなどを利用するとよい。
り得ることができる。例えば、カラシナ(Brassica junc
ea)、ナタネ(Brassica napus)等のアブラナ科植物の組
織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などを用いて物理
的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とし、該
組織片から通常の方法によりRNAを抽出する。該抽出操
作には、市販のRNA抽出キットを利用することができ
る。得られたRNA抽出液からエタノール沈澱によりRNAを
回収し、このRNAから通常の方法によりポリA鎖を有する
RNAを分画する。該分画操作には、市販のOligo dTカラ
ムを利用することができる。このようにして得られたポ
リA鎖を有するRNAから通常の方法によりcDNAを合成す
る。該合成操作には、市販のcDNA合成キットを利用する
ことができる。前記cDNAを鋳型として、配列番号2で示
される塩基配列を基にして設計され化学合成されたオリ
ゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行なうこと
により、ＤＮＡを増幅する。例えば、カラシナ(Brassic
a juncea)由来のcDNAを鋳型として、例えば、下記リス
ト１に示されるプライマー3と4を用いてPCRを行うこと
により、本発明遺伝子である「配列番号1で示されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合
成酵素遺伝子」、より具体的には「配列番号2で示される
塩基配列のうち塩基番号1から2654までの塩基で表され
る塩基配列からなるラフィノース合成酵素遺伝子」のcD
NAを増幅し取得することができる。この際に用いられる
プライマーは、目的に応じて配列番号2で示される塩基
配列を基にして設計し合成することができ、例えば、
「配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のオープンリ
ーディングフレーム領域をコードするＤＮＡ、すなわち
「配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号134から
2467までの塩基で表される塩基配列からなるラフィノー
ス合成酵素遺伝子」のＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記
す。）を増幅するには、下記リスト１のプライマー5と6
で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成
しプライマーに用いるとよい。増幅されたDNAは「Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」 (19
89),Cold Spring Harbor Laboratory Press、 「Curren
t Protocols In Molecular Biology」 (1987),John Wil
ey & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常
の方法に準じてサブクローニングすることができる。具
体的には、例えば、Invitrogen社のTAクローニングキッ
トやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベ
クターを用いてクローニングしてもよい。クローニング
されたDNAの塩基配列の確認は、F.Sanger,S.Nicklen,A.
R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Sc
ience U.S.A．(1977),74,5463頁-5467頁等に記載される
ダイデオキシターミネーティング法により行なうことが
できる。例えば、市販のパーキンエルマー社のABI PRIS
M Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction K
itなどを利用するとよい。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (23)
- 【請求項１】配列番号2で示される塩基配列のうち塩基
番号134から2467までの塩基で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原
子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1
→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能
力を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるラフィノ
ース合成酵素遺伝子。 - 【請求項２】配列番号1で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子。 - 【請求項３】配列番号2で示される塩基配列のうち塩基
番号134から2467までの塩基で表される塩基配列を有す
るラフィノース合成酵素遺伝子。 - 【請求項４】配列番号3で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子。 - 【請求項５】配列番号４で示される塩基配列のうち塩基
番号1から1719までの塩基で表される塩基配列を有する
ラフィノース合成酵素遺伝子。 - 【請求項６】請求項1〜５記載のラフィノース合成酵素
遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ。 - 【請求項７】ハイブリダイゼーション法によりラフィノ
ース合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを検出する方法であっ
て、請求項６記載のＤＮＡを標識しこれをプローブに用
いて前記ＤＮＡを検出することを特徴とする方法。 - 【請求項８】ポリメラーゼチェインリアクション法によ
りラフィノース合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅する
方法であって、請求項１〜５記載のラフィノース合成酵
素遺伝子の部分塩基配列を有するプライマーを用いて前
記ＤＮＡを増幅することを特徴とする方法。 - 【請求項９】ラフィノース合成酵素遺伝子の取得方法で
あって、請求項７記載の方法によりラフィノース合成酵
素遺伝子を含むＤＮＡを検出し該ＤＮＡを回収する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１０】ラフィノース合成酵素遺伝子の取得方法
であって、請求項８記載の増幅方法によりラフィノース
合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅し該ＤＮＡを回収す
る工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】請求項1〜５記載のラフィノース合成酵
素遺伝子を含むＤＮＡまたは請求項６記載のＤＮＡと、
宿主細胞においてプロモーター活性を示すＤＮＡとが連
結されてなるＤＮＡ。 - 【請求項１２】請求項1〜５記載のラフィノース合成酵
素遺伝子または請求項６もしくは１１記載のＤＮＡを有
するベクター。 - 【請求項１３】請求項1〜５記載のラフィノース合成酵
素遺伝子が宿主の細胞に導入されてなる形質転換体。 - 【請求項１４】請求項１１記載のＤＮＡが宿主の細胞に
導入されてなる形質転換体。 - 【請求項１５】請求項１２記載のベクターが宿主の細胞
に導入されてなる形質転換体。 - 【請求項１６】宿主が微生物である請求項1３〜１５記
載の形質転換体。 - 【請求項１７】宿主が植物である請求項1３〜１５記載
の形質転換体。 - 【請求項１８】宿主がアブラナ科植物である請求項１７
記載の形質転換体。 - 【請求項１９】宿主がカラシナである請求項１７または
１８記載の形質転換体。 - 【請求項２０】宿主がナタネである請求項１７または１
８記載の形質転換体。 - 【請求項２１】請求項１３〜２０記載の形質転換体を培
養しラフィノース合成酵素を産生させることを特徴とす
るラフィノース合成酵素の製造方法。 - 【請求項２２】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有
するラフィノース合成酵素。 - 【請求項２３】配列番号３で示されるアミノ酸配列を有
するラフィノース合成酵素。
Priority Applications (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10351246A JP2000014389A (ja) | 1998-04-30 | 1998-12-10 | ラフィノース合成酵素遺伝子 |
| AU23967/99A AU760702B2 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-26 | Raffinose synthase genes and their use |
| AT99107430T ATE433488T1 (de) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | Raffinose synthase gene und deren verwendung |
| EP99107430A EP0953643B1 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | Raffinose synthase genes and their use |
| ES99107430T ES2327367T3 (es) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | Genes de la rafinosa sintasa y su uso. |
| KR1019990015007A KR19990083522A (ko) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | 라피노스합성효소유전자및그의용도 |
| DK99107430T DK0953643T3 (da) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | Raffinosesyntasegener og anvendelsen deraf |
| DE69940966T DE69940966D1 (de) | 1998-04-30 | 1999-04-27 | Raffinose Synthase Gene und deren Verwendung |
| TR2001/00266A TR200100266A2 (tr) | 1998-04-30 | 1999-04-28 | Rafinoz sintaz genleri ve kullanımları. |
| TR1999/00944A TR199900944A3 (tr) | 1998-04-30 | 1999-04-28 | Rafinoz sintaz genleri ve kullanimlari |
| TR2001/00269A TR200100269A2 (tr) | 1998-04-30 | 1999-04-28 | Rafinoz sintaz genleri ve kullanımları. |
| TR2001/00268A TR200100268A2 (tr) | 1998-04-30 | 1999-04-28 | Rafinoz sintaz genleri ve kullanımları. |
| ARP990101961A AR016234A1 (es) | 1998-04-30 | 1999-04-28 | Un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una rafinosa sintetasa y un promotor heterologo que esta operativamente ligado a la secuencia de nucleotidos, vector que lo comprende, microorganismo modificado y metodo para producir una rafinosa sintetasa. |
| US09/301,766 US7511191B1 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-29 | Raffinose synthase genes and their use |
| CN99105331A CN1237635A (zh) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | 棉子糖合酶基因及其应用 |
| PL99332890A PL332890A1 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | Raffinose synthase genes and their application |
| BR9902058-0A BR9902058A (pt) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | Genes de rafinose sintase e seu uso. |
| CA002270504A CA2270504C (en) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | Raffinose synthase genes and their use |
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP10-120551 | 1998-04-30 | ||
| JP12055198 | 1998-04-30 | ||
| JP10351246A JP2000014389A (ja) | 1998-04-30 | 1998-12-10 | ラフィノース合成酵素遺伝子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000014389A true JP2000014389A (ja) | 2000-01-18 |
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ID=26458112
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|---|---|---|---|
| JP10351246A Pending JP2000014389A (ja) | 1998-04-30 | 1998-12-10 | ラフィノース合成酵素遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000014389A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024055405A1 (zh) * | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 江苏省农业科学院 | 一种大豆低聚糖相关的kasp标记及其应用 |
-
1998
- 1998-12-10 JP JP10351246A patent/JP2000014389A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024055405A1 (zh) * | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 江苏省农业科学院 | 一种大豆低聚糖相关的kasp标记及其应用 |
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